專利名稱：環(huán)狀半縮醛衍生物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有鈣蛋白酶抑制活性的新的環(huán)狀半縮醛衍生物。更具體地，本發(fā)明涉及含有新的環(huán)狀半縮醛衍生物的藥物。
背景技術(shù)：
鈣蛋白酶是一種細胞質(zhì)中的蛋白水解酶，其廣泛分布在活體中，并被鈣離子激活。目前，已經(jīng)闡明該該蛋白酶的異常激活涉及各種疾病，如中風，蛛網(wǎng)膜下出血，阿爾茨海默氏病，缺血性疾病，肌肉萎縮癥，白內(nèi)障，血小板凝集，關(guān)節(jié)炎等[Trends in Pharmacological Sciences，第15卷，第412頁(1994)]。在另一方面，已經(jīng)闡明鈣蛋白酶抑制劑在實驗性的白內(nèi)障模型中通過晶狀體培養(yǎng)有效用于保持晶狀體的透明度[Curr.Eye Res.，第10卷，第657-666頁(1994)]，并用作白內(nèi)障(WO93/23032)等的治療劑。關(guān)于此前報導的鈣蛋白酶抑制劑，可以提及肽鹵代甲烷衍生物(JP-B-6-29229)，肽重氮甲烷衍生物[Biochem.J.，第253卷，第751-758頁(1988)，J.Med.Chem.，第35卷，第216-220頁(1992)]，肽酰醛衍生物(EP771565，USP6057290等)等。然而，由于條件所限，這些抑制劑還未付諸實踐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種具有鈣蛋白酶抑制活性的化合物。
本發(fā)明人已經(jīng)進行深入研究以努力解決上述問題，獲得具有強烈鈣蛋白酶抑制活性的化合物，并進一步研究而完成本發(fā)明。
因此，本發(fā)明涉及(1)由式(I)表示的化合物
其中R1是低級烷基，R2是氫，鹵素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，并且n為0或1，(2)上述(1)的化合物，其中R1是含有3或4個碳原子的低級烷基，(3)上述(1)或(2)的化合物，其中R1是選自異丙基，異丁基和仲丁基的基團，(4)上述(1)的化合物，其中R1是異丁基并且R2是選自氫，鹵素，氰基，低級烷基和低級烷氧基的基團，(5)(2S)-4-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺，(6)一種包含由式(I)表示的化合物的藥物 其中R1是低級烷基，R2是氫，鹵素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，并且n為0或1，(7)上述(6)的藥物，其是鈣蛋白酶抑制劑，(8)上述(6)的藥物，其是用于預防或治療涉及鈣蛋白酶的疾病的藥劑，(9)一種藥物組合物，其包含由式(I)表示的化合物和藥用載體， 其中R1是低級烷基，R2是氫，鹵素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，并且n為0或1，(10)上述(9)的藥物組合物，其是鈣蛋白酶抑制劑，(11)一種治療涉及鈣蛋白酶的疾病的方法，其包含向需要治療的哺乳動物施用有效量的由式(I)表示的化合物，
其中R1是低級烷基，R2是氫，鹵素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，并且n為0或1，和(12)由式(I)表示的化合物作為鈣蛋白酶抑制劑的應(yīng)用， 其中R1是低級烷基，R2是氫，鹵素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，并且n為0或1。
在上述式(I)中，由R1表示的低級烷基是直鏈或支鏈的含有1-4個碳原子的基團，如甲基，乙基，丙基，異丙基，丁基，異丁基，仲丁基，叔丁基等。優(yōu)選含有3-4個碳原子的低級烷基，更優(yōu)選異丙基，異丁基或仲丁基，特別優(yōu)選異丁基。在上述(I)中，關(guān)于由R2表示的鹵素，可以提及氟，氯，溴和碘，特別優(yōu)選氟。在上述式(I)中，關(guān)于由R2表示的低級烷基，可以提及類似于上述由R1表示的低級烷基的那些，特別優(yōu)選甲基。在上述式(I)中，由R2表示的低級烷氧基是含有1-4個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基，如甲氧基，乙氧基，丙氧基，異丙氧基，丁氧基，異丁氧基，仲丁氧基和叔丁氧基等，特別優(yōu)選甲氧基。
此外，本發(fā)明包含由式(I)表示的化合物(以下有時稱為本發(fā)明的化合物)以及本發(fā)明化合物的各種溶劑化物，具有結(jié)晶多晶型的物質(zhì)和前藥。
本發(fā)明的化合物可以通過例如下列反應(yīng)路線制備
其中每個符號定義如上。由式(II)表示的化合物(以下有時稱為化合物(II))是其中氨基被由R3表示的保護基保護的α-氨基酸。關(guān)于由R3表示的保護基，例如，可以提及通常用于肽合成領(lǐng)域的那些，如叔丁氧羰基(以下有時稱為Boc基團)，芐氧羰基等。
通過將化合物(II)和N-羥基琥珀酰亞胺溶解在常規(guī)使用的有機溶劑中并在縮合劑的存在下攪拌獲得的溶液，可以獲得由式(III)表示的化合物(以下有時稱為化合物(III))。作為常規(guī)使用的有機溶劑，例如，可以提及不有害地影響反應(yīng)的常規(guī)溶劑，如四氫呋喃，二氯甲烷，N，N-二甲基甲酰胺，乙酸乙酯等，及其混合溶劑，優(yōu)選二氯甲烷。關(guān)于縮合劑，例如，優(yōu)選使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，N，N-二環(huán)己基碳二亞胺等。反應(yīng)溫度是通常在冷卻下，室溫或在加熱下，優(yōu)選在冰冷卻至室溫的范圍內(nèi)。
通過將化合物(III)溶解在常規(guī)使用的有機溶劑中，向其中加入α-氨基-γ-丁內(nèi)酯或其鹽(鹽酸鹽或氫溴酸鹽)并在堿存在或不存在下攪拌混合物，可以獲得由式(IV)表示的化合物(以下有時稱為化合物(IV))。關(guān)于通常使用的有機溶劑，可以提及不有害地影響反應(yīng)的常規(guī)溶劑，如N，N-二甲基甲酰胺，二甲亞砜，四氫呋喃，二氯甲烷，甲醇，乙醇，苯，甲苯，乙酸乙酯等，及其混合溶劑，優(yōu)選N，N-二甲基甲酰胺。關(guān)于堿，可以提及例如，三甲胺，三乙胺，甲基吡啶，N-甲基吡咯烷，N-甲基嗎啉，1，5-二氮雜雙環(huán)[4，3，0]壬-5-烯，1，4-二氮雜雙環(huán)[2，2，2]壬-5-烯，1，8-二氮雜雙環(huán)[5，4，0]-7-十一烯等，優(yōu)選三乙胺。盡管不具體限制反應(yīng)溫度，它通常在冷卻下，室溫或在加熱下，優(yōu)選冰冷卻至室溫。
通過適當?shù)剡x擇和應(yīng)用用于R3的氨基保護基(化合物(IV)的保護基)的消除反應(yīng)的常規(guī)方法，可以獲得由(V)表示的化合物(以下有時稱為化合物(V))。例如，當將叔丁氧羰基用作保護基時，將化合物(IV)溶解在常規(guī)使用的有機溶劑中并在酸的存在下攪拌得到的溶液以消除R3。作為通常使用的有機溶劑，可以提及例如不有害地影響反應(yīng)的常規(guī)溶劑，如四氫呋喃，二氯甲烷，乙酸乙酯等，及其混合溶劑。關(guān)于酸，可以提及鹽酸，三氟乙酸，對甲苯磺酸等。還可以使用可商購的鹽酸在乙酸乙酯或二噁烷等中的溶液用于消除。盡管不具體限制反應(yīng)溫度，它通常在冷卻下，室溫或在加熱下，優(yōu)選冰冷卻至室溫。當使用芐氧羰基時，在常規(guī)金屬催化劑的存在下進行催化還原(例如披鈀碳，阮內(nèi)鎳，氧化鉑等)。氫氣壓通常約1atm-約50atm，優(yōu)選約1atm-約5atm。關(guān)于溶劑，可以使用醇類(甲醇，乙醇等)，酯類(四氫呋喃等)，有機酸(乙酸等)，及其混合溶劑。不具體限制反應(yīng)溫度，只要不優(yōu)選的副反應(yīng)不發(fā)生，反應(yīng)通常在冷卻下，在室溫下或在加熱下進行?；衔?V)可以不分離或純化用于下一個反應(yīng)，只要下一個反應(yīng)不受影響。
通過將各種異硫氰酸酯試劑加入化合物(V)并在通常使用的有機溶劑中在堿存在或不存在下攪拌混合物，可以獲得由式(VI)表示的化合物(以下有時稱為化合物(VI))。作為通常使用的有機溶劑，可以提及不有害地影響反應(yīng)的常規(guī)溶劑，如四氫呋喃，二氯甲烷，N，N-二甲基甲酰胺，乙酸乙酯等，及其混合溶劑，優(yōu)選乙酸乙酯。關(guān)于堿，例如，可以提及三甲胺，三乙胺，甲基吡啶，N-甲基吡咯烷，N-甲基嗎啉，1，5-二氮雜雙環(huán)[4，3，0]壬-5-烯，1，4-二氮雜雙環(huán)[2，2，2]壬-5-烯，1，8-二氮雜雙環(huán)[5，4，0]-7-十一烯等，優(yōu)選三乙胺。盡管不具體限制反應(yīng)溫度，它通常在冷卻下，室溫或在加熱下，優(yōu)選冰冷卻下至室溫的范圍。
通過將化合物(VI)進行還原反應(yīng)，可以獲得由式(I)表示的化合物。該還原反應(yīng)可以通過已知的方法自身(per se)進行，如用金屬氫化物還原，用氫-金屬絡(luò)合化合物還原，用乙硼烷或取代的硼烷還原，催化氫化等。換句話說，該反應(yīng)通過用還原劑處理化合物(VI)來進行。關(guān)于還原劑，可以提及氫-金屬絡(luò)合化合物如堿金屬硼氫化物(例如硼氫化鈉，硼氫化鋰等)，氫化鋁鋰等，金屬氫化物如氫化鈉等，金屬或金屬鹽如有機錫化合物(氫化三苯基錫等)，鎳化合物，鋅化合物等，使用過渡金屬催化劑(例如鈀，鉑，銠等)催化還原劑和氫，和乙硼烷等。特別是，優(yōu)選使用氫化二異丁基鋁進行反應(yīng)。該反應(yīng)在不影響反應(yīng)的有機溶劑中進行。例如，可以提及不有害地影響反應(yīng)的常規(guī)溶劑，如N，N-二甲基甲酰胺，二甲亞砜，四氫呋喃，二氯甲烷，甲醇，乙醇，苯，甲苯，乙酸乙酯等，及其混合溶劑，優(yōu)選二氯甲烷。反應(yīng)溫度為約-100℃至約150℃，特別優(yōu)選約-80℃至約-10℃，反應(yīng)時間約1至約24小時。通過已知的分離和純化方法，如濃縮，減壓下濃縮，溶劑萃取，結(jié)晶，重結(jié)晶，相轉(zhuǎn)移，色譜法等可以分離或純化如此獲得的環(huán)狀半縮醛衍生物。
關(guān)于通過上述方法可以制備的式(I)表示的化合物，例如，可以提及(2S)-4-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺，(2S)-3-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺，(2S)-3-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)丁酰胺，(2S)-2-(((芐基氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺，(2S)-2-((((4-氟苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺，(2S)-2-((((4-甲氧基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺，(2S)-2-((((3-氰基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺，(2S)-2-((((4-氰基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺，(2S)-4-甲基-2-((((2-甲苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺，(2S)-4-甲基-2-((((3-甲苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺，(2S)-4-甲基-2-((((4-甲苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺等。
本發(fā)明的化合物是沒有在任何參考文獻中描述的新化合物，因為它具有優(yōu)越的鈣蛋白酶抑制活性，如以下實驗實施例中所示，該化合物用作鈣蛋白酶抑制劑的藥物，其如果需要通過組合作為活性成分的該化合物和下述載體等獲得。在下面所示實施例中公開的化合物的結(jié)構(gòu)式在表1中顯示。
表1.實施例化合物的結(jié)構(gòu)式 化合物號 nR1R21 0異丁基H2 0仲丁基H3 0異丙基H4 1異丁基H5 0異丁基4-氟6 0異丁基4-甲氧基7 0異丁基3-氰基8 0異丁基4-氰基9 0異丁基2-甲基100異丁基3-甲基110異丁基4-甲基包含本發(fā)明化合物的藥物用作預防或治療缺血性疾病，免疫疾病，阿爾茨海默氏病，骨質(zhì)疏松癥，缺血性腦疾病，白內(nèi)障，青光眼，視網(wǎng)膜(脈絡(luò)膜)疾病，由光凝固法導致的眼后段并發(fā)癥(例如斑點水腫，視網(wǎng)膜剝離，視神經(jīng)炎，視野異常，光覺異常，色覺異常等)等的藥物制劑，或用于預防或治療哺乳動物(例如人，大鼠，小鼠，兔子，牛，豬，狗，貓等)中血管生成，視網(wǎng)膜剝離等的藥物。另外，因為本發(fā)明的化合物在水溶性方面大多優(yōu)于相同種類的常規(guī)化合物，這使得可以將本發(fā)明化合物用作通常難以提供的水成液。此外，本發(fā)明的化合物在對組織的滲透和吸收性方面優(yōu)越，顯示極低的毒性并在安全性方面優(yōu)越。
可以系統(tǒng)或局部施用包含本發(fā)明化合物的藥物。對于系統(tǒng)給藥，通過口服施用或靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌內(nèi)注射等腸胃外施用。典型地，經(jīng)皮膚，肌肉，鼻內(nèi)，眼內(nèi)等施用。
關(guān)于包含本發(fā)明化合物的藥物的劑型，可以提及固體藥劑如散劑，顆粒劑，片劑，膠囊劑，栓劑等，液體如糖漿，注射劑，滴眼劑，滴鼻劑等，等等。關(guān)于顆粒劑或片劑的制備，例如，通過使用賦形劑(乳糖，蔗糖，葡萄糖，淀粉，結(jié)晶纖維素等)，潤滑劑(硬脂酸鎂，滑石，硬脂酸，硬脂酸鈣等)，崩解劑(淀粉，羧甲基纖維素鈉，碳酸鈣等)，粘合劑(淀粉液體，羥丙基纖維素液體，羧甲基纖維素液體，阿拉伯膠液體，明膠液體，海藻酸鈉液體等)等可以獲得任何劑型。對于顆粒劑和片劑，可以用適當?shù)陌聞?明膠，蔗糖，阿拉伯膠，巴西棕櫚蠟等)，腸包衣劑(例如醋酞纖維素，甲基丙烯酸共聚物，羥丙基纖維素鄰苯二甲酸酯，羧甲基乙基纖維素等)等形成包衣。
為了制備膠囊，將適當?shù)馁x形劑，如用于改善流動性和潤滑性的硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、滑石、輕質(zhì)無水硅酸等，用于壓縮流動性的結(jié)晶纖維素、乳糖等，以及上述崩解劑等適當?shù)丶尤氩⒕鶆蚧旌匣蚣庸こ深w粒劑或顆粒形式，用適當?shù)陌聞┬纬砂?，將得到的產(chǎn)品填充于膠囊，或者可以使用膠囊基質(zhì)形成包囊，所述膠囊基質(zhì)通過將甘油，山梨糖醇等加入適當?shù)哪z囊基質(zhì)(明膠等)以提高可塑性獲得。如果需要這些膠囊可以包含著色劑，防腐劑[二氧化硫，對羥基苯甲酸酯類(對羥基苯甲酸甲酯，對羥基苯甲酸乙酯，對羥基苯甲酸丙酯)]等。膠囊還可以制備成常規(guī)膠囊，以及腸包衣膠囊，胃內(nèi)抗性膠囊或緩釋膠囊。當制備腸溶膠囊時，將已經(jīng)用腸包衣劑包被的化合物或包含上述適當賦形劑的化合物填充到常規(guī)膠囊中，或者膠囊本身可以用腸包衣劑包被，或者腸溶性聚合物可以用作形成的基質(zhì)。
當制備栓劑時，可以適當?shù)剡x擇和使用栓劑基質(zhì)(例如可可脂，聚乙二醇等)。
當制備糖漿時，例如，可以適當選擇和使用穩(wěn)定劑(乙二胺四乙酸二鈉等)，懸浮劑(阿拉伯膠，羧甲纖維素等)，矯味劑(單糖漿，葡萄糖等)，芳香劑等。
當制備注射劑，滴眼劑或滴鼻劑時，可以通過將化合物溶解或分散在溶液中制備，該溶液適當?shù)睾兴幱锰砑觿?，如等滲劑(氯化鈉，氯化鉀，甘油，甘露醇，山梨糖醇，硼酸，硼砂，葡萄糖，丙二醇等)，緩沖液(磷酸鹽緩沖液，乙酸鹽緩沖液，硼酸鹽緩沖液，碳酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，Tris緩沖液，谷氨酸，ε-氨基己酸等)，防腐劑(對-羥基苯甲酸酯，氯丁醇，苯甲醇，苯扎氯銨，脫水乙酸鈉，乙二胺四乙酸二鈉，硼酸，硼砂等)，增稠劑(羥基乙基纖維素，羥基丙基纖維素，聚乙烯醇，聚乙二醇等)，穩(wěn)定劑(亞硫酸氫鈉，硫代硫酸鈉，乙二胺四乙酸二鈉，檸檬酸鈉，抗壞血酸，二丁基羥基甲苯等)，pH調(diào)節(jié)劑(鹽酸，氫氧化鈉，磷酸，乙酸等)等。
在本發(fā)明的化合物中，具有藥品期望的適當水溶性的化合物可以有利地用作水溶性液體，特別用于上述藥物制劑如糖漿，注射劑，滴眼劑，滴鼻液等。
盡管包含在上述糖漿，注射劑，滴眼劑或滴鼻劑中的添加劑的量根據(jù)所用添加劑的種類，應(yīng)用等而變化，僅需要以能夠?qū)崿F(xiàn)添加劑目的的濃度加入，其中等滲劑通常以約0.5至約5.0w/v％加入以使?jié)B透壓為約229至約343mOsm。以約0.01至約2.0w/v％加入緩沖液；以約0.01至約1.0w/v％加入增稠劑；以約0.001至約1.0w/v％加入穩(wěn)定劑。適當加入pH調(diào)節(jié)劑并通常調(diào)節(jié)至約pH 3至約9，優(yōu)選約4至約8。
盡管本發(fā)明的化合物的劑量根據(jù)目標疾病，癥狀，給藥受試者，給藥方法等而變化，例如，在內(nèi)服的藥物情形中，將約1至約100mg的單劑量1天數(shù)次施用于成人，在注射劑的情形中，將約0.1至約30mg一天一次施用于成人。對于眼的局部給藥，優(yōu)選將含有約0.001至約1.0w/v％，優(yōu)選約0.01至約0.5w/v％的本發(fā)明化合物的滴眼劑滴注到眼中，1天數(shù)次，每次滴注約20至約50μL。


圖1是顯示化合物1在大鼠晶狀體培養(yǎng)物中晶狀體混濁預防作用的圖，其中每個值顯示平均值±標準誤差(n＝5)，*表示通過Student’s T檢驗(兩側(cè))與對照組的顯著差異p＜0.01。
圖2是顯示在向兔子眼內(nèi)給藥以后化合物1在眼房水中的濃度的圖表，其中每個值顯示平均值±標準誤差(n＝4)。
圖3是顯示化合物在大鼠視網(wǎng)膜局部缺血模型中對神經(jīng)節(jié)細胞損傷的抑制作用的圖表，其中每個值顯示平均值±標準誤差(n＝6)，*表示通過Student’s T檢驗與對照組的顯著差異p＜0.05。
具體實施例方式
通過參照下列參考實施例，實施例，實驗實施例和配制實施例更詳細地解釋本發(fā)明，其不應(yīng)當被認為是限制性的。
在實施例中討論的化合物的分析值中，使用由Yanaco LID有限公司制備的MP-500V(未校正)測量熔點。使用由Varian公司制備的Gemini2000測量核磁共振譜(NMR)。由于異頭碳的存在，化合物1-11的NMR譜是復雜的，當相同質(zhì)子的主峰和次峰(minor peak)可以區(qū)分時，分別描述它們。使用由PerSeptive Biosystems公司制備的Voyager DE PRO測量基質(zhì)輔助激光解吸附離子化-飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)。使用Horiba有限公司制備的SEPA-2000測量比旋光([α]D)。
參考實施例1 N-(叔丁氧基)羰基-L-亮氨酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(參考化合物1)將叔丁氧羰基-L-亮氨酸(27g，110mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(16g，140mmol)溶解在四氫呋喃(180mL)中。在冰冷卻下向其中加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(27g，140mmol)在二氯甲烷(180mL)中的懸浮液。在室溫下攪拌該反應(yīng)混合物18小時，并在減壓下濃縮。將殘渣溶解在乙酸乙酯中，用1M鹽酸，飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和鹽水洗滌，用無水硫酸鎂干燥，在減壓下濃縮。將獲得的固體從己烷中結(jié)晶以產(chǎn)生參考化合物(33g，93％)，其為無色結(jié)晶。mp 74.1-75.5℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.88(d，3H，J＝6.3Hz)，0.91(d，3H，J＝6.3Hz)，1.39(s，9H)，1.54-1.75(m，3H)，2.80(s，4H)，4.32(m，1H)，7.62(d，1H，J＝8.4Hz)。
參考實施例2 N-(叔丁氧基)羰基-L-異亮氨酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(參考化合物2)以與參考實施例1相同的方式操作和使用叔丁氧基-L-異亮氨酸代替1的叔丁氧基-L-亮氨酸提供參考化合物2，其為白色固體。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ0.97(t，3H，J＝7.5Hz)，1.04(d，3H，J＝6.9Hz)，1.26(m，1H)，1.45(s，9H)，1.60(m，1H)，1.98(m，1H)，2.83(s，4H)，4.62(dd，1H，J＝8.7，5.1Hz)，5.01(d，1H，J＝8.7Hz)。
參考實施例3 N-(叔丁氧基)羰基-L-纈氨酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(參考化合物3)以與參考實施例1相同的方式操作和使用叔丁氧基-L-纈氨酸代替1的叔丁氧基-L-亮氨酸提供參考化合物3，其為無色固體。mp 125.7-127.4℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.99(d，6H，J＝6.9Hz)，1.4(s，9H)，2.15(m，1H)，2.81(s，4H)，4.22(dd，1H，J＝8.1，6.6Hz)，7.58(d，1H，J＝8.4Hz)。
參考實施例4(2S)-2-((叔丁氧基)羰基氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊酰胺(參考化合物4)將參考化合物1(20g，61mmol)溶解在N，N-二甲亞砜(120mL)中，在冰冷卻下加入(S)-(-)-α-氨基丁內(nèi)酯氫溴酸鹽(17g，91mmol)和三乙胺(18g，180mmol)。在室溫下攪拌該溶液18小時。用乙酸乙酯稀釋反應(yīng)混合物，用1M鹽水，飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和鹽水洗滌該溶液，用無水硫酸鎂干燥，在減壓下濃縮。從己烷中結(jié)晶殘渣以產(chǎn)生參考化合物4(19g，99％)，其為無色結(jié)晶。mp 92.5-93.3℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.85(d，3H，J＝6.3Hz)，0.88(d，3H，J＝6.6Hz)，1.28-1.50(m，2H)，1.38(s，9H)，1.61(m，1H)，2.14(m，1H)，2.39(m，1H)，3.96(m，1H)，4.20(m，1H)，4.34(m，1H)，4.60(m，1H)，6.88(d，1H，J＝8.4Hz)，8.30(d，1H，J＝8.4Hz)。
參考實施例5(2S)-2-((叔丁氧基)羰基氨基)-3-甲基-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊酰胺(參考化合物5)以與參考實施例4相同的方式操作和使用參考化合物2代替參考化合物1提供參考化合物5，其為白色粉末。mp 156.4-159.2℃.1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ0.90(t，3H，J＝7.5Hz)，0.95(d，3H，J＝6.6Hz)，1.15(m，1H)，1.43(S，9H)，1.50(m，1H)，1.88(m，1H)，2.21(m，1H)，2.73(m，1H)，4.01(m，1H)，4.26(m，1H)，4.46(td，1H，J＝9.0，1.2Hz)，4.54(m，1H)，5.11(d，1H，J＝8.7Hz)，6.87(m，1H)。
參考實施例6(2S)-2-((叔丁氧基)羰基氨基)-3-甲基-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)丁酰胺(參考化合物6)以與參考實施例4相同的方式操作和使用參考化合物3代替參考化合物1提供參考化合物6，其為無色結(jié)晶。mp 113.9-114.9℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.84(d，3H，J＝6.9Hz)，0.87(d，3H，J＝6.9Hz)，1.38(s，9H)，1.93(m，1H)，2.17(m，1H)，2.39(m，1H)，3.78(dd，1H，J＝8.9，7.2Hz)，4.21(m，1H)，4.40(m，1H)，4.60(m，1H)，6.68(d，1H，J＝8.9Hz)，8.37(d，1H，J＝7.8Hz)。
參考實施例7(2S)-4-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊酰胺(參考化合物7)將參考化合物4(3.4g，11mmol)溶解在乙酸乙酯(100mL)中，在冰冷卻下加入4N鹽酸/乙酸乙酯溶液(8.0mL)。在室溫下攪拌該溶液18小時(證實油在下面(oil-down))，在減壓下去除溶劑。向其中加入乙酸乙酯，再次在減壓下去除溶劑(重復兩次)。將殘渣懸浮在乙酸乙酯中，向其中加入異硫氰酸苯酯(1.5g，11mmol)和三乙胺(3.3g，32mmol)。在室溫下攪拌該溶液3小時。用1M鹽酸，飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和鹽水洗滌反應(yīng)混合物，用無水硫酸鎂干燥，在減壓下濃縮。從己烷中結(jié)晶殘渣，用己烷洗滌以產(chǎn)生參考化合物7(1.8g，48％)，其為無色結(jié)晶。mp 77.7-78.8℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.92(d，3H，J＝6.3Hz)，0.93(d，3H，J＝6.6Hz)，1.55-1.70(m，3H)，2.20(m，1H)，2.40(m，1H)，4.22(m，1H)，4.36(m，1H)，4.62(m，1H)，4.96(m，1H)，7.10(m，1H)，7.29-7.34(m，2H)，7.51-7.54(m，2H)，7.78(d，1H，J＝8.1Hz)，8.64(d，1H，J＝8.1Hz)，9.70(s，1H)。
參考實施例8(2S)-3-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊酰胺(參考化合物8)以與參考實施例7相同方式的操作和使用參考化合物5代替參考化合物4提供參考化合物8，其為白色固體。mp 71.9-72.7℃.1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ0.91(t，3H，J＝7.4Hz)，0.96(d，3H，J＝6.7Hz)，1.10-1.22(m，1H)，1.48-1.59(m，1H)，1.94-2.02(m，1H)，2.18-2.33(m，1H)，2.63-2.76(m，1H)，4.20-4.29(m，1H)，4.44(t，1H，J＝9.0Hz)，4.59(ddd，1H，J＝7.2，8.9，11.3Hz)，4.92(t，1H，J＝7.5Hz)，6.77(brs，1H)，6.98(brs，1H)，7.26-7.44(m，5H)，8.17(brs，1H)。
參考實施例9(2S)-3-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)丁酰胺(參考化合物9)以與參考實施例7相同方式的操作和使用參考化合物6代替參考化合物4提供參考化合物9，其為無色結(jié)晶。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ0.97(d，3H，J＝6.9Hz)，1.00(d，3H，J＝6.9Hz)，1.75(brs，1H)，2.15-2.33(m，2H)，2.63-2.72(m，1H)，4.45(t，1H，J＝9.0Hz)，4.61(ddd，1H，J＝11.4，8.8，7.3Hz)，4.89(t，1H，J＝7.4Hz)，6.75(d，1H，J＝8.1Hz)，7.01(d，1H，J＝6.7Hz)，7.21-7.50(m，5H)，8.17(brs，1H)。
參考實施例10(2S)-2-(((芐基氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊酰胺(參考化合物10)以與參考實施例7相同方式的操作和使用異硫氰酸芐酯代替異硫氰酸苯酯提供參考化合物10，其為無色油。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.92(d，3H，J＝6.0Hz)，0.93(d，3H，J＝6.0Hz)，1.56-1.72(m，3H)，2.18(m，1H)，2.41(m，1H)，4.22(m，1H)，4.36(m，1H)，4.63(m，1H)，5.00(m，1H)，7.49-7.98(m，8H)，8.60(d，1H，J＝8.1Hz)，9.75(s，1H)。
參考實施例11(2S)-2-((((4-氟苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊酰胺(參考化合物11)以與參考實施例7相同方式的操作和使用異硫氰酸4-氟苯酯代替異硫氰酸苯酯提供參考化合物11，其為淡黃色結(jié)晶。mp 47.5-48.4℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.92(d，3H，J＝6.3Hz)，0.93(d，3H，J＝6.3Hz)，1.55-1.72(m，3H)，2.18(m，1H)，2.39(m，1H)，4.21(m，1H)，4.35(m，1H)，4.60(m，1H)，4.95(m，1H)，7.12-7.18(m，2H)，7.49-7.55(m，2H)，7.78(d，1H，J＝7.8Hz)，8.62(d，1H，J＝7.8Hz)，9.65(s，1H)。
參考實施例12(2S)-2-((((4-甲氧基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊酰胺(參考化合物12)以與參考實施例7相同方式的操作和使用異硫氰酸4-甲氧基苯酯代替異硫氰酸苯酯提供參考化合物12，其為淡黃色結(jié)晶。mp 44.5-46.1℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.92(d，6H，J＝6.6Hz)，1.54-1.67(m，3H)，2.18(m，1H)，2.39(m，1H)，3.74(s，3H)，4.20(m，1H)，4.33(m，1H)，4.58(m，1H)，4.96(m，1H)，6.84-6.91(m，2H)，7.32-7.35(m，2H)，7.54(d，1H，J＝8.4Hz)，8.59(d，1H，J＝8.1Hz)，9.50(s，1H)。
參考實施例13(2S)-2-((((3-氰基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊酰胺(參考化合物13)以與參考實施例7相同方式的操作和使用異硫氰酸3-氰基苯酯代替異硫氰酸苯酯提供參考化合物13，其為白色固體。mp 72.0-73.2℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.92(d，3H，J＝6.1Hz)，0.92(d，3H，J＝6.1Hz)，1.56-1.72(m，3H)，2.11-2.25(m，1H)，2.36-2.44(m，1H)，4.17-4.26(m，1H)，4.35(dt，1H，J＝8.8，1.7Hz)，4.57-4.66(m，1H)，4.93(dd，1H，J＝14.2，7.2Hz)，7.49-7.53(m，2H)，7.71-7.77(m，1H)，8.10(d，1H，J＝8.1Hz)，8.17(brs，1H)，8.64(d，1H，J＝8.1Hz)，9.91(brs，1H)。
參考實施例14(2S)-2-((((4-氰基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊酰胺(參考化合物14)
以與參考實施例7相同方式的操作和使用異硫氰酸4-氰基苯酯代替異硫氰酸苯酯提供參考化合物14，其為白色固體。mp 71.9-73.4℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.90(d，3H，J＝6.1Hz)，0.91(d，3H，J＝6.1Hz)，1.56-1.69(m，3H)，2.14-2.25(m，1H)，2.36-2.44(m，1H)，4.17-4.25(m，1H)，4.35(dt，1H，J＝8.0，1.7Hz)，4.56-4.65(m，1H)，4.92(dd，1H，J＝14.5，7.5Hz)，7.73(d，2H，J＝8.5Hz)，7.86(d，2H，J＝8.7Hz)，8.18(d，1H，J＝8.1Hz)，8.66(d，1H，J＝8.1Hz)，10.08(brs，1H)。
參考實施例15(2S)-4-甲基-2-((((2-甲基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊酰胺(參考化合物15)以與參考實施例7相同方式的操作和使用異硫氰酸2-甲基苯酯代替異硫氰酸苯酯提供參考化合物15，其為淡黃色結(jié)晶。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.92(d，6H，J＝6.3Hz)，1.54-1.71(m，3H)，2.18(s，3H)，2.20(m，1H)，2.42(m，1H)，4.22(m，2H)，4.36(m，2H)，7.14-7.40(m，4H)，7.55(d，1H，J＝8.1Hz)，8.58(d，1H，J＝8.1Hz)，9.21(s，1H)。
參考實施例16(2S)-4-甲基-2-((((3-甲基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊酰胺(參考化合物16)以與參考實施例7相同方式的操作和使用異硫氰酸3-甲基苯酯代替異硫氰酸苯酯提供參考化合物16，其為白色固體。mp 59.1-62.2℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.86(d，3H，J＝6.3Hz)，0.91(d，3H，J＝6.3Hz)，1.51-1.72(m，2H)，2.10-2.25(m，1H)，2.27(s，3H)，2.33-2.44(m，1H)，4.15-4.25(m，1H)，4.30-4.38(m，1H)，4.54-4.65(m，2H)，4.92-4.99(m，1H)，6.91(d，1H，J＝7.3Hz)，7.18(t，1H，J＝7.8Hz)，7.30(d，1H，J＝9.2Hz)，7.31(s，1H)，7.72(d，1H，J＝8.2Hz)，8.61(d，1H，J＝8.2Hz)，9.62(s，1H)。
參考實施例17(2S)-4-甲基-2-((((4-甲基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-氧代-3-呋喃基)戊酰胺(參考化合物17)以與參考實施例7相同方式的操作和使用異硫氰酸4-甲基苯酯代替異硫氰酸苯酯提供參考化合物17，其為無色結(jié)晶。mp 107.9-111.2℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.89(d，3H，J＝6.5Hz)，0.90(d，3H，J＝6.5Hz)，1.40-1.51(m，2H)，1.52-1.70(m，1H)，2.09-2.27(m，1H)，2.20(s，3H)，2.32-2.43(m，1H)，4.16-4.29(m，2H)，4.34(dd，1H，J＝8.8，7.5Hz)，4.55-4.64(m，1H)，6.27(d，1H，J＝8.6Hz)，7.01(d，2H，J＝8.2Hz)，7.24(d，2H，J＝8.4Hz)，8.44(s，1H)，8.57(d，1H，J＝8.2Hz)。
實施例1(2S)-4-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺(化合物1)將參考化合物7(1.7g，4.9mmol)溶解在二氯甲烷(200mL)中，在-78℃下加入1M氫化二異丁基鋁/甲苯溶液(17mL，17mmol)。在-70℃或以下攪拌該溶液3小時，加入飽和氯化銨水溶液(4.0mL)并在室溫下攪拌混合物30分鐘。向其中加入無水硫酸鎂和乙酸乙酯，通過硅藻土濾去無機物質(zhì)。將該濾液在減壓下濃縮并通過HPLC(柱；YMC-Pack ODS-A 250×20mm I.D.，洗脫液；乙腈/水/三氟乙酸＝30∶70∶0.1)純化殘渣。收集主要級分并用乙酸乙酯萃取。用飽和碳酸氫鈉水溶液和飽和鹽水洗滌該溶液，用無水硫酸鎂干燥，在減壓下濃縮。從己烷中結(jié)晶殘渣以產(chǎn)生化合物1(0.46g，27％)，其為無色結(jié)晶。mp 62.0-63.8℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.91(d，6H，J＝6.0Hz)，1.49-1.91(m，4H)，2.14(m，1H)，3.64-4.00(m，3H)，4.91(m，1H)，5.00/5.11(d/t，1H，J＝4.5/4.7Hz)，6.16/6.34(d/d，1H，J＝4.8/4.8Hz)，7.10(m，1H)，7.29-7.34(m，2H)，7.49-7.53(m，2H)，7.72/7.78(d/d，1H，J＝8.4/8.7Hz)，8.26/7.87(d/d，1H，J＝6.3/7.5Hz)，9.69(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.85。MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值358.174，實驗值358.169.[α]D25+23.6°(c＝0.211)。
實施例2(2S)-3-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺(化合物2)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物8代替參考化合物7提供化合物2，其為無色結(jié)晶。mp 51.3-52.9℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.81-0.87(m，6H)，1.03(m，1H)，1.48(m，1H)，1.68-1.86(m，2H)，2.11(m，1H)，3.48/3.86(m/m，1H)，3.91-3.96(m，2H)，4.88(m，1H)，4.99/5.10(d/t，1H，J＝4.5/4.5Hz)，6.13/6.27(d/d，1H，J＝4.5/4.2Hz)，7.07(m，1H)，7.27-7.32(m，2H)，7.49-7.52(m，2H)，7.70/7.71(d/d，1H，J＝8.4/8.1Hz)，7.85/8.21(d/d，1H，J＝7.8/6.6Hz)，9.76(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.77.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值374.151，實驗值374.185.[α]D25+33.6°(c＝0.208)。
實施例3(2S)-3-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)丁酰胺(化合物3)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物9代替參考化合物7提供化合物3，其為無色結(jié)晶。mp 50.9-51.9℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.86-0.92(m，6H)，1.80(m，1H)，2.03-2.26(m，2H)，3.69/3.89(m/m，1H)，3.93-3.97(m，2H)，4.92(m，1H)，5.02/5.13(d/t，1H，J＝4.5/4.7Hz)，6.16/6.31(d/d，1H，J＝4.5/4.8Hz)，7.10(m，1H)，7.29-7.34(m，2H)，7.52-7.55(m，2H)，7.71(m，1H)，8.24/7.92(d/d，1H，J＝6.6/7.5Hz)，9.82(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.83.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值360.136，實驗值360.137.[α]D25+39.8°(c＝0.201)。
實施例4(2S)-2-(((芐基氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺(化合物4)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物10代替參考化合物7提供化合物4，其為無色結(jié)晶。mp 62.2-64.4℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.84-0.89(m，6H)，1.44-1.82(m，4H)，2.14(m，1H)，3.68/4.03(m/m，2H)，3.85-3.97(m，2H)，4.66(bs，1H)，4.85(m，1H)，4.99/5.11(d/t，1H，J＝4.5/4.4Hz)，6.12/6.34(d/bs，1H，J＝4.8Hz)，7.22-7.36(m，5H)，7.58(m，1H)，7.68/8.13(bs，1H)，7.96(bs，1H)，主∶次＝1.0∶0.80.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值388.167，實驗值388.162.[α]D25+18.9°(c＝0.211)。
實施例5(2S)-2-((((4-氟苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺(化合物5)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物11代替參考化合物7提供化合物5，其為無色結(jié)晶。mp 77.2-78.3℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.90(d，6H，J＝6.3Hz)，1.48-1.91(m，4H)，2.14(m，1H)，3.69/3.95(m/m，1H)，3.86-3.91(m，2H)，4.93(m，1H)，5.00/5.12(d/t，1H，J＝5.1/4.5Hz)，6.15/6.34(d/d，1H，J＝4.8/3.9Hz)，7.12-7.18(m，2H)，7.46-7.52(m，2H)，7.73/7.77(d/d，1H，J＝8.1/7.8Hz)，7.84/8.25(d/d，1H，J＝7.8/7.2Hz)，9.64(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.85.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值392.142，實驗值392.141.[α]D25+20.1°(c＝0.199)。
實施例6(2S)-2-((((4-甲氧基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺(化合物6)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物12代替參考化合物7提供化合物6，其為無色結(jié)晶。mp 67.9-68.8℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.88-0.91(m，6H)，1.47-1.87(m，4H)，2.14(m，1H)，3.69/3.94(m/m，1H)，3.74(s，3H)，3.86-3.90(m，2H)，4.89(m，1H)，4.99/5.11(d/t，1H，J＝4.8/4.4Hz)，6.15/6.35(d/d，1H，J＝4.8/4.2Hz)，6.88-6.91(m，2H)，7.28-7.33(m，2H)，7.47/7.53(d/d，1H，J＝8.1/6.9Hz)，8.22/7.81(d/d，1H，J＝6.6/7.8Hz)，9.49(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.78.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值404.162，實驗值404.166.[α]D25+19.9°(c＝0.200)。
實施例7(2S)-2-((((3-氰基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺(化合物7)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物13代替參考化合物7提供化合物7，其為無色結(jié)晶。mp 54.1-55.1℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.90-0.92(m，6H)，1.45-1.90(m，4H)，2.15(m，1H)，3.69/3.96(m/m，1H)，3.86-3.91(m，2H)，4.93(m，1H)，5.01/5.12(d/t，1H，J＝4.8/4.5Hz)，6.16/6.34(d/d，1H，J＝4.8/4.5Hz)，7.48-7.54(m，2H)，7.75(m，1H)，8.06-8.18(m，2H)，8.30/7.92(d/d，1H，J＝6.9/7.5Hz)，9.93(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.75.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值399.147，實驗值399.167.[α]D25+23.8°(c＝0.210)。
實施例8(2S)-2-((((4-氰基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-4-甲基-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺(化合物8)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物14代替參考化合物7提供化合物8，其為無色結(jié)晶。mp 80.0-82.9℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.89-0.92(m，6H)，1.50-1.90(m，4H)，2.14(m，1H)，3.69/3.96(m/m，1H)，3.86-3.91(m，2H)，4.93(m，1H)，5.01/5.12(d/t，1H，J＝5.1/4.5Hz)，6.16/6.33(d/d，1H，J＝4.5/4.2Hz)，7.73-7.76(m，2H)，7.84-7.88(m，2H)，8.18(m，1H)，8.31/7.95(d/d，1H，J＝6.6/7.8Hz)，10.10(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.75.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值399.147，實驗值399.150.[α]D25+51.2°(c＝0.195)。
實施例9(2S)-4-甲基-2-((((2-甲基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺(化合物9)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物15代替參考化合物7提供化合物9，其為無色結(jié)晶。mp 57.9-58.9℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.88-0.91(m，6H)，1.48-1.86(m，4H)，2.16(m，1H)，2.17(s，3H)，3.69/3.94(m/m，1H)，3.86-3.90(m，2H)，4.91(m，1H)，4.98/5.11(d/t，1H，J＝4.5/4.5Hz)，6.15/6.36(d/d，1H，J＝4.8/3.9Hz)，7.12-7.31(m，4H)，7.46/7.52(d/d，1H，J＝8.4/9.9Hz)，7.78/8.19(d/d，1H，J＝7.2/6.6Hz)，9.20(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.89.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值388.167，實驗值388.176.[αα]D25+9.8°(c＝0.203)。
實施例10(2S)-4-甲基-2-((((3-甲基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺(化合物10)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物16代替參考化合物7提供化合物10，其為無色結(jié)晶。mp 61.4-61.9℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.91(d，6H，J＝6.3Hz)，1.47-1.88(m，4H)，2.12(m，1H)，2.28(s，3H)，3.69/3.95(m/m，1H)，3.86-3.91(m，2H)，4.92(m，1H)，5.00/5.11(d/t，1H，J＝4.8/4.5Hz)，6.15/6.34(d/d，1H，J＝4.8/4.5Hz)，6.92(m，1H)，7.17-7.30(m，3H)，7.68/7.74(d/d，1H，J＝8.4/7.8Hz)，8.24/7.84(d/d，1H，J＝6.6/7.5Hz)，9.63(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.87.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值388.167，實驗值388.175.[α]D25+4.8°(c＝0.208)。
實施例11(2S)-4-甲基-2-((((4-甲基苯基)氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺(化合物11)以與實施例1相同方式的操作和使用參考化合物17代替參考化合物7提供化合物11，其為無色結(jié)晶。mp 87.3-88.7℃.1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.89(d，6H，J＝6.6Hz)，1.36-1.85(m，4H)，2.14(m，1H)，2.21(s，3H)，3.68/3.94(m/m，1H)，3.85-3.90(m，2H)，4.28(m，1H)，4.98/5.10(d/t，1H，J＝4.8/4.7Hz)，6.14/6.33(d/d，1H，J＝4.5/3.6Hz)，6.24(m，1H)，7.01-7.03(m，2H)，7.23-7.26(m，2H)，8.19/7.84(d/d，1H，J＝7.2/7.8Hz)，8.46(s，1H)，主∶次＝1.0∶0.46.MALDI-TOF MS[M+Na]+理論值388.167，實驗值388.165.[α]D25+23.9°(c＝0.209)。
實驗實施例1 μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶抑制活性的測定按照參考文獻[Anal.Biochem.208卷，387-392(1993)]所述方法測定μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶抑制活性。更具體地，將包含0.5mg/mL酪蛋白，50mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)，20mM二硫蘇糖醇和0.03酶單位的μ-鈣蛋白酶(來源于人紅細胞，由Cosmo Bio Co.，Ltd.制備)或m-鈣蛋白酶(來源于豬腎，由Cosmo Bio Co.，Ltd.制備)反應(yīng)混合物(200μL)，包含各種濃度的試驗藥物的二甲亞砜溶液(2.5μL)和20mM氯化鈣水溶液(50μL)加入96孔平板。在30℃下反應(yīng)60分鐘后，將反應(yīng)混合物(100μL)轉(zhuǎn)移至不同的96孔平板，加入凈化水(50μL)和50％考馬斯亮藍溶液(100μL)。將平板放在室溫下15分鐘，測量在595nm下的吸光度。使用不用試驗藥物以相同方式處理以后的值作為對照，和通過加入1mM EDTA代替20mM氯化鈣水溶液獲得的值作為空白值，從下列公式計算抑制率，測定50％抑制所需的量(IC50)。
抑制率(％)＝{1-(測量值-空白值)/(對照值-空白值)}×100試驗結(jié)果1
其結(jié)果在表2中顯示。
表2.本發(fā)明化合物的μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶抑制活性

結(jié)果，本發(fā)明的化合物顯示優(yōu)越的鈣蛋白酶抑制活性。
實驗實施例2 在大鼠晶狀體培養(yǎng)物中晶狀體混濁預防作用將獲自SD大鼠(5周齡)的晶狀體分成3組，如下培養(yǎng)。
(1)對于正常組，在整個實驗期間將晶狀體培養(yǎng)在基本培養(yǎng)液[Eagle’s無血清極限基本培養(yǎng)基(MEM，GIBCO)，含有10％胎牛血清(FBS，GIBCO)]中。
(2)對于對照組，將晶狀體培養(yǎng)在基本培養(yǎng)液中。
(3)對于藥物組，將晶狀體培養(yǎng)在培養(yǎng)液中，其中已經(jīng)將溶解在乙醇中的化合物1加入基本培養(yǎng)液(加藥培養(yǎng)液；在培養(yǎng)液中化合物1的濃度100μM，乙醇濃度0.5％)。
對于對照組和藥物組，在培養(yǎng)后2小時的培養(yǎng)液加入鈣離子載體(A23187，由Calbiochem-Novabiochem制備)的乙醇溶液(將A23187(1mg)溶解在乙醇(955μL)中)，使A23187濃度為10μM。在24小時后，對于藥物組將培養(yǎng)基換成加藥培養(yǎng)液，對于對照組，換成基本培養(yǎng)液。在培養(yǎng)4天后，在立體顯微鏡下進行觀察，使用計算機使用圖像分析儀(NIH圖像1.62)測量晶狀體的混濁度(象素)。
試驗結(jié)果2結(jié)果在圖1中表示。正常組的晶狀體是透明的。對照組的晶狀體在中央是不透明的白色。在加化合物1的組(藥物組)中，混濁度被顯著抑制。
上述結(jié)果提示本發(fā)明的化合物1有效用于預防晶狀體混濁。
實驗實施例3 眼房水滲透試驗將50μL后述配制實施例4的懸浮液滴注到日本白兔(體重約2kg，購自Fukusaki Rabbit Union)的兩只眼睛中。在滴注0.25，0.5，1和3小時后，用戊巴比妥殺死兔子，回收眼房水。使用柱轉(zhuǎn)換系統(tǒng)HPLC，測量在眼房水中化合物1的濃度。
試驗結(jié)果3其結(jié)果在圖2中表示。眼房水中化合物1的濃度在滴注后0.5小時達到最大值(Cmax)，其濃度為2903.6nM。在滴注后0-3小時內(nèi)滲透至水狀體的化合物1的量的藥物濃度-時間曲線下面積(AUC)為4786.2nM·h。
實驗實施例4 對大鼠視網(wǎng)膜缺血性疾病的作用使用雄性SD大鼠(體重150-200g，購自Charles River Japan，Inc.)。關(guān)于麻醉，在局部缺血前，將等量50mg/mL氯胺酮注射劑和20mg/mL賽拉嗪注射劑以1.0mL/kg體重肌內(nèi)施用于大鼠腿節(jié)中。為了完成局部缺血，使用Sugita微型夾(No.98)綁扎包括視網(wǎng)膜中央動脈的視神經(jīng)，阻斷血流55分鐘。對于正常組，僅暴露視網(wǎng)膜中央動脈，不設(shè)置局部缺血。在局部缺血再灌注7天后，制備組織樣本。為了制備組織樣本，腹膜內(nèi)施用過量的戊巴比妥溶液以殺死動物，摘除左眼球。在2％多聚甲醛和2.5％戊二醛的固定液(0.1M磷酸鹽緩沖液，pH 7.4)中固定摘除的眼球24小時。在固定后，制備石蠟包埋塊，在通過視神經(jīng)盤中央的部分以3μm的厚度切片，并用蘇木精和曙紅(HE)染色。在光學顯微鏡下對離視神經(jīng)盤中央1-2mm的視網(wǎng)膜部分每0.25mm寬度的神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)。
在局部缺血開始之前15分鐘和在局部缺血釋放之后即刻，將通過將羧基纖維素鈉溶解在蒸餾水中至0.5％的濃度獲得的溶液(CMC溶液)口服施用于對照組，將通過將化合物1以1.0％懸浮在CMC溶液中獲得的溶液口服施用于藥物組，結(jié)果化合物1以100mg/kg體重施用。
試驗結(jié)果4其結(jié)果在圖3中顯示。由于局部缺血，神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)降低至約正常組(對照組)的1/4。與此對比，化合物1給藥(藥物組)顯著抑制由于局部缺血導致的神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)的降低。
上述結(jié)果提示本發(fā)明的化合物1具有改善視網(wǎng)膜缺血性疾病的作用。
實驗實施例5 細胞毒性試驗將小鼠成神經(jīng)細胞瘤來源的細胞系(N1E-115細胞)以104/孔接種在96孔微型板中，并在含有10％FBS的Dulbecco’s改進的Eagle’s極限基本培養(yǎng)基(100μL，DMEM，GIBCO)中在37℃下在5％CO2下培養(yǎng)過夜。去除全部量的培養(yǎng)液，將培養(yǎng)基換成各種濃度的試驗藥物溶液(100μL，通過將化合物1溶解在99.5％乙醇和用DMEM將乙醇終濃度調(diào)整至1％制備)，培養(yǎng)細胞24小時。分別回收培養(yǎng)物上清液和細胞。將細胞超聲處理以產(chǎn)生可溶性級分，用LDH細胞毒性檢測試劑盒(MK401，由Takara Bio Inc.制備)測定它們中每個的乳酸脫氫酶(LDH)活性。通過下列公式確定LDH釋放率，并當作遭受細胞毒性的細胞比例。
LDH釋放率(％)＝{培養(yǎng)物上清液的LDH活性/(培養(yǎng)物上清液的LDH活性+胞內(nèi)LDH活性)}×100通過SAS臨床前程序包(6.12版)的LD50/ED50概率單位法，從每個試驗藥物濃度下的LDH釋放率確定LD50。
試驗結(jié)果5其結(jié)果在表3中顯示。
表3.N1E-115胞外釋放LDH試驗藥物濃度(化合物1) LDH釋放率(％)0.1mM 9.32±0.070.5mM 11.05±0.721mM 14.22±1.142mM 47.73±1.66從表3中LDH釋放率測定的化合物1的LD50為2.191±0.079mM。
制劑實施例1 片劑化合物105g淀粉12g乳糖27.2g硬脂酸鎂0.4g將化合物10，乳糖和淀粉充分混合以產(chǎn)生顆粒，其按照濕式片劑制備方法用于壓片。加入硬脂酸鎂并將混合物壓片以產(chǎn)生400片。如果需要用腸包衣劑包被片劑(甲基丙烯酸共聚物)。
制劑實施例2 注射劑化合物5 100mg氯化鈉 900mg1N氫氧化鈉 適量注射用蒸餾水總量100mL將上述成分通過常規(guī)方法無菌混合以提供注射劑。
制劑實施例3 滴眼劑化合物1 100mg硼酸700mg
硼砂適量氯化鈉 500mg乙二酸四乙胺二鈉0.05mg苯扎氯銨0.0005mg無菌凈化水 總量100mL將上述成分通過常規(guī)方法無菌混合以提供滴眼劑。
制劑實施例4 滴眼劑化合物1 500mg聚山梨酯80 100mg磷酸二氫鈉二水合物 100mg苯扎氯銨5mg氯化鈉 900mg氫氧化鈉適量PH 7.0無菌凈化水 總量100mL將上述成分通過常規(guī)方法無菌混合以提供滴眼混懸劑。
工業(yè)適用性因為本發(fā)明的式(I)表示的化合物具有優(yōu)越的鈣蛋白酶抑制活性，它用作預防或治療各種涉及鈣蛋白酶的疾病的藥物，所述疾病如缺血性疾病，免疫疾病，阿爾茨海默氏病，骨質(zhì)疏松癥，腦組織疾病導致的疾病，白內(nèi)障，青光眼，視網(wǎng)膜疾病，由光凝固法導致的眼后段并發(fā)癥，與血管生成有關(guān)的疾病等。
盡管在前面已經(jīng)詳細描述本發(fā)明的一些具體實施方案，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以在基本上不偏離本發(fā)明新教導和利益的范圍內(nèi)不同地修改和改變本文所示的具體實施方案。因此，在后附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，本發(fā)明包括所有這些修改和改變。
本申請是基于在日本提出的專利申請2002-072762，其內(nèi)容由此通過參考結(jié)合于此。
權(quán)利要求
1.由式(I)表示的化合物 其中R1是低級烷基，R2是氫，鹵素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，并且n為0或1。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1是含有3或4個碳原子的低級烷基。
3.權(quán)利要求1或2的化合物，其中R1是選自異丙基，異丁基和仲丁基的基團。
4.權(quán)利要求1的化合物，其中R1是異丁基并且R2是選自氫，鹵素，氰基，低級烷基和低級烷氧基的基團。
5.(2S)-4-甲基-2-(((苯基氨基)硫代甲基)氨基)-N-((3S)-四氫-2-羥基-3-呋喃基)戊酰胺。
6.一種包含由式(I)表示的化合物的藥物 其中R1是低級烷基，R2是氫，鹵素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，并且n為0或1。
7.權(quán)利要求6的藥物，其是鈣蛋白酶抑制劑。
8.權(quán)利要求6的藥物，其是用于預防或治療涉及鈣蛋白酶的疾病的藥劑。
9.一種藥物組合物，其包含由式(I)表示的化合物和藥用載體， 其中R1是低級烷基，R2是氫，鹵素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，并且n為0或1。
10.權(quán)利要求9的藥物組合物，其是鈣蛋白酶抑制劑。
11.一種治療涉及鈣蛋白酶的疾病的方法，其包含向需要治療的哺乳動物施用有效量的由式(I)表示的化合物， 其中R1是低級烷基，R2是氫，鹵素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，并且n為0或1。
12.由式(I)表示的化合物作為鈣蛋白酶抑制劑的應(yīng)用， 其中R1是低級烷基，R2是氫，鹵素，氰基，低級烷基或低級烷氧基，并且n為0或1。
全文摘要
提供由右式(I)表示的化合物其中R
文檔編號C07D307/22GK1642933SQ03806110
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月15日
發(fā)明者中村雅之, 井上淳 申請人:千壽制藥株式會社