專(zhuān)利名稱(chēng)：6－(4－取代－苯胺基)嘧啶衍生物、其制備方法以及包含其的抗病毒藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用作抗病毒劑的6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物，更具體地，本發(fā)明涉及一種由下式表示的新的6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物或其藥學(xué)可接受鹽，其對(duì)丙型肝炎病毒(HCV)的復(fù)制具有極強(qiáng)的抑制作用 其中，R代表C1-C4直鏈或支鏈烷氧基羰基、雜環(huán)基羰基、或者羧基烷基，本發(fā)明還涉及制備該化合物的方法，以及含有作為活性成分的該化合物的抗病毒藥物組合物。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒是主要為輸血后和社區(qū)獲得性的非甲型、非乙型病毒性肝炎的主要致病因素。一旦感染HCV后，根據(jù)其表現(xiàn)的癥狀，約80％的感染人群發(fā)展為慢性肝炎，而約20％的感染人群發(fā)展為引起肝硬化的急性肝炎，而肝硬化最終轉(zhuǎn)化為肝癌。根據(jù)最近發(fā)表的報(bào)道，世界范圍內(nèi)2億以上的人口感染了HCV。例如，450萬(wàn)以上的美國(guó)人感染了該病毒(該數(shù)量最多可達(dá)到1千5百萬(wàn))，且5百萬(wàn)以上的歐洲人為HCV患者。
HCV是黃病毒(Flaviviridae)科的成員之一。更具體地，HCV在其膜內(nèi)具有大小約為9.5kb的(+)-RNA(單鏈正指向RNA)基因組。RNA基因組在5’和3’端具有非翻譯區(qū)域(UTR)和長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀框架(ORF)。該ORF由宿主細(xì)胞酶表達(dá)為包括3,010至3,040個(gè)氨基酸的多蛋白質(zhì)，且被宿主細(xì)胞及其本身的蛋白酶分成3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。此外，在該基因組的5’和3’端分別具有均一保守區(qū)域。該區(qū)域被認(rèn)為在病毒的蛋白質(zhì)生成和RNA復(fù)制中具有重要作用。
長(zhǎng)的ORF表達(dá)為多蛋白質(zhì)，通過(guò)共翻譯加工或者翻譯后加工，將其加工為結(jié)構(gòu)蛋白，即，核心抗原蛋白(核心)和表面抗原蛋白(E1，E2)，以及非結(jié)構(gòu)性蛋白，NS2(蛋白酶)、NS3(絲氨酸蛋白酶，解旋酶)、NS4A(絲氨酸蛋白酶輔助因子)、NS4B(涉及抗性的蛋白酶輔助因子，)、NS5A、以及NS5B(RNA依賴(lài)性RNA聚合酶，RdRp)，其中每種蛋白都與病毒復(fù)制相關(guān)。結(jié)構(gòu)蛋白通過(guò)宿主細(xì)胞的信號(hào)肽酶分為核心、E1、和E2。同時(shí)，非結(jié)構(gòu)蛋白由病毒的絲氨酸蛋白酶(NS3)及輔助因子(NS2，NS4A，和NS4B)進(jìn)行加工。結(jié)構(gòu)蛋白中的核心抗原蛋白與表面抗原蛋白一起形成病毒的殼體，而諸如NS3和NS5B的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)在病毒的RNA復(fù)制中起到重要的作用(參考文獻(xiàn)Bartenschager，R.，1997，Molecular targets ininhibition of hepatitis C virus replication，Antivir.Chem.Chemother.8281-301)。
與其它黃病毒類(lèi)似，病毒RNA的5’和3’端具有具有均一保守的非翻譯區(qū)域(UTR)。已知該區(qū)域通常在病毒的復(fù)制中起到重要的作用。5’端具有由341個(gè)核苷酸組成的5’-UTR，該部分具有4個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)(I，II，III，和IV)。實(shí)際上，該部分是作為內(nèi)在核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)而起作用，該位點(diǎn)對(duì)于表達(dá)蛋白質(zhì)的翻譯加工是必須的。特別是，已有報(bào)道說(shuō)具有最大和最穩(wěn)定結(jié)構(gòu)且具有保守序列的莖III是核糖體結(jié)合中最重要的部分。此外，已知病毒蛋白質(zhì)通過(guò)從AUG啟動(dòng)翻譯加工來(lái)進(jìn)行表達(dá)的，其中AUG存在于莖IV的單鏈RNA中(參考文獻(xiàn)Stanley，M.Lemon and MasaoHonda，1997，Internal ribosome entry sites within the RNA genomes ofhepatitis C virus and other Flaviviruses，seminars in Virology 8274-288)。
另外，3’端具有包含318個(gè)核苷酸的3′-UTR。已知該部分在NS5B結(jié)合的起始步驟中起到重要的作用，其中NS5B是RNA復(fù)制的一種必須的酶。根據(jù)三級(jí)結(jié)構(gòu)的序列可以看出，3′-UTR由3個(gè)不同的部分組成從5’端起始至第98個(gè)核苷酸(98nt.)的-X-tail-5′、具有連續(xù)UTP的-poly(U)、以及其余的3′-UTR-。更具體地，X-tail-5′部分由具有非常保守序列的98個(gè)核苷酸組成，且具有3個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而形成非常穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)。這可能是為何認(rèn)為X-tail-5′部分對(duì)NS5B結(jié)合非常必要的原因。而且，有報(bào)導(dǎo)說(shuō)-poly(U)-部分誘導(dǎo)了嘧啶軌跡(track)，因此促進(jìn)了RNA聚合酶作用。最后，剩余部分的3′-UTR部分具有環(huán)狀三級(jí)結(jié)構(gòu)且在NS5B結(jié)合中起到重要作用。但是，其結(jié)構(gòu)稍微有些不穩(wěn)定?？傮w說(shuō)來(lái)，已知HCV RNA的3’端區(qū)域RNA復(fù)制啟動(dòng)時(shí)具有NS5B結(jié)合的必要結(jié)構(gòu)(參考文獻(xiàn)Yamada etal.，1996，Genetic organization and diversity of the hepatitisC virus genome，Virology 223255-281)。
在HCV的其它酶中，NS5B是一個(gè)直接參與RNA復(fù)制的酶，因此其非常重要。NS5B是一個(gè)包含591個(gè)氨基酸的酶，其分子量約為68kDa。NS5B酶中有兩個(gè)RNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即RBD1和RBD2。RBD1存在于83至194位的氨基酸之間，RBD2存在于196至298位的氨基酸之間。同時(shí)，對(duì)RNA結(jié)合及活性所必須的結(jié)構(gòu)域氨基酸為′Asp′(220位氨基酸)、，′Gly′(283位氨基酸)、′Gly′(317位氨基酸)、′Asp′(318位氨基酸)、′Asp′(319位氨基酸)，以及′Lys′(346位氨基酸)。進(jìn)一步地，只要存在病毒本身的RNA模板，該酶就能啟動(dòng)聚合酶反應(yīng)而無(wú)需其它引物(參考文獻(xiàn)Lohmann，V.etal.，1997，Biochemical properties of hepatitis C virusNS5B RNA dependent RNA polymerase and identification of amino acidsequence motifs essential forenzymatic activity，J.viral.718416-8428)。
HCV的RNA基因組在1989年通過(guò)分子克隆被分離出來(lái)(參考文獻(xiàn)Choo，Q-L，etal.，1989，Isolation of acDNA clone derived from ablood-borne non-A，non-B viral hepatitis genome.Science 244359-362)。盡管從那時(shí)開(kāi)始已經(jīng)對(duì)HCV進(jìn)行了大量的分子生物學(xué)研究，但是由于缺少更有效的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)以及動(dòng)物模型，因此上述研究都有限制性。幸運(yùn)的是，通過(guò)引入肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系已經(jīng)在一定程度上解決了上述問(wèn)題，利用上述細(xì)胞系能夠更穩(wěn)定地復(fù)制HCV(參考文獻(xiàn)Lohmann，V.，F(xiàn).Korner，J-O Koch，U.Herian，L.Theilmann，R.Bartenschlarger，1999，Replication of subgenomic hepatitis c virus RNAs in a hepatoma cell line.Science 285110-113)。
迄今為止，實(shí)際上還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)HCV非常有效的疫苗或者療法。因此，目前世界上許多藥廠和研究單位正致力于開(kāi)發(fā)丙型肝炎的療法和預(yù)防方法。世界上的HCV患者很普遍，且HCV發(fā)展成為肝硬化/或者肝癌的頻率要遠(yuǎn)高于HBV。而且，盡管發(fā)展為慢性肝炎的頻率很高，但是對(duì)病毒感染機(jī)制的研究仍在進(jìn)行中。人們通過(guò)輸血、靜脈給藥或者紋身被傳染上HCV，但是大多數(shù)的HCV傳染通過(guò)直接的血液接觸發(fā)生。然而，仍不確切知道40-50％的HCV患者是怎樣被傳染上的。考慮到這種情況，非常迫切需要研制出一種新的疫苗和療法來(lái)治療該疾病。通常，HCV在不同的株系和突變種之間具有不同的基因型。一旦一個(gè)人由HCV而發(fā)展為慢性肝炎，則不難發(fā)現(xiàn)由于遺傳性變型其很容易再次感染或者同時(shí)感染。由于這一原因，幾乎不可能成功開(kāi)發(fā)出有效的HCV疫苗。HCV治療的另一個(gè)實(shí)例是利用α干擾素。但是，已經(jīng)證實(shí)該方法并非很好，原因是由于α干擾素對(duì)不同的HCV基因型的作用具有很大差別，并且當(dāng)停止給藥時(shí)，多數(shù)情況下患者會(huì)復(fù)發(fā)感染丙型肝炎。因此非常有必要研制出一種抑制劑，其僅與特異的HCV蛋白結(jié)合，從而控制HCV的復(fù)制。這類(lèi)研究的最佳靶點(diǎn)為HCV的NS3蛋白酶/解旋酶和NS5B RNA聚合酶。由于宿主細(xì)胞并不需要這些酶，但是這些酶對(duì)HCV自身的復(fù)制確是必須的，因此這些酶在開(kāi)發(fā)抗HCV的制劑中非常有用。換言之，HCV的NS5B{RNA依賴(lài)性RNA聚合酶(復(fù)制酶)}是HCV的一個(gè)必需的酶，這使得該酶成為抑制HCV復(fù)制的一個(gè)良好的靶點(diǎn)。
既然不能通過(guò)疫苗來(lái)防治HCV，就引入了一種利用α干擾素和利巴韋林的新的治療方法。但是，該方法也導(dǎo)致了副作用，且在丙型肝炎的治療上不那么有效。例如，約25％的HCV患者對(duì)干擾素治療沒(méi)有反應(yīng)，有約25％對(duì)其有暫時(shí)性反應(yīng)，但是又復(fù)發(fā)感染為丙型肝炎。剩余的50％患者在治療完成后ALT保持在正常水平，HCV RNA轉(zhuǎn)為陰性。但是，其中的50％在3-6個(gè)月內(nèi)又復(fù)發(fā)感染為丙型肝炎。簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)，僅有25％的HCV患者表現(xiàn)出多于6個(gè)月的持續(xù)反應(yīng)。同時(shí)，在全世界的患者中所發(fā)現(xiàn)的最多的HCV亞型為1型(1a，1b)，與2型和3型相比，1型不容易通過(guò)干擾素進(jìn)行治療。當(dāng)采用干擾素和利巴韋林聯(lián)合治療時(shí)，療效也為雙倍的。已知單獨(dú)使用利巴韋林時(shí)，其對(duì)HCV幾乎沒(méi)有作用，甚至還會(huì)產(chǎn)生諸如紅細(xì)胞溶血性貧血等副作用。因此僅在干擾素治療效果不好或者再次復(fù)發(fā)時(shí)才使用利巴韋林。迄今為止，還沒(méi)有人研制出這樣一種抗病毒劑，其能通過(guò)抑制HCV的復(fù)制來(lái)治療丙型肝炎，而這種作用是通過(guò)其對(duì)HCV的特異性作用產(chǎn)生的。
因此，本發(fā)明的目的在于研制一種非核苷酸化合物，其幾乎沒(méi)有毒性和副作用，但是表現(xiàn)出對(duì)HCV的極佳的抗病毒活性，本發(fā)明是通過(guò)研究任何可能抑制重組HCV RNA聚合酶(NS5B，RNA聚合酶)活性的化合物來(lái)進(jìn)行的。
本發(fā)明人進(jìn)行了很多努力來(lái)研制對(duì)HCV具有極好抗病毒活性的化合物從而試圖開(kāi)發(fā)一種新的幾乎沒(méi)有毒性和副作用的HCV治療劑。本發(fā)明人最終成功合成了一種如式1所示的新的6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物，已經(jīng)證實(shí)這些化合物對(duì)抑制HCV的復(fù)制確實(shí)非常有效。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽，以及制備所述化合物的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種包含作為活性成分的上述化合物的藥物組合物，該組合物對(duì)抑制和治療丙型肝炎幾乎沒(méi)有副作用，且很經(jīng)濟(jì)。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種可用下式I表示的新的6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物或其藥學(xué)可接受鹽
其中，R代表C1-C4直鏈或支鏈烷氧基羰基、雜環(huán)基羰基、或者羧基烷基。
優(yōu)選地，式I中的R為異丙氧羰基、(3-吡啶基)羰基、(4-吡啶基)羰基或羧甲基。
如前所述，可使用上述化合物的藥學(xué)可接受鹽的形式。對(duì)于所述鹽來(lái)說(shuō)，可使用通過(guò)藥學(xué)可接受的游離酸制備的酸加成鹽。具有化學(xué)式I結(jié)構(gòu)的化合物能夠采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的常規(guī)方法來(lái)制備藥學(xué)可接受的酸加成鹽。所使用的游離酸可為有機(jī)酸以及無(wú)機(jī)酸。例如，無(wú)機(jī)酸包括氫氯酸、氫溴酸、硫酸，以及磷酸。有機(jī)酸包括檸檬酸、乙酸、乳酸、酒石酸、馬來(lái)酸、富馬酸、甲酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡糖酸、甲磺酸、羥基乙酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸、谷氨酸或天冬氨酸。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種制備6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物的方法，該方法以下述反應(yīng)路線表示
反應(yīng)路線(I) 其中R代表R代表C1-C4直鏈或支鏈烷氧基羰基、雜環(huán)基羰基，或者羧基烷基。
如上述反應(yīng)路線(I)所示，根據(jù)本發(fā)明制備6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物的方法包括下述步驟(i)使式II的4，6-二氯-2-(甲基硫代)嘧啶與式III的4-(4-嗎啉基)苯胺反應(yīng)，以生成式IV的2-甲基硫代-6-[4-(4-嗎啉基)苯胺基]-4-氯代嘧啶中間體；(ii)使步驟(i)中制得的式IV的中間體與式V的哌嗪反應(yīng)，以生成式VI的2-(甲基硫代)-6-[4-(4-嗎啉基)苯胺基]-4-(哌嗪-1-基)嘧啶中間體；以及(iii)使步驟(ii)中制得的式VI的中間體與適宜的鹵代化合物反應(yīng)以生成本發(fā)明的6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物。
在上述反應(yīng)路線(1)中所用的起始原料以及反應(yīng)物的4，6-二氯-2-(甲基硫代)嘧啶、4-(4-嗎啉基)苯胺、哌嗪和鹵代化合物等都可購(gòu)買(mǎi)得到。在步驟(iii)中所用的鹵代化合物是向目標(biāo)化合物中引入取代基的適宜反應(yīng)物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)所引入的取代基的不同來(lái)進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇。
更詳細(xì)地，上述制備方法中的步驟(i)和(ii)中，反應(yīng)在有機(jī)溶劑中在有機(jī)堿的存在下進(jìn)行，所述有機(jī)溶劑例如甲醇、乙醇、異丙醇、二氯甲烷、氯仿、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮等，所述有機(jī)堿例如三乙胺、N，N-二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉、1-甲基哌啶、吡啶、2，6-二甲基吡啶、4-二甲基氨基吡啶、N，N-二甲基苯胺等。在40-65℃的溫度范圍內(nèi)反應(yīng)12至45小時(shí)完成反應(yīng)。
更詳細(xì)地，上述制備方法中的步驟(iii)中，反應(yīng)在有機(jī)溶劑中在有機(jī)堿的存在下進(jìn)行，所述有機(jī)溶劑例如二氯甲烷、氯仿、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺等，所述有機(jī)堿例如三乙胺、N，N-二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉、1-甲基哌啶、吡啶、2，6-二甲基吡啶、4-二甲基氨基吡啶、N，N-二甲基苯胺等。根據(jù)所用鹵代化合物的種類(lèi)以及活性的不同，可在0-10℃的溫度范圍內(nèi)反應(yīng)1小時(shí)完成上述反應(yīng)步驟，或者在40-80℃的溫度范圍內(nèi)反應(yīng)12小時(shí)完成反應(yīng)。
本發(fā)明還提供了用于治療和預(yù)防丙型肝炎的藥物組合物，其包含作為活性成分的以式I所表示的6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物和/或其藥學(xué)可接受鹽。
采用化學(xué)式I的化合物作為丙型肝炎治療劑時(shí)，其可通過(guò)口服或者臨床所用的其它路徑進(jìn)行給藥，且可用作普通藥物的形式。在需要制備時(shí)，可采用常規(guī)使用的稀釋劑，包括填充劑、輔助劑(builder)、粘結(jié)劑、潤(rùn)濕劑、崩解劑或表面活性劑，或者賦形劑。而且，可用于口服給藥的固體制劑包括片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑或膠囊劑。所述固體制劑包括一種以上的化學(xué)式I的化合物以及一種以上的賦形劑，所述賦形劑例如淀粉、碳酸鈣、蔗糖或乳糖，或者明膠。用于口服給藥的液體劑型可以為懸浮液、溶液、油性藥物或者糖漿，但也可使用單純的稀釋劑，例如水、液體石蠟，或者其它諸如潤(rùn)濕劑、增甜劑、香味劑、防腐劑等賦形劑。用于非口服給藥的液體制劑可以為無(wú)菌水溶液、非水性溶劑、懸浮液或者油性藥物。優(yōu)選使用的非水性溶劑和懸浮液為丙二醇、聚乙二醇、諸如橄欖油的植物油、以及諸如油酸乙酯的可注射酯類(lèi)。
可根據(jù)患者的性別、年齡、以及狀態(tài)等來(lái)控制化學(xué)式I的化合物的有效劑量。一般說(shuō)來(lái)，可按照10至1000mg/天、更優(yōu)選20至500mg/天的劑量對(duì)成人給藥，或者每天分成1至3次給藥。
優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)描述現(xiàn)在將通過(guò)下述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。但是，所述實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明而非對(duì)本發(fā)明作出限制。
制備12-甲基硫代-6-[4-(4-嗎啉基)苯胺基]-4-氯嘧啶的制備順次向80ml甲醇中加入4，6-二氯-2-(甲基硫代)嘧啶5.85g、4-(4-嗎啉基)苯胺5.35g、以及三甲胺5.1ml，然后在55-60℃加熱18小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至20℃，攪拌2小時(shí)，過(guò)濾，并用25ml的甲醇洗滌，得到結(jié)晶產(chǎn)物。將所得產(chǎn)物于30-40℃下進(jìn)行真空干燥，得到8.79g的所需化合物(收率87％)。
m.p.159-161℃1H-NMR(CDCl3)，ppmδ2.51(s，3H)，3.15(t，4H)，3.86(t，4H)，6.19(d，1H)，6.76(s，1H)，6.91(d，2H)，7.16(d，2H)制備22-甲基硫代-6-4-[(4-嗎啉基)苯胺基]-4-(哌嗪-1-基)嘧啶的制備順次向80ml甲醇中加入制備例1中制備的2-甲基硫代-6-[4-(4-嗎啉基)苯胺基]-4-氯嘧啶5.6g、無(wú)水哌嗪14.3g，以及三甲胺2.6ml，然后在55-60℃加熱40小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至20℃，攪拌2小時(shí)，過(guò)濾，并用25ml的甲醇洗滌，得到結(jié)晶產(chǎn)物。將所得產(chǎn)物于30-40℃真空干燥，得到6.17g的所需化合物(收率96％)。
m.p.232-234℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ2.39(d，3H)，2.70(brs，4H)，3.02(brs，4H)，3.35(brs，4H)，3.70(m，4H)，5.53(s，1H)，6.87(d，2H)，7.34(d，2H)，8.78(s，1H)實(shí)施例12-甲基硫代-6-[4-(4-嗎啉基)苯胺基]-4-[4-(異丙氧基羰基)哌嗪-1-基]嘧啶的制備順次向40ml二氯甲烷中加入2-甲基硫代-6-4-(4-嗎啉基)苯胺基]-4-(4-哌嗪-1-基)嘧啶1g和三甲胺0.4ml，攪拌10分鐘充分溶解，然后冷卻到0℃。在0-5℃下緩慢加入2.85ml的氯甲酸異丙基酯(1.0M的甲苯溶液)，然后在0-5℃下攪拌反應(yīng)混合物20分鐘。加入40ml水，然后在20℃下攪拌10分鐘。分離有機(jī)層并用40ml的水洗滌一次，減壓濃縮。殘余物用30ml乙醚結(jié)晶，室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后過(guò)濾得到產(chǎn)物。用5ml乙醚洗滌所得產(chǎn)物，然后在30-40℃下進(jìn)行真空干燥，得到1.05g的所需化合物(收率86％)。
m.p.155-157℃1H-NMR(CDCl3)，ppmδ1.23(d，6H)，2.48(s，3H)，3.15(brs，4H)，3.50(brs，8H)，3.85(t，4H)，4.93(m，1H)，5.41(s，1H)，6.42(s，1H)，6.90(d，2H)，7.15(d，2H)實(shí)施例22-甲基硫代-6-4-[(4-嗎啉基)苯胺基]-4-[4-[(3-吡啶基)羰基]哌嗪-1-基]嘧啶的制備順次向40ml二氯甲烷中加入2-甲基硫代-6-[4-(4-嗎啉基)苯胺基]-4-(哌嗪-1-基)嘧啶1g和三甲胺0.4ml，攪拌10分鐘充分溶解，然后冷卻到0℃。在0-5℃下緩慢加入0.48g的鹽酸煙酰氯，然后在0-5℃下攪拌反應(yīng)混合物30分鐘。加入40ml水，然后在20℃下攪拌10分鐘。分離有機(jī)層并用40ml的水進(jìn)行洗滌一次，減壓濃縮。殘余物用4ml的二氯甲烷助溶劑和40ml乙醚結(jié)晶，室溫下攪拌2小時(shí)，然后過(guò)濾得到固態(tài)產(chǎn)物。將所得產(chǎn)物用5ml的乙醚洗滌然后在30-40℃下進(jìn)行真空干燥，得到1.13g的所需化合物(收率89％)。
m.p.131-133℃1H-NMR(CDCl3)，ppmδ2.47(d，3H)，3.15(brs，4H)，3.49(m，6H)，3.86(m，6H)，5.43(s，1H)，6.89(d，2H)，7.15(d，2H)，7.35(t，1H)，7.75(dd，1H)，8.67(d，2H)實(shí)施例32-甲基硫代-6-[4-(4-嗎啉基)苯胺基]-4-[4-[(4-吡啶基)羰基]哌嗪-1-基]嘧啶的制備采用與上述實(shí)施例2相同的方法制備所需的化合物，但采用鹽酸異煙酰氯來(lái)代替鹽酸煙酰氯。
收率93％m.p.155-156℃H-NMR(CDCl3)，ppmδ2.47(d，3H)，3.15(brs，4H)，3.41(brs，2H)，3.57(brs，4H)，3.85(m，6H)，5.42(s，1H)，6.50(s，1H)，6.91(brs，2H)，7.15(brs，2H)，7.28(m，2H)，8.70(d，2H)實(shí)施例42-甲基硫代-6-[4-(4-嗎啉基)苯胺基]-4-[4-(羧甲基)哌嗪-1-基]嘧啶的制備步驟12-甲基硫代-6-[4-(4-嗎啉基)苯胺基]-4-[4-(乙氧基羰甲基)哌嗪-1-基]嘧啶的制備順次向50ml乙腈中加入制備2中制備的2-甲基硫代-6-[4-(4-嗎啉基)苯胺基]-4-(哌嗪-1-基)嘧啶3g、氯代乙酸乙基酯0.9ml以及三甲胺1.3ml，并加熱。將反應(yīng)混合物在70-80℃下攪拌7小時(shí)。然后使反應(yīng)混合物緩慢冷卻到20℃，加入30ml的甲醇，攪拌1小時(shí)，過(guò)濾得到固態(tài)產(chǎn)物。用15ml甲醇洗滌所得產(chǎn)物，在35-45℃下真空干燥，得到3.41g的所需化合物(收率93％)。
m.p.88-90℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ1.16(m，3H)，2.39(d，3H)，3.02(brs，4H)，3.15(m，2H)，3.35(d，4H)，3.44(brs，4H)，3.70(d，4H)，4.04(m，2H)，5.56(d，1H)，6.87(m，2H)，7.34(d，1H)，7.37(d，1H)，8.82(s，1H)步驟22-甲基硫代-6-[4-(4-嗎啉基)苯胺基]-4-[4-(羧甲基)哌嗪-1-基]嘧啶的制備順次向30ml甲醇中加入在步驟1中制備的2-甲基硫代-6-[4-(4-嗎啉基)苯胺基]-4-[4-(乙氧羰甲基)哌嗪-1-基]嘧啶2.5g、水25ml、濃度為3N的氫氧化鈉水溶液5.3ml，并加熱。將反應(yīng)混合物在50-60℃下攪拌1小時(shí)。然后使反應(yīng)混合物緩慢冷卻，在10～20℃下加入濃度為3N的鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.0～7.0。攪拌混合物1小時(shí)，過(guò)濾得到固態(tài)產(chǎn)物。用20ml水洗滌所得產(chǎn)物，在40-50℃下真空干燥，得到2.24g的所需化合物(收率95％)。
m.p.156-158℃1H-NMR(DMSO-d6)，ppmδ2.39(d，3H)，2.62(brs，4H)，3.02(brs，4H)，3.20(s，2H)，3.47(brs，4H)，3.71(m，4H)，5.57(s，1H)，6.87(d，2H)，7.34(d，2H)，8.84(s，1H)試驗(yàn)例1對(duì)HCV RNA聚合酶(RNA依賴(lài)性RNA聚合酶，NS5B)活性的體外抑制作用的測(cè)試進(jìn)行下述的體外實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)本發(fā)明的化合物對(duì)HCV RNA依賴(lài)性RNA聚合酶活性的抑制作用。
重組HCV RNA聚合酶的構(gòu)建體采用下述方法制備HCV RNA聚合酶。
從HCV-1b型的HCV患者的血液中得到HCV cDNA，利用PCR對(duì)NS5B區(qū)域(1773堿基對(duì))進(jìn)行擴(kuò)增，并克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體VLHIS中，籍此制備重組轉(zhuǎn)移載體。將制得的轉(zhuǎn)移載體和野生型AcNPV載體共轉(zhuǎn)染至Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞系中，得到含有組氨酸標(biāo)記的重組載體pVLHIS-NS5B的重組桿狀病毒。使充分培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞感染上所得的重組桿狀病毒，并在含有10％FBS的Grace’s培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4天。離心培養(yǎng)物肉湯，只取被感染的細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞3次，然后用結(jié)合緩沖液[50mM磷酸鈉(pH 8.0)，30mM NaCl，1mM咪唑，1mM DTT，10％甘油，1％ NP-40]重懸浮細(xì)胞，超聲破碎，得到澄清化的裂解液。利用Ni-NTAHis結(jié)合樹(shù)脂(Novagen)通過(guò)親和柱層析來(lái)純化重組NS5B，制備純化的NS5B蛋白。(His)6-標(biāo)記的NS5B與Ni-NTA樹(shù)脂結(jié)合，用含有50mM咪唑的結(jié)合緩沖液進(jìn)行洗滌。采用步驟梯度(100-300mM)的方法利用含有咪唑的結(jié)合緩沖液來(lái)洗脫結(jié)合的NS5B。利用緩沖液[50mM Tris-HCl，50mMNaCl，1mM DTT，5mg MgCl2，10％甘油]來(lái)透析NS5B蛋白組分，然后于-70℃分成小的等分試樣。
含有HCV 3’端(3′-UTR)的RNA模板的構(gòu)建體采用下述方法來(lái)制備含有HCV 3’端(3′-UTR)的RNA模板。
利用PCR方法從丙型肝炎患者血液的1b HCV RNA中得到HCV的3′UTR cDNA(220bp)，并將其克隆至pcDNA3載體中。利用限制性酶EcoRI來(lái)制備含有3′-UTR的線性DNA片段，在采用T7 RNA聚合酶來(lái)制備含有3′-UTR的RNA片段的體外轉(zhuǎn)錄中，可采用上述制備的DNA片段作為模板。
檢測(cè)本發(fā)明的化合物在體外對(duì)重組HCV RNA聚合酶的抑制活性采用下述方法來(lái)檢測(cè)本發(fā)明的化合物對(duì)重組HCV RNA聚合酶的體外抑制活性。
制備適于待檢測(cè)的樣品的抗生蛋白鏈菌素包被的板。向每孔加入25μl的檢測(cè)緩沖液[50mM Tris-Cl(pH 7.5)，100mM NaCl，10mM MgCl2，20mM KCl，1mM EDTA，1mM DTT]、10μl純化HCV RNA聚合酶、以及200ng的聚合酶和3′-UTR模板RNA。然后，加入5μl的待檢測(cè)樣品，使終濃度分別為10、1、0.1和0.01μg/ml。最后，向每孔中加入10μl的反應(yīng)物溶液，該反應(yīng)物溶液含有DIG-(地高辛)-UTP、生物素-UTP、ATP、CTP、GTP，以及UTP，這些物質(zhì)作為與HCV 3′-UTR RNA的RNA模板進(jìn)行聚合酶反應(yīng)的核苷酸。將反應(yīng)混合物在22℃溫育60分鐘。在HCV聚合酶的作用下，復(fù)制了包括與生物素和DIG偶聯(lián)的UTP的新生成RNA，這些新的RNA能夠通過(guò)生物素偶聯(lián)的UTP與包被在孔上的抗生蛋白鏈菌素相結(jié)合。當(dāng)反應(yīng)完成后，將板用200μl的洗滌緩沖液(pH 7.0，Roche Co.)洗滌3次，以除去未結(jié)合的物質(zhì)和雜質(zhì)。然后，向每孔中加入100μl的抗-DIG-POD的二級(jí)抗體(過(guò)氧化物酶，Roche Co.)，并在37℃溫育1小時(shí)。然后，再次用洗滌緩沖液洗滌板孔。最后，向每孔中加入100μl的ABTSR(Roche Co.)作為POD底物，并反應(yīng)15至30分鐘。利用ELISA讀數(shù)器(Bio-Tek instrument Co.)在405nm來(lái)測(cè)量光密度(OD)。對(duì)HCV聚合酶活性的抑制作用通過(guò)減去沒(méi)有樣品的陽(yáng)性對(duì)照的OD值來(lái)進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果如下述表1所示。
表1

由上表可以看出，本發(fā)明化合物對(duì)HCV RNA聚合酶的活性具有很強(qiáng)的抑制作用，由于該酶在HCV的復(fù)制中起到重要的作用，因此利用本發(fā)明化合物的這一特性可抑制HCV的復(fù)制。優(yōu)選地，本發(fā)明的化合物能用作丙型肝炎的治療劑或者預(yù)防劑。
試驗(yàn)例2細(xì)胞毒性檢測(cè)利用Hep G2細(xì)胞采用MTT方法檢測(cè)式I化合物的細(xì)胞毒性，其中MTT是一種公知的細(xì)胞毒性的體外檢測(cè)方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)中所用的所有化合物的CC50都大于100μg/ml，這顯示這些化合物很安全，毒性極低。
工業(yè)實(shí)用性如上所述，以式I表示的本發(fā)明的新的6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物對(duì)丙型肝炎病毒的復(fù)制具有很強(qiáng)的抑制作用，且毒性很低。因此，可有利地將其用作丙型肝炎的治療劑或者預(yù)防劑。
權(quán)利要求
1. 6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，由下式I表示 其中，R代表C1-C4直鏈或支鏈烷氧基羰基、雜環(huán)基羰基，或者羧基烷基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中R選自異丙氧基羰基、(3-吡啶基)羰基、(4-吡啶基)羰基或羧甲基。
3.一種制備6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物的方法，包括下述步驟(i)使式II的4，6-二氯-2-(甲基硫代)嘧啶與式III的4-(4-嗎啉基)苯胺反應(yīng)，生成式IV的2-甲基硫代-6-[4-(4-嗎啉基)苯胺基]-4-氯代嘧啶中間體；(ii)使式IV的中間體與式V的哌嗪反應(yīng)，生成式VI的2-(甲基硫代)-6-[4-(4-嗎啉基)苯胺基]-4-(哌嗪-1-基)嘧啶中間體；以及(iii)使式VI的中間體與適宜的鹵代化合物反應(yīng)以生成6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物 其中，R代表C1-C4直鏈或支鏈烷氧基羰基、雜環(huán)基羰基，或者羧基烷基。
4.用于治療和預(yù)防丙型肝炎的藥物組合物，包括作為活性成分的權(quán)利要求1所述的6-(4-取代-苯胺基)嘧啶衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及用作抗病毒劑的6－(4－取代－苯胺基)嘧啶衍生物，更具體地涉及一種由下式(I)表示的新的6－(4－取代－苯胺基)嘧啶衍生物或其藥學(xué)可接受鹽，其對(duì)丙型肝炎病毒(HCV)的復(fù)制具有極強(qiáng)的抑制作用，其中，R代表C
文檔編號(hào)C07D413/14GK1642950SQ03806667
公開(kāi)日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2003年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月4日
發(fā)明者金鐘宇, 李常旭, 李根炯, 韓在辰, 樸相珍, 樸乙鏞, 慎重哲 申請(qǐng)人:B&C生物制藥株式會(huì)社