專利名稱：油菜鈉氫泵轉(zhuǎn)運蛋白編碼序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學、酶學、生理學以及基因工程等領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種在油菜(甘藍型，Brassica napus)中表達的Na+/H+antiporter蛋白(甘藍型油菜Na+/H+antiporter，BnNHX1)及其核酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白和核酸序列的制備方法和用途。
本發(fā)明中，我們從十字花科植物甘藍型油菜(Brassica napus)中克隆到擬南芥Na+/H+antiporter基因的同源基因BnNHX1。
在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中提及的甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白序列及其核酸序列。
本發(fā)明的第二目的是提供一種新的甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白(BnNHX1)。
本發(fā)明的第三目的是提供這種甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白多肽和編碼序列在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物抗逆(耐鹽堿)上的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第169-1716位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第169-1716位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第169-1716位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離出的甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。在實例中該宿主細胞是煙草。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將編碼具有甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白活性多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化入植物以提高植物抗逆(耐鹽堿)的方法，其步驟如下(1)將編碼具有甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列可操作地連于植物表達調(diào)控序列，形成含甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白基因的植物表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第169-1716位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將含表達載體的農(nóng)桿菌同真核宿主細胞共培養(yǎng)，在22-28℃條件下，暗培養(yǎng)1-2天后，通過篩選如抗生素篩選，獲得含有甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白基因的轉(zhuǎn)化細胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株及其后代，包括植物種子及植物組織。含有甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白基因的轉(zhuǎn)基因植株對鹽堿具有增強的抗性作用。
較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.3中第169-1716位的序列。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第169-1716位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框第169-1716位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中第169-1716位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第169-1716位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ IDNO.3中從核苷酸第169-1716位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的甘藍型油菜Na+/H+antiporter相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白或多肽”指具有甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然甘藍型油菜Na+/H+antiporter相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的甘藍型油菜Na+/H+antiporter多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴緊條件下能與甘藍型油菜Na+/H+antiporter DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗甘藍型油菜Na+/H+antiporter多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“甘藍型油菜Na+/H+antiporter保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.4的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產(chǎn)生。
表1


發(fā)明還包括甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然甘藍型油菜Na+/H+antiporter多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各利載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的甘藍型油菜Na+/H+antiporter多肽時，可以將甘藍型油菜Na+/H+antiporter編碼序列可操作地連于表達調(diào)控序列，從而形成甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白表達載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細胞”為真核細胞。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、煙草細胞和其它植物細胞。
還可用Northern印跡法技術(shù)分析甘藍型油菜Na+/H+antiporter基因產(chǎn)物的表達，即分析甘藍型油菜Na+/H+antiporter的RNA轉(zhuǎn)錄物在細胞中的存在與否和數(shù)量。
此外，根據(jù)本發(fā)明的甘藍型油菜Na+/H+antiporter核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選甘藍型油菜Na+/H+antiporter同源基因或同源蛋白。
為了得到與甘藍型油菜Na+/H+antiporter基因相關(guān)的甘藍型油菜cDNAs的點陣，可以用DNA探針篩選甘藍型油菜cDNA文庫，這些探針是在低嚴緊條件下，用32P對甘藍型油菜Na+/H+antiporter的全部或部分做放射活性標記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自甘藍型油菜的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識別與甘藍型油菜Na+/H+antiporter相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。
本發(fā)明的甘藍型油菜Na+/H+antiporter核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工化學合成的方法來合成有關(guān)序列。在本申請之前，現(xiàn)有技術(shù)已完全可以通過先合成多個多核苷酸小片段，然后再進行連接而獲得編碼本發(fā)明甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白的核酸序列。然后，可將該核酸序列引入本領(lǐng)域中各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，SanFrancisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。
利用本發(fā)明的甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與甘藍型油菜Na+/H+antiporter發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。
表2為本發(fā)明的甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白(BnNHX1)與擬南芥Na+/H+antiporter蛋白(AtNHX1)的核苷酸序列的同源比較(GAP)表。
表3為本發(fā)明的甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白(BnNHX1)與擬南芥Na+/H+antiporter蛋白(AtNHX1)的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標出，相似的氨基酸用“+”標出。
圖2為BnNHX1在不同轉(zhuǎn)基因植株中的表達量對照圖示。
實施例1甘藍型油菜Na+/H+antiporter基因的克隆1.組織分離(isolation)甘藍型油菜來源于四川大學，采取甘藍型油菜葉片材料后，立即置于液氮中冷凍保存。。
2.RNA的分離(RNA isolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。
3.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據(jù)擬南芥Na+/H+antiporter氨基酸保守序列，設(shè)計引物，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL試劑盒)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行(1)3′-RACEPCR(AP+BN01)得到2001BN3’(約800bp)，回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥(Arabidopsis thaliana)Na+/H+antiporter基因的同源性很高，故初步認為它是一個Na+/H+antiporter基因。
(2).5′-RACE第一輪PCR(AAP+BN02)第二輪PCR(AUAP+BNR03)得到2001BN 5′(約1050bp)(過程同(1))(3).PCR擴增2001BN編碼區(qū)(F1(5′-ATGTTGGATTCTCTAGTGTC-3′)+R1(5′-CTAGTGATTAGAGTCATCAAA-3’))得到2001BN編碼區(qū)(1548bp)(過程同(1))。
BLAST的結(jié)果證明從甘藍型油菜中新得到的基因確為一個植物Na+/H+antiporter。由于已知的同源Na+/H+antiporter如擬南芥Na+/H+antiporter基因具有較強的耐鹽堿作用(Science，1999，2851256-1258)，因此編碼甘藍型油菜Na+/H+antiporter的基因(BnNHX1)也應(yīng)具有相似的功能。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白的全長編碼序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放閱讀框)的基礎(chǔ)上，進一步設(shè)計引物A15′-TATGGAAAACGGTGTGTTGTC-3′(SEQ ID NO.1)為正向引物，核苷酸A25′-GTGAGAAGTCAATTGTTTGCA-3′(SEQ ID NO.2)為反向引物，以甘藍型油菜總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，R1/R2的PCR條件為94℃3分鐘，隨之以94℃50秒、62℃50秒和72℃50秒進行30個循環(huán)，最后以72℃延伸7分鐘。電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，獲得擴增片段。然后按常規(guī)方法以PCR擴增產(chǎn)物進行克隆、測序，獲得SEQ ID NO.3所示的序列。
實施例2
甘藍型油菜Na+/H+antiporter基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的甘藍型油菜Na+/H+antiporter全長cDNA的長度為1819bp，詳細序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于169-1716位核苷酸。根據(jù)全長cDNA推導(dǎo)出甘藍型油菜Na+/H+antiporter的氨基酸序列，共515個氨基酸殘基，分子量為57148道爾頓，等電點(pI)為6.30。詳細序列見SEQ ID NO.4。
將甘藍型油菜Na+/H+antiporter的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與擬南芥Na+/H+antiporter在核苷酸水平上具有89％的相同性(附表2)，與小麥Na+/H+antiporter具有82％的相同性；在氨基酸水平上，它與擬南芥Na+/H+antiporter蛋白有87％的相同性(附表3)。由此可見，甘藍型油菜Na+/H+antiporter基因與擬南芥Na+/H+antiporter基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，可以認為兩者在功能上也有很高相似性。
實施例3甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白或多肽在煙草細胞中進行真核細胞表達及轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性鑒定含目的基因(甘藍型油菜Na+/H+antiporter基因)的表達載體的構(gòu)建根據(jù)甘藍型油菜Na+/H+antiporter的全長序列(SEQ ID NO.3)，設(shè)計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴增后，將甘藍型油菜Na+/H+antiporter cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進一步克隆到雙元表達載體(pBI121，Jefferson R.A.，1987，Plant Molecular Biology Reporter5387-405.)，在保證閱讀框架的前提下鑒定好的表達載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(EHA105，Hood，E. E.等Journal of Bacteriology 158(1986)383-385.)中，獲得用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化植物的含目的基因(BnNHX1)的農(nóng)桿菌EHA105(pBIBnNHX1)，利用葉盤法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物煙草。利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草1.用無菌牙簽挑取YEB選擇平板上的陽性菌落，接種于2ml YEB液體(Sm+，Kan+)，28度，200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時；2.室溫下4,000g離心10min；3.棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；
4.取生長兩周左右的煙草的無菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1平方厘米見方的小葉片；5.將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5min，在無菌濾紙上吸干菌液；6.把經(jīng)侵染的葉片放于MS培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)48小時；7.將葉片轉(zhuǎn)到愈傷培養(yǎng)基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+cb250mg/L)上，25-28℃光照下培養(yǎng)，7-15天可見愈傷組織的形成；8.約20天后可見分化芽長出，待芽長大后，切下，置于生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan 25mg/L)上進行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；9.待根系生長發(fā)達后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。利用Southern blot檢測Na+/H+antiporter蛋白基因(BnNHX1)是否已整合入植物(煙草)基因組中采用常規(guī)方法從轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓曛刑崛NA(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，用SacI酶切植物DNA[8μg(微克)/樣品]及質(zhì)粒pBIBnNHX1(作為陽性對照)后，將DNA轉(zhuǎn)至雜交膜(尼龍膜)上后，用32P標記的BnNHX1基因編碼序列為探針對膜進行雜交(于65℃雜交16小時)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于42℃漂洗3次，每次5分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于55℃-65℃漂洗1-3次，用X光片壓片片1-7天，然后顯影、定影(方法參照參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)。結(jié)果(Southern blot)發(fā)現(xiàn)，不同轉(zhuǎn)基因植株具有不同的雜交帶型，證明BnNHX1基因已整合入煙草基因組中，且所獲得的轉(zhuǎn)基因植株為不同的獨立轉(zhuǎn)基因植株(附

圖1。1非轉(zhuǎn)基因植株；2-8不同的轉(zhuǎn)基因植株；9陽性對照(pBIBnNHX1))。為了研究外源基因(BnNHX1)在轉(zhuǎn)基因植株中是否表達，對轉(zhuǎn)基因植株進一步進行了Northern blot分析。利用Northern blot檢測Na+/H+antiporter蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的表達1.RNA的提取制備參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)2.RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計測OD260；RNA含量計算1 OD260＝40μg/ml。
3.總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離1)取6ml 25*電泳緩沖液，假如117ml無菌水，混勻。2)稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液張，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55℃水浴中。3)于通風櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的RNA(30μg)溶解于15mlRNA稀釋溶液中，在55℃-65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。6)在樣品中加入2μl 10*上樣緩沖液，混勻。9)在電泳液未蓋過膠的條件下點樣，80V電壓電泳10分鐘，待樣品全部進入膠后，加電泳液蓋過膠面約半厘米。80-100V電泳5小時。
4.RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移1)轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。2)將濕潤的膜準確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時。4)轉(zhuǎn)移后，將膜于80℃烘烤1-2小時。
5.膜上RNA的檢測1)將膜浸在4*SSC中10分鐘，取出膜置濾紙上吸去多余的液體，將膜放入預(yù)雜交液中(50％甲酰胺，5*SSC，50mmol/L磷酸鈉(pH6.4)，5*Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA)，42℃下預(yù)雜交過夜。2)倒出預(yù)雜交液，換入等量的雜交液，將用32P標記的DNA探針在沸水中變性5分鐘，加入雜交液(50％甲酰胺，5*SSC，50mmol/L磷酸鈉(pH6.4)，10％葡聚糖硫酸脂，1*Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA)中，于42℃雜交24-48小時。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于42℃漂洗3次，每次5分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于55℃-65℃漂洗1-3次。4)用X光片壓片1-7天，然后顯影、定影。結(jié)果(Northern blot)發(fā)現(xiàn)，甘藍型油菜Na+/H+antiporter基因(BnNHX1)在不同轉(zhuǎn)基因植株中的表達量不同(附圖2。1-6不同轉(zhuǎn)基因植株；7非轉(zhuǎn)基因植株)，因此Northern blot分析證實了甘藍型油菜Na+/H+antiporter基因(BnNHX1)在轉(zhuǎn)基因植株中的表達。含甘藍型油菜Na+/H+antiporter的轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性鑒定鑒于編碼Na+/H+antiporter如擬南芥的AtNHX1的基因已被證明對鹽脅迫具有抗性，而甘藍型油菜Na+/H+antiporter(BnNHX1)與擬南芥的AtNHX1具有較高的同源性，我們進一步對表達甘藍型油菜Na+/H+antiporter的轉(zhuǎn)基因植株進行耐鹽性鑒定。用200mmol的NaCl(氯化鈉)溶液灌溉表達甘藍型油菜Na+/H+antiporter的轉(zhuǎn)基因煙草植株和非轉(zhuǎn)基因植株，研究其對植株存活的影響。結(jié)果證明，表達甘藍型油菜Na+/H+antiporter的轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫確有抗性(能耐受200mmol的NaCl溶液)，并能正常生長結(jié)實；而非轉(zhuǎn)基因植株則在相同濃度(200mmol)的NaCl溶液處理中死亡。因此，研究證明，甘藍型油菜Na+/H+antiporter基因(BnNHX1)可應(yīng)用于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物抗逆(耐鹽堿)的研究和產(chǎn)業(yè)化中。
本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1TATGGAAAACGGTGTGTTGTC(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2GTGAGAAGTCAATTGTTTGCA(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度1819bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.31 tatggaaaac ggtgtgttgt cggtcacggt gcctaaaatg cctgagagga agcctgaggt61 caagtctatt gacatctccg gctaaataag atggaagatc agagataaaa caagataagt121 aagtatgatg atgtgaaata atgggtggca aaagatatat gaaaatcaat gttggattct181 ctagtgtcga aactgccttc gttatcgaca tctgatcacg cttctgtggt tgcgttgaat241 ctctttgttg cacttctttg tgcttgtatt gttcttggtc atcttttgga agagaataga301 tggatgaacg aatccatcac cgccttgttg attgggctag gcactagtgt taccattttg361 ttgattagta aaggaaaaag ctcgcatctt ctcgtcttta gtgaagatct tttcttcata421 tatcttttgc cacccattat attcaatgca gggtttcaag taaaaaagaa gcagtttttc481 cgcaacttcg tgacgattat gctctttggt gctattggaa ctgttgtctc ttgcactgtc541 ataactctag gtgtaacgca gttcttcaag aaactggaca ttgggacctt tgacttgggt601 gattatcttg caattggtgc catatttgcg gcaacagatt ctgtgtgcac actgcaggtg661 ctgaatcaag atgagacacc tttgctttac agtcttgtat tcggagaagg tgttgtgaat721 gatgccacat cagttgtcgt cttcaacgcc attcagagct ttgacctcac acaccttaac781 catgaagctg cttttcagct tcttggaaac ttcatgtatt tgtttctcct tagcacattg841 cttggtgttg cgactggtct gataagtgcg tatgtcatca aaaagctata ctttggaaga901 cactcaaccg accgagaaga ggttgccctt atgatgctta tggcatatct ttcatacatg961 cttgctgagc tattcgcctt gagtggtatt ctcactgtgt tcttctgtgg tattgtgatg1021 tcccattaca cgtggcacaa cgtaaccgag agctcaggag taactaccaa gcataccttt1081 gctactttgt cgtttctagc ggaggctttt attttccttt acgtcgggat ggatgcattg1141 gacatcgaga agtggagatt cgtgagtgac agcccgggga catcggttgc agtaagctca1201 attctgatgg gtctagtcat gcttggaaga gcagcttttg tgtttcctct ttccttctta1261 tcaaacttgt ccaagaaaaa tcagagcgag aagatcgata tcaagcagca agttgtgatc1321 tggtgggctg gtctgatgag aggtgctgtc tctatggctc ttgcctacaa taagtttaca1381 agatcaggac acactgaatt gcgcgggaat gcaatcatga ttaccagtac tataaccgtt1441 tgtcttttta gcaccatggt gtttggtatg ttgacaaaac cgctcattag acacctgatg1501 ccccatcaaa gtacaaccac cagcatgtta tccgacgaca acactccgaa gtctctccac1561 atgccgctcc tcgatggcga gcagcaagat tcattcgttg agttctctgg gagccaccat1621 gacgtgccgc gaccagacag ccttcggggt ttcctgatgc gtccagcacg cactgtgcat1681 cactactgga gacaatttga tgactctaat cactagtgaa ttcgcggccg cctgcaggtc1741 gaccatatca tcattgtaat gactattcct ctgacgagaa taatgcaaac aattgacttc1801 tcacaaaaaa aaaaaaaaa(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度515氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(iii).序列描述SEQ ID NO.41 MLDSLVSKLP SLSTSDHASV VALNLFVALL CACIVLGHLL EENRWMNESI51 TALLIGLGTS VTILLISKGK SSHLLVFSED LFFIYLLPPI IFNAGFQVKK101 KQFFRNFVTI MLFGAIGTVV SCTVITLGVT QFFKKLDIGT FDLGDYLAIG151 AIFAATDSVC TLQVLNQDET PLLYSLVFGE GVVNDATSVV VFNAIQSFDL201 THLNHEAAFQ LLGNFMYLFL LSTLLGVATG LISAYVIKKL YFGRHSTDRE251 EVALMMLMAY LSYMLAELFA LSGILTVFFC GIVMSHYTWH NVTESSGVTT301 KHTFATLSFL AEAFIFLYVG MDALDIEKWR FVSDSPGTSV AVSSILMGLV351 MLGRAAFVFP LSFLSNLSKK NQSEKIDIKQ QVVIWWAGLM RGAVSMALAY401 NKFTRSGHTE LRGNAIMITS TITVCLFSTM VFGMLTKPLI RHLMPHQSTT451 TSMLSDDNTP KSLHMPLLDG EQQDSFVEFS GSHHDVPRPD SLRGFLMRPA501 RTVHHYWRQF DDSNH
表289％identity in 1319 nt overlapgi|21105719|gb|AF510074.1| Arabidopsis thaliana Na+/H+antiporter(NHX1)mRNA，complete cdsIdentities＝1187/1319(89％)，Gaps＝3/1319(0％)Query169 atgttggattctctagtgtcgaaactgccttcgttatcgacatctgatcacgcttctgtg 228||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1atgttggattctctagtgtcgaaactgccttcgttatcgacatctgatcacgcttctgtg 60Query229 gttgcgttgaatctctttgttgcacttctttgtgcttgtattgttcttggtcatcttttg 288||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct61 gttgcgttgaatctctttgttgcacttctttgtgcttgtattgttcttggtcatcttttg 120Query289 gaagagaatagatggatgaacgaatccatcaccgccttgttgattgggctaggcactagt 348||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct121 gaagagaatagatggatgaacgaatccatcaccgccttgttgattgggctaggcactagt 180Query349 gttaccattttgttgattagtaaaggaaaaagctcgcatcttctcgtctttagtgaagat 408||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct181 gttaccattttgttgattagtaaaggaaaaagctcgcatcttctcgtctttagtgaagat 240Query409 cttttcttcatatatcttttgccacccattatattcaatgcagggtttcaagtaaaaaag 468||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct241 cttttcttcatatatcttttgccacccattatattcaatgcagggtttcaagtaaaaaag 300Query469 aagcagtttttccgcaacttcgtgacgattatgctctttggtgctattggaactgttgtc 528||||||||||||||||| |||||||| |||||||| ||||||||| |||| ||| || |Sbjct301 aagcagtttttccgcaatttcgtgactattatgctttttggtgctgttgggactattatt 360Query529 tcttgcactgtcataactctaggtgtaacgcagttcttcaagaaactggacattgggacc 588|||||||| ||||| ||||||||||||| |||||||| ||||| |||||||||| |||Sbjct361 tcttgcacaatcatatctctaggtgtaacacagttctttaagaagttggacattggaacc 420Query589 tttgacttgggtgattatcttgcaattggtgccatatttgcggcaacagattctgtgtgc 648|||||| |||||||||||||||| ||||||||||||||||| ||||||||||| || ||Sbjct421 tttgacatgggtgattatcttgctattggtgccatatttgctgcaacagattcagtatgt 480Query649 acactgcaggtgctgaatcaagatgagacacctttgctttacagtcttgtattcggagaa 708||||||||||| ||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct481 acactgcaggttctgaatcaagacgagacacctttgctttacagtcttgtattcggagag 540Query709 ggtgttgtgaatgatgccacatcagttgtcgtcttcaacgccattcagagctttgacctc 768||||||||||||||||| || |||||||| ||||||||||| |||||||||||||| |||Sbjct541 ggtgttgtgaatgatgcaacgtcagttgtggtcttcaacgcgattcagagctttgatctc 600Query769 acacaccttaaccatgaagctgcttttcagcttcttggaaacttcatgtatttgtttctc 828|| ||||| ||||| |||||||||||||| ||||||||||||||| ||||||||||||||Sbjct601 actcacctaaaccacgaagctgcttttcatcttcttggaaacttcttgtatttgtttctc 660Query829 cttagcacattgcttggtgttgcgactggtctgataagtgcgtatgtcatcaaaaagcta 888|| || || |||||||||| ||| || |||||||||||||||||||| ||||| ||||||Sbjct661 ctaagtaccttgcttggtgctgcaaccggtctgataagtgcgtatgttatcaagaagcta 720Query889 tactttggaagacactcaaccgaccgagaagaggttgcccttatgatgcttatggcatat 948||||||||||| |||||||| ||||| ||||||||||||||||||||||||||| |||Sbjct721 tactttggaaggcactcaactgaccg---agaggttgcccttatgatgcttatggcgtat 777Query949 ctttcatacatgcttgctgagctattcgccttgagtggtattctcactgtgttcttctgt 1008||||| || |||||||||||||| |||| |||||| ||||| ||||||||||| ||||||Sbjct778 ctttcttatatgcttgctgagcttttcgacttgagcggtatcctcactgtgtttttctgt 837Query1009 ggtattgtgatgtcccattacacgtggcacaacgtaaccgagagctcaggagtaactacc 1068||||||||||||||||||||||| |||||||| ||||| ||||||||| || |||| ||Sbjct838 ggtattgtgatgtcccattacacatggcacaatgtaacggagagctcaagaataacaaca 897Query1069 aagcatacctttgctactttgtcgtttctagcggaggcttttattttcctttacgtcggg 1128|||||||||||||| |||||||||||||| |||||| | ||||||||||| || || ||Sbjct898 aagcatacctttgcaactttgtcgtttcttgcggagacatttattttcctgtatgttgga 957Query1129 atggatgcattggacatcgagaagtggagattcgtgagtgacagcccggggacatcggtt 1188|||||||| |||||||| || |||||||||| ||||||||||| ||||| |||||| |Sbjct958 atggatgccttggacattgacaagtggagatccgtgagtgacacaccgggaacatcgatc 1017Query1189 gcagtaagctcaattctgatgggtctagtcatgcttggaagagcagcttttgtgtttcct 1248||||| |||||||| || |||||||| |||||| ||||||||||||| || || |||||Sbjct1018 gcagtgagctcaatcctaatgggtctggtcatggttggaagagcagcgttcgtctttccg 1077Query1249 ctttccttcttatcaaacttgtccaagaaaaatcagagcgagaagatcgatatcaagcag 1308| || || |||| ||||| ||||||| ||||| |||||||| ||| | | || |Sbjct1078 ttatcgtttctatctaacttagccaagaagaatcaaagcgagaaaatcaactttaacatg 1137Query1309 caagttgtgatctggtgggctggtctgatgagaggtgctgtctctatggctcttgcctac 1368|| |||||||| |||||| ||||||| |||||||||||||| |||||||||||||| |||Sbjct1138 caggttgtgatttggtggtctggtctcatgagaggtgctgtatctatggctcttgcatac 1197Query1369 aataagtttacaagatcaggacacactgaattgcgcgggaatgcaatcatgattaccagt 1428|| ||||||||||| | || ||||| || | |||||||||||||||||||| || |||Sbjct1198 aacaagtttacaagggccgggcacacagatgtacgcgggaatgcaatcatgatcacgagt 1257Query1429 actataaccgtttgtctttttagcaccatggtgtttggtatgttgacaaaaccgctcat 1487|| ||||| || |||||||||||||| |||||||||||||| |||| ||||| |||||Sbjct1258 acgataactgtctgtctttttagcacagtggtgtttggtatgctgaccaaaccactcat 1316Query甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白的核酸序列Sbjct擬南芥Na+/H+antiporter蛋白的核酸序列(AF510074)
表387％identity in 513aa overlapgi|21105720|gb|AAM34759.1|AF5100741(AF510074)Na+/H+ antiporter[Arabidopsis thaliana]Identities＝451/513(87％)，Positives＝480/513(92％)，Gaps＝5/513(0％)Query1 MLDSLVSKLPSLSTSDHASVVALNLFVALLCACIVLGHLLEENRWMNESITALLIGLGTS 60MLDSLVSKLPSLSTSDHASVVALNLFVALLCACIVLGHLLEENRWMNESITALLIGLGTSSbjct1 MLDSLVSKLPSLSTSDHASVVALNLFVALLCACIVLGHLLEENRWMNESITALLIGLGTS 60Query61VTILLISKGKSSHLLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFVTIMLFGAIGTVV 120VTILLISKGKSSHLLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFVTIMLFGA+GT++Sbjct61VTILLISKGKSSHLLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFVTIMLFGAVGTII 120Query121 SCTVITLGVTQFFKKLDIGTFDLGDYLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLLYSLVFGE 180SCT+I+LGVTQFFKKLDIGTFD+GDYLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLLYSLVFGESbjct121 SCTIISLGVTQFFKKLDIGTFDMGDYLAIGAIFAATDSVCTLQVLNQDETPLLYSLVFGE 180Query181 GVVNDATSVVVFNAIQSFDLTHLNHEAAFQLLGNFMYLFLLSTLLGVATGLISAYVIKKL 240GVVNDATSVVVFNAIQSFDLTHLNHEAAF LLGNF+YLFLLSTLLG ATGLISAYVIKKLSbjct181 GVVNDATSVVVFNAIQSFDLTHLNHEAAFHLLGNFLYLFLLSTLLGAATGLISAYVIKKL 240Query241 YFGRHSTDREEVXXXXXXXXXXXXXXELFALSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSGVTT 300YFGRHSTDR EV ELF LSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESS +TTSbjct241 YFGRHSTDR-EVALMMLMAYLSYMLAELFDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRITT 299Query301 KHTFATLSFLAEAFIFLYVGMDALDIEKWRFVSDSPGTSVAVSSILMGLVMLGRAAFVFP 360KHTFATLSFLAE FIFLYVGMDALDI+KWR VSD+PGTS+AVSSILMGLVM+GRAAFVFPSbjct300 KHTFATLSFLAETFIFLYVGMDALDIDKWRSVSDTPGTSIAVSSILMGLVMVGRAAFVFP 359Query361 LSFLSNLSKKNQSEKIDIKQQVVIWWAGLMRGAVSMALAYNKFTRSGHTELRGNAIMITS 420LSFLSNL+KKNQSEKI+ QVVIWW+GLMRGAVSMALAYNKFTR+GHT++RGNAIMITSSbjct360 LSFLSNLAKKNQSEKINFNMQVVIWWSGLMRGAVSMALAYNKFTRAGHTDVRGNAIMITS 419Query421 TITVCLFSTMVFGMLTKPLIRHLMPHQSTTTSMLSDDNTPKSLHMPLLDGEQQDSFVEFS 480TITVCLFST+VFGMLTKPLI +L+PHQ+ TTSMLSDDNTPKS+H+PLLD QDSF+E SSbjct420 TITVCLFSTVVFGMLTKPLISYLLPHQNATTSMLSDDNTPKSIHIPLLD---QDSFIEPS 476Query481 GSHHDVPRPDSLRGFLMRPARTVHHYWRQFDDS 513G+ H+VPRPDS+RGFL RP RTVH+YWRQFDDSSbjct477 GN-HNVPRPDSIRQFLTRPTRTVHYYWRQFDDS 508Query甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白氨基酸序列Sbjct擬南芥Na+/H+antiporter蛋白氨基酸序列(AAM34759)
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第169-1716位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第169-1716位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第169-1716位的核苷酸序列。
4.一種分離出的甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，其特征在于它是真核細胞。
8.一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將編碼具有甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白活性多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化入植物以提高植物耐鹽堿的方法，特征在于其步驟如下(1)將編碼具有甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列可操作地連于植物表達調(diào)控序列，形成含甘藍型油菜Na+/H+antiporter蛋白的植物表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第169-1716位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉(zhuǎn)入植物細胞；(3)通過篩選如抗生素篩選，獲得轉(zhuǎn)化細胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株及其后代，包括植物種子及植物組織，轉(zhuǎn)基因植物及其后代對鹽堿具有增強的抗性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在油菜中表達的新的Na
文檔編號C07K14/415GK1454997SQ0311480
公開日2003年11月12日 申請日期2003年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月9日
發(fā)明者唐克軒, 王勁, 左開井, 孫小芬 申請人:復(fù)旦大學