專利名稱：二環(huán)cb2大麻堿受體配體的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及作為外周大麻堿(cannabinoid)受體CB2配體的(+)α-蒎烯衍生物及其藥物組合物，可用于預防和治療自身免疫性疾病以及相關的紊亂、炎癥、疼痛、肌肉痙攣、心血管紊亂、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、神經(jīng)退行性疾病、CNS中毒以及某些種類的癌癥。
背景技術(shù)：
長期以來大麻制劑已經(jīng)被認為是治療多種疾病的治療劑(Mechoulam，R.“作為治療劑的大麻堿(Cannabinoids as TherapeuticAgents)”CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)la.，1-19，1986)?，F(xiàn)今，天然的活性組分Δ9-四氫大麻堿(Δ9-THC)以通用名Dronabinol由醫(yī)生開處方作為抗催吐劑并增強食欲，主要用于愛滋病人。然而，直到最近才實現(xiàn)臨床上不希望的影響精神的效果和治療上所希望的效果，諸如血管血壓過低和免疫調(diào)節(jié)之間的區(qū)別。兩種大麻堿受體CB1和CB2的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)幫助闡明了大麻堿不同的效果。
受體顯示出具有七個偶聯(lián)的跨膜結(jié)構(gòu)G-蛋白，它們共有44％的氨基酸序列同源性，但是在組織特異性方面不同(Munro，S.，Thomas，K.L.& Abu-Shaar，M.，Nature 36561-5，1993)。這兩種受體都通過對百日咳毒素-敏感的GTP-結(jié)合蛋白負調(diào)節(jié)腺苷酰基環(huán)化酶的活性來發(fā)揮它們的作用。在某些細胞類型中它們還表現(xiàn)出激活有絲分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)(Parolaro，D.，Life Sci.65637-44，1999)。
CB1受體主要表達在CNS中，并且在其它組織中表達水平較低。主要在與大麻堿對行為的作用相關的大腦區(qū)域，諸如海馬、扁桃體、腦皮層、基底神經(jīng)節(jié)以及小腦中發(fā)現(xiàn)CB1受體的存在。此外，發(fā)現(xiàn)高濃度的CB1受體存在于調(diào)節(jié)傷害感受過程的區(qū)域中。CB2受體大多數(shù)表達在與免疫功能相關的外周組織中，包括巨噬細胞、B和T細胞以及外周神經(jīng)末梢中以及肥大細胞上(Pertwee，R.G.，Prog.Neurobiol.63569-611，2001)。雖然已經(jīng)充分地研究了由主要存在于CNS中的CB1介導的作用，但是由CB2介導的作用目前仍然在解釋中。
利用放射性標記的THC類似物，諸如[3H]CP-55940確定受體的神經(jīng)解剖學分布(Elphick，M.R.& Egertova，M.，Phil.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.356381-408，2001)。人們發(fā)現(xiàn)最高濃度的大麻堿結(jié)合位點，特異性CB1受體存在于在參與運動的腦區(qū)域基底神經(jīng)節(jié)和小腦中。受體的一個亞群表達在脊神經(jīng)后根神經(jīng)節(jié)的外周末梢。有人認為大麻堿的止痛作用在解剖學上比它們的運動作用更明顯的位置處介導。其它技術(shù)包含免疫組織化學、利用特異性轉(zhuǎn)錄本的原位雜交分析(Galiegue，S.等人，Eur.J.Biochem.23254-61，1995)以及基因敲除小鼠(Buckley，N.E.等，Eur.J.Pharmacol.396141-9，2000)已被用來幫助對受體表達圖譜與功能的理解。CB2受體不在大腦中表達，但是在免疫組織中尤為豐富，比CB1的表達水平高10-100倍。在脾臟和扁桃體中，CB2 mRNA的含量相當于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中CB1 mRNA的含量。在主要的人類血細胞亞群中，CB2 mRNA的分布圖顯示重要的變化，即在B細胞中比在自然殺傷細胞或者單核細胞中水平更高以及在多形核嗜中性細胞、T8細胞和T4細胞中水平較低。
CB1基因敲除小鼠在行為分析中已經(jīng)顯示對大麻堿無反應，從而提供了通過活化主要存在于CNS中的CB1受體來清楚解釋包含鎮(zhèn)靜、幻覺以及精神錯亂和抗傷害感受的影響精神作用的分子證據(jù)。對CB2基因敲除小鼠的分析證實了CB2受體在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中發(fā)揮功能的事實。對來自CB2基因敲除小鼠的脾、淋巴結(jié)和胸腺的細胞的FACS分析確定了CB2不影響免疫細胞的發(fā)育和分化，但是介導Δ9-THC的抑制作用。
由于CB2受體在免疫細胞和神經(jīng)元的亞群中的限制性表達，所以選擇性CB2配體具有治療學價值(Pertwee，R.G.Curr.Med.Chem.6635-64，1999)。特別重要的是那些對CB2受體具有高親合性和高特異性的化合物。這些化合物可以賦予CB2激動劑(agonism)的優(yōu)點同時避免了在對CB1受體具有親合性的化合物中發(fā)現(xiàn)的不良副作用。這種化合物可以有效治療自身免疫疾病，包括但不限于多發(fā)性硬化、類風濕性關節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、重癥肌無力、I型糖尿病、肝炎、炎性腸病或者過敏性腸綜合征、牛皮癬的自身免疫性疾病及其他免疫相關的紊亂，包括但不限于器官移植中的組織排斥、吸收不良綜合征諸如脂瀉病、肺疾病諸如哮喘和Sjgren氏綜合癥。
大麻堿受體的發(fā)現(xiàn)以及最近對能夠激活CB受體的內(nèi)源性配體內(nèi)源性大麻堿(endocannabinoid)的鑒定已經(jīng)使我們理解了由大麻堿和相關化合物賦予的許多作用。除某些大麻堿激動劑有總的神經(jīng)保護作用外，還可以發(fā)現(xiàn)更具體的應用。因此，除了通過對由免疫細胞表達的CB2受體的作用進行免疫調(diào)節(jié)而可能緩和疾病以外，例如由內(nèi)源性大麻堿系統(tǒng)提供的對痙攣緊張性控制的證據(jù)暗示大麻堿激動劑可以輔助對肌肉痙攣以及多發(fā)性硬化中震顫的治療(Baker D.等人，F(xiàn)ASEB J.15300-2，2001)。大麻堿激動劑也被證明有助于治療癌癥以及HIV/AIDS患者的肌肉痙攣(Hall W.D.，Degenhardt L.J.& Currow D.Med.J.Aust.17539-40，2001)以及神經(jīng)性肌肉失調(diào)。
CB1受體的活化除了鎮(zhèn)靜以及不希望的影響精神的作用以外，在治療疼痛以及炎癥的治療中具有治療效果。大麻堿不僅通過對傷害應答的神經(jīng)元的作用抑制急性疼痛而且還調(diào)節(jié)持續(xù)的疼痛以及炎癥誘導的行為超敏反應。除了大麻堿的主要作用外，它們也抑制損傷部位的疼痛，并且有趣的是大麻堿在周圍神經(jīng)中的抗炎以及抗痛覺過敏作用也可以涉及CB2受體介導的活性。選擇性激活CB2受體的化合物有可能作為免疫調(diào)節(jié)劑并且為自身免疫性疾病以及相關紊亂提供治療方法。另外，已經(jīng)證明選擇性CB2受體激動劑可用于治療炎癥和疼痛，心肌缺血以及某些類型的癌癥。THC，以及迄今為止鑒定的兩種主要的內(nèi)源配體，花生四烯酰乙醇酰胺(arachidonoylethanolamide)(anandamide或者AEA)(Devane，W.A.等人，Science 2581946-9，1992)以及2-花生四烯酰甘油(arachidonylglycerol)(2-AG)(Sugiura，T.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.21589-97，1995)通過結(jié)合到這兩種大麻堿受體發(fā)揮它們大部分的作用。
幾個合成的化合物已經(jīng)顯示出對CB2受體的結(jié)合比對CB1受體具有更高的親合性(Pertwee，R.G.，Expert Opin.Investig.Drugs 91553-71，2000)。大麻堿受體激動劑包括四個主要的化合物組。典型的大麻堿保持了THC的二苯并吡喃環(huán)系，而非典型的大麻堿包括缺乏吡喃環(huán)的二環(huán)或者三環(huán)類似物。氨基烷基吲哚以及類似物組成第三族，而包含anandamide及其它脂肪酸衍生物的內(nèi)源性大麻堿組成第四族。例如，L-759656是典型的大麻堿類似物，而HU-308是二環(huán)類似物。兩者都具有300-400的CB2/CB1結(jié)合親合性比值，并且兩者都已經(jīng)在功能分析中表現(xiàn)出有效和特異的CB2激動劑(Hanus，L.等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 9614228-33，1999；Ross，R.A.等，Br.J.Pharmacol.126665-72，1999)。
將CB2受體的活化與治療學特性聯(lián)系起來的證據(jù)是多方面的。大麻堿特異性地通過活化CB2參與心臟保護，抗缺血以及包含心律不齊的再灌注作用最近在PCT專利申請WO 01/28588中以及被Krylatov等人(Krylatov A.V.等，Bull.Exp.Biol.Med.131523-5，2001)描述，其公開內(nèi)容在此處引入作為參考。大麻堿由于能夠誘導各種類型的腫瘤，包含動物模型的肺腺癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，甲狀腺上皮瘤以及皮膚非黑色素瘤的退化，可能是潛在的抗腫瘤劑。某些腫瘤，特別是神經(jīng)膠質(zhì)瘤表達CB2受體。Guzman等人(Galve-Roperh，I.等人，Nat.Med.6313-9，2000；Guzman，M.，Sanchez，C.，Galve-Roperh，I.，J.Mol.Med.78613-25，2001)已經(jīng)證實THC以及WIN55212-2誘導動物體內(nèi)惡性腦腫瘤的退化或者根除，前者THC是天然的配體，而后者WIN55212-2為合成的大麻堿。大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細胞系表達CB2并且根據(jù)用選擇性CB拮抗劑的研究，已經(jīng)有人認為任何一種受體的活化都可以引起細胞程序性死亡。
內(nèi)源性大麻堿系統(tǒng)在免疫抑制中的作用是許多研究的焦點(Berdyshev，E.V.Chem.Phys.Lipids 108169-90，2000)。Anandamide(AEA)，棕櫚酰乙醇酰胺(PEA)以及2-AG顯示出下調(diào)多種實驗系統(tǒng)中的免疫應答并且用作抗炎藥和免疫抑制劑。
THC因其止痛特性而眾所周知。兩種主要的內(nèi)源性配體，AEA和2-AG已經(jīng)顯示出起止痛劑的作用，并且可以通過結(jié)合到兩種大麻堿受體而發(fā)揮它們的作用(Calignano，A.等，Nature 394277-81，1998)。因此CB2受體或者假定的CB2樣受體的激動劑可用作外周、內(nèi)臟、神經(jīng)性、炎癥以及關聯(lián)痛的抑制劑。此外，CB2受體配體可以是防止CNS中毒。
美國專利4,208,351公開了在制備典型的三環(huán)大麻堿立體結(jié)構(gòu)選擇性過程中作為中間體的任選的旋光活性二環(huán)化合物。然而，沒有將治療活性歸因于中間體，也沒有提到這種化合物結(jié)合大麻堿受體的能力，因此就沒有預想到包括這種化合物的藥物組合物。
美國專利4,282,248公開了蒎烯衍生物的兩種同分異構(gòu)體的混合物以及單獨的異構(gòu)體。包含止痛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制、鎮(zhèn)靜以及鎮(zhèn)定活性的治療活性歸因于所述化合物，但是該公開內(nèi)容沒有教導所述化合物會結(jié)合任何大麻堿受體。
美國專利5,434,295公開了一族新的4-苯基蒎烯衍生物，并且教導如何將所述化合物利用在用于治療與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害相關的各種病理學癥狀的藥物組合物中。這個公開內(nèi)容既沒有教導也沒有暗示任何這些衍生物對于外周大麻堿受體是選擇性的。國際專利申請WO01/32169公開了一族二環(huán)化合物，包含作為CB2特異性激動劑的HU-308，并且舉例說明了它們在治療疼痛和炎癥、自身免疫性疾病、胃腸機能紊亂以及作為降血壓劑中的應用。
美國專利6,013,648公開了作為CB2特異性激動劑并且可能用于制備免疫調(diào)節(jié)藥物的吲哚衍生物。國際性專利申請WO 01/28497公開了對CB2受體顯示出高親合性的新的二環(huán)大麻堿類似物。對專業(yè)技術(shù)人員而言，顯而易見的是當參考在本申請中采用的命名法時，上述專利中的化合物為立體化學取向，其中C-1、C-4和C-5為R。然而，還沒有合成相應的(+)α-蒎烯衍生物，并且它們的治療活性是未知的。
很清楚本發(fā)明明確地排除了已知的化合物，包括那些公開在美國專利4,208,351，4,282,248和5,434,295和國際專利申請WO 01/32169中的化合物；雖然這些化合物的某些新特性同樣要求了保護的權(quán)利。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供新的α-蒎烯衍生物及其組合物。尤其是，優(yōu)選的化合物顯示對外周大麻堿受體CB2的特異性結(jié)合親合性，因此本發(fā)明提供了包括特異性治療用CB2結(jié)合配體的治療方法。這個方法涉及適當配制的藥物組合物的應用。本發(fā)明的另一目的是提供能夠體內(nèi)發(fā)揮它們的CB2受體-特異性作用的CB2結(jié)合配體。本發(fā)明進一步提供了通過給需要的個體施用包含作為活性成分的治療有效量的CB2特異性配體的藥物組合物以預防和治療疾病的方法。
根據(jù)本發(fā)明的第一個實施方案，我們公開了下列通式(I)的化合物及其藥用鹽、酯或者溶劑化物
式I 式I具有特異性立體化學結(jié)構(gòu)，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質(zhì)子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質(zhì)子為反式；并且其中R1選自(a)O或者S，(b)(R′)2，其中每次出現(xiàn)的R′獨立地選自氫、氰基、-OR″、-N(R″)2，飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″或者C1-C6烷基-N(R″)2，其中每次出現(xiàn)的R″獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出現(xiàn)的R獨立地選自氫或者飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基，并且(c)NR″或者N-OR″，其中R″如前所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)鹵素，(b)-R″、-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出現(xiàn)的R″如前所定義，(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，R″如前所定義，以及(d)由-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作為末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基，以及每次出現(xiàn)的Re選自氫和如前所定義的Rd；和R4選自(a)R，其中R選自氫、鹵素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2、SR、以及C(S)R，其中每次出現(xiàn)的R如前所定義，(b)飽和或者不飽、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基-R，其中R如前所定義，(c)芳香環(huán)，其可在任一位置由R進一步取代，其中R如前所定義，以及(d)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基，任選地以芳香環(huán)作為末端，所述芳香環(huán)可以如(c)所定義被進一步取代；附帶條件是當R1為O并且R2和R3為OH時，那么R4不是直鏈或者支鏈的C5-C10烷基、C5-C10烯基、C5-C8環(huán)烷基以及C5-C8環(huán)烯基。
根據(jù)目前優(yōu)選的實施方案，我們現(xiàn)在公開通式(I)的化合物，其中R1為O、CH2或者N-OH，R2和R3各自獨立地為H、OH、OCH3、琥珀酸酯、延胡索酸酯或者二乙基磷酸酯，并且R4為1，1-二甲基-戊基、1，1-二甲基庚基、1，1-二甲基-戊-4-烯基、1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-5-溴代-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基，1，1，3-三甲基-丁基，1-甲基-1-對氯苯基-乙基或者1-乙基-1-甲基-丙基，附帶條件如對式(I)的定義。
據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，我們公開下列通式(II)的化合物及其藥用鹽、酯或溶劑化物
式II 式II具有特異性立體化學結(jié)構(gòu)，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質(zhì)子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質(zhì)子為反式，并且C-2------C-3為任選的雙鍵；并且其中R5選自(a)鹵素或者氫，(b)-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出現(xiàn)的R″獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出現(xiàn)的R獨立地選自氫或飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基，(c)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基-SR″或者C1-C6烷基-S(O)(O)NR″，其中R″如前所述，(d)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，其中每次出現(xiàn)的R″如前所定義，(e)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基-S(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)ORb，其中Rb如前所定義，以及(f)Rc，其中Rc選自飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀C1-C6烷基，C1-C6烷基-OR″，C1-C6烷基-N(R″)2，C1-C6烷基-C(O)OR″，以及C1-C6烷基-C(O)N(R″)2，其中每次出現(xiàn)的R″如前所定義；R2和R3各自獨立地選自
(a)鹵素，(b)-R″，-OR″，-N(R″)2，-SR″，-S(O)(O)NR″，其中每次出現(xiàn)的R″如前所述，(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，其中R″如前所定義，以及(d)以-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作為末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或者-OC(ORd)-鏈，其中Rd為飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀C1-C6烷基，而且每次出現(xiàn)的Re選自氫和如前所定義的Rd；并且R4選自(a)R，其中R選自氫、鹵素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2，SR，和C(S)R，其中每次出現(xiàn)的R如前所定義；(b)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀C1-C12烷基-R，其中R如前所定義，(c)芳香環(huán)，其可在任一位置由R進一步取代，其中R如前所定義，以及(d)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基，任選地以芳香環(huán)作為末端，所述芳香環(huán)可以如(c)所定義進一步取代；附帶條件是當R5為Rc時，那么R4不是直鏈或者支鏈的C1-C12烷基鏈，直鏈或者支鏈飽和的-O-C2-C9烷氧鏈，其任選末端碳由苯基取代，以及直鏈或者支鏈飽和的C1-C7烷基鏈，其以羥基或者直鏈或者支鏈飽和的O-C1-C5烷氧鏈作為末端。
根據(jù)目前優(yōu)選的實施方案，我們現(xiàn)在公開通式(II)的化合物，其中R5為CH2OC(O)C(CH3)3、OH或者CH3，R2和R3各自獨立地為OH、H或者二乙基磷酸酯，R4為CH2OC(O)(CH2)3CH3、1，1-二甲基-庚基、1，1-二甲基-乙基-苯基或者1，1-二甲基-庚-6-炔基，并且在C-2和C-3之間有一個任選的雙鍵，附帶條件如對式(II)的限定。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選的實施方案，我們公開通式(I)的CB2結(jié)合化合物式I 式I具有特異性立體化學結(jié)構(gòu)，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質(zhì)子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質(zhì)子為反式；并且其中R1-R4取代基如上所定義。
根據(jù)本發(fā)明一可選擇的優(yōu)選實施方案，我們公開通式(II)的CB2結(jié)合化合物式II 式II具有特異性立體化學結(jié)構(gòu)，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質(zhì)子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質(zhì)子為反式，以及C-2------C-3為任選的雙鍵；并且其中取代基R2-R5如對式(II)的限定以及其中所限定的附帶條件。
本發(fā)明還包括含有作為活性成分的式(III)的化合物或其藥用鹽、酯或溶劑化物的藥物組合物
式(III) 式III具有特異性立體化學結(jié)構(gòu)，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質(zhì)子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質(zhì)子為反式；并且其中R1選自(a)O或者S，(b)C(R′)2，其中每次出現(xiàn)的R′獨立地選自氫、氰基、-OR″、-N(R″)2，飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″或者C1-C6烷基-N(R″)2，其中每次出現(xiàn)的R″獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出現(xiàn)的R獨立地選自氫，或者飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基，并且(c)NR″或者N-OR″，其中R″如前所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)鹵素，(b)-R″、-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出現(xiàn)的R″如前所定義，(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，R″如前所定義，以及(d)以-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作為末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或者-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或者不飽和、直鏈、支鏈的或者環(huán)狀的C1-C6烷基，以及每次出現(xiàn)的Re選自氫和如前所定義的Rd；和R4選自(a)R，其中R選自氫、鹵素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2、SR、以及C(S)R，其中每次出現(xiàn)的R如前所定義，(b)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基-R，其中R如前所定義，(c)芳香環(huán)，其可在任一位置由R進一步取代，其中R如前所定義，以及(d)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基，其任選地以芳香環(huán)作為末端，所述芳香環(huán)可以如(c)所定義進一步取代。
根據(jù)目前優(yōu)選的實施方案，我們現(xiàn)在公開包含作為活性成分的通式(III)的化合物的藥物組合物，其中R1為O、CH2或者N-OH，R2和R3各自獨立地為H、OH、OCH3、琥珀酸酯、延胡索酸酯或者二乙基磷酸酯，并且R4為1，1-二甲基-戊基、1，1-二甲基庚基、1，1-二甲基-戊-4-烯基、1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-5-溴-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基，1，1，3-三甲基-丁基，1-甲基-1-對氯苯基-乙基或者1-乙基-1-甲基-丙基。
本發(fā)明還包括含有作為活性成分的式(II)化合物或其藥用鹽、酯或溶劑化物的藥物組合物式II
式II具有特異性立體化學結(jié)構(gòu)其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質(zhì)子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質(zhì)子為反式，并且C-2------C-3為任選的雙鍵；以及其中R5選自(a)鹵素或者氫，(b)-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出現(xiàn)的R″獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出現(xiàn)的R獨立地選自氫，或者飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基，(c)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀C1-C6烷基-SR″或者C1-C6烷基-S(O)(O)NR″，其中R″如前所述，(d)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”以及C1-C6烷基-N(R”)2，其中每次出現(xiàn)的R”如前所定義，(e)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基-S(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)ORb，其中Rb如前所定義，以及(f)-Rc，其中Rc選自飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基，C1-C6烷基-OR″，C1-C6烷基-N(R″)2，C1-C6烷基-C(O)OR″，以及C1-C6烷基-C(O)N(R″)2，其中每次出現(xiàn)的R″如前所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)鹵素，(b)-R″，-OR″，-N(R″)2，-SR″，-S(O)(O)NR″，其中每次出現(xiàn)的R″如前所述，(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，其中R″如前所定義，以及(d)以-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作為末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或者-OC(ORd)-鏈，
其中Rd為飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀C1-C6烷基，而且每次出現(xiàn)的Re選自氫和如前所定義的Rd；以及R4選自(a)R，其中R選自氫、鹵素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2、SR，和C(S)R，其中每次出現(xiàn)的R如前所定義；(b)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基-R，其中R如前所定義，(c)芳香環(huán)，其可在任一位置由R進一步取代，其中R如前所定義，以及(d)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基，其任選地以芳香環(huán)作為末端，所述芳香環(huán)可以如(c)所定義進一步取代；附帶條件是當R5為Rc時，那么R4不是直鏈或者支鏈的C1-C12烷基鏈，直鏈或者支鏈飽和的-O-C2-C9烷氧鏈，其任選末端碳由苯基取代，并且直鏈或者支鏈飽和的C1-C7烷基鏈，其以羥基或者直鏈或者支鏈飽和的O-C1-C5烷氧鏈作為末端。
根據(jù)目前優(yōu)選的實施方案，我們現(xiàn)在公開包含作為活性成分的通式(II)的化合物的藥物組合物，其中R5為CH2OC(O)C(CH3)3、OH或者CH3，R2和R3各自獨立地為OH、H或者二乙基磷酸酯，R4為CH2OC(O)(CH2)3CH3，1，1-二甲基-庚基，1，1-二甲基-乙基-苯基或者1，1-二甲基-庚-6-炔基，并且在C-2和C-3之間具有任選的雙鍵，附帶條件如式(II)所定義。
除了傳統(tǒng)活性成分以外，新的組合物可以包含生產(chǎn)生理學可接受和穩(wěn)定制劑所必需的藥用載體、稀釋劑以及賦形劑。
藥物組合物可以通過任一傳統(tǒng)并且合適的路徑進行給藥，包括口服、胃腸外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、損傷內(nèi)、皮下、透過皮膚、鞘內(nèi)、直腸或者鼻內(nèi)給藥。
本發(fā)明的另一方面提供了通過刺激CB2受體治療病人的方法，所述方法包括給所述病人施用包含治療有效量的本發(fā)明通式(II)和(III)化合物的藥物組合物。
因此，本發(fā)明提供了給需要治療的個體施用治療有效量的通式(II)和(III)化合物的方法，用于免疫調(diào)節(jié)和對CB2受體調(diào)節(jié)敏感的癥狀。所述癥狀包括但不限于自身免疫疾病，包括類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、全身性紅斑狼瘡、重癥肌無力、I型糖尿病、肝炎和牛皮癬；以及免疫相關疾病，包括但不限于器官移植中的組織排斥、吸收不良綜合征諸如脂瀉病、肺疾病諸如哮喘以及Sjgren氏綜合癥，包含炎性腸病的炎癥，包含外周、內(nèi)臟、神經(jīng)性、炎性以及關聯(lián)痛的疼痛，肌肉痙攣，、包含心律不齊、高血壓和心肌缺血的心血管紊亂，包含中風、偏頭痛和叢發(fā)性頭痛的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，包含帕金森氏癥、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、亨廷頓氏舞蹈癥、朊病毒相關神經(jīng)退行性病變的神經(jīng)退行性疾病，CNS中毒以及某些類型的癌癥。
本發(fā)明包括通式(II)和III的化合物在制備用于治療和預防自身免疫性疾病的藥物中的應用，所述自身免疫性疾病包括但不限于如說明書中所示的風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、全身性紅斑狼瘡、重癥肌無力、I型糖尿病、肝炎、牛皮癬和免疫相關的紊亂，包括但不限于器官移植中的組織排斥、吸收不良綜合征諸如脂瀉病、肺疾病諸如哮喘以及Sjgren氏綜合癥，包含炎性腸病的炎癥，包含外周、內(nèi)臟、神經(jīng)性、炎性以及關聯(lián)痛的疼痛，肌肉痙攣，包含心律不齊、高血壓和心肌缺血的心血管紊亂，包含中風、偏頭痛和叢發(fā)性頭痛的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，包含帕金森氏癥、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、亨廷頓氏舞蹈癥、朊病毒相關神經(jīng)退行性病變的神經(jīng)退行性疾病，CNS中毒以及某些類型的癌癥。
雖然本發(fā)明的化合物和組合物具體目的是用作外周大麻堿受體CB2的配體，但是不管是否通過CB2受體介導它們可能同時具有被稱作“非典型大麻堿”類別的化合物的其它所希望的治療特征。因此通式(I)到(III)的化合物和組合物除了它們的免疫調(diào)節(jié)活性以外還具有神經(jīng)保護特性。
如下舉例所示，現(xiàn)在我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)已知的CB2特異性激動劑HU-308，其化學名全稱為(+){4-[4-(1，1-二甲基庚基)-2，6-二甲氧基-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-烯-2-基}-甲醇，也以(+)4-[2，6-二甲氧基-4-(1，1-二甲基庚基)苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-烯-2-甲醇公開在WO 01/32169中，其不僅在治療外周疼痛而且在治療神經(jīng)性疼痛中有效。而且，現(xiàn)在我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HU-308在治療和預防帕金森氏癥中尤其有效。


為了幫助理解本發(fā)明尤其是在實施例中給出的數(shù)據(jù)，給出下列附圖圖1顯示選定的二環(huán)化合物結(jié)合到CB1和CB2人類大麻堿受體。
圖2顯示選定的二環(huán)化合物對活化的巨噬細胞分泌作用的影響。試驗組A顯示單劑量對IL-1β分泌作用的影響。試驗組B顯示各種劑量對PGE2分泌作用的影響。
圖3顯示了各種劑量的本發(fā)明化合物對激活的T細胞的IL-2分泌作用的影響。
圖4顯示了各種劑量的本發(fā)明化合物在多發(fā)性硬化的EAE模型中的作用。
圖5顯示了各種劑量的已知CB2激動劑HU-308以及本發(fā)明的化合物在過敏或者其它免疫反應的DTH模型中的作用。
圖6顯示了已知的CB2激動劑HU-308在帕金森氏癥的MPTP模型中的作用。
圖7顯示了兩種劑量的本發(fā)明化合物在慢性神經(jīng)性疼痛的收縮神經(jīng)損傷模型中的作用。
圖8顯示了各種劑量的本發(fā)明化合物在急性外周疼痛的Tail Flick模型中的作用。試驗組A給出處理后30分鐘獲得的結(jié)果，試驗組B是處理后90分鐘獲得的結(jié)果。
圖9顯示了與介質(zhì)和嗎啡相比，單劑量的本發(fā)明化合物在5.5小時的時間內(nèi)在急性外周疼痛的Tail Flick模型中的作用。試驗組A給出的結(jié)果是潛伏時間，而試驗組B給出的結(jié)果是顯示潛伏時間比介質(zhì)處理的動物高兩倍的處理組中動物的百分比。
圖10顯示本發(fā)明的化合物與嗎啡相比對Tail Flick模型中測定的耐受性發(fā)展的影響。試驗組A顯示的結(jié)果是潛伏時間，而試驗組B顯示的結(jié)果以疼痛消失的動物的百分比表示。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了屬于非典型大麻堿的新化合物，含有這些化合物的藥物組合物以及使用這種化合物和組合物的方法。這種類型的化合物顯示了對大麻堿受體的親合性。本發(fā)明優(yōu)選的新化合物顯示了對外周人類大麻堿受體CB2的親合性。本發(fā)明的組合物已經(jīng)顯示出具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、止痛、神經(jīng)保護以及某些抗腫瘤的特性。一些化合物的作用可以引起參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)或者參與這種過程的信號轉(zhuǎn)導組分的調(diào)節(jié)。
大麻堿被認為是主要通過受體介導的機制發(fā)揮它們的生理學作用，但是已經(jīng)報道了非受體介導的活性(Felder C.C.等，Mol.Pharmacol.42838-45，1992)。而且，發(fā)展的藥理學證據(jù)顯示除了迄今為止發(fā)現(xiàn)的CB1和CB2以外還存在其它種類的大麻堿受體(Howlett A.C.等人，Pharmacol.Review 54161-202，2002)。因此，雖然本發(fā)明化合物最可能的作用機制是通過它們選擇性結(jié)合到CB2受體并且與特異性信號轉(zhuǎn)導途徑功能性偶聯(lián)得以實現(xiàn)，但是我們不能排除其它的機理，例如通過結(jié)合到其它尚未鑒定的大麻堿受體或者通過非受體介導的途徑或者這些機制的組合。
在本發(fā)明的說明書中，術(shù)語“前體藥物”表示在體內(nèi)例如通過在血液中的水解迅速轉(zhuǎn)化成式(I)到(III)的母體化合物的化合物。一些式(I)到(III)的化合物能夠進一步形式藥用鹽和酯?！八幱名}和酯”是指可以藥用并且具有期望的藥理學特性的任一鹽和酯。這種鹽包含可能來源于包含氨基酸的無機或者有機酸或者無機或者有機堿的鹽，所述酸或堿在任何情況下都沒有毒性或者符合要求。本發(fā)明同樣在其范圍內(nèi)包含式(I)到(III)的化合物的溶劑化物及其鹽，例如水合物。所有這些藥物形式都將包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求中使用的“預防有效的”是用來限定化合物的量以實現(xiàn)預防、降低或者根除紊亂發(fā)生的風險同時避免不良副作用。術(shù)語“治療有效”是用來限定所需的化合物的量，從而一旦紊亂不能進一步延緩以及病人不再無征狀，將實現(xiàn)減輕、減少紊亂的發(fā)展或者治療紊亂而同時沒有副作用的目的。本發(fā)明的組合物為預防性的和治療性的。
為了治療目的的“個體”或者“病人”包含受到對所述治療具有有效治療效果的任一疾病感染的所有人類或者哺乳動物受試對象。
基于它們的抗炎和免疫調(diào)節(jié)特性，應該認識到本發(fā)明的組合物可用于治療具有涉及它們的病源學或者發(fā)病機理的炎性或者自身免疫機制的癥狀，所述癥狀的例子為包含類風濕性關節(jié)炎、關節(jié)炎的關節(jié)炎，多發(fā)性硬化，全身性紅斑狼瘡(SLE)，重癥肌無力，I型糖尿病，肝炎和牛皮癬，免疫相關的紊亂包含但不限于器官移植中的組織排斥，吸收不良綜合征諸如脂瀉病，肺疾病諸如哮喘和Sjgren氏綜合癥，炎性腸病以及風濕性疾病。
雖然本發(fā)明的化合物和組合物是指CB2配體，但是它們共有這類非典型大麻堿的其它特性，包含神經(jīng)保護的特性(美國專利5,434,295)。由于它們的神經(jīng)保護特性，應該認識到根據(jù)本發(fā)明的組合物將用于治療包含但不限于中風、偏頭痛和叢發(fā)性頭痛的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂。本發(fā)明的組合物也可有效治療某些慢性退行性疾病，所述退行性疾病的特征在于逐漸的選擇性神經(jīng)元喪失。在這一點上，預計本發(fā)明的組合物預計在治療帕金森氏癥、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、亨廷頓氏舞蹈病和朊病毒相關的神經(jīng)退行性變中是治療有效的。由CB2激動劑賦予的神經(jīng)保護還可以有效預防和/或治療神經(jīng)毒劑，諸如神經(jīng)毒氣，以及其它由化學或者生物制劑引起的大腦或者神經(jīng)組織的損害。
由于它們的止痛的特性，應該認識到本發(fā)明的組合物將用于治療包含外周、內(nèi)臟、神經(jīng)性、炎性和關聯(lián)痛的疼痛。本發(fā)明的組合物也可有效保護心臟預防心律不齊、高血壓和心肌缺血。本發(fā)明的組合物也可有效治療肌肉痙攣和顫動。
本發(fā)明的另一特征是公開的化合物能夠預防或者治療某些癌癥，包含惡性腦腫瘤、皮膚腫瘤、肺腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、甲狀腺上皮瘤，其中CB2結(jié)合配體可以引發(fā)腫瘤細胞的細胞程序性死亡以及抑制腫瘤的血管生成。
而且，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些優(yōu)選的CB2結(jié)合化合物也可通過調(diào)節(jié)參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥的基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用。
此外，我們現(xiàn)在公開被發(fā)現(xiàn)有效治療外周疼痛的已知的CB2特異性激動劑HU-308出乎意料地也可以有效治療神經(jīng)性疼痛，正如通過嚙齒動物模型中坐骨神經(jīng)的慢性收縮所評定的。
另外，同樣發(fā)現(xiàn)HU-308顯著降低了用神經(jīng)毒素MPTP處理的小鼠黑質(zhì)中產(chǎn)生的細胞死亡的程度。這就提示這種化合物在治療帕金森氏癥中可以證實特別有效。
顯示出對CB2受體具有高親合性和特異性的二環(huán)化合物已經(jīng)由Makriyannis及合作者公開在國際專利申請WO 01/28497中。本領域技術(shù)人員會辨別出在此公開內(nèi)容中公開的化合物與本發(fā)明的化合物具有相反的立體化學結(jié)構(gòu)，因為如此公開物內(nèi)容式I和II所示，四元環(huán)的二甲基位于萜烯環(huán)平面的下方而芳基位于這個平面的上方。根據(jù)本發(fā)明中采用的命名法，Makriyannis的化合物為立體化學取向，其中C-1、C-4和C-5為R。
通常，已經(jīng)可以在功能上區(qū)分大麻堿和大麻堿相關化合物的R和S對映異構(gòu)體?；衔颒U-210和HU-211舉例說明了這種情況。HU-210為合成的大麻堿7-羥基-Δ6-四氫大麻堿-1，1-二甲基-庚基的(-)(3R，4R)對映異構(gòu)體。HU-211為此化合物的(+)(3S，4S)對映異構(gòu)體。與HU-210相反，HU-211顯示出對大麻堿受體較低的親合性，因此不能治療精神性疾病。另外，HU-211作為非競爭性的NMDA-受體激動劑和神經(jīng)保護劑發(fā)揮作用，HU-210缺乏這兩種特性(美國專利5,284,867)。
本發(fā)明的發(fā)明者意想不到地發(fā)現(xiàn)與公開在WO 01/28497中的化合物相反的立體化學對映異構(gòu)體是有效的CB2受體配體。本發(fā)明的公開內(nèi)容教導(+)α-蒎烯的新衍生物，如式(I)到(III)所示，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質(zhì)子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質(zhì)子為反式。本發(fā)明的優(yōu)選化合物與它們已知對映異構(gòu)體相比不僅對CB2具有更高的親合性和更好的選擇性而且通過試驗結(jié)果證實在體內(nèi)更有效。關于這一點，應該注意到對公開在WO 01/28497中的對映異構(gòu)體而言，發(fā)明者只測試了它們的結(jié)合活性而沒有在體外和體內(nèi)測試其它生物活性。
而且，本發(fā)明涉及這些新CB2配體在制備預防或者治療自身免疫性疾病和相關紊亂、炎癥、疼痛、肌肉痙攣、心血管紊亂、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、神經(jīng)退行性疾病、CNS中毒和某些類型的癌癥的化合物中的應用。
在本發(fā)明中，我們將參考環(huán)狀結(jié)構(gòu)中下列位置的編碼，其中位置1，4和5為手性中心。本發(fā)明公開的化合物的立體化學如式(IV)所示，其中C-5為S、C-1和C-5位置的質(zhì)子彼此間為順式，而在C-4和C-5位置的質(zhì)子為反式
式IV 本發(fā)明中，結(jié)合親合性由IC50值表示，也就是測試化合物置換來自CB受體的50％放射性標記的激動劑的濃度。優(yōu)選的化合物顯示出對CB2結(jié)合的IC50值為50nM或者更低，優(yōu)選地30nM或者更低，更優(yōu)選地10nM或者更低，最優(yōu)選地1nM或者更低。“CB2特異性或者選擇性的”表示化合物具有的CB2/CB1結(jié)合親合性比值至少10，優(yōu)選地20，更優(yōu)選地50并且最優(yōu)選地100或者更高。優(yōu)選地，可以獲得人類CB1和CB2受體的這些比值。對CB2的選擇性表示為CB2/CB1親合性，通過如下方式進行計算用測試化合物置換CB1特異性放射性配體獲得的IC50值除以測試化合物置換CB2特異性放射性配體獲得的IC50值，即IC50CB1/IC50CB2。一些本發(fā)明優(yōu)選的化合物不必共有這兩種特性，換句話說，一些化合物對CB2的IC50具有1nM或者更低但是比例僅僅為約30。
貫穿本說明書，本發(fā)明的某些化合物可能通過大寫字母而不是通過它們完整的化學名稱給出。烷基取代基可以為飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀，只有當烷基鏈中碳原子的數(shù)目大于或等于3時才是后者的情況。OC(O)R代表酯，OC(O)NR為氨基甲酸酯，OC(S)R為硫酯，NR2為胺，NRC(O)R為酰胺，NRC(O)NR為尿素，NRC(S)R為硫代酰胺，SR為硫醇或者硫化物，S(O)R為亞砜，SC(O)R為硫酯，SC(O)NR為硫代氨基甲酸酯，SC(S)R為二硫酯，S(O)(O)R為砜，S(O)(O)OR為磺酸酯，S(O)(O)NR為磺酰胺，S(O)(O)NC(O)R為?；酋０罚琒(O)(O)NC(O)NR為硫脲，當R為氫或者烷基鏈時S(O)(O)NC(S)R為硫代?；酋０?。
本發(fā)明涉及通式(I)的化合物式I 式I具有特異性立體化學結(jié)構(gòu)，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質(zhì)子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質(zhì)子為反式；并且其中取代基R1-R4為式(I)所限定以及其中限定的附帶條件。
根據(jù)目前優(yōu)選的實施方案，我們現(xiàn)在公開通式(I)的化合物，其中R1為O、CH2或者N-OH，R2以及R3各自獨立地為H、OH、OCH3、琥珀酸酯、延胡索酸酯或者二乙基磷酸酯，并且R4為1，1-二甲基-戊基、1，1-二甲基-庚基、1，1-二甲基-戊-4-烯基、1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-5-溴代-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基，1，1，3-三甲基-丁基，1-甲基-1-對氯苯基-乙基或者1-乙基-1-甲基-丙基，附帶條件如對式(I)的限定。
根據(jù)其它目前優(yōu)選的實施方案，我們現(xiàn)在公開通式(I)的化合物，其中R1是O，R2和R3為OCH3，而R4為1，1二甲基-庚基；R1為N-OH，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚-6-炔基；R1為O，R2和R3為OH，R4為1，1-二甲基-3-苯基-丙基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1-甲基-1-對氯苯基-乙基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-5-溴-戊基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-5-氰基-戊基；R1為O，R2為琥珀酸酯，R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為琥珀酸酯，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2為琥珀酸酯，R3為OH，而R4為1，1-二甲基-戊基；R1為O，R2為OH，R3為OCH3，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為H，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為CH2，R2和R3為OCH3，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為二乙基磷酸酯，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2為二乙基磷酸酯，以及R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為CH2，R2和R3為二乙基磷酸酯，而R4為1，1-二甲基-庚基；以及R1為O，R2為延胡索酸酯，R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚基。
本發(fā)明也涉及通式(II)的化合物式II 式II具有特異性立體化學結(jié)構(gòu)，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質(zhì)子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質(zhì)子為反式，以及C-2------C-3為任選的雙鍵；并且其中取代基R2-R5如對式(II)的限定以及其中所限定的附帶條件。
根據(jù)目前優(yōu)選的實施方案，我們現(xiàn)在公開通式(II)的化合物，其中R5是CH2OC(O)C(CH3)3、OH或者CH3，R2和R3各自獨立地為OH、H或者二乙基磷酸酯，R4為CH2OC(O)(CH2)3CH3，1，1-二甲基-庚基，1，1-二甲基-乙基-苯基或者1，1-二甲基-庚-6-炔基，并且在C-2和C-3之間具有任選的雙鍵，附帶條件如式(II)所定義。
根據(jù)其它目前優(yōu)選的實施方案，我們現(xiàn)在公開通式(II)的化合物，其中R5是OH，R2和R3為OH，R4為1，1二甲基-庚基，并且在C-2和C-3之間具有一單鍵；R5為CH3，R2和R3為OH，R4為1，1-二甲基-庚-6-炔基，并且在C-2和C-3之間具有一個雙鍵；R5為CH3，R2和R3為OH，R4為1，1-二甲基-乙基-苯基，并且在C-2和C-3之間具有一雙鍵；R5為OH，R2和R3為H，R4為1，1-二甲基-庚基，并且在C-2和C-3之間具有一單鍵；R5為CH3，R2和R3為OH，R4為CH2OC(O)(CH2)3CH3，并且在C-2和C-3之間具有一雙鍵；R5為OH，R2和R3為二乙基磷酸酯，R4為1，1-二甲基-庚基并且在C-2和C-3之間具有一單鍵。
本發(fā)明進一步涉及通式(I)的CB2結(jié)合化合物式I 式I具有特異性立體化學結(jié)構(gòu)，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質(zhì)子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質(zhì)子為反式；并且其中取代基R1-R4為對式(I)的定義。
本發(fā)明進一步涉及通式(II)的CB2結(jié)合化合物
式II 式II具有特異性立體化學結(jié)構(gòu)，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質(zhì)子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質(zhì)子為反式，并且C-2------C-3為任選的雙鍵；以及其中取代基R2-R5為對式(II)的限定以及其中所限定的附帶條件。
本發(fā)明涉及為了上述目的的藥物組合物，包括作為活性成分的通式(III)的化合物式III 式III具有特異性立體化學結(jié)構(gòu)，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質(zhì)子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質(zhì)子為反式；并且其中取代基R1-R4為對式(III)的定義。
根據(jù)目前優(yōu)選的實施方案，我們現(xiàn)在公開包括作為活性成分的通式(III)化合物的藥物組合物，其中R1為O、CH2或者N-OH，R2和R3各自獨立地為H、OH、OCH3、琥珀酸酯、延胡索酸酯或者二乙基磷酸酯，并且R4為1，1-二甲基-戊基、1，1-二甲基-庚基、1，1-二甲基-戊-4-烯基、1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-5-溴代-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基，1，1，3-三甲基-丁基，1-甲基-1-對氯苯基-乙基或者1-乙基-1-甲基-丙基。
根據(jù)目前其它優(yōu)選的實施方案，我們現(xiàn)在公開包括作為活性成分的通式(III)化合物的藥物組合物，其中R1是O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為OCH3，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為N-OH，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚-6-炔基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-3-苯基-丙基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1，1，3-三甲基-丁基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1-甲基-1-對氯苯基-乙基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-戊基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1-乙基-1-甲基-丙基；R1為O，R2和R3為OH，以及R4為1，1-二甲基-5-溴-戊基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-5-氰基-戊基；R1為O，R2為琥珀酸酯，R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為琥珀酸酯，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2為琥珀酸酯，R3為OH，而R4為1，1-二甲基-戊基；R1為O，R2為OH，R3為OCH3，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為H，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為CH2，R2和R3為OCH3，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為二乙基磷酸酯，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2為二乙基磷酸酯以及R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚基；R1為O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-戊-4-烯基；R1為CH2，R2和R3為二乙基磷酸酯，而R4為1，1-二甲基-庚基；以及R1為O，R2為延胡索酸酯，R3為OH，而R4為1，1-二甲基-庚基。
本發(fā)明進一步涉及用于上述目的的藥物組合物，包括作為活性成分的通式(II)的化合物式II
式II具有特異性立體化學結(jié)構(gòu)，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質(zhì)子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質(zhì)子為反式，并且C-2------C-3為任選的雙鍵；以及其中取代基R2-R5為式(II)的限定以及其中限定的附帶條件。
根據(jù)目前優(yōu)選的實施方案，我們現(xiàn)在公開包括作為活性成分的通式(II)化合物的藥物組合物，其中R5是CH2OC(O)C(CH3)3、OH或者CH3，R2和R3各自獨立地為OH、H或者二乙基磷酸酯，R4為CH2OC(O)(CH2)3CH3，1，1-二甲基-庚基，1，1-二甲基-乙基-苯基，或者1，1-二甲基-庚-6-炔基，并且在C-2和C-3之間具有任選的雙鍵，附帶條件如式(II)所定義。
根據(jù)其它目前優(yōu)選的實施方案，我們現(xiàn)在公開包括作為活性成分的通式(II)化合物的藥物組合物，其中R5是OH，R2和R3為OH，R4為1，1二甲基-庚基，并且在C-2和C-3之間具有一單鍵；R5為CH3，R2和R3為OH，R4為1，1-二甲基-庚-6-炔基并且在C-2和C-3之間具有一個雙鍵；R5為CH3，R2和R3為OH，R4為1，1-二甲基-乙基-苯基，并且在C-2和C-3之間具有一雙鍵；R5為OH，R2和R3為H，R4為1，1-二甲基-庚基，并且在C-2和C-3之間具有一單鍵；R5為CH3，R2和R3為OH，R4為CH2OC(O)(CH2)3CH3，并且在C-2和C-3之間具有一雙鍵；以及R5為OH，R2和R3為二乙基磷酸酯，R4為1，1-二甲基-庚基并且在C-2和C-3之間具有一單鍵。
本發(fā)明的新的非典型大麻堿最優(yōu)選地有效結(jié)合CB2受體，但是較弱地結(jié)合CB1受體，后者除了有效的治療作用外已知具有介導CNS中精神調(diào)理活性。
本發(fā)明進一步涉及利用本發(fā)明組合物在預防和治療如下疾病中的新的治療方法自身免疫疾病，包括類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、全身性紅斑狼瘡、重癥肌無力、I型糖尿病、肝炎和牛皮癬，以及免疫相關的紊亂，包括但不限于器官移植中的組織排斥、吸收不良綜合癥諸如脂瀉病、肺疾病諸如哮喘以及Sjgren氏綜合癥，包含炎性腸病的炎癥、包含外周、內(nèi)臟、神經(jīng)性、炎性以及關聯(lián)痛的疼痛，肌肉痙攣，包含心律不齊、高血壓和心肌缺血的心血管紊亂，包含中風、偏頭痛和叢發(fā)性頭痛的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，包含帕金森氏癥、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、亨廷頓氏舞蹈癥、朊病毒相關神經(jīng)退行性病變的神經(jīng)退行性疾病，CNS中毒以及某些類型的癌。
新的組合物除了活性成分以外可以包含傳統(tǒng)上對制備生理學上可接受和穩(wěn)定制劑所必需的藥用載體、稀釋劑以及賦形劑。對于具有溶解性問題的化合物而言，本發(fā)明的一些化合物在特征上是疏水的，并且具有較強的親油性，事實上不溶于水，具有表示為它們較高的辛醇/水分配系數(shù)和logP值，所以應該采用制備可接受劑型的制劑策略。能夠使本發(fā)明的化合物治療有效并且方便給藥是本發(fā)明不可分割的一部分。
對于水溶性化合物，將采用標準制劑?？梢酝ㄟ^將活性成分與作為藥用稀釋劑的傳統(tǒng)藥用成分，諸如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、環(huán)糊精、葡聚糖、甘油、polyglycolized甘油酯、tocopheryl聚乙二醇琥珀酸酯、十二烷基硫酸鈉、聚乙氧基化蓖麻油、非離子表面活性劑、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣和樹膠混合，制備用于口服給藥的固體組合物，諸如藥片、藥丸、膠囊、軟膠囊等。藥片或者藥丸可以包被或與本領域已知的藥用材料混合，諸如微晶纖維素和纖維素衍生物，諸如羥丙基甲基纖維素(HPMC)，以提供能夠延長作用或者持續(xù)釋放的劑型。其它固體組合物可以制備成用于直腸給藥的栓劑?？梢灾苽溆糜诳诜蛘咦⑸涞囊后w形式，所述給藥方式包含但不限于皮下、透皮、靜脈內(nèi)、鞘內(nèi)、損傷內(nèi)、接近或者進入腫瘤及其它腸胃外給藥途徑。液體組合物包含水溶液，存在或者不存在有機助溶劑，水或者油懸浮液，包含但不限于作為懸浮劑的環(huán)糊精，帶有食用油的加香乳劑，甘油三酸脂和磷脂以及酏劑和類似的藥用介質(zhì)。另外，本發(fā)明的組合物可以制成用于鼻內(nèi)等給藥的氣霧劑形式。本發(fā)明的局部藥物組合物可以與包含但不限于丙二醇、磷脂、甘油單酸酯、甘油二酯、甘油三酯、聚山梨酸酯、表面活性劑、水凝膠、礦脂或者其它本領域已知的賦形劑的藥用賦形劑配制成溶液、洗液、凝膠、乳油、油膏、乳劑或者粘著膜。
在它們用作藥劑之前，藥物組合物通常配制成單位劑量。用于人類的活性劑量一般在每公斤體重0.05mg到約50mg的范圍內(nèi)，給藥方案為每天1-4次。優(yōu)選的的劑量范圍是每kg體重從0.1mg到約20mg。然而，對本領域技術(shù)人員而言，顯而易見的是劑量將由主治醫(yī)師根據(jù)待治療的疾病、給藥方法、病人的年齡、體重、禁忌癥等進行確定。
參考下列的實施例將更全面的理解本發(fā)明的原理，所述實施例應以非限制性的方式解釋。
實施例合成實施例合成化合物A(-)-4-[4-(1，1-二甲基-庚基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
流程圖1中描述了化合物A的合成，其中苯二酚化合物的R部分為1，1-二甲基-庚基。
流程圖1 化合物AR＝1，1-二甲基-庚基化合物LR＝1，1-二甲基-戊基在-78℃的氮氣氣氛下，向含有正丁基鋰(196ml，2M)和44g叔丁醇鉀的3-頸瓶中逐滴添加50ml的(+)-α-蒎烯(1)。將反應物溫熱到室溫并連續(xù)攪拌48小時。然后將反應物冷卻到-78℃。添加硼酸三甲酯(113ml)的80ml醚溶液，然后將反應物溫熱到室溫并且再攪拌1小時。分離有機層，并用正己烷(3×80ml)萃取水層。用鹽水洗滌混合的有機相，并經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾并蒸干獲得化合物(2)％(+)-β-蒎烯。該流程根據(jù)Brown等人的方法進行(Brown H.C.等人，J.Org.Chem.541764-6，1989)。向(+)-β-蒎烯(2)(30.8g)中添加RuCl3(0.470g)，以及溶于250ml乙酸乙酯的芐基三丁基氯化銨(2.12g)。向這種混合物中逐滴添加高碘酸鈉(145.5g)的1.3L水溶液，在室溫下攪拌3小時并保存過夜。向反應混合物中添加250ml的乙酸乙酯。分離有機相，用500ml的鹽水、500ml的10％亞硫酸鈉洗滌，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾、減壓蒸發(fā)后獲得化合物(3)(-)-諾蒎酮。該流程根據(jù)Yuasa等人的方法進行(Yuasa Y.等人，J.Essent.Oil.Res.1039-42，1998)。將(-)-諾蒎酮(3)(14.86g)和對甲苯磺酸(1.48g)溶于異戊烯基乙酸酯(148ml)中。利用Dean-Stark裝置回流加熱反應混合物5小時以除去丙酮。減壓除去溶劑，將殘余物轉(zhuǎn)移到400ml醚中，用水洗滌，經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾并蒸發(fā)以獲得化合物(4)(+)諾蒎酮烯醇乙酸酯。這個流程基于由Archer等人對相反對映異構(gòu)體所開發(fā)的方法進行(Archer R.A.等人，J.Org.Chem.422277-84，1977)。向16.17g(+)-諾蒎酮烯醇乙酸酯(4)的202ml無水甲苯溶液中添加62.2g的Pb(OAc)4(之前在真空中經(jīng)P2O5/KOH干燥過夜)。反應混合物在80℃受熱3.5小時，冷卻，過濾，用飽和碳酸氫鈉洗滌。分離有機層，經(jīng)無水硫酸鈉干燥并在減壓下蒸發(fā)以產(chǎn)生(+)-6，6-二甲基-2，4-二乙酸基-2-norpinene(5)和(-)-6，6-二甲基-2，2-二乙酸基-3-norpinene(6)。5和6(1.18g，5mmol)，R為1，1-二甲基庚基(7)(1.18g，5mmol)的間苯二酚和對甲苯磺酸(0.95g，5mmol)的氯仿(50ml)的混合物在室溫下反應4小時。然后添加乙醚(30ml)，用飽和碳酸氫鈉、水洗滌有機相，然后經(jīng)無水硫酸鈉干燥、過濾并蒸發(fā)。殘余物在乙腈中結(jié)晶后提供0.5g的晶體。母液經(jīng)硅膠進行層析分離，另獲得0.7g的純化合物A。
合成化合物L(-)-4-[4-(1，1-二甲基-戊基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
流程圖1中描述了化合物L的合成，其中間苯二酚化合物的R部分為1，1-二甲基-戊基。如合成化合物A所述制備化合物1到6。
合成化合物B(-)-4-[4-(1，1-二甲基-庚基)-2，6-二甲氧基-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物B的合成描述在流程圖2中。
向化合物A(115mg，0.3mmol)的DMF(5ml)的溶液中添加碳酸鉀(0.5g，3.6mmol)并攪拌混合物10分鐘。然后添加碘代甲烷(0.15ml，24mmol)并在室溫下攪拌混合物過夜。向反應混合物中添加水并用EtOAc萃取。有機相用水洗滌兩次，經(jīng)無水硫酸鈉干燥并蒸發(fā)。殘余物經(jīng)反相C-18柱利用10％水的乙腈溶液作為洗脫液進行層析分離以獲得98mg的化合物B。
流程圖2.
合成化合物C(-)-5-(1，1-二甲基-庚基)-2-(4-羥基-6，6-二甲基二環(huán)[3.1.1]庚-2-基)-苯-1，3-二醇。
化合物C的合成描述在流程圖3中。
將溶于10ml甲醇的100mg的化合物A冷卻到0℃。逐步添加硼氫化鈉(200mg)并攪拌反應混合物4小時。將混合物倒入50ml的5％HCl中，用乙酸乙酯(2×30ml)萃取，經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)以產(chǎn)生白色粉末形式的90mg的化合物C。
流程圖3 合成化合物D4-[4-(1，1-二甲基-庚基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮肟。
化合物D的合成描述在流程圖4中。
將鹽酸羥胺(37.3mg)溶于5ml水中并將溶液冷卻到0℃。緩慢添加氫氧化鉀(30mg)的1ml水溶液中。添加化合物A(372.5mg)繼之以添加甲醇以溶解所有的組分。攪拌3小時后，觀察不到起始物質(zhì)。然后添加水并用乙酸乙酯萃取溶液，經(jīng)Na2SO4干燥、過濾并蒸發(fā)以提供380mg的化合物D。
流程圖4
合成化合物E(+)-5-(1，1-二甲基-庚-6-炔基)-2-(4，6，6-三甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-3-烯-2-基)-苯-1，3-二醇。
化合物E的合成描述在流程圖5中，其中間苯二酚化合物的R部分為1，1-二甲基-庚-6-炔基。
流程圖5 (+)馬鞭草烯醇 3-間苯二酚化合物ER＝1，1-二甲基-庚-6-炔基化合物KR＝1，1-二甲基-戊基化合物QR＝1，1-二甲基-乙基-苯基反應在無水條件下進行。(+)馬鞭草烯醇(0.505，3.3mmol)，3-(1，1-二甲基庚-6-炔基)間苯二酚(0.77g，3.3mmol)和催化量的無水對甲苯磺酸鈉的無水氯仿(10ml)的混合物在0℃攪拌1小時。將混合物倒入碳酸氫鈉(50ml)的水溶液上并用氯仿(3×30ml)萃取水相。然后用水(3×30ml)和鹽水(3×100ml)洗滌混合的有機層。有機層經(jīng)Na2SO4干燥、過濾并蒸發(fā)。這樣獲得的粗物質(zhì)通過硅膠上的快速層析利用5％乙醚/石油醚作為洗脫液進行純化以獲得1.034g的化合物E。
化合物Q的合成5-(1，1-二甲基-乙基-苯基)-2-(4，6，6-三甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-3-烯-2-基)-苯-1，3-二醇。
流程圖5中描述了化合物Q的合成，其中間苯二酚化合物的R部分為1，1-二甲基-乙基-苯基。
如對化合物14所述利用苯基鋰制備1，1-二甲基-乙基-苯基間苯二酚。如對化合物E所述利用(+)-馬鞭草烯醇進行濃縮。
合成化合物F(-)-4-[4-(1，1-二甲基-庚-6-炔基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物F的合成描述在流程圖6中。
如Harrington等人的描述制備(3，5-二甲氧基苯基)-N-甲氧基-N-甲基甲酰胺(carboxamide)(8)(Harrington P.E.等，J.Org.Chem.656576-82，2000)。根據(jù)Negishi等人的描述制備1-(三甲基甲硅烷基)-6-溴-1-己炔(9)(Negishi E-I等，J.Amer.Chem.Soc.1105383-96，1988)。根據(jù)下列流程制備[7-(3，5-二甲氧基苯基)-7-氧代-1-庚炔基]三甲硅烷(10)。
流程圖6
向金屬鎂(300mg)的5ml無水THF中添加催化量的二溴甲烷，并將反應混合物加熱到回流幾分鐘。終止加熱并利用注射器以保持回流的添加速率注射0.9ml的化合物9(大約20分鐘)。完成添加后，繼續(xù)回流1小時。將反應混合物冷卻到室溫。在0℃通過套管將如此獲得的Grignard轉(zhuǎn)移到化合物8(0.9g)的2ml THF溶液中。30分鐘后，用1M HCl溶液猝滅反應混合物并用乙醚進行稀釋。分離有機相，經(jīng)Na2SO4干燥、過濾并蒸發(fā)以提供1.5g的粗物質(zhì)。通過硅膠快速層析法，利用10％乙酸乙酯的石油醚溶液作為洗脫液進行純化獲得680mg的純化合物10。如國際專利申請WO 01/28497所述，從化合物10獲得3-(1，1-二甲基-6-炔基)間苯二酚(11)。5和6(1.18g，5mmol)，3-(1，1-二甲基-6-炔基)間苯二酚(11)(1.18g，5mmol)以及對甲苯磺酸(0.95g，5mmol)的氯仿(50ml)的混合物在室溫下反應4小時。然后添加乙醚(30ml)，用飽和碳酸氫鈉、水洗滌有機相，然后經(jīng)無水硫酸鈉干燥、過濾并蒸發(fā)。殘余物在乙腈中結(jié)晶以提供0.5g的晶體。母液經(jīng)硅膠進行層析分離以另提供0.7g的純化合物F。
合成化合物G4-[4-(1，1-二甲基-苯基-丙基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物G的合成描述在流程圖7中，其中R為2-乙基-苯。
如Harrington等所述制備化合物8，12以及13(Harrington P.E.等人，J.Org.Chem.656576-82，2000)。如國際專利申請WO 01/28497所述制備化合物14。如前合成化合物A所述制備化合物5以及6。如合成化合物A所述進行化合物5，6和14的縮合。
流程圖7 化合物GR＝2-乙苯化合物HR＝仲丁基化合物JR＝對氯苯合成化合物H(-)-4-[2，6-二羥基-4-(1，1，3-三甲基-丁基)-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物H的合成描述在流程圖7中，其中R為仲丁基。如化合物A和F的合成所述制備化合物5，6，8，12-14。如合成化合物A所述進行化合物5，6和14的縮合。
合成化合物J(-)-4-{4-[1-(4-氯-苯基)-1-甲基-乙基]-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物J的合成描述在流程圖7中，其中R為對氯苯。
如化合物A和F的合成所述制備化合物5，6，8，12-14。如合成化合物A所述進行化合物5，6和14的縮合。
合成化合物M(-)-4-[4-(1-乙基-1-甲基-丙基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物M的合成描述在流程圖8中。
流程圖8
(留18行插入原文第34頁的圖)化合物M如下合成化合物161-(1-羥基-1-乙基-丙基)-3，5-二甲氧基-苯。在無水條件下進行反應。在0℃，向甲基-3，5-二甲氧基基苯甲酸酯(5g，25.5mmole)的無水THF(100ml)溶液中添加乙基溴化鎂的THF(1M，76.5ml)。在室溫下攪拌反應混合物72小時。添加乙酸乙酯和水，并用乙酸乙酯萃取水相。然后用水和鹽水洗滌混合的有機層、干燥(Na2SO4)，并過濾以提供6.3g的化合物16。
下列流程描述在國際專利申請WO 01/28497中。
如下合成化合物171-(1-氯-1-乙基-丙基)-3，5-二甲氧基-苯?；衔?6(6.3g，25mmole)溶于無水CCl4(30ml)中，HCl(g)起泡1小時。然后用水和10％碳酸氫鈉溶液洗滌有機層、干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)以產(chǎn)生6.3g的化合物17。
如下合成化合物181-(1-乙基-1-甲基-丙基)-3，5-二甲氧基-苯。在N2下將化合物17(6g，25mmole)的無水甲苯溶液冷卻到-30℃，并添加三甲基鋁的庚烷(2M溶液)(25ml)。反應混合物溫熱到室溫并攪拌過夜。添加HCl(1N)，然后分離有機層，用水洗滌、干燥并蒸發(fā)。在硅膠上利用1％乙酸乙酯/石油醚作為洗脫液層析分離粗物質(zhì)以提供5.3g的化合物18。
如下合成化合物195-(1-乙基-1-甲基-丙基)-間苯二酚。在N2氣氛下向冷卻的(-50℃)化合物18的無水二氯甲烷中添加硼-三-溴化物(10.15ml，107.3mmole)。反應混合物溫熱到室溫并攪拌過夜。添加飽和碳酸氫鈉，分離有機層、干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)以產(chǎn)生4.2g的期望的間苯二酚19。如化合物A的合成所述制備化合物5和6以及與間苯二酚19的縮合。
合成化合物N(-)-4-[4-(5-溴-1，1-二甲基-戊基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物N的合成描述在流程圖9中，其中R為溴原子。
如合成化合物A所述制備化合物5以及6。化合物20的制備如Singer等人所述(Singer等，J.Med.Chem.414400-7，1998)。如合成化合物A所述進行化合物5，6和20的縮合。
合成化合物P(-)-4-[4-(1，1-二甲基-戊基-5-腈)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物P的合成描述在流程圖9中，其中R為氰基。
流程圖9 化合物20R＝Br化合物NR＝Br化合物21R＝CN化合物PR＝CN化合物5和6如化合物A的合成所述進行制備。化合物21從化合物20以類似于Singer等人描述的方法進行制備(Singer等，同上)。如合成化合物A所述進行化合物5，6和21的縮合。
合成化合物R(-)-4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2-琥珀酸酯-6-羥基-苯基}-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物R的合成描述在流程圖10中。
合成化合物S4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2，6-二琥珀酸酯-苯基}-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物S的合成描述在流程圖10中。
在N2氣氛下將化合物A(227mg，0.61mmole)和琥珀酸酐(731mg，7.31mmole)的無水吡啶(10ml)的混合物加熱到50℃。添加叔丁醇鉀，并將獲得的混合物攪拌過夜(50℃)。將混合物倒入1N HCl中，并用乙酸乙酯萃取?；旌系挠袡C相用1N HCl和鹽水進行洗滌，干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)。通過柱層析(20％乙酸乙酯/石油醚+0.1％乙酸)分離兩種產(chǎn)物以產(chǎn)生220mg的化合物R(油)和150mg的化合物S(固體)。
流程圖10
合成化合物T4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2，6-雙-二乙基磷酸酯-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物T的合成描述在流程圖11中。
流程圖11 反應在N2氣氛下進行。向充分攪拌的化合物A(1.97g，5.29mmole)的新蒸餾的THF溶液中添加叔丁醇鉀(1.54g，13.75mmole)，并攪拌混合物10分鐘。然后添加二乙基氯磷酸酯，并攪拌反應混合物過夜。添加水并用乙酸乙酯萃取水相。用鹽水洗滌混合的有機層，干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)。在硅膠上利用25％-70％乙酸乙酯-石油醚作為洗脫液進行色譜純化產(chǎn)生2.2g的純化合物T。
合成化合物U4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2-二乙基磷酸酯-6-羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物U的合成描述在流程圖11中。
合成化合物W(-)-4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2，6-雙-二乙基磷酸酯-苯基}-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚烷-2-亞甲基。
化合物W的合成描述在流程圖12中。
在N2氣氛下進行合成。向甲基-三苯基-碘化膦(5.92g，14.65mmole)的無水THF(100ml)的懸浮液中添加雙(三甲基甲硅烷基)酰胺鉀(PBTSA)的甲苯(0.5M，28.7ml)，并在室溫下攪拌混合物0.5小時。添加化合物T(1.89g，2.93mmole)的THF(10ml)溶液，并將混合物攪拌過夜。添加氯化銨的水溶液，分離有機層并用EtOAc萃取水相。混合的有機相用鹽水進行洗滌，干燥(Na2SO4)、過濾并蒸發(fā)。利用15％到30％EtOAc/石油醚作為洗脫液通過硅膠柱層析純化產(chǎn)物。
流程圖12 合成化合物Y(-)-4-{4-[1，1-二甲基-戊基]-2-琥珀酸酯-6-羥基-苯基}-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物Y的合成類似于描述在流程圖10中化合物R的合成。唯一的差異是起始物質(zhì)，利用相同的合成流程，化合物A產(chǎn)生化合物R，化合物L產(chǎn)生化合物Y。
合成化合物Z(-)-4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2-延胡索酸酯-6-羥基-苯基}-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物Z的合成描述在流程圖13中。
流程圖13 化合物A(600mg，1.6mmol)溶于100ml的無水二乙醚中。然后添加0.21ml的三乙胺(1.6mmol)和0.18ml的富馬酰氯(1.7mmol)。攪拌約15分鐘后，過濾氯化三甲銨鹽并蒸發(fā)濾液。然后向殘余物中添加乙酸乙酯，并用水洗滌3次直到pH高于4。然后用飽和氯化鈉洗滌有機相，經(jīng)硫酸鈉干燥、過濾并蒸發(fā)。然后利用20％乙酸乙酯和石油醚作為洗脫液在硅膠上通過柱層析純化化合物Z。
合成化合物AA(-)-4-[4-(1，1-二甲基-庚基)-2-羥基-6-甲氧基-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物AA的合成描述在流程圖14中。
流程圖14 向化合物A(150mg，0.4mmol)的DMF(16ml)溶液中添加碳酸鉀(400mg，2.9mmol)，并在室溫下攪拌混合物10分鐘。然后添加碘代甲烷(85.2mg，0.6mmol)，并在室溫下攪拌混合物過夜。向反應混合物中添加水并用EtOAc萃取。用水洗滌有機相兩次，經(jīng)無水硫酸鈉干燥、過濾并蒸發(fā)。殘余物經(jīng)反相柱利用50％水的乙腈溶液作為洗脫液進行層析分離以提供30mg的化合物AA。
合成化合物AB4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2，6-雙-二乙基磷酸酯-苯基}-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-醇。
化合物AB的合成描述在流程圖15中。
流程圖15
向充分冷卻的化合物T(0.12g，0.18mmol)的無水乙醇(6ml)溶液中添加硼氫化鈉(51mg，1.34mmol)。在-40℃攪拌反應混合物1小時，然后溫熱到室溫。3小時后，TLC分析顯示初始物質(zhì)的完全消失。然后添加水，并用乙酸乙酯萃取反應混合物。用水、飽和氯化鈉洗滌有機層，并經(jīng)硫酸鈉干燥。通過蒸發(fā)除去剩余溶劑以提供0.17g的化合物AB(92％的產(chǎn)率)。
合成化合物AC4-[4-(1，1-二甲基-庚基)-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-醇。
化合物AC的合成描述在流程圖16中。
流程圖16 在無水條件下進行反應。向充分冷卻的(-78℃)化合物AB(0.107g，0.165mmol)的無水THF(6ml)和液氨(約50ml)溶液中添加鋰(約50mg，7.2mmol)。保持反應容器完全封閉直到藍色消失(約30分鐘)，然后打開過夜使氨氣蒸發(fā)。殘余物溶于乙酸乙酯(30ml)和氯化銨的飽和溶液中。用乙酸乙酯萃取水相。經(jīng)硫酸鈉干燥混合的有機相、過濾并蒸發(fā)以提供77.6mg的化合物AC，HPLC測得的純度為100％。
合成化合物AD(-)-4-[4-(1，1-二甲基-庚基)-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物AD的合成描述在流程圖17中。
流程圖17 向充分攪拌的化合物AC(0.204g，0.6mmol)的無水二氯甲烷溶液中以一部分添加吡啶重鉻酸鹽(0.448g，1.2mmol)。在室溫下攪拌反應混合物過夜。通過硅藻土過濾固形物并用DCM洗滌。通過蒸發(fā)除去溶劑以提供0.27g的殘余物。利用10％乙酸乙酯/石油醚作為洗脫液通過快速層析法純化粗物質(zhì)以提供0.15g的純化合物AD(產(chǎn)率74％)。
合成化合物AE(+)5-(戊酸甲酯)-2-(4，6，6-三甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-3-烯-2-基)-苯-1，3-二醇。
化合物AE的合成描述在流程圖18中。
在室溫下攪拌甲基3，5-二甲氧基苯甲酸酯(20g，0.12mole)，咪唑(100g，1.47mole)和叔-丁基二甲基甲硅烷基氯化物(100g，0.66mole)的DMF(無水，400ml)溶液2小時。用水(300ml)稀釋反應混合物并用乙醚(3×300ml)萃取水相。用水洗滌混合的有機相，干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)。獲得的粗物質(zhì)溶于THF(300ml)中，冷卻到-20℃并逐滴添加LiAlH4的THF(1N，140ml，0.14mole)。在室溫下攪拌反應混合物2小時。反應混合物冷卻到-30℃并添加乙酸乙酯(300ml)，然后添加MgSO4的飽和溶液。通過硅藻土過濾獲得的溶液。
流程圖18 分離有機層并用乙酸乙酯萃取水相3次。用飽和氯化鈉洗滌混合的有機相，干燥(硫酸鈉)并蒸發(fā)以提供44.2g的粗產(chǎn)物(23)(0.12mole)。不用任何純化步驟，將三乙胺(25ml，0.18mole)和戊酰氯(30ml，0.25mole)添加到溶于無水二氯甲烷(1升)的粗產(chǎn)物(23)中。在室溫下攪拌產(chǎn)生的混合物過夜。然后添加水，分離有機層并用DCM(3×300ml)萃取水相。用飽和氯化鈉洗滌混合的有機相，干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)。殘余物在硅膠上用4％乙酸乙酯/石油醚作為洗脫液進行層析。獲得45g的黃色油(24)。向黃色油(45g，0.1mole)的THF(1升)溶液中添加氟化四丁銨(87g，0.33mole)，然后在室溫下攪拌混合物過夜。將反應混合物倒入用乙酸酸性化直到pH約為4.5的水(11)中，并用乙酸乙酯萃取若干次。用飽和氯化鈉洗滌混合的有機相，干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)。用30％乙酸乙酯和石油醚作為洗脫液在硅膠柱上層析分離殘余物以提供20g的白色固體(25)。將白色固體(0.75g，3.3mmol)用馬鞭草烯醇(0.5g，3.3mmol)溶解在CHCl3(40ml)中，并將產(chǎn)生的溶液冷卻到0℃。添加無水對甲苯磺酸(催化量)并將產(chǎn)生的混合物在0℃攪拌15分鐘。將反應混合物倒入碳酸鈉的飽和溶液中。用CHCl3萃取水相并用碳酸鈉的水溶液洗滌混合的有機相。干燥(Na2SO4)有機相、過濾并蒸發(fā)。分離化合物AE并用20％水與乙腈作為洗脫液通過預備性HPLC進行純化。
合成化合物AF4-{4-[1，1-二甲基-庚基]-2，6-二甲氧基-苯基}-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-亞甲基。
化合物AF的合成描述在流程圖19中。
流程圖19
在N2氣氛和無水條件下進行反應。向甲基三苯基碘化膦(1.083g，2.68mmol)的無水THF(20ml)的懸浮液中添加雙(三甲基甲硅烷)酰胺鉀的甲苯(5.26ml，2.63mmol，0.5M)。在室溫下攪拌反應混合物半小時。然后添加化合物B(0.214g，0.537mmol)的無水THF(2ml)溶液，并將產(chǎn)生的混合物攪拌過夜。向反應混合物中添加氯化銨的飽和溶液，并用乙酸乙酯萃取水相(3次)，用飽和氯化鈉清洗混合的有機相，干燥(硫酸鈉)過濾并蒸發(fā)。用己烷研磨獲得的粗褐色固體以除去三苯基氧化膦。
然后用100％的己烷作為洗脫液在硅膠上進行層析以獲得淡黃色油的化合物AF。
合成化合物AG(-)-4-[4-(1，1-二甲基-戊-4-烯基)-2，6-二羥基-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-酮。
化合物AG的合成描述在流程圖20中。
1g的金屬鈉(43mmol)溶于無水甲醇(25ml)中，然后添加溶于甲醇(3.5g，12mmol)的4-(7-溴-1，1-二甲基-庚基)-2，6-二羥基-苯基(20)。攪拌反應混合物約半小時。然后將反應混合物倒入100ml的1N HCl中。用乙酸乙酯萃取水相(3×100毫升)，用飽和氯化鈉清洗混合的有機相，干燥(硫酸鈉)、過濾并蒸發(fā)。獲得800mg的粗間苯二酚產(chǎn)物(26)，并用20％的乙酸乙酯的石油醚溶液經(jīng)硅膠柱層析進行純化。讓產(chǎn)物間苯二酚(170mg，0.82mmol)與諾蒎酮二-乙酸酯的兩種異構(gòu)體(5)和(6)(540mg，2.2mmol)的CHCl3溶液和催化量的對甲苯磺酸反應。在室溫下攪拌4小時后，完成反應。用碳酸氫鈉洗滌反應混合物并用乙酸乙酯萃取(3次)，用飽和氯化鈉清洗混合的有機相，干燥(硫酸鈉)、過濾并蒸發(fā)。獲得的粗物質(zhì)用石油醚研磨以產(chǎn)生150mg的粗化合物AG。然后用50％的水∶乙腈作為洗脫液經(jīng)反相層析純化產(chǎn)物。
流程圖20(留10行插入原文第45頁的圖)化合物AG合成化合物AH2，2-二甲基丙酸-4-{4-[1，1-二甲基-戊基]-2，6-二羥基-苯基}-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-烯-2基甲酯。
化合物AH的合成描述在流程圖21中。
流程圖21(留10行插入原文第43頁的上圖)4-羥基桃金娘烯基-7-特戊酸酯5-(1，1-二甲基-戊基)-間苯二酚化合物AH4-羥基桃金娘烯基-特戊酸酯的制備如美國專利4,876,276所述，而5-(1，1-二甲基戊基)-間苯二酚的制備如下。在250ml的圓底燒瓶中添加100ml的甲醇和100ml的THF。然后添加5.5g的3，5-二甲氧基-苯甲酸(0.03mole)和1.27g的氫氧化鋰一水合物(0.03mole)。然后添加10ml的水，并攪拌反應混合物1小時。過濾獲得的漿液并蒸發(fā)。殘余物用乙醚研磨，并再一次蒸發(fā)獲得淺黃色固體。在60℃、減壓條件下用P2O5干燥固體。向100ml THF的250ml圓底燒瓶中添加3，5-二甲氧基鋰苯甲酸的干燥鹽。添加正丁基鋰(20ml，1.7M，0.032mole)。反應物溫熱到50℃并攪拌2小時。反應混合物冷卻到室溫，并逐滴添加到250ml的1N HCl。然后添加Na2CO3直到pH為約11。然后用乙醚萃取反應混合物3次。經(jīng)硫酸鈉干燥混合的有機相，過濾并蒸發(fā)以產(chǎn)生從正戊烷結(jié)晶而來的橙色油。獲得2.6g的化合物12，其中R為丁基，總產(chǎn)率為39％。如流程圖7所述制備化合物13和14，其中R為丁基。如化合物E所述進行4-羥基桃金娘烯基-特戊酸酯和5-(1，1-二甲基戊基)-間苯二酚的縮合，并且產(chǎn)率為65％。
生理學實施例在一系列實驗系統(tǒng)中進行新的二環(huán)CB2配體治療作用的評估以支持這些藥物作為免疫調(diào)節(jié)、抗炎、止痛、神經(jīng)保護和抗腫瘤劑的實用性。這些作用都在體外和體內(nèi)進行評價，并利用如下所述的系統(tǒng)進行證實。除非另有所示，測試化合物的制備如下為了體外分析，首先將化合物溶于DMSO中，并逐步稀釋在分析緩沖液，通常為組織培養(yǎng)基中，直到終濃度為0.1％DMSO。為了體內(nèi)分析，測試化合物首先稀釋在CREMOPHOR EL∶乙醇中(分別為70％和30％w/w)并且進一步以1∶20的比例稀釋在生理緩沖液，通常為生理鹽水中，以到達合適的劑量。因此介質(zhì)為稀釋在合適緩沖液中的初始“溶劑”。
實施例1CB1和CB2受體的結(jié)合親合性。
在膜上通過檢測新化合物從CB1受體置換[3H]CP55940的能力進行CB1的結(jié)合分析，所述膜來源于hCB1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293細胞(Perkin Elmer/NEN)。將膜稀釋在分析緩沖液(50mM Tris-HCl，2.5mMEDTA，5mM MgCl2，1mg/ml BSA，pH＝7.4)中得到500μg蛋白/ml。在存在或者不存在二環(huán)測試化合物的條件下將50μl的稀釋膜(25μg)與[3H]CP55940一起溫育在總體積0.5ml中。測試化合物溶于DMSO中，并稀釋在分析緩沖液中得到0.1％溶劑的終濃度。添加與介質(zhì)等量的對照樣品。通過添加10μM的WIN 55212-2測量非特異性結(jié)合。在30℃培養(yǎng)1.5小時后，通過Whatman 934A/H過濾器(用0.1％的聚乙烯亞胺(PEI)預浸透)過濾反應物。
通過檢測新二環(huán)類似物從膜中的受體置換[3H]WIN 55212-2的能力確定新二環(huán)類似物與CB2受體的親合性，所述膜來源于hCB2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞(Perkin Elmer/NEN)。將膜稀釋在分析緩沖液(10mMHEPES，1mM MgCl2，1mM EDTA，0.3mg/ml BSA，pH＝7.4)中得到500μg蛋白/ml。在存在或者不存在幾個濃度的二環(huán)測試化合物的條件下將50μl的稀釋膜(25μg)與0.8nM的[3H]WIN 55212-2一起溫育在總體積1ml中。如前對hCB1的分析所述溶解并稀釋測試化合物。通過添加10μM的CP 55940測定非特異性結(jié)合。在30℃培養(yǎng)40分鐘后如先前所述過濾反應物。所有結(jié)合分析的過濾器用β-計數(shù)器計數(shù)并將類似物濃度的log對結(jié)合％作圖。從這個圖外推出IC50的值。
結(jié)合分析的結(jié)果顯示在表1中，其根據(jù)它們分別從CB2或者CB1結(jié)合位點置換[3H]WIN 55212-2或者[3H]CP55940的能力描述了優(yōu)選化合物的構(gòu)效關系(SAR)。
表1用于定義R2、R3和R4的縮寫參考下列取代基DMBP＝1，1-二甲基-5-溴代-戊基DMCP＝1，1-二甲基-5-氰基-戊基DMEP＝1，1-二甲基-乙基-苯基DMH＝1，1-二甲基-庚基
DMH6＝1，1-二甲基-庚-6炔基DMP＝1，1-二甲基戊基DMPP＝1，1-二甲基-3-苯基-丙基EMP＝1-乙基-1-甲基-丙基MCPE＝1-甲基-1-(對-氯代-苯基)-乙基表1中報告的IC50的值從諸如描述在圖1的圖表計算而來，其顯示了所選擇的二環(huán)化合物與大麻堿受體的結(jié)合。通過競爭性抑制穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有人類CB1受體基因的HEK-293細胞中的[3H]CP55940來測定與CB1的結(jié)合。通過競爭性抑制轉(zhuǎn)染有人類CB2受體基因的CHO細胞中的[3H]WIN55212-2來測定與CB2的結(jié)合。以抑制％作為化合物濃度函數(shù)的兩個曲線(hCB1■和hCB2◆)在這個圖中重疊。A-顯示由化合物A得到的結(jié)果。B-顯示由化合物B得到的結(jié)果。C-顯示由化合物J得到的結(jié)果。D-顯示由化合物L得到的結(jié)果。
表1.式(I)到(III)的二環(huán)化合物的SAR和IC50(nM)

帶有星號的化合物不在式(I)和(II)定義的范圍內(nèi)，包含在內(nèi)僅僅用于比較。HU-210公開在美國專利5,284,867中，而HU-308公開在國際專利申請WO 01/32169中。
實施例2體外二環(huán)CB2配體的抗炎特性。
炎性應答級聯(lián)的特異方面通過諸如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，IFN-γ，IL-2和IL-1β的細胞因子以及諸如COX-2和PGE2的炎性介質(zhì)介導。調(diào)節(jié)這些前炎性劑的水平對于最終炎癥結(jié)果的嚴重性是非常重要的。這些前炎性劑也由免疫系統(tǒng)的激活細胞產(chǎn)生，而這個研究的目的是測試新二環(huán)CB2配體對從活化的巨噬細胞和T細胞分泌這些炎性劑的影響。各種測試組中的分泌水平通過ELISA分析進行測定，并且對比介質(zhì)治療組計算抑制水平。
利用ELISA進行蛋白定量。
用于液體樣品，組織培養(yǎng)上清液或者體液中的給定蛋白的定量技術(shù)是基于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)的方法。不管是市售或者自產(chǎn)的，分析是基于由結(jié)合到ELISA板微孔底部的特異性抗體捕獲目的蛋白來進行的。沖洗掉未結(jié)合的物質(zhì)，然后將捕獲的蛋白暴露于通常用辣根過氧化酶(HRP)或者堿性磷酸酶(ALP)標記的二級抗體。再一次沖洗掉未結(jié)合的物質(zhì)，然后將樣品用產(chǎn)生比色反應的合適底物溫育。終止反應并在合適的波長處對分光光度計進行讀數(shù)。至少一式兩份測試樣品，并且在每個板上合編出由重組體靶蛋白的系列稀釋構(gòu)成的合適標準曲線。從標準曲線計算樣品中蛋白的濃度。
巨噬細胞的活化RAW 264.7巨噬細胞為一種小鼠細胞系(ATCC #TIB-71)，將其生長在Dulbecco氏改良的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)上，該培養(yǎng)基用4mM的L-谷氨酰胺調(diào)節(jié)以包含1.5g/L的碳酸氫鈉、4.5g/L的葡萄糖以及10％熱滅活的胎牛血清。細胞生長在組織培養(yǎng)瓶中并以合適的密度接種在24微孔組織培養(yǎng)板中。一毫升中的0.5×106的Raw細胞用2μg/ml的脂多糖E.coli 055B5(DIFCO實驗室)進行刺激。小鼠巨噬細胞用對照或者10μM的二環(huán)CB2配體預處理1小時，其后用LPS激活。50nM的地塞米松用作陽性對照?；罨?小時(對于PGE2)以及24小時(對于IL-1β和TNF-α)收集上清液，通過先前所述的ELISA測定研究中炎性劑的水平。相對介質(zhì)處理的細胞，計算抑制率。
抑制活化巨噬細胞中的IL-1β。
IL-β獲得的結(jié)果描述在圖2A中，其中對每一處理組繪制分泌的水平。由此圖可見，二環(huán)CB2配體在10μM時是IL-1β的有效抑制劑，化合物A抑制76％的分泌，化合物D抑制67％，化合物B抑制34％，而化合物C抑制26％的分泌。在相同的實驗中地塞米松抑制IL-1β97％的分泌。
抑制活化巨噬細胞中的TNF-α。
如先前所述進行巨噬細胞的活化。如先前所述用ELISA分析測定TNF-α的水平。對比介質(zhì)處理的細胞計算抑制率。用10μM的化合物A處理降低了53％的TNF-α分泌并且計算的IC50為10μM。用從1μM到20μM范圍內(nèi)各種劑量的測試化合物進行處理以確定本發(fā)明其它化合物的IC50值，諸如化合物L、N、P、R和Y，并且當劑量高達20μM時它們中沒有一個顯著影響TNF-α的分泌。
抑制活化巨噬細胞中的PGE2。
如先前所述進行巨噬細胞的活化。如先前所述用ELISA分析測定PGE2的水平。對比介質(zhì)處理的細胞計算抑制率。用從1μM到20μM的范圍內(nèi)的各種劑量的測試化合物進行處理以確定IC50值。結(jié)果描述在圖2B中。由化合物A、L、N、P、R和Y抑制PGE2分泌的IC50值分別為9μM、7μM、7μM、18μM、9μM和7μM。
T細胞的活化。
Jurkat細胞(人類急性淋巴瘤T-細胞系；ATCC #TIB-152)生長在RPMI 1640培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基用2mM的L-谷氨酰胺調(diào)節(jié)以包含1.5g/L的碳酸氫鈉、4.5g/L的葡萄糖，10mM的HEPES，1.0mM的丙酮酸鈉以及10％熱滅活的胎牛血清。細胞生長在組織培養(yǎng)瓶中并以合適的密度接種在24微孔組織培養(yǎng)板中。用10ng/ml的PMA(Sigma)和1μM的A23187鈣離子載體(Sigma)刺激一毫升中的2×106個細胞。環(huán)孢菌素A(Sandoz)為一種已知的免疫抑制藥物，用作陽性對照。刺激之前1小時以所示濃度加入對照和測試化合物。刺激后24小時收集上清液，并且如先前所述用ELISA分析測定研究中的炎性劑。對比載體處理的細胞計算抑制率。
抑制激活T細胞中的IL-2。
如先前所述進行T細胞的活化。如先前所述用ELISA分析測定IL-2的水平。對比介質(zhì)處理的細胞計算抑制作用。在圖3中顯示的這個實驗的結(jié)果為由介質(zhì)或者化合物處理的細胞獲得的IL-2的分泌水平，在每個濃度進行繪圖。由此圖可見，二環(huán)CB2配體可以為IL-2的有效抑制劑，化合物A具有3μM的計算IC50，而化合物L、R和Y分別具有8μM、9μM和9μM的計算IC50。在高達10μM的劑量下，在這種實驗設置中，從中衍生二環(huán)合成大麻堿族的HU-308本身具有最小的作用。相同實驗中濃度為10nM的環(huán)孢菌素A抑制98％的IL-2分泌。應該注意到在0.5-5μM的CB1拮抗劑SR141716A或者CB2拮抗劑SR144528存在的條件下在這種實驗設置中同樣測試了化合物A和L，而且它們的IL-2分泌抑制活性沒有被任何這些拮抗劑所逆轉(zhuǎn)。這種觀察可能通過拮抗劑不完全足以阻斷這種潛在的特異性受體-介導的活性的事實，或者通過一些化合物的活性不能由CB2結(jié)合介導但是通過選擇性的機制介導的假設進行解釋，例如通過結(jié)合到未經(jīng)鑒定的大麻堿受體或者通過非受體介導的機制進行。
總而言之，這些試驗結(jié)果支持了下列結(jié)論本發(fā)明的二環(huán)CB2結(jié)合化合物是從免疫系統(tǒng)活化的細胞分泌前炎性劑的有效抑制劑，而不管是通過CB2結(jié)合還是通過選擇性機制進行的。
肥大細胞的活化。
肥大細胞為活化后釋放有效炎性劑的多功能骨髓來源的細胞。從預先形成的顆粒通過脫顆粒的過程或者在刺激誘導的從頭合成后完成釋放。由肥大細胞釋放的分子包含諸如組胺的生物胺、趨化因子、細胞因子、酶、生長因子、肽、花生四烯酸產(chǎn)物和蛋白多糖。應該注意到肥大細胞也已知在產(chǎn)生疼痛信號中具有關鍵作用。RBL-2H3細胞(大鼠嗜堿性白血病細胞系；ATCC #CRL-2256)表達了CB2樣受體并且最適合于研究支撐CB2選擇性配體的抗炎活性的機制。RBL-2H3可以由IgE依賴的機制或者通過添加PMA和鈣離子載體進行刺激。
RBL-2H3細胞生長在EMEM培養(yǎng)基中，用Earle氏BSS，2mM L-谷氨酰胺調(diào)節(jié)到包含1.5g/L的碳酸氫鈉、0.1mM的非必需氨基酸、1.0mM的丙酮酸鈉和15％的熱滅活胎牛血清。細胞生長在組織培養(yǎng)瓶中并以合適的密度接種在24微孔組織培養(yǎng)板中。一毫升中的2×105細胞通過下列之一的方式進行刺激。首先，在IgE依賴的方法中，過夜涂板后，用包含0.5μg/ml的共軛連接IgE的抗-DNP(二硝基苯基)(Sigma，Cat.No.D-8406)的培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基并對細胞致敏1小時。然后用PBS洗滌細胞兩次并暴露于包含0.1μg/ml DNP-HAS(二硝基苯基白蛋白，人類血清，Sigma，Cat.No.A-6661)的新預熱的培養(yǎng)基。在最終刺激之前添加稀釋在DMSO中的測試化合物和對照，終濃度不超過0.1％DMSO。根據(jù)待評估的介質(zhì)，在37℃下讓脫顆粒過程進行不同時間段，然后收集200μl的上清液。例如，在組胺取樣之前刺激細胞1小時以及刺激3小時用于監(jiān)控血清素、TNF-α和IL-4的分泌水平。使用這種模型的第二種可能性是當利用10ng/ml的PMA(Sigma)以及1μM的A23187鈣離子載體(Sigma)實現(xiàn)刺激的時候。Src家族抑制劑PP1或者PKC抑制劑GF109203X(都獲得自Calbiochem)用作陽性對照。刺激之前以所示濃度加入對照和測試化合物。依據(jù)在研究中的介質(zhì)，刺激后收集上清液長達24小時，并且如先前所述用ELISA分析測定這種炎性劑的水平。對比介質(zhì)處理的細胞計算抑制率。
實施例3化合物對基因表達的作用。
通過一些二環(huán)CB2結(jié)合化合物對體外或者體內(nèi)免疫系統(tǒng)活化的細胞中炎性劑分泌的影響顯示的抑制活性可能與基因表達的調(diào)節(jié)相關。
RNA制備和實時RT-PCR。
利用SV總RNA分離系統(tǒng)(Promega)制備總RNA。細胞或者組織在溶解緩沖液中勻漿化。根據(jù)試劑盒的說明書，將裂解物轉(zhuǎn)移到RNA分離柱，用DNAse處理，洗滌并洗脫。利用GeneQuant II(Pharmacia-Amersham)確定RNA的濃度。利用SUPERSCRIPT II逆轉(zhuǎn)錄酶(LifeTechnologies)從總RNA合成互補DNA(cDNA)。根據(jù)試劑盒說明書，將2μg的總RNA與寡核苷酸(dT)15引物、0.5mM dNTP混合物、8單位的逆轉(zhuǎn)錄酶及其他反應組分組合達到20μl的終容積。反應混合物在42℃保溫45分鐘并在70℃滅活15分鐘。定量的實時RT-PCR包含1μl的cDNA，300nM的合適正反向引物(根據(jù)監(jiān)控的基因)以及7.5μl的反應混合物，所述反應混合物包含緩沖液、核苷酸、Taq聚合酶和SYBER綠(SYBER Green master混合物，Applied Biosystems)，總反應體積為15μl。利用GeneAmp 5700序列檢測系統(tǒng)(AppliedBiosystems)獲得基因擴增。擴增過程包含在95℃10分鐘的一個步驟，繼之以兩步的40個循環(huán)95℃20秒，以及在60℃1分鐘。每個退火步驟期間，擴增產(chǎn)物的量通過雙鏈DNA結(jié)合染料SYBER Green的熒光強度進行測定。對每種產(chǎn)物測定循環(huán)閾值(CT)，表示可以首先檢測到熒光高于基線信號的增加的PCR循環(huán)。CT中一個PCR循環(huán)的延遲被轉(zhuǎn)化為起始模板分子降低兩倍，反之亦然。將特異基因產(chǎn)物CT的改變規(guī)格化到參考基因親環(huán)素或者GAPDH CT的變化。結(jié)果表示為試驗系統(tǒng)中基因表達高于合適對照，諸如滅活細胞系或者介質(zhì)“處理”的動物的成倍增加。在所有的情況下，結(jié)果同樣規(guī)格化到諸如親環(huán)素或者GAPDH的參考管家基因。
實施例4化合物對ConA誘導的肝臟損傷的作用。
在刀豆素A誘導的肝臟損傷鼠模型中評價二環(huán)CB2結(jié)合化合物的護肝活性。
T細胞介導的損傷的ConA模型。
人類危急生命的T細胞介導肝臟損害最普遍的原因是感染乙型肝炎或者丙型肝炎病毒以及自身免疫肝炎。已經(jīng)發(fā)展了自身免疫肝臟損傷的不同動物模型，包含由靜脈內(nèi)注射T細胞刺激性植物凝集素刀豆素A(ConA)誘導的小鼠急性肝功能衰竭。ConA對肝竇具有較高的親合性。用ConA處理小鼠激活了在肝臟中聚集并釋放調(diào)節(jié)肝臟損傷的細胞因子(諸如IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ、IL-2)的T細胞。用免疫抑制劑藥物諸如環(huán)孢菌素或者FK506預處理完全預防了由ConA注射引起的肝臟損傷，從而證實了T細胞激活在這種模型中的主要作用。
每個實驗組包含至少5只BALB/c純系雌性小鼠(平均體重25g，Harlan，以色列)。陰性對照組由注射鹽水而非ConA的小鼠組成。以10mg/kg鹽水溶液的劑量在尾的基部通過i.v.進行ConA(Sigma)注射。注射ConA前30分鐘以1mg/kg的劑量i.v.注射進行處理?；衔锶苡贑REMOPHOR EL∶乙醇中，并且僅以內(nèi)部對照包含介質(zhì)。
在三個水平監(jiān)控處理的效果。首先，在注射ConA后預定的時間點利用后眼眶穿刺收集血樣(200-400μl)。短暫離心后(5000rpm，2分鐘)，收集血清并保藏在-80℃，直到進一步用于經(jīng)ELISA確定細胞因子的水平以及確定肝臟轉(zhuǎn)氨酶的滲漏作為肝臟損傷的標志。同時，也在目的器官中確定細胞因子或者其它炎性介質(zhì)的水平。為了這個目的，注射ConA后在預定時間點通過頸椎脫臼法處死小鼠。取出脾和肝臟。部分肝臟固定在4％的甲醛中，而其他部分保藏在-80℃用于蛋白或者RNA的提取。將脾稱重，并且將小部分脾固定在4％的甲醛中，而大部分根據(jù)下列方法進行培養(yǎng)。用5ml注射器的粗糙末端插入4ml的RPMI培養(yǎng)基中，將每個脾擠壓通過一細胞濾器。通過重力沉積除去大組織片段并且收集上清液。用5ml的紅細胞裂解緩沖液(Boehringer)洗滌細胞3次，重懸在4ml的RPMI培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基補充有2mM的L-谷氨酰胺，調(diào)節(jié)到包含1.5g/L的碳酸氫鈉、4.5g/L的葡萄糖，10mM HEPES，1.0mM的丙酮酸鈉以及10％熱滅活的胎牛血清，并在6微孔培養(yǎng)皿中鋪板。細胞保溫24小時并且通過如前所述的ELISA確定上清液中細胞因子的水平。
通過ConA處理8小時后測量血漿中ALT的水平評價化合物A對肝臟損傷的作用。暴露于ConA引起ALT血漿濃度從30急劇升高到2800IU/l以上。用介質(zhì)處理的動物僅僅顯示ALT非顯著性減少29％，而用1mg/kg的化合物A處理的動物顯示顯著性減少65％。ALT為肝臟損傷的明確標志，這些試驗結(jié)果支持了肝臟炎癥中二環(huán)CB2配體可能的治療效果。
實施例5注射LPS后化合物在腦組織中的作用。
在CNS炎癥的情況下，通過模型在體內(nèi)的試驗，確定二環(huán)CB2結(jié)合化合物的神經(jīng)保護活性，在所述模型中，將LPS注射到小鼠腦室中產(chǎn)生炎性損傷。PBS用作對照。LPS溶于PBS中濃度為50ng/μl，以1μl/分鐘的速度在注射泵和腦注入套管的幫助下將5μl注入每個腦室中。每次注射后，套管繼續(xù)遺留在原位一分鐘以避免回流。i.c.v(腦室內(nèi))注射LPS后緊接著i.p.(0.1毫升/10g體重)注射各種處理組和對照。每個處理組由五只C57/BL雄性小鼠(6-8周齡，平均體重25g，Harlan，Israel)組成。注射LPS后6小時，通過i.p.注射100mg/kg的戊巴比妥鈉處死動物，取出它們的大腦并保藏在-80℃直到下一步驟。從每個完整的大腦提取RNA并通過如前所述的實時RT-PCR分析炎性劑的基因表達水平。這個實驗的結(jié)果表示成LPS對PBS注射的大腦中所研究基因的成倍激活。
這個實驗模型同樣能夠通過測量神經(jīng)膠質(zhì)增生的程度來監(jiān)控二環(huán)CB2結(jié)合化合物對腦炎的作用。為了這個目的，LPS和處理注射后3天處死動物并取出大腦。在海馬區(qū)的水平面切割20μm的冷凍切片并利用抗F4/80標記的抗體，通過標準的免疫組織化學方法進行染色。通過對F4/80免疫活性細胞的計數(shù)進行定量分析。處理組之間的差異利用方差ANOVA分析繼之以事后(post-hoc)t檢驗進行比較。p＜0.05的值被認為是統(tǒng)計學上顯著的。
實施例6化合物在中腦動脈阻塞中的作用。
小鼠瞬時MCAo本發(fā)明化合物的神經(jīng)保護活性在模擬腦缺血的中腦動脈阻塞(MCAo)鼠模型中進行評價。這個模型相當于中風中觀察到的腦缺血。用30％氧和70％氮中的氟烷(在麻醉室中4％用于誘導，并且在面罩中1-2％為了維持)麻醉小鼠(C57B1，雄性，平均體重25g，Harlan，Israel)。在頸部皮膚進行中線切割，筆直地切開下面的組織。通過鈍器解剖研究右頸總動脈(CCA)及其與頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)的連接。然后灼燒ECA、枕骨和甲狀腺上動脈的分支。接著通過將其圍繞5-0絲縫線材料(Assut，瑞士)進行CCA的瞬間封閉。切割2厘米段的尼龍縫合材料并放進1％聚L-賴氨酸的溶液中，然后在烘箱(60℃)中干燥60分鐘。每段的頂端圍繞在火焰的下方。用相同類型的縫合材料將ECA永久地阻塞。此時，在ICA中用5-0絲縫線材料進行第三次瞬時閉合。在ECA中切開小孔并向ICA中插入尼龍線，同時避免進入翼突腭動脈。線插入11mm直到感覺到輕微的抗性。然后打一5-0絲縫線結(jié)使線固定。然后切斷留在外面的1厘米線。通過5-0絲縫線材料封閉皮膚傷口。
操作后，使動物在籠中醒來。損傷開始后1小時對動物進行臨床試驗以驗證MCA阻塞是否成功。評估系統(tǒng)基于Belayev等人的工作(Stroke 271616-23，1996；Brain Res.833181-90，1999)。它包括兩個測試姿勢反射測試和前肢放置測試。動物尾部懸吊評價姿勢反射，而通過胃部固定動物進行前肢放置測試。表1總結(jié)了這兩個試驗及它們的得分系統(tǒng)。
表1用MCAo進行小鼠的神經(jīng)學估價。

*記分如下0代表沒有觀察到不足，1代表懸吊測試期間四肢彎曲，2代表側(cè)面推力不足。
#記分如下0代表完全直接放置，1代表不完全或者延遲放置(＞2秒)，2代表沒有放置。
只有總分在8到12之間的動物才被歸入研究中。起始損傷后90分鐘，利用相同的方法給選擇的動物再次給服鎮(zhèn)靜劑，然后重新打開頸部傷口并用尼龍線拉出ICA。接著用5-0絲縫線材料封閉皮膚傷口。損傷結(jié)束之前1分鐘施用對照和測試化合物。經(jīng)靜脈內(nèi)遞送5ml/kg的所有處理物。介質(zhì)的施用為5ml/kg。每個測試組包括至少6只動物。然后追蹤動物的三個主要參數(shù)臨床功能評估，包含損傷程度的組織病理學評估以及免疫/炎性標記的評估。研究的最后，通過i.p.注射戊巴比妥鈉100mg/kg處死動物。然后取出大腦并準備用于檢查。從大腦同側(cè)的一半，制備總RNA用于監(jiān)控測試化合物對局部缺血標記的作用。通過如前所述的實時RT-PCR分析基因表達水平。結(jié)果可以表示成高于假裝操作動物的成倍激活?；虮磉_規(guī)格化到管家基因親環(huán)素。
實施例7處理炎癥小鼠的耳浮腫模型。
新二環(huán)CB2配體的抗炎活性利用小鼠的耳浮腫模型進行體內(nèi)篩選。這個測試系統(tǒng)利用各種炎癥誘導物，包含巴豆油(CO)以及花生四烯酸(AA)，并且通過測定耳組織腫脹確定結(jié)果。非甾醇類抗炎藥物已經(jīng)顯示出減輕這種模型的腫脹(Young，J.M.等人，J.Invest.Dermatol.82367-71，1984)。測試化合物預防或者減低對這些興奮劑的炎性應答的能力是它們?nèi)硇钥寡啄芰Φ闹甘尽?br> 化合物A溶于CREMOPHOR EL∶乙醇中，并根據(jù)需要的劑量在用無菌0.9％氯化鈉稀釋到期望的終濃度后i.p.注射成熟雄性ICR小鼠(平均體重30g，Harlan，以色列)。檢查化合物從0到30mg/kg范圍的各種劑量。每個處理組由8-10只動物組成而介質(zhì)處理組由16只動物組成。通過施用20μl 50％CO的丙酮溶液到一只耳的外表面可立即誘導炎癥，對側(cè)耳只暴露于丙酮并作為對照。利用表盤式測厚儀(Mitutoyo，Japan)在施用CO后3小時測定耳的厚度(0.01mm單位)。最后，修剪耳朵，取出一6mm直徑的耳孔并測量其重量。耳的浮腫可以表示為CO處理耳的耳孔重量與對側(cè)丙酮處理耳的耳孔重量的比值。結(jié)果計算為與CREMOPHOR EL∶乙醇介質(zhì)處理的動物相比的抑制％。從這個研究中進行的劑量反應的分析，我們發(fā)現(xiàn)當腹腔內(nèi)注射化合物A時，化合物A具有30mg/kg或者81μmole/kg的ED50。這些結(jié)果顯示二環(huán)CB2配體可以起到全身性抗炎化合物的作用。
實施例8處理炎癥小鼠的爪浮腫模型。
這個研究的目的是體內(nèi)測試化合物對動物后爪注射1％角叉菜膠誘導的爪浮腫的抗炎活性。分別以15和6mg/kg i.p.注射稀釋在無菌鹽水中的甲苯噻嗪和戊巴比妥組合麻醉雌性Balb/c小鼠(平均體重20g，Harlan，以色列)。在一只(右)爪趾面下區(qū)用0.05ml的1％w/v角叉菜膠的無菌水溶液皮下注射麻醉的小鼠。沒有注射對側(cè)的(左)爪，因為來自文獻的數(shù)據(jù)被我們自己的經(jīng)驗所證實，顯示注射0.05ml的生理鹽水不影響以后的厚度或者容積計量。包含已知的抗炎對照的所述測試化合物，在i.p.注射之前溶于CREMOPHOR EL∶乙醇中并進一步以1∶20或者1∶50稀釋在無菌鹽水中，所述i.p.注射緊跟在角叉菜膠注射之前發(fā)生。注射后3小時，如先前所述方法將動物重新服用鎮(zhèn)靜劑。利用表盤式測厚儀(Spring-dial，恒定低壓壓力表，Mitutoyo，TG/L-1，0.01mm)測量爪厚度，利用器官充滿度測量器(型號#7150，UgoBasile，Italy)測量爪體積。爪浮腫可以表示成同一動物右側(cè)處理和左側(cè)未經(jīng)處理的爪之間的差異，或者以立方毫米表示的Δ爪體積(ΔPV)或者以毫米表示的Δ爪厚度(ΔPT)。每個組包括至少10只動物。結(jié)果可以進一步規(guī)格化到每個處理組0mg/kg(只有介質(zhì))的ΔPV和ΔPT值。在研究最后，i.p.注射100mg/kg的戊巴比妥使動物安樂死。
結(jié)果首先計算為ΔPV或者ΔPT，然后通過比較處理和介質(zhì)對爪體積或者厚度的作用更進一步被分析成抑制％。各種處理組中的差異利用方差分析(ANOVA)繼之以事后t Fisher試驗進行分析。p＜0.05的值被認為是統(tǒng)計學上顯著的。
當結(jié)果表示為規(guī)格化到介質(zhì)的爪厚度抑制％，并根據(jù)測試化合物的劑量作圖時，產(chǎn)生的圖型為給定劑量時起始斜率直至最大的觀察結(jié)果(MOE)，繼之以更高劑量的平穩(wěn)狀態(tài)。針對下列兩個參數(shù)進行測試化合物的抗炎活性分析爪厚度的最大抑制％以及觀察到最大結(jié)果的劑量。第一個總的觀察是與在最多2mg/kg范圍內(nèi)的已知抗炎化合物，諸如地塞米松和Celecoxib相比，二環(huán)CB2配體在較低的劑量下是有效的。二環(huán)CB2配體的原型HU-308在0.6mg/kg劑量時產(chǎn)生爪厚度約28％的最大減少。在2.5mg/kg劑量時化合物A對爪厚度有類似28％的減少，而化合物L和R在0.25和0.5mg/kg劑量時分別顯示34％和31％的MOE。由于比較的緣故，已知的抗炎藥物諸如Celecoxib和地塞米松分別在相應的劑量范圍內(nèi)，在0.1mg/kg時引起爪厚度減少7％和26％，在0.25mg/kg時減少16％和31％，而在0.5mg/kg時減少24％和33％。因此，大多數(shù)測試的化合物至少優(yōu)于Celecoxib。應該記住這些市售藥物顯示嚴重的副作用，如果不經(jīng)補充性保護藥物處理的話會阻止它們長期應用。本發(fā)明的化合物與這些藥物相比具有抗炎活性的事實是非常令人鼓舞的，因為這個家族的化合物具有避免副作用的優(yōu)點，從而使它們成為代替現(xiàn)存抗炎藥物的重要候選藥物。這些結(jié)果支持了本發(fā)明的二環(huán)CB2配體具有可能與含有炎性組分的較寬范圍的人類狀態(tài)相關的抗炎效果。
實施例9試驗性自身免疫疾病CIA，EAE和DTH。
自身免疫疾病與升高水平的炎性細胞因子相關。最常研究的嚙齒動物模型為實驗性變應性腦脊髓炎(EAE)(一種人類多發(fā)性硬化的模型)，試驗性自身免疫關節(jié)炎(一種人類類風濕性關節(jié)炎的模型)，以及遲發(fā)型超敏反應(DTH)(一種人類過敏性反應的模型)。EAE為由動物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘堿性蛋白致敏化作用引發(fā)的自身免疫神經(jīng)系統(tǒng)疾病，所述髓鞘堿性蛋白又稱堿性致腦炎蛋白。試驗性的自身免疫關節(jié)炎由完全弗氏佐劑中的膠原蛋白免疫動物所引發(fā)因此所述模型稱為膠原蛋白誘導的關節(jié)炎(CIA)。遲發(fā)型超敏反應是根據(jù)嚴格時間表通過施用二硝基氟苯誘導的，因此產(chǎn)生的模型相當于人類變應性接觸性皮炎。本研究的目的是測試我們的化合物預防或者減弱這三種自身免疫病模型的臨床征象的能力。
膠原蛋白誘導的關節(jié)炎。
在這個研究中，每處理組使用至少8只成年DBA/1雄性小鼠(平均體重20g，Harlan，以色列)。在4℃通過攪拌ON將2型牛膠原蛋白溶于0.05M乙酸中，濃度為2mg/ml。膠原蛋白溶液在等體積的完全弗氏佐劑(CFA)中進一步乳化。每只動物施用100μg的2型膠原蛋白的0.1ml CFA乳化液。在尾的基部s.c.施用膠原蛋白。啟動后21天，小鼠皮內(nèi)加強注射100μg膠原蛋白的弗氏不完全佐劑溶液。
利用器官充滿度測量器(Hugo Basill，Italy)測量每個后爪的體積，利用轉(zhuǎn)盤恒壓計量器(Mitutoyo，日本)測量厚度。膠原蛋白給藥之前以及在指定的隨訪期間每隔一天進行測量。所有的處理為腹膜內(nèi)給藥。處理周期的最后，i.p.100mg/kg的戊巴比妥處死動物。
各種不同的處理組之間爪腫脹嚴重性的差異利用方差分析ANOVA繼之以事后t檢驗進行比較。p＜0.05的值被認為是統(tǒng)計學上顯著的。
試驗性自身免疫腦脊髓炎。
自身免疫腦脊髓炎的各種動物模型是本領域已知的，這取決于誘導方法，動物的傷情以及用于誘導疾病的抗原。利用Lewis大鼠測試二環(huán)CB2配體對EAE的影響，其中誘導后約10天通過臨床癥狀的表現(xiàn)觀察疾病的開始。疾病的進展以及臨床記分增加，并且大約15天達到頂點，誘導疾病后約18天觀察到自然恢復。動物(起始研究時每測試組至少9只，除了未經(jīng)處理的對照組，只包括5只大鼠)保持12小時照明/12小時黑暗的作息時間，22℃恒溫，不限量給食和水。通過用s.c.注射后爪25μg純化的豚鼠髓鞘堿性蛋白(MBP，Sigma)的0.1ml完全弗氏佐劑(Difco)的乳化液免疫這些動物而誘導EAE。
臨床上記分在0.5和1之間，顯示出疾病癥狀的動物用測試化合物或者介質(zhì)對照進行處理，給藥方式為從發(fā)病(誘導疾病后約第10天)開始連續(xù)3天靜脈內(nèi)注射，體積為5ml/kg。甲基強的松龍用作陽性對照，其從注射MBP誘導疾病開始每天i.v.施用30mg/kg，連續(xù)5天。結(jié)果記錄為臨床記分；0分表示沒有臨床征象的正常動物，0.5顯示尾遠部肌肉彈性的喪失，1顯示整個尾部癱瘓，2顯示截癱，3顯示四肢麻痹，4顯示整個身體癱瘓和瀕臨死亡以及5顯示死亡。發(fā)病后對動物臨床記分共11天，計算這段時間曲線下面積(AUC)。各種不同處理組之間臨床結(jié)果的差異利用方差分析(ANOVA)繼之以Fisher氏LSD檢驗進行分析。p＜0.05的值被認為是統(tǒng)計學上顯著的。
圖4中顯示的結(jié)果為每個處理組平均AUC的減少％。以劑量相關的方式，化合物A產(chǎn)生臨床記分AUC的降低，在1mg/kg劑量時明顯減少35％。結(jié)果顯示為圖4中的#，其在統(tǒng)計學上好(p＜0.05)于未經(jīng)處理和CREMOPHOR EL∶乙醇介質(zhì)處理獲得的結(jié)果。在這個試驗設置中，當以30mg/kg的劑量在發(fā)病前給藥5次時，陽性對照甲基強的松龍(MPred)減少34％。苯甲醇作為Mpred的介質(zhì)，并且自然而然提高AUC 18％，數(shù)據(jù)未顯示在圖中。實驗以盲法方式獨立地重復，并獲得類似的結(jié)果，例如采用1mg/kg的化合物A，臨床記分減少30％。
此外，在單獨研究中，誘導疾病后15天i.p.注射100mg/kg的戊巴比妥對動物實施安樂死。取出大腦和脊髓并用4％低聚甲醛溫育固定過夜。利用提高濃度的乙醇溶液對脊髓的頸部脫水，然后包埋入paraplast中。接著對脊髓進行切片(10μm)，并利用蘇木精和曙紅進行染色。用光學顯微鏡對浸潤淋巴細胞的病灶檢查染色的玻片。對病灶的數(shù)目進行計數(shù)，并對每個動物的6張切片加以平均。在這個系統(tǒng)中測試3組，每組至少4只動物未經(jīng)處理的，介質(zhì)處理的，和用0.5mg/kg的化合物A處理的動物。結(jié)果表示為病灶數(shù)目的平均值±SD。各種不同的處理組中浸潤病灶數(shù)目之間的差異利用方差分析(ANOVA)繼之以學生氏t檢驗進行分析。p＜0.05的值被認為是統(tǒng)計學上顯著的。
未經(jīng)處理的動物在它們的脊髓中顯示最高的浸潤病灶數(shù)，每個切片平均23±16個病灶。只用介質(zhì)處理對這個結(jié)果沒有影響，病灶數(shù)為21±6，而0.5mg kg的化合物A使浸潤顯著降低超過50％，每個切片病灶數(shù)為10±5。當已經(jīng)確診(自從發(fā)病約5天)疾病時進行這些觀察，并且支持了二環(huán)CB2配體通過阻止細胞浸潤產(chǎn)生損傷的炎性/免疫級聯(lián)作為有效的神經(jīng)保護劑的事實。
總而言之，這些試驗結(jié)果不僅在神經(jīng)系統(tǒng)的組織水平而且在功能性臨床結(jié)果的水平，暗示二環(huán)CB2配體為與人類多發(fā)性硬化相關的模型的有效處理劑。
小鼠的遲發(fā)型超敏反應第0天和第1天在腹部剃毛皮膚上涂敷稀釋在丙酮中的30μl0.15％二硝基氟苯(DNFB)，對成年雌性BALB/c小鼠(平均體重20g，Harlan，以色列)致敏。在第6天，通過在一只耳上涂敷10μl的DNFB丙酮溶液攻擊動物。對側(cè)耳不受攻擊但是涂敷10μl丙酮。以從0到15mg/kg提高的劑量i.p.施用測試化合物兩次，第一次注射緊接在DNFB攻擊后(第6天)，而第二次注射在攻擊后16小時(第7天)。每個處理組包括至少7只動物。地塞米松(DXM)用作陽性對照。攻擊后24小時(第7天第二次處理后6小時)利用表盤式測厚儀(Mitutoyo，Japan)確定耳的厚度。
結(jié)果分析為DNFB處理的耳厚度高于未用DNFB處理的對側(cè)耳的厚度。通過比較其對處理組動物的平均影響與只對合適的介質(zhì)產(chǎn)生的應答，進一步評價這種測試化合物的效果。結(jié)果顯示在圖5中，其中耳厚度減少的％相對處理劑量作圖。一般而言，獲得的圖型為到達活性平穩(wěn)狀態(tài)的曲線。對于陽性對照而言，我們可以發(fā)現(xiàn)最大抑制為約80％，而HU-308的最大抑制在60％的范圍內(nèi)。對于地塞米松計算的IC50為3.2mg/kg，而對于HU-308而言IC50為4.8mg/kg。在測試的劑量下，化合物A和L沒有到達50％的抑制，它們的最大減少是在35-43％的范圍內(nèi)。這些試驗結(jié)果顯示二環(huán)CB2配體可以有效處理與人類變應性和免疫應答相關的模型。
實施例10處理神經(jīng)退行性紊亂MPTP模型。
帕金森氏癥(PD)是一種神經(jīng)退行性紊亂，其特征在于震顫、運動減慢、僵硬以及平衡性差。如果不是所有的，大多數(shù)的這些行動障礙應歸于由黑質(zhì)致密層部分(SNpc)中多巴胺能神經(jīng)元以及紋狀體中它們的突出神經(jīng)纖維的喪失所引起的紋狀體多巴胺含量的顯著降低。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)是一種眾所周知的神經(jīng)毒素，可以引起多巴胺含量在紋狀體中的損耗以及黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)目在幾個物種中的減少，所述物種包含人類(Turski L.等，Nature349573，1991)。本研究的目的是檢驗二環(huán)CB2配體對MPTP-誘導的多巴胺能毒性進展的影響。
動物處理和方法。
在第1天以2小時的間隔，用4次注射MPTP(Sigma USA)(20mg/kg，5ml/kg)的鹽水(Teva Medical Israel)溶液對小鼠(C57/BL雄性小鼠，平均體重30g，Harlan，Israel)i.p.給藥。包含(a)鹽水，未處理的，(b)MPTP，未處理的，(c)介質(zhì)(1∶20的CREMOPHOR EL∶乙醇)，5ml/kg i.p.，以及(d)測試化合物的處理組僅在第一次MPTP給藥前經(jīng)一次i.p.給藥。MPTP處理動物后七天處死動物(通過i.p.施用戊巴比妥鈉CTS，以色列100mg/kg)，取出大腦利用免疫組織化學技術(shù)檢測酪氨酸羥化酶(TH)。
免疫組織化學。
通過心臟灌注4％低聚甲醛繼之以大腦浸入相同的固定劑至少72小時固定大腦。然后用PBS洗大腦并轉(zhuǎn)入30％蔗糖的PBS溶液中直到它們下沉。大腦沉入蔗糖后，利用專用制冷器速凍(-60℃)進行冷凍。然后在黑質(zhì)(SN)的平面對大腦進行低溫切片(20μm)。利用兔抗酪氨酸羥化酶(1∶100，Calbiochem)進行免疫組織化學染色。利用自動免疫染色系統(tǒng)(Ventana)的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)檢測試劑盒對玻片染色。通過在SNpc側(cè)面到第三腦神經(jīng)根部的最寬尺寸處對免疫活性(IR)細胞計數(shù)進行定量分析，所述第三腦神經(jīng)在interpreduncular核的平面將中間和側(cè)面SN分離開來。紋狀體平面的標記量利用計算機化圖象分析系統(tǒng)進行評估。
所有的數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。利用方差分析(ANOVA)繼之以事后Fisher檢驗分析數(shù)據(jù)。p＜0.05的值被認為是統(tǒng)計學上顯著的。在SNpc平面上的TH免疫反應性。
圖6顯示了i.p.20mg/kg的HU-308在帕金森氏癥MPTP模型中的作用。對每個處理組在MPTP注射和處理后SNpc平面TH-IR細胞/mm2的數(shù)目作圖。黑色柱-鹽水注射的未處理組。黑色帶點柱-MPTP注射的未處理組。陰影柱-MPTP注射的用化合物介質(zhì)處理的組。白色柱-MPTP注射的用HU-308處理組。柱上的符號是指統(tǒng)計分析#與鹽水處理組相比p＜0.05；*與介質(zhì)相比p＜0.05。注射MPTP后，TH-IR細胞的數(shù)目與鹽水處理的動物相比減少65％(58±10鹽水組對20±3MPTP組)。計算處理組相對于MPTP處理組的TH-IR結(jié)果顯示HU-308從MPTP毒性拯救約43％的SN多巴胺能細胞。介質(zhì)本身對TH-IR細胞沒有拯救作用。這些結(jié)果顯示二環(huán)CB2配體對慢性神經(jīng)退行性疾病諸如帕金森氏癥的模型是有效的。
實施例11內(nèi)臟疼痛的處理減弱機械痛覺過敏(allodynia)。
這個研究的目的是評價新二環(huán)CB2結(jié)合化合物在內(nèi)臟疼痛動物模型中可能的止痛效果。內(nèi)臟疼痛由諸如胃、腎、膽囊、膀胱、腸等內(nèi)臟器官紊亂引起。這些紊亂包含來自碰撞或者腫瘤的膨脹、局部缺血、腸系膜上的炎癥和粘連，其可以引起相關征狀，諸如發(fā)燒、不適和疼痛(Al-Haer E.D.等，Pain 96221-5，2002)。內(nèi)臟疼痛由i.p.注射乙酸誘導小鼠產(chǎn)生。
通過i.v.注射5ml/kg體積劑量的介質(zhì)、不同劑量的對照和測試化合物對雄性ICR小鼠(平均體重25g，Harlan，Israel)進行預處理。每個處理組由至少4只動物組成。十五分鐘以后，給小鼠i.p.注射10ml/kg的0.6％乙酸，并在乙酸給藥后5分鐘開始記下5分鐘時間段內(nèi)萎靡小鼠的數(shù)目。結(jié)果表示為萎靡平均數(shù)±SD。利用方差分析(ANOVA)繼之以事后Fisher試驗分析數(shù)據(jù)。p＜0.05的值被認為是統(tǒng)計學上顯著的。
未處理的動物顯示為平均30.5±4.3萎靡，而介質(zhì)處理的只有輕微的非顯著的結(jié)果，降低萎靡數(shù)目到21.8±3.4。然而，劑量范圍在從0.5到2mk/kg的化合物A在這個模型中效率很高，甚至在最低劑量時仍然具有統(tǒng)計顯著性(p＝0.015)。在0.5mg/kg劑量時，與介質(zhì)相比化合物A已經(jīng)降低了64％的萎靡數(shù)至7.9±4.8，在1mg/kg劑量時抑制高達95％，只有1.2±0.6的萎靡數(shù)，而在2mg/kg的劑量時化合物A顯示完全保護，抑制率達100％，并且根本沒有萎靡的動物。這些試驗結(jié)果支持了二環(huán)CB2結(jié)合化合物是有效止痛的并且防止內(nèi)臟疼痛。
實施例12處理慢性神經(jīng)性疼痛減弱機械痛覺過敏。
這個研究的目的是評定新二環(huán)CB2結(jié)合化合物在神經(jīng)性疼痛動物模型中的可能止痛效果。坐骨神經(jīng)慢性收縮后在大鼠右后肢誘導外周monopathy(Bennet，G.J.& Xie，Y-K.，Pain 3387-107，1988)。利用建立的行為測試監(jiān)控機械allodyna的發(fā)展(Von Frey纖維)。
確定手術(shù)前的基準值作為兩個術(shù)前值的平均數(shù)。一旦建立了基準值，通過用4根松的鉻羊腸線收緊右側(cè)坐骨神經(jīng)準備動物外科手術(shù)。手術(shù)后第11天，將基于預手術(shù)值已經(jīng)發(fā)展了機械allodyna的動物隨機分配給各種不同的處理組。
根據(jù)是否正在施用藥物或者介質(zhì)，以掩蔽方式進行隨機設計。在測試前，使雄性Sprague-Dawley大鼠適應行為測試設備。在測試這天，每處理組至少6只動物以2.5ml/kg的體積i.p.施用單劑量的一種測試化合物。15分鐘以后，一系列Von Frey纖維(在測試前預先標定)自下而上施用于后爪的趾面。從最弱力開始以逐漸遞增的順序施加纖維并且評價同側(cè)和對側(cè)后爪的退縮閾值。每一纖維在腳的中趾面到它剛剛開始彎曲的點壓痕；每一纖維以大約1Hz的頻率重復大約8-10次。縮回閾值被定義為兩種或多種連續(xù)Von Frey氏纖維引發(fā)一種反射縮回應答(即，一種短暫的爪翹起)的最小壓力，并以克進行測定。
圖7顯示化合物A在神經(jīng)性疼痛的慢性壓縮神經(jīng)損傷模型中的作用。結(jié)果被表示為在測試化合物處理組中相對介質(zhì)處理的動物中對VonFrey氏纖維的應答閾值增加的百分比，且根據(jù)定義，介質(zhì)處理組產(chǎn)生無效的基準值。黑色柱表示嗎啡處理的動物(4mg/kg)，灰色和帶點的柱條表示兩種劑量的化合物A(分別為0.5和1mg/kg)。從這個研究中可以看出處理15分鐘后，用4mg/kg劑量的嗎啡處理的動物在其同側(cè)的后爪比介質(zhì)處理組的動物具有91％的更高疼痛閾值。用0.5mg/kg和1mg/kg的化合物A處理的組分別顯示出疼痛閾值增加71％和64％，而在單獨實驗中，用5mg/kg的HU-308處理的動物顯示出117％的改善(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明本發(fā)明的二環(huán)CB2配體和已知的CB2激動劑HU-308一樣可減輕或治療慢性神經(jīng)性疼痛。迄今為止，已知HU-308減輕在福爾馬林測定中評價的外周疼痛(WO 01/32169)。
此外，如實施例10所述，應該注意到化合物A在試驗性自身免疫腦脊髓炎系統(tǒng)模擬的人多發(fā)性硬化中是有效的。患有MS的病人不但經(jīng)受神經(jīng)缺陷而且發(fā)展為嚴重的神經(jīng)性疼痛。本發(fā)明的化合物可同時治療這兩個方面疾病的事實賦于它們顯著的治療優(yōu)點。
實施例13急性外周疼痛的處理尾部翹起模型。
本研究的目的是用來評價新二環(huán)CB2結(jié)合化合物在急性疼痛動物模型中潛在的止痛作用。在此模型中，傷害性刺激是熱，并監(jiān)控直到動物尾部翹起的時間(Le Bars D.，Gozariu M.& Cadden S.W.，Pharmacol.Rev.53597-652，2001)。
ICR雄性小鼠(平均體重為20-30g，Harlan，Israel)以5ml/kg的體積劑量進行i.p.注射。每一處理組包含至少6只動物。嗎啡HCl以5mg/kg的終劑量用作陽性對照。其介質(zhì)，鹽也被包括在對照中。將測試的化合物溶于CREMOPHOR EL∶乙醇中，并在注射之前以1∶20稀釋在鹽水中，第二種介質(zhì)也被包括在陰性對照中。注射的終劑量從0.1到10mg/kg。在注射處理物后的預定時間點，動物被放入在尾部翹起系統(tǒng)中(Socrel，model DS 20)。動物輕輕地固定，而它們的尾部被置于光電池上。然后在距離末梢2cm處照射(21V)尾部且記錄按秒計量的潛伏時間，一式兩份。在研究的最后，通過i.p注射100mg/kg的戊巴比妥鈉對動物實施安樂死。
下列兩個參數(shù)被用于分析結(jié)果潛伏時間和顯示痛覺喪失動物的％。通過后者我們測定處理組中有多少動物已經(jīng)增加了對疼痛的抗性，通過潛伏時間測定，所述潛伏時間高于或等于介質(zhì)處理動物中所觀測的潛伏時間的兩倍。兩種情況下的結(jié)果表示為平均數(shù)±SE。不同處理組之間的顯示痛覺喪失的動物的潛伏時間或百分率之間的差異通過方差分析(ANOVA)繼之以事后Tukey氏檢驗(用于潛伏時間)或Fisher氏精確試驗(用于動物百分率)進行分析。p＜0.05的值被認為是統(tǒng)計學上顯著的。
圖8顯示了在用于急性疼痛的尾部翹起模型中，不同劑量化合物A(帶點柱)和化合物R(陰影柱)的作用。注射后30分鐘進行測定時(圖A)，兩個對照組的潛伏時間是類似的，對于鹽水為2.65秒，而對于測試化合物的介質(zhì)為2.89秒。陽性對照嗎啡為5mg/kg時增加潛伏時間到7.5秒(與鹽水相比p＜0.05，用星號標記在圖表中)。測試化合物A在所有從2到10mg kg的測試劑量時都顯著地(與介質(zhì)相比p＜0.05，用星號標記在圖表上)增加了潛伏時間，在最大測試劑量處具有7.1秒的最長潛伏時間。當注射90分鐘后(圖B)進行測定時，嗎啡的作用顯著地減少且其潛伏時間現(xiàn)在僅僅為3.9秒，幾乎倒回到基線，而化合物A和R的作用保持相對穩(wěn)定。在最佳的測試劑量10mg/kg時，化合物A在注射后90分鐘，仍然產(chǎn)生7.3秒的潛伏時間，而化合物R的最大潛伏時間保持高達8.5秒。當基于顯示痛覺喪失的動物百分率分析時，結(jié)果看上去更為顯著。然后我們觀察到在注射后90分鐘，僅僅大約40％的用5mg/kg嗎啡處理的動物仍然顯示痛覺喪失，而超過80％的用10mg/kg化合物A處理的動物和100％的用10mg/kg化合物R處理的動物具有超過兩倍于介質(zhì)處理的動物的潛伏時間。甚至注射后330分鐘，8和10mg/kg劑量的化合物A痛覺喪失仍然是明顯的?；衔颮更為顯著，100％的用10mg/kg化合物R處理的動物在注射后330分鐘仍然顯示增加的痛覺喪失，在此時間點絕對的潛伏時間仍然高達6.8秒。4和8mg/kg較低劑量的化合物R仍然兩倍于5mg/kg嗎啡所產(chǎn)生的痛覺喪失。
有趣的是注意到，化合物A相反的對映異構(gòu)體，其中其它所有參數(shù)與C-5是R的相同，在此實驗設置中進行測試，且被證明是無效的?；衔顰的(+)對映異構(gòu)體，即(4R)-4-[4-(1’，1’-二甲基庚基)-2，6-二羥苯基]-6，6-二甲基-2-norpinanone根據(jù)Makriyannis及其合作者的方案利用(-)-β-蒎烯作為初始材料進行合成(Drake D.J.等，J.Med.Chem.413596-3608，1998)。經(jīng)i.p.注射4mg/kg的化合物A，(-)對映異構(gòu)體處理的動物在給藥30分鐘后顯示出潛伏時間增加，為4.9秒，用介質(zhì)處理的動物為2.8秒，而用4mg/kg的(+)對映異構(gòu)體處理的動物具有僅僅2.4秒的平均潛伏時間。由(+)和(-)對映異構(gòu)體得到的結(jié)果之間的差異在統(tǒng)計學上是顯著的(雙尾不成對的t檢驗，p＝0.04)。此外，化合物A也比其(+)對映異構(gòu)體對CB2具有更高的選擇性，對CB2的IC50低10倍，CB2/CB1比例為約30，而對映異構(gòu)體僅為10。
對Sprague Dawley雄性大鼠進行類似的研究，其中藥物在小鼠模型中通過i.v.注射代替i.p.注射。獲得可比較的結(jié)果，僅在引發(fā)顯著增加的潛伏時間所需的劑量(與i.p相比在i.v中更低)，作用的開始(與i.p相比在i.v中更迅速)以及作用的持續(xù)時間(與i.p相比在i.v中更短)方面有細微的差別。這些觀察與給藥途徑相一致。在i.p研究中注射后的第一個時間點是30分鐘，而i.v注射后其為10分鐘，因此在這些實驗中，作用的開始時間沒有全面地測定。i.v注射后90分鐘，100％的用3或4mg/kg的化合物A處理的動物仍然具有超過介質(zhì)處理的動物兩倍的潛伏時間。在最后的測試時間點(注射后330分鐘)，幾乎70％的用4mg/kg化合物A處理的動物保持增加的對疼痛的抗性。
一旦確定了最佳的劑量，在此單劑量重復實驗較長的一段時間以確定止痛作用的持續(xù)時間。圖9A顯示了在5mg/kg的嗎啡劑量時，潛伏時間更加快速地回到介質(zhì)的基準值，且注射后兩個半小時嗎啡處理的動物的潛伏時間為3.1秒，而用介質(zhì)處理組為2.6秒，上述顯示類似于鹽水。這些觀察與已知的嗎啡短期止痛作用相一致。然而，10mg/kg劑量的化合物A，N，R和Z產(chǎn)生持續(xù)的止痛作用直到實驗的最后測試時間點。注射5個半小時后，化合物A，N，R和Z處理的動物分別顯示出4.9，5.4，6.8和5.2秒的潛伏時間。在此時間點，介質(zhì)處理的動物具有2.5秒的潛伏時間直到尾部翹起，而嗎啡處理的動物被輕微保護，具有3.6秒的潛伏時間。當用顯示增加痛覺喪失的動物的數(shù)目進行分析時，圖9B描述了相同實驗的結(jié)果。結(jié)果顯示了相似的模式，其中顯示嗎啡處理動物中增加的痛覺喪失的動物數(shù)目從注射后半小時的88％快速降至處理后5個半小時的17％。在用10mg/kg化合物A處理的組中，以更緩和的速度降低顯示痛覺喪失提高的動物的百分比，從研究開始的100％降至5個半小時后的80％，以及對于化合物N和Z而言，從70-90％降至研究結(jié)束時的大約60％。在用10mg/kg的化合物R處理的組中獲得了最顯著的結(jié)果，其中100％的動物顯示增加對疼痛的抗性，在整個研究期間，用潛伏時間表示是介質(zhì)的兩倍。
從這些結(jié)果可知，二環(huán)CB2配體具有比嗎啡時間延長的止痛作用，且它們可減輕或治療急性外周疼痛。雖然可與處理的早期相比較，但是在注射后至多90分鐘，二環(huán)CB2配體在獲得的潛伏時間和實現(xiàn)增加潛伏時間的動物的百分比方面都開始開始優(yōu)于嗎啡。應當記住本發(fā)明的化合物是CB2選擇性的，但其中的一些也的確保留對CB1受體的生理學顯著的結(jié)合能力。我們不能排除一些觀察到的活性是只取決于CB1的激活或與更強的CB2的激活的結(jié)合。盡管本發(fā)明的一些化合物的殘余CB1結(jié)合活性，二環(huán)CB2配體仍然在副作用，諸如耐受性方面具有顯著優(yōu)于嗎啡的優(yōu)點，這將在下面討論。
實施例14炎性疼痛的處理大鼠的爪浮腫模型。
此研究的目的是測定化合物對在動物后爪注射2％的λ角叉菜膠誘導的爪浮腫的抗炎性疼痛活性。雄性Sprague Dawley大鼠(平均體重200g，Harlan，以色列)在注射期間被放置在干冰上進行短暫鎮(zhèn)靜。在大鼠的一個(右)爪的足底區(qū)皮下注射0.1ml的2％w/vλ角叉菜膠的無菌鹽水溶液。因為文獻的數(shù)據(jù)通過我們自己的經(jīng)驗已證實，表明注射0.1ml的生理鹽水不影響隨后的止痛測定，因此對側(cè)的(左)爪不用注射。測試化合物，包括已知的抗炎性對照，溶于CREMOPHOR EL∶乙醇中，并在角叉菜膠注射后立即進行的i.p注射之前以1∶20或1∶50進一步稀釋在無菌鹽水中。誘導炎性疼痛前和注射后3小時，在兩個系統(tǒng)中測定動物對痛覺刺激的反應。第一刺激是熱，并根據(jù)Hargreaves的足底實驗利用Ugo Basile模型7370進行評價?？潭仍O定到50個任意單位的強度。對紅腫和非紅腫后爪記錄直到動物舉起爪作為對熱刺激的反應的潛伏時間。第二刺激是機械的(觸覺)，并利用DynamicPlantar Sesthesiomether(Ugo Basile Model 73400-002)進行評價。系統(tǒng)被設置在50克的最大力，且施加的力以10g/秒的速率逐步增加。在研究的結(jié)束，用100mg/kg的戊巴比妥對動物實施安樂死。
結(jié)果測定成在0小時和3小時的兩個后爪之間的差，對研究的熱部分中的潛伏時間為ΔLT，而對研究的機械部分的力為Δ力。每一處理組的結(jié)果被表示為平均值±SE，且組之間的差別通過方差分析(ANOVA)繼之以事后Tukey氏實驗進行分析。p＜0.5的值被認為是統(tǒng)計學上顯著的。
給藥2％λ角叉菜膠誘導爪炎癥，通過爪的腫脹和紅色表征。炎癥誘導后3個小時，未經(jīng)處理的或僅用介質(zhì)處理的動物在熱刺激后后爪之間顯示出大約5到7秒的ΔLT。當該動物用8mg/kg的化合物A(ΔLT＝1.5秒)或10mg/kg的化合物N(ΔLT＝2秒)處理時，這些結(jié)果減少了大約3倍，且當動物用10mg/kg化合物R處理時降至ALT＝0秒。在此模型中，5mg/kg嗎啡也是有效的且減少ALT到0秒。當施加的刺激是觸覺型時，人們觀察到引起大鼠舉起它們的爪所需的力減少了17(從注射角叉菜膠之前的47g降至3個小時后的30g)。同樣該結(jié)果在未經(jīng)處理的和用介質(zhì)處理的動物中是非常相似的，而8mg/kg的化合物A顯著地減少該結(jié)果，降至僅僅2g的Δ力，化合物N產(chǎn)生6g的Δ力，化合物R產(chǎn)生4g的Δ力，且化合物Z產(chǎn)生僅僅2g的Δ力，后面的化合物以10mg/kg進行測試。在2mg/kg劑量時，化合物L在未經(jīng)處理的或介質(zhì)處理的動物引起Δ力的減少從大約20g降至11g。這些值類似于由1mg/kg的化合物R得到的結(jié)果，其被證明在較高的濃度是有效的，然而這種正趨勢沒有統(tǒng)計學顯著性。在此模型中，5mg/kg嗎啡也是同樣有效的，且減少Δ力到2.7克。
二環(huán)CB2配體的抗炎止痛活性不僅與麻醉劑而且與非類固醇抗炎藥物(NSAID)進行比較。在此模型中下列三種藥物被測試Celecoxib(COX-2抑制劑)，Ketoprofen(COX-1抑制因子)和DiClofenac(混合的COX-1和COX-2抑制劑)。下列3種劑量的NSAIDS被測試5，10和20mg/kg，且選擇10mg/kg劑量的中間體用于其余的研究。在以10mg/kg劑量腹腔注射時，所有3種藥物是非常有效的，且減少ΔLT到0秒，然而這些結(jié)果是不顯著的，與10mg/kg化合物R的作用相反。當表示為Δ力時，僅僅Diclofenac和Ketoprofen顯示的活性分別為2和7g。這些值與A，N，R和Z相比在相同的范圍中。
應注意的是，在5mg/kg i.p.注射CB1拮抗劑SR141716A或CB2拮抗劑SR144528的情況下，化合物R也在此實驗設置中被測試，在角叉菜膠和化合物前15分鐘給藥。拮抗劑獨自給藥沒有止痛活性?；衔颮抗熱和機械刺激的止痛活性不被任何拮抗劑逆轉(zhuǎn)。這些觀察可通過拮抗劑沒有充分地阻斷此特異活性的事實，或一些化合物的活性不通過CB2結(jié)合介導而是通過可選擇的機制，例如通過結(jié)合其它的尚未鑒定的大麻堿受體或通過非受體介導的機制的假說來解釋。
總之，這些結(jié)果證明了本發(fā)明的二環(huán)CB2配體是有效的鎮(zhèn)痛藥，具有類似于或優(yōu)于嗎啡或NSAIDS的活性。這些活性是通過CB2結(jié)合還是通過可選擇的機制介導的仍有待于確定。市售的上述治療劑的副作用是眾所周知的，因此本發(fā)明的化合物可有利地代替它們。
實施例15外周有害疼痛的處理福爾馬林實驗。
通過外周神經(jīng)系統(tǒng)介導的疼痛，在用于皮膚(外周的)疼痛的“福爾馬林試驗”中(Tiolson A.等，Pain 515-17，1992)進行測試。首先，測試的化合物經(jīng)i.p.注射。然后在注射該測試化合物后90分鐘在小鼠的后爪的趾面s.c注射福爾馬林。福爾馬林給藥后立即通過動物舔注射福爾馬林的爪的次數(shù)來評價疼痛(每5分鐘評價一次，持續(xù)1小時)。
實施例16腺苷?；h(huán)化酶分析。
大麻堿及衍生物結(jié)合G蛋白偶聯(lián)的CB1以及CB2受體，并且通過抑制腺苷?；h(huán)化酶的活性行使它們的活性。通過確定它們抑制或者促進毛喉素-活化的cAMP的產(chǎn)生能力，對腺苷酰基環(huán)化酶的分析形成了化合物功能分析的基礎。根據(jù)Chin等人(Chin，C.N.等，J.Neurochem.70366-73，1998)進行分析。簡要地，用人類CB1或者CB2受體(cDNA)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293人類腎細胞(ATCC#CRL-1573)生長在補充有10％胎牛血清，1％青霉素-鏈霉素和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中。細胞以5×104細胞/微孔接種在24微孔板中，并培養(yǎng)48小時。然后除去培養(yǎng)基并用PBS清洗粘附細胞。向每個微孔添加補充有0.2mM Ro 20-1724，0.25％BSA以及20mM HEPES的200μl不含血清的培養(yǎng)基。然后在濃度范圍從10pM直至1μM的二環(huán)測試化合物的存在下用1μM毛喉素活化細胞。然后將活化的細胞培養(yǎng)在37℃20分鐘，并加入1.2M HC1到終濃度0.1M以終止反應。通過凍融裂解細胞，并用pH7.5的2M HEPES中和裂解物。利用[3H]-cAMP分析系統(tǒng)(Amersham)測量每份50μl的cAMP。
在這個系統(tǒng)中評價兩個參數(shù)，觀察達到cAMP最大抑制水平50％的劑量(IC50)以及用1μM的測試化合物所達到的抑制水平。必須指出，因為毛喉素通過多種方式活化cAMP的產(chǎn)生，所以只作用于一種受體或者有限量激活途徑的化合物一定難以預料100％的總抑制。這個實驗首先在CB2受體轉(zhuǎn)染的細胞上進行。在1μM時，確定下列化合物的IC50和％抑制HU-210作為參考(1.43nM和50％)，化合物A(0.24nM和63％)，L(未確定和33％)，R(0.47nM和64％)，S(0.16nM和58％)以及Y(1.13nM和60％)。對于對照而言，測試化合物也在非轉(zhuǎn)染的HEK-293細胞中進行測試，并在cAMP的水平上沒有觀察到抑制，這支持了先前描述的結(jié)果實際上特異于CB2受體的事實。對CB1結(jié)合的IC50為0.328nM的參比化合物HU-210，在CB1轉(zhuǎn)染的細胞中顯示對cAMP的IC50為0.35nM，在1μM最大的抑制為73％。同樣，化合物A在CB1轉(zhuǎn)染的細胞中顯示對抑制毛喉素誘導的cAMP產(chǎn)生的IC50為10.3nM，在1μM時最大抑制為69％。CB1結(jié)合化合物A的IC50與28nM的值范圍相同。IC50介于結(jié)合活性和功能抑制cAMP產(chǎn)生之間的類似性，進一步支持了這個實驗設置的相關性。這些結(jié)果顯示二環(huán)CB2配體不僅與受體結(jié)合而且引起源于足夠受體激活的適當?shù)墓δ苄砸l(fā)。從這些觀察可以推導出本發(fā)明的二環(huán)CB2配體起對受體激動劑的作用。
另外，穩(wěn)定表達外源人類CB1或者CB2受體和連接到環(huán)-AMP反應元件(CRE)的熒光素酶報告基因的哺乳動物細胞用諸如毛喉素或者鈣離子載體的不同刺激物活化。激活后，提取細胞并通過熒光素酶分析按照發(fā)光單位測量報告基因的活性。環(huán)狀-AMP的水平通過熒光素酶活性的增加得以反映。
實施例17化合物模擬精神病的作用。
雄性ICR小鼠(平均體重25g，Harlan，Israel)用于一系列影響精神作用的試驗，具體地為運動活性和直腸溫度。在適當?shù)臅r候，測試化合物、已知的和特異性CB1和CB2拮抗劑溶于稀釋在鹽水中的介質(zhì)中，并且以直至3mg/kg i.v.的劑量i.p.或者i.v.注射，所述體積不超過0.05ml/10g體重的小鼠。首次用于實驗的小鼠作為對照。每個處理組由至少6只動物組成。
i.v.給藥處理后5分鐘或者i.p.注射后30分鐘將動物置于露地(60×50cm)。利用基于計算機系統(tǒng)(ViewPoint，F(xiàn)rance)的錄象記錄它們的運動活性。記錄下列參數(shù)3分鐘總距離，時間和動物移動的速度。在露地檢查結(jié)束時，利用恒溫溫度計(Cole Parker型8402-00)和恒溫探針(YSI 400型號402)監(jiān)控另一參數(shù)直腸體溫。
結(jié)果表示為平均值±SE，介質(zhì)和處理之間的差異通過ANOVA繼之以事后Tukey氏試驗進行比較。p＜0.05的值被認為是統(tǒng)計學上顯著的。
就動物移動的總距離而言，觀察處理組之間的波動。i.v.注射介質(zhì)的動物在3分鐘隨訪期間移動1000cm。施用0.1，0.5和1mg/kg化合物A的動物顯示增強的運動活性，總距離在1300和1400cm之間。這個增強統(tǒng)計上是不顯著的。施用1，2，3，4，5和6mg/kg化合物R的動物同樣顯示所行總距離的波動，并且這種現(xiàn)象沒有統(tǒng)計顯著性。同樣，介質(zhì)處理動物的平均速度是5.9秒/cm，而用0.1，0.5和1mg/kg化合物Ai.v.處理的動物的移動速度稍有增加，達7到7.2秒/cm。用1，2，3，4，5和6mg/kg化合物R處理的動物以從4到8秒/cm的速度以劑量依賴的方式移動。這些速度差異在任一方向都不是統(tǒng)計上顯著的。最后，介質(zhì)處理動物的平均直腸體溫是38.4℃。化合物A和R誘導適中約2℃的低溫癥，這在統(tǒng)計學上是顯著的，但是在沒有嚴格生理意義的范圍內(nèi)。利用i.p.給藥途徑反復進行這些實驗，并且產(chǎn)生類似的觀察。兩種給藥途徑之間的唯一差異是i.p.注射的試驗劑量約為更高的數(shù)量級，測試化合物A直至30mg/kg i.p.，而測試化合物R直至40mg/kg。
雖然化合物A和R顯示一些適中的副作用，但是這些現(xiàn)象只在劑量遠遠超過它們的有效劑量至少6-8倍時觀察到，并且小鼠全部對化合物耐受性良好。沒有觀察到死亡，因此最大耐受劑量遠遠超過40mg/kg i.p。注射后在非常短的周期內(nèi)監(jiān)控二環(huán)CB2配體的行為作用并且被證明是不僅適中而且是瞬時的，因為注射后24小時所有動物都恢復到基線行為。應該記住本發(fā)明的化合物優(yōu)選地結(jié)合CB2受體，但是有些化合物保持對CB1受體的結(jié)合能力，所述CB1受體已知介導這種副作用。關于這點，應注意到化合物A和R結(jié)合CB1受體，IC50為約30-40nM。因此可以假定以最低親合性結(jié)合CB1受體的化合物，表達為置換高于40nM的IC50值，甚至會更安全。
測試化合物對全部運動能力的作用在第二實驗設置中進行評定，其中如Rozas等人所述(Rozas G.等人，J.of Neuroscience Methods 83165-75，1998)利用rotarod裝置進行動物的功能試驗。開始實驗前4天訓練動物雄性ICR小鼠(平均體重40g，Harlan，Israel)。它們的任務是停留在加速竿上不落下12分鐘(每個速度3分鐘)。試驗速度為15，19，23和27rpm。對竿上的動物表現(xiàn)記分如下每個動物以每個速度可以獲得在竿上完全行走的3個點(每分鐘1點)的最大值。因此，動物可以得到12點的滿分(每個速度3點)。對動物圍著的每3周來說，抓住竿的環(huán)繞橫梁沒有移動減去0.5點。前3周不影響記分。適當訓練后，每組至少6只動物i.p.施用各種劑量的測試化合物和對照，體積劑量為5ml/kg。注射化合物前零時間以及施用化合物或者介質(zhì)后30分鐘，3和24小時在rotarod裝置中確定記分。
結(jié)果表示為平均值±SD，介質(zhì)和處理之間的差異通過ANOVA繼之以事后Tukey氏檢驗進行比較。p＜0.05的值被認為是統(tǒng)計學上顯著的。在所有時間點，介質(zhì)處理的動物顯示最高分12，因為無論如何它們的運動能力不受影響。用10mg/kg化合物A處理的動物顯示統(tǒng)計上是顯著的，但是注射后三十分鐘運動活性瞬時降低，平均分為5.6。以后時點這種效果消失，在3和24小時平均分分別為9.7以及11.9。在第一個半小時觀察到的這種瞬時作用可能由于CB1結(jié)合化合物A的能力，這暗示與CB1受體以最低親合性結(jié)合的化合物甚至會更安全?；谶@些結(jié)果，在注射后至少半小時的時間點，測試化合物以保證觀察到的作用如果存在的話可以最低限度受到剩余CB1結(jié)合能力的影響。
實施例18化合物對心血管系統(tǒng)的作用。
這個研究的目的是評價測試化合物對雄性Sprague Dawley大鼠(270-350g，Harlan，Israel)的安全性。測試化合物溶于介質(zhì)中，以1∶20稀釋在無菌鹽水中，并i.v.或者i.p.注射，i.v.給藥的劑量范圍從0.1到2mg/kg，或者i.p.給藥的劑量范圍為10到40mg/kg，體積為每100g體重0.5ml。每個處理組由至少6只動物組成。氟烷麻醉(誘導4％并維持)的條件下將一套管(PE 50，Clay Adams，USA)植入股動脈。將導管插入靜脈用于藥物給藥。動脈插管附著于壓力傳感器(Ohmeda DT-XX USA)。轉(zhuǎn)換器連接一數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)(Biopac，USA)。在處理之前記錄心率(HR)、平均動脈血壓(MABP)和心電圖(ECG鉛2)20分鐘用于確立穩(wěn)定的基線，直至注射測試化合物后60分鐘。通過一直腸熱敏探示器(YSI模型400，USA)將動物也連接到溫度記錄器，并在研究期間監(jiān)控直腸溫度。研究結(jié)束時，通過i.p.注射100mg/kg的戊巴比妥鈉處死動物。
介質(zhì)和處理之間的差異通過單向ANOVA繼之以事后Newman-Keuls檢驗(Prism軟件，獲自Graphpad，San Diego)進行比較。p＜0.05的值被認為是統(tǒng)計學上顯著的。
介質(zhì)處理的動物血壓值沒有表現(xiàn)出變化。在約100mmHg的平均值時，MABP保持穩(wěn)定?；衔顰誘導劑量相關的瞬時壓力過低。在最低i.v.試驗劑量，0.1mg/kg注射后5分鐘只引起4mmHg的降低，在以后的時間點(15，30，45和60分鐘)處理動物的MABP恢復到基線。在化合物A的中間劑量0.5mg/kg，在5分鐘MABP減少約25mmHg，注射后30分鐘逐漸升高回到基線范圍，在最高劑量1mg/kg下，5分鐘時的MABP減少約30mmHg，注射后45分鐘逐漸升高回到基線范圍。1mg/kg劑量的化合物R獲得類似的結(jié)果。當i.p.注射時，在直至30mg/kg的劑量時化合物A引起不超過15mmHg適中的血壓過低，而在40mg/kg劑量時化合物R引起至多36mmHg的降低。沒有一個試驗劑量是血壓過低致死的，而且在化合物A和R的最高劑量至多45分鐘期間這個現(xiàn)象是瞬時的。如果血壓過低表現(xiàn)為MABP減少超過50％或者表現(xiàn)為效應延長，則該測試化合物的安全性可能受到質(zhì)疑。
介質(zhì)處理動物的心率顯示出與穩(wěn)定的基準值約每分鐘350次具有非常類似的模式，而0.1mg/kg的化合物A引起HR輕微和瞬時的降低，而更高劑量引起HR更清晰并且更延長的降低。HR的最大下降為約每分鐘80次并且不持續(xù)超過15分鐘，注射后最多45分鐘內(nèi)恢復到正常基準值。此外，當i.p.注射化合物時，化合物A高達20mg/kg的劑量和化合物R高達40mg/kg的劑量幾乎對HR沒有影響。在1小時隨訪(從基線5％)的時間內(nèi)，20mg/kg的化合物A只引起每分鐘約17次的微小降低，而40mg/kg的化合物R引起10％幅度的微小波動，結(jié)果平均只降低每分鐘約4次。相比而言，介質(zhì)處理的動物在HR上也顯示約17次/分鐘的微小降低，與基線相比降低5％。如果對心率的影響表現(xiàn)為每分鐘脈搏的數(shù)目減少超過50％或者表現(xiàn)為效應延長，則該測試化合物的安全性可能受到質(zhì)疑。
在這個研究期間沒有達到最大耐受劑量，并且可以假定經(jīng)i.p.給藥途徑，這個值比至少40mg/kg更高。根據(jù)使用的模型以及試驗的癥狀，本發(fā)明的化合物在mg/kg的劑量范圍內(nèi)顯示出治療上顯著的活性(從約0.1直至10mg/kg)。因此治療范圍大大低于尚未確認的毒性范圍，該毒性范圍至少高出4倍。例如在EAE中，1mg/kg i.p.化合物A引起臨床記分AUC顯著減少35％，在這種情況下治療指數(shù)至少為40，而在爪浮腫的情況下，i.p.0.5mg/kg的化合物R引起爪厚度減少31％，在這種情況下治療指數(shù)至少為80。應該記住在這些模型中，測試化合物的結(jié)果可與市售藥物的活性相比較?？偠灾?，這些結(jié)果支持本發(fā)明的二環(huán)CB2配體對治療很寬范圍的疾病和紊亂都是安全的，并且是有效的替代物。
實施例19反復施用化合物對耐受進展的影響。
當利用嗎啡處置嚴重疼痛狀況時，醫(yī)學團體遇到的主要問題之一是隨時間病人形成對藥物的耐受的事實。為了保持止痛活性，首先可以逐漸增加嗎啡的劑量，但是長期使用將達到飽和點，藥物將不再減輕疼痛。也可能形成大麻堿對CB1受體的選擇性耐受。上述實施例17和18所述的研究已經(jīng)證實，一些二環(huán)CB2配體的剩余CB1結(jié)合力沒有引起嚴重的和延長的副作用，并且全部耐受性良好。對于進一步加強本發(fā)明化合物的安全特性，測試了它們誘導耐受的能力。
在上述的尾部翹起模型中評價耐受性。簡要地，每日二次給每個10只動物的組i.p.施用測試化合物直至10天。如先前實施例13所述，在第1，4，8和10天第一次給藥后30分鐘測定有害疼痛閾。結(jié)果表示為直到動物翹起其尾部的平均潛伏時間±SE。潛伏時間或者各種處理組中顯示痛覺消失的動物的％之間的差異通過方差分析(ANOVA)繼之以事后Tukey氏試驗(對于潛伏時間)或者Fisher氏精確試驗(對于％動物)進行分析。p＜0.05的值被認為是統(tǒng)計學上顯著的。
結(jié)果描述在圖10中，其中圖A顯示了與嗎啡相比化合物A對潛伏時間的影響，而圖B顯示了對顯示痛覺消失增加的動物％的影響。每日施用5mg/kg嗎啡兩次，共10天，引起處理動物所期望的耐受性發(fā)展，表現(xiàn)為在整個研究期間潛伏時間和痛覺消失增加動物的百分比均逐漸降低。在第1天潛伏時間為7.5秒，在第10天潛伏時間僅僅為5.8秒，而在第1天顯示痛覺消失增加的動物的％為80％，而在第10天僅僅為30％。另一方面，每日兩次注射10mg/kg的化合物A對這些參數(shù)沒有顯著的影響，意思指20次以先前證明治療有效的劑量施用化合物A不引起耐受性的發(fā)展。具體地，用10mg/kg化合物A處理的動物在第1天觀察到的潛伏時間為8.1秒，而在第10天潛伏時間仍然高達7秒，而在第1天顯示痛覺消失增加的動物為88％，而在第10天仍然為80％。而且，應該注意到在第10天評價直腸體溫，并且發(fā)現(xiàn)兩個處理組都在正常范圍內(nèi)?？偠灾?，這些研究證實不僅本發(fā)明的化合物比嗎啡在止痛中更有效，而且它們也更安全，因為它們不誘導耐受性。
實施例20I型糖尿病NOD小鼠模型。在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠模型中，測試實驗設置中與人類胰島素-依賴的糖尿病有關的二環(huán)結(jié)合化合物的預防活性。
在第1天稱重NOD/lt雌性小鼠(研究開始時，70-80天齡，Harlan，Israel)。利用通過切斷尾部的頂端獲得的一滴血液和具有合適的glucosticks的糖度計(Elite，Bayer)確定它們的基線葡萄糖水平。然后以300mg/kg劑量i.p.注射小鼠稀釋在鹽水中的環(huán)磷酰胺(Sigma)。每隔一天利用尿multisticks(Bayer)監(jiān)控動物尿液中葡萄糖的存在。當試驗顯示動物達到葡萄糖尿時，過夜饑餓后連續(xù)兩天再評價血液中葡萄糖的水平。如果它們的葡萄糖血液水平高于300mg/dl，動物被確診為患糖尿病。糖尿病診斷后3天，通過i.p.注射戊巴比妥鈉100mg/kg處死動物。取出它們的脾和胰腺進行進一步研究，包括FACS分析脾中的T細胞亞群以及胰腺的組織和免疫病理學評估。
對每個動物在10個Langerhans胰島上進行組織病理學評估，并根據(jù)下列方法記分(Sempe P.等人，Eur.J.Immunol.211163，1991)。根據(jù)單核細胞浸潤的水平對損傷的嚴重性記分0-沒有浸潤，1-小導管周圍浸潤，2-胰島周圍浸潤，3-胰島內(nèi)浸潤，4-與β細胞破裂相關的胰島內(nèi)浸潤。每個動物的胰腺平均分數(shù)通過總分除以檢查的胰島數(shù)進行計算。
實施例21腎缺血。
在大鼠的急性腎缺血模型中測試二環(huán)CB2結(jié)合化合物的腎預防活性。
用分別為8和35mg/kg的甲苯噻嗪和戊巴比妥的組合i.p.注射麻醉雄性Sprague Dawley大鼠(平均體重250g，Harlan，以色列)。然后在兩個腎上雙側(cè)誘導45-分鐘的局部缺血。服鎮(zhèn)靜劑的動物仰臥放置。給腹部皮膚剃毛并用70％乙醇消毒。進行中線皮膚切口(2-3厘米長)，并通過切割腹白線打開腹部。輕輕地將腸移動到反方向后仔細研究腎。當進行這些工作時，用濕(溫鹽水37℃)無菌海綿覆蓋腸。通過從周圍脂肪鈍器解剖分離腎動脈，并用動脈用微鑷子(FST加拿大)在腎門與腎靜脈一起封閉。動脈封閉后迅即變蒼白的腎被認為是缺血性的。只有兩個腎都顯示缺血的動物才包括在研究中。在缺血性損傷期間將腸返回腹腔內(nèi)。用濕海錦(它們通過沖冼溫鹽水保持潮濕)覆蓋傷口。另外，監(jiān)視直腸溫度保持在37℃-38℃之間。利用熱敏電阻(YSI USA型號400)和計量裝置(Cole Farmer型號8402-00)測量直腸溫度。
局部缺血開始后四十五分鐘，除去動脈鉗。通過腎恢復粉紅色驗證再灌注。然后用3-0絲縫線材料(Assut，瑞士)封閉傷口兩層(腹腔壁和皮膚)。缺血性損傷后第1，3和7天，在麻醉室中用乙醚輕微麻醉動物，并在低眼眶凹處穿刺后收集血樣。血液收集在微量離心管中并離心(4000rpm，5分鐘)。然后分離血清并在評估肌酐和血液尿素氮(BUN)的血液水平前保藏在-20℃。研究結(jié)束時，i.p.注射100mg/kg的戊巴比妥鈉使動物安樂死。取出腎，稱重并保藏在4％甲醛溶液中用于其它可能的用途。
缺血性損傷的結(jié)束后迅即對每組10只動物以5ml/kg劑量i.v.施用處理物到股靜脈中。結(jié)果與缺血性(介質(zhì)處理的)和偽品(相同的方法，沒有腎動脈封閉)相比。利用方差比較(ANOVA)繼之以Duncan氏post-hoc檢驗比較BUN和肌酐的血液水平。
實施例22用于測量心臟保護的Langendorff灌注模型。
最近內(nèi)源性大麻堿被證明參與LPS抗心肌缺血的心臟保護效應(Lagneux，C.& Lamontagne，D.，Br.J.Pharmacol.132793-6，2001)。在分離灌注的大鼠心臟的Langendorff模型中檢驗新二環(huán)化合物的心臟保護效應。遵照實驗動物的管理和使用的NIH指南(NIH公布No.85-23，修訂版1996)稱重280±20g的雄性Sprague-Dawley大鼠用于灌注實驗。給動物腹腔內(nèi)注射肝素鈉(500U)并用戊巴比妥(30mg/動物)麻醉。迅即取出心臟并放入肝素化的冰冷鹽溶液中。將主動脈通過導管插入Langendorff灌注器，并切開肺動脈以提供流出物的自由排放。用改性的Krebs-Henseleit(KH)溶液保持逆行主動脈灌注。用95％氧和5％二氧化碳的混合物對KH充氣。保持主動脈灌注在37℃，90cmH2O的恒定壓力下。
正常體溫的短期局部缺血。
心臟經(jīng)歷20min的KH灌注，25分鐘的不流動性全身局部缺血(在37℃)，以及45分鐘的KH再灌注。這已經(jīng)顯示降低工作指標(LVDPxHR)恢復到約40％，通過藥物可能得以改善。在預缺血性灌注、再灌注或者二者期間添加不同濃度的化合物。
血液動力學測量。
將一頂端帶膠乳球的導管插入左側(cè)心房的一小切口并穿過二尖瓣推進到左側(cè)心室。該球通過一壓力轉(zhuǎn)換器與記錄系統(tǒng)(Hewlett Packard7758B，USA)相連。使球充氣并平衡到產(chǎn)生0mm Hg的末端舒張壓。在收縮(+dP/dt)和松弛(-dP/dt)期間，測量左心室的心臟收縮壓和舒張壓以及壓力延續(xù)的時間。由心臟收縮壓和舒張壓之間的差異計算左心室的展開壓力(LVDP)。由LVDP的積和心率(HR)計算心臟的工作指標(LVDPxHR)。在預缺血期間和再灌注過程中通過收集從肺動脈流出的流出物測量冠脈血流量(CF)。如果發(fā)生心律不齊，形成血栓，或者前20分鐘的灌注后LVDP以及心率分別小于60mm Hg和210次/分鐘，從研究中排除所述的心臟。
結(jié)果表示為平均值±SEM。心臟組之間統(tǒng)計學上的差異利用ANOVA以及Mann-Whitney秩檢驗進行計算。p＜0.05被認為是統(tǒng)計學上顯著的。
實施例23化合物對腫瘤細胞系和腫瘤的作用。體外。在存在我們的測試化合物的條件下，測試幾個衍生自腫瘤的細胞系的細胞增殖能力。腫瘤細胞系獲自ATCC，并根據(jù)供應商的說明書培養(yǎng)。細胞接種在24微孔板(105細胞/ml/微孔)并培養(yǎng)過夜。用測試化合物(1-100μM)或者介質(zhì)(0.1％DMSO終濃度)培養(yǎng)細胞。24小時以后利用標準結(jié)晶紫染色確定細胞的存活力。除去微孔的培養(yǎng)基并通過添加1ml/微孔的2％甲醛的PBS溶液固定10分鐘。細胞固定后，用PBS洗滌細胞3次，并給每個微孔添加250μl的0.5％(W/V)結(jié)晶紫，以及在室溫下輕輕攪拌培養(yǎng)板30分鐘。然后用重蒸餾水洗滌染色的細胞3次，并通過向每個微孔添加250μl的10％乙酸提取顏色。在室溫下攪動板15分鐘，一式兩份轉(zhuǎn)移100μl到96微孔板中用于讀數(shù)。在620nm處用ELISA讀數(shù)器測量細胞的光密度(OD)，結(jié)果表示為活細胞％。未經(jīng)處理的細胞的吸光度記錄為100％。確定IC50(劑量抑制細胞生長50％)。
此外，染色細胞的活化半胱氨酸蛋白酶3(caspase 3)以確定它們是否通過細胞程序性死亡機制死亡。棄去微孔的培養(yǎng)基并通過添加1ml的4％甲醛的PBS溶液固定10分鐘。細胞用PBS-0.1％Tween20(PBS-T)洗滌兩次并用冷甲醇滲透20分鐘。細胞用PBS-T洗滌兩次，并與1ml封閉溶液(3％BSA，PBS-T)溫育30分鐘。添加初級抗體(兔抗切割的半胱氨酸蛋白酶3(asp175)細胞信號傳導技術(shù)，用封閉溶液1∶50稀釋)，并在37℃培養(yǎng)細胞60分鐘。用PBS-T洗滌細胞兩次。向微孔添加二級抗體(HRP共軛的抗兔IgG，用封閉溶液以1∶200稀釋)并在室溫下培養(yǎng)60分鐘。用PBS-T洗滌細胞兩次，并與熒光素酪酰胺試劑(NEN，用擴增稀釋劑稀釋1∶50)培養(yǎng)10分鐘。用PBS-T洗滌細胞兩次，并通過熒光或者共焦顯微鏡觀察信號。除監(jiān)控活化的caspase-3之外，將用dexanabinol及其類似物處理的細胞與未經(jīng)處理的細胞比較細胞程序性死亡相關基因的表達。如前所述進行實時RT-PCR。用于每個基因而言，設計一對特異性PCR引物，并根據(jù)ABI方案進行反應。每個基因表達的定量分析水平規(guī)格化到管家基因，并與來自未處理細胞的RNA樣品相比較。
體內(nèi)。一旦我們已經(jīng)選擇了其增殖通過二環(huán)CB2結(jié)合測試化合物體外抑制的腫瘤細胞系，我們就測試其體內(nèi)的效力。根據(jù)供應商的說明書培養(yǎng)細胞。在裸CD-1雄性小鼠(平均體重20-25g，Harlan，Israel)的右股骨關節(jié)以上s.c.注射預定量(每動物0.12ml恒定體積的1×106細胞)。每個處理組由至少7只動物組成。每日臨床監(jiān)控每只動物。在每日訪問期間也監(jiān)控腫瘤的生長但是每周一次記錄實際的測量。當腫瘤達到合適的大小時，用介質(zhì)，5ml/kg/天或者用我們的測試化合物在2.5到10mg/kg/天的劑量范圍內(nèi)處理動物。
實施例24化合物在炎性腸病模型中的作用。
在大鼠乙酸誘導的IBD掩蔽研究中測試二環(huán)CB2結(jié)合化合物的抗炎活性。
通過i.p.注射克他命∶rompun組合(分別為100∶10mg/kg)，輕微麻醉雄性Sprague Dawley大鼠(10周齡，200-250g，Harlan，Israel)。將聚乙烯導管(外徑1.7mm)插入直腸5cm進入結(jié)腸內(nèi)。然后慢慢地將2ml的5％乙酸施用到結(jié)腸內(nèi)。15秒后，用3ml鹽水清洗結(jié)腸，15秒以后用另外的3ml鹽水洗滌。其后迅即，用任一種合適的處理物處理每個動物組。所有的處理物每天施用一次，共7天。臨床跟蹤動物1周。在這期間，每日監(jiān)控并記錄下列參數(shù)體重、糞便中血液的存在以及糞便的稠度。這些發(fā)現(xiàn)根據(jù)表1進行記分。
表1IBD疾病活性指數(shù)(DAI#)的記分標準(Murthy S.N.等，Dig.Dis.Sci.381722-34，1993)。

#DAI-(重量損失，糞便稠度以及出血的組合記分)/3。
*正常的糞便-形成良好的小球；稀糞-蒼白糞便不粘住肛門；以及腹瀉-液體糞便粘住肛門。
誘導動物疾病后7天用戊巴比妥100mg/kg i.p.處死動物。切除全部結(jié)腸，縱向切開并在放大鏡下檢驗，記錄所有明顯的損傷并根據(jù)表2記分。
表2評價IBD嚴重性的總的病理學記分方法(Wong等，J.Pharm.Exp.Ther.274475-80，1995)。

利用方差分析(ANOVA)繼之以post-hoc試驗分析臨床結(jié)果。非參數(shù)檢驗(Wilcoxon秩和檢驗)用于評價總的病理學發(fā)現(xiàn)。
制劑實施例用于復溶的凍干粉末。如上所述，一些本發(fā)明的化合物高度親脂，計算的LogP高于5，使它們十分不溶于水。雖然這些化合物可以配制在多種組合物中，使所述組合物具有它們的親脂性，但是已經(jīng)使用了基于母體化合物化學修飾的方法以改善水溶性從而擴大制劑的范圍以及適合于所述化合物的給藥途徑。一種這樣的例子為化合物R，其是化合物A的半琥珀酸酯衍生物。這個酯化步驟顯著提高了pH7時化合物計算的logD。化合物A具有6.21的logD，雖然其半琥珀酸酯衍生物化合物R只有3.76的logD(利用ACD軟件計算)。根據(jù)水溶性，這指的是在中性pH時，化合物A預計溶于水，濃度為7.6×10-5g/l，而化合物R預計可溶解至0.024g/l。提高的溶解性打開了替代制劑，諸如制備用于復溶的凍干粉末。
30毫克的化合物R溶于0.3ml的叔丁醇中。為了獲得最終5mg/ml的藥物濃度，添加6ml的磷酸鹽緩沖液(NaH2PO4以及Na2HPO4，pH7.8，80mM)。然后添加150mg的乳糖獲得最終25mg/ml的乳糖濃度。隨著化合物的溶解，溶液的pH趨向降低，并且利用0.2N的NaOH再調(diào)整到pH7.8。所得溶液冷凍干燥過夜獲得凍干粉末。化合物R的凍干粉末隨后用水重新溶解獲得約5mg/ml終濃度范圍的酯衍生物的透明溶液，所述終濃度與最初的76ng/ml化合物A母體藥物相比溶解性意外的顯著增加。也制備除了磷酸鹽緩沖液以外還包含濃度為9mg/ml的苯甲醇的相同制劑?？梢蕴砑?％的蔗糖或者5％的甘露糖醇，或者2％的甘油，或者5％的葡聚糖，或者直至5％，優(yōu)選地1-2.5％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K-30或者PVP K-10代替乳糖作為稀釋劑以及冷凍干燥過程中的防凍劑。用無菌水重新溶解凍干化合物R用于沖洗，并且如HPLC所監(jiān)控，顯示至少穩(wěn)定長達2小時。在這期間高達14％的化合物R水解成母體化合物A。如上所述，當配制在CREMOPHOREL∶乙醇時，化合物R具有生物學活性。初步研究顯示重新溶解的凍干化合物R也實現(xiàn)了化合物的治療目標。例如，配制在助溶劑中的化合物R在大約1μM/kg時使爪浮腫程度最大減少31％，而重新溶解的凍干化合物R在約0.5μM/kg時相同的模型中使爪浮腫減少29.5％。這個研究結(jié)果表明本發(fā)明的化合物可以制備成藥用鹽或者酯衍生物，從而使得各種劑型的制備以及通過各種途徑施用這種化合物處理由上述模型所引發(fā)的疾病成為可能。
雖然本發(fā)明僅僅為了說明目的提出各種不同的具體實施方案而已加以描述，但是這種具體公開的實施方案不應該理解為限制性的。根據(jù)申請人在這里的公開內(nèi)容，本領域技術(shù)人員可以得出很多其它這樣的實施方案，并且申請人認為本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅受所附權(quán)利要求書的限制。
權(quán)利要求
1.一種通式(I)的化合物及其藥用鹽，酯或溶劑化物式I 式I具有特異性立體化學結(jié)構(gòu)，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質(zhì)子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質(zhì)子為反式；并且其中R1選自(a)O或者S，(b)C(R′)2，其中每次出現(xiàn)的R′獨立地選自氫、氰基、-OR″、-N(R″)2，飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″或者C1-C6烷基-N(R″)2，其中每次出現(xiàn)的R″獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出現(xiàn)的R獨立地選自氫或者飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基，并且(c)NR″或者N-OR″，其中R″如前所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)鹵素，(b)-R″、-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出現(xiàn)的R″如前所定義，(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，R″如前所定義，以及(d)以-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作為末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基，每次出現(xiàn)的Re選自氫和如前所定義的Rd；和R4選自(a)R，其中R選自氫、鹵素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2、SR、以及C(S)R，其中每次出現(xiàn)的R如前所定義，(b)飽和或者不飽、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基-R，其中R如前所定義，(c)芳香環(huán)，其可在任一位置由R進一步取代，其中R如前所定義，以及(d)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基，其任選地以芳香環(huán)作為末端，所述芳香環(huán)可以如(c)所定義被進一步取代；附帶條件是當R1為O并且R2和R3為OH時，那么R4不是直鏈或者支鏈的C5-C10烷基、C5-C10烯基、C5-C8環(huán)烷基以及C5-C8環(huán)烯基。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為O、CH2或者N-OH，R2和R3各自獨立地為H、OH、OCH3、琥珀酸酯、延胡索酸酯或者二乙基磷酸酯，并且R4為1，1-二甲基-戊基、1，1-二甲基-庚基、1，1-二甲基-戊-4-烯基、1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-5-溴-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基，1，1，3-三甲基-丁基，1-甲基-1-對氯苯基-乙基或者1-乙基-1-甲基-丙基，附帶條件如對式(I)的限定。
3.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為O，R2以及R3為OH，而R4為1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-5-溴-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基或者1-甲基-1-對氯苯基-乙基。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為O，R4為1，1-二甲基庚基，以及R2和R3都為H、OCH3、二乙基磷酸酯或者琥珀酸酯。
5.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為O，R4為1，1-二甲基-庚基，R2為OH，以及R3為OCH3、二乙基磷酸酯、延胡索酸酯或者琥珀酸酯。
6.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為O，R2為琥珀酸酯，R3為OH，并且R4為1，1-二甲基-戊基。
7.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為CH2，R4為1，1-二甲基-庚基，R2和R3都為OCH3或者二乙基磷酸酯。
8.權(quán)利要求1的化合物，其中R1為NOH，R2和R為OH，并且R4為1，1-二甲基-庚基。
9.一種通式(II)的化合物及其藥用鹽、酯或溶劑化物式II 式II具有特異性立體化學結(jié)構(gòu)，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質(zhì)子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質(zhì)子為反式，并且C-2------C-3為任選的雙鍵；以及其中R5選自(a)鹵素或者氫，(b)-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出現(xiàn)的R″獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出現(xiàn)的R獨立地選自氫或者飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基，(c)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基-SR″或者C1-C6烷基-S(O)(O)NR″，其中R″如前所述，(d)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，其中每次出現(xiàn)的R″如前所定義，(e)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基-S(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)ORb，其中Rb如前所定義，以及(f)-Rc，其中Rc選自飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基，C1-C6烷基-OR″，C1-C6烷基-N(R″)2，C1-C6烷基-C(O)OR″，以及C1-C6烷基-C(O)N(R″)2，其中每次出現(xiàn)的R″如前所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)鹵素，(b)-R″，-OR″，-N(R″)2，-SR″，-S(O)(O)NR″，其中每次出現(xiàn)的R″如前所述，(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb如前所定義，以及(d)以-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作為末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或者-OC(ORd)-鏈，其中Rd為飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀C1-C6烷基，而且每次出現(xiàn)的Re選自氫和如前所定義的Rd；并且選自(a)R，其中R選自氫、鹵素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2，SR，和C(S)R，其中每次出現(xiàn)的R如前所定義；(b)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基-R，其中R如前所定義，(c)芳香環(huán)，其可在任一位置由R進一步取代，其中R如前所定義，以及(d)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基，其任選地以芳香環(huán)作為末端，所述芳香環(huán)可以如(c)所定義進一步取代；附帶條件是當R5為Rc時，那么R4不是直鏈或者支鏈的C1-C12烷基鏈，直鏈或者支鏈飽和的-O-C2-C9烷氧鏈，其任選末端碳由苯基取代，并且直鏈或者支鏈飽和的C1-C7烷基鏈，其以羥基或者直鏈或者支鏈飽和的O-C1-C5烷氧鏈作為末端。
10.權(quán)利要求9的化合物，其中R5為CH2OC(O)C(CH3)3、OH或者CH3，R2和R3各自獨立地為OH、H或者二乙基磷酸酯，R4為CH2OC(O)(CH2)3CH3、1，1-二甲基-庚基、1，1-二甲基-乙基-苯基或者1，1-二甲基-庚-6-炔基，以及在C-2和C-3之間有一個任選的雙鍵，附帶條件如對式(II)的限定。
11.權(quán)利要求9的化合物，其中R5為OH，R4為1，1二甲基-庚基，R2和R3都為H、OH或者二乙基磷酸酯，并且在C-2和C-3之間有一單鍵。
12.權(quán)利要求9的化合物，其中R5為CH3，R2和R3為OH，R4為1，1-二甲基-庚-6-炔基、1，1-二甲基-乙基-苯基或者CH2OC(O)(CH2)3CH3，并且在C-2和C-3之間有一個雙鍵。
13.權(quán)利要求9的化合物，其中R5為CH2OC(O)C(CH3)3，R2和R3為OH，R4為1，1-二甲基-戊基，并且在C-2和C-3之間有一雙鍵。
14.含有通式(III)化合物作為活性成分以及進一步含有藥用稀釋劑或載體的藥物組合物式III 式III具有特異性立體化學結(jié)構(gòu)，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質(zhì)子彼此之間為順式，而在C-4和C-5位置的質(zhì)子為反式；并且其中R1選自(a)O或者S，(b)C(R′)2，其中每次出現(xiàn)的R′獨立地選自氫、氰基、-OR″、-N(R″)2，飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″或者C1-C6烷基-N(R″)2，其中每次出現(xiàn)的R″獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出現(xiàn)的R獨立地選自氫或者飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基，并且(c)NR″或者N-OR″，其中R″如前所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)鹵素，(b)-R″、-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出現(xiàn)的R″如前所定義，(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR″以及C1-C6烷基-N(R″)2，R″如前所定義，以及(d)以-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作為末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或者-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或者不飽和、直鏈、支鏈的或者環(huán)狀的C1-C6烷基，并且每次出現(xiàn)的Re選自氫和如前所定義的Rd；和R4選自(a)R，其中R選自氫、鹵素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2、SR、以及C(S)R，其中每次出現(xiàn)的R如前所定義，(b)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基-R，其中R如前所定義，(c)芳香環(huán)，其可在任一位置由R進一步取代，其中R如前所定義，以及(d)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基，其任選地以芳香環(huán)作為末端，所述芳香環(huán)可以如(c)所定義進一步取代。
15.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中R1為O、CH2或者N-OH，R2和R3各自獨立地為H、OH、OCH3、琥珀酸酯、延胡索酸酯或者二乙基磷酸酯，并且R4為1，1-二甲基-戊基、1，1-二甲基-庚基、1，1-二甲基-戊-4-烯基、1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-5-溴-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基，1，1，3-三甲基-丁基，1-甲基-1-對氯苯基-乙基或者1-乙基-1-甲基-丙基。
16.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中R1是O，R2和R3為OH，而R4為1，1-二甲基-戊基、1，1-二甲基-庚基、1，1-二甲基-戊-4-烯基、1，1-二甲基-3-苯基-丙基，1，1-二甲基-庚-6-炔基，1，1-二甲基-5-溴-戊基，1，1-二甲基-5-氰基-戊基，1，1，3-三甲基-丁基，1-甲基-1-對氯苯基-乙基或者1-乙基-1-甲基-丙基。
17.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中R1為O，R4為1，1-二甲基-庚基，以及R2和R3都為H、OCH3、二乙基磷酸酯或者琥珀酸酯。
18.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中R1為O，R4為1，1-二甲基-庚基，R2為OH，以及R3為OCH3、二乙基磷酸酯、延胡索酸酯或者琥珀酸酯。
19.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中R1為O，R2為琥珀酸酯，R3為OH，并且R4為1，1-二甲基-戊基。
20.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中R1為CH2，R4為1，1-二甲基-庚基，R2和R3都為OCH3或者二乙基磷酸酯。
21.權(quán)利要求14的藥物組合物，其中R1為NOH，R2和R為OH，并且R4為1，1-二甲1，1-二甲基-庚基。
22.含有通式(II)化合物作為活性成分以及進一步含有藥用稀釋劑或載體的藥物組合物式II 式II具有特異性立體化學結(jié)構(gòu)，其中C-5為S，在C-1和C-5位置的質(zhì)子彼此之間為順式，在C-4和C-5位置的質(zhì)子為反式，并且C-2------C-3為任選的雙鍵；并且其中R5選自(a)鹵素或者氫，(b)-OR″、-N(R″)2、-SR″、-S(O)(O)NR″，其中每次出現(xiàn)的R″獨立地選自氫、C(O)R、C(O)N(R)2、C(S)R、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR以及C1-C6烷基-N(R)2，其中每次出現(xiàn)的R獨立地選自氫或者飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀C1-C12烷基，(c)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀C1-C6烷基-SR″或者C1-C6烷基-S(O)(O)NR″，其中R″如前所述，(d)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb選自氫、飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基、C1-C6烷基-OR”以及C1-C6烷基-N(R”)2，其中每次出現(xiàn)的R”如前所定義，(e)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀C1-C6烷基-S(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)Rb，C1-C6烷基-S(O)(O)ORb，其中Rb如前所定義，以及(f)-Rc，其中Rc選自飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基，C1-C6烷基-OR″，C1-C6烷基-N(R″)2，C1-C6烷基-C(O)OR″，以及C1-C6烷基-C(O)N(R″)2，其中每次出現(xiàn)的R″如前所定義；R2和R3各自獨立地選自(a)鹵素，(b)-R″，-OR″，-N(R″)2，-SR″，-S(O)(O)NR″，其中每次出現(xiàn)的R″如前所述，(c)-S(O)Rb、-S(O)(O)Rb、-S(O)(O)ORb，其中Rb如前所定義，以及(d)以-C(O)OH、-S(O)(O)ORe或者-P(O)(ORe)2作為末端的-OC(O)OH、-OS(O)(O)ORe、-OP(O)(ORe)2、-ORd或者-OC(O)-Rd鏈，其中Rd為飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C6烷基，而且每次出現(xiàn)的Re選自氫和如前所定義的Rd；以及選自(a)R，其中R選自氫、鹵素、OR、OC(O)R、C(O)OR、C(O)R、OC(O)OR、CN、NO2、N(R)2、NC(O)R、NC(O)OR、C(O)N(R)2、NC(O)N(R)2、SR，和C(S)R，其中每次出現(xiàn)的R如前所定義；(b)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基-R，其中R如前所定義，(c)芳香環(huán)，其可在任一位置由R進一步取代，其中R如前所定義，以及(d)飽和或者不飽和、直鏈、支鏈或者環(huán)狀的C1-C12烷基，其任選地以芳香環(huán)作為末端，所述芳香環(huán)可以如(c)所定義進一步取代；附帶條件是當R5為Rc時，那么R4不是直鏈或者支鏈的飽和C1-C12烷基鏈，直鏈或者支鏈飽和的-O-C2-C9烷氧鏈，其任選地末端碳由苯基取代，以及直鏈或者支鏈飽和的C1-C7烷基鏈，其以羥基或者直鏈或者支鏈飽和的O-C1-C5烷氧鏈作為末端。
23.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中R5是CH2OC(O)C(CH3)3、OH或者CH3，R2和R3各自獨立地為OH、H或者二乙基磷酸酯，R4為CH2OC(O)(CH2)3CH3，1，1-二甲基-庚基，1，1-二甲基-乙基-苯基，或者1，1-二甲基-庚-6-炔基，并且在C-2和C-3之間具有任選的雙鍵，附帶條件如式(II)所定義。
24.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中R5為OH，R4為1，1二甲基-庚基，R2和R3都為H、OH或者二乙基磷酸酯，并且在C-2和C-3之間具有一單鍵。
25.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中R5為CH3，R2和R3為OH，R4為1，1-二甲基-庚-6-炔基、1，1-二甲基-乙基-苯基或者CH2OC(O)(CH2)3CH3，并且在C-2和C-3之間具有一個雙鍵。
26.權(quán)利要求22的藥物組合物，其中R5為CH2OC(O)C(CH3)3，R2和R3為OH，R4為1，1-二甲基-戊基，并且在C-2和C-3之間具有一雙鍵。
27.根據(jù)權(quán)利要求14到26任一項的藥物組合物，其中稀釋劑包括含有藥用助溶劑的助溶劑水溶液，用天然或者合成的離子或者非離子表面活性劑制備的膠束溶液或者乳劑，或者這種助溶劑和膠束或者乳劑溶液的組合。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的藥物組合物，其中載體包括乙醇，表面活性劑和水的溶液。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的藥物組合物，其中載體為含有甘油三酯、卵磷脂、甘油、乳化劑和水的乳液。
30.根據(jù)權(quán)利要求14到26任一項的藥物組合物，其是單位劑型。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的藥物組合物，適用于口服。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的藥物組合物，適用于腸胃外給藥。
33.一種預防，緩解或者治療對CB2受體調(diào)節(jié)敏感的疾病或者紊亂的方法，通過給需要治療的個體施用治療有效量的權(quán)利要求14到26任一項的藥物組合物進行。
34.一種預防，緩解或者治療自身免疫病和炎癥，類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、全身性紅斑狼瘡、重癥肌無力、I型糖尿病、肝炎、牛皮癬、炎性腸病、器官移植中的組織排斥、吸收不良綜合癥、脂瀉病、肺疾病、哮喘以及Sjgren氏綜合癥的方法，通過給需要治療的個體施用治療有效量的權(quán)利要求14到26任一項的藥物組合物進行。
35.一種預防，緩解或者治療神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、中風、偏頭痛、叢發(fā)性頭痛、神經(jīng)退行性疾病，帕金森氏癥、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、亨廷頓氏舞蹈癥、朊病毒相關疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毒以及肌肉痙攣和震顫的方法，通過給需要治療的個體施用治療有效量的權(quán)利要求14到26任一項的藥物組合物進行。
36.一種預防，緩解或者治療包括外周、內(nèi)臟、神經(jīng)性、炎性以及關聯(lián)痛的疼痛的方法，通過給需要治療的個體施用治療有效量的權(quán)利要求14到26任一項的藥物組合物進行。
37.一種預防，緩解或者治療心血管紊亂、心律不齊、高血壓和心肌缺血性損傷的方法，通過給需要治療的個體施用治療有效量的權(quán)利要求14到26任一項的藥物組合物進行。
38.一種預防，緩解或者治療癌癥的方法，通過給需要治療的個體施用治療有效量的權(quán)利要求14到26任一項的藥物組合物進行。
39.一種預防，緩解或者治療神經(jīng)性疼痛的方法，通過給需要治療的個體施用治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包括(+){4-[4-(1，1-二甲基庚基)-2，6-二甲氧基-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-烯-2-基}-甲醇作為活性成分。
40.一種預防，緩解或者治療帕金森氏癥的方法，通過給需要治療的個體施用治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包括(+){4-[4-(1，1-二甲基庚基)-2，6-二甲氧基-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-烯-2-基}-甲醇作為活性成分。
41.根據(jù)權(quán)利要求33到40任一項的方法，其中組合物通過口服、腸胃外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、損傷內(nèi)、皮下、透皮、鞘內(nèi)、直腸和鼻內(nèi)進行給藥。
42.權(quán)利要求14到26任一項的組合物在制備用于預防，緩解或者治療對CB2受體調(diào)節(jié)敏感的疾病或者紊亂的藥物中的應用。
43.權(quán)利要求14到26任一項的組合物在制備用于預防，緩解或者治療自身免疫病和炎癥，類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、全身性紅斑狼瘡、重癥肌無力、I型糖尿病、肝炎、牛皮癬、炎性腸病、器官移植中的組織排斥、吸收不良綜合癥、脂瀉病、肺疾病、哮喘以及Sjgren氏綜合癥的免疫調(diào)節(jié)及抗炎性藥物中的應用。
44.權(quán)利要求14到26任一項的組合物在制備用于預防，緩解或者治療神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、中風、偏頭痛、叢發(fā)性頭痛、神經(jīng)退行性疾病、帕金森氏癥、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、亨廷頓氏舞蹈癥、朊病毒相關疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毒以及肌肉痙攣和震顫的神經(jīng)保護性藥物中的應用。
45.權(quán)利要求14到26任一項的組合物在制備用于預防，緩解或者治療包括外周、內(nèi)臟、神經(jīng)性、炎性以及關聯(lián)痛的疼痛的止痛藥物中的應用。
46.權(quán)利要求14到26任一項的組合物在制備用于預防，緩解或者治療心血管紊亂、心律不齊、高血壓和心肌缺血性損傷的藥物中的應用。
47.權(quán)利要求14到26任一項的組合物在制備用于預防，緩解或者治療癌癥的藥物中的應用。
48.(+){4-[4-(1，1-二甲基庚基)-2，6-二甲氧基-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-烯-2-基}-甲醇在制備用于預防，緩解或者治療神經(jīng)性疼痛的藥物中的應用。
49.(+){4-[4-(1，1-二甲基庚基)-2，6-二甲氧基-苯基]-6，6-二甲基-二環(huán)[3.1.1]庚-2-烯-2-基}-甲醇在制備用于預防，緩解或者治療帕金森氏癥的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及非典型的大麻堿(cannabinoids)，也就是外周大麻堿受體CB2的配體，及其包括作為活性成分的新(+)α－蒎烯衍生物的藥物組合物，其可用于預防和治療自身免疫性疾病，所述自身免疫性疾病包括但不限于如說明書中所示的風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、全身性紅斑狼瘡、重癥肌無力、I型糖尿病、肝炎、牛皮癬和免疫相關的紊亂，包括但不限于器官移植中的組織排斥、吸收不良綜合征諸如脂瀉病、肺疾病諸如哮喘以及Sjgren氏綜合癥，包含炎性腸病的炎癥，包含外周、內(nèi)臟、神經(jīng)性、炎性以及關聯(lián)痛的疼痛，肌肉痙攣，包含心律不齊、高血壓和心肌缺血的心血管紊亂，包含中風、偏頭痛和叢發(fā)性頭痛的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，包含帕金森氏癥、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化、亨廷頓氏舞蹈癥、朊病毒相關神經(jīng)退行性病變的神經(jīng)退行性疾病，CNS中毒以及某些類型的癌癥。
文檔編號C07F9/12GK1627939SQ03803173
公開日2005年6月15日 申請日期2003年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月31日
發(fā)明者阿倫·加爾松, 喬治·芬克, 達利特·埃絲特·達爾, 納伊姆·梅納什, 阿耶萊特·努德爾曼, 奧里特·格林伯格, 阿維海.亞科萬 申請人:法瑪氏公司