專利名稱：二氫硫雜菲羰基胍類化合物、其制備方法以及其作為藥物或診斷試劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及式(I)的二氫硫雜菲羰基胍類化合物， 其中定義如下R(1)和R(3)彼此獨立地表示氫、含1，2，3或4個碳原子的烷基、含1，2，3或4個碳原子的烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、NR(10)R(11)、-Op-(CH2)n-(CF2)x-CF3或-(SOm)p-(CH2)n-(CF2)x-CF3；R(10)和R(11)彼此獨立地表示氫、含1，2，3或4個碳原子的烷基或-(CH2)n-(CF2)x-CF3；m 0、1或2；n 0、1、2、3、4、5或6；x和p彼此獨立地表示0或1；R(2)氫、F、Cl、Br、I、CN、含1，2，3或4個碳原子的烷基、甲氧基、含3，4，5，6，7或8個碳原子的環(huán)烷基；R(4)和R(5)彼此獨立地表示氫、含1，2，3或4個碳原子的烷基；
R(6)、R(7)、R(8)和R(9)彼此獨立地表示氫、含1，2，3或4個碳原子的烷基、含1，2，3或4個碳原子的烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、NR(12)R(13)、-Oq-(CH2)r-(CF2)s-CF3或-(SOw)t-(CH2)u-(CF2)v-CF3；R(12)和R(13)彼此獨立地表示氫、含1，2，3或4個碳原子的烷基；w 0、1或2；r和u0、1、2、3、4、5或6；q、s、t和v彼此獨立地表示0或1；或R(6)和R(7)或R(7)和R(8)或R(8)和R(9)與相連的苯環(huán)共同構(gòu)成萘環(huán)體系；A -S-，-SO-或-SO2-及其可藥用鹽。
優(yōu)選的式(I)化合物說明如下R(1)和R(3)彼此獨立地表示氫、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、F、Cl、CN、NR(10)R(11)、-Op-(CH2)n-CF3或-(SOm)p-(CH2)n-CF3；R(10)和R(11)彼此獨立地表示氫、甲基、乙基或-CH2-CF3；m 0、1或2；n 0、1、2或3；p 0或1；R(2)氫、F、Cl、CN、含1，2，3或4個碳原子的烷基、甲氧基、含3，4，5或6個碳原子的環(huán)烷基；R(4)和R(5)
彼此獨立地表示氫、甲基或乙基；R(6)、R(7)、R(8)和R(9)彼此獨立地表示氫、含1，2，3或4個碳原子的烷基、甲氧基、乙氧基、F、Cl、CN、NR(12)R(13)、-Oq-(CH2)r-CF3或-(SOw)t-(CH2)u-CF3；R(12)和R(13)彼此獨立地表示氫、甲基或乙基；w 0、1或2；r和u0、1、2或3；q和t彼此獨立地表示0或1；或R(6)和R(7)或R(7)和R(8)或R(8)和R(9)與相連的苯環(huán)共同構(gòu)成萘環(huán)體系；A -S-、-SO-或-SO2-及其可藥用鹽。
特別優(yōu)選的式(I)化合物說明如下R(1)氫、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、F、Cl、NR(10)R(11)、-Op-(CH2)n-CF3或-(SOm)p-(CH2)n-CF3；R(10)和R(11)彼此獨立地表示氫、甲基、乙基或-CH2-CF3；m 0、1或2；n、p彼此獨立地表示0或1；R(2)氫、F、Cl、甲基、含3，4，5或6個碳原子的環(huán)烷基；R(3)、R(4)和R(5)氫；
R(6)、R(7)、R(8)和R(9)彼此獨立地表示氫、甲基、甲氧基、乙氧基、F、Cl、NR(12)R(13)、-Oq-(CH2)r-CF3或-(SOw)t-(CH2)u-CF3；R(12)和R(13)彼此獨立地表示氫、甲基或乙基；w 0、1或2；q、r、t和u彼此獨立地表示0或1；或R(6)和R(7)或R(7)和R(8)或R(8)和R(9)與相連的苯環(huán)共同構(gòu)成萘環(huán)體系；A -S-、-SO-或-SO2-及其可藥用鹽。
非常特別優(yōu)選的式(I)化合物說明如下R(1)氫、甲基、甲氧基、乙氧基、Cl、NR(10)R(11)、-O-CH2-CF3或-(SOm)p-(CH2)n-CF3；R(10)和R(11)彼此獨立地表示氫、甲基、乙基或-CH2-CF3；m 0、1或2；p 0或1；R(2)氫、F、Cl或甲基；R(3)、R(4)和R(5)氫；R(6)、R(7)、R(8)和R(9)彼此獨立地表示氫、甲基、甲氧基、乙氧基、F、Cl、-O-CH2-CF3或-(SOw)t-(CH2)u-CF3；w 0、1或2；
t和u彼此獨立地表示0或1；或R(6)和R(7)或R(7)和R(8)或R(8)和R(9)與相連的苯環(huán)共同構(gòu)成萘環(huán)體系；A -SO2-及其可藥用鹽。
帶有適當(dāng)取代基的式I化合物可能存在立體異構(gòu)形式。如果式I化合物含有一個或多個不對稱中心，對每個不對稱中心就可能存在彼此獨立的S構(gòu)型或R構(gòu)型。所有可能的立體異構(gòu)體，例如對映異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體，以及兩種或兩種以上立體異構(gòu)形式的混合物，例如任意比例的對映異構(gòu)體和/或非對映異構(gòu)體，均屬于本發(fā)明范疇。這樣一來，屬于本發(fā)明范疇的對映異構(gòu)體既包括光學(xué)對映純的(包括左旋體和右旋體兩種)形式，也包括不同比例的兩種對映異構(gòu)體的混合物或者外消旋體形式。如果需要，單一的立體異構(gòu)體可以通過常規(guī)的方法對混合物進行拆分獲得，或者通過例如立體選擇性合成的方法獲得。如果存在活潑氫原子，本發(fā)明化合物還包含式I化合物的所有互變異構(gòu)體。
所述烷基可以是直鏈或支鏈烷基。本發(fā)明還涉及化合物I的制備方法，其包括將式II化合物與胍反應(yīng) 其中R(1)至R(9)及A具有如上所述的含義，L是易于進行親核取代的離去基團。
式II的活化酸衍生物，其中L為烷氧基，優(yōu)選為甲氧基、苯氧基、苯硫基、甲硫基、2-吡啶硫基、含氮雜環(huán)，優(yōu)選1-咪唑基，可以方便地根據(jù)本身已知的方法由碳酰氯(式II，L＝Cl)制得，這些碳酰氯可根據(jù)本身已知的方法由羧酸(式II，L＝OH)與例如亞硫酰氯制得。
除了用式II的碳酰氯(L＝Cl)外，還可以用本身已知的方法直接從苯甲酸衍生物(式II，L＝OH)制備其它的活化的式II酸衍生物，例如用氯化氫氣體的甲醇溶液處理得到式II化合物的甲酯(式II，L＝OCH3)，用羰基二咪唑處理得到式II的咪唑衍生物[L＝1-咪唑基，Staab，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1，351-367(1962)]，在惰性溶劑、三乙胺存在條件下用Cl-COOC2H5或甲苯磺酰氯處理得到式II的混和酸酐，也可以用二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)或氧代-[(氰基(乙氧羰基)亞甲基)氨基]-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽(“TOTU”)[Proceedings of the 21st European Peptide Symposium，Peptides 1990，E.Giralt和D.Andreu編輯，Escom，Leiden，1991]來活化苯甲酸。在J.March，高等有機化學(xué)，第三版(John Wiley & Sons，1985)中列出了許多可用于制備式II的活化羧酸衍生物的方法，在350頁列出了文獻來源。
式II羧酸的活化衍生物與胍的反應(yīng)按照本身已知的方法在惰性的質(zhì)子性或非質(zhì)子性的極性有機溶劑中進行。在苯甲酸甲酯(II，L＝OMe)與胍的反應(yīng)中被證實可用的是甲醇、異丙醇或四氫呋喃，反應(yīng)溫度在20℃至所用溶劑沸點之間。大多數(shù)式II化合物與無鹽胍的反應(yīng)在非質(zhì)子性惰性溶劑如THF、二甲氧基乙烷、二氧雜環(huán)己烷中進行對反應(yīng)是有利的。然而，如果引入一種堿，例如NaOH時，水同樣可以作為式II化合物與胍的反應(yīng)溶劑。
當(dāng)L為Cl時，加入酸清除劑，例如通過加入過量的胍的方式來結(jié)合氫鹵酸對反應(yīng)是有利的。
優(yōu)選地，二氫硫雜菲羧酸結(jié)構(gòu)的組裝有利地起始于適當(dāng)取代的芐硫基、苯甲亞磺?；?、苯甲磺?；?。按照已知的方法(見Chem.Rev.95(7)，2457(1995)或“Metal-catalyzed Cross-coupling Reactions”，Diederich，F(xiàn)rancois；Stang，Peter J，；Editors Germany(1988)Publisher(Wiley-VCH，Weinheim，Germany)，517)或Tetrahedron(1998)，54(3/4)，263)進行分子內(nèi)芳基-芳基偶聯(lián)。優(yōu)選硼酸與適當(dāng)?shù)姆蓟u化物如芳基氯、芳基溴、芳基碘，或者與適當(dāng)?shù)姆蓟ダ绶蓟谆撬狨ァ⒎蓟谆撬狨サ呐悸?lián)。在這些情況下，硼酸功能基既可以在芐基中引入，也可以在苯甲酸反應(yīng)底物中引入。同樣優(yōu)選使用文獻Tetrahedron Lett.(1997)，38(22)，3841-3844中描述的雙(pinakolato)二硼。式III描述了這樣的起始物質(zhì)，其中R(1)至R(9)及A和L為給定的含義，X和Y為鹵原子或-O-SO2CH3或-O-SO2CF3。優(yōu)選的催化金屬是鈀，特別是它的絡(luò)合物Pd(dppf)2。反應(yīng)進行于無質(zhì)子偶極溶劑中，優(yōu)選DMF或DMA，溫度在0℃至溶劑沸點間，優(yōu)選溫度范圍為40℃至120℃。
通式III的衍生物的優(yōu)選制備方法是由式IV的3-巰基苯甲酸衍生物或3-亞磺基苯甲酸衍生物與式V的活化芐基衍生物反應(yīng)
其中，Z為易于進行親核取代的離去基團，例如氯、溴、碘、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯或三氟甲磺酸酯。式IV與式V衍生物在適當(dāng)?shù)娜軇?，例如DMF、THF或乙腈中反應(yīng)，加入堿如三乙胺或DIPEA，溫度在-20℃至溶劑沸點間，優(yōu)選溫度范圍為0℃至40℃。
式I的芳酰胍通常為弱堿，可以與酸結(jié)合成鹽。適宜的酸加成鹽是所有可藥用酸的鹽，例如鹵化物鹽，特別是鹽酸鹽、乳酸鹽、硫酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽。
式I化合物是取代的?；?。
與已知化合物相比，本發(fā)明化合物對Na+/H+交換的抑制活性非常突出。
正如已知化合物一樣，它們沒有不想要的和不利的促尿鹽排泄特性，而具有優(yōu)良的抗心律失常特性，這對治療例如表現(xiàn)為器官缺氧的相關(guān)疾病非常重要。根據(jù)這些化合物的藥理性質(zhì)，它們非常適于與一種保護心臟的成分一起作為抗心律失常藥，用于預(yù)防和治療心肌梗塞、治療心絞痛，還可以抑制或極大減緩局部缺血性損傷相關(guān)的病生理進程，特別是在局部缺血性心律失常初發(fā)時。由于它們對病理性缺氧、局部缺血情況的作用，本發(fā)明的式I化合物由于其抑制細胞Na+/H+交換機制，可用作局部缺血引起的急性或慢性損傷或由此引起的原發(fā)或繼發(fā)疾病的抑制劑。這涉及它們在外科手術(shù)如器官移植中的用途(在器官移植中，這些化合物即可用于在移植前，也可用于在移植過程中保護供體器官)，涉及到在例如治療過程中或在生理浴液中儲存時，以及在向給接受者移植過程中保護移植的器官。
這些化合物在血管整形外科手術(shù)中，例如心臟和外周血管手術(shù)中，同樣是有保護作用的有益藥物。與其對局部缺血性損害的保護效應(yīng)相關(guān)地，這些化合物還適于用作治療神經(jīng)系統(tǒng)，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部缺血的藥劑，適用于例如腦猝中或腦水腫的治療。此外本發(fā)明的式I化合物同樣適用于治療各類休克性疾病，例如過敏性休克、心源性休克、低血容量性休克和細菌性休克。此外，本發(fā)明的式I化合物對細胞增殖有顯著的抑制作用，如對成纖維母細胞的增殖，以及血管平滑肌細胞增生。因而，式I化合物適用作原發(fā)或繼發(fā)性細胞增生引起的疾病的治療藥劑，可用于抗動脈粥樣硬化、預(yù)防糖尿病晚期并發(fā)癥、癌癥、纖維化疾病如肺纖維化、肝纖維化或腎纖維化，器官肥大和增生，特別是前列腺增生和前列腺肥大的藥劑。
本發(fā)明化合物是細胞鈉離子-質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(Na+/H+交換)的有效抑制劑，該轉(zhuǎn)運過程在多種疾病(原發(fā)性高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病等)中細胞水平也被調(diào)高因而需要進行測量，例如在紅細胞、血小板或白細胞中。因此本發(fā)明化合物作為適用的優(yōu)良的簡單科學(xué)工具，可用于例如在以診斷為目的的高血壓確證或分型過程中，也用于動脈粥樣硬化、糖尿病、增生性疾病等的確診、分型中。此外，式I化合物還可用于高血壓進程中的預(yù)防治療，例如用于原發(fā)性高血壓。
另外，式I化合物還被發(fā)現(xiàn)對血漿脂蛋白有有益影響。通常認(rèn)為過高的血脂水平，也就是高脂蛋白血象，代表了血管動脈硬化性損傷，特別是冠心病的高風(fēng)險因素。因而降低升高的血漿脂蛋白水平對動脈粥樣硬化的預(yù)防和恢復(fù)異常重要。除了降低血清中總膽固醇水平外，降低總膽固醇中特定的導(dǎo)致動脈粥樣化的脂類級分的含量尤為重要，特別是低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)，因為這些脂類代表了動脈粥樣化的風(fēng)險因素。相比之下，高密度脂蛋白對冠心病則有防護功能。因此，降低血脂不僅僅是要降低總膽固醇水平，更重要的是要降低在血清膽固醇中的LDL和VLDL?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)式I化合物因其對血脂水平的影響具有可供治療利用的性質(zhì)。它們顯著降低由于食物中膽固醇和高脂飲食攝取過量或病理性代謝異常例如遺傳性高脂血癥，導(dǎo)致的血清LDL及VLDL濃度升高，因而可通過排除風(fēng)險誘因用于動脈粥樣硬化損傷的預(yù)防和恢復(fù)性治療。不僅可用于原發(fā)性高脂血癥，也可用于某些例如糖尿病導(dǎo)致的繼發(fā)性高脂血癥。此外式I化合物極大地降低代謝異常導(dǎo)致的梗塞，特別是極大的降低梗塞的發(fā)生范圍和嚴(yán)重程度。式I化合物還對代謝異常導(dǎo)致的內(nèi)皮系統(tǒng)損傷有顯著的預(yù)防作用，這種在內(nèi)皮功能紊亂綜合癥中對血管的保護作用使式I化合物可用作冠脈血管痙攣、動脈粥樣硬化形成、動脈粥樣硬化癥、左心室肥大，以及擴張性心肌癥和血栓性疾病的預(yù)防和治療藥。
所述化合物可優(yōu)選用于制備治療高膽固醇血癥的治療藥劑；制備預(yù)防動脈粥樣硬化形成的藥劑；制備動脈粥樣硬化癥的預(yù)防和治療藥劑；制備膽固醇水平升高所致疾病的預(yù)防和治療藥劑；制備內(nèi)皮功能紊亂所致疾病的預(yù)防和治療藥劑；制備動脈粥樣硬化癥導(dǎo)致的高血壓的預(yù)防和治療藥劑；制備動脈粥樣硬化癥導(dǎo)致的血栓性疾病的預(yù)防和治療藥劑；制備高膽固醇血癥和內(nèi)皮功能紊亂導(dǎo)致的局部缺血性損傷及局部缺血再灌注損傷的預(yù)防和治療藥劑；制備高膽固醇血癥和內(nèi)皮功能紊亂導(dǎo)致的心肌肥大、心肌癥和充血性心力衰竭(CHF)的預(yù)防和治療藥劑；制備高膽固醇血癥和內(nèi)皮功能紊亂導(dǎo)致的冠脈血管痙攣和心肌梗塞的預(yù)防和治療藥劑；制備治療所述疾病的藥物組合物，其包含降壓物質(zhì)，優(yōu)選血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑，一種包含式I的NHE抑制劑與有降血脂活性的成分的組合物，優(yōu)選HMG-CoA還原酶抑制劑(例如洛伐他汀或普伐他汀)，后者具備的降血脂活性增強了式I的NHE抑制劑的降血脂作用，其組合被證實有增強療效和降低活性成分所需劑量的優(yōu)異特性。
施用式I的鈉離子/質(zhì)子交換抑制劑作為降低增高的血脂水平的新藥劑，以及鈉離子/質(zhì)子交換抑制劑與降壓藥物和/或降血脂藥物的組合物也在權(quán)利要求之內(nèi)。
同樣要求的還有施用式I的鈉離子/質(zhì)子交換抑制劑，以及鈉離子/質(zhì)子交換抑制劑與降壓藥物，特別是ACE抑制劑(如雷米普利)和血管緊張素受體拮抗劑(如洛沙坦)的組合物作為CHF的新治療藥劑。
含有式I化合物的藥劑可以口服施用、胃腸外施用、靜脈內(nèi)施用、直腸施用或以吸入方式施用，優(yōu)選的施用方式取決于疾病的表征。而且，式I化合物單獨或與藥用賦型劑合用后，既可以作為獸用藥物，也可作為人用藥物。
所述藥物組合物中適用的賦型劑對本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員(根據(jù)其專業(yè)知識)來講是熟知的。除了溶劑、凝膠基質(zhì)、栓劑基質(zhì)、片劑賦型劑及其它活性成分載體外，還可使用例如抗氧化劑、分散劑、乳化劑、消沫劑、掩味劑、防腐劑、增溶劑或著色劑。
對口服施用形式，可將活性化合物與對此目的有益的添加劑，如載體、穩(wěn)定劑或惰性稀釋劑混和，再用常規(guī)方法制成適當(dāng)?shù)膭┬停缙瑒?、包衣片、兩件式膠囊、水溶液劑、醇溶液劑或油溶液劑?？捎玫亩栊暂d體實例有阿拉伯膠、氧化鎂、碳酸鎂、磷酸鉀、乳糖、葡萄糖或淀粉，特別是玉米淀粉。制備過程可采用干法制粒也可采用濕法制粒。適用的油劑載體或溶液的實例有菜油或動物油，例如葵花子油或魚肝油。
對皮下或靜脈內(nèi)施用方式，活性化合物要轉(zhuǎn)化為水溶液、混懸液或乳液，如果需要的話，通常根據(jù)目的加入如增溶劑、乳化劑或其它成分。適用溶劑的實例有水、生理鹽水或醇，如乙醇、丙醇、甘油，使用其糖溶液如葡萄糖或甘露醇溶液，或者多種所述溶劑的混合物。
適于制備氣霧或噴霧方式施用的藥物制劑有，例如溶液劑、混懸劑或乳劑，其中式I化合物作為活性成分溶于藥用溶劑例如特別是乙醇、水或這些溶劑的混合物。如果需要，這些制劑中還可包含其它藥用賦型劑，例如表面活性劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和一種助動氣體。此類制品中活性成分的含量按照重量計，通常為約0.1至10，特別是約0.3至3％。式I活性成分的施用劑量及施用頻度取決于所用化合物的作用強度和作用持續(xù)時間；還取決于待處理疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度；以及受治哺乳動物的性別、年齡、體重及個體反應(yīng)差異。
平均來講，體重約75kg的患者施用的日劑量是按照體重至少為0.001mg/kg，優(yōu)選0.01mg/kg，最大劑量上限是10mg/kg，優(yōu)選不超過1mg/kg。對于急癥，例如心肌梗塞初發(fā)時，劑量可能需要提高，而且通常特別采用例如每日多達4次的單劑施用方式。特別是靜脈內(nèi)施用時，對于重癥監(jiān)護病房的梗塞患者高達每kg體重200mg的日劑量可能是必需的。
縮略語清單DIPEA 二異丙基乙胺DMAN，N-二甲基乙酰胺DME1，2-二甲氧基乙烷
DMFN，N-二甲基甲酰胺EA 乙酸乙酯(EtOAc)Eq.當(dāng)量MeOH 甲醇Pd(dppf)2[1，1’-雙(二苯基磷)二茂鐵]氯化鈀(II)/二氯甲烷絡(luò)合物(1∶1)RT 室溫m.p. 熔點THF四氫呋喃實驗部分二氫硫雜菲羰基胍合成的一般方法步驟1)4-溴-5-氯磺?；?2-甲基苯甲酸甲酯4-溴-5-氯磺?；?2-甲基苯甲酸(12g；J.Med.Chem.1997，40，2017)與亞硫酰氯(20ml)在隔絕潮氣的條件下煮沸回流8小時。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空下除去過量的亞硫酰氯，然后將殘余物以無水甲苯(50ml)分散并再次進行蒸發(fā)，將所得的?；却制啡苡跓o水甲苯(25ml)，然后加入MeOH(1.7ml)，再于50℃下攪拌2小時。再次加入MeOH(1.7ml)，繼續(xù)在50℃下攪拌4小時。將反應(yīng)混合物以EA(200ml)稀釋，再以飽和NaHCO3水溶液(100ml)洗滌。在Na2SO4干燥后，真空除去溶劑，得到淡黃色油狀物(11.0g)，無須進一步純化即可使用。
步驟2)2-溴-5-甲氧基羰基-4-甲基苯亞磺酸將Na2SO3(550mg)溶于水(2ml)中，在70℃下滴加入4-溴-5-氯磺?；?2-甲基苯甲酸甲酯的DME(2ml)溶液。在滴加過程中，溶液變?yōu)槲⑺嵝?pH＝5)。然后將混合物在70℃下攪拌2.5小時，冷卻后以鹽酸水溶液調(diào)節(jié)至pH＝1-2。將其以EA(50ml)稀釋并以飽和NaCl水溶液(50ml)洗滌。在Na2SO4干燥后，真空除去溶劑，得到淡黃色油狀物(228mg)，無須進一步純化即可使用。
步驟3)4-溴-5-(2-溴苯基甲磺酰基)-2-甲基苯甲酸甲酯2-溴-5-甲氧基羰基-4-甲基苯亞磺酸(150mg，0.51mmol，步驟2)溶于DMF(1.5ml)。向其中加入2-溴代芐基溴(128mg，0.51mmol)的DMF(0.5ml)溶液以及DIPEA(0.1ml，0.56mmol)，混合物隔絕潮氣在室溫下攪拌16小時，然后過濾反應(yīng)溶液，以EA(20ml)稀釋，再以1N的鹽酸(20ml)和鹽水(強度為5％，20ml)洗滌。使有機相流經(jīng)干燥筒(無水Na2SO4)，并以EA(5ml)洗滌干燥筒。將濾液蒸發(fā)，所得粗品以制備性HPLC純化。
根據(jù)一般反應(yīng)方程式
步驟2)的產(chǎn)物 步驟3)的產(chǎn)物以類似的方法制備了以下化合物
這些涉及的芐基溴中不能直接購買的既可以從相應(yīng)的甲基芳族化合物以N-溴代琥珀酰亞胺通過游離基溴化制得，也可從相應(yīng)的芐醇與溴化氫水溶液或與甲磺酰氯/三乙胺然后與四丁基溴化銨反應(yīng)制備。產(chǎn)物粗品在乙腈/水(9∶1，1ml)中攪拌，可能要加入DMF(0.2ml)。經(jīng)過筒狀裝置吸濾并以乙腈/水(9∶1，0.5ml)洗滌。濾集的固體在50℃真空干燥。根據(jù)HPLC/MS檢測，純度＞80％。將母液以制備性HPLC純化，因為其中仍含有大量的產(chǎn)物。
步驟4)6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氫-硫雜菲-7-羧酸甲酯將雙(pinacolato)二硼(68mg，0.266mmol)、醋酸鉀(71mg，0.725mmol)和Pd(dppf)2(9mg，0.012mmol)混于DMA(2ml)中，再向其中加入4-溴-5-(2-溴苯基甲磺?；?-2-甲基苯甲酸甲酯(112mg，0.242mmol，步驟3)的DMA(4ml)溶液。混合物在80℃下、保護氣中攪拌過夜。反應(yīng)溶液經(jīng)硅膠過濾并以EA(20ml)洗滌。有機相以水和5％鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，真空蒸發(fā)。所得粗品以制備性HPLC純化。
根據(jù)一般反應(yīng)方程式
步驟3)的產(chǎn)物 步驟4)的產(chǎn)物以類似的方法制備了以下化合物
步驟5)二氫硫雜菲羰基胍，一般方法 步驟4)的產(chǎn)物 步驟5)的產(chǎn)物將叔丁醇鉀(53mg，0.5mmol)混懸于無水DMF(2ml)中，向其中加入鹽酸胍(50mg，0.55mol)，然后將混懸液在室溫下隔絕潮氣攪拌30分鐘。隨后加入步驟4甲酯的(0.1mmol)DMF(1ml)溶液，再將混合物在室溫下攪拌過夜。濾除析出的鹽，然后馬上把濾液以制備性HPLC(色譜柱填料MerckSupersphere RP18e，乙腈/水梯度洗脫，以0.1％甲酸為緩沖劑)純化。所得產(chǎn)物以Agilent系列1100系統(tǒng)的分析型HPLC/MS鑒定，質(zhì)量檢測采用正離子電離解析法。
方法A色譜柱MERCK LiChroCart 55-2填料PuroSpher STAR RP18流速0.75ml/min柱溫40℃梯度溶劑A 乙腈/水(90∶10)+0.5％甲酸溶劑B 乙腈/水(10∶90)+0.5％甲酸
方法B色譜柱YMC J’Sphere ODS H80填料4μ流速1.0ml/分鐘柱溫30℃梯度溶劑A /水+0.05％三氟乙酸溶劑B 乙腈
實施例1-11的標(biāo)題化合物是按照二氫硫雜菲羰基胍的一般合成方法合成的實施例1N-(6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氫-9-硫雜菲-7-羰基)-胍甲酸鹽
MS(ES)330(M+1)+保留時間2.384分鐘(220nm，方法A)實施例2N-(2-甲基-5，5-二氧代-5，6-二氫-5-硫雜苯并[c]菲-3-羰基)-胍甲酸鹽 MS(ES)380(M+1)+保留時間1.793分鐘(220nm，方法B)實施例3N-(3，6-二甲基-9，9-二氧代-9，10-二氫-9-硫雜菲-7-羰基)-胍甲酸鹽 MS(ES)344(M+1)+保留時間2.411分鐘(220nm，方法A)實施例4N-(2-氯-6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氫-9-硫雜菲-7-羰基)-胍甲酸鹽
MS(ES)364(M+1)+保留時間2.390分鐘(220nm，方法A)實施例5N-(3-氟-6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氫-9-硫雜菲-7-羰基)-胍甲酸鹽 MS(ES)348(M+1)+保留時間2.215分鐘(220nm，方法A)實施例6N-(1-氟-6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氫-9-硫雜菲-7-羰基)-胍甲酸鹽 MS(ES)348(M+1)+保留時間2.218分鐘(220nm，方法A)實施例7N-(3-氯-6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氫-9-硫雜菲-7-羰基)-胍甲酸鹽 MS(ES)364(M+1)+保留時間2.394分鐘(220nm，方法A)實施例8N-(2-甲氧基-6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氫-9-硫雜菲-7-羰基)-胍甲酸鹽
MS(ES)360(M+1)+保留時間2.271分鐘(220nm，方法A)實施例9N-(1-氯-6-甲基-9，9-二氧代-9，10-二氫-9-硫雜菲-7-羰基)-胍甲酸鹽 MS(ES)364(M+1)+保留時間2.358分鐘(220nm，方法A)實施例10N-(4，6-二甲基-9，9-二氧代-9，10-二氫-9-硫雜菲-7-羰基)-胍甲酸鹽 MS(ES)344(M+1)+保留時間2.302分鐘(220nm，方法A)實施例11N-(2，6-二甲基-9，9-二氧代-9，10-二氫-9-硫雜菲-7-羰基)-胍甲酸鹽
MS(ES)344(M+1)+保留時間2.671分鐘(220nm，方法A)Jansen NHE抑制法NHE-1的IC50[nM]抑制濃度測定方法如下用經(jīng)轉(zhuǎn)染的表達人NHE-1的細胞系以FLIPR檢驗法測定pHi的恢復(fù)情況以確定NHE-1抑制率。
檢測在暗箱中置有含無菌培養(yǎng)基的96-孔微量滴定板的FLIPR(熒光成像平板讀數(shù)器)中進行。經(jīng)轉(zhuǎn)染的表達不同亞型NHE的細胞系(親代細胞系為誘變后篩選出的無內(nèi)在NHE活性的LAP-1[得自Prof.Pouyssegur，Nice])的起始濃度為約25000個細胞/孔[轉(zhuǎn)染細胞的生長培養(yǎng)基(Iscove+10％胎牛血清)中還含有選擇性抗生素G418以保證轉(zhuǎn)染序列的存在]。
真正的檢測是從移走生長培養(yǎng)基并在每孔中加入載樣緩沖液(5μM的BCECF-AM[2’，7’-二(羧乙基)-5-(及-6-)-羧基熒光素乙酸甲酯]、20mM的NH4Cl，115mM的氯化膽堿，1mM的MgCl2，1mM的CaCl2，5mM的KCl，20mM的HEPES，5mM的葡萄糖；調(diào)節(jié)pH至7.4[以氫氧化鉀])后開始的。將細胞于37℃下孵育20分鐘。孵育使細胞載入發(fā)出熒光的強度與pHi呈相關(guān)關(guān)系的熒光染料，而NH4Cl則使細胞呈弱堿性。[無熒光的染料前體BCECF-AM作為一種酯，具有細胞膜滲透性。而真正的染料BCECF沒有細胞膜滲透性，是在細胞內(nèi)由酯酶水解釋放出來的。]孵育20分鐘后，在細胞清洗器(Tecan Columbus)中用每次400μl的洗滌緩沖液(133.8mM的氯化膽堿，4.7mM的KCl，1.25mM的MgCl2，1.25mM的CaCL2，0.97mM的K2HPO4，0.23mM的KH2PO4，5mM的HEPES，5mM的葡萄糖；調(diào)節(jié)pH至7.4[以氫氧化鉀])清洗三次，以除去含有NH4Cl和未結(jié)合的BCECF-AM的載樣緩沖液。在孔中殘留物的體積為90μl(可能的范圍是50-125μl)。這個洗滌步驟除去了未結(jié)合的BCECF-AM，而且由于除去了細胞外的NH4+離子，細胞內(nèi)呈現(xiàn)酸性(～pHi6.3-6.4)。
由于除去細胞外的NH4+離子導(dǎo)致細胞內(nèi)NH4+離子與NH3和H+離子的平衡被打破，接下來NH3可以即時穿透細胞膜，所以洗滌步驟導(dǎo)致H+離子滯留在細胞內(nèi)，這是細胞內(nèi)酸化的原因。如果這種現(xiàn)象持續(xù)足夠長的時間將導(dǎo)致細胞死亡。
重要的一點是洗滌緩沖液中不能含有鈉離子(＜1mM)，因為細胞外的鈉離子會通過NHE的同工型活性迅速使pHi得以恢復(fù)。
同樣重要的還有所有使用的緩沖液(載樣緩沖液、洗滌緩沖液、恢復(fù)緩沖液)中不能含有HCO3-離子，因為碳酸氫根會導(dǎo)致干擾LAP-1親代細胞系中存在的碳酸氫根依賴性pHi調(diào)節(jié)系統(tǒng)的活化。
將載有酸化細胞的微量滴定板轉(zhuǎn)移至FLIPR中(在酸化后20分鐘內(nèi))。在FLIPR中以氬原子激光發(fā)生器產(chǎn)生的波長為488nm的光激發(fā)細胞內(nèi)的熒光染料，調(diào)整測定參數(shù)(激發(fā)光強度、照射時間、FLIPR配備的CCD照相機光圈數(shù)值)使每孔的平均熒光信號介于30000和35000的相對熒光單位之間。
FLIPR中的測定開始后用CCD照相機按照波長遞減次序每兩單位波長拍攝一次。10秒鐘后開始用FLIPR配備的96-孔吸移管管理器加入90μl的恢復(fù)緩沖液(133.8mM的NaCl，4.7mM的KCl，1.25mM的MgCl2，1.25mM的CaCL2，0.97mM的K2HPO4，0.23mM的KH2PO4，10mM的HEPES，5mM的葡萄糖；調(diào)節(jié)pH至7.4[以氫氧化鈉])恢復(fù)細胞內(nèi)的pH。
陽性對照孔(100％的NHE活性)中只加入恢復(fù)緩沖液，而陰性對照(0％的NHE活性)只使用洗滌緩沖液。在所有其它孔中加入兩倍于檢測物質(zhì)濃度的恢復(fù)緩沖液。FLIPR中的測定在測量60次后(2分鐘)結(jié)束。
將未經(jīng)處理的原始數(shù)據(jù)輸入基于活性的方程中，首先計算出測試物質(zhì)在各種濃度下的NHE活性，由此得出其IC50值。因為在試驗中pHi的回復(fù)并不一直是線性的，而是在最后由于較高pHi處NHE活性的降低而下調(diào)，因此在評估測量值時選擇適宜的范圍為保證陽性對照中熒光的增高保持線性是很重要的。
權(quán)利要求
1.一種式I的二氫硫雜菲羰基胍 其中定義如下R(1)和R(3)彼此獨立地表示氫、含1，2，3或4個碳原子的烷基、含1，2，3或4個碳原子的烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、NR(10)R(11)、-Op-(CH2)n-(CF2)x-CF3或-(SOm)p-(CH2)n-(CF2)x-CF3；R(10)和R(11)彼此獨立地表示氫、含1，2，3或4個碳原子的烷基或-(CH2)n-(CF2)x-CF3；m 0、1或2；n 0、1、2、3、4、5或6；x和p彼此獨立地表示0或1；R(2) 氫、F、Cl、Br、I、CN、含1，2，3或4個碳原子的烷基、甲氧基、含3，4，5，6，7或8個碳原子的環(huán)烷基；R(4)和R(5)彼此獨立地表示氫、含1，2，3或4個碳原子的烷基；R(6)、R(7)、R(8)和R(9)彼此獨立地表示氫、含1，2，3或4個碳原子的烷基、含1，2，3或4個碳原子的烷氧基、F、Cl、Br、I、CN、NR(12)R(13)、-Oq-(CH2)r-(CF2)s-CF3或-(SOw)t-(CH2)u-(CF2)v-CF3；R(12)和R(13)彼此獨立地表示氫、含1，2，3或4個碳原子的烷基；w 0、1或2；r和u
0.1、2、3、4、5或6；q、s、t和v彼此獨立地表示0或1；或R(6)和R(7)或R(7)和R(8)或R(8)和R(9)與相連的苯環(huán)共同構(gòu)成萘環(huán)體系；A -S-，-SO-或-SO2-及其可藥用鹽。
2.權(quán)利要求1所述的式I化合物，其中定義如下R(1)和R(3)彼此獨立地表示氫、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、F、Cl、CN、NR(10)R(11)、-Op-(CH2)n-CF3或-(SOm)p-(CH2)n-CF3；R(10)和R(11)彼此獨立地表示氫、甲基、乙基或-CH2-CF3；m 0、1或2；n 0、1、2或3；p 0或1；R(2)氫、F、Cl、CN、含1，2，3或4個碳原子的烷基、甲氧基、含3、4、5或6個碳原子的環(huán)烷基；R(4)和R(5)彼此獨立地表示氫、甲基或乙基；R(6)、R(7)、R(8)和R(9)彼此獨立地表示氫、含1，2，3或4個碳原子的烷基、甲氧基、乙氧基、F、Cl、CN、NR(12)R(13)、-Oq-(CH2)r-CF3或-(SOw)t-(CH2)u-CF3；R(12)和R(13)彼此獨立地表示氫、甲基或乙基；w 0、1或2；r和u0、1、2或3；q和t彼此獨立地表示0或1；或R(6)和R(7)或R(7)和R(8)或R(8)和R(9)與相連的苯環(huán)共同構(gòu)成萘環(huán)體系；A -S-，-SO-或-SO2-及其可藥用鹽。
3.權(quán)利要求1或2所述的式I化合物，其中定義如下R(1)氫、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、F、Cl、NR(10)R(11)、-Op-(CH2)n-CF3或-(SOm)p-(CH2)n-CF3；R(10)和R(11)彼此獨立地表示氫、甲基、乙基或-CH2-CF3；m 0、1或2；n、p 彼此獨立地表示0或1；R(2) 氫、F、Cl、甲基、含3、4、5或6個碳原子的環(huán)烷基；R(3)、R(4)和R(5)氫；R(6)、R(7)、R(8)和R(9)彼此獨立地表示氫、甲基、甲氧基、乙氧基、F、Cl、NR(12)R(13)、-Oq-(CH2)r-CF3或-(SOw)t-(CH2)u-CF3；R(12)和R(13)彼此獨立地表示氫、甲基或乙基；w 0、1或2；q、r、t和u彼此獨立地表示0或1；或R(6)和R(7)或R(7)和R(8)或R(8)和R(9)與相連的苯環(huán)共同構(gòu)成萘環(huán)體系；A -S-，-SO-或-SO2-及其可藥用鹽。
4.權(quán)利要求1至3中任意一項所述的式I化合物，其中定義如下R(1)氫、甲基、甲氧基、乙氧基、Cl、NR(10)R(11)、-O-CH2-CF3或-(SOm)p-(CH2)n-CF3；R(10)和R(11)彼此獨立地表示氫、甲基、乙基或-CH2-CF3；m 0、1或2；p 0或1；R(2) 氫、F、Cl或甲基；R(3)、R(4)和R(5)氫；R(6)、R(7)、R(8)和R(9)彼此獨立地表示氫、甲基、甲氧基、乙氧基、F、Cl、-O-CH2-CF3或-(SOw)t-(CH2)u-CF3；w 0、1或2；t和u彼此獨立地表示0或1；或R(6)和R(7)或R(7)和R(8)或R(8)和R(9)與相連的苯環(huán)共同構(gòu)成萘環(huán)體系；A -SO2-及其可藥用鹽。
5.權(quán)利要求1所述的式I化合物的用途，其用于制備治療或預(yù)防由于局部缺血而引發(fā)的疾病的藥物。
6.治療和預(yù)防由于局部缺血而引發(fā)的疾病的方法，其包括將有效量的權(quán)利要求1所述的式I化合物與常規(guī)的添加物混合并以合適的劑型施用。
7.權(quán)利要求1所述的式I化合物的用途，其用于制備治療或預(yù)防心肌梗塞的藥物和心律失常的藥物。
8.權(quán)利要求1所述的式I化合物的用途，其用于制備治療或預(yù)防心絞痛的藥物。
9.權(quán)利要求1所述的式I化合物的用途，其用于制備治療或預(yù)防心臟局部缺血的藥物。
10.權(quán)利要求1所述的式I化合物的用途，其用于制備治療或預(yù)防外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部缺血的藥物以及中風(fēng)的藥物。
11.權(quán)利要求1所述的式I化合物的用途，其用于制備治療或預(yù)防外周器官和四肢局部缺血的藥物。
12.權(quán)利要求1所述的式I化合物的用途，其用于制備治療休克的藥物。
13.權(quán)利要求1所述的式I化合物的用途，其用于制備在外科手術(shù)和器官移植期間使用的藥物。
14.權(quán)利要求1所述的式I化合物的用途，其用于制備保存和貯存外科用移植物的藥物。
15.權(quán)利要求1所述的式I化合物的用途，其用于制備治療其中細胞增殖代表其原發(fā)或繼發(fā)病因的疾病的藥物。
16.權(quán)利要求1所述的式I化合物的用途，其用于制備治療或預(yù)防脂類代謝疾病的藥物。
17.包含有效量的如權(quán)利要求1至4之一項或多項所述的式I化合物的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)的二氫硫雜菲羰基胍化合物，其中R
文檔編號C07D335/12GK1630649SQ03803550
公開日2005年6月22日 申請日期2003年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月7日
發(fā)明者H-W·克勒曼, P·貝洛 申請人:安萬特醫(yī)藥德國有限公司