專利名稱：一種從蛇毒中分離純化類凝血酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物、醫(yī)藥提取技術(shù)，涉及一種從蛇毒中分離純化類凝血酶的方法，具體地說，是一種采用陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析和凝膠排阻層析三步法從蛇毒中提取類凝血酶的制備方法。
類凝血酶的主要生理功能是使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槟鄣睦w維蛋白。但它又不同于血漿凝血酶，類凝血酶作用于纖維蛋白原時(shí)只釋放出血纖肽A，同時(shí)去A肽纖維蛋白原迅速聚合形成凝塊。但這種去血纖肽A的纖維蛋白單體只能首尾聚合。又由于類凝血酶不激活凝血因子XIII，生成的纖維蛋白多聚體之間不產(chǎn)生交聯(lián)，因而形成一種較脆弱的可溶性微凝塊，后者很容易被體內(nèi)纖溶系統(tǒng)所清除[2]。類凝血酶的這一作用特點(diǎn)已被臨床上作為抗凝劑而用于治療血管栓塞性疾病，如腦血栓、周圍血管阻塞性疾病、心血管疾病等。
1965年，Suzuki實(shí)驗(yàn)室分離了蝮蛇日本亞種中的絲氨酸蛋白酶，并將其分為三類，即激肽釋放酶、類溶血纖維酶和毛細(xì)管通透性因子[4]，并測(cè)定了它們?cè)?2種蛇毒中的頒情況[5]；1979年Viljoen等分離測(cè)定了加蓬絲蝰中的三種絲氨酸蛋白酶組分，它們分別具有凝血、激肽釋放和纖維蛋白溶解的活性[6]，1982年，管利豐和戚正武研究了浙江蝮蛇(Agkistrodon halyspallas)蛇毒中的類凝血酶。
在我國(guó)浙江蝮蛇類凝血酶純化工藝方面，管利豐和戚正武應(yīng)用了SephadexG-25、DE-11、DE-52和SephadexG-75的四步方法[1]，徐光壽等應(yīng)用DEAE-SephadexA-50，CM-SephadexC-50和SE-SephadexC-25三步法[7]，蔣芝萍等用DE-32和Sephadex G-75二步法對(duì)其進(jìn)行了分離[8]，李鳳閣等用DEAE-葡聚糖A-50和TEMZ二步法對(duì)其進(jìn)行了分離。
由于類凝血酶在蛇毒中含量低，結(jié)構(gòu)特殊，提純較為困難，故長(zhǎng)期以來研究進(jìn)展緩慢。上述純化工藝也僅限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模研究和少量樣品的制備，難以在線放大到中試以至生產(chǎn)規(guī)模。
所述溶樣液可以使用陽(yáng)離子交換層析的A液，而A液一般可用磷酸鹽-檸檬酸鹽組成的PH在3.0左右的緩沖液，B液為在A液中加入0.2M左右的NaCl溶液，梯度方式為洗脫從A完全到B時(shí)，至少?zèng)_洗10個(gè)柱體積以上，介質(zhì)可選擇商品化的陽(yáng)離子交換介質(zhì)。
本發(fā)明與傳統(tǒng)方法比較，這種方法操作簡(jiǎn)單、提取時(shí)間短，而且可基本線性放大到中試乃至規(guī)模生產(chǎn)。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例中的類凝血酶在CM Sepharose CL-6B陽(yáng)離子交換柱上的分離圖譜；圖2是本發(fā)明實(shí)施例中的類凝血酶在DEAE sepharose Fast Flow柱上的分離圖譜；圖3是本發(fā)明實(shí)施例中的類凝血酶在CM Sepharose G-75上的分離圖譜。
本發(fā)明是在前人工作的基礎(chǔ)上研究的一種用陽(yáng)離子交換、陰離子交換的凝膠排阻層析方法從蝮蛇毒中提取類凝血酶的方法。
本發(fā)明的從蛇毒中提取類凝血酶的三步提取工藝是-----陽(yáng)離子交換層析+陰離子交換層析+凝膠排阻層析，從蛇毒中提取了類凝血酶；優(yōu)化了從蛇毒中提取類凝血酶的各種中試工藝參數(shù)，以最大限度地縮短提取時(shí)間，增大批處理量，提高目標(biāo)產(chǎn)品的收率，并建立了一套目標(biāo)產(chǎn)品純度和活性檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。技術(shù)指標(biāo)為1.穩(wěn)定的從蛇毒提取類凝血酶的中試生產(chǎn)工藝，每次可上樣量80克，可得符合藥用活性和純度的類凝血酶240毫克左右。
2.血酶的純度在95％以上，活性符合藥用。
本發(fā)明可在一般在帶有梯度洗脫裝置的高、中、低壓層析儀上進(jìn)行，要求能同時(shí)顯示紫外和電導(dǎo)參數(shù)。活性測(cè)定參照胰蛋白酶測(cè)定法，用BAEE作底物。
其具體實(shí)施方法和步驟如下1.依據(jù)江浙產(chǎn)蝮蛇抗栓酶的等電點(diǎn)在4～5左右，可以選擇在它的等電點(diǎn)附近酸堿度的溶樣液，首先使類凝血酶在溶樣液中以陽(yáng)離子蛋白質(zhì)形式存在，然后選擇一種合適的可以與這樣帶電蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的陽(yáng)離子交換介質(zhì)進(jìn)行梯度洗脫，收集活性峰。溶樣液可以使用陽(yáng)離子交換層析的A液，而A液一般可用磷酸鹽-檸檬酸鹽組成的PH在3.0左右的緩沖液，B液為在A液中加入合適濃度的NaCl溶液，梯度方式為洗脫從A完全到B時(shí)，要求至少?zèng)_洗10個(gè)柱體積以上，介質(zhì)可選擇商品化的陽(yáng)離子交換介質(zhì)，如Phamacia公司的CM、SP-Sepharose介質(zhì)或Bio-rad公司的Bio-rex 70介質(zhì)。
2.陽(yáng)離子交換收集的含有類凝血酶活性的餾分經(jīng)稀釋和調(diào)pH值后，上陰離子交換柱，要求稀釋后含NaCl一般在0.05M以下，pH在8.5左右，陰離子交換層析的A液可選用pH在8.5左右的PBS緩沖液或Tris-HCl緩沖液，B液為在A液中加入合適濃度有NaCl溶液，梯度方式為洗脫液從A完全變到B時(shí)，要求至少?zèng)_洗10個(gè)柱體積以上，介質(zhì)可選擇商品化的陰離子交換介質(zhì)，如Phamaicia公司的DEAE、Q-Sepharose介質(zhì)或Bio-rad公司生產(chǎn)的DEAE介質(zhì)，收集陰離子層析后含類凝血酶的活性峰。
3.將陰離子交換收集的含類凝血酶的活性餾分直接上凝膠層析，收集含類凝血酶的餾分，流動(dòng)相選用pH5.0-9.0的HAC-NaAC或PBS緩沖液，濃度在10mM-50mM之間，用等度洗脫，介質(zhì)可選用商品化的凝膠介質(zhì)，如Phamaicia公司的Sephadex G-75，G-50等。
4.對(duì)最后一步的峰作SDS-PAGE電泳和HPLC檢測(cè)，其純度分別約為98％和95％，脫鹽凍干后可得純類凝血酶。
用溶栓治療法溶解動(dòng)脈與靜脈中的血栓或肺栓塞，現(xiàn)已成為一種很成熟的醫(yī)療技術(shù)。目前常用的藥物有鏈激酶、尿激酶及重組組織纖維蛋白酶原激活劑，它們加對(duì)血栓有一定療效，但均伴有較高的出血并發(fā)癥發(fā)生率。而本發(fā)明所提取的類凝血酶將對(duì)腦血栓有很好療效，且無明顯不良反應(yīng)。
下面是發(fā)明人給出的一個(gè)用陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析和凝膠排阻層析三步法從蛇毒中分離純化類凝血酶的實(shí)例。本發(fā)明不限于該實(shí)施例。
取10g粗蛇毒(江浙蝮蛇蛇毒)，溶于30ml pH＝3.05的20mM Na2HPO4-檸檬酸的緩沖液中，上樣到3.0×40cm的CM Sepharose CL-6B陽(yáng)離子交換柱上，流速為1.5mol/min，A液為20mM Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，B液為A液中加0.6MNaCl，梯度方式為30min A液30min-33min B液0-100％330min-360min B液洗出層析圖見附圖1，共出來6個(gè)峰，其中同時(shí)標(biāo)明了各峰的相對(duì)活性，收集相對(duì)最大活性的第IV峰。
將收集到的CM柱上的IV峰用01mMPBS(PH＝8.5)的緩沖液稀釋5倍，使其鹽濃度在0.05M以下，pH轉(zhuǎn)化成8.5。再取稀釋后溶液上DEAE-Spharose Fast Flow柱，柱大小為3.0×40cm，流速為1.7mol/min，A液為10mMPBS，PH＝8.5，B液為A液中加0.2MNaCl，梯度方式為0min-30min A液30min-330min， B液0-100330min-600min B液洗出層析圖見附圖2，共出來5個(gè)峰，其中同時(shí)標(biāo)明了各峰的相對(duì)活性，收集相對(duì)最大活性的第I峰。
將收集到的DEAE峰后的峰I直接上Sephadex G-75柱，柱大小為5.0×100cm，，流動(dòng)相為10mMPBS(PH＝8.0)，流速為1.0ml/min，用等度洗脫，洗出層析圖見附圖3，共出來4個(gè)峰，其中同時(shí)標(biāo)明了各峰的相對(duì)活性，收集相對(duì)最大活性的第III峰。
對(duì)最后一步的峰III作SDS-PAGE電泳和HPLC檢測(cè)，其純度分別為98％和95％，脫鹽凍干后可得30mg純類凝血酶。
六、參考文獻(xiàn)1.管利豐，戚正武，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，14(1988)303。
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6.C.C.，Viljoen，et al，Toxicon，1979，17，145.
7.徐光壽等，動(dòng)物學(xué)雜志，1985，6，293。
8.蔣芝萍等，動(dòng)物學(xué)雜志，1985，6，361。
9.李鳳閣等，中草藥，1987，18，4。
權(quán)利要求
1.一種從蛇毒中分離純化類凝血酶的制備方法，其特征在于，采用陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析和凝膠排阻層析三步法從蛇毒中分離純化類凝血酶，在帶有梯度洗脫并能同時(shí)顯示紫外和電導(dǎo)參數(shù)裝置的高、中、低壓層析儀上進(jìn)行；性測(cè)定參照胰蛋白酶測(cè)定法，用BAEE作底物；具體步驟如下1).選用江浙產(chǎn)蝮蛇抗栓酶的等電點(diǎn)在4～5左右，并選擇在它的等電點(diǎn)附近酸堿度的溶樣液，首先使類凝血酶在溶樣液中以陽(yáng)離子蛋白質(zhì)形式存在，然后選擇一種可以與這樣帶電蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的陽(yáng)離子交換介質(zhì)進(jìn)行梯度洗脫，收集活性峰；2).陽(yáng)離子交換收集的含有類凝血酶活性的餾分經(jīng)稀釋和調(diào)pH值后，上陰離子交換柱，稀釋后含NaCl在0.05M以下，pH在8.5左右，陰離子交換層析的A液可選用pH在8.5左右的PBS緩沖液或Tris-HCl緩沖液，B液為在A液中加入0.6-1.0M左右的NaCl溶液，梯度方式為洗脫液從A液完全變到B液時(shí)，至少?zèng)_洗10個(gè)柱體積以上，介質(zhì)選擇商品化的陰離子交換介質(zhì)，收集陰離子層析后含類凝血酶的活性峰；3).將陰離子交換收集的含類凝血酶的活性餾分直接上凝膠層析，收集含類凝血酶的餾分，流動(dòng)相選用pH5.0-9.0的HAC-NaAC或PBS緩沖液，濃度在10mM-50mM之間，用等度洗脫，介質(zhì)選用商品化的凝膠介質(zhì)；4)對(duì)最后一步的最大活性峰作SDS-PAGE電泳和HPLC檢測(cè)，其純度分別約為98％和95％，脫鹽凍干后可得純類凝血酶。
2.如權(quán)利1所述的從蛇毒中分離純化類凝血酶的制備方法，其特征在于，所述溶樣液可以使用陽(yáng)離子交換層析的A液，而A液用磷酸鹽-檸檬酸鹽組成的PH在3.0左右的緩沖液，B液為在A液中加入0.2M左右的NaCl溶液，梯度方式為洗脫從A完全到B時(shí)，至少?zèng)_洗10個(gè)柱體積以上，介質(zhì)可選擇商品化的陽(yáng)離子交換介質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從蛇毒中分離純化類凝血酶的方法，采用陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析和凝膠排阻層析三步法從蛇毒中分離純化類凝血酶，在帶有梯度洗脫并能同時(shí)顯示紫外和電導(dǎo)參數(shù)裝置的高、中、低壓層析儀上進(jìn)行；性測(cè)定參照胰蛋白酶測(cè)定法，用BAEE作底物。本發(fā)明可以方便、快速地從蛇毒中提取類凝血酶，其純度和生物活性均可達(dá)到藥用標(biāo)準(zhǔn)。與傳統(tǒng)方法相比較，本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，回收率高，活性損失小，并可幾乎線性放大到工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1439718SQ0311451
公開日2003年9月3日 申請(qǐng)日期2003年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月28日
發(fā)明者邊六交, 楊曉燕, 董妍, 祁淼 申請(qǐng)人:邊六交, 祁淼