專利名稱：一種合成硫酸酯化α(1→3)連接L-巖藻寡糖的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于具有潛在藥物功能的活性寡糖的制備和應用領域。
背景技術：
硫酸酯化的巖藻寡糖具有良好的抗凝血活性，其結構特點是含有α(1→2)、α(1→3)或α(1→4)連接的部分羥基硫酸酯化的巖藻糖重復單元。研究表明，在每個巖藻寡糖重復單元中不同位置硫酸酯化的寡糖會有不同的抗凝血活性(TheJournal of Biological Chemistry，1999，274，7656-7667；Carbohydr.Res.，2002，337，2231-2238)。然而，由于區(qū)域選擇性和立體選擇性難以控制等原因，目前該類寡糖大多是從海藻等生物體中提取得到的，只有幾篇文獻報道了硫酸酯化α(1→2)連接巖藻寡糖的化學合成方法(Synthesis，1998，56-62)。在這幾篇有限的報道中，所用合成方法不僅合成步驟繁瑣，而且所得產(chǎn)物產(chǎn)率低，選擇性不好，有的甚至沒有立體選擇性。更重要的是，目前尚未見有關硫酸酯化α(1→3)巖藻寡糖合成方法的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明以乙基β-L-巖澡糖硫代苷為起始物，在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，咪唑(Im)和叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)體系中，區(qū)域選擇性地用TBS保護乙基β-L-巖澡糖硫代苷的3-OH，用芐基或其它酯基保護剩余的2，4位羥基，并以此類3-硅烷基保護的巖藻糖硫代苷為供體，以三甲基硅基三氟甲磺酸酯和N-碘代琥珀酰亞胺為催化劑、或以單質碘為催化劑，在二氯甲烷、乙醚、乙腈、硝基甲烷、或甲苯等溶劑中，-40℃-10℃的條件下合成α(1→3)連接L-巖藻寡糖苷。產(chǎn)物按傳統(tǒng)方法脫除芐基或脫除酯基以后，在DMF中與三氧化硫吡啶復合物反應，得到硫酸酯化的β-L-巖澡糖苷，可作為潛在的抗凝血藥物。
本發(fā)明不僅大大提高了區(qū)域選擇性和立體選擇性，而且可以簡便、高效地合成各種不同位置硫酸酯化α(1→3)L-巖藻寡糖及其衍生物。
下面，結合實例對本發(fā)明進行詳細的說明。
檢測、分離的一般條件旋光度在25℃用自動旋光儀測得。1HNMR和13CNMR用BrukerARX-400在CDCl3中測得?；瘜W位移以Me4Si為內標，以ppm為單位表示。薄層色譜(TLC)由HF254硅膠板上用30％(v/v)的硫酸甲醇溶液或紫外檢測器檢測。柱色譜采用100-200目的硅膠，以乙酸乙酯-石油醚為淋洗液。
(1)乙基3-氧-叔丁基二甲基硅烷基-1-巰基-β-L-巖藻糖苷(2)的制備乙基1-巰基-β-L-巖藻糖苷1(1.900克，9.13毫摩爾)溶在15毫升干燥的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在0℃下，依次加入咪唑(1.595克，23.42毫摩爾)和叔丁基二甲基氯硅烷(1.775克，11.67摩爾)。室溫下攪拌兩小時后，向反應體系中加50毫升水，用乙酸乙酯(50毫升×3)萃??；萃取液用無水硫酸鎂干燥，減壓蒸除溶劑，用硅膠柱色譜純化分離，淋洗液為7/1的石油醚/乙酸乙酯，得到漿狀物2(2.709克，85％)。
(2)乙基2，4-二-氧-苯甲基-3-氧-叔丁基二甲基硅烷基-1-巰基-β-L-巖藻糖苷(3)的制備化合物2(1.114克，3.46毫摩爾)溶在15毫升干燥的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，冰水浴下，依次加入氫化鈉(1.040克，21.67毫摩爾)，溴化芐(0.90毫升，7.75毫摩爾)。室溫下攪拌90分鐘后，向反應體系中加50毫升冷水，用乙酸乙酯(50毫升×3)萃取，再以鹽水反萃有機相；萃取液用無水硫酸鎂干燥，減壓蒸除溶劑，用硅膠柱色譜純化分離，淋洗液為1/1的石油醚/乙酸乙酯，得到泡沫狀產(chǎn)物3(1.678克，97％)。
(3)辛基2，4-二-氧-苯甲基-3-氧-叔丁基二甲基硅烷基-β-L-巖藻糖苷(4)的制備在氮氣氛圍，-20℃下，將化合物3(512毫克，1.02毫摩爾)溶于3毫升干燥的二氯甲烷中，然后加入正辛醇(194微升，1.22毫摩爾)和少量分子篩。攪拌20分鐘后依次加入N-碘代琥珀酰亞胺(370毫克，1.51毫摩爾)，三甲基硅基三氟甲磺酸酯(19.4微升，0.11毫摩爾)。上述反應條件下，攪拌約20分鐘，加入三乙胺中和反應至中性。過濾除去分子篩后，減壓蒸除溶劑，用硅膠柱色譜純化分離，淋洗液為10/1的石油醚/乙酸乙酯，得到漿狀物4(569毫克，98％)。
(4)辛基2，4-二-氧-苯甲基-β-L-巖藻糖苷(5)的制備化合物4(821毫克，1.44毫摩爾)溶于15毫升四氫呋喃(THF)，室溫下加入TBAF(1.327克，4.21毫摩爾)，攪拌約3小時，反應完全。減壓蒸除溶劑，用硅膠柱色譜純化分離，淋洗液為4/1的石油醚/乙酸乙酯，得到漿狀物5(334毫克，68％)。
(5)辛基2，4-二-氧-苯甲基-3-氧-叔丁基二甲基硅烷基-β-L-巖藻糖苷(6)的制備將化合物5(468毫克，1.03毫摩爾)和化合物3(547毫克，1.09毫摩爾)混合，在油泵上減壓抽真空約30分鐘。在氮氣氛圍，-20℃下，此混合物溶于3毫升干燥的二氯甲烷中，然后加入少量分子篩。攪拌20分鐘后依次加入N-碘代琥珀酰亞胺(270毫克，1.10毫摩爾)，三甲基硅基三氟甲磺酸酯(15微升，0.08毫摩爾)。上述反應條件下，攪拌約40分鐘，加入三乙胺中和反應至中性。過濾除去分子篩后，減壓蒸除溶劑，用硅膠柱色譜純化分離，淋洗液為20/1的石油醚/乙酸乙酯，得到得到泡沫狀產(chǎn)物6(800毫克，89％)。
(6)辛基2，4-二-氧-苯甲基-α-L-巖藻糖苷(1→3)2，4-二-氧-苯甲基-β-L-巖藻糖苷(7)的制備化合物6(800毫克，0.89毫摩爾)溶于3毫升四氫呋喃(THF)，室溫下加入TBAF(890毫克，0.28毫摩爾)，攪拌約4小時，反應完全。將反應液倒入50毫升冷水中，用乙酸乙酯(50毫升×3)萃取，再以飽和碳酸氫鈉洗兩次。萃取液用無水硫酸鎂干燥，減壓蒸除溶劑，用硅膠柱色譜純化分離，淋洗液為7/1的石油醚/乙酸乙酯，得到泡沫狀產(chǎn)物7(533毫克，76％)。
(7)辛基2，4-二-氧-苯甲基-3-氧-叔丁基二甲基硅烷基-α-L-巖藻糖基-(1→3)-2，4-二-氧-苯甲基-α-L-巖藻糖基-(1→3)-2，4-二-氧-苯甲基-β-L-巖藻糖苷(8)的制備將化合物7(393毫克，0.50毫摩爾)和化合物3(288毫克，0.57毫摩爾)混合，在油泵上減壓抽真空約30分鐘。在氮氣氛圍，-20℃下，此混合物溶于2毫升干燥的二氯甲烷中，然后加入少量分子篩。攪拌20分鐘后依次加入N-碘代琥珀酰亞胺(133毫克，0.54毫摩爾)，三甲基硅基三氟甲磺酸酯(10微升0.06毫摩爾)。上述反應條件下，攪拌約40分鐘，加入三乙胺中和反應至中性。過濾除去分子篩后，減壓蒸除溶劑，用硅膠柱色譜純化分離，淋洗液為15/1的石油醚/乙酸乙酯，得到得到泡沫狀產(chǎn)物8(488毫克，80％)。
(8)辛基2，4-二-氧-苯甲基-α-L-巖藻糖基-(1→3)-2，4-二-氧-苯甲基-α-L-巖藻糖基-(1→3)-2，4-二-氧-苯甲基-β-L-巖藻糖苷(9)的制備將化合物8(308毫克，0.25毫摩爾)溶于2毫升四氫呋喃(THF)，室溫下加入TBAF(335毫克，1.06毫摩爾)，攪拌約4小時，反應完全。將反應液倒入50毫升冷水中，用乙酸乙酯(50毫升×3)萃取，再以飽和碳酸氫鈉洗兩次。萃取液用無水硫酸鎂干燥，減壓蒸除溶劑，用硅膠柱色譜純化分離，淋洗液為6/1的石油醚/乙酸乙酯，得到泡沫狀產(chǎn)物9(270毫克，97％)。
(9)辛基2，3，4-三-氧-苯甲基-α-L-巖藻糖基-(1→3)-2，4-二-氧-苯甲基-α-L-巖藻糖基-(1→3)-2，4-二-氧-苯甲基-α-L-巖藻糖基-(1→3)-2，4-二-氧-苯甲基-β-L-巖藻糖苷(10)的制備將化合物9(270毫克，0.24毫摩爾)和化合物13(197毫克，0.40毫摩爾，Carbohydr.Res.1985，139，105-113)混合，在油泵上減壓抽真空約30分鐘。在氮氣氛圍，-20℃下，此混合物溶于2毫升干燥的二氯甲烷中，然后加入少量分子篩。攪拌20分鐘后依次加入N-碘代琥珀酰亞胺(124毫克，0.51毫摩爾)，三甲基硅基三氟甲磺酸酯(7微升0.04毫摩爾)。上述反應條件下，攪拌約40分鐘，加入三乙胺中和反應至中性。過濾除去分子篩后，減壓蒸除溶劑，用硅膠柱色譜純化分離，淋洗液為12/1的石油醚/乙酸乙酯，得到得到泡沫狀產(chǎn)物10(295毫克，80％)。核磁δH(CDCl3)7.34～7.11(m，45H，PhH)，5.05～5.02(m，4H，HI～IV).δC(CDCl3)139.02，138.92，138.82，138.65，138.56，138.31，138.13，138.07(9Ph)103.98，96.2395.02，94.87(CI～IV-1)79.47，78.67，78.44，77.31，76.99，76.67，76.51，76.30，76.00，75.62，75.53，75.18，74.86，74.78，74.39，74.30，74.18，73.94，72.46，70.12，69.91，66.80，66.50，66.23，31.90，31.79，29.73，29.67，29.41，29.33，29.21，26.14，22.66，22.62，16.78，16.48，16.43，16.25，14.10，14.05。
(10)辛基α-L-巖藻糖基-(1→3)-α-L-巖藻糖基-(1→3)-α-L-巖藻糖基-(1→3)-β-L-巖藻糖苷(11)的制備將化合物10(212毫克，0.14摩爾)溶于50毫升乙酸乙酯和甲醇混合液(體積比為1/1)中，加入209毫克鈀碳，室溫攪拌下通氫氣70小時，反應完全，過濾，減壓蒸干濾液，得泡沫狀產(chǎn)物11(83毫克，83％)。核磁δH(CDCl3)5.00(b，3H，HII～IV-1)，4.25(b，4H，HI～IV-4).3.94(b，4H，HI～IV-3)3.86(b，4H，HI～IV-2或HI～IV-5)3.86(b，4H，HI～IV-2或HI～IV-5)δC(CDCl3)102.85，95.70，95.44，77.80，74.97，71.91，70.45，69.46，68.74，68.52，68.03，67.63，66.95，66.47，48.86，31.50，29.06，28.93，25.43，22.34，15.84，15.59，15.47，15.38，13.70，0.84。
(11)辛基2，3，4-三-氧-磺酸基-α-L-巖藻糖基-(1→3)-2，4-二-氧-磺酸基--α-L-巖藻糖基-(1→3)-2，4-二-氧-磺酸基--α-L-巖藻糖基-(1→3)-2，4-二-氧-磺酸基--β-L-巖藻糖苷(12)的制備將化合物11(83毫克，0.12毫摩爾)溶于4毫升干燥的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入三氧化硫-吡啶復合物(500微升，3.14毫摩爾)。80℃下回流36小時，以離子交換處理，用P2柱分離，得到漿狀物4(毫克，79％)。
本發(fā)明還可用于合成各種不同位置硫酸酯化α(1→3)L-巖藻寡。該合成方法的關鍵合成子為化合物14乙基3，4-氧-異丙叉基-2-氧-苯甲基-1-巰基-β-L-巖藻糖苷。
由化合物14可分別制得化合物15(乙基2-氧-苯甲基-3-氧-叔丁基二甲基硅烷基-4-氧-乙?；?1-巰基-β-L-巖藻糖苷)、化合物16(乙基2-氧-苯甲基-3，4-二-氧-乙?；?1-巰基-β-L-巖藻糖苷)、化合物17(辛基2-氧-苯甲基-β-L-巖藻糖苷)，以這些化合物為基礎，即可簡便、高效地合成各種不同位置硫酸酯化α(1→3)L-巖藻寡糖及其衍生物。

權利要求
1.以β-巖澡糖硫代苷為底物，在N，N-二甲基甲酰胺，咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷體系中反應，合成3位單硅烷化的β-巖澡糖硫代苷。
2.以3位硅烷基保護，2，4位酯基或芐基保護的巖藻糖硫代苷為供體，以三甲基硅基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)和N-碘代琥珀酰亞胺(NIS)為催化劑，在二氯甲烷中合成硫酸酯化α(1→3)連接的L-巖藻寡糖苷的方法。
3.權利要求2中的催化劑也可為單質碘。
4.權利要求2中的溶劑也可為乙醚、乙腈、硝基甲烷甲苯等。
5.權利要求2中的反應溫度為-40℃-10℃。
全文摘要
本發(fā)明公開了β－巖藻糖硫代苷區(qū)域選擇性保護3－OH的方法，并以此類3－硅烷基保護的巖藻糖硫代苷為供體，以三甲基硅基三氟甲磺酸酯(TMSOTf)和N－碘代琥珀酰亞胺為復合催化劑、或以單質碘為催化劑，在二氯甲烷中合成硫酸酯化的α(1→3)巖藻寡糖的方法。
文檔編號C07H3/06GK1530368SQ0311931
公開日2004年9月22日 申請日期2003年3月13日 優(yōu)先權日2003年3月13日
發(fā)明者杜宇國, 華玉夏 申請人:中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心