專利名稱：重組新型復(fù)合干擾素在預(yù)防和治療非典型肺炎中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及新型復(fù)合干擾素基因的克隆、基因工程表達(dá)和含有新型復(fù)合干擾素的制劑作為人類非典型肺炎的預(yù)防和治療藥物。
干擾素是細(xì)胞對病毒感染或各種合成及生物誘生作用反應(yīng)，而產(chǎn)生并分泌的一類天然生成的小蛋白分子，分子量為15,000-21,000道爾頓。已經(jīng)確定的干擾素有兩大類(即I型和II型)。I型干擾素包括25種以上的α干擾素以及β干擾素和omega干擾素。所有的α干擾素生物作用相似，但每一種α干擾素并不具有全部活性，在許多情況下，每一干擾素亞型的活性程度差別很大。
新型復(fù)合干擾素是一種重組的、非自然存在的I型干擾素。新型復(fù)合干擾素的166個(gè)氨基酸序列的取得是通過對幾種天然α亞型干擾素序列的掃描，把最常見的氨基酸轉(zhuǎn)移到各個(gè)對應(yīng)的位置。為了便于分子構(gòu)造，另外對多個(gè)氨基酸作了改變，并利用化學(xué)合成方法構(gòu)造了一個(gè)對應(yīng)的合成DNA序列。新型復(fù)合干擾素與αII型干擾素的差異在20/166個(gè)氨基酸(88％同源性)，與β干擾素比較，氨基酸位置一致性在30％以上，相似性比任何天然的α亞型干擾素為高。新型復(fù)合干擾素是在大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞中產(chǎn)生的，細(xì)胞中插入為新型復(fù)合干擾素編碼的合成序列加以遺傳改變。最終純化之前，新型復(fù)合干擾素氧化復(fù)性至天然狀態(tài)，順序通過一系列層析柱后達(dá)到最終純度。這種蛋白質(zhì)的分子量約為19,000道爾頓。
新型復(fù)合干擾素的抗病毒、抗增殖、天然殺傷細(xì)胞(NK)激活、和基因誘生活性，用試管內(nèi)測定和別的重組α干擾素加以比較，結(jié)果表明活性范圍相似。新型復(fù)合α干擾素顯示的體外特異性活性比α-2a和α-2b干擾素至少大五倍以上。新型復(fù)合干擾素與世界衛(wèi)生組織國際效能標(biāo)準(zhǔn)的一種重組α干擾素(83/514)比較，表明在一項(xiàng)體外抗病毒細(xì)胞病變作用測定和一項(xiàng)抗增殖測定中的特異性活性均為1×109單位/mg。
新型復(fù)合干擾素在抗丙型肝炎及乙型肝炎方面顯示了非常有效的治療作用。我公司除將新型復(fù)合干擾素作成針劑用于治療以上疾病外，還將其開發(fā)成噴霧制劑，用于非典型肺炎的預(yù)防和治療，已證明了其有效性。
本發(fā)明采用下述技術(shù)方案(1)本發(fā)明首先設(shè)計(jì)合成了新型復(fù)合干擾素易于在大腸桿菌中表達(dá)的全基因序列，并選用pBV220載體構(gòu)建了重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌工程菌DH5α或者JM109并經(jīng)42攝氏度誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到菌體總蛋白的20-30％。表達(dá)率經(jīng)100次以上傳代不降低。
(2)通過發(fā)酵工程菌，用2YT作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，適當(dāng)增加碳源和氮源，通過優(yōu)化溶氧、攪拌速度、發(fā)酵pH值等工藝參數(shù)，最終培養(yǎng)物OD600值可達(dá)25左右，生物量為每升培養(yǎng)物30-35g，產(chǎn)物表達(dá)率在20-30％之間。真正實(shí)現(xiàn)了高水平表達(dá)。
(3)在發(fā)酵基礎(chǔ)上建立了純化工藝，其中包括菌體的破碎和產(chǎn)物抽提、陰陽離子交換層析和凝膠排阻層析精制等。
所建立的工藝穩(wěn)定、回收率高、活性好。本工藝具有以下特點(diǎn)①通過包含體的抽提去除了大量的可溶性蛋白，而目標(biāo)蛋白無損失；②陰、陽離子交換層析可去除幾乎所有的剩余雜蛋白；③最后一步凝膠排阻層析可以去除大小分子量的酸性雜質(zhì)。
(4)純品加入藥用甘露醇以及磷酸鹽緩沖液等穩(wěn)定劑和助溶劑后，用微孔濾膜過濾除菌，分裝成水針劑、凍干粉針劑或噴霧劑，用于乙型肝炎、丙型肝炎和非典型肺炎的預(yù)防和治療。
本發(fā)明運(yùn)用重組DNA技術(shù)，采用基因合成的方法設(shè)計(jì)合成了易于大腸桿菌表達(dá)的新型復(fù)合干擾素基因，運(yùn)用合理的表達(dá)元件組合提高了產(chǎn)物的表達(dá)，且產(chǎn)物主要以包含體形式存在于大腸桿菌內(nèi)，產(chǎn)物比活性高，下游純化方式簡便，收率高，達(dá)到臨床用藥的質(zhì)量要求。本產(chǎn)品用于人類乙型肝炎、丙型肝炎和非典型肺炎的預(yù)防和治療，能得到顯著的療效。
本發(fā)明用下述實(shí)例進(jìn)行說明實(shí)施例1、全長基因的合成將所設(shè)計(jì)的全長DNA序列分為大致相等的8個(gè)片段，正、反向鏈各4個(gè)。設(shè)計(jì)的片段全部人工合成，然后用PCR的方法分別合成5′端268bp(片段I)和3′端268bp(片段II)兩個(gè)cDNA半分子。片段I的3′端和片段II的5′端有20bp的堿基序列互補(bǔ)。得到全長的DNA分子后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物插入測序質(zhì)粒pUC18，測序正確后進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建。
實(shí)施例2、表達(dá)載體的構(gòu)建從pUC18/IFN酶切獲得目的基因片段，回收后連接已雙酶切的pBV220表達(dá)載體成為原核表達(dá)質(zhì)粒pBV220/IFNco，轉(zhuǎn)化優(yōu)選的DH5α大腸桿菌后用PCR方法篩選陽性克隆，且酶切正確。含有以上表達(dá)質(zhì)粒的DH5α工程菌經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)、42℃誘導(dǎo)，在19kd左右多出一條蛋白條帶。
實(shí)施例3、重組新型干擾素的發(fā)酵生產(chǎn)工程菌30℃過夜培養(yǎng)后，按5％比例接種于2YT培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)到OD600為4.0時(shí)，升高溫度至42℃，4h后收集菌體。發(fā)酵產(chǎn)物密度可達(dá)OD600為25，生物量為每升培養(yǎng)物30-35g。電泳鑒定尿酸氧化酶表達(dá)水平，薄層掃描顯示尿酸氧化酶占菌體總蛋白的20-30％之間。
實(shí)施例4、新型復(fù)合干擾素的分離純化重組新型復(fù)合干擾素在菌體內(nèi)主要以包含體形式存在于菌體胞漿內(nèi)，菌體破碎后離心回收沉淀，沉淀用磷酸鹽緩沖液洗滌后進(jìn)行蛋白的變復(fù)性，使產(chǎn)物得到初步純化。復(fù)性后的上清再經(jīng)Q-Sepharose和SP-Sepharose柱層析可以得到電泳純的新型復(fù)合干擾素。最后用Sephacryl S-100精制得到19kd的產(chǎn)品。
實(shí)施例5、抗SARS病毒活力測定VeroE6細(xì)胞接種于96孔板，每孔100μl，含細(xì)胞2×104個(gè)/孔，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞長成單層。將最大無毒濃度以下的藥物10倍稀釋5個(gè)濃度，分別加入細(xì)胞板中，每孔100μl，37℃5％CO2溫箱培養(yǎng)24小時(shí)后，再分別加入不同稀釋度的SARS病毒(10-3、10-4、10-5)，共同培養(yǎng)48-72小時(shí)，觀察細(xì)胞病變程度。每個(gè)稀釋度設(shè)4個(gè)孔，并設(shè)正常細(xì)胞對照、藥物對照和不同稀釋度(10-3、10-4、10-5)的病毒對照，每天觀察，待病毒觀察出現(xiàn)細(xì)胞明顯病變時(shí)，判定干擾素抗病毒的效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為重組人新型復(fù)合干擾素對細(xì)胞的無毒濃度為106IU/ml。當(dāng)病毒濃度為10-5時(shí)，干擾素對SARS病毒有封閉作用，其半數(shù)抑制病毒濃度為265IU/ml。
權(quán)利要求
1.新型復(fù)合干擾素在預(yù)防和治療非典型肺炎中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1的新型復(fù)合干擾素的基因序列為5′CG GAATTC1 ATG TGC GAC CTG CCT CAG ACC CAC AGC CTG GGT AAC CGT CGT GCT CTG ATC CTG CTGGCT61 CAG ATG CGT CGT ATC TCT CCG TTC TCC TGC CTG AAA GAC CGT CAC GAC TTC GGT TTCCCG121 CAG GAA GAG TTC GAT GGC AAC CAG TTC CAG AAA GCT CAG GCT ATC TCT GTT CTG CACGAA181 ATG ATC CAG CAG ACC TTC AAC CTG TTC AGC ACT AAA GAC TCC TCT GCT GCT TGG GACGAA241 AGC CTG CTG GAA AAA TTC TAC ACT GAA CTG TAC CAG CAG CTG AAC GAC CTG GAA GCTGGC301 GGT ATC CAG GAA GTT GGT GTT GAA GAA ACT CCG CTG ATG AAC GTT GAC TCC ATC CTGGCT361 GTT AAA CGT TAC TTC CAG CGT ATC ACT CTG TAC CTG AAC GAA AAA AAA TAC AGC CCGTGC421 GCT TGG GAA GTT GTT CTG GCT GAA ATC ATG CGT ACC TTC TCT CTG TCA ACC AAC CTGCAG481 GAA CGT CTG CGT CGT AAA GAA TAAGGA TCC CG3′
3.權(quán)力要求2得到的產(chǎn)物用相應(yīng)的核酸內(nèi)切酶消化后插入到pBV220載體構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒pBV220/IFNco，不僅限于pBV220載體。
4.權(quán)利要求3的原核表達(dá)質(zhì)粒pBV220/IFNco轉(zhuǎn)化DH5α或HB101大腸桿菌(不僅限于DH5α或HB101菌)，發(fā)酵后得到高水平表達(dá)的重組新型復(fù)合干擾素。
5.權(quán)力要求4得到的新型復(fù)合干擾素通過蛋白的變復(fù)性、離子交換、凝膠過濾等純化過程得到純度98％以上的產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型復(fù)合干擾素(Urate oxidase，簡稱UOX)在預(yù)防和治療非典型肺炎中的應(yīng)用。本發(fā)明利用原核表達(dá)原理與技術(shù)，優(yōu)選了大腸桿菌偏愛的密碼子，設(shè)計(jì)了新型復(fù)合干擾素的基因序列，進(jìn)行了全基因序列的人工合成并選用pBV220載體構(gòu)建了重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌工程菌DH5α或者JM109并經(jīng)42攝氏度誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到菌體總蛋白的20－30％。工程菌經(jīng)過發(fā)酵、破菌后，離心保留沉淀。沉淀經(jīng)過變復(fù)性后利用陰離子交換、陽離子交換和凝膠排阻層析的方法純化產(chǎn)品。純品加入保護(hù)劑后制成藥用噴霧制劑。該制劑用于非典型肺炎的預(yù)防和治療。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1589899SQ0315592
公開日2005年3月9日 申請日期2003年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月27日
發(fā)明者徐明波, 王勇波, 崔鐵民, 吳彥卓, 陳遙, 盧安京, 李亞軍, 賈志杰, 袁雪蓮, 王京燕, 趙艷紅, 紀(jì)曉光, 李曉萸, 張永祥 申請人:北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司