專利名稱：一種用于核酸合成載體及其制作方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸合成載體，其原理是利用納米顆粒的巨大比表面積作為核酸合成的固相支持物，該核酸合成載體，用于核酸提高核酸合成的產(chǎn)量及產(chǎn)率。
商業(yè)化核酸合的載體是控孔玻璃(CPG)和聚苯乙烯。當應(yīng)用珀金—埃爾默產(chǎn)392/394型DNA合成儀及其試劑時，通過測量DMT陽離子估計，載體產(chǎn)生大于98％的偶聯(lián)效率。CPG是一種多孔非膨脹的顆粒，顆粒直徑大約150μm，孔徑500。大孔CPG載體(1000)也可用于合成60個堿基以上的寡核苷酸，聚苯乙烯是一種多孔非膨脹顆粒的疏水載體，顆粒直徑50～700μm，孔徑1000 。載體與四種核苷A，G，C，T共價結(jié)合。在這些核苷上的反應(yīng)基團被封閉或被保護，防止不必要的副反應(yīng)。它們的5′-OH都被DMT基團封閉，腺苷(A)、胞苷(C)和鳥苷(G)上環(huán)外氨基也與保護基鍵合。對于標準的和快速寡核苷酸脫保護(FOD)亞磷酰胺的保護基是不同的，標準亞磷酰胺應(yīng)用苯甲?；Ｗo腺苷和胞苷(Abz，Cbz)，而用異丁酰基保護鳥苷(Gibu)。FOD亞磷酰胺應(yīng)用二甲基甲瞇基保護腺苷和鳥苷(Admf，Cdmf)，用異丁酰基保護胞苷(Cibu)。胸苷不需要保護要保護基，因為胸苷環(huán)沒有環(huán)外氨基。CFG有一個連接臂通過硅氧烷鍵連接到其表面。所有的游離硅醇基都被封閉，以防發(fā)生副反應(yīng)。聚苯乙烯有一個氨基甲基連接臂連接到其表面。因為聚苯乙烯表面是惰性的，所以很少發(fā)生副反應(yīng)。核苷的3′-OH通過琥珀酸酯鍵共價地結(jié)合到載體的連接臂上。這個琥珀酸酯鍵對堿不穩(wěn)定，用氨可以從載體上切去。合成完成后，寡核苷酸被定量地切下，保留一下游離3′-OH。
根據(jù)測定DMT釋放的量估計，核苷的加入量一般為27～40μmol/g(對于40nmol柱為8-12μmol/g)。預(yù)裝柱有40nmol(僅聚苯乙烯)，0.2μmol，1μmol或10μmol的初始核苷四種規(guī)格。40nmol或0.2μmol規(guī)模，為大多數(shù)用途提供了足夠量的純寡聚核苷酸。當需要較大量的DNA時，應(yīng)用1μmol合成規(guī)模。10μmol規(guī)模對于物理學研究如x射線晶體學，核磁共振(NMR)，或反義寡核苷酸應(yīng)用是有用的。大孔徑(1000)CPG載體僅用在0.2μmol的規(guī)模。1000載體的核苷加樣量是較低的，大約15μmol/g載體。在CPG上合成長寡核苷酸，已經(jīng)表明低核苷加樣量和大孔徑載體是成功的關(guān)鍵。但由于大孔徑載體的使用在合成規(guī)模上受到限制，也限制了增加了規(guī)模合成的成本。
技術(shù)方案本發(fā)明提出了一種用于核酸合成載體及其制作方法和應(yīng)用。此發(fā)明使用的核酸合成的載體是具有順磁性的納米顆粒，其表面修飾了或包被了有機高分子材料，并對其表面進行化學修飾，使表面帶上活性的化學基團。
這種用于核酸合成載體制備方法包括(1)制備納米順磁性顆粒利用氧化還原法制備納米顆粒，并且納米顆粒是強順磁性；(2)納米順磁性顆粒包被調(diào)整納米順磁性顆粒懸浮液的PH值之后，加入有機高分子材料的單體，使其在懸浮液中的順磁性納米顆粒表面聚合形成一層或多層有機高分子；(3)化學修飾在表面聚合形成的有機高分子，通過親核反應(yīng)，修飾具有活性的基團。
使用順磁性納米顆粒作為核酸合成的固相承載物替代了控孔玻璃珠(CPG)。這種納米順磁性顆粒表面可以被聚乙烯，聚苯乙烯，聚吡咯，聚吡咯烷酮等其中之一包裹或使用多種有機化合物進行包裹。如聚苯乙烯包裹后，其表面性質(zhì)與多孔聚苯乙烯材料相似，有巨大的比表面積，但同時沒有空間的限制，合成的核酸沒有長度上的限制。
本發(fā)明的一種用于核酸合成的載體可以裝在小柱中，在商業(yè)化的核酸合成儀上使用，在合成過程中，小柱的側(cè)面加上一個電磁鐵，每次小柱中有液體流過時，電磁鐵工作，使順磁性納米顆粒聚集，不被流體沖出合成小柱。在合成中化學反應(yīng)過程中，液體停止流動時，電磁鐵不工作，由于順磁性納米顆粒是順磁性的，納米顆?？梢栽跈C械振動或液體沖擊下，恢復懸浮狀態(tài)，利于化學反應(yīng)的進行。由于合成過程中使用的順磁性納米顆粒納米體積比相同表面積的控孔玻璃珠要小得多，反應(yīng)腔的體積也小得多，因此，在完成相同的反應(yīng)時，試劑的使用量及損失量也小得多?？梢源蟠蠼档秃怂岬暮铣沙杀?。在另一方面，由于順磁性納米顆粒作為核酸合成的固相支持材料，利用的是其外表面，所以在合成量及合成核酸的長度等方面有更加靈活的選擇。
本發(fā)明的一種用于核酸合成載體，即順磁性納米顆粒作為核酸合成的載體可以在無氧無水手套箱中合成，在無氧無水手套箱中進行核酸合成，可以設(shè)計更加靈活的裝置來完成高通量的核酸合成。如使用96孔板或384孔板作為核酸合成試劑的反應(yīng)池，通過電磁鐵的移動順磁性納米顆粒載體在不同溶液中移動，以完成不同步驟的化學合成反應(yīng)。如果可以同時完成高通量的核酸序列的合成。如果使用小于電磁鐵來控制與96孔板或384孔板相適應(yīng)的電磁鐵陣列，有選擇性地控制順磁性納米顆粒的移動來完成多種核酸序列的合成，可以達到高通量的核酸合成能力。
順磁性納米顆粒作為核酸合成的載體可以在無氧無水手套箱中合成，在無氧無水手套箱中進行核酸合成，使用96孔板或384孔板作為核酸合成試劑的反應(yīng)池，合成反應(yīng)可用于光脫保護法的核酸合成方法。每步的合成反應(yīng)是將要合成的堿基在相應(yīng)的溶液中反應(yīng)時導入特定的光，使合成反應(yīng)得以進行。
順磁性納米顆粒載體不僅可用于合成脫氧核糖核酸DNA序列，也可以用以核糖核酸RNA序列，肽核酸PNA序列和多肽序列的合成。
技術(shù)效果本發(fā)明提出的一種用于核酸合成載體及其制作方法和應(yīng)用檢測探針合成方法，使用的是順磁性納米顆粒作為核酸合成的固相承載物。具有以下特點(a)使用納米顆粒替代控孔玻璃珠作為核酸合成的固體載體；(b)納米顆粒是順磁性的；(c)納米顆粒在其表面修飾了或包被了有機高分子材料。
順磁性納米顆粒載體可以裝在小柱中，在商業(yè)化的核酸合成儀上使用，在合成過程中有電磁鐵，每次小柱中有液體流過時，電磁鐵工作，使納米顆粒聚集，不被流體沖出合成小柱。
順磁性納米顆粒載體可以在無氧無水手套箱中合成，通過電磁鐵移動載體在不同溶液中進行化學合成反應(yīng)，可以同時完成高通量的核酸序列的合成。
順磁性納米顆粒載體表面可以被聚乙烯，聚苯乙烯，聚吡咯，聚吡咯烷酮等其中之一包裹或使用多種有機化合物進行包裹。
本發(fā)明的核酸合成載體與傳統(tǒng)的載體控孔玻璃珠相比，有更大的比表面積，但同時沒有空間的限制，合成的核酸沒有長度上的限制。
順磁性納米顆粒載體可用于合成DNA序列，肽核酸(PNA)序列和多肽序列。
順磁性納米顆粒載體可用于光脫保護法的核酸合成。
圖中1所指的是順磁性納米顆粒。2所指的是包裹在順磁性納米顆粒外的有機高分子聚合物。3所指的是順磁性納米顆粒外表面合成的核酸分子圖2順磁性納米顆粒在合成柱中反應(yīng)示意圖。
圖中4指的是反應(yīng)柱的溶液入口，5指的是順磁性納米顆粒，6指的是反應(yīng)柱，7指的是電磁鐵(非工作狀態(tài))，8指的是反應(yīng)柱的溶液出口。
圖3順磁性納米顆粒在合成柱中液體流動時效果示意中4指的是反應(yīng)柱的溶液入口，順磁性納米顆粒，6指的是反應(yīng)柱，7指的是電磁鐵(工作狀態(tài))，8指的是反應(yīng)柱的溶液出口，9指的是順磁性納米顆粒在磁場的作用下聚集。
一種用于核酸合成載體，是具有順磁性的納米顆粒1，其表面修飾了或包被了有機高分子材料2，并對其表面進行化學修飾，使表面帶上活性的化學基團。其應(yīng)用方法步驟如下1.固體支持物的準備合成納米順磁性顆粒。
2.固相支持物的活化用有雙功能活性試劑通過化學反應(yīng)在載體的表面鍵合上活性基團，以便與相應(yīng)的配基共價結(jié)合，形成具有能與核酸合成的單體相結(jié)合的基團。
3.合成儀固相合成采用商業(yè)化固相化學合成儀合成。用合成的順磁性納米顆粒正規(guī)化控孔玻璃珠作為核酸固相合成的承載物。
4.無氧無水手套箱中的固相合成順磁性納米顆粒作為核酸合成的載體可以在無氧無水手套箱中合成，在無氧無水手套箱中進行核酸合成，可以設(shè)計更加靈活的裝置來完成高通量的核酸合成。如使用96孔板或384孔板作為核酸合成試劑的反應(yīng)池，通過電磁鐵的移動順磁性納米顆粒載體在不同溶液中移動，以完成不同步驟的化學合成反應(yīng)。如果可以同時完成高通量的核酸序列的合成。如果使用小于電磁鐵來控制與96孔板或384孔板相適應(yīng)的電磁鐵陣列，有選擇性地控制順磁性納米顆粒的移動來完成多種核酸序列的合成。
5.合成后處理用氨水將合成的核酸從順磁性納米顆粒上分離下來，實施例一納米順磁性顆粒商業(yè)化的DNA合成儀的使用1.制備納米順磁性顆粒利用還原法制備，將氯化鐵在煮沸狀態(tài)和強力攪拌下加入NaOH，通過調(diào)變?nèi)芤旱腜H值、反應(yīng)溫度和應(yīng)應(yīng)時間來控制磁性微粒的粒徑，制備出10nm左右的Fe3O4顆粒，是強順磁性納米顆粒。
2.納米順磁性顆粒包被調(diào)整溶液的PH值到7左右后，苯乙烯單體SM、表面活性劑SDS、油酸、過氧化苯甲酰(BPO)，使苯乙烯通過聚合反應(yīng)，在納米順磁性顆粒的表面聚合形成一層聚苯乙烯。
3.化學修飾在表面聚合形成一層聚苯乙烯的納米順磁性顆粒溶液中通過清洗后，加入溴化氰溶液反應(yīng)后，將溶液置換成無水甲酰胺，加入羰基二咪唑反應(yīng)后，產(chǎn)生咪唑基團，再用雙胺基的乙二胺，最后在表面形成了氨基。回收純化后貯于無水乙腈中備用。
4.DNA合成將上述納米順磁性顆粒裝入小柱中，接入商業(yè)化的DNA合成儀中進行DNA合成，使用成套的DNA合成試劑，但注意，在合成的每一步反應(yīng)的液體流動時必須啟動電磁鐵(如圖3所示)，將納米順磁性顆粒聚集成團，以免載體丟失過多。
5.純化步驟與商業(yè)化的DNA合成儀使用CPG(控孔玻璃珠)合成后的處理方式一致。實施例二納米順磁性顆粒商業(yè)化的DNA合成儀的使用
1.制備納米順磁性顆粒利用還原法制備，將氯化鐵在煮沸狀態(tài)和強力攪拌下加入NH3，通過調(diào)變?nèi)芤旱腜H值、反應(yīng)溫度和應(yīng)應(yīng)時間來控制磁性微粒的粒徑，制備出10nm左右的Fe3O4顆粒，是強順磁性納米顆粒。
2.納米順磁性顆粒包被調(diào)整溶液的PH值到7左右后，苯乙烯單體SM、表面活性劑SDS、油酸、過氧化苯甲酰(BPO)，使苯乙烯通過聚合反應(yīng)，在納米順磁性顆粒的表面聚合形成一層聚苯乙烯。
3.化學修飾在表面聚合形成一層聚苯乙烯的納米順磁性顆粒溶液中通過清洗后，加入溴化氰溶液反應(yīng)后，將溶液置換成無水甲酰胺，加入羰基二咪唑反應(yīng)后，產(chǎn)生咪唑基團，再用雙胺基的乙二胺，最后在表面形成了氨基?；厥占兓筚A于無水乙腈中備用。
4.DNA合成將上述納米順磁性顆粒裝入96孔板中(孔內(nèi)有無水乙腈)，用電磁鐵將納米順磁性顆粒在不同的溶液中移動，以依設(shè)計的序列完成DNA合成的各步反應(yīng)。
5.純化步驟與商業(yè)化的DNA合成儀使用CPG(控孔玻璃珠)合成后的處理方式一致。
權(quán)利要求
1.一種用于核酸合成載體，其特征在于載體是具有順磁性的納米顆粒，其表面修飾了或包被了有機高分子材料，并對其表面進行化學修飾，使表面帶上活性的化學基團。
2.一種用于核酸合成載體制備方法，其特征在于(1)制備納米順磁性顆粒利用氧化還原法制備納米顆粒，并且納米顆粒是強順磁性；(2)納米順磁性顆粒包被調(diào)整納米順磁性顆粒懸浮液的PH值之后，加入有機高分子材料的單體，使其在懸浮液中的順磁性納米顆粒表面聚合形成一層或多層有機高分子；(3)化學修飾在表面聚合形成的有機高分子，通過親核反應(yīng)，修飾具有活性的基團。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于核酸合成載體制作方法，其特征在于順磁性納米顆粒表面可以被聚乙烯，聚苯乙烯，聚吡咯，聚吡咯烷酮等其中之一包裹或同時使用多種有機化合物進行包裹。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于核酸合成載體在核酸合成中的應(yīng)用，其特征在于此種載體可以裝在合成小柱中，在商業(yè)化的核酸合成儀上使用，在合成過程中有電磁鐵，每次小柱中有液體流過時，電磁鐵工作，使納米顆粒聚集成團，不被流體沖出合成小柱。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于核酸合成載體在核酸合成中的應(yīng)用，其特征在于載體可以在無氧無水手套箱中合成，通過電磁鐵移動載體在不同溶液中進行化學合成反應(yīng)，可以同時完成高通量的核酸序列的合成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于核酸合成載體應(yīng)用，其特征在于載體可用于光脫保護法的核酸合成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于核酸合成載體應(yīng)用，其特征在于載體可用于合成脫氧核糖核酸DNA序列，核糖核酸RNA序列，肽PNA序列和多肽序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于核酸合成載體的應(yīng)用，其特征在于載體用于合成脫氧核糖核酸DNA序列，核糖核酸RNA序列，肽PNA序列和多肽序列后，合成產(chǎn)物可以不從載體上分離下來，直接使用磁性顆粒作為合成產(chǎn)物的標記物。
全文摘要
本發(fā)明一種用于核酸合成載體及其制作方法和應(yīng)用。公開了一種替代控孔玻璃珠(CPG)的納米磁性微粒作為合成載體的核酸合成方法。這種納米磁性微粒是由微乳法合成的氧化鐵的順磁性的納米顆粒，在其外表面取聚合一層有機高分子化合物，通過一次或多次修飾有機高分子化合物產(chǎn)生氨甲基后，可采用采用亞磷酸三酯法合成核酸，也可在其表面合成肽核酸(PNA)或多肽。由于納米磁性微粒具有巨大的比表面積，因此，在同樣的合成條件下，其合成產(chǎn)量比CPG法要高，并且此方法合成的核酸可以形成合成陣列，利于提高合成批量，甚至可以直接使用。
文檔編號C07H21/04GK1431218SQ0311277
公開日2003年7月23日 申請日期2003年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月28日
發(fā)明者劉全俊, 王紅, 肖鵬峰, 陸祖宏 申請人:劉全俊, 王紅, 陸祖宏