專利名稱：一種多層電泳凝膠及其在核酸分離和制備中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)技術(shù)，特別是涉及核酸分離和制備中的電泳凝膠及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
凝膠電泳是生物化學(xué)分離的最基本技術(shù)之一，在核酸分離分析和制備方面用得最普遍的凝膠是瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。瓊脂糖凝膠的濃度通常為0.7％-2％，適合分離幾百至20,000堿基的較大的核酸分子，采用更高濃度的瓊脂糖凝膠例如4％瓊脂糖可分離小于100堿基的核酸，但太高濃度瓊脂糖凝膠制作困難而且分辯率差，通常采用聚丙烯酰胺凝膠來分離這種小分子核酸；采用更低濃度的瓊脂糖凝膠如0.5％瓊脂糖可分離更大分子量的核酸，但太低濃度的瓊脂糖凝膠制作困難機械強度太差，往往采用特殊的脈沖瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)來分離特大分子量的核酸。聚丙烯酰胺凝膠濃度通常為4％-20％，適合分離幾十堿基至2,000堿基的較小的核酸，采用更低濃度聚丙烯酰胺凝膠如2.5-3％則機械性能很差或根本不能形成凝膠，而且提高核酸分離幅度極其有限，往往采用瓊脂糖凝膠來分離大分子核酸。以上所談分離核酸的范圍是指聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠的總的分離范圍，對于一個特定的膠即某個濃度的膠，它能分離核酸的范圍均大大小于上述總的范圍。例如，2％瓊脂糖膠很難分離大于5000堿基的核酸，而0.5％瓊脂糖膠很難分離小于500堿基的核酸，同樣4％的聚丙烯酰胺凝膠很難分離小于100堿基的核酸，而20％的聚丙烯酰胺凝膠很難分離大于1000堿基的核酸。為了克服單一濃度膠分離核酸范圍較小的缺點，擴展一個特定膠的分離范圍，早就發(fā)明設(shè)計了膠濃度從膠頂部至低部逐步增高的聚丙烯酰胺梯度凝膠。瓊脂糖凝膠是用水平方式鋪板的，至今未見有梯度瓊脂糖凝膠的報導(dǎo)。聚丙烯酰胺梯度凝膠雖然分離范圍比單一濃度膠有所提高但存在若干缺點第一，梯度膠制作比較困難，需專門的設(shè)備。第二，膠與膠之間及同一膠內(nèi)不同縱切面的梯度變化往往不勻一，造成不同電泳行的核酸遷移速度不一。第三，無論是線性梯度還是指數(shù)梯度凝膠，凝膠的濃度是按這二種規(guī)律以無級的方式變化，指定梯度凝膠的上限和下限后選擇變化的空間就很有限。第四，梯度凝膠設(shè)計的原意是想通過濃度的梯度變化，既顧及較大分子核酸的分離又顧及較小分子核酸的分離。但是，正因為梯度凝膠的膠濃度呈無級改變，最適合某分子量核酸分離的區(qū)間很短。例如4％濃度適合分離2000堿基的核酸，但在4-20％的梯度膠內(nèi)適合2000堿基核酸分離的4％濃度膠層僅存在于頂部，大分子核酸還未分開就進(jìn)入濃度較低的膠層了。同樣20％濃度的膠適合分離20堿基的小分子核酸，但在4-20％的梯度凝膠內(nèi)適合分離20堿基的20％濃度膠僅僅存在于膠的底部，尚未很好分開的小分子一旦進(jìn)入適合其分離的膠層電泳也就得宣告結(jié)束。隨著分子生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，單一濃度凝膠或梯度聚丙烯酰胺凝膠不能滿足各種核酸分離檢測的需要。例如PCR，基因克隆和限制性核酸內(nèi)切酶作用后的片段分析，往往需要在同一凝膠上既分離顯示分子量極大的核酸又要檢測另一個分子量相當(dāng)小的核酸，或者需要在二個核酸區(qū)段內(nèi)均有較高的分辯率。目前尚無一種多層凝膠特別是雙層凝膠，凝膠內(nèi)分二個或二個以上濃度層次，它既不同于濃度固定不變的單一層凝膠，又不同于濃度呈無級變化的梯度膠。多層凝膠有分離范圍寬、分辯率高和性能變化多端能滿足不同需要等優(yōu)點，其性能超過現(xiàn)有的各種單一濃度凝膠和梯度聚丙烯酰胺凝膠。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明提供一種多層電泳凝膠及其在核酸分離和制備中的應(yīng)用，以克服現(xiàn)有的濃度固定不變的單一層凝膠和濃度呈無級變化的梯度凝膠分離范圍窄、分辯率低和性能缺乏變化以及不能滿足不同需要等缺點。
技術(shù)方案本發(fā)明提供的一種多層電泳凝膠，其各層凝膠由聚丙烯酰胺和瓊脂糖兩種組分構(gòu)成，或由不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠、或不同濃度的瓊脂糖凝膠所構(gòu)成。
上述的電泳凝膠，其不同組分或不同濃度的凝膠之間的界面與電泳方向垂直、平行或者斜向相交，優(yōu)選界面與電泳方向垂直。
本發(fā)明的另一種技術(shù)方案為上述的電泳凝膠，其不同組分或不同濃度的凝膠之間的pH值不同?；蛘?，其各層凝膠分別含有核酸的染色劑、變性劑、顯色劑、交聯(lián)劑、核酸探針、抗體或者組蛋白的成分。
上述的多層電泳凝膠，按其制作和使用的方式可分為垂直夾板式凝膠或水平式凝膠。
以上所述的多層電泳凝膠在核酸分離和制備中的應(yīng)用，與現(xiàn)有技術(shù)的不同在于核酸在各個凝膠層中的遷移速度均有差異，優(yōu)選由不同核酸分子在凝膠層中的遷移速度差異較大的單層凝膠組成。
上述的多層電泳凝膠在核酸分離和制備中的另一應(yīng)用方案為，多層凝膠為界面垂直于電泳方向的水平式瓊脂糖凝膠，優(yōu)選由兩層不同濃度的瓊脂糖凝膠組成的水平式凝膠。
本發(fā)明的多層凝膠在制作和應(yīng)用上與現(xiàn)有的單層或者梯度凝膠有著顯著的差異，同時也帶來了獨特的技術(shù)效果，總結(jié)如下1〕本發(fā)明的多層電泳凝膠，就實際應(yīng)用而言通常為雙層凝膠，根據(jù)需要可設(shè)計為三層或更多層。
2〕本發(fā)明的多層凝膠的每一層凝膠都起分離作用，它有別于分離蛋白質(zhì)用的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，該種凝膠的點樣層僅有濃縮功能而無分離作用。
3〕本發(fā)明的多層凝膠主要用于核酸的分離，但也可用于其他生化物質(zhì)的分離。
4〕本發(fā)明多層膠制作方便，除了常規(guī)的的灌膠設(shè)備不需要添任何裝置。
5〕本發(fā)明的多層凝膠可用于各種垂直式凝膠如垂直板式聚丙烯酰胺凝膠。也可用于各種水平式凝膠如瓊脂糖凝膠。
6〕本發(fā)明的多層凝膠可以是同一種凝膠，層與層之間僅濃度不同，例如一層低濃度聚丙烯酰胺凝膠和一層高濃度聚丙烯酰胺凝膠，或一層低濃度瓊脂糖凝膠和一層高濃度瓊脂糖凝膠。本發(fā)明的多層凝膠也可以各種性質(zhì)不同的凝膠，例如一層聚丙烯酰胺凝膠和一層瓊脂糖凝膠。
7〕本發(fā)明多層凝膠在層與層之間的濃度差別和長度比例上沒有限制。針對既定的核酸分離要求，例如最大與最小目標(biāo)分離核酸的分子量，在一個以上區(qū)段內(nèi)二個目標(biāo)核酸均有高的分辯率等等來設(shè)計出最適合的多層凝膠。
8〕本發(fā)明的多層凝膠就應(yīng)用而言主要是橫向分層，即在與電泳走向垂直的方向上分二層，但也可根據(jù)需要作縱向分層，即在與電泳走向平行的方向上分層，也可以斜向分層，既有橫向又有縱向分層，或任何其他方式的分層。從制作方便角度考慮，分層方式較復(fù)雜的各種多層凝膠更適合于水平式凝膠。
9〕本發(fā)明的多層膠的層與層之間除濃度可不同外，還可根據(jù)需要在某一層中加核酸染色劑而另一層中不加，也可在不同層中加不同的染色劑，也可加與不加，或加不同的符合需要又與電泳原理不違背的其他物質(zhì)。
10〕本發(fā)明多層凝膠是在單一濃度膠基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它簡單而又有效地能改進(jìn)了電泳的分離范圍和分辯率。這種改進(jìn)完全不依賴于凝膠本身的特性。凝膠本身特性改進(jìn)如凝膠原料質(zhì)量，添加劑成份，pH等等使電泳分離范圍和分辯的提高，均不會限制本發(fā)明的應(yīng)用，換言之，在各種改進(jìn)的基礎(chǔ)上再使用多層膠將會使分離范圍和分辯更高。
具體實施例方式
實施例1.
包括4個聚丙烯酰胺凝膠電泳。其中，4-20％聚丙烯酰胺梯度凝膠系美國伯樂公司(Bio-rad)產(chǎn)品，4％單一濃度聚丙烯酰胺凝膠、15％單一濃度聚丙烯酰胺凝膠和上層為4％濃度聚丙烯酰胺下層為15％濃度聚丙烯酰胺的雙層凝膠均用伯樂公司出品的灌膠裝置制備。膠的長度均為7cm，實際膠的走距為6-6.5cm。所有膠均用伯樂公司生產(chǎn)的與膠大小匹配的小型垂直式電泳槽。單層膠按常規(guī)方法灌注。制備雙層膠時先灌注下層高濃度膠，待下層凝固后再加上層高濃度膠并放好點樣梳子，待全部膠凝固后去除梳子開始點樣電泳。每個膠分別加標(biāo)準(zhǔn)核酸A15μL，標(biāo)準(zhǔn)核酸B和C各10μL。各種標(biāo)準(zhǔn)核酸的名稱和所含核酸條帶數(shù)和每一條帶的堿基數(shù)列于表1。
表1.用于本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)DNA


加樣緩沖液為Promega出的6X加樣染料含10mMTris-HCl，pH7.5和50mM-EDTA，和橙G，溴酚藍(lán)和二甲本青藍(lán)FF三種指示染料，其濃度分別為0.03％，0.03％和0.4％。除商品梯度膠采用TBE電泳液外均采用TAE電泳液。電泳時電壓均固定為100V，當(dāng)橙色指示染料到膠底線，即走膠6.5-7cm時停止電泳。取出凝膠用0.1ug/ml溴乙錠染色10分鐘，然后用圖象儀掃描核酸條帶并記錄結(jié)果。
掃描的結(jié)果表明4％單一濃度瓊脂糖膠能分離較大的核酸，分離上限為3kb，但不能分離小于100bp的核酸。15％的單一濃度瓊脂糖膠能分離小分子核酸，下限為20bp，但不能分離大于1.5kb的核酸。4-20％的商品梯度膠的分辯范圍與15％單一濃度膠相比基本相同無明顯改進(jìn)。本發(fā)明的4％濃度和15％濃度各半的雙層膠則能分離小至20bp大至3kb的核酸。
實施例2.
包括3個瓊脂糖凝膠電泳，鋪膠和電泳槽為小形普通水平式商品電泳槽，膠長和實際走膠距離分別為7和6.5cm。0.8％和2％單一濃度瓊脂糖膠按常規(guī)方法鋪膠。制備0.8％和2％雙層膠時先以2％濃度瓊脂糖鋪膠，待凝固后用刀將膠切割一分為二，移走靠點樣部位的一半膠，然后再鋪濃度為0.8％的凝膠，使之達(dá)到同樣厚度并加點樣梳子。待凝膠全部凝固后點樣電泳，所有條件與實施例1相同，但溴乙錠染色時間為30分種。結(jié)果表明0.8％單一瓊脂糖凝膠能分離分子量達(dá)23kb的大分子核酸，但對分子量低于500bp的小分子核酸的分辯頻率很差。2％單一的瓊脂糖能分離分子量為100bp以上的小分子核酸，但對分子量高于5kb的大分子核酸分辯率很差。本發(fā)明的0.8％和2％的雙層瓊脂糖凝膠則既能分辯低至100bp的小分子核酸，又能分辯高至23kb的大分子核酸。
實施例3.
由瓊脂糖和聚丙烯酰胺組成的垂直式雙層凝膠，凝膠灌注裝置和垂直式電泳槽與實施例1相同。先灌注8％聚丙烯酰胺凝膠，灌注高度為膠長度的一半，待下層凝固后再灌注1.2％的上層瓊脂糖膠并加好點樣梳子。待全部凝膠凝固后去除梳子點樣并電泳，所有條件與實施例1相同。結(jié)果表明由瓊脂糖和聚丙烯酰胺組成的雙層凝膠既能分離低至20bp的小分子核酸，又能分離高至10kb的大分子核酸，其分離范圍之寬超過了實施例1和2所示結(jié)果，也超過各種單一濃度或梯度商品膠所宣稱的分離范圍(表二)。
表2.各種商品單一濃度膠和梯度膠分離核酸的范圍(走膠長度為6-8cm)

實施例4.
由1％和2％二層瓊脂糖凝膠和一層10％聚丙烯酰胺凝膠組成的多層凝膠，在水平電泳槽上鋪板并用水平電泳槽電泳。先按常規(guī)鋪2％瓊脂糖膠，待凝固后在膠的上下二側(cè)各切割去除約三分之一的膠。然后在膠的上方鋪1％瓊脂糖膠并加點樣梳子，在下方鋪10％的聚丙烯酰胺凝膠，為避免氧對聚合的抑制作用在膠的上面輕輕復(fù)蓋一張塑料薄膜，待膠凝固后移去薄膜。點樣，電泳和染色的條件與條施例2相同，標(biāo)準(zhǔn)核酸D和E的加量也為10ul。結(jié)果表明此三層凝膠既能分離高至23kb的大分子核酸又能分離低至幾十鹼基的小分子核酸，在幾百至10kb的范圍內(nèi)均顯示很高的分辯率。
實施例5.
由二塊1％瓊脂糖凝膠按縱向分層(與電泳方向平行)組成的雙層凝膠，左側(cè)和右測分別含0.5ug/ml的核酸染色劑溴乙錠和SYBR金。二種核酸染色劑的靈敏度和最適激發(fā)光波長等特性不同。制備時先準(zhǔn)備含0.5ug/ml溴乙錠的1％瓊脂糖膠，按常規(guī)方法鋪水平膠，并加點樣梳子，待凝固后去除點樣梳子，用刀片按縱向切割成二塊，移去右側(cè)一塊留下左側(cè)一塊然后將點樣梳插回原來的孔中，再在右側(cè)灌注含0.5ug/mlSYBR金的1％瓊脂糖，待全部凝固后再除去梳子點樣電泳，條件與實施例4相同，電泳結(jié)束后免去染色步驟直接用圖象儀檢測記錄。掃描時分別采用圖象儀設(shè)定的溴乙錠和熒光素二個不同激發(fā)光的檢測程序，應(yīng)用二層膠可以方便，準(zhǔn)確地在同一電泳凝膠內(nèi)比較觀察二種染色劑對核酸遷移速度的影響，染色劑的靈敏度和不同激發(fā)光對不同染色劑核酸顯色的影響。
本實施例例結(jié)果表明含SYBR金的膠核酸遷移較慢，因為廣泛的研究表明瓊脂糖凝膠中預(yù)混溴乙錠對核酸遷移基本上無影響已廣泛被采用，這就說明在所試條件下SYBR金對核酸遷移略有阻滯作用。但是，試驗清楚地表明SYBR金的靈敏度顯著高于溴乙錠，可使用的激發(fā)光波長范圍又較寬，并且對大小分子的顯色比較勻一。而預(yù)混溴乙錠染料方法在本試驗條件下對小分子核酸的顯色很弱，這可能是因為溴乙錠在電泳過程中較快的遷向負(fù)極即膠的上方，當(dāng)小分子核酸到達(dá)膠的下方時該部分膠的染色劑可能已不復(fù)存在。
總之多層膠為比較在凝膠中預(yù)混染色劑的優(yōu)劣利弊提供了十分簡單和可比性強的方法。在分子生物研究中常常需要分析同一樣品中以等克分子量存在的大小縣殊的二種核酸，例如從一個5kb的質(zhì)粒中切割出一個200堿基的插入片段，一個2kb的核酸片段用限制性核酸內(nèi)切酶切割成1950和50鹼基的二個片段，這些情況下大片段的含量將是小片段的幾十倍，這不僅在選擇凝膠進(jìn)行分離比較相當(dāng)困難，在選擇染色劑和圖象分析儀的的靈敏度及反差上也往往顧此失彼，如果采用濃度不同的雙層膠，并且在上層即大分子核酸停留的部分預(yù)混靈敏度較低的染色劑，而在在下層即小分子量核酸停留的部分預(yù)混靈敏較高并且在電場中不遷移或遷移很慢的染色劑，這類經(jīng)常迂到的實際問題便可迎刃而解。
權(quán)利要求
1.一種多層電泳凝膠，其特征在于各層凝膠由聚丙烯酰胺和瓊脂糖兩種組分構(gòu)成，或由不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠、或不同濃度的瓊脂糖凝膠所構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電泳凝膠，其特征在于不同組分或不同濃度的凝膠之間的界面與電泳方向垂直、平行或者斜向相交。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電泳凝膠，其特征在于不同組分或不同濃度的凝膠之間的界面與電泳方向垂直。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電泳凝膠，其特征在于不同組分或不同濃度的凝膠之間的pH值不同。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電泳凝膠，其特征在于各層凝膠分別含有核酸的染色劑、變性劑、顯色劑、交聯(lián)劑、核酸探針、抗體或者組蛋白的成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電泳凝膠，其特征在于多層凝膠為垂直夾板式凝膠或水平式凝膠。
7.權(quán)利要求1所述的多層電泳凝膠在核酸分離和制備中的應(yīng)用，其特征在于核酸在各個凝膠層中的遷移速度均有差異。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多層電泳凝膠在核酸分離和制備中的應(yīng)用，其特征在于多層凝膠是由不同核酸分子在凝膠層中的遷移速度差異較大的單層凝膠組成。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多層電泳凝膠在核酸分離和制備中的應(yīng)用，其特征在于多層凝膠為界面垂直于電泳方向的水平式瓊脂糖凝膠。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多層電泳凝膠在核酸分離和制備中的應(yīng)用，其特征在于多層凝膠為兩層不同濃度的瓊脂糖凝膠組成的水平式凝膠。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于分離核酸和其他生化物質(zhì)的電泳凝膠及其應(yīng)用，這種多層凝膠由聚丙烯酰胺和瓊脂糖兩種組分構(gòu)成，或由不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠、或不同濃度的瓊脂糖凝膠所構(gòu)成。特別是由二層不同濃度的同一種凝膠或二層不同性質(zhì)的凝膠所組成。多層凝膠制備方法簡單，形式變化多樣可滿足不同分離分析要求。在分離范圍和分辨率上優(yōu)于單一濃度凝膠和梯度凝膠。適用于核酸和其他生化物質(zhì)的分離和制備。
文檔編號C07H21/00GK1583778SQ03150449
公開日2005年2月23日 申請日期2003年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月19日
發(fā)明者徐定邦, 朱德芬, 謝文凱, 徐文慧 申請人:徐定邦, 徐文慧