專利名稱：重組胎盤生長因子的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從基因修飾的細胞提取和純化重組胎盤生長因子的方法。
背景技術：
胎盤生長因子(PLGF)是具有與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)類似結(jié)構(gòu)的同二聚糖蛋白。Maglione和Persico在要求1990年9月27日的意大利優(yōu)先權(quán)的專利EP-B-550 519(WO-A-92/06194)中描述了編碼PLGF蛋白的完整多核苷酸序列。剪接PLGF的ARN的不同過程產(chǎn)生三個同源形式的胎盤生長因子，明確地是PLGF-1，PLGF-2和PLGF-3，其具有不同的多肽序列，全部在文獻中描述。
上面提及的專利也描述了制備PLGF因子的方法，包括使用以被表達載體修飾的宿主細胞為特征的誘導型原核表達系統(tǒng)，在該載體中，人PLGF基因被整合在誘導型啟動子(直接或間接)的控制下。在適當活化劑誘導PLGF表達后，培養(yǎng)該細胞，分離并接受裂解。
這樣獲得的粗溶解產(chǎn)物是含少量被表達的PLGF蛋白并具有低特異活性的蛋白的復雜混合物。事實上，在已知方法中，在含低細胞密度的培養(yǎng)中誘導蛋白表達，誘導時低光學密度在600nm處明顯是0.2和0.6OD之間。此外，在前述文件中所述方法不包括表達蛋白的另外純化階段。由于這個原因，根據(jù)申請WO-A-92/06194獲得的溶解產(chǎn)物本身不適合直接用于制備藥物。
Maglione等在″Il Farmaco″55(2000)，165-167頁設想了純化相同胎盤因子的更復雜方法。然而，該方法公開內(nèi)容僅給出了已知適用技術的簡單列表，沒有描述其條件和實驗細節(jié)，而這些是獲得制藥用途所需純度和數(shù)量的PLGF蛋白所必需的。
本發(fā)明的范圍提供了提取和純化在細菌細胞中表達的重組PLGF的新方法，允許獲得具有適合工業(yè)應用于制備藥物的高水平純度和產(chǎn)量的PLGF。
本發(fā)明的更多范圍是獲得基本上活性形式(高于98.5％)的PLGF蛋白，主要包括二聚體(不低于70％)和多聚體形式，并且含有不高于1.5％的單體形式的殘余物(很少或無活性)。
發(fā)明概述本發(fā)明基于確定了尤其適合提取和純化在細菌細胞中表達的人PLGF的純化技術的順序。本發(fā)明進一步基于確定了單一技術和待純化物質(zhì)的化學-物理特征的最佳操作條件。
接著，本發(fā)明的目的是提取和純化依靠誘導型原核表達系統(tǒng)表達的重組胎盤生長因子(PLGF)的方法，包括步驟I)細菌細胞的發(fā)酵，II)內(nèi)含體的提取和純化，III)表達蛋白的復性，IV)離子交換層析，V)反相層析，和任選VI)超濾、配制和冷凍干燥的最后階段。根據(jù)這種方法，在進行誘導步驟之前，實施發(fā)酵(步驟I)直到獲得培養(yǎng)基中高細菌密度，其中這種高細菌密度由培養(yǎng)基中高光學密度表明。步驟(II)包括細菌裂解、DNA破裂和內(nèi)含體分離。表達蛋白的復性(步驟III)是通過內(nèi)含體溶解于變性緩沖液，和轉(zhuǎn)化至少部分表達蛋白為二聚體形式獲得的。最后，在步驟(IV)和(V)中，二聚體和多聚體形式的表達蛋白與單體形式分開并以純化形式分離，隨后超濾和在通常冷凍干燥和配制添加劑存在下進行冷凍干燥。
本發(fā)明的特殊目的是上面提及的提取和純化人源PLGF-1蛋白的方法，但是對動物來源的PLGF-1也基本有效。
要求保護的方法有利地允許獲得比根據(jù)現(xiàn)有技術所述方法獲得的產(chǎn)量高30-50倍的表達蛋白產(chǎn)量。要求保護的方法還允許獲得非常純的蛋白，具有高特異活性和基本上是二聚體形式。
本發(fā)明的另一目的是依靠本發(fā)明的方法可獲得的活性胎盤生長因子，其不含任何殘余蛋白或其它細菌污染物且含有的單體形式殘余物不高于1.5％。


圖1該圖顯示了監(jiān)測步驟I在還原條件下電泳SDS-PAGE獲得的結(jié)果。Pre1和Pre2代表誘導前檢查，如下制備。誘導前不久，取600nm(OD600)下吸光度為0.064單位的物質(zhì)并用水稀釋5倍。取20μl這種稀釋液，添加至20μl還原緩沖液并煮沸。20μl這種最終溶液加樣到SDS PAGE基質(zhì)上。Post1和Post2代表誘導后檢查，如上制備。M表示分子量標記的混合物。在誘導后柱(Post1和Post2)中，就在分子量指示14.3的上面記錄一個條帶，在誘導前柱(Pre1和Pre2)中基本缺乏這一條帶，其相應于表達和隔離于內(nèi)含體中的PLGF-1蛋白。
圖2該圖顯示了Q-Sepharose Fast Flow樹脂上陰離子交換層析的監(jiān)測層析譜。X-軸表示洗脫體積(ML)，y-軸表示吸光度單位(OD)。用20％緩沖液B(NaCl 200mM)洗脫獲得的第一個洗脫峰對應于基本上二聚體形式的PLGF-1蛋白，但是它包括雜質(zhì)和單體形式。用100％緩沖液B(NaCl 1M)洗脫的隨后的峰含有被除去的雜質(zhì)。
圖3該圖顯示了在RP Source 30樹脂上反相層析的第一個洗脫階段的監(jiān)測層析譜。X-軸表示洗脫體積(ml)，y-軸表示吸光度單位(OD)。第一個大量洗脫峰對應于各種雜質(zhì)，它不結(jié)合樹脂。第二個洗脫峰對應于在等度洗脫(isochratic)條件(實驗發(fā)現(xiàn)在大約10-15％緩沖液B處)下洗脫的單體形式PLGF蛋白。
圖4該圖顯示了在RP Source 30樹脂上反相層析的第二個洗脫階段的監(jiān)測層析譜。X-軸表示洗脫體積(ml)，y-軸表示吸光度單位(OD)。洗脫峰對應于二聚體-多聚體形式的PLGF蛋白。
圖5該圖顯示了全過程最后監(jiān)測的SDS-PAGE上電泳獲得的結(jié)果。Prerefol和Postrefol代表表達蛋白復性(步驟III)之前和之后的檢查。QFF代表從Q Sepharose Fast Flow樹脂洗脫的峰，主要含有二聚體形式的蛋白。Mon代表含單體形式的峰。Dim代表在RP Source30樹脂上反相層析的第二分步中洗脫的峰。應該注意在復性前，表達蛋白主要是單體形式。復性后，部分蛋白是二聚體形式。通過QFF和RF 30層析的下列純化允許獲得具有高純度的PLGF-1蛋白。
發(fā)明詳述Maglione等在在先專利EP-B-0550519(WO-A-92/06194)中描述了細菌宿主細胞的基因修飾。為了這個目的，導入含對應于編碼PLGF-1因子的人基因的插入物的表達載體以轉(zhuǎn)化細菌細胞。文獻中已知該完整基因序列并且可以自由獲得。含這種序列的質(zhì)粒保藏在ATCC，保藏號ATCC NO 40892。在T7噬菌體的RNA聚合酶系統(tǒng)控制下并用IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)誘導實施表達。
然而，可以利用其它誘導型原核表達系統(tǒng)。市場上可獲得的這種系統(tǒng)的實例由以下代表1)pBAD表達系統(tǒng)(In vitrogen BV)，其中蛋白合成置于araBAD啟動子控制下且可以依靠阿拉伯糖在不同大腸桿菌菌株中誘導。
2)T7表達系統(tǒng)(In vitrogen BV或Promega)，其中蛋白合成受T7噬菌體的RNA聚合酶啟動子控制且可以依靠乳糖或其類似物(IPTG)誘導。在這種情況下，需要使用大腸桿菌衍生物DE3(Bl21(DE3)或JM109(DE3))型，即含有乳糖誘導型啟動子控制下的T7噬菌體的Rna聚合酶的基因拷貝。
3)Trc表達系統(tǒng)(In vitrogen BV)，其中蛋白合成置于trc雜合啟動子控制下。這種啟動子可以通過解鏈trp啟動子和lac啟動子而獲得，并可以依靠乳糖或其類似物(IPTG)在不同大腸桿菌菌株中誘導。
4)Tac表達系統(tǒng)(Amerham biosciences)，其中蛋白合成置于tac啟動子控制下。在這個系統(tǒng)中，依靠乳糖或其類似物(IPTG)在大腸桿菌菌株lacIq(JM105型)中誘導蛋白合成。
5)PL表達系統(tǒng)，其中蛋白合成置于PL啟動子控制下，可以通過添加色氨酸誘導。在這種情況下，需要使用含色氨酸誘導型啟動子控制下λ噬菌體cI抑制劑的編碼基因拷貝的大腸桿菌衍生物(GI724)。
步驟I發(fā)酵和誘導要求保護的方法的第一階段由發(fā)酵與在先歐洲專利(上面)中所述菌株等同的功能性修飾的細菌菌株組成。在優(yōu)選實施方案中，該微生物是大腸桿菌的衍生物，被含PLGF人基因的表達質(zhì)粒修飾。優(yōu)選的微生物是稱作[B12(DE3)pLysS PLGF-1]的一個，由人PLGF-1基因整合入市場上可獲得的菌株[B12(DE3)pLysS](PromegaCorporation USA)中獲得。然而，本發(fā)明不限于人PLGF-1因子，也涉及動物來源(猴子、小鼠、兔子等)的。本發(fā)明不限于使用大腸桿菌衍生物，而是包括使用易于進行基因修飾并能夠表達內(nèi)含體形式的異源蛋白的任何原核微生物。
本發(fā)明方法中利用作為接種物的菌株在使用它們前保存為冷凍干燥形式以維持其表達能力。使用時，通過利用適當緩沖液，冷凍干燥物質(zhì)再放入溶液中。
盡管有廣泛的市場上可獲得且可以有效使用的已知培養(yǎng)基，但是為了避免任何感染風險，優(yōu)選在不含任何動物或人來源物質(zhì)的培養(yǎng)基中實施根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵步驟。添加一種或多種合適抗生素的酵母提取物(Difco)代表該方法的最合適手段。在優(yōu)選實施方案中，使用通過在無菌條件下含酵母提取物、甘油和硫酸銨的第一溶液(A)與含磷酸鹽緩沖液的第二溶液(B)混和而獲得的培養(yǎng)基。接著該混合物與氨芐青霉素和氯霉素或等價抗生素結(jié)合。適當?shù)目股貪舛仁?0至300μg/ml氨芐青霉素，優(yōu)選100至200μg/ml以及10至100μg/ml氯霉素，優(yōu)選30至40μg/ml。
發(fā)酵步驟前可以進行預接種步驟，其中冷凍干燥的微生物懸浮于培養(yǎng)基中并進行連續(xù)培養(yǎng)和稀釋步驟，旨在使培養(yǎng)體系中具有最佳數(shù)量的微生物細胞。優(yōu)選地，在37℃過夜培養(yǎng)該微生物，接著再稀釋和培養(yǎng)幾個小時。隨后離心所選預接種體積，再次懸浮于富含氨芐青霉素的培養(yǎng)溶液中并在發(fā)酵容器中孵育進行發(fā)酵步驟。
在添加氨芐青霉素和氯霉素的上面提及培養(yǎng)基中，于適合該微生物的溫度下，通常在大約37℃，在溶解O2百分比為20％至40％，優(yōu)選30％(相對于空氣飽和度)存在下實施發(fā)酵。發(fā)酵期間，pH保持在中性或弱酸性值(6.4-7.4)。此外，由于在攪拌下進行發(fā)酵過程，因此優(yōu)選使用防泡劑。
發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的光密度增加。由于這個原因，光密度是根據(jù)本發(fā)明可利用的參數(shù)以監(jiān)測發(fā)酵進展程度。在600nm的讀數(shù)特別合適。
本發(fā)明的主要特征是表達誘導時培養(yǎng)體系中達到的高細胞密度。由于本發(fā)明培養(yǎng)基的原因，在600nm的光密度(OD600)可以達到1至50。然而，優(yōu)選高于18的密度以獲得要求保護的方法典型的高產(chǎn)量水平。特別優(yōu)選16和20之間的密度以誘導該制備型細菌菌株并得到最佳結(jié)果。接著，發(fā)酵保持在上面提及的條件下，直到獲得這種光密度值，接著進行誘導蛋白表達。
可以有益地利用能夠在使用的微生物細胞中誘導異源蛋白表達機械的任何試劑或化學-物理條件。在具體情況下，其中使用了用含T7噬菌體啟動子的表達載體修飾的細菌菌株BL21(DE3)pLysS時，用適當濃度即大約1mM的乳糖或其衍生物，如異丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導表達。根據(jù)需要誘導持續(xù)時間可以變化。幾個小時的時間可以獲得好的結(jié)果，優(yōu)選3至4個小時；在最佳方法中，通過使用大約等于10％的溶解O2百分比，誘導保持3個小時20分鐘。
于誘導前后取細胞樣品并接受對照技術分析如SDS-PAGE電泳，來確定誘導結(jié)果。
當?shù)鞍妆磉_達到期望水平時，離心培養(yǎng)物，取出細胞進行下列步驟。
步驟II提取和純化細菌菌株中表達的異源蛋白以內(nèi)含體形式隔離于細胞中。因此，本發(fā)明的方法提供了細胞裂解、核酸提取材料(DNA)的破裂和內(nèi)含體的回收和洗滌。
洗滌細胞(盡管不是必須)并懸浮于含適當濃度乳化劑的溶液，優(yōu)選0.5％-1％濃度的Triton X100，接著它們進行細胞膜的裂解?？梢砸揽績?融、弗氏壓碎器，超聲處理或其它類似已知技術實施裂解過程。然而，對于細菌菌株BL21(DE3)pLysS的優(yōu)選方法是凍/融方法，在最優(yōu)選實施方案中，該凍/融方法重復至少兩個連續(xù)循環(huán)。機械裂解之后，裂解階段在裂解溶液中室溫攪拌下持續(xù)幾分鐘。
裂解培養(yǎng)基中內(nèi)含體的釋放伴隨著微生物不同成分和細胞物質(zhì)的釋放，以及核酸材料。這些物質(zhì)可干擾和危害隨后蛋白純化方法。因此，依靠酶試劑，如DNAse(天然或重組酶如Benzonase)，化學試劑，如脫氧膽酸，或物理-機械試劑，如超聲處理或依靠葉片進行高能量攪拌，例如在混和器中，來打斷這種核酸材料，特別是DNA，從而對裂解獲得的懸浮液/溶液進行處理。DNA的破裂，例如在混和器中實施，是對重懸于含螯合劑和洗滌劑(例如EDTA和Triton X100)的適當體積洗滌溶液的裂解細胞實施。優(yōu)選在洗滌溶液中重復更多循環(huán)，優(yōu)選2次，可選擇地可以增加稀釋步驟，離心和除去上清，以除去含內(nèi)含體的餾分中的成分和細胞物質(zhì)。
步驟III蛋白的復性(重折疊)含純化的PLGF-1內(nèi)含體的餾分接著溶于含已知變性試劑如尿素、異硫氰酸胍、鹽酸胍的變性緩沖液中。優(yōu)選，變性溶液是變性濃度為例如8M的尿素溶液。為了加速溶解過程，該餾分可以有益地接受勻漿化或超聲處理。溶解內(nèi)含體之后，用相同變性緩沖液稀釋溶液直到獲得在280nm測定為大約0.8(OD280 0.8)的光密度。隨后，用稀釋緩沖液進一步稀釋該溶液直到0.5OD280。合適的稀釋溶液含有鹽和聚乙二醇(PEG)并具有堿性pH(大約8)。PLGF-1蛋白在稀釋溶液中的復性通過向該溶液添加適當濃度的氧化/還原對，隨后在攪拌下于10-30℃(優(yōu)選20℃)孵育10至30小時，優(yōu)選18-20小時而完成。這種對的實例是胱氨酸/半胱氨酸，胱胺/半胱胺，2-羥基乙基二硫化物/2-巰基-乙醇。氧化/還原對的優(yōu)選實例是氧化和還原形式的谷胱甘肽，分別以0.1mM和2.5mM(優(yōu)選0.5mM)之間和0.25mM和6.25mM(優(yōu)選1.25mM)之間的濃度。依靠復性，主要以單體形式表達的PLGF-1蛋白部分恢復成二聚體形式(圖5)。
步驟IV陰離子交換層析將主要含單體形式蛋白以及部分二聚體形式蛋白的來自前面步驟的溶液(優(yōu)選經(jīng)過離心和/或過濾步驟)裝入陰離子交換樹脂上，以富集二聚體形式的化合物和從細菌污染物中純化之。同樣可以使用適合陰離子交換層析的任何市場上可獲得的基質(zhì)，只要其容量、填料和流速的特征類似于Q Sepharose Fast Flow樹脂(Amershambiosciences)，并適合于工業(yè)方法。在優(yōu)選實施方案中，使用高流動樹脂，例如Q Sepharose Fast Flow樹脂(Amersham biosciences)或等同物。洗滌該樹脂并用具有低離子強度的溶液平衡。這種溶液的實例包括具有低或無鹽含量的乙醇胺-HCl(pH8.5)?？梢岳孟嗤芤哼M行裝入、吸收和洗滌待純化的蛋白混合物。使用的樹脂允許裝入大體積蛋白溶液，裝入體積/柱體積的比率從1∶1至10∶1變化。優(yōu)選接近10∶1的體積/體積比率，因為它們使柱的使用優(yōu)化。然而，要避免高于10∶1的比率，因為由于基質(zhì)吸附容量的飽和，它們導致二聚體形式蛋白的高度損失。
鑒于低離子強度洗滌階段中單體形式的PLGF-1蛋白已經(jīng)過濾掉，因此通過增加起始溶液的離子強度達到二聚體和多聚體形式的洗脫。這種增加是通過平衡溶液與增加的和預先建立的百分比的含NaCl1M的第二溶液混和而完成的。在優(yōu)選實施方案中，用含15％至25％NaCl 1M(相當于150至250mM NaCl)的溶液洗脫二聚體形式的蛋白。在最佳實施方案中，在200mM NaCl濃度的等度洗脫條件下洗脫該蛋白。通過測定280nm的吸光度來自動監(jiān)測各物質(zhì)的洗脫(圖2)。隨后SDS-PAGE電泳來控制所收集的含二聚體形式PLGF-1蛋白的餾分(圖5)。有益地，用合適程序控制下操作的計算機化系統(tǒng)來自動實施整個層析過程，例如軟件FPCL Director system(Amershambiosciences)。
步驟V反相層析收集富含活性形式的PLGF-1蛋白的來自前面步驟的餾分，用適當緩沖液稀釋，并裝入反相層析柱上，以進一步純化活性形式的蛋白。裝入溶液的量相應于每毫升層析基質(zhì)4.5和5.5之間的OD280值。認為這種量是最大量。
可以利用任何適合于本發(fā)明用途的市場上可獲得的層析基質(zhì)，只要其裝入容量和流速特征與該方法所需條件相容。在優(yōu)選實施方案中，使用這樣的樹脂，即其珠大小能保證最佳利用吸附能力并易于裝填柱本身。這種基質(zhì)的實例是RP Source 15或RP Source 30(Amershambiosciences)樹脂。所有平衡、裝入、樹脂洗滌和洗脫的溶液是氫化有機溶液，其含有不同百分比的有機溶劑。這種溶液的實例是包含乙醇、甲醇或乙腈的溶液。優(yōu)選，利用含不斷增加的百分比的乙醇的氫化-醇溶液。在本發(fā)明的實施方案中，混和適當量的兩種緩沖溶液，前者包括緩沖液A，即乙醇40％和TFA(三氟醋酸)0.1％，后者包括緩沖液B，即乙醇70％和TFA 0.1％。
裝入樹脂上并適當洗滌的蛋白物質(zhì)接著通過洗脫過程洗脫，包括兩個連續(xù)階段，其中利用了含梯度不斷增加的有機溶劑的洗脫溶液。在梯度升高的有機溶劑的條件下實施第一個階段直到獲得單體形式的洗脫峰。這種梯度可以通過向緩沖液A添加4％至40％的緩沖液B而獲得，對于每個洗脫柱體積，緩沖液B增加比例是3％。相當于單體形式蛋白的洗脫峰一出現(xiàn)，在等度洗脫條件下持續(xù)洗脫直到單體形式洗脫峰耗盡。如此設置的等度洗脫條件可以最大可能地分開對應于單體和二聚體形式的層析峰，進而獲得具有最佳可獲得分辨率的工業(yè)方法，而不是分析型方法。再次在梯度不斷增加的有機溶劑條件下實施第二個階段直到完成主要是二聚體形式的蛋白的完整洗脫。在第二個階段中，梯度是通過向緩沖液A中添加10％至100％的百分比的緩沖液B獲得的，對于每個洗脫柱體積，緩沖液B的增加比例是40.9％。通過測定280nm的吸光度自動監(jiān)測各種形式PLGF-1蛋白的洗脫(圖3和圖4)。隨后由SDS-PAGE電泳控制含主要含二聚體形式PLGF-1蛋白的餾分(圖5)。有益地，用合適程序控制下操作的計算機化系統(tǒng)自動實施整個反相層析過程，例如軟件FPCL Director system(Amersham biosciences)。
電泳結(jié)果表明從第二階段反相層析獲得的PLGF-1蛋白是高純度活性形式，即它包括二聚體和部分多聚體形式，但它基本不含單體形式的任何污染物。如此獲得的產(chǎn)物包括至少98.5％的活性形式，優(yōu)選至少99.5％，其中至少70％是二聚體形式。單體形式的殘留物不高于1.5％。每升細菌培養(yǎng)物獲得平均160mg量的活性形式蛋白。根據(jù)上述方法獲得的純蛋白可以接受另外的處理階段如膜超濾。在這種情況下，在具有低于或等于30kD截留值的膜上過濾產(chǎn)物并對TFA酸化水進行滲濾，直到達到1∶106的稀釋系數(shù)。如此獲得的終產(chǎn)物可以與冷凍干燥添加劑適當配制并冷凍干燥以保持其最好的生物活性。
下面依靠實施例描述本發(fā)明，然而，實施例僅僅舉例說明，沒有限制的目的。
實施例1發(fā)酵下列步驟涉及發(fā)酵和使用1mM IPTG誘導發(fā)酵容器中基因修飾的微生物(MOGM)[Bl21(DE3)pLysS PLGF-1]的方法。
材料溶液SBM由下列組成溶液A(每1升)Bacto酵母提取物(Difco)34g硫酸銨2.5g甘油100mlH2O約900ml溶液B(10X)(每100ml)KH2PO41.7gK2HPO4-3H2O 20g，或K2HPO415.26gH2O加適量至100ml溶液A和B分開高壓消毒并在無菌條件下混和使用。可供選擇地，在無菌條件下混和溶液A和B并過濾。
通過5g純物質(zhì)溶于100ml蒸餾水制備IPTG 200mM(200X)。依靠0.22μm過濾器過濾該溶液，細分成等分部分并冰凍在-20℃。
利用的防泡劑是Antifoam O-10(非硅)Sigma Cat A-8207。
使用的細菌菌株是[BL21pLysS PlGF-1 WCB](工作細胞庫)。
預接種取一管冷凍干燥的基因修飾的微生物(MOGM)WCB并懸浮于1ml的SBM+100μg/ml氨芐青霉素+34μg/ml氯霉素中。
懸液稀釋于30ml的SBM+100μg/ml氨芐青霉素+34μg/ml氯霉素中。
懸液在37℃孵育過夜(O/N)。第二天，30ml O/N培養(yǎng)物稀釋于800ml的SBM+100μg/ml氨芐青霉素+34μg/ml氯霉素中，并且它們細分到4個1升Erlenmeyer瓶，每瓶含200ml。
每瓶內(nèi)容物在37℃培養(yǎng)24小時?；旌?瓶內(nèi)容物，通過1/20稀釋于水(50μl+950μl水)中讀取OD600。
已建立體積的預接種物接著在4℃，無菌管中，以7.500xg離心10分鐘。
接著通過在420rpm室溫攪拌20分鐘將細菌重懸于每升發(fā)酵物20ml的SBM+200μg/ml氨芐青霉素+10μg/ml氯霉素中。同時，準備發(fā)酵容器并校準氧探頭。
在37℃溫度用氮氣將氧探針校定為0％，接著無防泡劑以及600rpm攪拌下用空氣將探針校定為100％。
在下列實驗條件下實施發(fā)酵培養(yǎng)基SBM+200μg/ml氨芐青霉素+10μg/ml氯霉素溫度37℃溶解O2％30％(相對于空氣飽和度)pH從6.4至7.4防泡劑1∶10稀釋于水中；以每750ml培養(yǎng)基140μl的量添加它之前強烈攪拌。
誘導在下列條件下實施誘導誘導物的OD60016-20誘導劑IPTG，終濃度1mM溶解O2％10％(相對于空氣飽和度)誘導時間3小時20分鐘。
就在誘導前，取20μl細菌，添加到80μl水中并進行誘導前檢查。
誘導時，IPTG添加至終濃度1mM。
溶解O2百分比是10％。
誘導末期，讀取最終OD600并測定整體體積。
接著，取10μl細菌，添加到90μl水中并進行誘導后檢查。
通過加20μl的2個預先煮沸的樣品進行SDS-PAGE電泳以控制誘導。
接著含誘導細菌的培養(yǎng)基在4℃以7.500xg離心10分鐘，或3000xg離心20分鐘并除去上清。
結(jié)果SDS-PAGE電泳檢查誘導結(jié)果，如圖1所示。
實施例2內(nèi)含體的提取和純化下列步驟涉及PLGF-1的內(nèi)含體的制備和重折疊。依靠重折疊，PLGF-1細菌蛋白被部分恢復成二聚體形式。
材料適當容量的混和器裂解溶液1mM Mg2SO4+20mM Tris-HCl pH8+1％TritonX100.
洗滌溶液0.5％triton X100+10mM EDTA pH8.
BD(變性緩沖液)8M尿素，50mM Tris pH8，乙二胺20mM.
溶解于水中.
氧化型谷胱甘肽200x100mM，水中還原型谷胱甘肽200x250mM，水中.
稀釋緩沖液終濃度600uM的PEG 4000(2.4g/l)50mM Tris-HCl pH8，20mM NaCl.
防泡劑Antifoam O-10(非硅)SigmaPLGF-1內(nèi)含體的制備。
在室溫(RT)平衡裂解和洗滌溶液。
在-80/37℃實施凍/融循環(huán)。
以每450 OD600細菌1ml裂解溶液的濃度使細菌沉淀溶解。
接著在RT孵育30分鐘，同時攪拌(250rpm)
該溶液倒入適當容量的混和器中，每450 OD600細菌添加3ml洗滌溶液。
如果需要，每毫升樣品添加0.4μl未稀釋防泡劑。
該溶液以最大速度離心1分鐘或直到樣品被很好均質(zhì)化。
接著混和器的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到適當容量的容器中并且每450 OD600細菌添加6.5ml洗滌溶液。在攪拌下室溫培養(yǎng)45分鐘。
如此獲得的懸液在25℃以13.000xg離心45分鐘并倒出上清。
沉淀以每450 OD600細菌4ml洗滌溶液的濃度進行重懸，并在混和器中進行第二次重復循環(huán)。
懸液轉(zhuǎn)移到適當容量的容器中，每450 OD600細菌用6.5ml洗滌溶液稀釋并在室溫攪拌下培養(yǎng)30分鐘。
接著在上述條件下重復離心并除去上清。
實施例3蛋白的復性內(nèi)含體溶于7ml變性緩沖液BD(含尿素8M)中并進一步稀釋于BD直到OD280為0.8。隨后，為了使尿素終濃度達到5M，添加0.6體積的稀釋緩沖液。
其后添加1/200還原型谷胱甘肽200×(終濃度1.25mM)和1/200氧化型谷胱甘肽200×(終濃度0.5mM)。取15μl用于檢查的樣品(prerefol)，接著溶液在20℃攪拌下培養(yǎng)18-20小時。
培養(yǎng)末期，培養(yǎng)基在20℃，10.000×g離心10分鐘，依靠0.45或0.8μm過濾器過濾并取15μl樣品用于檢查(postrefol)。
結(jié)果依靠SDS-PAGE電泳分析15μl重折疊前和重折疊后的溶液(圖5)。
實施例4陰離子交換層析下列步驟涉及重折疊后PLGF-1蛋白純化的第一步。樣品裝入柱上后，將有不被吸收的PLGF-1單體的高度損失。裝入的量應該不超過柱體積的10倍，因為這將引起PLGF-1二聚體的明顯損失。
在20％緩沖液B(見下)(相當于200mM NaCl濃度)的等度洗脫條件下進行洗脫。洗脫峰仍含有用于重折疊的谷胱甘肽，它形成大約50％的OD280。
材料和參數(shù)FPLC系統(tǒng)Amersham-biosciences出售，由FPLC Director軟件操作。
監(jiān)測參數(shù)U.V.波長＝280nm；scale top＝2.
溫度20℃(最小15，最大25)樹脂Q-Sepharose Fast Flow(Amersham-biosciences).
柱體積/高度體積待裝入樣品體積的1/10；高度13和16cm之間.
平衡2柱體積(CV)的緩沖液B，接著1.5CV的緩沖液A.
樣品復性、離心和/或過濾的PLGF-1.至多裝入其10CV.
緩沖液A20mM乙醇胺-HCl pH8.5.
緩沖液B緩沖液A+1M NaCl.
灌注速度1cm/分(在小柱上測試的最大速度＝1.887cm/分；測試的最小速度＝0.5cm/分.).
洗脫速度1cm/分(在小柱上測試的最大速度＝1.887cm/分；測試的最小速度＝0.5cm/分.).
灌注后洗滌1.5CV的0％緩沖液B.
收集峰在20％緩沖液B的等度洗脫條件下運行大約3CV而洗脫的峰。
最后洗滌2CV，100％B。
步驟收集在20％緩沖液B的等度洗脫條件下洗脫的峰，接著向其中添加0.271體積水，0.0045體積TFA和0.225體積乙醇。這樣樣品結(jié)果被稀釋1.5倍，含有15％乙醇和0.3％TFA。添加這兩種物質(zhì)促進PLGF-1與反相樹脂的結(jié)合(見實施例5)。
結(jié)果通過監(jiān)測280nm的光密度連續(xù)控制層析步驟，如圖2所示。
依靠SDS-PAGE電泳分析分離的蛋白材料的純度(圖5)。
實施例5反相層析可以在RP source樹脂(15微米或30微米平均顆粒直徑)實施下列步驟。然而，盡管不會使純化方法產(chǎn)生任何改變，30微米RP source樹脂允許樹脂本身的經(jīng)濟節(jié)約(大約50％)，柱的裝填步驟更加容易和反壓更低。
該步驟涉及通過QFF樹脂后PLGF-1蛋白純化的第二階段。樣品灌注過程中，高吸附度很明顯并相當于不結(jié)合樹脂的谷胱甘肽的未吸附峰。這個步驟由2個分階段組成，前者稱為RPCmon，用于除去大部分PLGF-1單體成分，而后者用于洗脫主要是二聚體成分的蛋白并且它稱作RPCdim。
第一個分階段(RPCmon)材料和參數(shù)FPLC系統(tǒng)Amersham-biosciences出售，由FPLC Director軟件操縱。
監(jiān)測參數(shù)U.V.波長＝280nm；full scale＝0.05.
溫度20℃(最小15，最大25)樹脂反相Source 30(Amersham-biosciences).
柱體積/高度體積待裝入樣品整體OD280的1/5-1/6；高度27和33cm之間.
平衡2柱體積(CV)的緩沖液B，接著2CV的緩沖液A.
樣品來自前面步驟(實施例4)的PLGF-1，稀釋1.5倍，含有乙醇15％和TFA0.3％。每毫升樹脂最大裝入4.5至5.5 OD280。
緩沖液A乙醇40％+TFA 0.1％.
緩沖液B乙醇70％+TFA 0.1％.
灌注速度1.887cm/分.
洗脫速度1.887cm/分.
灌注后洗滌1.5CV的4％緩沖液B.
單體峰梯度范圍為12CV(3％B/CV)的4至40％B。就在峰洗脫開始之后，到OD280達到全刻度(full scale)的25％時，以該時刻的緩沖液B濃度持續(xù)進行等度洗脫直到洗脫峰完成(大約2.5-3.5CV)。
操作取對應于“單體”峰的合適量溶液并濃縮進行檢查(圖5中mon)。
第二分階段(RPCdim)材料和參數(shù)無需再次平衡該柱，但是UV監(jiān)測器的刻度范圍移至值2，梯度范圍從10-100％的緩沖液B運行2.2CV(40.9％B/CV)。
操作取對應于“二聚體”峰的餾分。圖4顯示了其實例。收集它們并測定體積和280nm的光密度。
通過OD280乘以稀釋倍數(shù)乘以體積計算冷凍干燥前獲得的整體產(chǎn)量(以mg表示)。這種產(chǎn)量的平均值是每升細菌培養(yǎng)物164mg純PLGF-1，標準差是23.21。也以每1000 OD600發(fā)酵細菌的mg量來表示，得到每1000 OD600發(fā)酵細菌5.58mg純PLGF-1的結(jié)果，標準差是0.8。
如此獲得的二聚體溶液保存在-20℃直到超濾和冷凍干燥。這種溶液樣品進行SDS-PAGE電泳，如圖5所示。
權(quán)利要求
1.一種提取和純化在修飾的原核細胞中的誘導型表達系統(tǒng)中表達的重組胎盤生長因子(PLGF)的方法，包括下列步驟I)該原核細胞的發(fā)酵，II)內(nèi)含體的提取和純化，III)所表達蛋白的復性，IV)離子交換層析，V)反相層析，其特征在于實施步驟(I)直到培養(yǎng)基在600nm的光密度達到1至50(OD6001-50)，隨后誘導；步驟(II)包括裂解培養(yǎng)細胞，使DNA斷裂和分離內(nèi)含體；在步驟(III)中，內(nèi)含體溶于變性緩沖液中并使表達蛋白至少部分恢復為二聚體形式；在步驟(IV)和(V)中，二聚體和多聚體形式的表達蛋白與單體形式分開并分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于胎盤生長因子(PLGF)是人PLGF-1或是動物來源的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于該原核細胞是細菌細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其特征在于步驟I在允許發(fā)酵步驟中獲得高細菌密度并且不含任何動物或人來源的物質(zhì)的培養(yǎng)基中實施。
5.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其特征在于步驟I在含一種或多種選擇試劑，酵母提取物，甘油和銨鹽的培養(yǎng)基中實施。
6.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其特征在于誘導型表達系統(tǒng)是表達系統(tǒng)T7。
7.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其特征在于細菌細胞是源自大腸桿菌的菌株。
8.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其特征在于細菌菌株是大腸桿菌{B121(DE3)pLysS}。
9.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其特征在于通過乳糖、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)或功能等同的類似物來誘導表達。
10.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其特征在于誘導時培養(yǎng)物在600nm的光密度是14-30OD(14-30OD600)，優(yōu)選16-20(16-20OD600)。
11.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其特征在于步驟I包括預接種的預備步驟。
12.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其特征在于步驟II中，通過凍/融，弗氏壓碎器或其它等同技術實施細胞裂解。
13.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其特征在于步驟II中，通過提取或重組來源的DNAse，優(yōu)選benzonase，或通過化學-機械作用來使DNA斷裂。
14.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其特征在于步驟II中，通過混和器來使DNA斷裂。
15.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其特征在于步驟II中，通過至少兩個循環(huán)的離心和洗滌進入合適的緩沖液來分離內(nèi)含體。
16.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其特征在于步驟III中，內(nèi)含體溶于含尿素、異硫氰酸胍、鹽酸胍或其它任何變性試劑的變性緩沖液中并任選進行勻漿或超聲處理。
17.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其特征在于步驟III中，內(nèi)含體溶解之后，稀釋該溶液并向該溶液中添加氧化/還原劑，并在溫度10℃至30℃，優(yōu)選20℃，于攪拌下孵育10至30小時，優(yōu)選18至20，從而使蛋白物質(zhì)復性。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于稀釋該溶液直到280nm的光密度(OD280)達到0.01至2，優(yōu)選0.5，并且氧化/還原劑是谷胱甘肽，其氧化型和還原型的比例和濃度允許最大可能地形成二聚體形式。
19.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其特征在于在步驟IV中，來自前面步驟的溶液裝入陰離子交換柱上，裝載體積/柱體積的比率為1∶1至10∶1。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其特征在于裝載體積/柱體積的比率是10∶1。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其特征在于用乙醇胺-HCl、NaCl緩沖液洗脫蛋白質(zhì)，單體形式的蛋白主要包含在含不結(jié)合于樹脂的物質(zhì)的餾分中，而二聚體形式的蛋白主要包含在用150至250mM濃度的NaCl洗脫的隨后餾分中。
22.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其特征在于步驟V中，前述步驟中于150至250mM NaCl濃度處洗脫的溶液被稀釋并以相當于每毫升樹脂中280nm光密度為4.5至5.5OD的量裝入反相層析柱上。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其特征在于該蛋白通過兩個隨后洗脫階段洗脫，其中洗脫緩沖液含有梯度增加的有機溶劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其特征在于在梯度不斷增加的有機溶劑條件下實施第一洗脫階段直到出現(xiàn)單體形式洗脫峰，在等度洗脫條件下繼續(xù)洗脫直到單體形式洗脫峰耗盡，在梯度不斷增加的有機溶劑條件下實施第二階段直到主要是二聚體形式的蛋白完全洗脫。
25.根據(jù)權(quán)利要求22-24任一項的方法，其特征在于洗脫緩沖液含有乙醇、甲醇或乙腈。
26.根據(jù)權(quán)利要求22-25任一項的方法，其特征在于洗脫緩沖液是含百分比不斷增加的乙醇的氫化醇溶液。
27.根據(jù)權(quán)利要求22-26任一項的方法，其特征在于在直徑中值為30微米的顆粒的樹脂上實施反相層析。
28.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，包括額外的超濾步驟，其后為在存在或缺乏適當添加劑情況下的冷凍干燥。
29.通過權(quán)利要求1-25中任一項的方法可獲得的活性形式的胎盤生長因子，其特征在于它是純的，不含宿主菌株的污染物且它含有百分比不高于1.5％的單體形式，并且主要是二聚體和多聚體形式。
全文摘要
提取和純化在誘導型原核表達系統(tǒng)中表達的重組胎盤生長因子(PLGF)的方法包括下列步驟I)細菌細胞的發(fā)酵，II)內(nèi)含體的提取和純化，III)表達蛋白的復性，IV)離子交換層析，V)反相層析。
文檔編號C07K1/00GK1620465SQ02828331
公開日2005年5月25日 申請日期2002年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月5日
發(fā)明者D·瑪格里尼, M·巴緹斯特, E·康緹, G·薩爾維亞, M·圖斯 申請人:蓋莫納股份公司