專利名稱：金葡菌毒力因子調(diào)控蛋白的抗原表位及其模擬表位和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗原表位及模擬表位，具體涉及金黃色葡萄球菌(金葡菌)毒力因子調(diào)控蛋白的兩個抗原表位及其模擬表位。本發(fā)明還涉及與這些表位氨基酸序列一致的多肽在制備抗金葡菌感染藥物或疫苗等方面中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
金葡菌是一類常見的革蘭氏陽性致病菌，是引起燒傷及戰(zhàn)傷感染、肺炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、中毒性休克等致命性疾病的主要微生物之一。每年僅醫(yī)院內(nèi)感染金葡菌的人數(shù)就超過數(shù)百萬。目前臨床上對金葡菌的治療多采用聯(lián)合使用抗生素的辦法，但是效果并不理想。由于金葡菌極易產(chǎn)生耐藥性且無好的解決方法，常用的許多抗生素對之無效，控制金葡菌感染是臨床醫(yī)學(xué)殛待解決的問題之一。
金葡菌的主要致病物質(zhì)是毒素，包括溶血毒素、殺白細(xì)胞素、腸毒素等。最新研究表明，金葡菌這些毒力因子的合成是受一種可調(diào)節(jié)RNA分子，及RNAIII控制的。RNAIII激活毒力因子的基因轉(zhuǎn)錄，通過堿基互補(bǔ)調(diào)節(jié)毒力因子的翻譯。在細(xì)菌生長的對數(shù)早期其RNAIII水平低，但到對數(shù)晚期RNAIII水平會增加40倍，而RNAIII的水平是由金葡菌自身分泌的蛋白RAP(RNAIIIactivating protein)即RNAIII激活蛋白調(diào)節(jié)的，故因子RAP又稱為金葡菌毒力刺激因子。金葡菌持續(xù)分泌RAP，在RAP達(dá)到一定濃度后才有激活毒力因子產(chǎn)生的作用。沒有RAP產(chǎn)生的金葡菌本身并不致病。最新研究發(fā)現(xiàn)，RAP激活RNAIII的轉(zhuǎn)錄是通過一個21KD的蛋白TRAP(Target of RNAIIIactivating protein)介導(dǎo)的，當(dāng)TRAP蛋白的編碼基因被突變失活后，RAP不能夠激活RNAIII的轉(zhuǎn)錄。TRAP由167個氨基酸組成，具有His激酶活性。TRAP蛋白在金葡菌生長的早期開始磷酸化，在對數(shù)生長中期達(dá)到最大水平。在RAP作用后，通過自身磷酸化來進(jìn)行信號傳導(dǎo)，從而介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)RNAIII水平上升，加速金葡菌外毒素的分泌(Naomi B，et al，J.Biol.Chem 2001，2762658-2667)。由此可見TRAP蛋白在金葡菌的毒素表達(dá)調(diào)控也起著關(guān)鍵性的作用。2001的研究發(fā)現(xiàn)TRAP的抗體可以有效的降低金葡菌外毒素的分泌(Oleny V，et al.Peptides 2001，221621-1627)。
抗原表位作為免疫細(xì)胞識別的靶結(jié)構(gòu)和激發(fā)特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)，對于免疫反應(yīng)的相關(guān)研究具有重要意義。抗原缺失突變、合成肽段掃描(PEPSCAN)、X射線晶體衍射等技術(shù)的應(yīng)用，使“抗原表位”的確定成為可能，但這些方法費(fèi)用高昂，需耗費(fèi)大量人力、物力，而且不適于復(fù)雜表位的研究，因而其應(yīng)用受到限制?！澳M表位”(mimotope)這一概念的出現(xiàn)，不僅為抗原表位的分析提供了線索，也為疫苗研究的發(fā)展開辟了一條新的思路。模擬表位(mimotope)，通常指能夠模擬抗原表位的多肽結(jié)構(gòu)，它具有與天然抗原相似的反應(yīng)原性，與適當(dāng)?shù)妮d體偶聯(lián)后，還可能具有相似的免疫原性，(但在天然抗原中可能并無與之相同或相似的序列或空間結(jié)構(gòu))。對于一些難以獲得或尚不確定的抗原，人們很難甚至無法確定其抗原表位，使相關(guān)的研究難以進(jìn)行。而通過獲得“模擬表位”這一徑，便有可能解決上述問題。不僅為抗原表位的分析提供了線索，也為疫苗研究的發(fā)展開辟了新思路，尤其是推動了構(gòu)象型表位和非蛋白抗原表位的研究。
推動模擬表位研究的一項關(guān)鍵技術(shù)，是1985年由Dr.Smith建立并發(fā)展的噬菌體展示技術(shù)。噬菌體展示肽庫的構(gòu)建是運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)，將隨機(jī)排列的外源肽(通常6～15個氨基酸殘基組成)展示在噬菌體表面，構(gòu)成多樣性為107以上的隨機(jī)肽庫。通過親和純化的生物淘選過程，從噬菌體肽庫中篩選出靶分子(如單克隆抗體、多克隆抗體)的結(jié)合肽，將結(jié)合肽與天然抗原進(jìn)行比較，其中有的與天然抗原表位高度同源，有的與天然抗原完全不同，但都具有與天然抗原相似的抗原性和免疫原性，這些結(jié)合肽便被稱為“模擬表位”。與分析抗原表位的傳統(tǒng)方法相比，噬菌體展示技術(shù)具有很強(qiáng)的優(yōu)勢，不僅簡便、快捷，而且應(yīng)用范圍廣泛，適于構(gòu)象型表位、非蛋白抗原表位以及尚不明確的抗原研究(Zhong G，et al.J Biol Chem 1994，26924183-24188；Mottic etal.Gene 1994，146191-198；Rodriguez L，et al.J Gen Virol 1999，80(Pt3)727-738)。
與單克隆抗體相比，以多克隆抗體或抗血清為靶標(biāo)的篩選過程，難度大，但有明顯的優(yōu)勢。表現(xiàn)在首先，靶標(biāo)容易獲得，較制備單克隆抗體時間短、成本低、操作簡單；其次，可獲得多個抗原表位的模擬表位，篩選效率高，有利于制備具有強(qiáng)免疫原性的復(fù)合疫苗。本實驗將抗血清進(jìn)行了免疫親和層析純化，去除了非特異抗體，以獲得特異性高的篩選分子，有利于篩選到特異的噬菌體克隆，減少非特異克隆的富集。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供金葡菌毒力因子調(diào)控蛋白TRAP(Target of RNAIIIactivating protein)的兩個抗原表位及其模擬表位。
本發(fā)明的另一目的是提供上述表位或與這些表位氨基酸序列一致的多肽在制備抗金葡菌感染藥物或疫苗等方面中的應(yīng)用。
為實現(xiàn)本發(fā)明的第一個目的，我們以TRAP多克隆抗體為靶標(biāo)，通過線性肽庫篩選獲得了兩組TRAP蛋白的抗原模擬表位，通過與TRAP蛋白序列比較，發(fā)現(xiàn)兩個家族的序列都可以在表達(dá)序列上找到一致序列，即TRAP蛋白本身的兩個抗原表位21-34位氨基酸序列和156-167位氨基酸序列。它們的氨基酸序列如下抗原表位1對應(yīng)于TRAP蛋白的21-34位氨基酸序列21 NPTHQLFQFSASDT 34抗原表位2對應(yīng)于TRAP蛋白的156-167位氨基酸序列
156 SYFERYLYPIKE 167本發(fā)明的金葡菌毒力因子調(diào)控蛋白TRAP的兩個抗原模擬表位是具有以下氨基酸序列結(jié)構(gòu)模式的多肽抗原模擬表位1XPXHHQHXTGFT抗原模擬表位2SWFDXXLYPXXX上述抗原表位和抗原模擬表位結(jié)構(gòu)中，大寫英文字母分別代表二十一種已知天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構(gòu)體的一種，即A代表丙氨酸殘基，R代表精氨酸殘基，N代表天冬酰胺殘基，D代表天冬氨酸殘基，Q代表谷氨酰胺殘基，E代表谷氨酸殘基，H代表組氨酸殘基，W代表色氨酸殘基，Y代表酪氨酸殘基，F(xiàn)代表苯丙氨酸殘基，T代表蘇氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，L代表亮氨酸殘基，G代表甘氨酸殘基，P代表脯氨酸殘基，V代表纈氨酸殘基，K代表賴氨酸殘基，M代表甲硫氨酸殘基，I代表異亮氨酸殘基，X代表二十一種已知天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構(gòu)體的任意一種。
上述表位中的有些氨基酸可以根據(jù)氨基酸的相似性進(jìn)行相互替代，如谷氨酰胺殘基(Q)，谷氨酸殘基(E)，天冬氨酸殘基(D)或天冬酰胺殘基(N)之間可以相互替代；色氨酸殘基(W)，酪氨酸殘基(Y)或苯丙氨酸殘基(F)之間可以相互替代；賴氨酸殘基(K)和精氨酸殘基(R)之間可以相互替代；絲氨酸殘基(S)和蘇氨酸殘基(T)之間可以相互替代；丙氨酸殘基(A)和甘氨酸殘基(G)之間可以相互替代；亮氨酸殘基(L)和甲硫氨酸殘基(M)之間可以相互替代。
本發(fā)明的小分子多肽可通過化學(xué)合成或用基因工程重組表達(dá)的方法制得。
實驗證明，具有上述結(jié)構(gòu)模式的多肽能夠與可以特異競爭TRAP與其多抗的結(jié)合，有效地抑制抗體的功能，與合適的載體耦聯(lián)后具有與TRAP相似的免疫原性。這就為抗金葡菌感染疫苗的研究打下良好的基礎(chǔ)，從而得以實現(xiàn)本發(fā)明的第二個目的。
傳統(tǒng)抗生素治療產(chǎn)生抗藥性的原因主要是用藥后細(xì)菌在生存壓力下產(chǎn)生分解抗生素中有效基團(tuán)的誘導(dǎo)酶。本發(fā)明利用的TRAP抗原表位及其模擬表位所對應(yīng)的多肽在不同的金葡菌菌株TRAP蛋白之間高度保守，并且可以刺激人體產(chǎn)生針對TRAP的抗體，抑制TRAP的活性，因此可以制備疫苗對抗金葡菌的感染，不殺滅細(xì)菌而使細(xì)菌的致病性喪失，適用于所有耐藥及非耐藥菌株，這就為根除一直困擾臨床的抗藥性金葡菌感染這一常見、多發(fā)且有致命性的疾病找到新的出路。


圖1為TRAP多抗親和純化電泳2為競爭ELISA方法檢測抗原模擬表位序列1噬菌體克隆競爭TRAP蛋白與抗體的結(jié)合圖本發(fā)明的抗原表位及其模擬表位為抗金葡菌感染疫苗方面的研究奠定了基礎(chǔ)，為治療金葡菌感染開辟了新的途徑，具有廣泛的應(yīng)用價值及廣闊的市場前景。
具體實施例方式
下面以抗原模擬表位1為實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
實施例1.TRAP蛋白多抗的制備及純化將純化的TRAP蛋白免疫家兔制備多克隆抗體。利用偶聯(lián)了TRAP蛋白的親和柱從多抗血清中分離抗TRAP的IgG。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明所純化的IgG純度＞90％，ELISA結(jié)果表明效價在1×105以上(見附圖1，圖中1表示低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，2表示純化后的TRAP多抗)。
實施例2.TRAP多抗抗原模擬表位的篩選首先用100μl純化的TRAP多抗IgG包被于酶聯(lián)板，置4℃過夜。經(jīng)過2％的明膠封閉1h后，加入噬菌體十二肽庫，室溫孵育1h，用TBST(50mmol/LTris-HCl，0.1％TWEEN20，pH7.5)洗滌非特異結(jié)合的噬菌體，再用0.2mmol/L甘氨酸-HCl pH2.2洗脫特異結(jié)合的噬菌體，洗脫液用1mmol/L Tris-HCl pH9.0中和。按照試劑盒提供的方法，測定洗脫液中的噬菌體的滴度，以未包被的靶蛋白的洗脫噬菌體的滴度作為對照，測定投入產(chǎn)出比。同時將洗脫的與TRAP抗體IgG結(jié)合的噬菌體擴(kuò)增，并測定其下滴度，用于下一輪的篩選。經(jīng)過3輪篩選后，測定的投入產(chǎn)出有了明顯的提高。將富集的噬菌體克隆進(jìn)行ELISA鑒定，隨機(jī)挑取24個陽性克隆進(jìn)行測序。分析后得到包含抗原模擬表位序列1的上述2個家族的多肽序列。
實施例3.篩選到的抗原模擬表位序列1和表達(dá)的TRAP序列進(jìn)行比較將篩選的序列和表達(dá)的TRAP蛋白的原始序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，抗原模擬表位序列1的序列與TRAP蛋白的21-34位氨基酸序列相似抗原模擬表位序列1NPLHHEHATGWTTRAP蛋白一級序列 21NPTHOLFQFSASDT34實施例4.抗原模擬表位序列1噬菌體克隆競爭TRAP蛋白與抗體的結(jié)合選擇擴(kuò)增抗原模擬表位序列1的噬菌體克隆，檢測其是否能夠競爭TRAP與TRAP多抗的結(jié)合。包被TRAP抗體，加入不同量TRAP蛋白和噬菌體(109)的混和物，通過酶標(biāo)抗M13的單克隆抗體檢測噬菌體競爭TRAP蛋白與抗體的結(jié)合。實驗結(jié)果表明抗原模擬表位序列1的噬菌體克隆可以競爭TRAP蛋白與其抗體的結(jié)合，隨著TRAP蛋白量的逐步提高，與抗體結(jié)合的噬菌體數(shù)目在逐步減少(附圖2，圖中1表示109抗原模擬表位序列1噬菌體克隆，2表示5μgTRAP+109抗原模擬表位序列1噬菌體克隆，3表示10μgTRAP+109抗原模擬表位序列1噬菌體克隆)。
實施例5.抗原模擬表位序列1的噬菌體克隆對TRAP多抗活性的抑制作用1∶100接種RN6390B，將樣品加入CY培養(yǎng)基與金葡菌共培養(yǎng)6h，通過MDBK細(xì)胞毒模型檢測金葡菌外毒素的分泌水平。實驗結(jié)果表明TRAP多抗可以降低金葡菌外毒素的水平，而抗原模擬表位序列1的噬菌體克隆可以抑制抗體的功能，能使TRAP多抗的作用降低25％左右。這表明抗原模擬表位序列1的多肽可以通過特異結(jié)合抗體與TRAP結(jié)合部位而抑制抗體的作用。
實施例6.TRAP抗原模擬表位序列1展示在細(xì)菌鞭毛上及免疫動物的效果觀察利用鞭毛的在細(xì)菌表面的高拷貝數(shù)(每個細(xì)菌約二萬個拷貝)的性質(zhì)，我們將TRAP抗原模擬表位序列1對應(yīng)的多肽展示在大腸桿菌GI826鞭毛蛋白的硫氧環(huán)蛋白區(qū)，將重組菌免疫小鼠，檢測特異抗體的產(chǎn)生，經(jīng)過兩次免疫后。ELISA和Westen Blot實驗結(jié)果顯示產(chǎn)生的抗血清能夠特異結(jié)合TRAP蛋白，并且抗血清的效價大于5000，表明我們獲得的模擬肽與合適的載體耦聯(lián)后具有與TRAP相似的免疫原性。這就為抗金葡菌感染疫苗的研究打下良好的基礎(chǔ)。
序列表<110> 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所海南通用同盟藥業(yè)有限公司<120> 金葡菌毒力因子調(diào)控蛋白抗原表位及其模擬表位和用途<130>
<160> 2<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 14<212> PRT<213>
<400> 1Asn Pro Thr His Gln Leu Phe Gln Phe Ser Ala Ser Asp Thr1 5 10<210> 2<211> 12<212> PRT<213>
<400> 2Ser Tyr Phe Glu Arg Tyr Leu Tyr Pro Ile Lys Glu1 5 10
權(quán)利要求
1.金葡菌毒力因子調(diào)控蛋白的抗原表位，其特征在于具有序列表中序列1所示的氨基酸序列。
2.金葡菌毒力因子調(diào)控蛋白的抗原表位，其特征在于具有序列表中序列2所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1抗原表位的模擬表位，其特征在于具有下式所示的氨基酸序列XPXHHQHXTGFT式中，字母X代表二十一種已知天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構(gòu)體的任意一種。
4.權(quán)利要求2抗原表位的模擬表位，其特征在于具有下式所示的氨基酸序列SWFDXXLYPXXX式中，字母X代表二十一種已知天然L-型氨基酸殘基或其D-型異構(gòu)體的任意一種。
5.金葡菌毒力因子調(diào)控蛋白的抗原表位，其特征在于其氨基酸序列是根據(jù)氨基酸的相似性對權(quán)利要求1或2序列中的有些氨基酸進(jìn)行替代而成。
6.金葡菌毒力因子調(diào)控蛋白的抗原模擬表位，其特征在于其氨基酸序列是根據(jù)氨基酸的相似性對權(quán)利要求3或4序列中的有些氨基酸進(jìn)行替代而成。
7.權(quán)利要求1至6中的任意一種序列的多肽以任何形式在制備抗金葡菌感染藥物或疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及金葡菌毒力因子調(diào)控蛋白TRAP的兩個抗原表位及其模擬表位。該抗原表位的氨基酸序列為NPTHQLFQFSASDT或SYFERYLYPIKE，模擬表位的氨基酸序列為XPXHHQHXTGFT或SWFDXXLYPXXX，式中X代表二十一種已知天然L－型氨基酸殘基或其D－型異構(gòu)體的任意一種。本發(fā)明的抗原表位及其模擬表位可用于制備新型抗金葡菌感染疫苗或藥物。
文檔編號C07K14/31GK1569893SQ0315020
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月21日
發(fā)明者邵寧生, 楊光, 柳川, 高亞萍, 董潔, 丁紅梅, 沈倍奮 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 海南通用同盟藥業(yè)有限公司