專利名稱：抗腫瘤重組蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中的抗腫瘤重組蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴(yán)重的一類疾病。目前治療癌癥的常用方法有外科手術(shù)治療、化學(xué)藥物療法、放射治療、生物療法和中醫(yī)中藥療法。其中以外科手術(shù)治療、化學(xué)藥物療法、放射治療最為常用。外科手術(shù)治療作為大多數(shù)腫瘤治療的首選和主要方案，使無(wú)數(shù)腫瘤患者得以康復(fù)、延長(zhǎng)壽命或者提高了生活質(zhì)量。但是，在腫瘤治療方面，外科手術(shù)治療只適用于一定條件和范圍的病人，而且由于腫瘤可復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的原因，手術(shù)切除并不都能達(dá)到根治的目的?；瘜W(xué)藥物療法和放射治療的運(yùn)用在腫瘤的治療方面也發(fā)揮著非常重要和必不可少的作用，并且也在不斷的發(fā)展。但是，目前應(yīng)用的化療藥物療法和放射治療對(duì)身體中所有活躍的增殖細(xì)胞都有侵害，如造血系統(tǒng)、胃腸道等，所以放化療的病人常有血象降低、胃腸道出血、惡心、嘔吐等癥狀。而且，由于受到病人機(jī)體和精神方面承受力及腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)耐藥性等多方面原因的限制，放化療并不能殺死所有的腫瘤細(xì)胞，為腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移及疾病的惡化留下了隱患。生物療法和中醫(yī)中藥療法也是抗腫瘤的合理的方法，但仍需繼續(xù)研究以提高療效。因此，開(kāi)發(fā)有明顯治療效果、安全的抗腫瘤藥物已經(jīng)成為醫(yī)藥界面臨的一項(xiàng)迫在眉睫的任務(wù)。
研究表明，惡性實(shí)體腫瘤的無(wú)限制侵襲性生長(zhǎng)及其轉(zhuǎn)移依賴于新血管的不斷生成，所以抑制血管生成能顯著地抑制腫瘤的生長(zhǎng)。抑制血管生成，阻斷瘤體血液供應(yīng)是不同于常規(guī)抗腫瘤治療的新策略，也稱為“腫瘤饑餓療法”，已經(jīng)成為抗腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。正常生理狀態(tài)下，除了女性生殖系統(tǒng)在排卵，黃體生成，懷孕等過(guò)程，有短暫的新生血管生成過(guò)程外，成年人的脈管系統(tǒng)增生處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)。但是在腫瘤組織中，為適應(yīng)瘤組織的快速生長(zhǎng)，血管生成非?；钴S，以及時(shí)為瘤組織生長(zhǎng)供應(yīng)血液。腫瘤組織中的微血管來(lái)源有兩種一種是腫瘤細(xì)胞等產(chǎn)生的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)瘤體生成微血管；另一種是殘存于瘤體的宿主血管逐漸變?yōu)槟[瘤血管，既宿主血管的腫瘤化。與正常血管不同，腫瘤血管的血管內(nèi)皮細(xì)胞不完整，基底膜稀疏且易于泄露。腫瘤血管生成后不再進(jìn)一步分化改建成動(dòng)脈及靜脈，無(wú)平滑肌及神經(jīng)末梢，屬于被動(dòng)血管，其血流完全依賴于體循環(huán)。新生的微血管是腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的第一站，腫瘤細(xì)胞通過(guò)腫瘤微血管壁進(jìn)入血液循環(huán)向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。
實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)需要大量的血液供應(yīng)。許多實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)抑制動(dòng)物體內(nèi)新血管生成，可有效地切斷為腫瘤生長(zhǎng)提供養(yǎng)分的血液供應(yīng)，使瘤體萎縮以至消失?？剐律芩幬颰NP-470以及抗bFGF、VEGF單克隆抗體的應(yīng)用，突變型VEGF受體FlK-1競(jìng)爭(zhēng)性阻斷VEGF信號(hào)傳導(dǎo)，αVβ3過(guò)度表達(dá)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、以及Angiostatin特異抑制腫瘤新生血管形成等，均可抑制腫瘤生長(zhǎng)，是一種新型的、有前途的抗腫瘤藥物，可以彌補(bǔ)當(dāng)前臨床腫瘤治療手段的局限并取代部分治療手段。由于這類藥物是通過(guò)抑制新生血管的形成來(lái)達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的，而人的正常組織細(xì)胞的生長(zhǎng)不依賴于新生血管的生成，所以對(duì)正常組織幾乎沒(méi)有毒副作用。這類藥物不直接作用于腫瘤細(xì)胞，故抑制腫瘤具有廣譜性而不產(chǎn)生抗藥性，是當(dāng)前國(guó)際上公認(rèn)的有效、安全、有前途的抗腫瘤藥物。它主要用于原位和轉(zhuǎn)移實(shí)體瘤的治療和輔助腫瘤的手術(shù)治療，也可以用來(lái)防止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，開(kāi)發(fā)具有血管增生抑制作用的抗腫瘤藥物，在惡性腫瘤的防治方面，具有重要的臨床意義。
心肌肌鈣蛋白I和心肌肌鈣蛋白C均是心肌肌鈣蛋白的亞基，目前常被用作心肌梗塞診斷的標(biāo)志物，心肌肌鈣蛋白I是序列表中的SEQ ID №1，由210個(gè)氨基酸殘基組成；心肌肌鈣蛋白C由160個(gè)氨基酸殘基組成。
大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是用于表達(dá)外源蛋白的最成功的表達(dá)系統(tǒng)之一，近年來(lái)發(fā)展非常迅速，目前已有幾百種蛋白在該表達(dá)系統(tǒng)中得以表達(dá)。畢赤酵母是一種甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母菌，其生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，可以高密度連續(xù)培養(yǎng)，遺傳操作與釀酒酵母相似，技術(shù)已相當(dāng)成熟，是工業(yè)生產(chǎn)中常用的高表達(dá)菌種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供抗腫瘤重組蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明提供的抗腫瘤重組蛋白，選自下列蛋白質(zhì)家族中任意一種(1)心肌肌鈣蛋白I的N末端氨基酸殘基與心肌肌鈣蛋白C羧基端氨基酸殘基序列部分或全部相融合的蛋白質(zhì)；(2)心肌肌鈣蛋白I的C末端氨基酸殘基與心肌肌鈣蛋白C氨基端氨基酸殘基序列部分或全部相融合的蛋白質(zhì)；(3)心肌肌鈣蛋白I的N末端氨基酸殘基與心肌肌鈣蛋白C羧基端氨基酸殘基序列部分或全部、心肌肌鈣蛋白I的C末端氨基酸殘基與心肌肌鈣蛋白C氨基端氨基酸殘基序列部分或全部相融合的蛋白質(zhì)。
上述心肌肌鈣蛋白C氨基端氨基酸殘基序列是序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列，其羧基端氨基酸殘基序列是序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列。
所述抗腫瘤重組蛋白可為序列表中SEQ ID №4的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID№4的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQID №4相同活性的由SEQ ID №4衍生的蛋白質(zhì)；所述抗腫瘤重組蛋白可為序列表中SEQ ID №5的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №5的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №5相同活性的由SEQ ID №5衍生的蛋白質(zhì)；所述抗腫瘤重組蛋白可為序列表中SEQ ID №6的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №6的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №6相同活性的由SEQ ID №6衍生的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供抗腫瘤重組蛋白的編碼基因。
本發(fā)明提供的抗腫瘤重組蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一(1)序列表中的SEQ ID №7或與其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；(2)序列表中的SEQ ID №8或與其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；(3)序列表中的SEQ ID №9或與其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；(4)序列表中的SEQ ID №10或與其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；(5)序列表中的SEQ ID №11或與其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；(6)序列表中的SEQ ID №12或與其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；(7)編碼序列表中SEQ ID №4蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；(8)編碼序列表中SEQ ID №5蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；(9)編碼序列表中SEQ ID №6蛋白質(zhì)序列的多核苷酸。
含有上述基因的表達(dá)載體及細(xì)胞系均屬本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種上述抗腫瘤重組蛋白在大腸桿菌和畢赤酵母菌中的高效表達(dá)方法。
抗腫瘤重組蛋白的高效表達(dá)方法一，是將編碼抗腫瘤重組蛋白的基因?qū)氲疆叧嘟湍妇?，表達(dá)獲得抗腫瘤重組蛋白。
具體地說(shuō)，該方法包括以下步驟1、選用畢赤酵母菌優(yōu)選密碼子，并用計(jì)算機(jī)模擬計(jì)算了翻譯起始區(qū)和抗腫瘤重組蛋白基因5’端二級(jí)結(jié)構(gòu)最小生成自由能，設(shè)計(jì)并合成序列7，或序列8，或序列11抗腫瘤重組蛋白基因序列；2、將合成的基因片段分別與載體pPIC9K連接，得到表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌后獲得表達(dá)工程菌；3、培養(yǎng)工程菌，表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)液中，獲得目標(biāo)蛋白。
為了獲得更好的效果，畢赤酵母菌的表達(dá)過(guò)程中用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)過(guò)程中的甲醇終濃度優(yōu)選為1％-5％。
所述畢赤酵母菌優(yōu)選為GS115畢赤酵母菌。
抗腫瘤重組蛋白的高效表達(dá)方法二，是將編碼抗腫瘤重組蛋白的基因?qū)氲酱竽c桿菌中，表達(dá)獲得抗腫瘤重組蛋白。
具體地說(shuō)，該方法包括以下步驟1、選用大腸桿菌優(yōu)選密碼子，設(shè)計(jì)并合成序列9，或序列10，或序列12抗腫瘤重組蛋白基因序列；2、將合成的基因片段分別與載體pET21b連接，得到表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后獲得表達(dá)工程菌；3、培養(yǎng)工程菌，表達(dá)產(chǎn)物，獲得目標(biāo)蛋白。
所述大腸桿菌優(yōu)選為BL21-DE3大腸桿菌。
本發(fā)明將心肌肌鈣蛋白I和心肌肌鈣蛋白C進(jìn)行融合，合成新的心肌肌鈣蛋白I-C融和體。該融合體具有明顯的抗小鼠實(shí)體腫瘤的作用，大鼠靜脈注射融合體蛋白的血漿穩(wěn)定性較靜脈注射心肌肌鈣蛋白I的血漿穩(wěn)定性明顯延長(zhǎng)。在臨床上可降低藥劑量提高療效。在惡性腫瘤的治療方面，具有重要意義。
用本發(fā)明的方法得到的抗腫瘤重組蛋白占培養(yǎng)液總蛋白的20-60％，表達(dá)過(guò)程操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)品成本較低，可用于規(guī)模化生產(chǎn)，對(duì)于開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤藥物具有重要意義。


圖1為pPIC-AAF表達(dá)質(zhì)粒的圖譜。
圖2為pPIC-AAF表達(dá)質(zhì)粒酶切凝膠電泳圖譜。
圖3為甲醇誘導(dǎo)后的GS115畢赤酵母菌培養(yǎng)液電泳圖譜圖4為pET-AAF表達(dá)質(zhì)粒的圖譜。
圖5為pET-AAF表達(dá)質(zhì)粒酶切凝膠電泳圖譜。
圖6為IPTG誘導(dǎo)后的BL21-DE3大腸桿菌培養(yǎng)液電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、抗腫瘤重組蛋白的畢赤酵母菌體外表達(dá)1、抗腫瘤重組蛋白基因的合成人工合成序列表中序列13(心肌肌鈣蛋白I的編碼基因)的全長(zhǎng)序列，并在其5’端加上NdeI、3’端加上NotI酶切位點(diǎn)，得到序列AFF1；人工合成序列表中序列7的1-285位堿基序列，并在其5’端加上NdeI酶切位點(diǎn)、3’端加上與基因序列13的5’端互補(bǔ)的15個(gè)堿基，然后將此序列與序列AFF1連接，得到序列AFF2；人工合成序列表中序列8的631-858堿基，并在其3’端加上NotI酶切位點(diǎn)、5’端加上與基因序列13的3’端互補(bǔ)的15個(gè)堿基，然后將此序列與序列AFF1連接，得到序列AFF3。
2、抗腫瘤重組蛋白體外表達(dá)(1)將上述人工合成的全序列分別裝入pGEM-T-EASY質(zhì)粒內(nèi)，分別構(gòu)建pGEM-AAF1\AAF2\AAF3克隆載體。
(2)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建采用購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司的高效表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K，用NdeI和NotI分別酶切pGEM-AAF1\AAF2\AAF3質(zhì)粒和pPIC9K質(zhì)粒，凝膠電泳收集目標(biāo)片段，用T4連接酶16℃過(guò)夜連接。經(jīng)常規(guī)方法的轉(zhuǎn)化，挑菌，擴(kuò)增獲得表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-AAF1\AAF2\AAF3，其通用結(jié)構(gòu)圖譜如圖1所示。如圖4所示，酶切鑒定，證明表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)正確。圖中，泳道1為pPIC-AAF1表達(dá)質(zhì)粒酶切凝膠電泳結(jié)果，泳道2為pPIC-AAF3表達(dá)質(zhì)粒酶切凝膠電泳結(jié)果，泳道3為pPIC-AAF2表達(dá)質(zhì)粒酶切凝膠電泳結(jié)果。
(3)將質(zhì)粒pPIC9K-AAF1\AAF2\AAF3分別用SacI線性化，采用浙江新芝公司電基因?qū)雰x，將線性化的pPIC9K-AAF1\AAF2\AAF3分別導(dǎo)入GS115畢赤酵母菌(購(gòu)自Invitrogen公司)內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)，挑選，篩選等過(guò)程，獲得三種抗G418mg/ml的單克隆菌。
(4)挑選單克隆菌，接種于5ml培養(yǎng)基中，30℃過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)入250ml培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600＝10-20，收集菌體，用無(wú)碳源培養(yǎng)基稀釋至OD600＝50，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，加入甲醇至終濃度為1％誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24小時(shí)加甲醇一次，至96小時(shí)。離心取上清液，進(jìn)行凝膠電泳分析和功能測(cè)定。取10ml上清液，用12％SDS-PAGE電泳，并經(jīng)考馬斯亮蘭染色。結(jié)果如圖3所示，AAF1序列在32KD的位置，有誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)，并根據(jù)BSA對(duì)照，表達(dá)量為30mg/L；AAF2序列在38KD的位置，有誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)，并根據(jù)BSA對(duì)照，表達(dá)量為50mg/L；AAF3序列在43KD的位置，有誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)，并根據(jù)BSA對(duì)照，表達(dá)量為80mg/L。圖中，泳道1為pPIC-AAF1表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)液電泳結(jié)果，泳道2為pPIC-AAF3表達(dá)質(zhì)的轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)液電泳結(jié)果，泳道3為pPIC-AAF2表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)液電泳結(jié)果。
在本實(shí)施例中，培養(yǎng)單克隆菌體時(shí)用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)意義很大，在沒(méi)有誘導(dǎo)之前，培養(yǎng)液中目標(biāo)蛋白的含量很低，如圖3所示，誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液中有顯著的目標(biāo)蛋白帶，而誘導(dǎo)前的培養(yǎng)液中沒(méi)有顯著的目標(biāo)蛋白帶。
3、本發(fā)明抗腫瘤重組蛋白的功能測(cè)定取24只昆明小鼠，分為甲醇誘導(dǎo)前上清和甲醇誘導(dǎo)后上清兩組，分別頸部皮下接種S180腹水細(xì)胞瘤株，三天后分別皮下注射甲醇誘導(dǎo)前上清和甲醇誘導(dǎo)后上清0.5ml/只，每隔12小時(shí)注射一次，連續(xù)注射7天。觀察并切取瘤組織，稱重，結(jié)果甲醇誘導(dǎo)前上清和甲醇誘導(dǎo)后上清序列AAF1、AAF2和AAF3組瘤體重分別為0.82+0.22克和0.11+0.05克，0.13+0.08克，0.09+0.05克，抑瘤率分別為86.6％，84.1％和89.0％。
實(shí)施例2、抗腫瘤重組蛋白的大腸桿菌體外表達(dá)1、人工基因的合成人工合成序列表中序列14(心肌肌鈣蛋白I的編碼基因)的全長(zhǎng)序列，并在其5’端加上NdeI、3’端加上NotI酶切位點(diǎn)，得到序列AFF4；人工合成序列表中序列9的1-285位堿基序列，并在其5’端加上NdeI酶切位點(diǎn)、3’端加上與基因序列14的5’端互補(bǔ)的15個(gè)堿基，然后將此序列與序列AFF4連接，得到序列AFF5；人工合成序列表中序列10的631-858堿基，并在其3’端加上NotI酶切位點(diǎn)、5’端加上與基因序列14的3’端互補(bǔ)的15個(gè)堿基，然后將此序列與序列AFF4連接，得到序列AFF6。
2、抗腫瘤重組蛋白體外表達(dá)(1)將上述人工合成的全序列分別裝入pGEM-T-EASY質(zhì)粒內(nèi)，構(gòu)建pGEM-AAF4\AAF5\AAF6克隆載體。
(2)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建采用購(gòu)自美國(guó)Novagen公司的高效表達(dá)質(zhì)粒pET21b，用SnabI和NotI分別酶切pGEM-AAF4\AAF5\AAF6質(zhì)粒和pET21b質(zhì)粒，凝膠電泳收集目標(biāo)片段，用T4連接酶16℃過(guò)夜連接。經(jīng)常規(guī)方法的轉(zhuǎn)化，挑菌，擴(kuò)增獲得表達(dá)質(zhì)粒pET-AAF4\AAF5\AAF6，其通用結(jié)構(gòu)圖譜如圖4所示。如圖5所示，酶切鑒定，證明表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)正確。圖中，泳道1為pET-AAF4表達(dá)質(zhì)粒酶切凝膠電泳結(jié)果，泳道2為pET-AAF6表達(dá)質(zhì)粒酶切凝膠電泳結(jié)果，泳道3為pET-AAF5表達(dá)質(zhì)粒酶切凝膠電泳結(jié)果。
(3)分別將質(zhì)粒pET-AAF4\AAF5\AAF6經(jīng)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入BL21-DE3大腸桿菌內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)，挑選，篩選等過(guò)程，獲得單克隆菌。
(4)挑選單克隆菌，接種于5ml培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜，然后轉(zhuǎn)入250ml培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600＝0.8，加入IPTG至終濃度為1％37℃誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)。離心取沉淀，用裂解液混懸，超聲破碎，10000g離心30分鐘，棄上清，沉淀洗滌兩次，最后用8M尿素溶解，經(jīng)50mM磷酸鹽緩沖液過(guò)夜透析。取透析后的蛋白質(zhì)溶液10ul，用12％SDS-PAGE電泳，并經(jīng)考馬斯亮蘭染色。結(jié)果如圖6所示，AAF4序列在29KD的位置，有誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)，并根據(jù)BSA對(duì)照，表達(dá)量為30mg/L；AAF5序列在37KD的位置，有誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)，并根據(jù)BSA對(duì)照，表達(dá)量為45mg/L；AAF6序列在42KD的位置，有誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)，并根據(jù)BSA對(duì)照，表達(dá)量為50mg/L。圖中，泳道1為pET-AAF4表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)液電泳結(jié)果，泳道2為pET-AAF5表達(dá)質(zhì)的轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)液電泳結(jié)果，泳道3為pET-AAF6表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)液電泳結(jié)果。
3、本發(fā)明抗腫瘤重組蛋白的功能測(cè)定取24只昆明小鼠，分為磷酸鹽緩沖液和表達(dá)提純液組，分別頸部皮下接種S180腹水細(xì)胞瘤株，三天后分別皮下注射磷酸鹽緩沖液和表達(dá)提純液1.0mg蛋白/kg，每隔12小時(shí)注射一次，連續(xù)注射7天。觀察并切取瘤組織，稱重，結(jié)果磷酸鹽緩沖液和表達(dá)提純液序列AAF4，AAF5和AAF6組瘤體重分別為1.02+0.28克和0.15+0.06克，0.12+0.06克，0.11+0.04克，抑瘤率分別為85.3％，88.1％和89.2％。
實(shí)施例3、抗腫瘤重組蛋白的大腸桿菌體外表達(dá)提純液的體內(nèi)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取24只昆明小鼠，分為磷酸鹽緩沖液和表達(dá)提純液組，分別皮下注射磷酸鹽緩沖液和實(shí)施例2中得到的表達(dá)提純液2.0mg蛋白/kg，注射8小時(shí)，眼底靜脈取血，分離血清，采用常規(guī)酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清抗腫瘤重組蛋白濃度。結(jié)果磷酸鹽緩沖液和表達(dá)提純液序列AAF4，AAF5和AAF6組血清抗腫瘤重組蛋白濃度分別為0.52+0.08ng/ml、3.55+0.12ng/ml、8.22+1.08ng/ml和9.31+1.62ng/ml，表明與肌鈣蛋白C融合可增加其體內(nèi)穩(wěn)定性，延緩降解。
序列表<160>14<210>1<211>210<2 12>PRT<213>人屬人(Homo sapiens)<220>
<223>
<400>1Met Ala Asp Gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala15 10 15Pro Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala20 25 30Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys Ile Ser Ala Ser Arg35 40 45Lys Leu Gln Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln Ile Ala Lys Gln Glu50 55 60Leu Glu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala65 70 75Leu Ser Thr Arg Cys Gln Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe80 85 90Ala Glu Leu Gln Asp Leu Cys Arg Gln Leu His Ala Arg Val Asp95 100 105Lys Val Asp Glu Glu Arg Tyr Asp Ile Glu Ala Lys Val Thr Lys110 115 120Asn Ile Thr Glu Ile Ala Asp Leu Thr Gln Lys Ile Phe Asp Leu125 130 135Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Thr Leu Arg Arg Val Arg Ile Ser140 145 150
Ala Asp Ala Met Met Gln Ala Leu Leu Gly Ala Arg Ala Lys Glu155 160 165Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gln Val Lys Lys Glu Asp170 175 180Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val Gly Asp Trp Arg Lys Asn Ile185 190 195Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Lys Phe Glu Ser200 205 210<210>2<211>95<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
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<400>3Lys Asp Asp Ser Lys Gly Lys Ser Glu Glu Leu Ser Asp Leu Phe15 10 15Arg Met Phe Asp Lys Asn Ala Asp Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Glu20 25 30Leu Lys Ile Met Leu Gln Ala Thr Gly Glu Thr Ile Thr Glu Asp35 40 45Asp Ile Glu Glu Leu Met Lys Asp Gly Asp Lys Asn Asn Asp Gly50 55 60Arg Ile Asp Tyr Asp Glu Phe Leu Glu Phe Met Lys Gly Val Glu65 70 75<210>4<211>305<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>4Met Asp Asp Ile Tyr Lys Ala Ala Val Glu Gln Leu Thr Glu Glu15 10 15Gln Lys Asn Glu Phe Lys Ala Ala Phe Asp Ile Phe Val Leu Gly20 25 30
Ala Glu Asp Gly Cys Ile Ser Thr Lys Glu Leu Gly Lys Val Met35 40 45Arg Met Leu Gly Gln Asn Pro Thr Pro Glu Glu Leu Gln Glu Met50 55 60Ile Asp Glu Val Asp Glu Asp Gly Ser Gly Thr Val Asp Phe Asp65 70 75Glu Phe Leu Val Met Met Val Arg Cys Met Lys Asp Asp Ser Lys80 85 90Gly Lys Ser Glu Glu Met Ala Asp Gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg95 100 105Glu Pro Arg Pro Ala Pro Ala Pro Ile Arg Arg Arg Ser Ser Asn110 115 120Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys125 130 135Ile Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gln Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gln140 145 150Ile Ala Lys Gln Glu Leu Glu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gly155 160 165Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ser Thr Arg Cys Gln Pro Leu Glu Leu170 175 180Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu Leu Gln Asp Leu Cys Arg Gln Leu185 190 195His Ala Arg Val Asp Lys Val Asp Glu Glu Arg Tyr Asp Ile Glu200 205 210Ala Lys Val Thr Lys Asn Ile Thr Glu Ile Ala Asp Leu Thr Gln215 220 225Lys Ile Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Thr Leu Arg230 235 240Arg Val Arg Ile Ser Ala Asp Ala Met Met Gln Ala Leu Leu Gly245 250 255Ala Arg Ala Lys Glu Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gln260 265 270
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Ala Arg Ala Lys Glu Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gln260 265 270Val Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val Gly Asp275 280 285Trp Arg Lys Asn Ile Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys290 295 300Lys Lys Phe Glu Ser Lys Asp Asp Ser Lys Gly Lys Ser Glu Glu305 310 315Leu Ser Asp Leu Phe Arg Met Phe Asp Lys Asn Ala Asp Gly Tyr320 325 330Ile Asp Leu Asp Glu Leu Lys Ile Met Leu Gln Ala Thr Gly Glu335 340 345Thr Ile Thr Glu Asp Asp Ile Glu Glu Leu Met Lys Asp Gly Asp350 355 360Lys Asn Asn Asp Gly Arg Ile Asp Tyr Asp Glu Phe Leu Glu Phe365 370 375Met Lys Gly Val Glu380<210>7<211>918<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>7atggacgaca tctacaaggc tgctgtcgag caattgaccg aggagcaaaa gaacgagttc 60aaggctgctt tcgacatctt cgtcttgggt gctgaggacg gttgtatctc caccaaggag120ttgggtaagg tcatgagaat gttgggtcaa aacccaaccc cagaggagtt gcaagagatg180atcgacgagg tcgacgagga cggttccggt accgtcgact tcgacgagtt cttggtcatg240atggtcagat gtatgaagga cgactccaag ggtaagtccg aggagatggc tgacggttcc300tccgacgctg ctagagagcc aagaccagct ccagctccaa tcagaagaag atcctccaac360
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<211>918<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>12atggacgaca tctacaaagc tgctgttgaa cagctgactg aagaacagaa aaacgaattc 60aaagctgctt tcgacatctt cgttctgggt gctgaagacg gttgcatctc tactaaagaa120ctgggtaaag ttatgcgtat gctgggtcag aacccgactc cggaagaact gcaggaaatg180atcgacgaag ttgacgaaga cggttctggt actgttgact tcgacgaatt cctggttatg240atggttcgtt gcatgaaaga cgactctaaa ggtaaatctg aagaaatggc tgacggttct300tctgacgctg ctcgtgaacc gcgtccggct ccggctccga tccgtcgtcg ttcttctaac360taccgtgctt acgctactga accgcacgct aaaaaaaaat ctaaaatctc tgcttctcgt420aaactgcagc tgaaaactct gctgctgcag atcgctaaac aggaactgga acgtgaagct480gaagaacgtc gtggtgaaaa aggtcgtgct ctgtctactc gttgccagcc gctggaactg540gctggtctgg gtttcgctga actgcaggac ctgtgccgtc agctgcacgc tcgtgttgac600aaagttgacg aagaacgtta cgacatcgaa gctaaagtta ctaaaaacat cactgaaatc660gctgacctga ctcagaaaat cttcgacctg cgtggtaaat tcaaacgtcc gactctgcgt720cgtgttcgta tctctgctga cgctatgatg caggctctgc tgggtgctcg tgctaaagaa780tctctggacc tgcgtgctca cctgaaacag gttaaaaaag aagacactga aaaagaaaac840cgtgaagttg gtgactggcg taaaaacatc gacgctctgt ctggtatgga aggtcgtaaa900aaaaaattcg aatctaaaga cgactctaaa ggtaaatctg aagaactgtc tgacctgttc960
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1.抗腫瘤重組蛋白，選自下列蛋白質(zhì)家族中任意一種(1)心肌肌鈣蛋白I的N末端氨基酸殘基與心肌肌鈣蛋白C羧基端氨基酸殘基序列部分或全部相融合的蛋白質(zhì)；(2)心肌肌鈣蛋白I的C末端氨基酸殘基與心肌肌鈣蛋白C氨基端氨基酸殘基序列部分或全部相融合的蛋白質(zhì)；(3)心肌肌鈣蛋白I的N末端氨基酸殘基與心肌肌鈣蛋白C羧基端氨基酸殘基序列部分或全部、心肌肌鈣蛋白I的C末端氨基酸殘基與心肌肌鈣蛋白C氨基端氨基酸殘基序列部分或全部相融合的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤重組蛋白，其特征在于所述抗腫瘤重組蛋白為序列表中SEQ ID №4的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №4的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №4相同活性的由SEQ ID №4衍生的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤重組蛋白，其特征在于所述抗腫瘤重組蛋白為序列表中SEQ ID №5的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №5的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №5相同活性的由SEQ ID №5衍生的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤重組蛋白，其特征在于所述抗腫瘤重組蛋白為序列表中SEQ ID №6的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №6的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №6相同活性的由SEQ ID №6衍生的蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求1所述抗腫瘤重組蛋白的編碼基因，是下列核苷酸序列之一(1)序列表中的SEQ ID №7或與其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；(2)序列表中的SEQ ID №8或與其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；(3)序列表中的SEQ ID №9或與其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；(4)序列表中的SEQ ID №10或與其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；(5)序列表中的SEQ ID №11或與其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；(6)序列表中的SEQ ID №12或與其限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；(7)編碼序列表中SEQ ID №4蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；(8)編碼序列表中SEQ ID №5蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；(9)編碼序列表中SEQ ID №6蛋白質(zhì)序列的多核苷酸。
6.含有權(quán)利要求5所述基因的表達(dá)載體和細(xì)胞系。
7.一種高效表達(dá)權(quán)利要求1所述抗腫瘤重組蛋白的方法，是將編碼抗腫瘤重組蛋白的基因?qū)氲疆叧嘟湍妇?，表達(dá)獲得抗腫瘤重組蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中畢赤酵母菌的表達(dá)過(guò)程中用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)；誘導(dǎo)過(guò)程中的甲醇終濃度優(yōu)選為1％-5％；所述畢赤酵母菌為GS115畢赤酵母菌。
9.一種高效表達(dá)權(quán)利要求1所述抗腫瘤重組蛋白的方法，是將編碼抗腫瘤重組蛋白的基因?qū)氲酱竽c桿菌中，表達(dá)獲得抗腫瘤重組蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述大腸桿菌優(yōu)選為BL21-DE3大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了抗腫瘤重組蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，目的是提供抗腫瘤重組蛋白及其編碼基因與高效表達(dá)該蛋白的方法。本發(fā)明提供的抗腫瘤重組蛋白，選自下列蛋白質(zhì)家族中任意一種(1)心肌肌鈣蛋白I的N末端氨基酸殘基與心肌肌鈣蛋白C羧基端氨基酸殘基序列部分或全部相融合的蛋白質(zhì)；(2)心肌肌鈣蛋白I的C末端氨基酸殘基與心肌肌鈣蛋白C氨基端氨基酸殘基序列部分或全部相融合的蛋白質(zhì)；(3)心肌肌鈣蛋白I的N末端氨基酸殘基與心肌肌鈣蛋白C羧基端氨基酸殘基序列部分或全部、心肌肌鈣蛋白I的C末端氨基酸殘基與心肌肌鈣蛋白C氨基端氨基酸殘基序列部分或全部相融合的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了該蛋白的編碼基因及高效表達(dá)該蛋白的方法。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1539850SQ0310978
公開(kāi)日2004年10月27日 申請(qǐng)日期2003年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月21日
發(fā)明者劉鳳鳴 申請(qǐng)人:劉鳳鳴