專利名稱：化學(xué)修飾的人生長激素綴合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)修飾的人生長激素(hGH)及其激動劑變異體，其中hGH的化學(xué)和/或生理特性已發(fā)生改變。PEG化的hGH可能增加血漿駐留時間、降低清除率、改善穩(wěn)定性、減少抗原性或上述優(yōu)點的組合。本發(fā)明也涉及修飾hGH的方法。另外，本發(fā)明涉及含有所述經(jīng)修飾的hGH的藥用組合物。另一實施方案涉及所述修飾的hGH在治療生長發(fā)育病癥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人生長激素(hGH)是包括經(jīng)兩個二硫橋交聯(lián)的191個氨基酸單鏈的蛋白質(zhì)，其單體形式的分子量為22kDa。人生長激素由腦下垂體分泌，也能由重組遺傳工程獲得。hGH能促使所有能生長身體組織的生長。重組hGH已經(jīng)市售多年。目前市售的兩類治療用重組hGH制劑為經(jīng)認(rèn)證的例如GenotropinTM，或NutropinTM，和在氮端帶有額外的甲硫氨酸殘基的類似物，例如SomatonormTM。hGH用于刺激具有垂體機能不足的侏儒癥(也稱生長激素缺乏(GHD))或Turner綜合癥患者的線性生長(linear growth)，但也適于其他適應(yīng)癥，包括長期治療出生時胎齡(SGA)不足的兒童生長不足，治療普-拉-威綜合癥(PWS)患者，慢性腎功能不全，艾滋病衰竭，和衰老。
生長激素(GH)的主要生物效應(yīng)是促進(jìn)幼小哺乳動物生長和維持老年哺乳動物的組織。受其影響的器官系統(tǒng)包括骨骼，結(jié)締組織，肌肉，和內(nèi)臟例如肝、腸，和腎。生長激素通過與靶細(xì)胞膜上的特殊受體相互作用而發(fā)揮其作用。hGH是同源激素家族一員中的，該家族包括胎盤催乳素、促乳激素，和其它遺傳和物種的變異體或生長激素(Nicoll，C.S.等，(1986)Endocrine Reviews7169)。hGH是其中的獨特激素，它具有廣譜的物種特異性，并能與克隆的體細(xì)胞(somatogenic)(Leung，D.W.等，Nature 330；537)、或促乳激素受體(Boutin等，J.M.Cell5369)結(jié)合。已在大腸桿菌中以分泌形式表達(dá)了hGH的克隆基因(Chang，C.N等，Gene 55189)，并且其DNA和氨基酸序列也有報道(Goeddel等，[1979)Nature 281544；Gray等，Gene 39247]。
人生長激素(hGH)參與正常人生長發(fā)育的許多調(diào)節(jié)。垂體激素表現(xiàn)出許多生物效應(yīng)，包括線性生長即體質(zhì)形成、泌乳、巨噬細(xì)胞的激活、胰島素樣和致糖尿病作用等(Chawla，R，K.(1983)Ann.Rev. Med.34，519；Edwards，C.K.等，(1988)Science 239，769；Thomer，M.O，等，(1988)J.Clin.Invest.81745)。兒童生長激素缺乏可導(dǎo)致侏儒癥，過去十年來已通過外源性施用hGH成功治療了侏儒癥。
人生長激素(hGH)是由191個氨基酸構(gòu)成的單鏈多肽(分子量21,500)。二硫鍵連結(jié)位置53和165及位置182和189(Niall，Nature，New Biology，23090(1971))。hGH是有效的同化激素類藥，尤其是由于對氮、磷、鉀和鈣的駐留能力。經(jīng)GH治療的垂體切除的大鼠能至少部分地恢復(fù)其生長速度(Moore等，Endocrinology 1222920-2926(1988))。它對垂體機能不足的(GH-缺陷)受試者的最顯著作用是加速了骨-生長-板(plate)-軟骨的線性生長，從而使身高增長(Kaplan，Growth Disorders in Children andAdolescents(Springfield，ILCharles C.Thomas，1964)。
hGH可在各種動物模型中產(chǎn)生多種生理性和代謝作用，包括線性骨生長、泌乳、巨噬細(xì)胞的激活、胰島素樣和致糖尿病作用等(R.K.Chawla等，Annu.Rev.Med.34519(1983)；O.G.P.Isaksson等，Annu.Rev.Physio.47，483(1985)；C.K.Edwards等，Science239，769(1988)；M.O.Thomer和M.L.V ance，J.Clin.Invest.82745(1988)；J.P.Hughes和H.G.Friesen，Ann.Rev.Physiol.47469(1985))。據(jù)報道，特別是經(jīng)絕后女性的生長激素分泌隨著年齡而下降。Millard等，Neurobiol.Aging，11229-235(1990)；Takahashi等，Neuroendocrinology M，L6-137-142(1987)。參見Rudman等，J.Clin.Invest.，671361-1369(1981)和Blackman，Endocrinology andAging，16981(1987)。此外，據(jù)報道，每周用GH治療3次，可減少衰老表現(xiàn)(包括瘦體重下降、脂肪組織體重增加、和皮膚變薄)。參見例如Rudman等，N.Eng.J.Med.，3231-6(1990)，和Dr.Vance在該雜志中的文章(52-54頁)。這些生物效應(yīng)來源于hGH與特定細(xì)胞受體之間的相互作用。已克隆出兩種不同的人受體，即hGH肝受體(D.W.Leung等，Nature 330537(1987))和人催乳素受體(J.M.Boutin等，Mol.Endocrinology.31455(1989))。然而，還可能存在其它受體，包括人胎盤催乳素受體(M.Freemark，M.Comer，G.Komer和S.Handwerger，Endocrinol.1201865(1987))。這些同源受體含有序列和尺寸相差較大的糖基化的胞外激素結(jié)合域、單一跨膜結(jié)構(gòu)域和胞漿區(qū)。據(jù)信一種或更多受體在對hGH的生理反應(yīng)起著決定性作用。
通?？梢杂^察到，施用到身體中的生理學(xué)活性蛋白質(zhì)的藥理學(xué)活性作用時間較短，這是由于它們在體內(nèi)的高清除率。此外，這些蛋白質(zhì)相對的疏水性可能限制了它們的穩(wěn)定性和/或溶解性。
已有一些方法用來降低治療性蛋白質(zhì)的清除率、改善其穩(wěn)定性或消除其抗原性，這包括用水溶性聚合物化學(xué)修飾所述蛋白質(zhì)。這種類型的化學(xué)修飾能有效地阻滯蛋白水解酶與蛋白質(zhì)主鏈直接接觸，這樣就防止了降解。與某些水溶性聚合物化學(xué)性連接，使分子的流體動力學(xué)體積(hydrodynamic volume)增加，從而可有效降低腎清除率。額外的優(yōu)點包括，在某些情況下還可增加治療性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和循環(huán)時間、增加其溶解性和降低免疫原性。
聚(環(huán)氧烷烴)、特別是聚乙二醇(PEG)，就是一種用于制備治療性蛋白質(zhì)產(chǎn)品的化學(xué)部分(動詞“PEG化”是指連接至少一種PEG分子)。連接聚乙二醇能防止蛋白水解(Sada等，J.FermentationBioengineering 71137-139(1991))，并且連接某些聚乙二醇部分的方法是已知的。參見專利US4,179,337，Davis等，“Non-ImmunogenicPolypeptides”，1979年12月18日公開；和US4,002,531，Royer，“Modifying enzymes with Polyethylene Glycol and ProductProduced Thereby”，1977年1月11日公開。和Abuchowski等在Enzymesas Drugs中的綜述(J.S.Holcerberg和J.Roberts，編輯，367-383頁(1981))。
其它水溶性聚合物也已經(jīng)使用，例如乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯基吡咯烷酮，聚(-1，3-二氧戊環(huán))，聚(-1，3，6-三噁烷)，乙烯基/馬來酐共聚物，聚-氨基酸(均聚物或無規(guī)共聚物)。
許多文獻(xiàn)描述了PEG化治療性蛋白質(zhì)的示例。ADAGEN，是腺苷脫氨酶的PEG化制劑，已被批準(zhǔn)用于治療嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病。ONCASPAR，PEG化的L-天冬酰胺酶已被批準(zhǔn)用于治療所有患者的過敏。PEG化的超氧化物歧化酶也已處于治療顱腦損傷的臨床試驗中。PEG化的α-干擾素(US5,738,846、US5,382,657)已被批準(zhǔn)用于治療肝炎；報道據(jù)PEG化的葡糖腦苷脂酶和PEG化的血色素也處于臨床前試驗階段。另一個示例是PEG化的IL-6，EF0442724(名稱為“改性的hIL-6”)，其中公開了連接有聚乙二醇分子的IL-6。
另一經(jīng)化學(xué)修飾的特定的治療性蛋白質(zhì)是粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)。G-CSF誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞快速增殖并釋放到血流中，從而在抗感染中提供治療作用。1990年12月12日公開的歐洲專利文本EP0401384(名稱為“Chemically Modified Granulocyte ColonyStimulating Factor”)，描述了用于制備連接有聚乙二醇的G-CSF的材料和方法。EP0473268(1992年3月4日公開，名稱為“ContinuousRelease Pharmaceutical Compositions Comprising a PolypeptideCovalently Conjugated To A Water Soluble Polymer”)，描述了經(jīng)修飾的G-CSF及其類似物，其中衍生物與水溶性顆粒聚合物例如聚乙二醇的共價綴合。1989年10月4日公開的EP0335423報道了具有粒細(xì)胞集落刺激因子活性的修飾多肽。US 5,824,784描述了N-端修飾蛋白質(zhì)或其類似物的方法和所得到的組合物，包括新穎的N-端化學(xué)修飾的G-CSF組合物。US5,824,778公開了化學(xué)修飾的G-CSF。
已有許多方法可將聚乙二醇分子連接到蛋白質(zhì)上。通常，聚乙二醇經(jīng)蛋白質(zhì)上的反應(yīng)基與蛋白質(zhì)連接。
氨基(例如賴胺酸殘基上的氨基或N-端的氨基)適于這種連接。例如，Royer(US4,002,531，同上)描述了用于連接聚乙二醇分子和酶的還原性烷基化反應(yīng)。EP0539167(Wright，1993年4月28日公開，“PEGImidates and Protein Derivatives Thereof”)指出，具有游離氨基的肽和有機化合物可用PEG的亞氨酸酯(imidate)衍化物或相關(guān)的水溶性有機聚合物修飾。US5,298,643和US5,637,749公開了PEG芳基亞氨酸酯。
Chamow等，Bioconjugate Chem.5133-140(1994)報道了用單甲氧基聚乙二醇醛通過還原性烷基化作用修飾CD4免疫粘和素。該作者報道，在控制PEG化程度的條件下，有50％的CD4-Ig被MePEG修飾(同前，137頁)。作者還報道經(jīng)修飾的CD4-Ig的體外結(jié)合(與蛋白gp120)能力降低，其降低速度與MePEG化程度相關(guān)(出處同前)。US4,904,584(Shaw，1990年2月27日公布)涉及對蛋白質(zhì)上的許多賴氨酸殘基進(jìn)行修飾，使之通過活性胺基與聚乙二醇連接。
許多用于連接聚合物和蛋白質(zhì)的方法均涉及采用起連接基作用的部分(moiety)。然而，這種連接基部分可能是抗原性的。有一種氯化三氟乙烷磺酰(tresyl chloride)方法不采用連接基，但是這種方法難以用來生產(chǎn)治療性產(chǎn)品，因為氯化三氟乙烷磺?？赡墚a(chǎn)生毒性副產(chǎn)物。參見Francis等在Stability of protein pharmaceuticalsin vivopathways of degradation and strategies for proteinstabilization(Ahern，T.和Manning，M.C.編輯，Plenum出版社，紐約，1991)，及Delgado等，“Coupling of PEG to Protein By ActivationWith Tresyl Chloride，Applications In Immunoaffinity CellPreparation”，在Separations Using Aqueous Phase Systems，Applications In Cell Biology and Biotechnology，F(xiàn)isher等編輯，Plenum出版社，紐約，N.Y.，1989，211-213頁)。
同時參見Rose等(Bioconjugate Chemistry 2154-159(1991))，報道了連接基碳酰肼(carbohydrazide)與蛋白質(zhì)底物(胰島素)上C端羧基的選擇性結(jié)合。
WO93/00109涉及刺激哺乳動物或鳥類GH應(yīng)答組織的方法，包括在3天或更長時間內(nèi)維持連續(xù)的有效血漿GH濃度。據(jù)稱，使用GH與大分子物質(zhì)例如PEG(聚乙二醇)結(jié)合，可達(dá)到這種血漿濃度。據(jù)稱與大分子物質(zhì)的結(jié)合能提高半衰期。WO93/00109報道了PEG化的人生長激素，其中采用了mPEG醛-5000和mPEG N-羥基琥珀酰亞胺酯(mPEG-NHS-5000)。使用mPEG-NHS，可形成多PEG化形式的hGH的非均勻混合物。WO93/00109也公開了用mPEG-馬來酰亞胺對半胱氨酸hGH變異體進(jìn)行PEG化。
WO99/03887公開PEG化的半胱氨酸變異體生長激素。命名為BT-005，據(jù)稱這種綴合物在刺激生長激素缺乏的大鼠的體重增加方面比hGH更有效，且具有更長的半衰期。
Clark等也報道了采用羧甲基化PEG的琥珀酰亞胺酯進(jìn)行人生長激素的PEG化(Journal of Biological Chemistry27121969-21977，1996)。Clark等描述，使用能選擇性結(jié)合伯胺的mPEG-NHS-5000，可增加hGH衍生物的尺寸。增加PEG修飾水平，可降低其對受體的親合力，并使EC50增加1500倍(細(xì)胞水平分析)。Olson等(Polymer Preprints 38568-569，1997)公開了采用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)PEG和琥珀酰亞胺丙酸酯(SPA)PEG得到hGH的多PEG化種類。
WO94/20069預(yù)言性地公開了作為肺部給藥制劑一部分的PEG化的hGH。
US4,179,337公開PEG化酶和激素的方法，其中得到了生物活性的非免疫原性水溶性多肽綴合物。其中GH是被PEG化的激素的一個示例。
EP458064A2公開對生長激素中引入或天然存在的半胱氨酸殘基進(jìn)行PEG化的方法。EP458064A2還提到環(huán)(術(shù)語為位于野型牛生長激素中殘基102-112上的ω環(huán))中的兩個半胱氨酸殘基的插入(incorporation)，更具體地說，EP458064A2公開牛生長激素上編號102和112殘基分別由Cys取代Ser和由Cys取代Tyr。
WO95/11987認(rèn)為PEG可與母體分子中存在或者經(jīng)定向誘變引入的半胱氨酸殘基上的巰基結(jié)合。WO95/11987涉及PEG化蛋白酶連結(jié)素-1，同時也提出hGH和其它蛋白質(zhì)通?？梢员籔EG化。
例如，WO99/03887公開了修飾的生長激素，其中經(jīng)絲氨酸殘基插入額外的半胱氨酸，使PEG與引入的半胱氨酸殘基結(jié)合。
WO00/42175涉及制備含有供PEG結(jié)合的游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的方法。WO00/42175公開了hGH的下列突變蛋白質(zhì)T3C，S144C和T148C，及其半胱氨酸PEG化。
wo9711178(以及US5849535，US6004931和US6022711)涉及以生長激素變異體作為hGH的激動劑或拮抗物。WO9711178也公開人生長激素的PEG化，包括賴氨酸的PEG化和引入或取代賴氨酸(例如K168A和K172R)。WO9711178也公開了取代G120K。
前述PEG化的hGH需要與多個PEG結(jié)合以形成大于70K分子量的流體動力學(xué)體積而被腎過濾截留(Knauf M.J.等，j.Biol.Chem.26315064-15070，1988)，這可能產(chǎn)生不利的產(chǎn)品異質(zhì)性(heterogeneity)。
具有較長循環(huán)半衰期的GH分子將降低必要的給藥次數(shù)，并可能在提供更優(yōu)化的治療hGH水平的同時增加治療作用。
本發(fā)明提供化學(xué)修飾的hGH綴合物，其具有降低了的不均勻性、降低了的清除率、增加的血漿駐留持續(xù)時間、改善的溶解性、提高的穩(wěn)定性、降低了的抗原性或上述優(yōu)點的組合。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及化學(xué)修飾的hGH及其激動劑變異體，其具有至少一種但并不限于以下改善的化學(xué)或生理特性降低的清除率、提高的血漿駐留持續(xù)時間、提高穩(wěn)定性、改善的溶解性和降低的抗原性。這樣，如下面更為詳細(xì)的描述所述，本發(fā)明涉及與化學(xué)修飾的hGH及其激動劑變異體、以及采用多種聚乙二醇部分進(jìn)行的特定修飾等有關(guān)的方面。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)化學(xué)修飾的hGH及其激動劑變異體的方法。
本發(fā)明還涉及包括化學(xué)修飾的hGH及其激動劑變異體的組合物。
本發(fā)明經(jīng)修飾的hGH及其激動劑變異體可用于治療以下疾病，包括但不限于侏儒癥(HD)、成年人GHD、Turner綜合癥、出生時小于胎齡(SGA)的兒童生長疾病的長期治療、治療普-拉-威綜合癥(PWS)患者、慢性腎功能不全(CRI)、Aids衰竭、衰老、終末期腎衰竭和囊性纖維化。
附圖簡述附

圖1是對hGH和20K PEG-ALD和陰離子交換純化的20K PEG-ALDhGH反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行的還原和非還原性SDS-PAGE分析。泳道1.MW蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；泳道2.還原的hGH-10μg；泳道3.還原的20K線性PEG-ALDhGH反應(yīng)混合物-10μg；泳道4.還原的陰離子交換純化的20K線性PEG-ALD hGH-10μg；泳道5.空白；泳道6.未還原的hGH-10μg；泳道7.未還原的20K線性PEG-ALD hGH反應(yīng)混合物-10μg；泳道8.未還原的陰離子交換純化的20K線性PEG-ALD hGH-10μg；泳道9.空白；泳道10.MW蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。
附圖2是對各種陰離子交換純化的PEG化hGH分子的非還原性SDS-PAGE分析。泳道1.MW蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；泳道2.hGH-10μg；泳道2.4-6×5K PEG-SPA hGH-10μg；泳道3.20K線性PEG-ALD hGH-10μg；泳道4.20K支鏈PEG-ALD hGH-10μg；泳道5.40K支鏈PEG hGH-10μg。
附圖3為胰蛋白酶消化hGH、40K Br PEG-ALD hGH和40K Br PEG-NHShGH的RP-HPLC洗脫圖。PEG主要與hGH的N端結(jié)合(如40K Br ALD hGH所示)，使N端(T1)碎片峰減少，而產(chǎn)生新PEG化的T1峰。
附圖4為未PEG化hGH(日劑量，0.3mg/Kg/天)與單PEG化(每6天皮下(SC)施用一次，1.8mg/Kg)體內(nèi)生物活性的比較結(jié)果，以垂體切除的大鼠在11天中的體重增加表示。
附圖5為未PEG化hGH(每日SC，0.3mg/Kg/天)與4-6×5KPEG-SPA-hGH、單PEG化的20K支鏈PEG-ALD hGH、和單PEG化的40K支鏈PEG-ALD hGH(每6天SC一次，1.8mg/Kg)體內(nèi)生物活性的比較結(jié)果，以垂體切除的大鼠在11天中的體重增加表示。
附圖6為未PEG化的hGH(每日SC，0.3mg/Kg/天)與4-6×5KPEG-CMHBA-hGH、單PEG化的20K線性ALD、單PEG化的30K線性ALD、單PEG化的20K支鏈PEG-ALD hGH及單PEG化的40K支鏈PEG-ALD hGH(每6天SC一次，1.8mg/Kg)的體內(nèi)生物活性比較結(jié)果，以垂體切除大鼠在11天中的體重增加表示。
附圖7為1.8mg/Kg單SC劑量的未PEG化hGH與單PEG化的5K線性PEG-ALD hGH、單PEG化的20K線性PEGALD hGH、單PEG化20K支鏈PEG-ALD hGH、單PEG化的20K線性PEG-Hydrazide hGH、單PEG化的30K線性PEG-ALD hGH、單PEG化的40K支鏈PEG-ALD hGH、4-6×5K PEGSPAhGH、4-6×5K PEG-CMHBA hGH的體內(nèi)生物活性比較結(jié)果，以垂體切除大鼠在9天中的血漿IGF-1水平增加表示。
發(fā)明詳述HGH及其激動劑變異體屬于重組蛋白質(zhì)家族的成員，參見US4658021和US5633352的描述。有關(guān)它們的重組生產(chǎn)和使用方法參見US4342832、4601980；US4898830；US5424199和US5795745。
采用由宿主細(xì)胞(例如經(jīng)重組遺傳技術(shù)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的大腸桿菌和動物細(xì)胞)產(chǎn)生的任何純化和分離的hGH或其激動劑變異體，均可用于本發(fā)明。另外的hGH變異體見1991年6月14日提交的美國專利申請07/715、1991年8月9日提交的美國序列申請07/743,614，和1992年6月年11日公開的WO92/09690中的描述。其中尤其優(yōu)選經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌產(chǎn)生的hGH或其激動劑變異體?？纱笈康孬@得高純度和同質(zhì)性(homogeneity)的這種hGH或其激動劑變異體。例如，可采用US4,342,832、US4,601,980、US4,898,830、US5,424,199和US5,795,745描述的方法，制備上述hGH或其激動劑變異體。術(shù)語“基本上含有以下氨基酸序列”是指上述氨基酸序列可能包括氨基酸變化(缺失、添加、插入或替換)，條件是這種變化不會對hGH或其激動劑變異體的功能產(chǎn)生任何不利的非相似性(non-similarity)。更優(yōu)選使用基本上具有氨基酸序列的hGH或其激動劑變異體，其中包括至少一種賴胺酸、天冬氨酸、谷氨酸、未配對的半胱氨酸殘基、游離氮端α-氨基或游離C端羧基。
根據(jù)本發(fā)明，聚乙二醇通過氨基酸殘基與hGH或其激動劑變異體共價結(jié)合。許多具有不同官能團(tuán)、連接子、構(gòu)型和分子量的活化聚乙二醇在本領(lǐng)域是已知的，它們可用于生產(chǎn)PEG-hGH綴合物或PEG-hGH激動劑變異體綴合物(參見綜述Roberts M.J.等，Adv Drug Del.Rev.54459-476，2002；Harris J.M.等，Drug Delivery Sytems 40538-551，2001)。氨基酸殘基可以是任何活性的氨基酸殘基，其中具有例如游離氨基、羧基、硫氫基(巰基)、羥基、胍基(guanidinyl)或咪唑基(imidizoyl)基可與活化的聚乙二醇的未端反應(yīng)基結(jié)合。
具有游離氨基的氨基酸殘基包括賴胺酸殘基和/或N-端氨基酸殘基，那些具有自由羧基的殘基可包括天冬氨酸、谷氨酸和/或C端氨基酸殘基，那些具有游離硫氫基(巰基)的殘基例如半胱氨酸，那些具有游離羥基的殘基例如絲氨酸或酪氨酸，那些具有游離胍基的殘基例如精氨酸，和那些具有游離咪唑基的殘基例如組氨酸。
在另一個實施方案中，肟類化學(xué)物質(zhì)(Lemieux & Bertozzi Tib Tech16506-513，1998)被用來靶向N-端絲氨酸殘基。
本發(fā)明所用的聚乙二醇不局限于任何特殊形式或分子量范圍。聚乙二醇分子量為500-100,000。通常，其分子量為500-60,000，優(yōu)選1,000-40,000。更優(yōu)選分子量大于5,000-約40,000。
在另一個實施方案中，聚乙二醇具有連接著一種以上PEG部分的支鏈PEG。優(yōu)選的示例性支鏈PEG參見US5,932,462；US5,342,940；US5,643,575；US5,919,455；US6,113,906；US5,183,660；WO02/09766；Kodera Y.，Bioconjugate Chemistry 5283-288(1994)；和Yamasaki等，Agric.Biol.Chem.，522125-2127，1998。在一個優(yōu)選實施方案中，支鏈PEG中每一聚乙二醇的分子量是5,000-20,000。
聚(環(huán)氧烷烴)、特別是聚乙二醇可經(jīng)未端反應(yīng)基與hGH或其激動劑變異體結(jié)合，其中在PEG與蛋白質(zhì)之間可以留下或不留下連接部分(間隔基)。為了形成本發(fā)明hGH綴合物或其激動劑變異體，可將聚合物例如聚(環(huán)氧烷烴)轉(zhuǎn)化成活化形式，這在本領(lǐng)域是已知的。例如，反應(yīng)基是末端反應(yīng)基，其在蛋白質(zhì)的化學(xué)部分(例如氨基、羧基或巰基)與聚乙二醇之間形成鍵合。典型地，將末端聚合物的一個或兩個羥基末端基(即α和ω端羥基)轉(zhuǎn)化為能進(jìn)行共價綴合的活性官能團(tuán)。該方法稱為“活化作用”，并將具有反應(yīng)基的聚乙二醇產(chǎn)物在以下簡稱為“活化聚乙二醇”。含有α和ε連接基的聚合物稱為“雙-活化聚(環(huán)氧烷烴)和“雙官能”。有時將在α和ε末端羥基上包含相同反應(yīng)基的聚合物稱為“同基雙官能”或“同基雙活化的”。有時將在α和ε末端羥基上包含不同反應(yīng)基的聚合物稱為“雙異官能團(tuán)”(參見WO01/26692)或“雙異官能活化的”。包含單一反應(yīng)基的聚合物稱為“單活化”聚環(huán)氧烷烴或“單官能”?；旧戏强乖缘钠渌酆衔镱愃朴诘亍盎罨被颉肮倌芑?。
活化的聚合物適于在蛋白質(zhì)的化學(xué)部分(例如α或ε氨基、羧基或巰基)與聚乙二醇之間形成鍵合。在另一個實施方案中，雙活化聚合物能以這樣的方式與兩個蛋白質(zhì)分子或一個蛋白質(zhì)分子和一個活性小分子反應(yīng)，從而通過交聯(lián)有效地形成蛋白質(zhì)聚合物或蛋白質(zhì)-小分子綴合物。
能與hGH或其激動劑變異體上賴氨酸的氨基端α-氨基或ε-氨基反應(yīng)的官能團(tuán)包括N-羥基琥鉑酰亞胺基酯，碳酸酯例如對硝基苯基，或琥鉑酰亞胺基(US 5,808,096、US5,612,460、US5,324,844、US5,5,122,614)；羰咪唑；二氫噁唑酮(US5,321,095,US5,567,422)；環(huán)亞胺硫酮(cyclic imide thione)(US5,405,877、US5,349,001)；異氰酸酯或異硫氰酸酯(Greenwald R.B.，J.Org.Chem.，60331-336，1995)；氯化三氟乙烷磺酰(EP714402，EP439508)；鹵素甲酸酯(WO96/40792)，和醛。
能與hGH或其激動劑變異體上羧基、活性羰基及氧化的糖部分反應(yīng)的官能團(tuán)包括；伯胺；和肼和酰肼官能團(tuán)，例如酰肼，卡巴肼(carbazate)，半卡巴肼(semicarbazate)，硫代卡巴肼(thiocarbazate)等(WO01/70685)。
如果hGH或其激動劑變異體上存在疏基，它也可用作與具有反應(yīng)基(例如巰基、馬業(yè)酰亞胺、砜、和苯乙二醛)的活化聚合物連接的中心；參見例如US5,093,531，其公開內(nèi)容在此引入作為參考。其它能與親電中心反應(yīng)的親核物質(zhì)包括但不限于例如，羥基、氨基、羧基、巰基、活性亞甲基等。
也包括含有親脂和親水部分的聚合物，參見US5,359,030和US5,681,811；US5,438,040；和US5,359,030。
以及WO98/32466公開的能與氨基、巰基和芳族羥基反應(yīng)的鹵化PEG，它們可將PEG直接共價連接到蛋白質(zhì)上。
在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案中，利用hGH或其激動劑變異體上賴氨酸的N-端α-氨基或ε-氨基，與活化的PEG形成仲胺或酰胺鍵。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面，通過用適宜的還原劑(例如NaCNBH3、NaBH3、吡啶硼烷等)，在hGH或其激動劑變異體的N-端伯α-或ε-氨基與單或支鏈PEG醛之間形成仲胺鍵。參見Chamow等(Bioconjugate Chem.5133-140(1994))和US5,824,784的描述。。
在一個優(yōu)選的實施方案中，至少70％，優(yōu)選至少80％，優(yōu)選至少81％，優(yōu)選至少82％，優(yōu)選至少83％，優(yōu)選至少84％，優(yōu)選至少85％，優(yōu)選至少86％，優(yōu)選至少87％，優(yōu)選至少88％，優(yōu)選至少89％，優(yōu)選至少90％，優(yōu)選至少91％，優(yōu)選至少92％，優(yōu)選至少93％，優(yōu)選至少94％，優(yōu)選至少95％，優(yōu)選至少96％，優(yōu)選至少97％，和最優(yōu)選至少98％的聚乙二醇在氨基末端的α-氨基上。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，用形成酰胺的連接基(例如琥鉑酰亞胺酯、環(huán)亞胺硫酮等)活化所述聚合物，以作用于hGH或其激動劑變異體與聚合物之間的連接，例如參見US5,349,001；US5,405,877；和Greenwald等，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.17101-161，2000，其公開內(nèi)容在此引入作為參考?？膳chGH或其激動劑變異體的游離氨基結(jié)合的活化聚乙二醇優(yōu)選包括單或支鏈N-羥基琥珀酰亞胺聚乙二醇，可用N-羥基琥珀酰亞胺活化聚乙二醇的琥珀酸酯而獲得。
本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方案包括采用其它活化聚合物經(jīng)ε-氨基或其它基團(tuán)在聚合物與hGH或其激動劑變異體之間形成共價結(jié)合。例如，異氰酸酯或異硫氰酸酯形式的未端活化聚合物可用于與賴胺酸氨基形成以脲或硫脲為基礎(chǔ)的連接(Greenwald R.B.，J.Org.Chem.，60331-336，1995)。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，與蛋白質(zhì)形成氨基甲酸酯(尿烷)連接，參見US5,122,614、5,324,844和5,612,640的描述，其公開內(nèi)容在此引入作為參考。示例包括N-琥鉑酰亞胺基碳酸酯、對-硝基苯基碳酸酯和羰咪唑活化的聚合物。在本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方案中，PEG的苯并三唑碳酸酯衍生物與hGH或其激動劑變異體上的氨基連接。
本發(fā)明另一方面描述了前體藥物或緩釋形式的hGH或其激動劑變異體，包括水溶性聚合物例如聚乙二醇經(jīng)官能連接基與hGH或其激動劑變異體分子結(jié)合，該連接基預(yù)期能由酶催化或pH導(dǎo)致的水解降解而釋放出游離的hGH或其它hGH或其激動劑變異體衍化物。
所述前體藥物也可是具有級聯(lián)(cascade)潛效化作用的“雙重前藥”(Bundgaard，Advanced Drug Delivery Drug Delivery Reviews 339-65，1989)。在這種系統(tǒng)中，水解反應(yīng)包括起初的速限制性(慢)酶催化或pH控制的步驟，和另一個在第一個步驟之后的快速非酶水解步驟。這種可釋放性聚合物能提供暫時性的蛋白質(zhì)綴合物，該綴合物可用作不斷釋放hGH或其激動劑變異體的貯庫。這種官能連接基可參見US5,614,549；US5,840,900；US5,880,131；US5,965,119；US5,965,565；US6,011,042；US6,153,655；US6,180,095B1；US6,413,507；GreenwaldR.B等，J.Med.Chem.42；3657-3667，1999；Lee，S.等，BioconjugateChem 12163-169，2001；Garman A.J.等，F(xiàn)EBS Lett.223361-365，1987；Woghiren C.等，Bioconjucate Chem.4314-318，1993；Roberts M.J.等，J.Pharm.Sci.87；1440-1445，1998；Zhao X.，inNinth Int.Symp.Recent Adv.Drug Delivery Syst.199；GreenwaldR.B.等，J.Med.Chem.43475-487，2000；和Greenwa1d R.B.Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.17101-161，2000.Zalipsky等，28thInt.Symp.On controlled Release of Bioactive Materials1；73-74，2001。
曾經(jīng)有人在溶液中采用摩爾過量的聚合物(不考慮聚合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合部位)，進(jìn)行了綴合反應(yīng)(稱為PEG化反應(yīng))。然而，已證明這種常規(guī)技術(shù)不足以將生體活性蛋白質(zhì)綴合到非抗原性聚合物上并保持足夠生物學(xué)活性。有一種可保持hGH或其激動劑變異體生物學(xué)活性的方法，即在聚合物結(jié)合過程中基本上避免與hGH或其激動劑變異體上受體結(jié)合部位相關(guān)反應(yīng)基的綴合。本發(fā)明的另一方面是提供聚乙二醇與hGH或其激動劑變異體綴合的方法，其中的hGH或其激動劑變異體保持了高水平的保留(retained)活性。
在任何適宜條件下，生物活性物質(zhì)與活化聚乙二醇反應(yīng)，通過共價鍵實現(xiàn)所述化學(xué)修飾。在相對溫和的條件下進(jìn)行綴合反應(yīng)，以避免滅活hGH或其激動劑變異體。所述溫和條件包括使反應(yīng)的pH保持在3-10和反應(yīng)溫度約0-37℃。在hGH或其激動劑變異體上的反應(yīng)性氨基酸殘基具有游離氨基的情況下，優(yōu)選于4-37℃在適宜緩沖劑(pH3-10)進(jìn)行上述修飾1-48小時，所述緩沖劑包括但不限于磷酸鹽、MES、檸檬酸鹽、醋酸鹽、琥珀酸鹽或HEPES。在用反應(yīng)物例如PEG醛靶向N-端氨基時，優(yōu)選保持pH4-8?？刹捎眉s0.05-100倍、優(yōu)選約0.01-2.5倍于hGH或其激動劑變異體上游離氨基摩爾量的活化聚乙二醇。另一方面，當(dāng)hGH或其激動劑變異體上的反應(yīng)性氨基酸殘基具有自由羧基時，優(yōu)選在pH約3.5-5.5下進(jìn)行上述修飾，例如，于4-37℃，在碳二酰亞胺(pH3.5-5)的存在下，用聚(氧乙二胺)進(jìn)行修飾1-24小時?？刹捎?.05-300倍于hGH或其激動劑變異體上游離羧基摩爾量的活化聚乙二醇。
在獨立的實施方案中，綴合反應(yīng)中聚合物的上限約超過1∶1，這樣活化聚合物與hGH或其激動劑變異體有可能不形成大量高分子物，即約20％以上的綴合物中含有約一個以上的聚合物鏈(每分子hGH或其激動劑變異體)。例如，在本發(fā)明這方面中，采用高至約6∶1的比例，可形成大量的并能隨后從任何高分子物中分離出來的所需綴合物。
在本發(fā)明的另一方面中，可采用雙官能活化的PEG衍生物產(chǎn)生聚合性的hGH或其激動劑變異體-PEG分子，其中多個hGH或其激動劑變異體分子經(jīng)PEG交聯(lián)。盡管在此描述的反應(yīng)條件能產(chǎn)生大量未修飾的hGH或其激動劑變異體，這些未修飾的hGH或其激動劑變異體很容易回收供另一批綴合反應(yīng)使用。令人驚奇地是，本發(fā)明方法產(chǎn)生了非常少的(少于約30％和更優(yōu)選少于約10％)高分子物，及包含一個以上的聚合物鏈(每hGH或其激動劑變異體)的高分子物。這些反應(yīng)條件不同于典型地用于聚合綴合反應(yīng)的條件，其中活化的聚合物的量幾倍摩爾過量于靶物。在本發(fā)明的其它方面中，聚合物的量約為每當(dāng)量hGH或其激動劑變異體0.1/氨基-50當(dāng)量。在本發(fā)明的其它方面中，聚合物的量約為每當(dāng)量hGH或其激動劑變異體1-10當(dāng)量。
本發(fā)明綴合反應(yīng)最初提供反應(yīng)混合物或池(pool)，其中含有單-和二-PEG-hGH綴合物、未反應(yīng)的hGH、未反應(yīng)的聚合物和通常約少于20％高分子物。高分子物包括包含一種以上的聚合物鏈和/或聚合的PEG-hGH或其激動劑變異體的綴合物。待除去未反應(yīng)的物質(zhì)和高分子物后，得到主要包含單-和二-聚合物-hGH或其激動劑變異體綴合物的組合物。當(dāng)綴合物大部分包括單聚合物鏈時，所述綴合物是基本上同質(zhì)的。采用標(biāo)準(zhǔn)化FDC-P1細(xì)胞增殖分析法(Clark等，Journal of Biological Chemistry27121969-21977，1996)、受體結(jié)合分析法(US5,057,417)或測定垂體切除的小鼠的生長(Clark等，Journal of Biological Chemistry 27121969-21977，1996)，測得這些修飾后的hGH或其激動劑變異體至少具有天然或未修飾的hGH或其激動劑變異體體外生物活性的0.1％。然而，在本發(fā)明的優(yōu)選方面，更優(yōu)選修飾后的hGH或其激動劑變異體具有約25％的體外生物活性，更優(yōu)選修飾后的hGH或其激動劑變異體具有約50％的體外生物活性，更優(yōu)選修飾后的hGH或其激動劑變異體具有約75％的體外生物活性，和最優(yōu)選修飾的hGH或其激動劑變異體具有相等或改善的體外生物活性。
本發(fā)明方法優(yōu)選包括使用限定比例的聚合物和hGH或其激動劑變異體。這樣，hGH或其激動劑變異體綴合物主要限于含有一個聚合物鏈的綴合物。此外，與所用的高摩爾過量的聚合物連接基相比，聚合物與hGH或其激動劑變異體反應(yīng)基的結(jié)合的隨機性基本上更低。淬滅綴合反應(yīng)后，采用離子交換作用或篩析層析或類似的分離技術(shù)，回收反應(yīng)池中未修飾的hGH或其激動劑變異體，供將來反應(yīng)使用。
可采用用于純化蛋白質(zhì)的常規(guī)方法，例如透析法、鹽析、超濾、離子交換層析、疏水作用層析(HIC)、凝膠層析和電冰法，從反應(yīng)混合物中純化出本發(fā)明聚乙二醇-修飾的hGH或其激動劑變異體(即化學(xué)修飾的蛋白質(zhì))。在除去未反應(yīng)的聚乙二醇和hGH或其激動劑變異體方面，離子交換層析尤其有效。在本發(fā)明的另一實施方案中，從反應(yīng)混合物中除去高分子物和未修飾的hGH或其激動劑變異體，從而分離出單-和二-聚合物-hGH或其激動劑變異體。將混合物置于包含約0.5-10mg/mL的hGH或其激動劑變異體-聚合物綴合物的緩沖溶液中，進(jìn)行分離。適宜溶液的pH約為4-8。所述溶液優(yōu)選包含一種或更多緩沖鹽，選自KCl、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、NaHCO3、NaBO4、CH3CO2H和NaOH。
根據(jù)反應(yīng)緩沖液的不同，可首先將hGH或其激動劑變異體聚合物綴合物溶液進(jìn)行緩沖液交換/超濾，以除去任何未反應(yīng)的聚合物。例如，PEG-hGH或其激動劑變異體綴合物溶液經(jīng)低截流分子量膜(10,000-30,000道爾頓)超濾，除去可能存在的最不需要的物質(zhì)例如未反應(yīng)的聚合物、表面活性劑等。
優(yōu)選地，采用離子交換層析介質(zhì)，將綴合物分級收集到含有所需物質(zhì)的池中。這種介質(zhì)能通過電荷差異選擇性地結(jié)合PEG-hGH或其激動劑變異體綴合物，所述電荷差異以某種可預(yù)測的方式變化。例如，通過測定蛋白質(zhì)表面上的荷電基團(tuán)數(shù)量，可測定hGH或其激動劑變異體的表面電荷。這些荷電基典型地作為聚(環(huán)氧烷烴)聚合物的潛在結(jié)合點。hGH或其激動劑變異體綴合物的電荷不同于另一物質(zhì)，因此可以實施選擇性分離。
本發(fā)明方法可采用強極性陰離子或陽離子交換樹脂(例如季胺或磺丙基樹脂)。尤其優(yōu)選離子交換樹脂。適于本發(fā)明的市售陽離子交換樹脂包括但不限于SP-hitrap、SP Sepharose HP；和SP Sepharose速流。也可使用其它適宜的陽離子交換樹脂例如S和CM樹脂。適于本發(fā)明的市售陰離子交換樹脂包括但不限于Q-hitrap，Q Sepharose Hp和Q Sepharose速流。也可使用其它適宜的陰離子交換樹脂例如DEAE樹脂。
例如，陰離子或陽離子交換樹脂優(yōu)選包裝于柱中并經(jīng)常規(guī)方法平衡?？刹捎门c聚合物綴合的hGH或其激動劑變異體溶液之pH和滲透壓相同的緩沖劑。洗脫緩沖劑優(yōu)選包含一種或更多鹽類，其選自KCl、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4、NaHCO3、NaBO4和(NH4)2CO3。然后，將含綴合物的溶液吸附到不存留未反應(yīng)聚合物和某些高分子物的柱子上。負(fù)載后，對柱子施以梯度流(鹽濃度遞增)的洗脫緩沖劑，以洗脫所需的聚環(huán)氧烷烴-綴合的hGH或其激動劑變異體級分。優(yōu)選地，經(jīng)陽離子或陰離子交換分離步驟后，洗脫出的級分限于均一的聚合物綴合物。然后，采用常規(guī)方法，從柱中洗滌出任何未綴合的hGH或其激動劑變異體。如有需要，可采用額外的離子交換層析或篩析層析，進(jìn)一步對單和多PEG化的hGH或其激動劑變異體進(jìn)行分離。
也可使用增加鹽濃度或pH的多步驟等度洗脫技術(shù)。漸增濃度的多步等度洗脫將對二-和一-hGH或其激動劑變異體-聚合物軛合物進(jìn)行連續(xù)洗脫。
洗脫的溫度范圍約為4-25℃。優(yōu)選地，在約4-22℃的溫度下進(jìn)行洗脫。例如，PEG-hGH或其激動劑變異體餾份的洗脫物檢測于280nm處的UV吸光度?？赏ㄟ^簡單的時間洗脫圖收集餾份。
可在聚乙二醇聚合物與hGH或其激動劑變異體部分的綴合方法中使用表面活性劑。適宜的表面活性劑包括離子型表面活性劑，例如十二烷基硫酸鈉(SDS)。也可使用其它離子型表面活性劑，例如十二烷基硫酸鋰，季銨化合物，?；悄懰幔了?，癸烷磺酸等。也可使用非離子型表面活性劑。例如，可使用聚氧乙烯脫水山梨醇(Tweens)、聚氧乙烯醚(Tritons)。參見Neugebauer，A Guide to the Properties and Usesof Detergents in Biology and Biochemistry(1992)，Calbiochem公司。本發(fā)明方法對表面活性劑的唯一限定是應(yīng)在不引起hGH或其激動劑變異體實質(zhì)上的不可逆變性作用和不完全抑制聚合物綴合的的濃度和條件下使用。反應(yīng)混合物中表面活性劑的用量約為0.01-0.5％；優(yōu)選0.05-0.5％；和最優(yōu)選約為0.075-0.25％。也可采用表面活性劑的混合物。
據(jù)信，表面活性劑可在聚合物的綴合過程中提供暫時性、可逆性的保護(hù)系統(tǒng)。已經(jīng)證明表面活性劑能有效選擇性阻止聚合物聚集，使以賴氨酸為基礎(chǔ)的或氨基端為基礎(chǔ)的綴合得以進(jìn)行。
本發(fā)明聚乙二醇-修飾的hGH或其激動劑變異體具有更持久的藥理學(xué)作用，這可能歸因于其延長的體內(nèi)半衰期。
此外，本發(fā)明聚乙二醇-修飾的hGH或其激動劑變異體可用于治療垂體機能不足性侏儒癥(GHD)，成人生長激素缺乏，Turner綜合癥，胎齡(SGA)不足的兒童生長不足，普-拉-威綜合癥(PWS)，慢性腎功能不全(CRI)，艾滋衰竭和衰老。
為了便于患者施用，可將本發(fā)明聚乙二醇修飾的hGH或其激動劑變異體配制成藥劑，其中也可含有藥用稀釋劑、調(diào)節(jié)溶液等滲的物質(zhì)和pH調(diào)節(jié)劑。
可根據(jù)治療目的，經(jīng)皮下、肌注、靜脈注射、肺部、皮內(nèi)或口服施用上述藥劑。也可根據(jù)要治療的患者病癥的種類和狀況確定劑量，正常地，成人經(jīng)注射施用0.1mg-5mg和口服0.1mg-50mg。
所用的聚合物也優(yōu)選為在室溫下水溶性的。這種聚合物的非限定性示例包括聚(環(huán)氧烷烴)均聚物，例如聚乙二醇或聚(丙二醇)，聚(氧乙烯化多元醇)及其共聚物和嵌段共聚物，條件是是嵌段共聚物保持水溶性。
有效的非抗原性物質(zhì)也可用來替代以PEG為基礎(chǔ)的聚合物，例如可使用葡聚糖，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(丙烯酰胺)，聚(乙烯醇)，以糖類為基礎(chǔ)的聚合物等。實際上，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是，可采用類似于轉(zhuǎn)化聚(環(huán)氧烷烴)的方式，對這些聚合物中α-和ω-端基進(jìn)行活化。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將領(lǐng)會到上述示例僅僅用于示例說明，可采用所有具有在此描述性質(zhì)的聚合物。在本發(fā)明中，“有效的非抗原性”是指所有材料在本領(lǐng)域中應(yīng)理解為對哺乳動物無毒且不誘發(fā)可觀察到的免疫原反應(yīng)。
以下為縮略語及其可互換使用的相應(yīng)含義列表g 克mg 毫克ml或mL 毫升RT 室溫PEG聚乙二醇本說明書中提及的所有出版物、專利或?qū)＠暾埖娜績?nèi)容均在此引用作為參考，就好象每一出版物、專利、專利申請均特定和獨立地被引入作為參考。
盡管出于清楚領(lǐng)會之目的，已通過示例說明和實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)描述。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在本發(fā)明的教導(dǎo)下可實施并不偏離本發(fā)明精神和范疇的改進(jìn)和變化。以下實施例旨在示例說明，對業(yè)已通過較寬泛術(shù)語描述的本發(fā)明范圍沒有限制作用。
在以下實施例中，hGH是SEQ ID NO1的hGH。可以領(lǐng)會的是，可采用類似于后續(xù)實施例中的示例方式，對多肽hGH或其激動劑變異體家族的其它成員進(jìn)行PEG化。
在此引用的所有參考、專利或?qū)＠暾?，其全部?nèi)容引入作為參考。
以下實施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，所述實施例不應(yīng)認(rèn)為是對本實施例1直鏈20,000MW PEG-ALD hGH
該實施例說明了經(jīng)還原性烷基化作用生產(chǎn)基本上同質(zhì)的N-端單PEG化的hGH制劑的方法。利用N-端上伯胺的相對pKa值與賴氨酸殘基上ε-氨基位置pKa值之間的差異，約20,000MW的甲氧基-線性PEG-丙醛試劑(Shearwater公司)經(jīng)還原性氨基化反應(yīng)與hGH的氮端選擇性結(jié)合。將hGH蛋白溶于25mM的MESpH6.0(Sigma Chemical公司，St.Louis，MO)、25mM HepespH7.0(Sigma Chemical公司，St.Louis，MO)、或溶于10mM醋酸鈉pH4.5(Sigma Chemical公司，St.Louis，MO)中，濃度為10mg/mL，加入甲氧基-PEG-ALD(任選可加入8％乙腈)，使hGH蛋白與甲氧基-PEG-丙醛(M-PEG-ALD，Shearwater公司，Huntsville，AL)反應(yīng)，使PEG∶hGH的相對摩爾比為每胺0.1∶0.7。通過添加1M的NaCNBH4貯備液(Sigma Chemical公司，St.Louis，MO)催化反應(yīng)，溶于H2O中，終濃度為10-50mM。反應(yīng)在黑暗中進(jìn)行18-24小時(4℃至室溫)。加入1M的Tris pH約7.6(Sigma Chemical公司，St.Louis，MO)，停止反應(yīng)。Tris的終濃度為50mM或用供直接純化的適當(dāng)緩沖劑稀釋。
實施例2直鏈30,000MW PEG-ALD hGH按照實施例1描述的方法，甲氧基-線性30,000MW PEG丙醛試劑(Shearwater公司)與hGH的N-端結(jié)合。
實施例3直鏈5,000MW PEG-ALD hGH按照實施例1描述的方法，甲氧基-線性5,000MW PEG-丙醛試劑(Fluka)與hGH的N-端結(jié)合。
實施例4支鏈40,000MW PEG-ALD hGH
按照實施例1描述的方法，甲氧基-支鏈40,000MW PEG醛(PEG2-ALD)試劑(Shearwater公司)與hGH的N-端結(jié)合。
實施例5支鏈20,000MW PEG-ALD hGH甲氧基-支鏈20,000MW PEG-醛(PEG2-ALD)試劑(Shearwater公司)按照實施例1描述的方法，與hGH的N-端結(jié)合，其中PEG與hGH的摩爾比率為0.1-0.5每胺。
實施例6直鏈30,000MW SPA-PEG hGH 該實施例說明了采用N-羥基琥珀酰亞胺基(NHS)活性酯生產(chǎn)基本上同質(zhì)的單PEG化hGH制劑的方法。hGH蛋白儲備溶液溶解于pH7.20的.25M HEPE緩沖液中(任選也可加入8％乙腈)，濃度為10mg/mL。然后，加入SPA-PEG產(chǎn)生PEG∶hGH的相對摩爾比為每胺0.1-0.65，使溶液與甲氧基-PEG-琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA-PEG)反應(yīng)。反應(yīng)于4℃至室溫下進(jìn)行5分鐘至1小時。用0.1N醋酸或加入5X摩爾過量的Tris HCl使pH降低到4.0，從而停止反應(yīng)。
實施例7直鏈20,000MW SPA-PEG hGH按照實施例6描述的方法，直鏈20,000MW SPA-PEG試劑Shearwater公司)與hGH的N-端結(jié)合。
實施例8直鏈3,400MW生物素-SPA-PEG-hGH 按照實施例描述6的方法，3,400MW生物素-PEG-CO2-NHS反應(yīng)物(Shearwater公司)與hGH結(jié)合。
實施例9支鏈10,000MW NHS-PEG-hGH 按照實施例6描述的方法，10,000MW支鏈PEG2-NHS(Shearwater公司)與hGH結(jié)合。
實施例10
支鏈20,000MW NHS-PEG-hGH按照實施例6描述的方法，20,000MW支鏈PEG2-NHS(Shearwater公司)與hGH結(jié)合。
實施例11支鏈40,000MW NHS-PEG-hGH按照實施例6描述的方法，40,000MW支鏈PEG2-NHS(Shearwater公司)與hGH結(jié)合。
實施例12直鏈20,000MW PEG-BTC-hGH 按照實施例6描述的方法，20,000MW PEG-BTC(Shearwater公司)與hGH結(jié)合。該實施例說明了采用PEG的苯并三唑碳酸酯衍生物生產(chǎn)基本上同質(zhì)的PEG化hGH制劑的方法。
實施例13直鏈5000MW PEG-SS-hGH 按照實施例描述6的方法，5,000MW琥珀酰亞胺基琥珀酸酯-PEG(SSPEG)(Shearwater公司)與hGH結(jié)合。該實施例說明了采用可水解連接生產(chǎn)基本上同質(zhì)的PEG化hGH制劑的方法。
實施例14
直鏈20,000MW PEG-CM-HBA-hGH 按照實施例6描述的方法，20,000MW羧甲基羥丁酸-PEG(CMHBA-PEG)(Shearwater公司)與hGH結(jié)合。該實施例說明了采用可水解連接生產(chǎn)基本上同質(zhì)的PEG化hGH制劑的方法。
實施例15直鏈2-4x 5,000MW PEG-CM-HBA-hGH按照實施例13描述的方法，5,000MW PEG-CM-HBA(Shearwater公司)與hGH結(jié)合。
實施例16直鏈20,000MW HZ-PEG hGH PEG-OCH2CONHNH2該實施例說明了采用20,000MW甲氧基-PEG-酰肼(HZ-PEG，Shearwater公司)生產(chǎn)基本上同質(zhì)的PEG化hGH制劑的方法。將hGH蛋白儲備液溶于10mM的MES(pH4.0)中，濃度為10mg/mL。然后，加入固體產(chǎn)生PEG∶hGH的相對摩爾比為每羧基0.1-5.0，使該溶液與HZ-PEG反應(yīng)。反應(yīng)用終濃度為2mM-4mM的碳二亞胺(EDC、EOAC、EDEC)催化。反應(yīng)于4℃進(jìn)行2小時至過夜，或于室溫進(jìn)行10分鐘至過夜。通過陽離子交換純化，除去未結(jié)合的PEG和碳二亞胺，使反應(yīng)停止。
實施例17多PEG化的種類由實施例1和4分別獲得連接有兩或更多PEG(多PEG化)的修飾hGH，并采用陰離子交換層析將其從單PEG化綴合物中分離出來。采用陽離子交換色層分離法，也可從單PEG化綴合物分離出連接有兩或更多PEG(多PEG化)的修飾的hGHs。
由2、3、5-13實施例中獲得連接有兩或更多PEG(多PEG化)的修飾hGHs，并按似于實施例1和4的方式純化。
實施例18PEG化hGH的純化采用單步離子交換層析，將PEG化的hGH種類從反應(yīng)混合物中分離出來(SEC分析)達(dá)到＞95％。
陰離子交換層析采用單步陰離子交換層析，將PEG hGH綴合物從反應(yīng)混合物中分離出來(SEC分析)，達(dá)到＞95％。采用陰離子交換層析，從未修飾的hGH和多-PEG化的hGH種類中純化出單-PEG化的hGH。如上所述，采用pH7.3的25mM HEPES(緩沖劑A)平衡的Q Sepharose Hitrap柱(1或5mL)(Amersham Pharmacia Biotech公司，Piscataway，NJ)或Q-Sepharose速流柱(26/20，70mL柱床體積)(Amersham PharmaciaBiotech公司，Piscataway，NJ)，對典型的20K醛hGH反應(yīng)混合物(5-100mg蛋白質(zhì))進(jìn)行純化。反應(yīng)混合物用緩沖劑A稀釋5-10倍，并以2.5mL/分鐘的流速負(fù)載到柱上。用8倍柱體積的緩沖劑A沖洗柱。接著，以80-100倍柱體積的緩沖劑A和0-100mM的線性NaCl梯度將各種hGH從柱中洗脫出來。于280nm處(A280)監(jiān)測洗脫液，并收集5mL的級分。根據(jù)PEG化的程度(例如單、二、三PEG化等，如實施例15的評估)收集級分。然后，在Centriprep YM10濃縮器(Amicon，TechnologyCorporation，Northborough，MA)中，濃縮收集物至0.5-5mg/mL。于280nm測定富集的蛋白質(zhì)濃度(吸光系數(shù)0.78)。該方法純化的單20K-醛hGH的總收率為25-30％。
陽離子交換層析在用pH4.0的10mM醋酸鈉(緩沖劑B)平衡的SP Sepharose高效柱(Pharmacia XK 26/20，70ml柱床體積)上，進(jìn)行陽離子交換層析。反應(yīng)混合物用緩沖劑B稀釋10倍，并以5mL/分鐘的流速負(fù)載到柱上。接著，用5倍柱體積的緩沖劑B，然后5倍柱體積的12％緩沖劑C(10nM醋酸鹽pH4.5，1M的NaCl)順序沖洗柱。接著，PEG-hGH從柱中洗脫出來(線性梯度為12-27％的20倍柱體積的緩沖劑C)。于280nm處監(jiān)測洗脫液，并收集10mL的級分。根據(jù)PEG化的程度(單、二、三等)收集級分，交換到10mM醋酸鹽緩沖劑(pH4.5)中，并在裝有Amicon YM 10膜的攪拌池中濃縮到1-5mg/mL。于280nm測定富集的蛋白質(zhì)濃度(吸光系數(shù)0.78)。該方法的單PEG化hGH的總收率為10-50％。
實施例19生物化學(xué)表征采用還原和非還原性SDS-PAGE、非變性和變性篩析層析、分析用陰離子交換層析、N端序列測定、疏水作用層析和反相HPLC，對純化的PEG化hGH進(jìn)行了表征。
大小排阻高效液相層析(SEC-HPLC)非變性SEC-HPLC采用非變性SEC-HPLC，對各種結(jié)合化合性質(zhì)(chemistry)、大小、連接子和幾何形狀的甲氧基-PEG與hGH的反應(yīng)、陰離子交換純化富集物和最終純化產(chǎn)品進(jìn)行評價。采用Tosohaas G4000PWXL柱，7.8mm×30cm(Tosohaas Amersham Bioscience公司，Piscataway，NJ)或Superdex200(Amersham Bioscience公司，Piscataway，NJ)在20mM磷酸鹽pH7.2，150mM的NaCl中以流速0.5mL/分鐘，進(jìn)行非變性SEC-HPLC分析。PEG化極大地提高了蛋白質(zhì)的流體動力學(xué)體積，使其移位至較早的保留時間。在PEG醛hGH反應(yīng)混合物中觀察到了新物種和未修飾的hGH。采用Q-Sepharose層析分離這些PEG化和未PEG化的物質(zhì)，并且所得純化的單PEG醛hGH綴合物在非變性SEC上以單峰洗脫出(＞95純度)。采用Q-Sepharose層析步驟，可有效地從單-PEG化hGH中除去游離的PEG、hGH和多PEG化的hGH。非變性SEC-HPLC證明各種PEG化hGH的有效粒度大于其相應(yīng)的理論分子量很多(表1)。
表1粒度排阻層析(SEC)
變性SEC-HPLC采用變性SEC-HPLC，對各種甲氧基-PEG與hGH的反應(yīng)、陰離子交換純化物和最終純化產(chǎn)品進(jìn)行了評價。采用Tosohaas 3000SWXL柱，7.8mm×30cm(Tosohaas Pharmcia Biotech公司，Piscataway，NJ)在pH6.8的10mM磷酸鹽，0.1％SDS中，以流速0.8mL/分鐘，進(jìn)行變性SEC-HPLC分析。PEG化極大地提高了蛋白質(zhì)的流體動力學(xué)體積，使其移位至較早的保留時間。在20K PEG醛hGH反應(yīng)混合物中觀察到了新種類和未修飾的hGH。采用Q-Sepharose層析分離這些PEG化和未PEG化的物質(zhì)，接著所得純化的單20K PEG醛hGH綴合物在變性SEC上以單峰洗脫出(＞95純度)。采用Q-Sepharose層析步驟，可有效地從單-PEG化hGH中除去游離的PEG、hGH和多PEG化的hGH。
SDS PAGE/PVDF遷移采用SDS-PAGE，對各種PEG試劑與hGH的反應(yīng)和純化的最終產(chǎn)品進(jìn)行了評價。采用單20K線性和支鏈20K和40K PEG醛和4×6 5K SPA PEG，對這種技術(shù)作了示例(圖1和2)。在還原和非還原條件下，用NovexColloidal CoomassieTMG-250染色試劑盒(Invitrogen，Carlsbad CA)染色，在1mm厚的10-20％ Tris N-三(羥甲基)甲基甘氨酸凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)上進(jìn)行SDS-PAGE。純化的單PEG-醛hGH是SDS-PAGE上的主要遷移帶。將遷移帶點到PVDF膜上，供隨后N-末端序列測定。
分析性陰離子交換HPLC采用分析性陰離子交換HPLC，評價了各種mPEG與hGH的反應(yīng)、陰離子交換純化級分和最終的純化產(chǎn)品。采用Tosohaas Q5PW或DEAE-PW陰離子交換柱，7.5mm×75mm(Tosohaas Pharmacia Biotech公司，Piscataway，NJ)在50mM Tris pH8.6，以流速1mL/分鐘，進(jìn)行分析性陰離子交換HPLC。用5-200mM線性梯度的NaCl洗脫試樣。
反相HPLC(RP HPLC)采用RP-HPLC分析PEG-GH反應(yīng)混合物和純化的PEG化產(chǎn)品，來說明hGH種類、單和多PEG化的hGH種類，并監(jiān)測氧化的hGH形式以及在不同位點(例如N-端或賴氨酸ε-氨基)結(jié)合有單PEG的PEG hGH異形體，采用Zorbax SB-CN 150或250mm×4.6mm(3.5mm或5mm)反相HPLC柱，進(jìn)行RP-HPLC。實驗在室溫中進(jìn)行，典型載樣量為10mg蛋白質(zhì)/試樣。緩沖劑A是在水中的0.1％三氟乙酸；緩沖劑B是在乙腈中的三氟乙酸。以每分鐘增加％B的梯度如下
步驟時間流速％A％B步驟00 1 60 40 013 1 60 40 0220 1 50 50 132 1 60 40 146 1 60 40 0N-端序列和肽圖采用自動Edman降解化學(xué)法測定NH2-端蛋白序列。采用AppliedBiosystems 494型Procise序列測定儀(Perkin Elmer公司，WellesleyMA)降解。采用配有Perkin Elmer/Brownlee 2.1mm的AppliedBiosystems 140 C型PTH分析儀(PTH-C18柱，同上)，通過在線方式RP-HPLC分析，確定各個PTH-AA衍生物。對轉(zhuǎn)移至到PVDF膜上的20K線性和20和40K支鏈PEG-ALD hGH蛋白質(zhì)帶、或純化的20K線性和支鏈20和40K PEG-ALD hGH的溶液進(jìn)行了測序。純化的20K線性PEG-hGH產(chǎn)生了主要信號(約88％收率)，并觀察到其具有預(yù)期的hGH序列，但是沒有氮端氨基酸。該結(jié)果與經(jīng)醛化學(xué)法對蛋白質(zhì)N-端PEG化的預(yù)測一致。與PEG部分結(jié)合的第一個環(huán)的殘基是不可恢復(fù)的。較少的信號(約12％收率)具有適當(dāng)?shù)陌被税被嵝蛄?。由于RP-HPLC采集的峰是100％PEG化的，這些資料表明約88％的PEG修飾發(fā)生在N-端，其余的則與幾種可能的賴氨酸殘基中的一種顯然相關(guān)。
在1mg/mL的濃度下進(jìn)行胰蛋白酶消化，每一消化典型地使用50μg材料。加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶與PEG-hGH的比例為1∶30(w/w)。Tris緩沖劑的濃度為30mM和pH為7.5。試樣在室溫下保溫16±0.5小時。加入每mL消化溶液50μL的1N HCl，淬滅反應(yīng)。在裝入自動取樣器之前，將試樣稀釋，終濃度為0.25mg/ml(在6.25％乙腈中)。首先加入乙腈(至19.8％乙腈)，溫和地混合，然后用水加至終體積(4倍于起始體積)。除去額外的消化溶液，并于-20℃貯藏1周。
采用Waters Alliance 2695 HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析，但是其它系統(tǒng)的結(jié)果也類似。所用的柱子是Astec C-4聚合的具有5μm粒子25cm×4.6mm柱。實驗在室溫中進(jìn)行，典型載樣量為50μg蛋白質(zhì)/試樣。緩沖劑A在水中的0.1％三氟乙酸；緩沖劑B是在乙腈中的0.085％三氟乙酸。梯度如下時間 A％B％C％D％ 流速曲線0.000.00.0100.0 0.0 1.000190.00.00.055.045.01.000690.10 0.00.00.0 100.0 1.000691.00 0.00.00.0 100.0 1.000691.10 0.00.0100.0 0.0 1.000695.00 0.00.0100.0 0.0 1.0006用加熱夾套將柱子加熱到40℃。采用Waters 996 PDA檢測器收集210-300nm間的數(shù)據(jù)，檢測峰。214nm處的萃取層析圖用于試樣分析，以測定N-端PEG化的程度(T-1片段損失)，如表2所示。
表2試樣％T-1存在％T-1損失 ％ T-1存在(相對于對照)醛5K ALD 2.0 98.07.420K 0.0 100.0 0.02×20K 0.0 100.0 0.030K 1.3 98.74.540K支鏈 1.9 98.16.8NHS4-6×5SPA1.3 98.7 4.72-4×5CM 0.0 100.0 0.030K 23.176.9 84.12×30K 18.281.8 63.940K 5.7 94.3 19.9支鏈 20.979.1 73.5
實施例20藥效學(xué)研究對垂體切除鼠的效力研究對在Harlan試驗室中切除垂體的雌性Sprague Dawley大鼠進(jìn)行7-10天生長率的預(yù)篩。接著，進(jìn)行為期11天的生長研究。鼠被分成6-8個組。第1組鼠每日或第0天和第6天皮下給予載體。第2組每日皮下給予GH(0.3mg/kg/劑量)。第3組于第0天和第6天皮下給予GH(1.8mg/kg/劑量)。第4組于第0、6天皮下給予PEG-GH(1.8mg/kg/劑量)。
研究期間，鼠至少每隔一天稱重一次，監(jiān)測垂體切除鼠的體重增加。每周施用一次的20K PEG-ALD hGH、20K和40K支鏈PEG-ALD hGH、和4-6x 5PEG-SPA hGH的體重增加(均值±SEM)，與每日施用hGH的結(jié)果類似(圖3和4)。表3概述了每周施用各種PEG化hGH分子的相對于每日施用hGH的動物于11天時的總體重增加(均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SEM))。
表3鼠體重增加
完成生長研究后，處死動物并分析其骨(脛骨)長度。圖6為在第0天和6天施用各種PEG-GH綴合物或每日施用hGH后的第11天時的脛骨長度變化脛骨(均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。
垂體切除鼠中的IGF-1水平同上述體重增加研究一樣，測定IGF-1水平，但于第0、1、2、3、4、5天取血液試樣，并于第9天處死動物。采用ELISA測定IGF-1水平。圖7比較在每日給予hGH或單劑量hGH或于第0、6天給予PEG化人生長激素后，垂體切除鼠的血清IGF-1水平增加(均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。藥代動力學(xué)研究在正常Sprague-Dawley雄性大鼠、小鼠和短尾猴中，進(jìn)行藥代動力學(xué)研究。配制注射劑，單一皮下注射1.8mg/kg，或單一靜脈注射1.0mg/kg GH或PEG-GH，每組6只大鼠和多達(dá)60只小鼠。對于短尾猴，單劑量皮下濃注和靜脈注射0.18mg/kg GH或PEG-GH，每組2-4只猴。視情況而定，于1-5天取血液試樣，供有關(guān)的PK系數(shù)分析(表4)。
(t1/2)＝終半衰期，(Cl)＝清除率，(Tmax)＝達(dá)最高濃度的時間，Vss＝穩(wěn)態(tài)時的體積分布(表觀)，和(Cmax)＝采用免疫分析法測定的每一試樣最高GH和PEG-GH濃度血液水平。
HGH免疫分析采用hGH AutoDELFIA試劑盒熒光免疫測定技術(shù)(PerkinElmer LifeSciences)，以適當(dāng)?shù)腜EG hGH制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定大鼠、小鼠和短尾猴血漿中的hGH和PEG化hGH蛋白質(zhì)濃度水平。
表4
序 列 表<110> Pharmacia CorporationFinn，RoryLiao，WeiSiegel，Ned<120> 化學(xué)修飾的人生長激素綴合物<130> 03582/1/PCT<150> US 60/331907<151> 2001-11-20<160> 1<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 191<212> PRT<213> 人(homo sapiens)<400> 1Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asp Ala Met Leu Arg1 5 10 15Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu20 25 30Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asp Pro35 40 45Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asp Arg50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asp Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65 70 75 80Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Ser Leu Arg Ser Val85 90 95Phe Ala Asp Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asp Val Tyr Asp100 105 110Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu115 120125Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser130 135 140Lys Phe Asp Thr Asp Ser His Asp Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asp Tyr145 150 155 160Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe165 170 175Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 190
權(quán)利要求
1.包括至少一種水溶性聚合物分子的綴合物，所述聚合物與生物活性人生長激素(hGH)多肽或其激動劑變異體的至少一個氨基酸殘基共價連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的綴合物，其中所述人生長激素多肽包括SEQ IDNO1氨基酸順序。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的綴合物，其中所述聚合物是聚氧乙烯分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的綴合物，其中所述聚氧乙烯分子是聚乙二醇分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的綴合物。其中聚乙二醇與具有游離氨基、羧基或巰基的氨基酸殘基連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的綴合物，采用活化的聚乙二醇形成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的綴合物，其中所述活化的聚乙二醇包括官能團(tuán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的綴合物，其中所述連接在具有游離氨基的氨基酸上。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的綴合物，其中所述官能團(tuán)選自碳酸酯、羰咪唑、羧酸的活性酯、二氫唑酮、環(huán)二酰亞胺硫酮、異氰酸酯或異硫氰酸酯、亞氨酸酯和醛。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的綴合物，其中所述官能團(tuán)碳酸酯或羰咪唑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的綴合物，其中所述活化的聚乙二醇選自 和
12.根據(jù)權(quán)利要求11的綴合物，具有以下結(jié)構(gòu) 其中R是人生長激素多肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的綴合物，其中所述人生長激素多肽包括SEQID NO1氨基酸順序。
14.根據(jù)權(quán)利要9求的綴合物，其中所述官能團(tuán)是環(huán)二酰亞胺硫酮。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的綴合物，其中所述活化的聚乙二醇選自 和 其中L選自-O-，-NH-，-OCH2-，-NH-CO(CH2)n，-NH-CO(CH2)nO-，-CO-NH(CH2)n-，-S-，-CO-NH(CH2)nO-，-O(CH2)NO-，-O(CH2)n-，-SCH2CH2-，和-NH(CH2)n-。
16.根據(jù)權(quán)利要求9的綴合物，其中所述官能團(tuán)是二氫唑酮。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的綴合物，其中所述活化的聚乙二醇選自 和 其中R1選自氫，烷基，環(huán)烷基，碳環(huán)和雜環(huán)芳環(huán)，α，β-不飽合烷基；和R2和R3獨立地選自氫，烷基，芳基和烷基芳基。
18.根據(jù)權(quán)利要求9的綴合物，其中所述官能團(tuán)是異氰酸酯或異硫氰酸酯。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的綴合物，其中所述活化的聚乙二醇選自mPEG-N＝C＝O，和mPEG-N＝C＝S。
20.根據(jù)權(quán)利要求9的綴合物，其中所述官能團(tuán)是醛或水合醛。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的綴合物，其中所述活化的聚乙二醇選自 和
22.根據(jù)權(quán)利要求9的綴合物，其中所述官能團(tuán)是羧酸的活性酯。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的綴合物，其中所述活化的聚乙二醇選自
24.根據(jù)權(quán)利要求23的綴合物，具有選自以下的結(jié)構(gòu) 其中R是人生長激素多肽。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的綴合物，其中所述人生長激素多肽包括SEQID NO1氨基酸順序。
26.根據(jù)權(quán)利要求9的綴合物，其中所述活化的聚乙二醇選自mPEG-O-SO2-CH2CF3，和
27.根據(jù)權(quán)利要求2 6的綴合物，具有選自以下的結(jié)構(gòu)PEG-NH-R，和 其中R是人生長激素多肽。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的綴合物，其中所述人生長激素多肽包括SEQID NO1氨基酸順序。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的綴合物，其中所述官能團(tuán)是亞氨酸酯。
30.根據(jù)權(quán)利要求9的綴合物，其中所述活化的聚乙二醇選自 其中m是0-20，和， 其中R1是烷基，苯基，苯基烷基，和環(huán)烷基。
31.根據(jù)權(quán)利要求9的綴合物，其中所述游離氨基是氨基端α-氨基。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的綴合物，其中所述氨基端α-氨基位于苯丙氨酸上。
33.根據(jù)權(quán)利要求8的綴合物，其中所述連接在具有游離羧基的氨基酸上。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的綴合物，其中所述官能團(tuán)選自伯胺；肼；和酰肼官能團(tuán)。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的綴合物，其中所述官能團(tuán)選自mPEG-CH2CH2-NH2，mPEG-O-CH2-CO-NH-NH2， 和
36.根據(jù)權(quán)利要求8的綴合物，其中所述連接在具有游離巰基的氨基酸上。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的綴合物，其中所述官能團(tuán)選自巰基；馬來酰亞胺；乙烯基砜；和苯乙二醛。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的綴合物，其中所述官能團(tuán)選自 和
39.根據(jù)權(quán)利要求38的綴合物，具有選自以下的結(jié)構(gòu) 和mPEG-S-S-R其中R是人生長激素多肽。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的綴合物，其中所述人生長激素多肽包括SEQID NO1氨基酸順序。
41.根據(jù)權(quán)利要求8的綴合物，其中所述聚乙二醇的分子量約為0.5kD-100kDa。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的綴合物，其中所述聚乙二醇分子量約為的5kD-40kDa。
43.根據(jù)權(quán)利要求8的綴合物，其中所述聚乙二醇是分枝聚合物。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的綴合物，其中所述分枝聚合物選自
45.具有以下結(jié)構(gòu)的人生長激素-PEG綴合物 其中R是人生長激素多肽。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的綴合物，其中所述人生長激素多肽包括SEQID NO1氨基酸順序。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的綴合物，其中至少80％的所述聚乙二醇與氨基端苯丙氨酸綴合。
48根據(jù)權(quán)利要求46的綴合物，其中至少90％的所述聚乙二醇與氨基端苯丙氨酸綴合。
49.根據(jù)權(quán)利要求47或48的綴合物，其中各mPEG的分子量約為20kDa。
50.具有以下結(jié)構(gòu)的人生長激素-PEG綴合物 其中R是人生長激素多肽。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的綴合物，其中所述人生長激素多肽包括SEQID N01氨基酸順序。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的綴合物，其中至少80％的所述聚乙二醇與氨基端苯丙氨酸綴合。
53.根據(jù)權(quán)利要求51的綴合物，其中至少90％的所述聚乙二醇與氨基端苯丙氨酸綴合。
54.根據(jù)權(quán)利要求52或53的綴合物，其中各mPEG的分子量約為20kDa。
55.具有mPEG-OCH2CH2CH2NH-R結(jié)構(gòu)的人生長激素-PEG綴合物，R是人生長激素多肽。
56.根據(jù)權(quán)利要求55的綴合物，其中所述人生長激素多肽包括SEQID NO1氨基酸順序。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的綴合物，其中至少80％的所述聚乙二醇與氨基端苯丙氨酸綴合。
58.根據(jù)權(quán)利要求56的綴合物，其中至少90％的所述聚乙二醇與氨基端苯丙氨酸綴合。
59.根據(jù)權(quán)利要求57或58的綴合物，其中各mPEG的分子量約為20kDa。
60.根據(jù)權(quán)利要求8的綴合物，其中所述聚乙二醇是雙官能聚合物。
61.根據(jù)權(quán)利要求8的綴合物，其中所述聚乙二醇是前體藥物。
62.組合物，包括如權(quán)利要求1的人生長激素和至少一種可藥用載體。
63.治療生長或發(fā)育障礙患者的方法，包括將治療有效量的如權(quán)利要求1的hGH綴合物給予所述患者。
64.根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中所述生長或發(fā)育障礙是生長激素缺乏(GHD)。
65.根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中所述生長或發(fā)育障礙是Turner綜合癥。
66.根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中所述生長或發(fā)育障礙是慢性腎機能不全。
67.根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中所述生長或發(fā)育障礙是小于胎齡(SGA)。
68.組合物，包括如權(quán)利要求48的人生長激素和至少一種可藥用載體。
69.治療生長或發(fā)育障礙患者的方法，包括將治療有效量的如權(quán)利要求48的hGH綴合物給予所述患者。
70.根據(jù)權(quán)利要求69的方法，其中所述生長或發(fā)育障礙是生長激素缺乏(GHD)。
71.根據(jù)權(quán)利要求69的方法，其中所述生長或發(fā)育障礙是Turner綜合癥。
72.根據(jù)權(quán)利要求69的方法，其中所述生長或發(fā)育障礙是慢性腎機能不全。
73.根據(jù)權(quán)利要求69的方法，其中所述生長或發(fā)育障礙是小于胎齡(SGA)。
74.組合物，包括如權(quán)利要求50或55的hGH和至少一種可藥用載體。
75.治療生長或發(fā)育障礙患者的方法，包括將治療有效量的如權(quán)利要求74的hGH綴合物給予所述患者。
76.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中所述生長或發(fā)育障礙是生長激素缺乏(GHD)。
77.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中所述生長或發(fā)育障礙是Turner綜合癥。
78.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中所述生長或發(fā)育障礙是慢性腎機能不全。
79.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中所述生長或發(fā)育障礙是小于胎齡(SGA)。
全文摘要
本發(fā)明提供化學(xué)修飾的人生長激素(hGH)，它是通過水溶性聚合物與所述蛋白質(zhì)結(jié)合制備的。與未修飾的hGH相比，本發(fā)明化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)具有更持久的hGH活性，可降低了劑量和安排給藥時間。
文檔編號C07K17/08GK1608079SQ02825928
公開日2005年4月20日 申請日期2002年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月20日
發(fā)明者R·F·菲恩, W·勞, N·R·斯格爾 申請人:法瑪西雅公司