專(zhuān)利名稱(chēng)：高效液相法精制河豚毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能獲得高純度河豚毒素的方法。
一種高效液相法精制河豚毒素的方法，其特征是先稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品和河豚毒素粗品制成稀醋酸水溶液，得到標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖和粗品的制備圖，用分析/半制備型高效液相色譜儀控制流速和進(jìn)樣量，根據(jù)已建立的標(biāo)準(zhǔn)條件確定制備條件的毒素峰，收集制備色譜中對(duì)應(yīng)峰的流出液，調(diào)節(jié)pH值，析出結(jié)晶，將該結(jié)晶先后用稀氨水、乙醇洗滌，然后將結(jié)晶溶于稀醋酸中；再用稀氨水調(diào)節(jié)pH，出結(jié)晶；如此反復(fù)數(shù)次；將獲得的結(jié)晶干燥。
本發(fā)明能防止產(chǎn)品異構(gòu)化，確保TTX的活性，減少損失，并且不需要貴重試劑，杜絕了帶入背景雜質(zhì)的可能，確保了TTX的純度，操作簡(jiǎn)便，避免使用過(guò)多的毒性試劑，比較安全，流動(dòng)相的條件簡(jiǎn)單，成本低。


及
具體實(shí)施例方式
附圖1為河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。
附圖2為半制備條件的色譜圖準(zhǔn)確稱(chēng)取河豚毒素(TTX)標(biāo)準(zhǔn)品2.00mg，溶于10ml醋酸水溶液，制成儲(chǔ)備液，該標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為0.2mg/ml。進(jìn)樣，得到標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖(圖1)。稱(chēng)取河豚毒素粗品20mg溶于2ml 2％(重量百分濃度)稀醋酸水溶液，手動(dòng)向色譜柱進(jìn)樣，進(jìn)樣量200μl，流速為3.0ml/min。根據(jù)分析條件確定制備條件的毒素峰，以圖2的色譜圖作為制備條件，主峰為毒素峰，并用小鼠法輔助驗(yàn)證毒素峰的位置，收集對(duì)應(yīng)峰的流出液，得到毒液46ml。該流出液經(jīng)冷凍干燥，經(jīng)氨水純化析出TTX晶體。反復(fù)經(jīng)氨水和乙醇洗滌再結(jié)晶4次，經(jīng)真空干燥得到TTX純品15.58mg，經(jīng)定量分析確認(rèn)純度可達(dá)99.0％。并經(jīng)核磁共振和質(zhì)譜驗(yàn)證了河豚毒素的分子結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的分析和半制備條件為WATERS公司600 E分析/半制備型高效液相色譜儀，大連依利特Hypersil反相C18色譜柱，規(guī)格為250*4.6mmi.d.和250*10.0mm，流動(dòng)相為醋酸水溶液。確定流速為2.0ml/min、進(jìn)樣體積20μl和200μl，檢測(cè)波長(zhǎng)為195nm。
本發(fā)明中所述的醋酸水溶液濃度為0.1-5％，所述的流速范圍為0.2-10ml/min，向色譜柱進(jìn)樣量的范圍10-5000μl。
由于河豚毒素結(jié)構(gòu)具有一個(gè)胍基，在水溶液中呈弱堿性，(pKa值為8.76)能與酸(如醋酸、苦味酸、檸檬酸)成鹽，加弱堿能游離出TTX。本發(fā)明利用此性質(zhì)，將河豚毒素溶于一定濃度的醋酸中，經(jīng)HPLC分離，分離的峰經(jīng)檢測(cè)確定出有毒位置。
權(quán)利要求
1.一種高效液相法精制河豚毒素的方法，其特征是先稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品和河豚毒素粗品制成稀醋酸水溶液，得到標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖和粗品的制備圖；用分析/半制備型高效液相色譜儀控制流速和進(jìn)樣量，根據(jù)已建立的標(biāo)準(zhǔn)條件確定制備條件的毒素峰，收集制備色譜中對(duì)應(yīng)峰的流出液，調(diào)節(jié)pH值，析出結(jié)晶；將該結(jié)晶先后用稀氨水、乙醇洗滌，然后將結(jié)晶溶于稀醋酸中，再用稀氨水調(diào)節(jié)pH，出結(jié)晶，如此反復(fù)數(shù)次；將獲得的結(jié)晶干燥。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的醋酸水溶液濃度為0.1-5％。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的控制流速范圍為0.2-10ml/min，向色譜柱進(jìn)樣量范圍為10-5000μl。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的調(diào)節(jié)pH值的范圍為8.0-10.0。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的色譜柱為反相C18柱。
全文摘要
一種高效液相法精制河豚毒素的方法，其特征是先稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品和河豚毒素粗品制成稀醋酸水溶液，得到標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖和粗品的制備圖。用分析/半制備型高效液相色譜儀控制流速和進(jìn)樣量，根據(jù)已建立的標(biāo)準(zhǔn)條件確定制備條件的毒素峰，收集制備色譜中對(duì)應(yīng)峰的流出液，調(diào)節(jié)pH值，析出結(jié)晶，將該結(jié)晶先后用稀氨水、乙醇洗滌，然后將結(jié)晶溶于稀醋酸中，再用稀氨水調(diào)節(jié)pH，出結(jié)晶，如此反復(fù)數(shù)次；將獲得的結(jié)晶干燥。本發(fā)明能防止產(chǎn)品異構(gòu)化，確保TTX的活性，減少損失，并且不需要貴重試劑，杜絕了帶入背景雜質(zhì)的可能，確保了TTX的純度，操作簡(jiǎn)便，避免使用過(guò)多的毒性試劑，比較安全，流動(dòng)相的條件簡(jiǎn)單，成本低。
文檔編號(hào)C07D491/22GK1470514SQ0313870
公開(kāi)日2004年1月28日 申請(qǐng)日期2003年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月24日
發(fā)明者宮慶禮, 崔建洲, 王仁芳, 閻承璋, 黃海龍, 車(chē)兆東 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)