專利名稱：毛蚶中的多肽蛋白類活性物質(zhì)及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種毛蚶(Arca subcrenata Lischke；Scapharcasubcrenata；)中的多肽蛋白類活性物質(zhì)，及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
毛蚶(Arca subcrenata Lischke；Scapharca subcrenata；)屬于軟體動(dòng)物門，瓣鰓綱，列齒目，蚶科。其貝殼為中藥瓦楞子。有31～34條放射肋。殼表面有毛，呈茶褐色。產(chǎn)于我國(guó)北部沿海。
《中國(guó)海洋藥物》雜志2003年第2期P37，介紹了牡蠣蛋白的分離方法。新鮮牡蠣軟體，4℃下以2倍量生理鹽水勻漿，3000r/min離心15min，取上清液，分別加入(NH)2SO4，使溶液的(NH)2SO4的飽和度分別達(dá)到50％、75％和100％，4℃下靜置12h。再以3000r/min離心15min，取沉淀，少量水溶解后，倒入透析袋脫鹽。每2h換水一次。直至15％CaCl2檢測(cè)溶液中無(wú)SO42-存在，最后得到蛋白。牡蠣提取物的營(yíng)養(yǎng)分析顯示，牡蠣中含有豐富的糖源、蛋白質(zhì)及必需氨基酸，特別是牛磺酸含量高，還含有多種必須的微量元素和多種維生素?！侗静菥V目》等均記載了牡蠣的治療功效，牡蠣入藥在我國(guó)已有千年的歷史。除此之外，申請(qǐng)人在檢索過(guò)程中并未發(fā)現(xiàn)關(guān)于毛蚶多肽蛋白類活性物質(zhì)的藥用報(bào)道及其提取方法的報(bào)道。
上述文獻(xiàn)報(bào)道的方法中使用的(NH)2SO4沉淀步驟來(lái)提取蛋白，得到的只是粗總蛋白，其中含有多糖等多種雜質(zhì)，是多種成分的混合物。所得提取物不能直接用于純度要求高的用途中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來(lái)源于毛蚶中的多肽蛋白類活性物質(zhì)，及其制備方法和醫(yī)藥用途，通過(guò)本發(fā)明的制備方法提取得到的毛蚶的多肽蛋白類活性物質(zhì)純度大大提高，可以直接用于純度要求高的用途中。
本發(fā)明是通過(guò)如下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。將毛蚶內(nèi)容物清洗后，加入蒸餾水，勻漿，離心去渣，取上清；對(duì)上清進(jìn)行離子交換柱層析，分別收集各峰后，脫鹽，經(jīng)凝膠柱層析分離，合并分子量為3-150kDa的各峰，經(jīng)濃縮干燥后得到毛蚶多肽蛋白類活性物質(zhì)。
將該多肽蛋白類活性物質(zhì)，配以適當(dāng)?shù)乃幱幂o料，制成適當(dāng)劑型的藥物，可用于抑制腫瘤。適當(dāng)?shù)膭┬屠缡亲⑸鋭?br> 用本發(fā)明的多肽蛋白類活性物質(zhì)制成的抗腫瘤藥物，可有73.72％的抑瘤率，同時(shí)因?yàn)槭翘烊簧锾崛∥镔|(zhì)，具有低毒的特點(diǎn)。本發(fā)明的毛蚶多肽蛋白類活性物質(zhì)的提取方法，直接將毛蚶蛋白進(jìn)行離子交換柱層析，脫鹽后，再進(jìn)行凝膠柱層析分離，可達(dá)到將多肽蛋白提取物在分離提取的同時(shí)得到純化的效果，更好地適用于醫(yī)藥用途。
最佳實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
實(shí)施例1取毛蚶，去殼，取其內(nèi)容物，用4℃常水清洗3次后，再用4℃的蒸餾水清洗兩遍；按1∶3的重量比加入蒸餾水，以5000r/min勻漿3min，在離心機(jī)上去渣，離心10min后取上清；對(duì)上清進(jìn)行離子交換柱層析(利用DEAE陰離子交換劑，采用磷酸緩沖溶液進(jìn)行0.8-1.5M鹽濃度梯度洗脫)，通過(guò)該步驟，已經(jīng)將提取物按照對(duì)離子交換介質(zhì)吸附能力的不同分離純化。分別收集各峰后，透析脫鹽。脫鹽后再經(jīng)凝膠柱層析分離(填料為Sephadex G-50，利用磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫)，進(jìn)一步將相同吸附力的提取物按照不同分子量進(jìn)行分離，將得到的分子量在3-150kDa的各峰合并，濃縮，干燥，得到毛蚶的多肽蛋白類活性物質(zhì)，它的組成及純度有了很大的提高。
實(shí)施例2取上述毛蚶的多肽蛋白類活性物質(zhì)進(jìn)行荷瘤小鼠的體內(nèi)腫瘤實(shí)驗(yàn)，取雄性昆明種小鼠，體重19～21g，隨機(jī)分組，每組10只。每只小鼠左腋下接種0.2ml S180艾氏腹水癌的瘤液。次日開始以生理鹽水為陰性對(duì)照，5-氟尿嘧啶為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行腹腔注射，注射8天后稱重，解剖皮下瘤塊，稱重。實(shí)體瘤的療效以瘤重抑制百分率表示，計(jì)算公式如下瘤重抑制率％＝(1-T/C)×100％
T治療組平均瘤重C陰性對(duì)照組平均瘤重藥物對(duì)小鼠S180中瘤的抑制作用組別 給藥劑量給藥途徑 動(dòng)物體重(g) 平均瘤重(g) 抑瘤率 給藥前后及天數(shù)藥前 藥后(％) 體重變化生理鹽水 20ml/kg ip×8 20.7423.65 1.61樣品 75mg/kg ip×8 20.5520.32 0.423 73.72-1.12％5-氟尿嘧啶 10ml/kg ip×8 20.9616.30.457 71.61-22.23％實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提取的活性蛋白的抑瘤率高達(dá)73.72％，且其毒性低于陽(yáng)性對(duì)照5-氟尿嘧啶組(樣品組小鼠實(shí)驗(yàn)前后體重下降明顯低于5-氟尿嘧啶組，說(shuō)明其毒性較低)；同時(shí)，該制劑對(duì)體外腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)也有較高的抑制率。因此，本發(fā)明的提取物具有高效低毒，制作過(guò)程無(wú)污染等特點(diǎn)，有望為臨床提供一種安全、有效、質(zhì)量可控的新型抗腫瘤藥物。
權(quán)利要求
1.一種毛蚶(Arca subcrenata Lischke；Scapharca subcrenata；)中的多肽蛋白類活性物質(zhì)，它是通過(guò)下述方法制備的將毛蚶內(nèi)容物清洗后，加入蒸餾水，勻漿，離心去渣，取上清，對(duì)上清進(jìn)行離子交換柱層析，分別收集各峰后，脫鹽，經(jīng)凝膠柱層析分離，合并分子量為3-150kDa的各峰，經(jīng)濃縮干燥后得到多肽蛋白類活性物質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的毛蚶中的多肽蛋白類活性物質(zhì)的制備方法，該方法包括將毛蚶內(nèi)容物清洗后，加入蒸餾水，勻漿，離心去渣，取上清，對(duì)上清進(jìn)行離子交換柱層析，分別收集各峰后，脫鹽，經(jīng)凝膠柱層析分離，合并分子量為3-150kDa的各峰，經(jīng)濃縮干燥后得到多肽蛋白類活性物質(zhì)。
3.按照權(quán)利要求2的制備方法，其中所述的毛蚶的內(nèi)容物清洗步驟是先用4℃常水清洗3次后，再用4℃的蒸餾水清洗兩遍；所述加入的蒸餾水與毛蚶的重量比為3∶1。
4.含有權(quán)利要求1的毛蚶中的多肽蛋白類活性物質(zhì)的藥物組合物。
5.權(quán)利要求1的毛蚶中的多肽蛋白類活性物質(zhì)在制備用于抑制腫瘤的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種毛蚶(Arca subcrenata Lischke；Scapharca subcrenata；)中的多肽蛋白類活性物質(zhì)，及其制備方法和用途，所述制備方法包括直接將毛蚶勻漿后得到的上清液進(jìn)行離子交換柱層析，脫鹽后，再經(jīng)凝膠柱層析分離，合并分子量為3－150kDa的各峰，濃縮干燥后，得到多肽蛋白類活性物質(zhì)。上述活性物質(zhì)具有73.72％的抑瘤率，可制成抗腫瘤藥物，且純度高，毒性低。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1600792SQ03157458
公開日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2003年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月22日
發(fā)明者于榮敏, 趙昱 申請(qǐng)人:于榮敏, 趙昱