專利名稱：一種副雞嗜血桿菌的抗原模擬表位肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及模擬副雞嗜血桿菌抗原表位的短肽，具體說涉及一組能模擬C型副雞嗜血桿菌的血清型抗原表位的短肽，以及該組短肽在制備雞傳染性鼻炎鑒別診斷及預(yù)防藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
副雞嗜血桿菌(Haemophilus paragallinarum，Hpg)是引起雞傳染性鼻炎的致病菌。它可以分為A、B、C三種血清型，A和C型為主要致病菌。雞傳染性鼻炎是一種急性呼吸道疾病，在早期文獻(xiàn)中，其臨診癥狀被描述為雞瘟，接觸性傳染，或傳染性卡他和無并發(fā)癥鼻炎。由于具有傳染性并主要感染鼻道，所以被命名為傳染性鼻炎。它的主要危害是造成蛋雞產(chǎn)蛋量下降及育成雞生長不良。有文獻(xiàn)報道，由Hpg引起的傳染性鼻炎可使產(chǎn)蛋量下降40％，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。
對Hpg的鑒別主要有表型鑒定，血清型鑒定及PCR等方法。這些方法在實際推廣應(yīng)用中都受到一定的限制由于Hpg生長緩慢，培養(yǎng)條件苛刻，普通實驗室很難通過表型對其進(jìn)行分離鑒定；血清型鑒定是常用的方法，它的經(jīng)典方法是根據(jù)Page使用的平板凝集試驗將分離到的Hpg分型；也有通過血清型單抗阻斷酶聯(lián)免疫反應(yīng)進(jìn)行血清分型的報道。由于迄今尚沒有商品供應(yīng)的血清型特異的單抗，因此無法推廣應(yīng)用。近來有文獻(xiàn)報道，通過合成特異的寡核苷酸探針，采用PCR法對Hpg進(jìn)行快速鑒別。但該法較易出現(xiàn)假陽性，且需要特殊的儀器設(shè)備，因而不利于在基層推廣使用。
目前對雞傳染性鼻炎的防治主要采用接種疫苗—減毒活菌苗的方法。因為缺少方便快捷適于基層推廣的血清型鑒別方法，所以通常都是混合接種A和C型減毒活菌苗。隨之而來的問題是Hpg是革蘭氏陰性菌，含有內(nèi)毒素，大量接種也會影響蛋雞的產(chǎn)蛋及育成雞的生長。若能針對疫情分型接種將減少內(nèi)毒素的影響，從而減少經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立一種簡便有效的Hpg血清型鑒別診斷方法及研制不含內(nèi)毒素的新型多肽疫苗將具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決Hpg的鑒別診斷的技術(shù)難題，本發(fā)明公開了一種能模擬Hpg C的血清型抗原表位的短肽，還公開了該短肽在制備雞傳染性鼻炎鑒別診斷及預(yù)防藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的發(fā)明人以Hpg C的一株血清型單抗為靶蛋白，從噬菌體展示的構(gòu)象約束型隨機環(huán)七肽庫(New England Biolabs公司)中篩選到與之結(jié)合的短肽。所篩選到的短肽具有9個氨基酸殘基，其氨基酸序列兩端為半胱氨酸殘基，中間的7個氨基酸殘基中含有SWYFP序列。本發(fā)明的短肽可以用公式CSWYFPX1X2C表示，其中C代表半胱氨酸殘基；S代表絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基，優(yōu)選代表絲氨酸殘基；W代表色氨酸殘基；Y代表酪氨酸殘基或苯丙氨酸殘基，優(yōu)選代表酪氨酸殘基；F代表苯丙氨酸殘基或酪氨酸殘基，優(yōu)選代表苯丙氨酸殘基；P代表脯氨酸殘基；X1X2分別代表任意氨基酸殘基。
本發(fā)明公開了上述序列之一的最優(yōu)選序列為CSWYFPSHC，其中C代表半胱氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，W代表色氨酸殘基，Y代表酪氨酸殘基，F(xiàn)代表苯丙氨酸殘基，P代表脯氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，H代表組氨酸殘基。
本發(fā)明的短肽可通過本發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)如化學(xué)合成等方法制備。將本發(fā)明公開的序列與GeneBank中已公布的Hpg的蛋白序列進(jìn)行比較，未發(fā)現(xiàn)有同源性，這些短肽可抑制天然抗原與單抗的結(jié)合，說明它們在結(jié)構(gòu)上能模擬天然抗原表位，為一種新的抗原模擬表位序列。
Hpg的血清型抗原成分迄今尚不清楚。本發(fā)明的目的是以這類短肽作為替代血清型抗原，用于對Hpg的鑒別診斷及新型疫苗的研制。將含有上述保守序列的短肽與GST融合表達(dá)作為替代抗原，包被到96孔酶聯(lián)板，ELISA試驗結(jié)果表明該融合肽可特異地與C型單抗及C型Hpg接種后雞的多抗血清結(jié)合，而不與A型單抗及A型Hpg接種后雞的多抗血清反應(yīng)。
本發(fā)明的申請人將上述序列展示在細(xì)菌鞭毛硫氧還蛋白的袢環(huán)區(qū)，該區(qū)位于細(xì)菌鞭毛上，外源片段不僅具有一定的構(gòu)象約束性，而且可以實現(xiàn)高拷貝表達(dá)。將此重組菌做為免疫原，免疫接種雄性昆明鼠，獲得了特異識別插入序列和天然抗原的抗體，說明該表位肽構(gòu)成免疫原后可以誘導(dǎo)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對C型Hpg的抗體。
利用本發(fā)明的短肽，可以提供一種新型，快速，易于操作的雞的傳染性鼻炎的血清型鑒別診斷方法，并為進(jìn)一步研制安全高效新型疫苗奠定了工作基礎(chǔ)，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和市場前景。


圖1為模擬表位融合肽與單抗的結(jié)合示意2為模擬表位融合肽與多抗血清的結(jié)合示意圖具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但所述實施例不以任何形式限制本發(fā)明。
實施例一 模擬表位融合肽在鑒別診斷中的應(yīng)用一、實驗方法人工合成編碼模擬表位肽CSWYFPSHC的寡核苷酸序列(其中C代表胱氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，W代表色氨酸殘基，Y代表酪氨酸殘基，F(xiàn)代表苯丙氨酸殘基，P代表脯氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，H代表組氨酸殘基)，并在兩端加上EcoR I和HindIII內(nèi)切酶識別的粘末端序列。將PGEX-KG表達(dá)載體(含有編碼GST蛋白的核酸序列，Promega公司產(chǎn)品)以上述EcoR I和HindIII內(nèi)切酶酶切，低熔點膠回收大片段，然后按合成片段與載體片段5∶1的比例以T4連接酶16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)菌。將經(jīng)過酶切及測序鑒定的重組菌按1∶100接種于氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.8，加入終濃度為0.25mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h。4℃離心培養(yǎng)液，收集菌體，并按誘導(dǎo)表達(dá)菌液的1/10體積重懸于PBS中，超聲破碎，離心后收集上清。經(jīng)Gluthine sepharose 4B親合樹脂(Sigma公司)純化，得到高純度的GST模擬表位融合肽。將此融合肽作為抗原包被96孔酶聯(lián)板，用ELISA方法對A型和C型單抗及接種Hpg A和Hpg C后產(chǎn)生的雞多抗血清(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供)分別進(jìn)行檢測。采用TMB顯色系統(tǒng)顯色，測定OD450。
二、實驗結(jié)果ELISA結(jié)果顯示模擬表位的GST融合肽能特異結(jié)合Hpg C型單抗及其多抗血清，而不與HpgA型單抗及其多抗血清結(jié)合，兩者有顯著性差異(p＜0.01)，結(jié)果見圖1和圖2；單純GST與A型和C型單抗均不反應(yīng)。因此該方法能方便快捷地區(qū)分疫區(qū)致病菌的血清型，為按血清型進(jìn)行免疫接種提供鑒別依據(jù)。
實施例二 模擬表位在細(xì)菌鞭毛上的展示及免疫小鼠后特異抗體的檢測一、實驗方法按照Invitrogen公司的產(chǎn)品FliTrx系統(tǒng)說明書推薦的操作方法，將人工合成的編碼模擬表位肽SWYFPSH的寡核苷酸序列插入FliTrx載體的多克隆位點BstX I和Xho I之間。模擬表位肽將在細(xì)菌鞭毛硫氧還蛋白的袢環(huán)區(qū)呈CSWYFPSHC展示。經(jīng)酶切和測序檢驗插入正確后，重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)GI826宿主菌。重組菌于25℃ IMC培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，色氨酸誘導(dǎo)表達(dá)6h。取體重20±2g雄性昆明鼠20只，隨機分為4組，每組5只。實驗組按108個細(xì)菌/只的劑量進(jìn)行腹腔注射，實驗組1加適量不完全福氏佐劑；實驗組2不加；對照組1腹腔注射等量鹽水；對照組2腹腔注射等量載體菌。三周后加強免疫，加強后一周取血，用ELISA檢測血清中的抗體。
二、實驗結(jié)果酶聯(lián)96孔板包被C型Hpg超聲破碎液(1×108/100μl/孔)，4℃過夜；10％脫脂奶粉封閉后對1∶200稀釋的免疫小鼠血清進(jìn)行ELISA檢測。結(jié)果顯示實驗組OD值明顯高于對照組，統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性差異(p＜0.01)(表1)，表明免疫接種的小鼠體內(nèi)已產(chǎn)生特異識別C血清型抗原的抗體。提示該表位肽可以作為構(gòu)建C血清型Hpg免疫原的表位。
表1 ELISA法檢測小鼠血清抗體組別 OD450對照組1 0.089±0.028對照組2 0.124±0.043實驗組1 0.393±0.056實驗組2 0.354±0.078
權(quán)利要求
1.一種副雞嗜血桿菌抗原模擬表位肽，其特征在于具有氨基酸序列CSWYFPX1X2C，其中C代表半胱氨酸殘基；S代表絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基；W代表色氨酸殘基；Y代表酪氨酸殘基或苯丙氨酸殘基；F代表苯丙氨酸殘基或酪氨酸殘基；P代表脯氨酸殘基；X1X2分別代表任意氨基酸殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副雞嗜血桿菌抗原模擬表位肽，其特征在于S代表絲氨酸殘基；Y代表酪氨酸殘基；F代表苯丙氨酸殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的副雞嗜血桿菌抗原模擬表位肽，其特征在于X1代表絲氨酸殘基，X2代表組氨酸殘基。
4.權(quán)利要求1或2或3所述的副雞嗜血桿菌抗原模擬表位肽在制備雞傳染性鼻炎診斷試劑和疫苗中的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所說的診斷試劑為C型副雞嗜血桿菌血清抗原的診斷試劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所說的疫苗為C型副雞嗜血桿菌疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種副雞嗜血桿菌的抗原模擬表位肽及其用途。該抗原模擬表位肽的氨基酸序列具有以下通式CSWYFPX
文檔編號C07K14/195GK1597693SQ03157110
公開日2005年3月23日 申請日期2003年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月15日
發(fā)明者高亞萍, 柳川, 孟露露, 邵寧生, 辛忠濤, 張培君 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所