專利名稱：抗惡性腫瘤南柴胡萃取物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種應(yīng)用在癌癥治療領(lǐng)域，從天然物中萃取出治療細(xì)胞增生性疾病(Cell Proliferative Disorder)的植物萃取物及其萃取方法，特別是關(guān)于一種分離自南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium)，并以具γ-丁內(nèi)酯(γ-Butyrolactone)核心的雜環(huán)化合物作為治療人類肝癌(Hepatoma)、肺癌(Lung cancer)、卵巢癌(Ovarian cancer)、惡性腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤(Human Malignant Glioblastoma)以及大腸直腸癌(ColorectalCancer)等癌細(xì)胞的主要活性成份的南柴胡萃取物及其萃取方法。
背景技術(shù)：
癌癥是一種細(xì)胞增生性疾病，已經(jīng)成為十大死亡原因之首。根據(jù)Boring等人1993年的統(tǒng)計(jì)，美國每年約有五十二萬六千人死于癌癥，以女性癌癥的首乳癌(Breast Cancer)為例，幾已成為40至55歲婦女的主要?dú)⑹?。且隨著環(huán)境污染日益嚴(yán)重，卵巢癌(Ovarian Carcinoma)、肺癌以及肝癌等實(shí)體癌(Solid Tumor)以及皮膚癌等患者也明顯增多。根據(jù)Fitzpatrick等人1986年的研究，今日的癌癥患者人數(shù)與1945年相較，足足多出六倍，顯見癌癥的檢查與治療實(shí)在是刻不容緩。
根據(jù)目前癌癥的研究發(fā)現(xiàn)，真核細(xì)胞(Eukaryocyte)的細(xì)胞老化(Senescence)、復(fù)制(Replication)以及分裂(Division)都會遵循細(xì)胞周期(Cell Cycle)的模式予以調(diào)控。的，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制時(shí)，攜帶基因的染色體(Chromosome)其去氧核醣核酸(Deoxyribonucleic Acid，DNA)含量會由2N倍增成4N，以于有絲分裂(Mitosis)后產(chǎn)生兩個(gè)2N子細(xì)胞(Daughter Cell)。1995年Blackburn等人指出，真核細(xì)胞分裂時(shí)，染色體末端會重復(fù)一段稱作“端粒(Telomere)”的固定序列。以人類細(xì)胞為例，人類染色體末端的端粒會重復(fù)固定5’-TTAGGG序列。從目前研究結(jié)果得知，“端粒”與細(xì)胞周期的時(shí)程(Cell Clock)調(diào)控有關(guān)，隨著有絲分裂次數(shù)增加，端粒會逐漸變短，當(dāng)端粒縮短到一定長度時(shí)，染色體末端覆蓋的端粒很容易黏結(jié)而導(dǎo)致染色體配對異常，甚至造成細(xì)胞死亡(Cell death)。
1995年Feng等人在胚細(xì)胞(Germ-line Cell)、干細(xì)胞(Stem Cell)及腫瘤細(xì)胞(Tumor Cell)等旺盛分裂的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞染色體末端的端粒上附著有一種稱為“端粒酶(Telomerase)”的核醣蛋白復(fù)合體(Ribonucleoprotein Complex)，端粒酶的作用在于維持端粒長度，避免端粒歷經(jīng)多次有絲分裂而變短，因此，端粒酶的存在可以幫助細(xì)胞跳脫細(xì)胞周期限制而走向不死化。
若進(jìn)一步以TRAP(Telomerase Repeat Amplification Protocol)Assay測試染色體端粒酶活性(Telomerase Activity)更發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞或分化不完全的細(xì)胞系(如胚細(xì)胞、干細(xì)胞等)中，端粒酶的活性很高，但在骨髓細(xì)胞及生殖細(xì)胞以外的正常體細(xì)胞則幾乎沒有端粒酶活性；又，1994及1995年Kim及Broccoli等人亦證實(shí)，端粒酶在協(xié)助腫瘤細(xì)胞閃躲細(xì)胞程序化死亡調(diào)控的連鎖機(jī)制(Apoptotic Cascade)中扮演重要角色，因此，以端粒酶活性作為抗癌藥物的檢查標(biāo)的，可以有效取代傳統(tǒng)化學(xué)標(biāo)的，準(zhǔn)確地檢查藥物對于腫瘤細(xì)胞的毒殺情形，而使得檢測端粒酶活性幾已成為測試抗癌藥物治療功效的高專一性(Specificity)指針。
另一方面，根據(jù)中醫(yī)界多年來臨床治療經(jīng)驗(yàn)，將臨床上認(rèn)為具有抗癌功效的五、六十種中藥材，經(jīng)TRAP活性篩選后發(fā)現(xiàn)，柴胡、黃柏、人參、甘草、當(dāng)歸、龍膽及黃芩等中藥材對于惡性腫瘤具有明顯的治療效果。同時(shí)，將中藥與目前抗癌藥物相較，亦發(fā)現(xiàn)中藥造成患者的副作用(如白血球數(shù)量減少、惡病質(zhì)(Cachexia)等)較為緩和，因此，從中藥里萃取出具腫瘤抑制功效的活性成份，極可能作為新型抗癌藥物的篩選來源。
此外，以現(xiàn)今廣泛用來治療轉(zhuǎn)移性實(shí)體癌的化學(xué)治療劑(Chemotherapeutic Agent)“紫杉醇(Paclitaxel，商品名TAXOL)”為例，紫杉醇最早是從太平洋紫杉木(Pacific Yew Tree)萃取而得，化學(xué)式如下式所示(分子式C47H51NO14，分子量854，以二帖類(Diterpene)結(jié)構(gòu)為核心) 紫杉醇(Paclitaxel)主要應(yīng)用于治療卵巢癌(Ovarian Cancer)、轉(zhuǎn)移性乳癌(Metastatic Breast Cancer)、肺癌(Lung Cancer)以及黑色素細(xì)胞瘤(Melanoma)等癌癥，其毒殺腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)轉(zhuǎn)，系藉由紫杉醇以1∶1比例結(jié)合細(xì)胞骨架(Cytoskeleton)內(nèi)的β微小管(β-tubulin)來抑制微小管(Microtubule)的去聚合作用(Depolymerization)，藉此阻斷有絲分裂(Mitosis)完成以激活腫瘤細(xì)胞凋亡(Blafosklonny et.al，1995)。因此，使用紫杉類(Taxane)藥物治療卵巢癌之初，可以有效殺死腫瘤細(xì)胞，而使患者的兩年存活率提高約15％。
但是，隨著療程延長，臨床上發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對于紫杉醇會逐漸產(chǎn)生抗藥性。尤其，從最近研究發(fā)現(xiàn)，部分具紫杉醇抗藥性的腫瘤細(xì)胞系在β微小管的表現(xiàn)(Expression)及電泳移動(dòng)性(ElectrophoreticMobility)上明顯不同于傳統(tǒng)腫瘤細(xì)胞。根據(jù)1995年Rao等人的研究可知，這些腫瘤細(xì)胞(如人類肺癌細(xì)胞系A(chǔ)T-12)會改變組成β微小管的六個(gè)次單體構(gòu)型(Subunit Configuration)，使紫杉醇不僅無法與β微小管結(jié)合，反會被細(xì)胞當(dāng)作外來物排除(Ion-pumping)，致使腫瘤細(xì)胞對于紫杉醇逐漸產(chǎn)生抗藥性而在化療后期逐漸失效。
并且，以現(xiàn)存其它抗癌藥物，如5-氟嘧啶二酮(5-Fluorouracil)、埃波霉素(Epothilone)、順雙胺雙氯鉑(Cisdiammine Dichloroplatinum，俗稱Cisplatin)、甲基芐胼(Procarbazine)以及環(huán)磷胺(Cyclophosphamide)等單獨(dú)使用或并用紫杉醇來治療對于紫杉類藥物具抗藥性的患者，臨床治療效果不佳，且從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來看亦發(fā)現(xiàn)目前的抗癌藥物難以抑制紫杉醇抗藥性腫瘤細(xì)胞系(Taxol-resistance TumorCell Line)增生。然如提高藥物投予劑量，例如將紫杉醇劑量調(diào)高到每公斤300毫克注射大白鼠時(shí)，紫杉醇產(chǎn)生的細(xì)胞毒性(Cytotoxicity)很強(qiáng)，往往于用藥后造成正常細(xì)胞大量壞死(Necrosis)。
是故，為增進(jìn)化療后期癌細(xì)胞的毒殺效果，從臨床上初見抗癌功效的中藥材里發(fā)展出能有效抑制紫杉醇抗藥性腫瘤細(xì)胞系的抗癌藥物，已成為醫(yī)藥界的當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的主要目的在于提供一種萃取自南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd.)，用于抑制紫杉醇抗藥性腫瘤細(xì)胞系(Taxol-resistance Tumor Cell Line)的具γ-丁內(nèi)酯(γ-Butyrolactone)核心雜環(huán)化合物或其藥物上可接受的鹽、酯、酮及其衍生物，以及萃取此等雜環(huán)化合物及其衍生物的萃取方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種由南柴胡生藥中分離出具腫瘤細(xì)胞抑制效果，以新穎化合物異柴胡內(nèi)酯(Isochaihulactone)為首的柴胡內(nèi)酯(Chaihulactone)類似物(Analogues)及其衍生物或其藥物上可接受的鹽、酯、酮與其衍生物的萃取方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種由南柴胡生藥中分離出可抑制人類肝癌、卵巢癌、惡性腦瘤、肺癌及大腸直腸癌的具γ-丁內(nèi)酯(γ-Butyrolactone)核心的雜環(huán)化合物或其藥物上可接受的鹽、酯、酮，與其衍生物的萃取方法。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種在不影響正常肝腎功能的情況下，發(fā)展出對紫杉醇抗藥性腫瘤細(xì)胞系具高度專一性毒殺效果的南柴胡萃取物及其萃取方法，的，該南柴胡萃取物進(jìn)一步包含有以γ-丁內(nèi)酯(γ-Butyrolactone)為核心的雜環(huán)化合物，或其藥物上可接受的鹽、酯、酮與其衍生物。為了完成本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種從南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium)中分離出用于對抗細(xì)胞細(xì)胞增生性疾病的活性成份的南柴胡萃取方法，該萃取方法包括抽提南柴胡以取得木脂素混合物，其中該木脂素混合物包含有至少一種可抑制腫瘤增生的活性成份；以及分離該抑制腫瘤增生的活性成份，以得到單一類型的南柴胡萃取物。
在該方法中，從南柴胡中抽提出該木脂素混合物的步驟包括以極性互異的第一、第二、第三及第四溶液來執(zhí)行以下步驟以第一溶液溶抽粉碎后的南柴胡，分離取得南柴胡第一萃取物及殘?jiān)?；以第二溶液溶抽殘?jiān)?，分離取得南柴胡第二萃取物；以第三溶液抽提該南柴胡第一萃取物，并且脫除抽提水層中的醇類；以及以第四溶液抽提該脫除醇類的抽提水層，并予以濃縮。
換言之，本發(fā)明的腫瘤抑制物質(zhì)及其萃取方法，包括含有分離自南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd.)，用于治療肺癌、卵巢癌、肝癌、人類惡性腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤或大腸直腸癌的南柴胡萃取物及其萃取方法，以及從南柴胡粗萃取物(Crude Extracts)中進(jìn)一步分離出來的腫瘤抑制成份，或藥物上可接受的鹽、酯、酮或其衍生物。
該南柴胡萃取物的腫瘤抑制成份主要包含一種如通式(I)代表，以γ-丁內(nèi)酯(γ-Butyrolactone)為核心，并在碳-2(5)為Z構(gòu)型或E構(gòu)型的雜環(huán)化合物或其藥物上可接受的鹽、酯、酮與其衍生物
式(I)其中，X＝N，O，S，Se；A，B分別選自具有下式的取代基 其中，R1，R2，R3，R4，R5分別選自氫原子、鹵原子、羥基、硫氫基、胺基、烷氧基及硝基。
同時(shí)，式(I)中還包括一種如通式(II)及通式(III)所示，首次公開并且分別命名為柴胡內(nèi)酯(Chaihulactone)、異柴胡內(nèi)酯(Isochaihulactone)及其類似物的雜環(huán)化合物。的，該柴胡內(nèi)酯、異柴胡內(nèi)酯以及該柴胡內(nèi)酯類似物及其衍生物屬于存在于南柴胡的木脂素(Lignan)。比較式(I)、式(II)及式(III)可知，柴胡內(nèi)酯、異柴胡內(nèi)酯均為一種以γ-丁內(nèi)酯結(jié)構(gòu)為核心，且碳2-(5)呈Z構(gòu)型或E構(gòu)型的雜環(huán)化合物。
式(II)其中，R代表烷氧基。
式(III)其中，R代表氫原子、烷氧基或芳基。
從本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以不同溶劑(如丙酮、甲醇水溶液等)分離南柴胡中含有γ-丁內(nèi)酯結(jié)構(gòu)等雜環(huán)化合物的萃取物，均可以有效抑制腫瘤細(xì)胞增生，且以南柴胡丙酮粗抽取物的腫瘤抑制效果最佳。而且，利用層析法(Chromatography)進(jìn)一步分離該南柴胡丙酮粗抽取物，并分析各濃縮物的分子結(jié)構(gòu)，可以得到新穎雜環(huán)化合物“柴胡內(nèi)酯、異柴胡內(nèi)酯、柴胡內(nèi)酯相關(guān)類似物及其衍生物”。
根據(jù)本發(fā)明較佳實(shí)施例實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將南柴胡萃取物中分離出來的柴胡內(nèi)酯(Chaihulactone)、異柴胡內(nèi)酯(Isochaihulactone)、柴胡內(nèi)酯類似物及其衍生物加入人類肺癌、肝癌、惡性腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤及大腸癌細(xì)胞系以后發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞系的端粒酶活性(Telomerase Activity)較未加藥的控制組明顯減少約5倍，尤其是紫杉醇抗藥性腫瘤細(xì)胞系(Taxol-resistance Tumor Cell Line)的端粒酶活性在南柴胡萃取物添加之后，可以產(chǎn)生明顯的毒殺效果，顯示本發(fā)明所提供的南柴胡萃取物里確實(shí)含有腫瘤抑制成份，且該腫瘤抑制成份包括以γ-丁內(nèi)酯結(jié)構(gòu)為核心，丁內(nèi)酯核心的碳2(5)處呈Z構(gòu)型或E構(gòu)型的雜環(huán)化合物，或其藥物上可接受的鹽、酯、酮與其衍生物，其中又以新發(fā)現(xiàn)的柴胡內(nèi)酯(Chaihulactone)、異柴胡內(nèi)酯(Isochaihulactone)及其衍生物其腫瘤毒殺效果最為顯著，因此，本發(fā)明是將以異柴胡內(nèi)酯為首的雜環(huán)化合物作為腫瘤抑制物質(zhì)(Antineoplastic Agent)的主要活性成份。
以下即揭示從南柴胡中分離出具腫瘤抑制功效的γ-丁內(nèi)酯雜環(huán)化合物及其衍生物的萃取方法。該萃取方法包含兩階段，第一階段是以極性(Polarity)互異的溶劑將南柴胡生藥分離出不同萃取層，而第二階段則是以層析法(Chromatography)分離特定萃取層以得到單一類型的南柴胡萃取物。以下即逐步說明南柴胡生藥萃取出腫瘤抑制成份的方法以丙酮(Acetone)浸泡并攪拌南柴胡粉末，反復(fù)抽取濃縮得到南柴胡丙酮粗抽取物(Bupleurum scorzonerifolium-Acetone Crude Extract，簡稱為BS-A層)后，將殘?jiān)约状汲槿〉玫侥喜窈状即殖槿∥?簡稱為BS-M層)，復(fù)以水抽取殘?jiān)缘玫侥喜窈畬映槿∥?簡稱為BS-W層)；將BS-A層溶解于甲醇水溶液，經(jīng)過正己烷(n-Hexane)萃取后，分離取得南柴胡正己烷層(簡稱為BS-H層)以及南柴胡甲醇水層；脫除南柴胡甲醇水層中的甲醇，并以氯仿(Chloroform，CHCl3)重復(fù)萃取濃縮；以層析法(Chromatography)分離該南柴胡氯仿萃取物，并分別收集不同濃度的甲醇/二氯甲烷洗提層(Elution)予以濃縮；
將不同濃度的甲醇/二氯甲烷洗提層各以層析法分離純化，以得到單一類型的化合物。
由于依上述方法得到的南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A)、南柴胡甲醇粗抽取物(BS-M)、5％甲醇/二氯甲烷洗提層以及層析收集物等加入腫瘤細(xì)胞系培養(yǎng)后均發(fā)現(xiàn)明顯腫瘤毒殺效果，且以質(zhì)譜(Mass Spectrum)及核磁共振圖譜(Nuclear Magnetic Resonance Spectrum)鑒定南柴胡中具腫瘤抑制活性的化合物結(jié)構(gòu)，亦顯示此等化合物均具有γ-丁內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，由此可證本發(fā)明的萃取方法抽取南柴胡，確能有效保留藥材住中藥材中的腫瘤抑制成份。
再者，以TRAP Assay檢測腫瘤細(xì)胞系加入南柴胡萃取物以后，端粒酶(Telomerase)的活性抑制情形，結(jié)果發(fā)現(xiàn)南柴胡丙酮粗抽取物可以有效抑制人類肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的端粒酶活性及hTERT信息核糖核酸的表現(xiàn)，顯示南柴胡丙酮粗抽取物對于癌細(xì)胞可能具有高度專一性的毒殺效果。
尤其，將含有以γ-丁內(nèi)酯為核心的雜環(huán)化合物的南柴胡丙酮粗抽取物以及從南柴胡萃取物分離出來的柴胡內(nèi)酯類似物與其衍生物加入紫杉醇抗藥性腫瘤細(xì)胞系(Taxol-resistance Tumor Cell Line)，例如A549-T12(對紫杉醇具抗藥性的人類肺癌細(xì)胞系)，亦發(fā)現(xiàn)南柴胡萃取務(wù)中的γ-丁內(nèi)酯核心雜環(huán)化合物及其衍生物會誘發(fā)紫杉醇抗藥性腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生細(xì)胞凋亡(Apoptosis)；且從流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer)及西方點(diǎn)墨法(Western Blot)結(jié)果進(jìn)一步探討南柴胡萃取物的作用機(jī)轉(zhuǎn)，亦發(fā)現(xiàn)當(dāng)腫瘤細(xì)胞系加入南柴胡萃取物以后，該南柴胡萃取物會誘導(dǎo)細(xì)胞大量生產(chǎn)p21及p53等腫瘤抑制蛋白抑制物(TumorSuppressor)，使腫瘤細(xì)胞停滯在有絲分裂后期(高G2/M比例)的紡垂絲聚合狀態(tài)(Spindle Polymerization)。故，由細(xì)胞調(diào)控(Cell Regulation)的觀點(diǎn)來看，南柴胡丙酮粗萃取物及其內(nèi)所含以γ-丁內(nèi)酯(γ-Butyrolactone)為核心的雜環(huán)化合物可視為一種用于抑制有絲分裂的微小管穩(wěn)定劑(Microtubule Stabilizing Agent)，其作用機(jī)轉(zhuǎn)與紫杉醇(Paclitaxel)類似，均具有促進(jìn)微小管聚合(Microtubule Polymerization)的功效，使增生的腫瘤細(xì)胞停滯在G2/M期，變成無效細(xì)胞(Junk Cell)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。


圖1為顯示以本發(fā)明萃取方法分離南柴胡所取得的南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A)、南柴胡甲醇粗抽取物(BS-M)以及南柴胡水層粗抽取物(BS-W)進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)(MTT Assay)后，腫瘤細(xì)胞存活率與南柴胡投藥劑量間的變化示意圖；圖2A至圖2D為顯示以本發(fā)明萃取方法分離南柴胡所取得的南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A)、南柴胡甲醇粗抽取物(BS-M)以及南柴胡水層粗抽取物(BS-W)加至肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549且以流式細(xì)胞儀檢測后，各種南柴胡萃取物對于腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞周期波峰示意圖；圖3A至圖3C為顯示人類肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549在未加藥、加入異柴胡內(nèi)酯20μM及柴胡丙酮萃取物60微克/毫升連續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，經(jīng)流式細(xì)胞儀測得的Annexin V-FLOUS細(xì)胞凋亡象限圖(橫軸表示與Annexin V-FLOUS抗體接合的腫瘤細(xì)胞螢光強(qiáng)度，而縱軸代表與PI抗體接合的腫瘤細(xì)胞螢光強(qiáng)度)；圖4為顯示人類肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549在未加藥(控制組)、加入南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A)、南柴胡萃取物第八成份(BS-8)以及紫杉醇的作用下，經(jīng)流式細(xì)胞儀測得的細(xì)胞周期變化分析圖；圖5為顯示人類肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549在未加藥(C)、加入南柴胡丙酮萃取物(BS-A)、南柴胡甲醇萃取物(BS-M)、南柴胡水層萃取物(BS-W)、南柴胡萃取物第八成份(BS1)、南柴胡萃取物第三成份(BS2)一日或三日后，測試腫瘤抑制蛋白抑制物(Tumor Suppressor)p21以及p53含量的西方點(diǎn)墨法(Western Blot)示意圖；圖6為顯示人類肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549在未加藥(C)、加入南柴胡丙酮萃取物12小時(shí)、24小時(shí)及48小時(shí)以后，測試腫瘤細(xì)胞細(xì)胞骨架中，第一型α-微小管以及第五型β-微小管的西方點(diǎn)墨法示意圖；圖7為顯示人類肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549在未加藥(A549)、加入南柴胡萃取物第八成份、紫杉醇以及Vinca植物堿之后，測試腫瘤細(xì)胞β-微小管在溶解型(Soluble form，以S表示)或顆粒型(Particular form，以P表示)的西方點(diǎn)墨法示意圖；圖8為顯示人類肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549在加入南柴胡萃取物之后，紡錘絲呈現(xiàn)拉長狀態(tài)的共軛交顯微鏡(Confocal Microscope)螢光標(biāo)定切片圖；圖9A至圖9D為顯示人類肺癌紫杉醇抗藥性細(xì)胞系A(chǔ)549-T12在未加藥、加入南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A)、南柴胡萃取物第八成份(BS-8)以及南柴胡萃取物第十五成份(BS-15)24小時(shí)之后，經(jīng)流式細(xì)胞儀測得的Annexin V-FLOUS細(xì)胞凋亡象限圖(橫軸表示與Annexin V-FLOUS抗體接合的腫瘤細(xì)胞螢光強(qiáng)度，而縱軸代表與PI抗體接合的腫瘤細(xì)胞螢光強(qiáng)度)；
圖10A至圖10C為顯示人類肺癌紫杉醇抗藥性細(xì)胞系A(chǔ)T-12在加入南柴胡丙酮萃取物(BS-A)、南柴胡萃取物第八成份(BS-8)及南柴胡萃取物第十五成份(BS-15)24小時(shí)以及48小時(shí)期間，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗(yàn)(MTT Assay)示意圖；圖11A為顯示裸鼠皮下植A549細(xì)胞系(控制組)，放大100倍并經(jīng)蘇木紫與伊紅染色法(Haematoxylin and Eosin Stain，H&E Stain)處理后的組織切片示意圖；圖11B為顯示于裸鼠皮下植入A549細(xì)胞系，連續(xù)五天投予腹腔內(nèi)注射500毫克/公斤南柴胡丙酮萃取物，第七天的腫瘤經(jīng)放大100倍以及蘇木紫與伊紅染色法(Haematoxylin and Eosin Stain，H&E Stain)處理后，出現(xiàn)大片腫瘤組織出血性壞死的組織切片示意圖；圖12A為顯示裸鼠皮下植入A549-T12細(xì)胞系(控制組)，放大100倍并經(jīng)蘇木紫與伊紅染色法(Haematoxylin and Eosin Stain，H&E Stain)處理后的組織切片示意圖；圖12B為顯示于裸鼠皮下植入A549-T12細(xì)胞系，連續(xù)五天投予腹腔內(nèi)注射400毫克/公斤南柴胡丙酮萃取物，第七天的腫瘤經(jīng)放大100倍以及蘇木紫與伊紅染色法(Haematoxylin and Eosin Stain，H&E Stain)處理后，出現(xiàn)大片組織纖維化及只剩余若干腫瘤細(xì)胞；圖13A為顯示裸鼠皮下植入A549細(xì)胞系形成腫瘤，連續(xù)五天投予腹腔內(nèi)注射400毫克/公斤的BS-A治療，第七日后與未加藥的控制組相較，其皮下腫瘤直徑的局部放大照片；圖13B為顯示活體狀態(tài)下，以每公斤體重500毫克的南柴胡丙酮粗抽取物腹腔注射投予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并比較未加藥控制組與加藥治療組在相對腫瘤體積與治療天數(shù)間的變化示意圖；圖14為顯示以每公斤體重400毫克的南柴胡萃取物投予清醒鼠72小時(shí)期間，胰臟、肝臟、心臟、腎臟及造血組織各功能的生化指針酵素變化示意圖；圖15為顯示以靜脈注射每公斤體重400毫克的南柴胡萃取物投予清醒鼠72小時(shí)期間，血小板、白血球、淋巴球的變化示意圖；圖16為顯示以靜脈注射每公斤體重400毫克的南柴胡萃取物投予清醒鼠72小時(shí)期間，心搏、收縮壓、舒張壓及平均壓的變化示意圖；以及圖17為以連續(xù)五日腹腔內(nèi)注射每公斤體重300毫克的南柴胡萃取物投予清醒鼠之后，其肝臟細(xì)胞及腎臟細(xì)胞的組織切片圖。
具體實(shí)施例方式
以下為藉由特定的具體實(shí)施例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，熟習(xí)此技藝的人士可由本說明書所揭示的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明亦可藉由其它不同的具體實(shí)施例加以施行或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)亦可基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在不悖離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾與變更。
本發(fā)明至少包含三部分一為從南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd)生藥中萃取出對于人類肝癌細(xì)胞系J5、卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3、惡性腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系DBTRG-05MD、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及大腸直腸癌細(xì)胞系HT29具抑制功效的天然萃取物的南柴胡萃取方法。
其二是按照該萃取方法，從南柴胡萃取物中分離出以γ-丁內(nèi)酯為核心，且碳2(5)位置呈Z構(gòu)型或E構(gòu)型的雜環(huán)化合物，以及形成此等雜環(huán)化合物在藥物上可接受的鹽、酯、酮及其類似衍生物。其中，該雜環(huán)化合物中進(jìn)一步包括有新穎化合物柴胡內(nèi)酯(Chaihulactone)、異柴胡內(nèi)酯(Isochaihulactone)、以及與柴胡內(nèi)酯相關(guān)的類似物及其衍生物。
而第三部份則是將具有γ-丁內(nèi)酯核心雜環(huán)化合物的南柴胡丙酮粗抽取物、柴胡內(nèi)酯、異柴胡內(nèi)酯、柴胡內(nèi)酯類似物及其衍生物，或其藥物上可接受的鹽、酯、酮等加至腫瘤細(xì)胞系來檢驗(yàn)體內(nèi)(in vivo)及體外(in vitro)環(huán)境下，各南柴胡萃取物對于腫瘤細(xì)胞系的抑制效果，復(fù)運(yùn)用動(dòng)物模式進(jìn)一步評估南柴胡萃取物對于生物體正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的影響，以檢視活體狀態(tài)下，南柴胡萃取物對于肝癌、卵巢癌、肺癌、惡性腦瘤或大腸直腸癌的抑癌效果。
根據(jù)本發(fā)明較佳實(shí)施例所采用的南柴胡抽取方法，該方法是將生藥南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium)粉碎后浸泡于丙酮(Acetone)，經(jīng)過四次反復(fù)攪拌、抽取及濃縮而取得南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A層)后，將殘?jiān)约状汲槿〉玫侥喜窈状即殖槿∥?簡稱為BS-M層)，再以水抽取殘?jiān)缘玫侥喜窈畬映槿∥?簡稱為BS-W層)；之后，將南柴胡丙酮粗抽取物溶解于甲醇水溶液，經(jīng)過正己烷(n-Hexane)粗抽后，分離取得南柴胡正己烷層(簡稱為BS-H層)以及南柴胡甲醇水層；而后，脫除南柴胡甲醇水層中的甲醇，并以氯仿(Chloroform，CHCl3)重復(fù)萃取濃縮取得南柴胡氯仿萃取物；而后，利用層析法(Chromato-graphy)分離該南柴胡氯仿萃取物，并且分別收集不同濃度的甲醇/二氯甲烷洗提層(Elution)進(jìn)行濃縮；最后，以層析法(如硅膠柱層析法(Silica Gel Chromatography)、制備型高效能液相層析法(preparative HPLC)等)將甲醇/二氯甲烷洗提層分離純化，俾取得單一類型的化合物。
從層析法分離出來的單離化合物，經(jīng)過質(zhì)譜(Mass Spectrum)及核磁共振圖譜(Nuclear Magnetic Resource Spectrum)鑒定各單類化合物的分子量以及結(jié)構(gòu)，可得到如下表所示的雜環(huán)化合物

將南柴胡各萃取層以及分離自南柴胡丙酮粗抽物中的上述雜環(huán)化合物分別施予藥物篩選，可得知南柴胡生藥中所含有的腫瘤抑制成份主要保留在南柴胡丙酮粗抽取物以及南柴胡甲醇水層，南柴胡正己烷層以及經(jīng)氯仿處理后分離的南柴胡水層幾乎不具腫瘤抑制功效。而且，經(jīng)層析法(如低壓液相層析或高效能液相層析法(High PerformanceLiquid Chromatography，HPLC))進(jìn)一步純化，可以分段收集各洗提層，以濃縮后得到上述各類單一化合物。
惟從本發(fā)明較佳實(shí)施例的藥物篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在層析法分離出來的各種上述成份中，第三成份、第八成份對于人類肝癌、卵巢癌、肺癌、惡性腦瘤以及大腸直腸癌細(xì)胞系的腫瘤毒殺效果最為顯著。而且，進(jìn)一步分析具腫瘤效果的第三、第八成份的主要代表性分子結(jié)構(gòu)，亦可得知南柴胡萃取物中的抑癌有效成份其分子主要特征系如通式(I)所示，俱具有γ-丁內(nèi)酯(γ-Butyrolactone)核心，且以具有γ-丁內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，同時(shí)碳-2(5)位置呈Z構(gòu)型或E構(gòu)型的雜環(huán)化合物或其藥物上可接受的鹽、酯、酮與其衍生物作為抑制腫瘤增生的主要活性成份。
式(I)其中，X＝N，O，S，Se；A，B分別選自具有下式之取代基 其中，R1，R2，R3，R4，R5分別選自氫原子、鹵原子、羥基、硫氫基、胺基、烷氧基及硝基。
若進(jìn)一步分析純化合物中，第三成份、第八成份、第十四成份以及第十五成份的分子結(jié)構(gòu)，亦可知南柴胡萃取物中包括有一類首次公開并且命名為柴胡內(nèi)酯(Chaihulactone)、異柴胡內(nèi)酯(Isochaihulactone)以及與該柴胡內(nèi)酯相關(guān)類似物或衍生物，如柴胡奈酮(Chaihunaphthone)等的新穎雜環(huán)化合物。其中，該柴胡內(nèi)酯以及異柴胡內(nèi)酯均是以γ-丁內(nèi)酯為碳骨架核心，并于碳-2(5)位置形成Z構(gòu)型的雜環(huán)化合物，該柴胡內(nèi)酯類似物及異柴胡內(nèi)酯類似物的通式分別如式(II)及式(III)所示 式(II)其中，R代表烷氧基。
式(III)其中，R代表氫原子、烷氧基或芳基。
此新穎雜環(huán)化合物柴胡內(nèi)酯、異柴胡內(nèi)酯，以及與柴胡內(nèi)酯相關(guān)的類似物及其衍生物屬于一種存在于南柴胡干燥物的木脂素(Lignan)。由于藥物篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)各類南柴胡萃取物中以南柴胡丙酮粗抽取物以及第八成份的異柴胡內(nèi)酯(Isochaihulactone)具有最佳的腫瘤抑制效果，因此，以下所述的較佳實(shí)施例遂分別以南柴胡丙酮粗抽取層及第八成份來當(dāng)作含有γ-丁內(nèi)酯的南柴胡萃取物，以及南柴胡新穎化合物“柴胡內(nèi)酯類似物及其衍生物”的活性指針成份。以用來抑制人類肝癌、卵巢癌、肺癌、惡性腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及大腸直腸癌的功效指針成份。
(γ-Butyrolactone)核心雜環(huán)化合物及柴胡內(nèi)酯類似物的指針，藉以檢測南柴胡萃取物對于細(xì)胞系以及生物體內(nèi)的腫瘤抑制情形。
惟從本發(fā)明較佳實(shí)施例的組織切片結(jié)果，已明白顯示出南柴胡丙酮萃取物能夠有效縮小腫瘤體積(Tumor Volume)，使腫瘤細(xì)胞核發(fā)生裂解，淋巴球浸潤而造成腫瘤組織大片壞死。而且，經(jīng)由動(dòng)物毒性試驗(yàn)結(jié)果，亦可知投予南柴胡萃取物至哺乳類動(dòng)物后，體內(nèi)各項(xiàng)器官功能性指針，例如脂解酶(Lipase)、淀粉酶(Amylase)、肌胺酸酐激酶(Creatinine Kinase)、乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase)、GOT、BUN等，在投予南柴胡萃取物前后并無顯著差異，但是腫瘤部位的端粒酶活性在投予南柴胡萃取物后卻明顯降低，顯示以本發(fā)明的南柴胡丙酮粗抽取物以及新穎化合物“柴胡內(nèi)酯、異柴胡內(nèi)酯及柴胡內(nèi)酯相關(guān)類似物與其衍生物”投予哺乳類動(dòng)物，可在不傷害正常肝腎功能的情況下，可能對于人類肝癌、卵巢癌、肺癌、惡性腦瘤以及大腸直腸癌產(chǎn)生高度專一性(High Specificity)的毒殺能力。
另一方面，將具有γ-丁內(nèi)酯雜環(huán)化合物的南柴胡丙酮粗萃取物，以及自南柴胡萃取物中分離出來的第八成份異柴胡內(nèi)酯(為柴胡內(nèi)酯、柴胡內(nèi)酯類似物及其衍生物的指針成份)投予紫杉醇抗藥性腫瘤細(xì)胞系(例如人類肺癌細(xì)胞系A(chǔ)T-12)后觀察其腫瘤抑制情形。結(jié)果顯示經(jīng)過分離及純化步驟，柴胡內(nèi)酯、異柴胡內(nèi)酯之類似物及其衍生物作用于抑制紫杉醇抗藥性腫瘤細(xì)胞系的端粒酶活性的有效濃度(約1.2微克/毫升)遠(yuǎn)小于南柴胡丙酮萃取物的有效濃度(約60微克/毫升)，顯示柴胡內(nèi)酯、異柴胡內(nèi)酯以及柴胡內(nèi)酯相關(guān)類似物及其衍生物是南柴胡中最主要的腫瘤抑制活性成份，而且，生藥型態(tài)的南柴胡經(jīng)過本發(fā)明的萃取方法分離后，其南柴胡萃取物的腫瘤抑制效果更為顯著。
因此，從南柴胡萃取物(尤指南柴胡丙酮粗抽取物、柴胡內(nèi)酯、異柴胡內(nèi)酯以及柴胡內(nèi)酯相關(guān)類似物及其衍生物)的藥物作用機(jī)轉(zhuǎn)看來，南柴胡萃取物與紫杉醇類似，是一種用于抑制有絲分裂的微小管穩(wěn)定劑(Microtubule Stabilizing Agent)，然而兩者對于β微小管的作用部位可能不相同。
綜上，從南柴胡中分離出來的新穎化合物“柴胡內(nèi)酯、異柴胡內(nèi)酯、柴胡內(nèi)酯類似物及其衍生物”，在新藥開發(fā)上極可能成為新的抗癌藥物來源。
以下的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明的觀點(diǎn)，但并非以任何觀點(diǎn)限制本發(fā)明的范疇。
現(xiàn)即配合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明(1)具腫瘤抑制功效的南柴胡萃取物，(2)該萃取物所含有的活性成份，(3)從南柴胡生藥里萃取出南柴胡萃取物，以及(4)南柴胡萃取物中各活性成分的萃取方法，藉以治療人類肝癌(Hepatoma)、卵巢癌(Ovarian Cancer)、肺癌(LungCancer)、惡性腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤(Malignant Glioblastoma)及大腸直腸癌(Colorectal Carcinoma)等癌細(xì)胞各較佳實(shí)施例，惟下述各實(shí)施例僅用于顯示本發(fā)明的較佳實(shí)施態(tài)樣，并非用以限制本發(fā)明的可實(shí)施范疇，且以南柴胡萃取物及其活性成份欲制作成藥物上可接受的鹽、酯、酮及類似物時(shí)，其藥物組成、劑型及合成方式均得按實(shí)際實(shí)施情況進(jìn)行調(diào)整。
實(shí)施例1南柴胡腫瘤抑制(Antineoplastic)活性成分的萃取方法本發(fā)明所用的南柴胡為全綠單葉互生，呈復(fù)傘花序的狹葉柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd，我國稱為南柴胡)。經(jīng)過干燥及粉碎處理后，于室溫下將6公斤的南柴胡粉末浸泡于20公升丙酮，攪拌四小時(shí)濃縮過濾并且反復(fù)粗抽四次，即取得南柴胡丙酮粗抽取物(簡稱為BS-A)，將殘?jiān)约状汲槿〉玫侥喜窈状驾腿∥?簡稱為BS-M層)，再以水抽取殘?jiān)缘玫侥喜窈畬虞腿∥?簡稱為BS-W層)。之后，將南柴胡丙酮粗抽取物以95％甲醇水溶液溶解，并以正己烷(n-Hexane)萃取三次后，分離出南柴胡正己烷層(簡稱為BS-H)以及南柴胡甲醇水層，并且加入蒸餾水500毫升脫除南柴胡甲醇水層中的甲醇。接著，在脫除甲醇的南柴胡甲醇水層中加入氯仿(Chloroform)進(jìn)行萃取，經(jīng)過三次氯仿萃取后分離氯仿層及水層并且合并濃縮，俾制得南柴胡氯仿萃取物(簡稱為BS-C)。
將南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A)、南柴胡甲醇粗抽取物(BS-M)、南柴胡正己烷萃取物(BS-H)、南柴胡氯仿萃取物(BS-C)及南柴胡水層萃取物(BS-W)分別以MTT Assay測試不同萃取層所收集的萃取物對于肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的藥物毒性，結(jié)果如圖1所示，在各種南柴胡萃取層中，以南柴胡丙酮萃取物的腫瘤抑制效果最佳，且按照粗抽物的萃取流程「丙酮粗萃取物→甲醇水萃取物→氯仿萃取物」均含有腫瘤抑制成份。然為從南柴胡萃取物中分離出具有腫瘤抑制效果的成份，本發(fā)明于是進(jìn)一步以層析法(Chromatography)洗提分離該南柴胡氯仿萃取物。
以硅膠層析法(Silica Gel Chromatography)將約100克南柴胡氯仿萃取物分別以5％甲醇/二氯甲烷、10％甲醇/二氯甲烷、20％甲醇/二氯甲烷以及甲醇洗提(Elution)分離，得到5％甲醇/二氯甲烷層萃取物27.5克、10％甲醇/二氯甲烷層萃取物14.04克、20％甲醇/二氯甲烷層10.96克以及甲醇層萃取物7.25克，其中，腫瘤抑制成份主要保留在5％甲醇/二氯甲烷層萃取物。而后，以例如硅膠柱層析法、或制備型高效能液相層析法(preperative High Performance Liquid Chromatography，HPLC)、或中壓液相層析法(Medium Pressure Liquid Chromatography)或Lobar等層析技術(shù)分離5％甲醇/二氯甲烷萃取物，并且濃縮收集出具腫瘤抑制效果的第三成份、第八成份、第十四成份及第十五成份。
實(shí)施例2南柴胡腫瘤抑制活性成分的結(jié)構(gòu)按上述萃取方法從南柴胡丙酮萃取物分離出來的第三成份、第八成份、第十四成份及第十五成份各主要代表物，分別以質(zhì)譜(MassSpectrum)及核磁共振圖譜(Nuclear Magnetic Resonance Spectrum，NMR)定義各化合物的分子量及其結(jié)構(gòu)后，其結(jié)果如同下表所示表1南柴胡丙酮萃取物中具腫瘤抑制功效的分離化合物
經(jīng)過分子結(jié)構(gòu)整合歸納發(fā)現(xiàn)，對于人類肝癌、卵巢癌、肺癌、惡性腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤及大腸直腸癌的腫瘤細(xì)胞系具抑制效果的南柴胡萃取物，其化合物碳骨架均為以γ-丁內(nèi)酯為核心，且在碳2(5)處呈Z構(gòu)型或E構(gòu)型的雜環(huán)化合物(Heterocyclic Compounds)。而且，由細(xì)胞毒性測試結(jié)果可知，第三成份及第八成份對于肺癌細(xì)胞系的毒殺效果優(yōu)于其它成份，故將第三及第八成份結(jié)晶以后，以氫核磁共振圖譜(1H-NMR)及碳13核磁共振圖譜(13C-NMR)進(jìn)一步分析此兩洗提成份的分子結(jié)構(gòu)，而得到分別如通式(I)及通式(II)所示，命名為“柴胡內(nèi)酯(Chaihulactone)”及“異柴胡內(nèi)酯(Isochaihulactone)”的新穎化合物 式(I)
其中，R代表烷氧基。
式(II)其中，R代表氫原子或烷氧基。
(白色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)137-138℃，[α]D25-29.0°(c0.5，CHCl3)；IR(KBr)vmaxcm-11745，1635，1581，1335，1153；UV(CHCl3)λmaxnm(logε)247(4.08)，298(4.17)，327(4.08))再而，若進(jìn)一步分析其它具腫瘤抑制功效的化合物結(jié)構(gòu)，例如前述第一成份、第二成份、第十一成份及第十五成份的代表分子以及相關(guān)類似物或其衍生物，并與現(xiàn)行藥物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。其比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，南柴胡萃取物中具有腫瘤毒殺效果的醫(yī)藥組成物，均為含有γ-丁內(nèi)酯(γ-Butyrolactone)核心結(jié)構(gòu)，且碳-2(5)處呈Z構(gòu)型或E構(gòu)型的雜環(huán)化合物，或其藥物上可接受的鹽、酯、酮及其衍生物。該雜環(huán)化合物的通式為如式(I)所示 式(I)其中，X＝N，O，S，Se；A，B分別選自具有下式的取代基 其中，R1，R2，R3，R4，R5分別選自氫原子、鹵原子、羥基、硫氫基、胺基、烷氧基及硝基；且該取代基進(jìn)一步包含以下的取代基結(jié)構(gòu)
而且，由細(xì)胞毒性測試結(jié)果可知，第八成份異柴胡內(nèi)酯對于肺癌細(xì)胞系的毒殺效果明顯優(yōu)于其它柴胡內(nèi)酯類似物，因此，本發(fā)明所包含的下列各實(shí)施例，均是以南柴胡丙酮萃取物(BS-A)及第八成份的異柴胡內(nèi)酯(BS-(8))作為評估南柴胡腫瘤抑制成份“γ-丁內(nèi)酯核心，碳2(5)呈Z構(gòu)型的雜環(huán)化合物”，以及新穎化合物“柴胡內(nèi)酯、異柴胡內(nèi)酯、柴胡內(nèi)酯類似物及其衍生物”功效的指針物質(zhì)。
實(shí)施例3南柴胡萃取物對于細(xì)胞增生(Cell Proliferation)的影響將從南柴胡生藥中萃得的南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A)、南柴胡甲醇粗抽取物(BS-M)、南柴胡水層粗抽取物(BS-W)以及分離自該BS-A萃取物的第八成份(BS-(8))分別加至人類肝癌細(xì)胞系、卵巢癌細(xì)胞系、肺癌細(xì)胞系、惡性腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及大腸直腸癌細(xì)胞系培養(yǎng)基中，觀察加藥7日間各腫瘤細(xì)胞系間的抑制情形。本實(shí)施例以肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及大腸直腸癌細(xì)胞系HT-29為例，當(dāng)各萃取物投予三日后，加入60毫克南柴胡丙酮粗抽取物的腫瘤細(xì)胞數(shù)(Tumor Cell Counts)降低程度與600毫克的南柴胡甲醇粗抽取物所降低的腫瘤細(xì)胞數(shù)相似，顯示腫瘤抑制成份在BS-M層的含量遠(yuǎn)較BS-A層為低，南柴胡中具腫瘤抑制功效的物質(zhì)仍然主要保留于南柴胡丙酮萃取物中。
再而，若比較添加各南柴胡萃取物前后，人類肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的細(xì)胞增生變化，其結(jié)果可以利用流式細(xì)胞儀(Flow Cytometry)來進(jìn)行檢查。如圖2A至圖2D所示，橫軸代表與抗體接合的腫瘤細(xì)胞染色體對數(shù)，縱軸代表FITC螢光強(qiáng)度，則從各圖結(jié)果可清楚得知未加藥前，肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549主要分布在G0/G1期，但是，當(dāng)腫瘤細(xì)胞加入南柴胡丙酮萃取物(BS-A)以及南柴胡甲醇萃取物(BS-M)以后，腫瘤細(xì)胞會明顯地停滯在G2/M期，尤其更以南柴胡丙酮萃取物的功效最為顯著。另一方面，從流式細(xì)胞儀的PI染色結(jié)果，亦發(fā)現(xiàn)加入南柴胡萃取物后，G0/G1期的染色體數(shù)量減少，但G2/M期的染色體(2N，4N等)數(shù)量卻大為提高，而且該現(xiàn)象在人類肝癌細(xì)胞系、卵巢癌細(xì)胞系、肺癌細(xì)胞系及大腸直腸癌細(xì)胞系中均呈現(xiàn)相似結(jié)果，顯示南柴胡萃取物的腫瘤抑制機(jī)轉(zhuǎn)極可能與G2/M停滯(G2/M Arrest)有關(guān)。
實(shí)施例4南柴胡萃取物與細(xì)胞凋亡(Apoptosis)為進(jìn)一步證實(shí)南柴胡萃取物是否具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生細(xì)胞凋零(Apoptosis)的功效，本發(fā)明較佳實(shí)施例于是以流式細(xì)胞儀(FlowCytometry)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription PolymeraseChain Reaction，RT-PCR)及西方點(diǎn)墨法(Western Blot)一同檢視腫瘤細(xì)胞系分別加入南柴胡萃取物第八成份以及南柴胡丙酮萃取物以后，腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞周期以及調(diào)控蛋白p21及p53上的變化。
以肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為例，將未加藥的A549細(xì)胞系、加入20M異柴胡內(nèi)酯的A549細(xì)胞系以及加入60微克/毫升南柴胡丙酮萃取物的A549細(xì)胞系連續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)之后，利用流式細(xì)胞儀(Flow Cytometry)來檢查Annexin V-FLOUS與PI之間的染色結(jié)果。其中，橫軸表示與Annexin V-FLOUS抗體接合的腫瘤細(xì)胞螢光強(qiáng)度，而縱軸代表與PI抗體接合的腫瘤細(xì)胞螢光強(qiáng)度，結(jié)果由圖3A至3C可知，控制組(指未加藥的A549腫瘤細(xì)胞系)培養(yǎng)48小時(shí)后，與Annexin V結(jié)合(顯示細(xì)胞膜外翻，細(xì)胞凋亡的指針)的細(xì)胞數(shù)量僅占3.8％，然而于A549肺癌細(xì)胞系中加入異柴胡內(nèi)酯或南柴胡丙酮粗萃取物后再培養(yǎng)48小時(shí)，則發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與Annexin V結(jié)合的腫瘤細(xì)胞量大幅增加至32.7％，顯示腫瘤細(xì)胞在南柴胡萃取物的作用下能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡(Apoptosis)產(chǎn)生。
因此，從圖4的細(xì)胞周期以及圖5西方點(diǎn)墨法結(jié)果可知，南柴胡丙酮粗抽取物、以及南柴胡萃取物中的異柴胡內(nèi)酯對于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期作用機(jī)轉(zhuǎn)與紫杉醇類似，均在有絲分裂成熟階段(G2/M期)停滯住，而且，南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A)以及柴胡內(nèi)酯相似物與其衍生物(BS-3或BS-8)會大幅提高腫瘤抑制蛋白(Tumor Suppressor)p21及p53產(chǎn)量來阻礙Cyclin D及Cyclin E，藉此阻擋細(xì)胞進(jìn)入G0/G1期而使腫瘤細(xì)胞停滯于G2/M期。
故，由上述結(jié)果可知，南柴胡丙酮萃取物以及包含異柴胡內(nèi)酯的柴胡內(nèi)酯類似物及其衍生物具有促使腫瘤細(xì)胞停滯在G2/M期，俾誘發(fā)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞凋亡(Apoptosis)的功效，且上述現(xiàn)象在人類肝癌、肺癌、卵巢癌、惡性腦瘤以及大腸直腸癌細(xì)胞系中均會發(fā)生，顯示南柴胡萃取物具有抑制人類肝癌、卵巢癌、肺癌、惡性腦瘤及大腸直腸癌增生的功效，且其作用機(jī)轉(zhuǎn)可能與紫杉醇的作用機(jī)轉(zhuǎn)類似，為一種G2/M停滯劑。
若再以西方點(diǎn)墨法來檢測腫瘤細(xì)胞系投予南柴胡丙酮萃取物及南柴胡萃取物第八成份以后，細(xì)胞骨架(Cytoskeleton)的變化。由圖6所示，肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549加入南柴胡丙酮萃取物12小時(shí)、24小時(shí)及48小時(shí)期間，細(xì)胞骨架中的第一型α-微小管無明顯變化，但在第五型β-微小管卻逐漸減少，而且，比較加入南柴胡萃取物前后，β-微小管是否出現(xiàn)聚集狀態(tài)，由圖7結(jié)果亦可得知，南柴胡萃取物第八成份加入以后，溶解型(Soluble form，指未聚合狀態(tài)的β-微小管，圖中以S表示)的蛋白帶消失，而顆粒型(Particular form，指聚合以后的β-微小管，圖中以P表示)的蛋白帶增加，顯示南柴胡萃取物與紫杉醇相似，均具有致使β-微小管聚集的功能。
并且，藉由共軛交顯微鏡(Confocal Microscope)進(jìn)一步檢視螢光標(biāo)定微小管抗體接合到微小管上以后，細(xì)胞骨架內(nèi)紡錘絲的移動(dòng)情形。其結(jié)果圖8所示，當(dāng)腫瘤細(xì)胞加入南柴胡萃取物以后，β-微小管產(chǎn)生聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致紡錘絲持續(xù)拉長，進(jìn)而阻擋2倍數(shù)或多倍數(shù)染色體向細(xì)胞兩極移動(dòng)，使腫瘤細(xì)胞無法一分為二。如此，腫瘤細(xì)胞不僅無法有效地執(zhí)行有絲分裂，甚至隨著2N，4N染色體不斷累積而導(dǎo)致無效細(xì)胞(Junk Cell)細(xì)胞凋亡。
實(shí)施例5南柴胡萃取物對于紫杉醇抗藥性腫瘤細(xì)胞系(TaxolResistanee Tumor Cell Line)的影響由于現(xiàn)行藥物對于化療后期具紫杉醇抗藥性的腫瘤細(xì)胞并無令人滿意的毒殺效果，而且從上述流式細(xì)胞儀(Flow Cytometry)結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，南柴胡丙酮粗抽取物以及異柴胡內(nèi)酯類似物及其衍生物對于人類肝癌、卵巢癌、惡性腦癌、肺癌及大腸直腸癌的腫瘤抑制機(jī)轉(zhuǎn)與紫杉醇近似，因此，本發(fā)明冀以南柴胡萃取物作為新藥篩選來源，進(jìn)一步檢視南柴胡萃取物對于紫杉醇抗藥性細(xì)胞系的毒殺效果。
以下，本發(fā)明實(shí)施例將以人類肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549繼帶培養(yǎng)所產(chǎn)生的紫杉醇抗藥性肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549-T12為例，來試驗(yàn)?zāi)喜窈腿∥?BS-A)、南柴胡萃取物第八成份及第十五成份(BS-8，BS-15)，各代表柴胡內(nèi)酯及與柴胡內(nèi)酯相關(guān)的類似衍生物)對于A549-T12細(xì)胞系的影響，并運(yùn)用流式細(xì)胞儀、藥物毒性試驗(yàn)以及組織切片來評估南柴胡萃取物對于紫杉醇抗藥性腫瘤細(xì)胞系的毒殺效果。
如圖9A至9D所示，比較控制組(未加藥的A549-T12)以及加入100nM紫杉醇、30微克/毫升BS-A、8微克/毫升BS-8及8微克/毫升BS-15的A549-T12在流式細(xì)胞儀下，Annexin V-FLOUS與PI之間的變化。的，橫軸表示與Annexin V-FLOUS抗體接合的腫瘤細(xì)胞螢光強(qiáng)度，而縱軸代表與PI抗體接合的腫瘤細(xì)胞螢光強(qiáng)度，結(jié)果顯示控制組(指未加藥的紫杉醇抗藥性腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549-T12)培養(yǎng)48小時(shí)后，與Annexin V結(jié)合的細(xì)胞數(shù)量僅占6.8％，然于A549-T12細(xì)胞系中分別加入異柴胡內(nèi)酯、柴胡內(nèi)酯衍生物或南柴胡丙酮粗抽取物后再培養(yǎng)48小時(shí)后，則發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與Annexin V結(jié)合的腫瘤細(xì)胞量大幅增加30.6％、23.1％及24％，顯示異柴胡內(nèi)酯對于誘發(fā)紫杉醇抗藥性細(xì)胞系產(chǎn)生細(xì)胞凋亡的能力較其它柴胡內(nèi)酯衍生物更佳，而且，南柴胡丙酮萃取物經(jīng)過純化后，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞凋零的效果較粗萃取物狀態(tài)更為顯著。
再者，從細(xì)胞毒性測試結(jié)果可知，當(dāng)添加南柴胡丙酮粗抽取物(BS-A)、柴胡內(nèi)酯類似物(BS-8)以及柴胡內(nèi)酯衍生物(BS-15)至紫杉醇抗藥性肺癌細(xì)胞系48小時(shí)以后，如圖10A至10C所示，腫瘤細(xì)胞存活率均明顯降低，且經(jīng)過純化取得的柴胡內(nèi)酯類似物毒殺腫瘤細(xì)胞的效果，從細(xì)胞或動(dòng)物的有效半數(shù)致死量(IC50或ED50)上來看，皆遠(yuǎn)小于丙酮萃取物。顯示包含柴胡內(nèi)酯、異柴胡內(nèi)酯在內(nèi)的柴胡內(nèi)酯類似物及其衍生物，為南柴胡丙酮粗抽取物里抑制腫瘤成份的主要活性物質(zhì)，而且，經(jīng)過分離以后的南柴胡萃取物只需要極低的劑量(1.5微克/毫升)便能引起腫瘤細(xì)胞凋亡。
實(shí)施例6南柴胡萃取物在生物體內(nèi)(in vivo)抑癌效果評估如以組織切片進(jìn)一步檢視南柴胡萃取物對于生物體內(nèi)(in vivo)A549細(xì)胞系及紫杉醇抗藥性腫瘤細(xì)胞(A549-T12)的抑制情形。如圖11A、圖11B以及圖12A和圖12B所示，從放大100倍的蘇木紫與伊紅染色法(Haematoxylin and Eosin Stain，H&E Stain)組織切片結(jié)果比較使用BS-A治療前后腫瘤組織的壞死情形，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，投予動(dòng)物每公斤300毫克以上的BS-A以后，腫瘤細(xì)胞于細(xì)胞核部分發(fā)生裂解，淋巴球浸潤且產(chǎn)生大片腫瘤細(xì)胞出血性壞死；從圖12B更顯示經(jīng)過BS-A治療以后，原本密集分布的腫瘤細(xì)胞只剩下數(shù)顆腫瘤細(xì)胞。同時(shí)，從圖13A皮下腫瘤組織(A549細(xì)胞系)比較圖亦顯示，經(jīng)過每公斤500毫克劑量的南柴胡萃取物投予，動(dòng)物皮下的腫瘤體積明顯縮小77％(腫瘤直徑由13微米縮小為3微米)，且從相對腫瘤體積來看，如圖13B所示，以南柴胡萃取物治療腫瘤后，腫瘤增大的速度亦會明顯趨緩。因此，從組織切片及皮下腫瘤組織可以得知，南柴胡萃取物對于生物體內(nèi)的腫瘤組織具有顯著的毒殺效果，并能控制腫瘤體積的擴(kuò)張速度。
實(shí)施例7南柴胡萃取物在細(xì)胞毒性及動(dòng)物毒性方面的影響從本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果偵知，南柴胡丙酮粗抽取物(60微克/毫升)對于人類肝癌、卵巢癌、肺癌、惡性腦瘤以及大腸直腸癌細(xì)胞系具顯著抑制功效，且在組織切片及皮下腫瘤試驗(yàn)中，亦證實(shí)南柴胡萃取物可以毒殺生物體(in vivo)內(nèi)的腫瘤組織。故為進(jìn)一步測量南柴胡萃取物在執(zhí)行腫瘤毒殺效果的同時(shí)，對于其它正常細(xì)胞或器官是否具有傷害性，以評估南柴胡萃取物作為新藥來源的可能，本發(fā)明以清醒鼠為例來顯示投予每公斤400微克的南柴胡萃取物以后，鼠體各器官生化指針酵素的變化。
如圖14及圖15所示，于活體狀態(tài)下靜脈投予每公斤400微克劑量的南柴胡丙酮萃取物至清醒鼠體內(nèi)72小時(shí)以后，在胰臟功能指針脂肪酶(Lipase)、淀粉酶(Amylase)，肝臟功能指針酵素葡萄糖氧化酶(GOT)、葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)化酶(GPT)，心臟功能指針酵素乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase，LDH)、肌酸酐激酶(Creatinine Kinase，CK)，腎臟功能指針肌酸酐(Creatinine)、血清尿素氮(Blood Urea Nitrogen，BUN)等各類生化值，以及心搏、舒張壓、收縮壓、血小板以及白血球方面，均無異于未投藥的控制組，顯示南柴胡萃取物的投予并不會對生物體內(nèi)的消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、造血機(jī)能及生殖細(xì)胞造成毒害。而且，從圖15的肝、腎組織切片亦能左證連續(xù)五日腹腔內(nèi)投予南柴胡萃取物每公斤300微克以后，正常肝細(xì)胞及腎細(xì)胞并不會受到破壞。另一方面，由于南柴胡丙酮萃取物或異柴胡內(nèi)酯對于活體動(dòng)物的腫瘤細(xì)胞端粒酶(Telomerase)的活性具明顯抑制功效，因此，綜合上述結(jié)果可以清楚得知，南柴胡萃取物投予生物體后并不會影響正常細(xì)胞功能或器官運(yùn)作，但對包含紫杉醇抗藥性細(xì)胞系在內(nèi)的腫瘤細(xì)胞卻具有高度專一性的毒殺效果，故，以南柴胡萃取物或其藥物上可接受的鹽、酯、酮及其衍生物作為治療藥物，可以有效解決現(xiàn)行藥物對于紫杉醇抗藥性腫瘤細(xì)胞毒殺效果不彰的問題，而為化療后期紫杉醇逐漸失效的患者提供一種新的抗腫瘤藥劑來源。
結(jié)論綜上而言，以本發(fā)明萃取方法分離取得的南柴胡萃取物，為以包含如通式(I)，具γ-丁內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，碳2(5)呈Z構(gòu)型或E構(gòu)型的雜環(huán)化合物的南柴胡丙酮萃取物，以及分離自該南柴胡丙酮萃取物，而以異柴胡內(nèi)酯為代表的柴胡內(nèi)酯類似物與其衍生物，或其藥物上可接受的鹽、酯、酮與其衍生物作為治療人類肝癌、卵巢癌、肺癌、惡性腦瘤及大腸直腸癌的腫瘤抑制活性成份。
式(I)其中，X＝N，O，S，Se；A，B分別選自具有下式之取代基 其中，R1，R2，R3，R4，R5分別選自氫原子、鹵原子、羥基、硫氫基、胺基、烷氧基及硝基。
惟從本發(fā)明的較佳實(shí)施例可知，南柴胡萃取物經(jīng)過分離、純化得到的異柴胡內(nèi)酯較丙酮粗抽取物具有更佳的腫瘤抑制效果，而且，投予南柴胡萃取物以后，不論在一般腫瘤細(xì)胞或紫杉醇抗藥性腫瘤細(xì)胞，其抑制腫瘤端粒酶活性、縮小相對腫瘤體積、抑制腫瘤細(xì)胞增生以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋零方面均具有顯著功效，并在不影響生物體正常消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、造血系統(tǒng)以及生殖泌尿系統(tǒng)的狀態(tài)下，高度專一性地毒殺腫瘤細(xì)胞。
再者，由細(xì)胞調(diào)控的觀點(diǎn)來看，南柴胡丙酮萃取物為一種促使細(xì)胞骨架的β-微小管聚集，使拉長的紡錘絲無法向兩極牽引而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的微小管穩(wěn)定劑(Microtubule Stabilizing Agent)，且其作用機(jī)轉(zhuǎn)與紫杉醇類似，可以促使腫瘤細(xì)胞的有絲分裂停滯在G2/M期，而達(dá)到控制腫瘤細(xì)胞增生的功效。
權(quán)利要求
1.一種從南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium)中分離出用于對抗細(xì)胞細(xì)胞增生性疾病的活性成份的南柴胡萃取方法，其特征在于，該萃取方法包括抽提南柴胡以取得木脂素混合物，其中該木脂素混合物包含有至少一種可抑制腫瘤增生的活性成份；以及分離該抑制腫瘤增生的活性成份，以得到單一類型的南柴胡萃取物。
2.如權(quán)利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，從南柴胡中抽提出該木脂素混合物的步驟包括以極性互異的第一、第二、第三及第四溶液來執(zhí)行以下步驟以第一溶液溶抽粉碎后的南柴胡，分離取得南柴胡第一萃取物及殘?jiān)?；以第二溶液溶抽殘?jiān)?，分離取得南柴胡第二萃取物；以第三溶液抽提該南柴胡第一萃取物，并且脫除抽提水層中的醇類；以及以第四溶液抽提該脫除醇類的抽提水層，并予以濃縮。
3.如權(quán)利要求2所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該第一溶液為丙酮。
4.如權(quán)利要求2所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該第二溶液為甲醇。
5.如權(quán)利要求2所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該第三溶液為95％甲醇水溶液。
6.如權(quán)利要求2所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該第四溶液為氯仿。
7.如權(quán)利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該方法還包括以層析法分離該腫瘤抑制增生的活性成份。
8.如權(quán)利要求7所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該層析法為硅膠層析法。
9.如權(quán)利要求7所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該層析法為制備型高效能液相層析法。
10.如權(quán)利要求7所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該層析法為中壓液相層析法。
11.如權(quán)利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該方法還包括以質(zhì)譜及核磁共振圖譜鑒定各單一類型南柴胡萃取物的分子量及其結(jié)構(gòu)。
12.如權(quán)利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該細(xì)胞增生性疾病為人類肝癌。
13.如權(quán)利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該細(xì)胞增生性疾病為人類卵巢癌。
14.如權(quán)利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該細(xì)胞增生性疾病為人類惡性腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤。
15.如權(quán)利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該細(xì)胞增生性疾病為人類肺癌。
16.如權(quán)利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該細(xì)胞增生性疾病為人類大腸直腸癌。
17.如權(quán)利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該細(xì)胞增生性疾病對于紫杉類治療劑具抗藥性。
18.如權(quán)利要求17所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該紫杉類治療劑為紫杉醇。
19.如權(quán)利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該抑制腫瘤增生的活性成份包括至少一種具以下通式的雜環(huán)化合物，或包含有如下式的藥物上可接受的鹽、酯、酮或其衍生物 其中，X＝N，O，S，Se；A，B分別選自具有下式的取代基 其中，R1，R2，R3，R4，R5分別選自氫原子、鹵原子、羥基、硫氫基、胺基、烷氧基及硝基。
20.如權(quán)利要求19所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該A，B取代基選自以下的取代基結(jié)構(gòu) 以及
21.如權(quán)利要求19所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該雜環(huán)化合物為在碳2(5)處呈Z構(gòu)型。
22.如權(quán)利要求19所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該雜環(huán)化合物為在碳2(5)處呈E構(gòu)型。
23.如權(quán)利要求19所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該雜環(huán)化合物為具有以下通式命名的柴胡內(nèi)酯 其中，R代表烷氧基。
24.如權(quán)利要求19所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該雜環(huán)化合物具有以下通式命名的異柴胡內(nèi)酯 其中，R代表氫原子、烷氧基或芳基。
25.如權(quán)利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該抑制腫瘤增生的活性成份為一種調(diào)控細(xì)胞周期的G2/M停滯劑。
26.如權(quán)利要求1所述的南柴胡萃取方法，其特征在于，該抑制腫瘤增生的活性成份為一種促使細(xì)胞骨架的β-微小管聚集的微小管穩(wěn)定劑。
27.一種經(jīng)權(quán)利要求1所述的方法萃取得到的萃取物。
全文摘要
一種萃取自南柴胡，用于治療細(xì)胞增生性疾病的柴胡萃取物及其萃取方法，該柴胡萃取物的活性成分至少包括以γ－丁內(nèi)酯為核心，碳2(5)位置呈Z構(gòu)型或E構(gòu)型的雜環(huán)化合物，以及包含于該雜環(huán)化合物中的新的“柴胡內(nèi)酯、異柴胡內(nèi)酯、柴胡內(nèi)酯類似物及其衍生物”，由藥物毒性試驗(yàn)、細(xì)胞特性、動(dòng)物試驗(yàn)以及組織切片等結(jié)果可知，南柴胡中分離出來的萃取物對于肝癌、肺癌、卵巢癌、大腸直腸癌或惡性腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤等癌細(xì)胞具抑制效果，并且能夠在不損傷正常細(xì)胞的情況下，高度專一性地毒殺化療后期對于紫杉類藥物具抗藥性的腫瘤細(xì)胞，而作為新一代腫瘤抑制劑的藥物篩選來源。
文檔編號C07D333/32GK1580043SQ0314965
公開日2005年2月16日 申請日期2003年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月4日
發(fā)明者林欣榮, 韓鴻志 申請人:財(cái)團(tuán)法人佛教慈濟(jì)綜合醫(yī)院