專利名稱：：血紅蛋白-人血清白蛋白偶聯(lián)物制備血液代用品及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種血液代用品，尤其涉及以血紅蛋白為基質(zhì)的血液代用品研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：輸血對于臨床手術(shù)、抗災和戰(zhàn)場救護是不可缺少的醫(yī)療手段?？咳双I血不僅面臨血源短缺問題，而且由于血型復雜，輸血必須進行嚴格的配型，同時血液要低溫儲存，保存期短，運輸不便，更為嚴重的是肝炎、艾滋病等病毒的污染使輸血安全受到威脅。近年來，血液需求量不斷增高，而安全有效的血源卻日益緊缺。因此，近幾十年來人血液代用品一直是國際科學界和企業(yè)界關(guān)注的研究開發(fā)熱點。人血液代用品(humanbloodsubstitutes)，即人紅細胞代用品(humanredcellsubstitutes)，是具有氧傳遞功能、維持血液滲透壓和酸堿平衡及擴充容量的人工制劑。理想的血液代用品要求具有天然紅細胞的傳遞氧功能、生物相容性、安全性和穩(wěn)定性。其具有廣泛的應(yīng)用前景，不僅能用于和平時期和戰(zhàn)爭時期用于臨床外科、急性貧血、和大量出血的治療之外，也可用于各種疾病的治療，如圍術(shù)期常規(guī)使用、創(chuàng)傷治療、血液稀釋、局部缺血組織的灌流、敗血癥休克、多種抗體病人、腫瘤治療等?，F(xiàn)有的人血液代用品主要包括有機化學合成的高分子全氟碳化合物類和生物技術(shù)制備的血紅蛋白類及紅細胞類血液代用品。其中由于全氟碳化合物不具備天然血紅蛋白的生物學載氧特性，其研究與開發(fā)已不再是重點；通過血型轉(zhuǎn)換成的紅細胞具有貯存期短、不易運輸?shù)热秉c，其研究與應(yīng)用也受到極大的限制；而來源于紅細胞本身的血紅蛋白(Hb)具有高效的載氧能力和維持膠體滲透壓的功能，當前各國都將研制以血紅蛋白為基質(zhì)的攜氧劑作為主攻方向，主要包括化學修飾血紅蛋白以及脂質(zhì)體包封血紅蛋白和其它包含血紅蛋白的微膠囊(WinslowRM.Hemoglobin-basedredcellsubstitute.TheJohnHopkinsUniversityPress，BaltimoreandLondon.199239)。無基質(zhì)血紅蛋白在體內(nèi)易氧化或解離成單體和二聚體而引起腎毒性，并且存在氧親和性高、循環(huán)半壽期短、膠體滲透壓高等缺陷，采用化學修飾法實現(xiàn)血紅蛋白分子內(nèi)交聯(lián)并提高血紅蛋白分子量可在一定程度上解決這些問題。分子內(nèi)交聯(lián)增強了四聚體的穩(wěn)定性，提高血紅蛋白的分子量可使其不易直接透過腎而被循環(huán)代謝掉，從而延長其在體內(nèi)的循環(huán)半壽期。但并非所有的化學偶聯(lián)均能降低血紅蛋白的免疫原性。因此修飾要求一方面提高血紅蛋白分子量，消除產(chǎn)品在體內(nèi)代謝過程中的腎毒性副作用，另一方面修飾還要保持血紅蛋白的生物學活性，消除產(chǎn)品的免疫原性。目前常用的幾種血紅蛋白修飾方法有血紅蛋白自身聚合(RauschCW，GawrylMS，LightWRetal.Stablepolymerizedhemoglobinblood-substitute.EP1093720.2001-04-25)，血紅蛋白表面修飾大分子多聚物如PEG(DavisF，NHOK，ZALIPSKYS.Chemicallymodifiedhemoglobinasaneffective，stablenon-immunogenicredbloodcellsubstitute.US5234903.1993-08-10)，以及血紅蛋白與多糖或蛋白偶聯(lián)(AdamsonGJ.Hemoglobin-polysaccharideconjugates.US6500930.2002-11.31)雖然目前所研制的血液代用品很少具有天然血液的缺點，但還沒有一種血液代用品具有血液的全部優(yōu)點。就目前的研究水平看，血液代用品仍存在許多問題尚未解決，其中重要的是血液代用品的安全性和有效性等問題。血液代用品存在一些副作用(如血管收縮和高血壓)限制了它們的應(yīng)用，特別是用于有各種疾病的老年人身上。其次是產(chǎn)品在體內(nèi)循環(huán)中存留時間短(短則幾小時，最長壽命為70幾小時，而天然紅細胞的壽命則為120天)，只能提供短期的供氧功能，且與正常的血液功能差距較大。人血清白蛋白(HSA)分子量67,000，是血漿的主要蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)具有維持血液滲透壓和攜帶血液中多種配基(包括脂肪酸、氨基酸、類固醇、金屬離子及藥物)與組織進行交換等生理功能，醫(yī)療上作為重要的臨床藥物用于手術(shù)輸血和危重病人補液。將血紅蛋白與人血清白蛋白偶聯(lián)制備血液代用品的優(yōu)勢非常明顯。一方面，血紅蛋白是主要的載氧蛋白質(zhì)，白蛋白能夠維持血液滲透壓，運輸營養(yǎng)物質(zhì)，攜帶膽紅素等積累性毒性物質(zhì)從而具有解毒功能，因此該新型血液代用品與現(xiàn)有的血液代用品相比，將具有更完全的血液的功能。另一方面，偶聯(lián)人血清白蛋白大大增加血紅蛋白的分子量，同時進行的分子內(nèi)交聯(lián)可增強四聚體的穩(wěn)定性，并且HSA在體內(nèi)顯負電性，由于電荷作用不易透過膜，這樣更進一步延長了偶聯(lián)物在體內(nèi)的循環(huán)半壽期。并且更容易形成分子量較均一的的交聯(lián)產(chǎn)物，避免多聚體的聚集，消除腎毒副作用。更重要的是，不同于其它動物的血清白蛋白，來源于人的血清白蛋白不會產(chǎn)生免疫原性，若與動物血紅蛋白偶聯(lián)，還會在很大程度上減弱或消除異體的血紅蛋白輸入人體內(nèi)造成的免疫原性。因此本發(fā)明采取來自于人或豬、牛、馬、羊、狗等動物的血紅蛋白與人血清白蛋白偶聯(lián)的方式，制備一種安全有效的新型血液代用品。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種血紅蛋白與人血清白蛋白的偶聯(lián)物及其制備方法。本發(fā)明偶聯(lián)物的血紅蛋白來自于人或其它哺乳動物，優(yōu)選為豬、牛、羊、馬、狗的血紅細胞。偶聯(lián)物中血紅蛋白數(shù)目為1～3個，優(yōu)選為1～2個，人血清白蛋白數(shù)目為1～3個，優(yōu)選為1個。偶聯(lián)物中血紅蛋白是分子內(nèi)交聯(lián)或未分子內(nèi)交聯(lián)的血紅蛋白，優(yōu)選為分子內(nèi)交聯(lián)的血紅蛋白。偶聯(lián)產(chǎn)物分子量分布在100KD～300KD之間。該偶聯(lián)物用作血液代用品具有載氧、維持滲透壓及運輸營養(yǎng)成分的較完全的血液的功能。本發(fā)明提供的偶聯(lián)物的制備方法，包括無基質(zhì)血紅蛋白的制備、血紅蛋白與人血清白蛋白的偶聯(lián)以及偶聯(lián)產(chǎn)物的純化。將膜過濾和離子交換層析集成純化血紅蛋白，可以得到電泳純或色譜純無基質(zhì)血紅蛋白。將洗凈的紅細胞在低滲透壓下溶脹破裂(DocziJ.Injectablestromafreehemoglobinanditsmethodofmanufacture.1976，US3991181)，得到的紅細胞裂解液經(jīng)0.22～0.65μm膜微濾，再經(jīng)10～30KD膜超過濾，優(yōu)選為0.45μm膜微濾，再經(jīng)30KD膜超過濾進行預處理。所得血紅蛋白溶液經(jīng)透過式陰離子交換層析進一步純化，層析介質(zhì)優(yōu)選為DEAESepharoseFastFlow、QMASpherosilLS、QSepharoseBigBeads(Amershamphamacia，Sweden)，層析采用pH值為6.6～8.5，優(yōu)選為pH值為7.0～7.8的磷酸緩沖液，緩沖液濃度為10mM～100mM，優(yōu)選為20～50mM。采用PEG伴隨式層析，選擇PEG400～PEG4000，濃度為0.25％～10％，優(yōu)選為0.5～5％，層析的回收率大于95％。純化各單元的操作溫度為4～10℃。得到用于與人血清白蛋白交聯(lián)。本發(fā)明采用的偶聯(lián)劑為與蛋白質(zhì)氨基、巰基或羥基反應(yīng)的雙功能交聯(lián)劑，優(yōu)選為帶有醛基、琥珀酰亞胺(NHS)基團、環(huán)氧基團、馬來酰亞胺基團、亞胺酸酯基團的同型或異性雙功能交聯(lián)劑。本發(fā)明的人血清白蛋白與血紅蛋白偶聯(lián)方法，包括液相一步偶聯(lián)法和兩步偶聯(lián)法，還包括將蛋白質(zhì)吸附在固相介質(zhì)上進行偶聯(lián)的方法。一步偶聯(lián)方法將蛋白質(zhì)溶于pH6～12，優(yōu)選為pH7.5～9.5的磷酸、HEPES、硼酸、硼砂-氫氧化鈉或碳酸鈉緩沖溶液中，蛋白質(zhì)濃度為1～150mg/ml，優(yōu)選蛋白質(zhì)濃度為10～100mg/ml，加入交聯(lián)劑，交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)的配比為3∶1～600∶1，優(yōu)選為10∶1～200∶1，控制反應(yīng)溫度4～55℃，優(yōu)選為25～37℃，反應(yīng)時間0.1～48小時，優(yōu)選為0.5～10小時。兩步交聯(lián)方法先活化血紅蛋白或先活化人血清白蛋白，將其溶于pH6～12，優(yōu)選為pH7.0～9.5的磷酸、HEPES、硼酸、硼砂-氫氧化鈉或碳酸鈉緩沖溶液中，蛋白質(zhì)濃度為1～150mg/ml，優(yōu)選蛋白質(zhì)濃度為5-60mg/ml，控制反應(yīng)溫度4～55℃之間，優(yōu)選為25～37℃，加入交聯(lián)劑，交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)的配比為3∶1～600∶1，優(yōu)選為10∶1～500∶1，反應(yīng)時間0.1～48小時，優(yōu)選為0.5～10小時。交聯(lián)劑與血紅蛋白或人血清白蛋白的活性基團反應(yīng)(該活性基團可以為巰基或氨基)后，過SephadexG～25脫鹽柱或低溫透析脫修飾劑，同時調(diào)節(jié)緩沖液pH值，使pH與第一步反應(yīng)pH相同或不同，但其pH范圍仍為6～12，優(yōu)選為7.5～9.5，再等量加入另一種蛋白，使交聯(lián)劑與其活性基團(該活性基團可以為巰基或氨基)再繼續(xù)反應(yīng)1～48小時。固相介質(zhì)上的偶聯(lián)介質(zhì)選用陰離子交換介質(zhì)或陽離子交換介質(zhì)，優(yōu)選為DEAESepharoseFastFlow、QSepharoseBigBeads、QSepharoseFastFlow、SPSepharoseFastFlow以及CMSepharoseFastFlow(Amershamphamacia，Sweden)。用50mMpH4.0～8.5，優(yōu)選為pH4.5～7.5的磷酸鹽或HEPES緩沖液平衡層析介質(zhì)，加入0.5～5mg/ml的血紅蛋白或人血清白蛋白溶液，使蛋白質(zhì)首先吸附在介質(zhì)上。再加入交聯(lián)劑，使交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)的摩爾比為30∶1～600∶1，優(yōu)選為10∶1～500∶1，反應(yīng)時間0.1～12小時，優(yōu)選為0.5～10小時。用上述平衡緩沖液洗柱除去過量的交聯(lián)劑后，再用含有0.5MNaCl的該緩沖液將帶有交聯(lián)劑的活化的蛋白質(zhì)洗脫，收集蛋白峰。經(jīng)SephadexG-25凝膠過濾柱，脫去溶液中的NaCl。收集含蛋白的洗脫液，超過濾濃縮至蛋白濃度為1～5mg/ml，加入等摩爾的另外一種蛋白質(zhì)，同時調(diào)節(jié)緩沖液pH值，使pH與第一步反應(yīng)pH相同或不同，其pH范圍仍為6～12，優(yōu)選為7.5～9.5，使活化的蛋白質(zhì)交聯(lián)劑與另外一種蛋白質(zhì)活性基團(該活性基團可以為巰基或氨基)再繼續(xù)反應(yīng)1～24小時，可以得到血紅蛋白與人血清白蛋白1∶1的偶聯(lián)物。本發(fā)明制備的偶聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)過離子交換層析、超過濾以及凝膠過濾層析純化，除去未發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)及分子量大于300KD和小于100KD的成分。將純化后的偶聯(lián)產(chǎn)物pH值調(diào)至7.4，對于受2，3-二磷酸甘油酸影響的血紅蛋白，需要向溶液中加入2，3-DPG或磷酸吡哆醛等調(diào)節(jié)血紅蛋白氧親和力的共價調(diào)節(jié)劑。終產(chǎn)品其具有良好的血液代用品的特性。本發(fā)明通過以下具體實施例來描述本血液代用品，即血紅蛋白與人血清白蛋白偶聯(lián)物的制備方法。圖1為純化后的血紅蛋白電泳掃描圖譜A為血紅蛋白溶脹破裂液B為純化后的血紅蛋白圖2為純化后的血紅蛋白高效凝膠過濾液相色譜色譜柱為TSK3000SW，檢測波長280nm圖3為DEAESepharoseFastFlow陰離子交換法分離純化偶聯(lián)物圖4為Superdex200凝膠過濾法鑒定偶聯(lián)物a為離子交換法收集的蛋白峰上凝膠過濾柱b為反應(yīng)混合物上凝膠過濾柱圖5為SDS-PAGE鑒定偶聯(lián)物圖譜1為標準分子量蛋白，2為偶聯(lián)物，3為標準牛血清白蛋白，4為純化的無基質(zhì)血紅蛋白圖6為偶聯(lián)產(chǎn)物的載氧活性具體實施方法實施例1電泳純無基質(zhì)牛血紅蛋白的制備取一定體積洗凈的新鮮牛血紅細胞，用兩倍體積的冷溶脹液(含0.6％NaCl的20mmol/LKH2PO4/Na2HPO4(PBS)緩沖液，pH7.4)懸浮，4℃振蕩1h；以每分鐘溶液總體積10％的速度泵入2倍紅細胞體積的20mmol/LPBS緩沖液(pH7.4)，振蕩1h后調(diào)NaCl鹽濃度為0.9％，即得血紅細胞溶脹破裂液。采用MilliporePellicon錯流膜過濾系統(tǒng)對破裂液進行預處理。先采用0.22μm膜微濾去除細胞碎片及大分子雜質(zhì)，再進一步用截留分子量10KD的膜超過濾除去小分子雜質(zhì)。所得血紅蛋白溶液經(jīng)DEAESepharoseFastFlow陰離子交換層析進一步純化。采用PEG伴隨式層析，用含有5％PEG400的20mM磷酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH值為7.4進行層析，收集透過的血紅蛋白峰經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測為一條帶(圖1)。層析的回收率為97％。操作溫度為10℃。用HEMOX血氣分析儀檢測純化后的血紅蛋白的50％氧飽和度(P50)為25.6mmHg，Hill系數(shù)為2.41。實施例2色譜純無基質(zhì)豬血紅蛋白的制備取一定體積洗凈的新鮮豬血紅細胞，用兩倍體積的冷溶脹液(含0.6％NaCl的20mmol/LKH2PO4/Na2HPO4(PBS)緩沖液，pH7.4)懸浮，4℃振蕩1h；以每分鐘溶液總體積10％的速度泵入2倍紅細胞體積的20mmol/LPBS緩沖液(pH7.4)，振蕩1h后調(diào)NaCl鹽濃度為0.9％，即得血紅細胞溶脹破裂液。采用MilliporePellicon錯流膜過濾系統(tǒng)對破裂液進行預處理。先采用0.45μm膜微濾去除細胞碎片及大分子雜質(zhì)，再進一步用截留分子量30KD的膜超過濾除去小分子雜質(zhì)。所得血紅蛋白溶液經(jīng)QSepharoseBigBeads陰離子交換層析進一步純化。操作溫度為4℃。采用PEG伴隨式層析，用含有0.5％PEG4000的20mM磷酸緩沖液，采用10mM的磷酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH值為7.8進行層析，收集透過的血紅蛋白峰經(jīng)高效凝膠過濾液相色譜(HPLC)檢測為單峰(圖2)，層析的回收率為95％。實施例3間-馬來酰亞胺苯甲酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)一步交聯(lián)人血紅蛋白與人血清白蛋白由于HSA分子的巰基基團會與MBS反應(yīng)，從而影響偶聯(lián)反應(yīng)。因此，在用MBS活化HSA前需要封閉剩余的巰基。向10ml的5mg/mlHSA溶液(pH7.8的HEPES緩沖液)緩慢加入0.2ml的30mM碘代乙酰胺，室溫下反應(yīng)20分鐘。隨后加入0.5ml的30mMMBS溶液(溶于二甲基甲酰胺)，室溫下反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)混合液通過SephadexG-25凝膠過濾柱，除去過量的MBS和碘代乙酰胺，收集蛋白組分。因血紅蛋白分子有反應(yīng)活性的巰基基團(β-93半胱氨酸的巰基)，活化的HSA可直接與血紅蛋白分子反應(yīng)。收集的蛋白組分與10ml的20mg/ml血紅蛋白溶液分別充氮氣2小時，混合后在氮氣保護下于室溫反應(yīng)2小時。隨后，加入0.2ml的30mM碘乙酰胺來終止偶聯(lián)反應(yīng)。實施例4乙二醇二縮水甘油醚兩步法交聯(lián)羊血紅蛋白與人血清白蛋白血紅蛋白濃度60mg/ml，溶液體系為pH7.5的50mM的HEPES緩沖液、溶液總體系為10ml，乙二醇二縮水甘油醚與血紅蛋白摩爾比為500∶1，37℃水浴搖床反應(yīng)10小時，通過SephadexG-25凝膠過濾除修飾劑，換緩沖液為pH9.5的50mM的硼砂-氫氧化鈉緩沖液，按血紅蛋白∶白蛋白＝1∶1加入白蛋白，37℃水浴搖床反應(yīng)48小時。交聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示有83kD和97kD條帶生成。血紅蛋白單亞基分子量約為16kD，白蛋白分子量為67kD，83kD為單個血紅蛋白亞基與血清白蛋白的交聯(lián)物，97kD為交聯(lián)的兩個血紅蛋白亞基與一個血清白蛋白的偶聯(lián)物。說明生成了血紅蛋白與血清白蛋白的偶聯(lián)物。實施例5戊二醛兩步法交聯(lián)狗血紅蛋白與人血清白蛋白白蛋白濃度1mg/ml，溶液體系為pH7.0的50mM的HEPES緩沖液、溶液總體系為10ml，戊二醛與白蛋白摩爾比為100∶1，37℃水浴搖床反應(yīng)1小時，通過SephadexG-25凝膠過濾除修飾劑，換緩沖液為pH8.5的50mM的硼酸-硼砂緩沖液，按血紅蛋白∶白蛋白＝1∶1加入血紅蛋白，37℃水浴搖床反應(yīng)10小時。交聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示有83kD條帶生成。血紅蛋白單亞基分子量約為16kD，白蛋白分子量為67kD，83kD為單個血紅蛋白亞基與血清白蛋白的交聯(lián)物，說明生成了血紅蛋白與血清白蛋白的偶聯(lián)物。實施例6乙醇醛固相交聯(lián)馬血紅蛋白與人血清白蛋白用50mMHEPES緩沖液(pH6.6)平衡5mlQSepharoseFastFlow介質(zhì)，與10ml的2mg/ml牛血清白蛋白溶液混合，使蛋白吸附在介質(zhì)上。加入乙醇醛，其與蛋白質(zhì)的摩爾比為500∶1，混勻后在10℃下靜置，并將柱封住。2小時后用300ml50mMHEPES緩沖液(pH6.6)洗柱，隨后改用含有0.5MNaCl的50mMHEPES緩沖液(pH6.6)洗脫，收集蛋白峰。收集物隨后上用50mMHEPES緩沖液(pH6.6)平衡的SephadexG-25凝膠過濾柱，脫去溶液中的NaCl。收集含蛋白的洗脫液，超過濾濃縮至蛋白濃度為5mg/ml，加入等摩爾的血紅蛋白，同時調(diào)節(jié)緩沖液pH值9.5，使活化的白蛋白所帶交聯(lián)劑與血紅蛋白再繼續(xù)反應(yīng)24小時，得到兩種蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物。實施例7戊二醛固相交聯(lián)牛血紅蛋白與人血清白蛋白用50mM磷酸緩沖液(pH8.0)平衡5mlDEAESepharoseFastFlow介質(zhì)，與10ml的5mg/ml血紅蛋白溶液混合，使蛋白吸附在介質(zhì)上。加入戊二醛，其與蛋白質(zhì)的摩爾比為10∶1，混勻后在4℃下靜置，并將柱封住。0.5小時后用300ml50mM磷酸緩沖液(pH8.0)洗柱，隨后改用含有0.5MNaCl的50mMHEPES緩沖液(pH8.0)洗脫，收集蛋白峰。收集物隨后上用50mMHEPES緩沖液(pH8.0)平衡的SephadexG-25凝膠過濾柱，脫去溶液中的NaCl。收集含蛋白的洗脫液，超過濾濃縮至蛋白濃度為1mg/ml，加入等摩爾的白蛋白，緩沖液pH值仍為8.0，使活化的血紅蛋白的戊二醛醛基與白蛋白再繼續(xù)反應(yīng)8小時，得到兩種蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物。實施例8偶聯(lián)產(chǎn)物的純化用300KD和100KD的超濾膜除去聚合產(chǎn)物中大于300KD和小于100KD的成分，所得產(chǎn)物為分子量分布在100KD～300KD之間的偶聯(lián)產(chǎn)物，即1～3個已經(jīng)分子內(nèi)交聯(lián)或未分子內(nèi)交聯(lián)的血紅蛋白與1～3個人血清白蛋白分子的偶聯(lián)物。實施例9偶聯(lián)產(chǎn)物的純化將實施例6中偶聯(lián)產(chǎn)物的pH值調(diào)至7.0，上DEAESepharoseFastFlow陰離子交換層析柱，該柱已用含有0.1MNaCl的50mMHEPES緩沖液(pH7.0)平衡。用25ml平衡液洗脫，流速為0.5ml/min。隨后改用55ml含有0.1-0.5MNaCl的50mMHEPES緩沖液(pH7.0)洗脫，流速為0.5ml/min。洗脫液在280nm下檢測，圖譜見圖3。收集含有偶聯(lián)物的蛋白峰，濃縮后上Superdex200凝膠過濾柱。以50mMHEPES緩沖液(pH7.0)為流動相，流速為0.35ml/min。洗脫后在280nm下檢測出現(xiàn)兩個洗脫峰，其中偶聯(lián)物在第一個洗脫峰(圖4)，收集用SDS-PAGE凝膠電泳進一步鑒定(圖5)。純化的偶聯(lián)物主要含兩條蛋白帶(第2泳道)，分子量約為16kDa和83kDa。這是由于血紅蛋白為四聚體蛋白，加入上樣緩沖液煮沸后，解聚為16kDa的亞基。而血紅蛋白與HSA偶聯(lián)后，四聚體蛋白中的3個亞基解離出來，而剩下的1個亞基與BSA分子結(jié)合為分子量83kDa的蛋白。因此，可確定該蛋白為1∶1結(jié)合的HSA-血紅蛋白偶聯(lián)物。實施例10本血液代用品成品制得及特性將純化后的偶聯(lián)產(chǎn)物的pH值調(diào)至7.4。對于受2，3-二磷酸甘油酸影響的血紅蛋白，需要向溶液中加入2，3-DPG或磷酸吡哆醛等調(diào)節(jié)血紅蛋白氧親和力的共價調(diào)節(jié)劑。實施例7中偶聯(lián)產(chǎn)物用HEMOX血氣分析儀檢測純化后的血紅蛋白的P50為26.8mmHg，Hill系數(shù)為2.30(圖6)。權(quán)利要求1.一種蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物，其特征是血紅蛋白與人血清白蛋白的偶聯(lián)物。2.權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征是血紅蛋白數(shù)目為1～3個，人血清白蛋白數(shù)目為1～3個。3.權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征是血紅蛋白數(shù)目為1～2個，人血清白蛋白數(shù)目為1～2個。4.權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征是血紅蛋白數(shù)目為1個，人血清白蛋白數(shù)目為1個。5.權(quán)利要求1～4中任一權(quán)利要求所述的偶聯(lián)物，其特征是偶聯(lián)產(chǎn)物分子量分布在100KD～300KD之間。6.權(quán)利要求1～4中任一權(quán)利要求所述的偶聯(lián)物，其特征是血紅蛋白是分子內(nèi)交聯(lián)的血紅蛋白。7.權(quán)利要求1中所述偶聯(lián)物的制備方法，其中血紅蛋白的制備方法是將膜過濾和離子交換層析集成純化血紅蛋白，步驟如下1)用0.22～0.65μm膜微濾，得到的透過液經(jīng)10～30KD膜超濾；2)超過濾后的血紅蛋白濃縮液經(jīng)透過式陰離子交換層析，層析pH值為7.0～7.8，緩沖液濃度為10mM～50mM，采用PEG伴隨式層析，選擇PEG400～PEG4000，濃度為0.25％～10％，操作溫度為4～10℃。8.權(quán)利要求1中所述偶聯(lián)物的制備方法，是指在液相中將兩種蛋白質(zhì)直接與交聯(lián)劑反應(yīng)的一步偶聯(lián)法，或者先修飾一種蛋白質(zhì)再偶聯(lián)另外一種蛋白質(zhì)的兩步偶聯(lián)法，或者將蛋白質(zhì)吸附在固相介質(zhì)上進行偶聯(lián)的方法，采用的偶聯(lián)劑為與蛋白質(zhì)氨基、巰基或羥基反應(yīng)的雙功能交聯(lián)劑。9.權(quán)利要求1中所述偶聯(lián)物的制備方法，其中偶聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)過離子交換層析、超過濾以及凝膠過濾層析純化，除去未發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)及分子量大于300KD和小于100KD的成分。10.權(quán)利要求1中所述的偶聯(lián)物用作血液代用品的用途。全文摘要本發(fā)明提供了一種血紅蛋白與人血清白蛋白偶聯(lián)物及其制備方法。采用膜過濾和離子交換層析純化血紅蛋白，采用液相一步偶聯(lián)法、兩步偶聯(lián)法或者將蛋白質(zhì)吸附在固相介質(zhì)上偶聯(lián)的方法將血紅蛋白與人血清白蛋白偶聯(lián)，偶聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)過離子交換層析、超過濾以及凝膠過濾層析純化，制備的偶聯(lián)產(chǎn)物分子量分布在100KD～300KD之間，為1～3個已經(jīng)分子內(nèi)交聯(lián)或未分子內(nèi)交聯(lián)的血紅蛋白與1～3個人血清白蛋白分子的偶聯(lián)物。采用固相吸附法可以得到血紅蛋白與人血清白蛋白1∶1的偶聯(lián)物。終產(chǎn)品具有良好的血液代用品的特性。文檔編號C07K14/805GK1535986SQ0310962公開日2004年10月13日申請日期2003年4月9日優(yōu)先權(quán)日2003年4月9日發(fā)明者蘇志國,路秀玲,鄭春楊,徐宇紅,胡濤申請人:中國科學院過程工程研究所