專利名稱：白色念珠菌轉錄激活因子基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及白色念珠菌菌絲生長相關基因和致病基因。具體地，涉及從白色念珠菌的基因組文庫中克隆到白色念珠菌轉錄激活因子基因CaSWI1及其用途。該基因編碼的產物CaSwi1蛋白是重要的菌絲生長激活因子和毒性因子，參與白色念珠菌的菌絲生長和致病過程。
背景技術：
白色念珠菌(Candida albicans)是一種臨床上分離到的一種機會性人體致病真菌，特別在免疫下調的病人中，如器官移植病人，艾滋病毒感染者等，可以引起廣泛的淺部和深部系統(tǒng)感染，感染部位包括口腔，女性陰道等，引起鵝口瘡，陰道炎等，也可以侵入表皮和內皮細胞進入血液而到達內臟器官，如腎臟，腦部等，導致敗血癥，嚴重可以導致死亡(Odds，F.C.1994.J.Am.Acad，Dermatol.31S2-S5.)。
白色念珠菌在不同的生長條件下，有不同的生長形態(tài)，包括菌體(yeastform)，假菌絲(pseudohyphae)和菌絲(hyphae)。這種形態(tài)轉化能力直接影響白色念珠菌的致病能力(Odds，F.C.1985.Crit Rev Microbiol.1245-93；Brown，A.J.P.et al.1999.Trends Microbiol.7334-338.)，菌絲生長缺陷的菌株其系統(tǒng)感染能力大大下降或消失(Lo，H.J.et al，Cell 90939-949.)。許多培養(yǎng)條件可以引起白色念珠菌的形態(tài)轉換，包括血清，溫度，pH值，氮源利用以及氧壓等等。
調節(jié)白色念珠菌的形態(tài)轉換的細胞內分子機制主要有MAPK途徑(mitoge-actlvaied protein kinase pathway)和cAMP/PKA途徑(cAMP-dependentprotein kinase A pathway)。同時還發(fā)現Cph2介導的，Efg1介導的以及pH應答的信號途徑也都和白色念珠菌的形態(tài)發(fā)生相關(Stoldt，V.R.，et al.EMBOJ.161982-1991；El Barkani A et al.Mol.Cell.Biol.204635-4647.)。在白色念珠菌中還存在抑制效應的信號途徑，主要是Tup1介導的信號途徑，依靠抑制因子Rfg1，Nrg1等來發(fā)揮作用(Kadosh D et al.Mol.Cell.Biol.212496-2505Braun BR et al EMBO J.204753-4761.)。
釀酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)SWI1基囚(ScSWI1)最先根據其和單倍體細胞HO基因和乙醇脫氫酶2基因(ADHII)的正確表達相關而克隆得到的(Michael Stern et al.J.Mol.Biol.1984，178853-868；Aileen K.et al.Genet.1987，116523-530.)。ScSwi1p具有BRIGHT/ARID(AT-richinteractive domain)結構域，是一個核定位蛋白(Aileen K.et al.Genet.1987，116523-530.)。ScSWI1基因的敲除，在單倍體細胞中可阻斷a型和α型生殖型之間的轉換，在雙倍體細胞間引起減數分裂缺陷，導致生長缺陷，對非發(fā)酵糖類(如半乳糖，蔗糖，棉于糖，甘油等)利用的缺陷以及a，α型細胞特異性基因(如STE6，MCM1，MATα1等)以及其他和代謝相關基因(如SUC2，INO1，ADHI，PHO85等)表達的下調(Aileen K.et al.Genet.1987，116523-530；Craig L.Peterson et al.Cell.1992，68573-583；Priya Sudarsanam etal.PANS.2000，97(7)3364-3369.)。遺傳和生化證據表明在酵母細胞中，ScSwi1p是由11個成分組成的SWI/SNF復合物的一個組分，在ATP存在的條件下，此復合物可以和RNA聚合酶II全酶(RNA polymerase holoenzyme)，轉錄激活因子(transcriptional activator)，染色質上的組蛋白，非組蛋白成分以及其它抑制因子相互作用，改變染色質的結構，去除抑制因素，把RNA聚合酶II全酶募集到所調控基因的啟動子上，從而激活轉錄(Loree GriffinBurns et al.Mol.Cell.Biol.1997，17(8)4811-4819；Kruger et al.Genes.Dev.1995，92770-2779；Igor M et al.EMBO.J.1997，16(20)6263-6271；Christopher J et al.Cell.1996，84235-244；Kristen E.Neely et al.Mol.Cell.Biol.2002，22(6)1615-1625；Natalya Yudkovsky et al.GenesDev.1999，132369-2374.)，也有可能使染色質結構更加緊密而抑制轉錄(Joseph A et al.Genes Dev，2002，162231-2236.)。
綜上所述，鑒于白色念珠菌引起的疾病越來越多，因此本領域迫切需要開發(fā)與白色念珠菌致病性有關的基因和蛋白。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種參與白色念珠菌致病作用的新的白色念珠菌轉錄激活因子基因及其編碼蛋白。
本發(fā)明的另一目的是提供該多肽及其編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的白色念珠菌CaSWI1多肽，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個(1-15個，較佳地1-10個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有轉錄激活功能的由(a)衍生的多肽。
在另一優(yōu)選例中，所述的多肽具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸的序列具有SEQ ID NO1中554-3514位。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，它含有本發(fā)明上述的多核苷酸的多核苷酸，以及一種宿主細胞，它含有上述的載體。
在本發(fā)明第四方面，提供了一種能與本發(fā)明所述的白色念珠菌CaSWI1蛋白特異性結合的抗體。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有本發(fā)明所述的多核苷酸的載體。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種能與本發(fā)明所述的白色念珠菌CaSwi1蛋白特異性結合的抗體。
在本發(fā)明的第五方面，提供了制備CaSwi1蛋白的方法，該方法包含(a)在表達條件下，培養(yǎng)上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出CaSwi1蛋白。
在本發(fā)明的第六方面，提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的15-3802個核苷酸。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在CaSwi1蛋白的方法，它包括將樣品與CaSwi1蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在CaSwi1蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進CaSwi1多肽活性的激動劑，或者篩選抑制CaSwi1多肽活性的拮抗劑。本發(fā)明的CaSwi1蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列。


圖1顯示了白色念珠菌CaSWI1基因全長核苷酸序列。
圖2顯示了白色念珠菌CaSWI1基因開放閱讀框的核苷酸序列及推導的氨基酸序列。
圖3A顯示了白色念珠菌CaSwi1蛋白和釀酒酵母ScSwi1蛋白的氨基酸序列比較。黑色部分表示相同氨基酸。
圖3B顯示了CaSWI1能部分互補scswi1突變株在甘油培養(yǎng)基上的生長缺陷。左邊是YPD培養(yǎng)基，無明顯的生長缺陷互補現象，右邊是以甘油為唯一碳源的SD培養(yǎng)基，CaSWI1能部分互補scswi1生長缺陷現象。
圖4A顯示了白色念珠菌野生菌和CaSWI1高表達菌株的菌落形態(tài)。培養(yǎng)條件為SD培養(yǎng)基，37℃，7天。CaSWI1高表達菌株形成表面皺褶的菌落。
圖4B顯示了從圖4A中刮取的白色念珠菌野生菌和CaSWI1高表達菌株的細胞形態(tài)，菌株有明顯伸長的細胞和假菌絲。
圖4C顯示了Northern雜交分析，檢測白色念珠菌野生菌和CaSWI1高表達菌株中CaSWI1基因的表達情況。
圖5顯示了CaSWI1基因的敲除導致白色念珠菌生長緩慢。培養(yǎng)條件為YPD固體培養(yǎng)基，37℃，3天。
圖6顯示了白色念珠菌CaSWI1基因的敲除導致白色念珠菌菌絲生長缺陷。A.固體血清培養(yǎng)基和Lee’s培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)。B.液體YPD加10％血清和Lee’s培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)。
圖7顯示了Northern雜交分析，檢測CaSWI1基因對菌絲生長基因轉錄的調控。caswi1缺失株阻斷菌絲特異性基因HWP1和ECE1的表達。
圖8顯示了小鼠系統(tǒng)感染試驗，CaSWI1基因的敲除導致白色念珠菌毒性下降。High為1×107/ml高濃度菌液；Low為1×106/ml低濃度菌液，每只小鼠尾靜脈注射100μl菌液。
具體實施例方式
本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，從白色念珠菌(Candida albicans)基因組文庫中篩選得到一個3.8kb的新的轉錄激活因子基因CaSWI1(SEQ ID NO1)，其開放閱讀框含2964個核苷酸，編碼一個987個氨基酸的蛋白質(SEQ ID NO2)。
試驗表明，(1)CaSwi1可部分互補釀酒酵母scswi1突變株在甘油培養(yǎng)基上的生長缺陷表型。在白色念珠菌中，CaSwi1呈組成型表達，CaSWI1基因的敲除導致白色念珠菌生長形態(tài)發(fā)生變化，包括菌絲生長缺陷，生長速度下降。(2)在分子水平上CaSWI1基因能調控一些菌絲特異性基因如HWP1、ECE1的表達，在白色念珠菌中高表達CaSWI1基因能在一定程度上激活菌絲生長。(3)CaSWI1基因的缺失確實阻斷了白色念珠菌菌絲的形成。CaSWI1基因的缺失確實影響了菌絲生長相關基因的表達。(4)CaSWI1基因的敲除導致白色念珠菌菌絲生長缺陷，使得白色念珠菌即使在強烈的菌絲誘導條件下也無法形成菌絲。(5)通過小鼠系統(tǒng)感染試驗發(fā)現CaSWI1基因敲除株沒有毒性。因此，轉錄激活因子CaSwi1蛋白是白色念珠菌中重要的菌絲生長激活因子和毒性因子，參與白色念珠菌的致病過程。在此基礎上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明中，術語“CaSwi1蛋白”、“CaSwi1多肽”或“白色念珠菌CaSwi1多肽”可互換使用，都指具有白色念珠菌CaSwi1氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽，以及將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有轉錄激活功能的由(a)衍生的多肽。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的白色念珠菌CaSwi1蛋白或多肽”是指白色念珠菌CaSwi1多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化白色念珠菌CaSwi1蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。
在本發(fā)明中，術語“白色念珠菌CaSwi1多肽”指具有白色念珠菌CaSwi1蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與白色念珠菌CaSwi1蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括白色念珠菌CaSwi1蛋白的活性片段和活性衍生物。
在本發(fā)明中，“白色念珠菌CaSwi1蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼白色念珠菌CaSwi1蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明的白色念珠菌CaSwi1核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的DNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的DNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當地選擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或白色念珠菌CaSwi1蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的CaSwi1多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼白色念珠菌CaSwi1多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發(fā)明中，白色念珠菌CaSwi1多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體?？傊灰茉谒拗黧w內復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含白色念珠菌CaSwi1編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的白色念珠菌CaSwi1蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)用于篩選促進或對抗白色念珠菌CaSwi1蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組白色念珠菌CaSwi1蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激白色念珠菌CaSwi1蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對白色念珠菌CaSwi1 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于白色念珠菌CaSwi1基因產物或片段。較佳地，指那些能與白色念珠菌CaSwi1基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的白色念珠菌CaSwi1基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達白色念珠菌CaSwi1蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備。
抗白色念珠菌CaSwi1蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的白色念珠菌CaSwi1蛋白。
利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與白色念珠菌CaSwi1蛋白發(fā)生相互作用的物質，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測白色念珠菌CaSwi1蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的。
一種檢測檢測樣品中是否存在白色念珠菌CaSwi1蛋白的方法是利用白色念珠菌CaSwi1蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與白色念珠菌CaSwi1蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在白色念珠菌CaSwi1蛋白。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
通用方法Southern分析白色念珠菌基因組DNA抽提方法和Southern雜交分析方法按照文獻操作(Chen et al.J.Bacteriol.1745624-56312.)?；蚪MDNA用PvuII(購自GIBCO公司)完全酶切，電泳完成后的瓊脂糖膠分別用變性液和中和液浸泡45min，尼龍膜用雙蒸水或10xSSC浸透，搭好轉膜平臺，膠與膜間用Parafilm封閉，加一個500g砝碼。，以10xSSC為轉膜液轉移過夜，第二天漂洗晾干交聯。交聯后的膜裝入雜交管，加入10ml預雜交液(6xSSC，5xdenhardt’s Reagent，0.5％SDS，100μg/ml魚精DNA于42℃預雜交12h，探針在100℃變性5min，加入150μl(約1/3所標記的探針)42℃雜交10-16h。0.1xSSC，0.1％SDS洗兩到三次，每次40min，取出膜，晾干，室溫或-70℃壓片。探針標記用invitrogene的隨機引物標記試劑盒并按照其說明進行操作。將含25ng DNA的溶液于100℃加熱變性5-10min，置于冰浴中，再依次加入Random Primers Buffer Mixture，2μl dCTP，2μl dGTP，2μl dTTP，3μl[α-32P]-dATP(10μCi/μl)，混勻后加入1μl Klenow酶，于25℃保溫1h，以Sephadex G-25柱以3000rpm離心4min，收集離心液，即為純化后的探針溶液。探針于100℃變性5min冰上冷卻后加入雜交體系中。
Northern分析用熱酚法抽提白色念珠菌總RNA，以及Northern雜交分析方法參照文獻(Greenberg，M.E.1987，Current protocols in molecular biology，vol.1.Wiley Interscience，New York，N.Y.)。具體而言方法如下各菌株在YPD，30℃中培養(yǎng)至對數生長期后期，轉接至YPD+10％血清，或者Lee’s培養(yǎng)基叫1，起始OD＝0.05，并在相應溫度下培養(yǎng)指定時間，用熱酚法抽提白色念珠菌總RNA。20μl上樣量包括RNA樣品12μl(25μg)，4μl甲醛，2μl 10xMOPS，2μl上樣緩沖液、65℃加熱10min，0℃冷卻2min，離心5s，上樣。電泳在含甲醛的變性膠上進行(1g agarose，10ml 10xMOPS，87ml DEPC處理水，加熱融化稍冷后加入2.7ml 37％甲醛)。電泳條件為100mA，50-70V，5-7h電泳完成后同樣用毛細法轉膜，轉膜液用5xSSC。轉膜過夜后，取出膜，不能使膜干透，用Bio-Ra GS Gene Linker C3protocol紫外交聯，加入10ml預雜交液，65℃，2h后更換為10ml雜交液，加入探針65℃雜交過夜，用2xSSC，0.1％SDS，65℃洗膜兩次，每次30min。雜交好的膜不要晾干，用保鮮膜包好后-70℃壓片。重雜交洗膜用0.5％SDS，90-100℃加熱5-10min，或按照Clontech推薦用0.5％SDS，90-100℃加熱10min后讓其自然冷卻10min后取出備用，若不立即位用，用保鮮膜包好后置于-20℃保存。
白色念珠菌和釀酒酵母的轉化準備PEG/LiAc溶液(pH 7.5)10ml；在1.5mI Eppendof管中依次加入質粒(如果轉釀酒酵母，質粒0.μg，如果轉白色念珠菌，線形化質粒大約5μg)，10μl10mg/ml魚精DNA，混勻；加入0.1ml感受態(tài)細胞和0.6ml PEG/LiAc，votex混勻；30℃200rpm培養(yǎng)30min；加入70μl DMSO，輕輕混勻；42℃熱沖擊15min，期間不時輕輕搖勻；冰浴～2min高速離心15s，吸掉上清，用0.2ml TE重懸細胞；涂布于適當的營養(yǎng)篩選SD平板上。
小鼠系統(tǒng)感染試驗以體重在16-18g ICR雄性小鼠為實驗對象，通過尾靜脈注射100μl白色念珠菌各菌株，并培養(yǎng)觀測25天。各個菌株各注射高低兩個濃度，高濃度菌液為5×107細胞/ml，低濃度菌液為5×106細胞/ml。
實施例1CaSWI1基因的克隆將用常規(guī)方法構建的白色念珠菌的染色體基因庫轉入釀酒酵母單倍體flo8缺失株(可購自Yeast Genetics Stock Culture Center of the American Type CultureCollection)，在SD-ura平板上生長，得到三萬個菌落，用水沖洗后，平板上共剩下40個菌落。這些菌落互補了flo8缺失所引起的侵入生長缺陷，能夠進行侵入生長。
按以下方法抽提酵母菌質粒接種單菌落于5ml SD ura-液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)20h，室溫5000r/min離心3min，棄上清，加入200μl酵母裂解液(2％Triton X-100，1％SDS，100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA)，振蕩重懸酵母菌，加入0.3mg酸洗玻璃珠(425～600μm)，200μl苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，充分振蕩5min，液氮凍10min，室溫融化，再充分振蕩5min，室溫12000r/min離心10min，將上清液轉移至新的1.5ml離心管，加入20μl 3mol/L NaAc，500μl無水乙醇，-70℃凍存1h，4℃12500r/min離心10min，棄上清，70％乙醇洗滌沉淀，抽干，加入20μl TE(pH8.0)溶解。
將從這些菌落中抽提出的質粒，轉入大腸桿菌，從大腸桿菌中抽提的質粒分別導入單倍體和雙倍體flo8缺失株，觀察菌落的侵入生長和絲狀生長表型，發(fā)現37號質粒對釀酒酵母flo8缺失株的的假菌絲生長和侵入生長有很強的促進作用。將37號質粒測序，并通過NCBI進行比較分析，得到CaSWI1基因，包括開放閱讀框的5’和3’端非編碼區(qū)，全長共有3802個核苷酸(圖1和SEQ ID NO1)，其ORF位于第554-3314位，編碼全長987aa的蛋白(圖2和SEQ ID NO2)。
利用BLAST同源搜索，發(fā)現這個基因的編碼產物與釀酒酵母(Sacchromycescerevisiae)的SWI1基因編碼產物有最高的同源性(23％identity)，因此把這個基因命名為CaSWI1，CaSWI1基因編碼的蛋白稱為CaSwi1。
實施例2白色念珠菌CaSWI1基因能部分互補ScSWI1功能缺陷CaSWI1基因在釀酒酵母中的表達能夠校正ste7/ste7，ste12/ste12，tec1/tec1，flo8/flo8和phd1/ste12缺失株菌絲生長的缺陷，說明CaSWI1在釀酒酵母中具有激活菌絲形成的能力。
通過結構域分析，發(fā)現CaSwi1和ScSwi1都有一個明顯的BRIGHT/ARID結構域，這個結構域具有非特異性的DNA結合性質，具有這個結構域的蛋白質可以結合于含AT較多的DNA區(qū)域(Deborah Wilsker et al.Cell.Growth.Differentiation.2002，1395-106.)，這個結構域在結構和功能上具有多樣性。在兩者BRIGHT/ARID結構域N端都有富含谷氨酰胺的區(qū)域，這個區(qū)域推測可以與一些轉錄因子相結合。在ScSwi1的C端還有一個鋅指結構，在CaSwi1中沒有(圖3A)。根據這個鋅指結構證明ScSwi1是一個核定位蛋白(Aileen K.et al.Genet.1987，116523-530.)。
ScSWI1基因的缺失株scswi1表現出對非發(fā)酵糖利用的缺陷(Aileen K.et al.Genet.1987，116523-530；Craig L.Peterson et al.Cell.1992，68573-583.)，而重新導入ScSWI1可以抑制這種缺陷。白色念珠菌CaSwi1和釀酒酵母ScSwi1在序列和結構域上具有相似性，但是在非發(fā)酵糖的利用上，只有在甘油培養(yǎng)基中CaSWI1能部分互補scswi1缺失株的生長缺陷。在以可發(fā)酵糖葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上，scswi1缺失株和野生菌株生長速度差別不大，但是在以半乳糖，蔗糖，棉子糖等非發(fā)酵糖為碳源的培養(yǎng)基上，scswi1缺失株生長速度明顯下降，導入并過表達CaSWI1不能提高缺失株的生長速度，其生長速度基本上與scswi1缺失株差不多。而在以甘油為唯一碳源的SD培養(yǎng)基上，scswi1缺失株導入CaSWI1后能提高其生長速度并在甘油培養(yǎng)基中生長，說明在以甘油為碳源的利用上，CaSWI1能部分互補ScSWI1功能的缺陷(圖3B)，而在以其他非發(fā)酵糖為碳源的培養(yǎng)基上CaSWI1不能互補scswi1缺失株生長的缺陷，因此CaSwi1和ScSwi1在序列上有一定的相似性，在功能上也有部分的互補性。
實施例3CaSWI1的高表達促進白色念珠菌菌絲生長1.CaSWI1高表達質粒的構建CaSWI1編碼框用pfu DNA聚合酶(購自鼎國公司)從野生型菌株PCR擴增得到，用KpnI(購自GIBCO公司)37℃酶切1小時。白色念珠菌高表達載體BA1(Feng，Q.et al.J.Bacteriol.1816339-6346)用KpnI酶切并用堿性磷酸酯酶(CIP，購自BioLab公司)37℃處理后1小時，和PCR酶切片斷用T4 DNA連接酶(購自GIBCO公司)16℃連接1小時，轉化大腸桿菌，挑取單克隆，抽取質粒用KpnI和EcoRV(均購自GIBCO公司)酶切鑒定得到CaSWI1高表達質粒。擴增CaSWI1編碼框所用的引物為引物1GCT GGT ACC ATG TCT GAT TGG TTG AAT GAA AAT GC(SEQID NO3)和引物2GTC GGT ACC CTA GAT CCC CTC ACA AGC CTT TAA(SEQ ID NO4)。
表達的CaSwi1蛋白的分子量約為110KD，與預測值相符。
2.CaSWI1的高表達促進白色念珠菌菌絲生長CaSWI1在釀酒酵母缺失株中的高表達可以激活缺失株的菌絲形成，為了研究CaSWI1在白色念珠菌中的高表達能否激活菌絲生長，利用在ADHI啟動子操縱下的ADE2位點整合型載體把CaSWI1導入白色念珠菌中，發(fā)現CaSWI1的高表達，在一定程度上能促進白色念珠菌菌絲的形成。野生型菌株在SD培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)7天后，形成表面光滑，邊緣規(guī)則的菌落，而CaSWI1的高表達菌株表面開始形成皺褶，邊緣不規(guī)則，而且形成少量的菌絲侵入培養(yǎng)基中(圖4A)，刮取少量菌在顯微鏡下觀察，發(fā)現CaSWI1的高表達菌株比野生型菌株形成更多的假菌絲(圖4B)。Northern實驗證實CaSWI1在該菌株中確實高表達了(圖4C)。
這些結果表明CaSWI1在白色念珠菌體內的高表達有一定的菌絲激活作用。
實施例4白色念珠菌CaSWI1基因的敲除為了研究白色念珠菌CaSWI1基因的功能，在本實施例中，在白色念珠菌中敲除了這個基因。體外構建了CaSWI1基因敲除質粒，把CaSWI1開放閱讀框(openreading frame，ORF)中1.8kb BclI片斷用HisG-URA3-HisG替代，通過同源重組的方法，可以把染色體上的CaSWI1基因中BclI片段用HisG-URA3-HisG替換，從而破壞染色體上的CaSWII基因。篩選標志URA3和一份HisG序列可以在含5-氟乳清酸(5-fluoro-orotic acid，5-FOA)平板上通過兩個同向HisG同源序列在同一條染色體上的重組而環(huán)出，丟失了URA3篩選標志的重組子可以在5-FOA平板上通過正向篩選得到(Boeke et al.Mol.Gen.Genet.197345-346)，從而可以進行下一輪的轉化進而破壞另一條染色體上的CaSWI1基因，重組子基因型用Southern雜交檢測鑒定。
結果1、白色念珠菌CaSWI1缺失株的表型CaSWI1基因的敲除，引起了白色念珠菌一系列細胞形態(tài)和菌落形態(tài)的變化。CaSWI1基因的敲除導致白色念珠菌生長缺陷，而CaSWI1的重新導入則可以回復生長速度(圖5)。在以蔗糖，半乳糖和棉子糖非發(fā)酵糖為碳源的培養(yǎng)基與在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上的生長速度沒有明顯差別，但是在以甘油為碳源的培養(yǎng)基上，缺失株生長速度比以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上略有下降，說明CaSWI1確實在利用甘油的代謝途徑上有作用。CaSWI1基因的敲除導致白色念珠菌細胞形態(tài)的變化。caswi1缺失株在YPD或者SD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)條件下，幾個到幾十個細胞會形成有分枝的鏈狀細胞，在這些細胞團中，往往中間最初的母細胞會形成較大的球形細胞，而鏈中間的子細胞往往會伸長，某些子細胞會在不同部位長出幾個子細胞，末端的子細胞大部分都是球形的，一部分也有略微伸長的，這種細胞形態(tài)和白色念珠菌中的假菌絲很相似。而野生型菌株在同樣培養(yǎng)條件下，呈現典型的分散的球形細胞生長。缺失株中這種鏈狀生長的細胞形態(tài)在其它白色念珠菌和釀酒酵母的缺失株中都有發(fā)現(Mark D.McNemaret al.J.Bacteriology.Apr.2002，p2058-206；Eric S.Bensen et al.Eukaryotic Cell，Oct.2002，p787-798.)，提示可能G2/M期的轉換或者有絲分裂后septin ring的正常形成或者septum的分裂分離發(fā)生問題，暗示CaSwi1可能在這些過程中有作用。在YPD或者SD培養(yǎng)基上，caswi1缺失株的菌落形態(tài)也發(fā)生變化。由原來的具有光滑的表面，規(guī)則的邊緣轉變?yōu)榘欛薜谋砻婧筒灰?guī)則的邊緣，而且菌落和培養(yǎng)基間以及菌和菌之間的粘附明顯下降。而在釀酒酵母ScSWI1的缺失并沒有引起細胞和菌落形態(tài)的變化，也說明了CaSWI1和ScSWI1在體內可能發(fā)揮不同的作用。在白色念珠菌CBK1，FKH2缺失株和釀酒酵母FKH1，FKH2雙缺失株中也可形成類似的細胞和菌落形態(tài)(Mark D.McNemar etal.J.Bacteriology.Apr.2002，p2058-206；Peter C.Hollenhorst etal.Genetics.2000.1541533-1548；Eric S.Bensen et al.EukaryoticCell，Oct.2002，p787-798.)。
2、CaSWI1基因的敲除對白色念珠菌菌絲形成的影響白色念珠菌菌絲形成能力對其侵入和感染是必需的。CaSWI1基因的敲除大大降低了白色念珠菌菌絲形成能力。在含血清的固體Agar板上，經過37℃5天培養(yǎng)，野生型菌株和回復菌株都強烈地形成菌絲，而缺失株形成較小的圓形菌落，菌絲形成嚴重受阻(圖6A)。這種菌絲生長阻斷現象在固體Lee’s平板上更加明顯。經過7天37℃培養(yǎng)，野生型菌株和回復菌株都強烈地形成菌絲，而caswil缺失株菌絲形成能力完全被阻斷，雖然缺失株在Lee’s固體板上長成邊緣不規(guī)則的菌落，但是邊緣卻是光滑的，并沒有看到菌絲的形成(圖6A)。在液體培養(yǎng)基中(圖6B)，YPD加10％小牛血清，經過37℃，3小時培養(yǎng)后，可以看到野生型菌株和回復菌株都形成典型的菌絲(hyphae)，延長的管狀細胞和平行生長的細胞壁，細胞之間沒有明顯的縊縮，而caswi1缺失株則不能形成這種典型的菌絲，細胞之間仍然是鏈狀相連。在Lee’s液體培養(yǎng)基中，細胞形態(tài)和在YPD加10％血清培養(yǎng)中基本一致，說明CaSWI1基因的缺失確實阻斷了白色念珠菌菌絲的形成。
3、CaSWI1基因的缺失引起白色念珠菌菌絲特異基因表達的變化白色念珠菌CaSWI1基因的缺失引起了一系列細胞和菌落形態(tài)的變化，在基因水平上檢測了CaSWI1基因缺失引起的表型變化是通過哪些基因表達的改變來實現的。HWP1，ECE1(Staab et al.J.Biol.Chem.2716298-6305；Birse et al.Infect.Immun.613648-3655.)是白色念珠菌菌絲生長特異性基因，在菌絲生長條件下，這些基因均呈現高表達，而在酵母生長條件下，這些基因不表達。通過Northern雜交分析可以看到，在菌絲誘導條件下，CaSWI1基因的缺失并沒有誘導HWP1和ECE1的表達，而其它可被誘導成菌絲生長的菌株均有HWP1和ECE1的高表達(圖7)，說明CaSWI1基因的缺失確實影響了菌絲生長相關基因的表達。
4、CaSWI1基因的缺失對白色念珠菌毒性的影響CaSWI1基因的敲除導致白色念珠菌菌絲生長缺陷，使得白色念珠菌即使在強烈的菌絲誘導條件下也無法形成菌絲，通過小鼠尾靜脈注射白色念珠菌菌株進行系統(tǒng)感染實驗來檢測CaSWI1基因的敲除是否導致了菌株毒性下降。結果表明野生型菌株有毒性，而caswi1缺失株不管在高濃度(5×107細胞/ml)還是在低濃度(5×106細胞/ml)下均沒有毒性(圖8)，說明轉錄激活因子CaSwi1是白色念珠菌中重要的毒性因子，參與白色念珠菌的致病過程。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>白色念珠菌轉錄激活因子基因及其用途<130>034049<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3802<212>DNA<213>白色念珠菌(Candida albicans)<220>
<221>CDS<222>(554)..(3514)<223>
<400>1gatcagagtg gtcggagatg ctcttggata tatggtggga ccctgctatg tacgaacaaa 60tgcacatgca atgggaacac aaagaacagg acgctctaga aaccttgtat tcaacacaag 120cttggataag agagagaatt gcgtttttac ctttacgcca aatcaatgcg ttcccaccag 180gcgcttgttc agaccaagct gacgatccac agtatttttt ccaaaaccat gactttgtag 240tgaatatggc agggtgtgaa tggggtagag attgctgggg tgaaatggaa cattataagg 300cgttgtcgaa aaagcttcat aagagatggt ggaagttttg ggagtagtag aattgtactt 360tgtagtgtgt ttttttttaa tttacatagt tactttaaca gccgttagga aacagcgaca 420aagaagagaa aaaaaaaact tcgagttcaa gagagagaga aaaaaaaaat caaaacaaca 480aaaaactgag gaaacggaaa agttctattc aaaggtcaac cataaatcta ggtttagcga 540aatataataa atc atg tct gat tgg ttg aat gaa aat gca ttt gca gat 589Met Ser Asp Trp Leu Asn Glu Asn Ala Phe Ala Asp1 5 10agc aac agc aat gac gat ttt ttg aat tcc att ttt gat cag agc caa637Ser Asn Ser Asn Asp Asp Phe Leu Asn Ser Ile Phe Asp Gln Ser Gln15 20 25gga gag caa caa gct cca cag gtt gcg cag gtt tct aca tca atg tca685Gly Glu Gln Gln Ala Pro Gln Val Ala Gln Val Ser Thr Ser Met Ser30 35 40aac cca cca ctt caa tca caa tca gcc ctg tct act tca aga atc tca733Asn Pro Pro Leu Gln Ser Gln Ser Ala Leu Ser Thr Ser Arg Ile Ser45 50 55 60caa gca cac act cca atg tac caa cag tct cct gtt act gct cac act781Gln Ala His Thr Pro Met Tyr Gln Gln Ser Pro Val Thr Ala His Thr65 70 75ata ccg caa aac agt cct caa agt atg ccg aat caa gta gca cag cct829Ile Pro Gln Asn Ser Pro Gln Ser Met Pro Asn Gln Val Ala Gln Pro80 85 90caa caa caa ata cca cca ccc cct ctg caa cac tta caa cag aca acc877Gln Gln Gln Ile Pro Pro Pro Pro Leu Gln His Leu Gln Gln Thr Thr95 100 105gcc caa atg ctt cct caa cag caa cag caa cag caa cag caa caa cag925Ala Gln Met Leu Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln110 115 120cag caa caa aaa caa gag cag cta tac aga atg aag caa cag att tac973Gln Gln Gln Lys Gln Glu Gln Leu Tyr Arg Met Lys Gln Gln Ile Tyr
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1 5 10 15Asp Asp Phe Leu Asn Ser Ile Phe Asp Gln Ser Gln Gly Glu Gln Gln20 25 30Ala Pro Gln Val Ala Gln Val Ser Thr Ser Met Ser Asn Pro Pro Leu35 40 45Gln Ser Gln Ser Ala Leu Ser Thr Ser Arg Ile Ser Gln Ala His Thr50 55 60Pro Met Tyr Gln Gln Ser Pro Val Thr Ala His Thr Ile Pro Gln Asn65 70 75 80Ser Pro Gln Ser Met Pro Asn Gln Val Ala Gln Pro Gln Gln Gln Ile85 90 95Pro Pro Pro Pro Leu Gln His Leu Gln Gln Thr Thr Ala Gln Met Leu100 105 110Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys115 120 125Gln Glu Gln Leu Tyr Arg Met Lys Gln Gln Ile Tyr Gln Gln Gln Met130 135 140Leu Lys Lys Gln Gln Glu Asn Met Ser Arg Gln Pro Ser Pro Met Asn145 150 155 160Ser Ala Gly His Asn Thr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Thr Gln Asn Ala165 170 175Lys Thr Pro Gln Asn Asn Ser Lys Leu Gln Ser Met Gln Met Glu Leu180 185 190Phe Phe Ser Val Leu Tyr Asp Phe Leu Gln Arg Ser Gly Ile Ser Ile195 200 205Pro Gln Ser Leu Ala Ile Asn Gly Lys Arg Val Asn Leu Phe Ile Leu210 215 220Tyr Ile Leu Ser Gln Arg Leu Gly Gly Tyr Arg Val Met Lys Ala Phe225 230 235 240Leu Leu Met Ser Pro Glu Gln Gln Arg Met Gln Gln Gln Asn Pro Trp245 250 255Ala Leu Met Ala Asp Lys Met Gly Phe His Asp Lys Gly Glu Asp Pro260 265 270Met Ala Lys Glu Arg Ile Ala Arg Glu Leu Cys Asn Cys Tyr Ser Asn275 280 285Phe Ile Leu Pro Tyr Glu Glu Tyr Tyr Ala Thr Pro Glu Gly Asn Lys290 295 300Asp Ile Glu Ala Ser Lys His Arg Phe Gln Gln Gln Ile Val Gln Lys305 310 315 320Tyr Leu Ser Asn Val Pro Thr Pro Ala Pro Asn Gln Gln Ser Pro Met325 330 335Ile Ser Ser Ala Pro Thr Pro His Gln Gln Arg Lys Leu Ser Arg Thr340 345 350Ser Asn Ser Val Asn Asn Ser Pro Asn Val Ser Ser Pro Phe His Asn355 360 365Thr Pro Arg Gln Val Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Val Gln Thr Ala370 375 380Ala Ser Met Pro Pro Pro Thr Pro Val Thr Ala Lys Ser Gln Thr Thr385 390 395 400Lys Ala Asp Ala His Ile Leu Lys Asn Tyr Thr Pro Phe Lys Lys Ile405 410 415Val Glu Thr His Gly Pro Phe Asn Ile Lys Glu Leu Ser Gln Leu Ser420 425 430Thr Glu Ile Glu Val Thr Lys Pro Val Tyr Leu Phe Ala Pro Glu Leu435 440 445Gly Ile Ile Asn Leu Gln Ala Leu Thr Met Ser Val Lys Ser Asn Ser450 455 460Gly Ile Gln Ser Ser Glu Val Val Asn Ala Leu Asn Thr Leu Leu Val
465 470 475 480Ala Thr Ser Asp Val Asn Tyr Ala Phe Gln Ile Lys Asp Ile Met Glu485 490 495Leu Leu Asp Ala Leu Ser Ser Leu Gly Lys Asp Val Leu Asn Lys Ile500 505 510Val Gly Val Asn Thr Glu Glu Asp Cys Val Asn Ala Asp Val Thr Lys515 520 525Leu Ser Ala Asn Gly Arg Ile Asp Asp Ile Phe Asn Arg Tyr Val Lys530 535 540Gly Gln Gly Glu Asp Ile Leu Tyr Val Val Asn Ser Leu Thr Gly Glu545 550 555 560Val Val Ser Asp Asp Glu Asp Ile Glu Glu Leu Phe Ser Val Cys Asp565 570 575Asp Gly Asn Leu Glu Ser Pro Ile Asp Lys Leu Thr Asp Leu Leu Asp580 585 590Val Leu Glu Phe His Leu Asp Asp Tyr Leu Thr Ala Leu Lys Asn Phe595 600 605Lys Ser Glu Asn Lys His His Phe Ser Lys Leu Gln Thr Arg Ser Ala610 615 620Thr Asp Asp Gln Ile Leu Leu Val Asp Glu Leu Ile Thr Ile Thr Met625 630 635 640Ile Leu Arg Asn Ile Ser Phe Ala Glu Tyr Asn Lys Glu Pro Met Ala645 650 655Gly Asn Arg Leu Phe Lys Asp Leu Leu Phe Ser Thr Val Lys Ser Val660 665 670Ala Leu Asn Asn Asp Lys Phe Val Phe Ser Arg Lys Arg Leu Cys Leu675 680 685Leu Lys Asp Cys Leu Leu Met Leu Asp Asn Ile Ser Leu Phe Thr His690 695 700Leu His Thr Leu Glu Glu Ala Phe Leu Ser Phe Val Leu Val Ala Ser705 710 715 720Phe Gly Pro Lys Ile Glu Asp Gln Tyr Lys Ile Pro Arg Cys Asn Ile725 730 735Glu Thr His Ser Tyr Phe Ala Phe Gly Leu Asp Ala Phe Thr Lys Leu740 745 750Met Val Arg Glu Pro Tyr Asn Arg Ser Leu Ile Gln Ala Val Leu Asn755 760 765Gly Thr Leu Asn Ser Ser Met Thr Gly Tyr Ser Val Ser Leu Gln Asp770 775 780Gln Glu Tyr Thr Arg Lys Leu Ile Lys Ala Tyr Asn Lys Asp Tyr Lys785 790 795 800Ser Ala Ser Leu Leu Ser Gln Ala Phe Gln Met Tyr Met Ser Ile Leu805 810 815Pro Phe Asp Ala Asn Thr Phe Glu Leu Ser Lys Phe Ile Phe Met Arg820 825 830Ser Pro Thr Ile Ser Gln Met Leu Phe Gly Ala Lys Leu Leu Ile Asp835 840 845Met Val Pro Val Asp Asp Leu Asn Thr His His Asn Lys Leu Ser Leu850 855 860Tyr Trp Leu Leu Glu Asn Arg Glu Leu Leu Leu Gly Asn Phe Ala Arg865 870 875 880Ile Val Val Ala Leu Ser Thr Glu Thr Gly Lys Phe Pro Arg Glu Ser885 890 895Pro Glu His Lys Val Leu Ser Leu Val Leu Arg Lys Ala Leu Val Val900 905 910Ile Asn Ser Leu Val Asp Asn Ala Val Leu Ala Lys Glu Ile Gly Asp915 920 925Leu Arg His Thr Asp Leu Met Glu Ser Leu Thr Asp Cys Leu Ala Phe
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<221>misc_feature<222>(1)..(35)<223>引物<400>3gctggtacca tgtctgattg gttgaatgaa aatgc35<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(33)<223>引物<400>4gtcggtaccc tagatcccct cacaagcctt taa 3權利要求
1.一種分離的白色念珠菌CaSWI1多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有轉錄激活功能的由(a)衍生的多肽。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列具有SEQID NO1中554-3514位。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的載體。
8.一種能與權利要求1所述的白色念珠菌CaSWI1蛋白特異性結合的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種參與白色念珠菌致病作用的新的白色念珠菌轉錄激活因子基因CaSWI1及其編碼蛋白CaSwi1。本發(fā)明還提供了所述蛋白及其編碼序列的用途。該基因編碼的產物CaSwi1蛋白是重要的菌絲生長激活因子和毒性因子，參與白色念珠菌的菌絲生長和致病過程。
文檔編號C07K16/12GK1583788SQ0315042
公開日2005年2月23日 申請日期2003年8月20日 優(yōu)先權日2003年8月20日
發(fā)明者陳江野, 毛旭明 申請人:中國科學院上海生命科學研究院