專利名稱：血小板糖蛋白受體阻抑物、含其的藥物組合物及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及血小板糖蛋白受體阻抑物，具體地說是一類新的由多肽衍生的化合物，還涉及含其的藥物組合物及其用于制備治療血小板凝集有關的疾病藥物的用途。
背景技術：
心臟病是西方發(fā)達國家最為主要的致死性疾病。由于生活水平提高，或高能量，高脂飲食在中國人中的增加，心腦血管病也已成為首要的致死疾病。
血小板凝集是引起心血管血栓，導致心臟疾病的主要因素，當正常血管壁受損時，一系列的反應會立即發(fā)生，激活血小板導致止血反應，這種止血反應是必要的，正常的生理反應。然而，在病理條件下，血栓形成，引起堵塞部位缺血，而導致組織壞死。如果這種堵塞發(fā)生在冠狀動脈，會引起心肌缺血。冠狀動脈血栓形成是引起冠心病綜合癥候群臨床特征的主要原因。冠心病綜合癥包括胸悶，胸絞痛、心肌梗塞，以及心肌缺血引起的突然死亡。
無數研究表明，血小板表面糖蛋白受體二B三A是引起血小板凝集所必需的分子受體。很多細胞內外因子可以激活此受體，導致該受體與血液中纖維蛋白原結合，從而纖維蛋白原與血小板交織一起，形成血小板凝集，形成血栓。在沒有激活的血小板中，糖蛋白二B三A是沒有活性的。激活血小板的因子很多，包括ADP、凝血酶、膠原蛋白等。這些因子與其本身特異的受體結合后，引發(fā)由里致外的信息傳遞，從而導致糖蛋白受體二B三A發(fā)生構象變化，這種構象變化是糖蛋白受體二B三A對纖維蛋白原的親合力成千倍的增加(見Williams等，1995，Seminais in Cell Biology，6305-314；Shattil等，1998 Blood，91，2645-2657；Phillips等，1991，Cell，653359-362)。如果這種血小板凝集引起動脈血栓形成，就會引起一些心腦疾病，包括心肌梗塞，腦中風。為了減少血栓的形成或治療血栓引起的疾病，近年來，阿斯匹林和肝素獲得了廣泛的應用，取得了一定的效果。但這些藥物通常副作用大。血小板在血栓中起著重要的作用，而血小板表面糖蛋白受體二B三A又是特異地引起血小板交織一起的受體。因而，尋求特異阻抑靶點的藥物很有必要。這類新藥將更安全，更有效。

發(fā)明內容
為了篩選血小板受體二B三A的阻抑劑，我們首先克隆了血小板二B三A的基因。然后將血小板受體二B三A的基因分別表達在動物細胞表達載體pHS，形成表達質粒pHS2B和pHS3A。pHS2B和pHS3A然后共同表達在中國倉鼠卵巢上皮細胞表面，形成功能性受體。我們發(fā)現這些受體能和纖維蛋白原結合。這些體外生長的細胞株可以用來篩選特異受體的阻抑劑，這些受體阻抑劑可能是生物活性分子，如蛋白質、抗體、多肽、核酸，或者是天然的化學物質、人工合成的化學物質，或者半人工合成的小分子、大分子物質。本項發(fā)明是包括有多肽在內組成的一個環(huán)形分子如下式(I)及其藥學上可接受的鹽。 根據本發(fā)明，藥學上可接受的鹽包括銨鹽或/和羧酸鹽。
上述的化合物，其中酰胺基與羧基可互換，硫橋中烷基可為同系物。
本發(fā)明化合物可以多種途徑合成。氨基用Boc or Fmoc保護好的氨基酸可以作為原料氨基酸。這些氨基保護的氨基酸可以從供應商買到，或制備。它們的制備方法，是所屬技術領域的技術人員都熟悉的。合成可以是人工合成，或者用多肽合成儀。先合成鏈形化合物，然后再環(huán)化。
本發(fā)明化合物能與細胞分子受體特異性結合，親合力強，該細胞受體糖蛋白二B三A是已證明直接引起血栓的分子受體，因而本發(fā)明化合物能有效地抑制血栓形成。本化合物屬小分子生物活性物質，可以生物合成，也可以化學合成。
其功能試驗如下1、結合抑制檢驗。糖蛋白受體二B三A可以從表達的中國倉卵巢上皮細胞，或者其他細胞，或者直接從人的血小板中分離，提純。然后結合到微量平板。固定的糖蛋白二B三A，然后和纖維蛋白原結合。本發(fā)明可以阻抑該受體蛋白與纖維蛋白原的結合，而對照物不會阻抑。因此，可以測定抑制劑的抑制效率。這種抑制效率可用百分比來描述。即以纖維蛋白原與二B三A受體蛋白的結合在對照物的實驗條件下為百分之百來計算。50％的抑制濃度(IC50)是常用來表達阻抑劑抑制效果的。我們測定到本發(fā)明化合物的50％的有效抑制濃度為2-4微摩爾。
2、中國倉鼠卵巢上皮細胞結合抑制的測定。人血小板糖蛋白受體二B三A表達在中國倉鼠卵巢上皮細胞表面，能與纖維蛋白原結合。本發(fā)明可以用來抑制纖維蛋白原與表達受體的中國倉鼠卵巢上皮細胞的結合。因而，這些細胞株可以用來測定本發(fā)明的效率，沒有表達該受體的中國倉鼠卵巢上皮細胞，或表達其它糖蛋白受體的細胞都不會與纖維蛋白原結合，因而可以用來作為對照，用以測定本發(fā)明對受體的專一性及特異性。
本發(fā)明化合物對上皮細胞受體粘附的影響是按以下測定的首先將纖維蛋白原在磷酸緩沖液中稀釋到每毫升20微克，pH值為7.4，然后在96孔平板中，每孔加入100微升，讓其粘附過夜。第二天，用PBS洗一次，每孔加入100微升的濃度為每毫升10毫克的牛血清白蛋白，復蓋1小時。其目的是阻止與此非特異性結合，同時，準備好培養(yǎng)好的表達不同受體的中國倉鼠卵巢上皮細胞，每孔加入100微升，10萬細胞，在37℃下，孵化不同的時間后，(通常30分鐘或60分鐘)，洗脫三次。粘附的細胞數則從測細胞內的內源性磷酸化酶的活性來進行比較。即洗脫未粘附的細胞后，加上100微升的細胞溶解液，加上磷酸酶底物(1％ Triton X-100，每毫升6毫克硝基苯磷，50毫摩醋酸鈉(pH5.0)。一小時后，反應以50微升的1M氫氧化鈉終止。活性用平板分光光度計測定。如附圖1所顯示，本發(fā)明化合物的50％有效抑制，濃度都在微摩爾的范圍內。表明其對受體的親合力很高。在濃度高于1微摩爾時，能完全抑制細胞受體對纖維蛋白原的結合，見附圖1。
3、血小板凝集抑制試驗。人血小板可從人的血液中分離出來。本發(fā)明阻抑血小板糖蛋白受體二B三A的有效率可以在沒有激活，或用ADP，或者凝血酶激活的條件下，測定本發(fā)明的抑制功能或效果。通過增加阻抑劑的濃度，其對凝集反應的影響，可以通過測定其透光率而測定。本發(fā)明化合物能有效地抑制人血小板的凝集(見附圖3)4、動物試驗。把本發(fā)明化合物靜脈注射到實驗動物體內，在不同的濃度的阻抑劑注射到動物體內后，在不同的時間內，取樣。然后測定本發(fā)明化合物在體內對血小板凝集的影響。動物試驗還可以在給動物血小板不同激活劑的情況下，測定本發(fā)明對血小板的影響。本發(fā)明化合物能有效地抑制由ADP、凝血酶等引起的血栓形成。如圖4所示，本發(fā)明藥物進入動物體內20分鐘后，就能有效地抑制由ADP引超的血小板凝集。藥停后，血小板凝血在90分鐘后恢復。
如上文所表明，本發(fā)明的化合物具有治療血小板所引起的疾病的用途，這種血小板凝集、血栓引起的疾病包括心臟梗塞、胸悶、胸痛以及周身血液血栓性疾病，由心血管搭橋后引起的心血管疾病，以及其它的與血小板凝集相關引起的疾病。
本發(fā)明化合物可用于制備成各種臨床上常用的藥物制劑，所述藥物制劑的劑型優(yōu)選口服劑如口服液、片劑、膠囊及注射劑如液體注射劑及凍干制劑。藥物組合物包括治療有效量的結構式(I)化合物和藥學上可接受的載體，所述藥學上可接受的載體是指惰性的固體或液體填充物、稀釋液或膠囊包被物。在本領域中熟知的、合適的、優(yōu)選的液體載體如無菌水、水性葡萄糖、糖溶液、乙醇、生理鹽水等。
按照本發(fā)明，在對于治療的病人有效的抗血小板凝集所引起的疾病組合物中，本發(fā)明的藥物日常有效劑量是1-20mg/kg/天，最適合的劑量是2-6mg/kg/天。
四

圖1 是本發(fā)明化合物對血小板糖蛋白受體二B三A與其配體纖維蛋白原結合的影響。
圖2 是化合物XP2094的質譜。
圖3 XP2094對血小板凝集的抑制作用。
圖4 XP2094對血小板凝集的抑制作用(動物試驗)。
五具體實施例方式
化合物XP2094的制備偶聯用的樹脂、butyloxy Carbonyl(Boc)保護的氨基酸，以及其它合成過程所用的試劑，431A型多肽合成儀等是從實用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)購買得到的。其合成過程從灌脂開始，多肽化學合成的順序，從C-末端開始。0.5毫摩爾的C-末端氨基酸樹脂按如下處理。用25％的三氟乙酸處理3-5分鐘，再以50％的三氟乙酸處理15分鐘，達到去保護的目的。去保護后，以同樣的方法偶聯下一個殘基。以同樣的方式，完成類肽的合成。在類肽鏈合成完成以后，用三氟乙酸除去BOC保護基團。多肽鏈與樹脂一起干燥，再以無水氟酸在負-10℃下處理40-60分鐘。真空除去氟酸后，用二乙酯醚懸浮溶解，再以三氯甲烷和乙醚洗3-5次，用2摩爾的醋酸從樹脂中萃取多肽鏈。將粗提的類肽鏈溶解于10毫摩爾的醋酸氨中，然后，逐滴加入10毫摩爾的高鐵氰化鉀，攪拌30-60分鐘，再以醋酸調pH值至5。由此所得的環(huán)形化合物再過離子交換柱。最后用制備性HPLC純化制成。結構式如下 分子式C34H48N11O9S2+Exact Mass818.31分子量818.95元素分析C 49.86；H 5.91；N 18.81；O 17.58；S 7.83化合物XP2094的質譜見附圖2。
權利要求
1.結構式(I)的化合物及其藥學上可接受的鹽
2.權利要求1所述的化合物，其中酰胺基與羧基可互換，硫橋中烷基可為同系物。
3.藥物組合物，其中含有治療有效量的結構式(I)化合物和藥學上可接受的載體。
4.權利要求3所述的藥物組合物，其中劑型為注射劑。
5.權利要求3所述的藥物組合物，其中劑型為口服劑。
6.權利要求1或2所述的化合物在制備治療血小板凝集、血栓引起的疾病的藥物中的用途。
7.權利要求6所述的用途，其中疾病包括心臟梗塞、胸悶、胸痛和周身血栓性疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及血小板糖蛋白受體阻抑物，具體地說是一類新的由多肽衍生的化合物，其能特異性地與血小板糖蛋白受體二B三A結合，阻抑該受體與纖維蛋白原的結合，本發(fā)明公開了含其的藥物組合物及其用于制備治療血小板凝集有關的疾病藥物的用途。
文檔編號C07K7/54GK1434055SQ03112798
公開日2003年8月6日 申請日期2003年1月30日 優(yōu)先權日2003年1月30日
發(fā)明者李圣鋒 申請人:關玉嬋