專利名稱：抑制sars病毒感染的小rna分子及其作用靶點(diǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一組能夠特異抑制SARS病毒及與SARS病毒基因序列相似的其他RNA病毒感染的小核糖核酸(RNA)分子及其作用靶點(diǎn)。本發(fā)明還涉及這些小RNA分子及其作用靶點(diǎn)在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
RNA干擾(RNA interference RNAi)是生物中雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性基因沉默(gene silencing)。RNAi研究被“Science”雜志評(píng)為2001年十大科技成就之一。自從1995年發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象后，已在多物種中觀察到RNAi現(xiàn)象，包括線蟲、果蠅、植物、真菌、哺乳動(dòng)物等。作為一種新的“基因阻滯”技術(shù)，RNAi在基因功能的研究中已成為熱點(diǎn)。RNAi的高效、特異、可擴(kuò)散、可調(diào)控特性，使其作為成熟的基因篩選技術(shù)大規(guī)模應(yīng)用于后基因組的研究中，包括對(duì)具有相關(guān)功能的基因篩選，某一特異基因的功能鑒定等(Andrew F.et al.1998 Nature 391806-810；ZamorePD.et al.2000 Cell 101(1)25-33；.Hammond SM.et al.2000 Nature404(6775)293-296；Bernstein E.et al.2001 Nature 409(6818)363-366；ElbashirSM.et al.20001 Nature 411(6836)494-498)。
SARS冠狀病毒在種屬分類上屬于“ssRNA positive-strand viruses”家系的“Nidovirales”族中的“Coronaviridae”系。它是冠狀病毒家族中新出現(xiàn)的一個(gè)子類。全長29,736bp，已知有11個(gè)編碼序列(cds)，而其中的一個(gè)cds(putativeorflab polyprotein)與鼠類的肝炎病毒(murine hepatitis virus)結(jié)構(gòu)類似，依據(jù)鼠類的肝炎病毒的結(jié)構(gòu)模式，推斷出該段cds應(yīng)該編碼了14個(gè)蛋白質(zhì)。SARS冠狀病毒是一種高變異性的單鏈(+)RNA病毒。通過長期對(duì)冠狀病毒的研究發(fā)現(xiàn)于單鏈(+)RNA病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程主要包括如下的步驟1)正鏈RNA利用宿主細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)表達(dá)了RNA聚合酶；2)在RNA聚合酶作用下以正鏈RNA為模板合成了負(fù)鏈RNA；3)負(fù)鏈RNA又作為模板通過“嵌入式”的方式合成了大小不等的編碼不同病毒蛋白mRNA和正鏈RNA；4)病毒在細(xì)胞內(nèi)組裝；由此可見SARS病毒其自身攜帶的正鏈RNA和在細(xì)胞內(nèi)合成的負(fù)鏈RNA是病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的關(guān)鍵。如果破壞病毒的RNA，將直接干擾病毒的復(fù)制，而利用RNAi技術(shù)篩選獲得的小分子雙鏈干擾RNA(siRNA)即可以達(dá)到這樣效果。
這方面類似的抗病毒研究已有成功報(bào)道在2003年3月，PNAS雜志連續(xù)報(bào)道了RNAi在病毒治療方面的突破性進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞模型上和在含有胚胎的雞蛋模型上，利用RNAi技術(shù)靶向沉默流感病毒的mRNA，可以直接降低病毒mRNA在宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，從而有效的降低病毒的復(fù)制(Ge Q，et al.2003 PNAS 100(5)2718-2723)。同時(shí)還有文獻(xiàn)表明，利用RNAi技術(shù)可以有效的保護(hù)小鼠爆發(fā)性肝炎的發(fā)生和發(fā)展，在爆發(fā)性肝炎感染的動(dòng)物模型上，通過在尾靜脈注射siRNA對(duì)Fas基因沉默可以有效的降低動(dòng)物的死亡率(Song E，et al.2003 Nature Med.9(3)347-351)。另外，在抗HIV感染方面也取得類似進(jìn)展。由于SARS病毒和流感病毒都屬于冠狀病毒的家族，都是正鏈RNA病毒。二者在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制應(yīng)該十分相似，因此，我們認(rèn)為利用RNAi技術(shù)來沉默SARS病毒RNA和其編碼蛋白mRNA，采用多靶點(diǎn)沉默的原則，將會(huì)阻止SARS病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，從而降低其對(duì)宿主的損傷作用。
本發(fā)明的上述序列可以通過體外直接化學(xué)合成或其他任何方法制備的，也可以通過體外轉(zhuǎn)錄得到的，還可以利用載體或其DNA模板在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的。
為闡明本發(fā)明的小RNA分子的作用靶點(diǎn)，本發(fā)明的發(fā)明人通過計(jì)算機(jī)生物信息學(xué)分析獲得非常特異的針對(duì)SARS病毒復(fù)制的藥物基因靶點(diǎn)。
與本發(fā)明的上述序列完全一致的基因序列可以作為藥物靶點(diǎn)，這些基因序列如下aaGTCTAAACGAACATGAAAC，來源于SRAS病毒mRNA轉(zhuǎn)錄起始部位基因序列；aaGTATAAATTTGTCCGTATC，來源于SRAS蛋白中表達(dá)NSP2蛋白的部分基因序列；aaGTGAATTCAACACTAGAAC，來源于SRAS蛋白中表達(dá)NSP10蛋白的部分基因序列；aaGAACACTTGTGATGGTAAC，來源于SRAS蛋白中表達(dá)NSP5蛋白的部分基因序列；aaGTGCTGCTATGACCATGTC，來源于SRAS蛋白中表達(dá)NSP10蛋白的部分基因序列；
aaGACTGCTCTTAAGAATGC，來源于SRAS蛋白中表達(dá)NSP1蛋白的部分基因序列；aaGCTGCAAGACGTTGTTAAC，來源于SRAS蛋白中表達(dá)spike蛋白的部分基因序列；aaGGAGCAGCTGCAACTACTC，來源于SRAS蛋白中表達(dá)MHV蛋白的部分基因序列；這些靶標(biāo)可以用于與SARS病毒序列類似的其他RNA病毒感染的預(yù)防和治療。它們的模擬空間結(jié)構(gòu)可以是通過計(jì)算機(jī)分析或其他分子生物學(xué)方法如各種生物文庫展示技術(shù)等方法獲得的。這些模擬空間結(jié)構(gòu)可以作為研制針對(duì)SARS或與SARS病毒序列相似的其他RNA病毒感染的藥物靶標(biāo)。
實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的小RAN分子對(duì)SARS病毒感染具有很好的抑制作用，這些分子可以單獨(dú)或以任何比例、任何組合方式與其他任何治療SARS病毒感染的方法混合用于SARS病毒感染的預(yù)防和治療，對(duì)與SARS病毒序列類似的其他RNA病毒感染的預(yù)防和治療也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明獲得的序列及靶點(diǎn)對(duì)SARS病毒的診斷也有一定意義，并具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
1.實(shí)驗(yàn)方法1.1 siRNA DNA模板設(shè)計(jì)利用軟件和實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)GENEBANK報(bào)告的SARS病毒(病毒株SARS coronavirus CUHK-W1)的基因序列，已經(jīng)設(shè)計(jì)并制備了16條siRNA，所靶向的基因幾乎涵蓋了整個(gè)病毒基因組包括MHV(777-2693) NSP1(2694-9959) NSP2(9960-10877) NSP5(11917-12590)rdrp(13347-16141)nsp10(16142-17944)Spikeprotein(21467-25234)以及SARS病毒蛋白轉(zhuǎn)錄起始序列，并設(shè)計(jì)合成能夠體外轉(zhuǎn)錄成siRNA的DNA模板引物序列，具體序列見表1，單鏈DNA模板由上海博潤生物技術(shù)公司合成。上述siRNA序列在目前已報(bào)道的所有SARS病毒基因序列中皆存在，且序列完全一致。因此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是針對(duì)所有SARS病毒株基因序列皆有效。
表1.siRNA DNA模板的引物序列




1.2 DNA模板退火將相互匹配的正義和反義單鏈DNA模板溶于20μl轉(zhuǎn)錄緩沖液中95℃加熱10分鐘，然后室溫放置15分鐘。
1.3體外轉(zhuǎn)錄制備單鏈RNA按下列轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄5xbuffer 4μlrNTP(25mM each) 4μlDNA模板 1μlT7 polymerase2μlDEPC H2O9μl37℃，4h加入DNA酶消化 37℃ 1h1.4 siRNA制備將產(chǎn)生的正義鏈RNA和反義鏈RNA混合退火，95℃10分鐘，然后室溫放置15分鐘，將退火后樣品用超濾離心管(MW3000)，1,3000r/min離心1h，70％乙醇1,3000r/min離心1h，用無RNase H2O洗脫回收RNA，2％瓊脂糖電泳鑒定雙鏈RNA。
1.5 siRNA轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞并觀測對(duì)病毒感染的保護(hù)作用(在P3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作)用不含抗生素的無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋5pmol dsiRNA至25ml，另外用同樣培養(yǎng)基將0.25μl Lipofectamide 2000(Invitrogen)稀釋至25ml，5分鐘內(nèi)將兩者輕輕混合，室溫孵育20分鐘；將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的VeroE6(猴腎上皮細(xì)胞)細(xì)胞(培養(yǎng)條件為含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)接種96孔板(Costa)，5×104細(xì)胞/孔/100μl，每孔加入50μl上述孵育后的siRNA樣品，24小時(shí)后更換新鮮正常完全培養(yǎng)基，然后各個(gè)細(xì)胞孔中加入100μl DMEM完全培養(yǎng)基稀釋的SARS病毒病毒(10-4)，繼續(xù)37℃，5％CO2培養(yǎng)72小時(shí)，觀察細(xì)胞存活狀態(tài)。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1 siRNA的鑒定。從瓊脂糖電泳圖(附

圖1)可以看出，雙鏈siRNA著色深，位置靠前而單鏈RNA對(duì)照染色很淺，位置稍靠后，表明已成功制備出雙鏈siRNA。
2.2 不同siRNA轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞對(duì)SARS病毒感染的保護(hù)作用結(jié)果見表2。從表中可以看出，序列4，17能夠完全抑制SARS病毒對(duì)vero細(xì)胞的感染，序列5，9，11具有較強(qiáng)的抑制病毒感染作用，序列1，2，15具有較弱的抑制病毒感染作用。而序列3，6，7，8，10，12，13，14，16完全沒有抑制SARS病毒感染的作用，其結(jié)果與光加脂質(zhì)體對(duì)照，或無血清對(duì)照，或針對(duì)GFP(綠色熒光蛋白)的siRNA及無關(guān)tRNA對(duì)照相似，細(xì)胞皆嚴(yán)重感染SARS病毒，導(dǎo)致細(xì)胞壞死。不加SARS病毒的正常細(xì)胞對(duì)照細(xì)胞生長良好。
表2.不同siRNA轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞對(duì)SARS病毒感染的保護(hù)作用

注“+”表示細(xì)胞受到病毒感染程度，數(shù)值越大表示感染程度越嚴(yán)重；“-”表示細(xì)胞未受到細(xì)胞感染，細(xì)胞生長狀態(tài)正常。
以上結(jié)果為病毒持續(xù)感染72小時(shí)結(jié)果。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>抑制SARS病毒感染的小RNA分子及其作用靶點(diǎn)<130><160>42<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>RNA<213><400>1ggagcagcug caacuacuca u 21<210>2<211>21<212>RNA<213><400>2gaguaguugc agcugcuccu u 21<210>3<211>21<212>RNA<213><400>3gacugcucuu aagaaaugca a 21<210>4<211>21<212>RNA<213><400>4gcauuucuua agagcagucu u 21<210>5<211>21<212>RNA<213><400>5gaacacuugu gaugguaaca c 21<210>6<211>21<212>RNA<213><400>6guuaccauca caaguguucu u 21<210>7<211>21<212>RNA<213><400>7guauaaauuu guccguaucc a 21<210>8<211>21<212>RNA<213><400>8gauacggaca aauuuauacu u 21<210>9<211>21<212>RNA<213><400>9gugcugcuau gaccauguca u 21<210>10<211>21<212>RNA<213><400>10gacaugguca uagcagcacu u 21<210>11<211>21<212>RNA<213><400>11guuucauguu cguuuagacu u 21<210>12<211>21<212>RNA<213><400>12gucuaaacga acaugaaacu u 21<210>13<211>21<212>RNA<213><400>13gcugcaagac guuguuaacc a21<210>14<211>21<212>RNA<213><400>14guuaacaacg ucuugcagcu u 21<210>15<211>21<212>RNA<213><400>15gugaauucaa cacuagaaca g 21<210>16<211>21<212>RNA<213><400>16guucuagugu ugaauucacu u21<210>17<211>19<212>DNA<213><400>17gtctaaacga acatgaaac19<210>18<211>19<212>DNA<213><400>18gtataaattt gtccgtatc19<210>19<211>19<212>DNA<213><400>19gtgaattcaa cactagaac19<210>20<211>19<212>DNA<213><400>20gaacacttgt gatggtaac19<210>21<211>19<212>DNA<213><400>21gtgctgctat gaccatgtc 19<210>22<211>19<212>DNA<213><400>22gactgctctt aagaaatgc 19<210>23<211>19<212>DNA<213><400>23gctgcaagac gttgttaac 19<210>24<211>19<212>DNA<213><400>24ggagcagctg caactactc 19<210>25<211>21<212>RNA<213><400>25gugcugcuau gaccauguca u21<210>26<211>21<212>RNA<213><400>26gacaugguca uagcagcacu u21<210>27<211>21<212>RNA<213><400>27guugaauguu ggugauuacu u 21<210>28<211>21<212>RNA<213><400>28guaaucacca acauucaacu u 21<210>29<211>21<212>RNA<213><400>29guuucauguu cguuuagacu u 21<210>30<211>21<212>RNA<213><400>30gucuaaacga acaugaaacu u 21<210>31<211>21<212>RNA<213><400>31ggagaaguca gcucaaugcu u 21<210>32<211>21<212>RNA<213><400>32gcauugagcu gacuucuccu u21<210>33<211>21<212>RNA<213><400>33ggauggacau guugaaaccu u21<210>34<211>21<212>RNA<213><400>34gguuucaaca uguccauccu u21<210>35<211>21<212>RNA<213><400>35guugccucuu gguauuaaca u21<210>36<211>21<212>RNA<213><400>36guuaauacca agaggcaacu u21<210>37<211>21<212>RNA<213><400>37gcugcaagac guuguuaacc a21<210>38<211>21<212>RNA<213><400>38guuaacaacg ucuugcagcu u 21<210>39<211>21<212>RNA<213><400>39gccuucaaac cuauguaaca c 21<210>40<211>21<212>RNA<213><400>40guuacauagg uuugaaggcu u 21<210>41<211>21<212>RNA<213><400>41gugaauucaa cacuagaaca g 21<210>42<211>21<212>RNA<213><400>42guucuagugu ugaauucacu u 2權(quán)利要求
1.具有下述序列結(jié)構(gòu)的任意一個(gè)雙鏈RNA分子，即序列表中的序列1和25’GGAGCAGCUGCAACUACUCAU 3’5’GAGUAGUUGCAGCUGCUCCUU 3’序列3和45’GACUGCUCUUAAGAAAUGCAA 3’5’GCAUUUCUUAAGAGCAGUCUU 3’序列5和65’GAACACUUGUGAUGGUAACAC 3’5’GUUACCAUCACAAGUGUUCUU 3’序列7和85’GUAUAAAUUUGUCCGUAUCCA 3’5’GAUACGGACAAAUUUAUACUU 3’序列9和105’GUGCUGCUAUGACCAUGUCAU 3’5’GACAUGGUCAUAGCAGCACUU 3’序列11和125’GUUUCAUGUUCGUUUAGACUU 3’5’GUCUAAACGAACAUGAAACUU 3’序列13和145’GCUGCAAGACGUUGUUAACCA 3’5’GUUAACAACGUCUUGCAGCUU 3’，或序列15和165’GUGAAUUCAACACUAGAACAG 3’5’GUUCUAGUGUUGAAUUCACUU 3’。
2.與權(quán)利要求1所述序列有90％以上同源性的任何雙鏈RNA分子。
3.具有下述序列結(jié)構(gòu)的任何一條單鏈RNA分子，包括正義鏈和反義鏈，即序列表中的序列1至16中的任一序列序列15’GGAGCAGCUGCAACUACUCAU 3’序列25’GAGUAGUUGCAGCUGCUCCUU 3’序列35’GACUGCUCUUAAGAAAUGCAA 3’序列45’GCAUUUCUUAAGAGCAGUCUU 3’序列55’GAACACUUGUGAUGGUAACAC 3’序列65’GUUACCAUCACAAGUGUUCUU 3’序列75’GUAUAAAUUUGUCCGUAUCCA 3’序列85’GAUACGGACAAAUUUAUACUU 3’序列95’GUGCUGCUAUGACCAUGUCAU 3’序列105’GACAUGGUCAUAGCAGCACUU 3’序列115’GUUUCAUGUUCGUUUAGACUU 3’序列125’GUCUAAACGAACAUGAAACUU 3’序列135’GCUGCAAGACGUUGUUAACCA 3’序列145’GUUAACAACGUCUUGCAGCUU 3’序列155’GUGAAUUCAACACUAGAACAG 3’，或序列165’GUUCUAGUGUUGAAUUCACUU 3’。
4.與權(quán)利要求3所述序列有90％以上同源性的任何單鏈RNA分子，包括正義鏈和反義鏈。
5.抑制SRAS病毒感染的藥物靶點(diǎn)，其特征為SRAS病毒中表達(dá)MHV蛋白、NSP蛋白或spike蛋白的部分基因序列。
6.抑制SRAS病毒感染的藥物靶點(diǎn)，其特征為SRAS病毒中表達(dá)各種蛋白的mRNA起始序列UCUAAAC。
7.權(quán)利要求5的藥物靶點(diǎn)，具有序列表中的序列17至24中的任一序列序列17aaGTCTAAACGAACATGAAAC序列18aaGTATAAATTTGTCCGTATC序列19aaGTGAATTCAACACTAGAAC序列20aaGAACACTTGTGATGGTAAC序列21aaGTGCTGCTATGACCATGTC序列22aaGACTGCTCTTAAGAAATGC序列23aaGCTGCAAGACGTTGTTAAC，或序列24aaGGAGCAGCTGCAACTACTC。
8.權(quán)利要求1或2的雙鏈RNA分子在制備SARS病毒或與SARS病毒基因序列相似的其他RNA病毒感染的防治藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求3或4的單鏈RNA分子在制備SARS病毒或與SARS病毒基因序列相似的其他RNA病毒感染的防治藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求5、6或7的藥物靶點(diǎn)在篩選SARS病毒或與SARS病毒基因序列相似的其他RNA病毒感染的防治藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組抑制SARS病毒感染的小RNA分子及其作用靶標(biāo)。這些小RNA分子為單鏈或雙鏈RNA分子。本發(fā)明的RNA分子能夠特異抑制SARS病毒及與SARS病毒基因序列相似的其他RNA病毒感染。本發(fā)明作藥物用靶點(diǎn)可用于篩選SARS病毒感染防治藥物。
文檔編號(hào)C07H21/02GK1443770SQ0312517
公開日2003年9月24日 申請(qǐng)日期2003年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月27日
發(fā)明者邵寧生, 楊光, 李潔, 曹國軍, 劉雪梅, 范明, 柳川, 沈倍奮 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所