專利名稱：某些作為絲氨酸蛋白酶xa因子抑制劑的1－(d－環(huán)丙基甘氨酰基)－4－(哌啶－4－基)哌 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用作藥物的化合物，包含該化合物的藥物組合物，制備該化合物的方法，用于制備該化合物的中間體，以及該化合物作為藥物的用途。
心血管疾病一直是目前一種主要的世界范圍的健康問題，并且是重病和死亡的很常見的原因。
研究人員在尋找新的心血管疾病治療中所追尋的一條研究路線是假設(shè)絲氨酸蛋白酶，即XA因子的抑制劑可以用作治療血栓形成疾病的抗凝劑。
XA因子的抑制劑是已知的。例如，WO 01/96323公開了某些包含芳基、帶有環(huán)基的甘氨酸殘基和4-取代哌嗪基的化合物。所述環(huán)基可以是環(huán)烷基，比如環(huán)戊基或環(huán)己基，但是已表明優(yōu)選其中環(huán)基是苯基的化合物。
令人驚奇的是，現(xiàn)在，通過在WO 01/96323的范圍內(nèi)進(jìn)行選擇，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)4-甲氧苯基或3-氟-4-甲氧苯基作為芳基，環(huán)丙基甘氨?；鶊F(tuán)作為甘氨酸殘基，并且1-甲基哌啶-4-基哌嗪基作為4-取代哌嗪基時，可以得到一類化合物，它們是選擇性的XA因子抑制劑，且具有特別有益的性能。
因此，本發(fā)明提供式(I)的化合物
其中R表示氫原子或氟原子，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
式(I)的化合物已經(jīng)被認(rèn)為是絲氨酸蛋白酶，XA因子的有效的和選擇性的抑制劑，在人血漿中具有優(yōu)良的抗凝活性，在哺乳動物口服時具有優(yōu)良的血漿曝量(exposure)，并且具有特別有益的藥理學(xué)和毒理學(xué)活性分布。
式(I)的化合物也可以用化學(xué)名稱表示1-(4-甲氧基苯甲?；?D-環(huán)丙基-甘氨?；?-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪和1-(3-氟-4-甲氧基苯甲?；?D-環(huán)丙基-甘氨?；?-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪。
應(yīng)當(dāng)理解，式(I)化合物包含具有(D)構(gòu)型的不對稱中心。因此，該化合物可以以含有相應(yīng)的(L)異構(gòu)體的混合物形式，比如外消旋混合物的形式存在并被分離，或可以獨(dú)立存在。優(yōu)選，該化合物被分離得基本上不含(L)異構(gòu)體。
還應(yīng)理解，式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽可以以溶劑化物的形式分離，因此任何這種溶劑化物都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
藥學(xué)上可接受的鹽的實例包括鹽酸鹽、富馬酸鹽和馬來酸酸加成鹽。
應(yīng)當(dāng)理解，式(I)化合物包含有兩個堿性氮原子，因此可以形成單和二酸加成鹽。
一組式(I)的化合物是其中R是氫原子的化合物。
其中R表示氫原子的特定的化合物是1-(4-甲氧基苯甲?；?D-環(huán)丙基甘氨?；?-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪和其鹽酸鹽、富馬酸鹽和馬來酸酸加成鹽，特別是二鹽酸鹽、二富馬酸鹽和二馬來酸酸加成鹽。
已經(jīng)制備出結(jié)晶的二鹽酸鹽、二富馬酸鹽和二馬來酸酸加成鹽，并用差示掃描量熱計(DSC)對其進(jìn)行了表征二鹽酸鹽熔融之前分解；二富馬酸鹽222.8℃(開始)，225.4℃(峰值)；和二馬來酸鹽195.8℃(開始)，202.0℃(峰值)。
特別要提及結(jié)晶形態(tài)的1-(4-甲氧基苯甲酰基-D-環(huán)丙基甘氨?；?-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪二富馬酸鹽。
另一組式(I)的化合物是其中R是氟原子的化合物。
其中R表示氟原子的特定的化合物是1-(3-氟-4-甲氧基苯甲酰基-D-環(huán)丙基甘氨?；?-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪；和鹽酸酸加成鹽。
式(I)化合物和其藥學(xué)上可接受的鹽可以通過包括以下步驟的方法制備(a)使式(II)化合物 或其鹽(比如三鹽酸鹽)與式(III)化合物 或其活性衍生物反應(yīng)；或(b)使式(IV)化合物 或其鹽(比如二氫溴酸鹽)與式(V)化合物 或其活性衍生物反應(yīng)；之后，如果希望其藥學(xué)上可接受的鹽的話，形成藥學(xué)上可接受的鹽。
式(II)化合物與式(III)化合物之間的反應(yīng)可以很方便地使用通常用于形成酰胺鍵的試劑和反應(yīng)條件進(jìn)行。反應(yīng)很方便地在諸如1-羥基苯并三唑或1-羥基-7-氮雜苯并三唑的基于苯并三唑的試劑和諸如二環(huán)己基碳二亞胺或1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺的脫水劑存在下，在惰性有機(jī)溶劑，比如二甲基甲酰胺和/或二氯甲烷中進(jìn)行。反應(yīng)溫度通常是0-50℃，優(yōu)選室溫。如果使用式(II)化合物的鹽，則反應(yīng)通常在額外存在堿，比如三乙胺的條件下進(jìn)行。其他適當(dāng)?shù)脑噭┖腿軇┰诒绢I(lǐng)域中是已知的，例如酰鹵，比如對甲氧苯甲酰氯，在堿，比如三乙胺的存在下。
式(IV)化合物與式(V)化合物之間的反應(yīng)可以很方便地使用通常用于形成酰胺鍵的試劑和反應(yīng)條件進(jìn)行，例如上述用于式(II)化合物與式(III)化合物反應(yīng)的試劑與反應(yīng)條件。
式(II)化合物可以通過使式(IV)化合物與式(VI)化合物 反應(yīng)，其中R1表示氨基保護(hù)基，比如叔丁氧基羰基(Boc)，以得到式(VII)化合物， 隨后除去保護(hù)基來制備。
式(IV)化合物是已知的，還可稱作1-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪。
式(V)化合物可以通過使式(VIII)化合物， 其中R2表示羧基保護(hù)基，例如(1-6C)烷基，比如甲基或乙基，與式(III)化合物反應(yīng)，以得到式(IX)化合物， 隨后除去保護(hù)基來制備。
式(VI)和(VIII)化合物是已知的或者可以使用通用的用于保護(hù)氨基酸中羧基或氨基的方法由(D)-環(huán)丙基甘氨酸制備。(D)-環(huán)丙基甘氨酸可以很方便地使用(R)-(+)-α-甲基芐胺通過美國專利6,090,982中所述的方法，或者通過使用其中引用的方法由環(huán)丙烷甲醛制備。
式(III)化合物是眾所周知的。
氨基和羧基的保護(hù)參見McOmie的著作，Protecting Groups inOrganic Chemistry，Plenum Press，NY，1973，和Greene與Wuts的著作，Protecting Groups in Organic Synthesis，第二版，John Wiley& Sons，NY，1991。羧基保護(hù)基的實例包括C1-C6烷基如甲基，乙基，叔丁基和叔戊基；芳基(C1-C4)烷基如芐基，4-硝基芐基，4-甲氧基芐基，3，4-二甲氧基芐基，2，4-二甲氧基芐基，2，4，6-三甲氧基芐基，2，4，6-三甲基芐基，二苯甲基和三苯甲基；甲硅烷基如三甲基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基以及烯丙基如烯丙基和1-(三甲基甲硅烷基甲基)丙-1-烯-3-基。
胺保護(hù)基的實例包括酰基，如式R3CO的基團(tuán)，其中R3表示C1-6烷氧基，苯基C1-6烷氧基，或C3-10環(huán)烷氧基，其中苯基可以任選被，例如一個或兩個鹵素、C1-C4烷基和C1-C4烷氧基取代。
優(yōu)選的氨基保護(hù)基包括芐氧基羰基(CBz)和叔丁氧基羰基(Boc)。
本發(fā)明中描述的某些中間體，例如式(II)和(V)的化合物被認(rèn)為是新的，因此提供作為本發(fā)明的另一方面。
本發(fā)明的化合物可以經(jīng)過任何合理而可行的途徑給藥，例如施用到胃腸道(如直腸或口腔)、鼻腔、肺、肌肉或血管中或通過經(jīng)皮給予。本發(fā)明化合物可以以任何常用的給藥形式，如片劑、粉末劑、膠囊劑、溶液劑、分散劑、混懸劑、糖漿劑、噴霧劑、栓劑、凝膠劑、乳劑、貼劑等形式給予。這些組合物可含有藥物制劑中常用的組分，如稀釋劑、載體、pH調(diào)節(jié)劑、甜味劑、添充劑和其它活性劑。如果希望腸胃外給藥的話，組合物應(yīng)當(dāng)是無菌的并且為適于注射或輸注的溶液劑或混懸劑形式。這樣的組合物形成本發(fā)明的另一方面。
從這一方面考慮，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供用于治療的式(I)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于治療血栓形成病癥的藥物方面的用途。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了在需要治療的對象中治療血栓形成病癥的方法，其包括施用有效量的式(I)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
所述對象可以是人或非人動物，如非人哺乳動物，例如貓、狗、馬、乳?；蜓?。
血栓形成病癥可以是，例如，靜脈血栓形成，肺栓塞，動脈血栓形成，心肌缺血，心肌梗死或腦血栓形成。根據(jù)本發(fā)明的方法，本發(fā)明化合物也可以用于治療與溶血栓療法和再狹窄有關(guān)的急性脈管閉合，例如在經(jīng)腔冠狀血管成形術(shù)或冠狀或周圍動脈旁路移植手術(shù)之后的急性脈管閉合，和在長期血液透析患者中維持脈管通路開放。
式(I)化合物的劑量將取決于待治療病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、給藥途徑和對象的大小及種類。一般說來，給藥量應(yīng)當(dāng)在每公斤體重0.01到100μM范圍內(nèi)。
這里使用的術(shù)語″治療″包括預(yù)防。術(shù)語″有效量″是指有效減輕或抑制受治療的血栓形成病癥癥狀的發(fā)展的式(I)化合物的量。
本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)給藥或與具有不同作用方式的抗凝劑或與溶解血栓劑聯(lián)合使用。
以下實施例舉例說明本發(fā)明。
使用的縮寫遵照IUPAC-IUB命名規(guī)則。在全文中使用以下縮寫B(tài)oc(叔丁氧基羰基)，Calcd(計算的)，DMSO(二甲亞砜，如果用于NMR的話指全氘代的)，EDCI(1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)，ES-MS(電子噴霧離子化質(zhì)譜)，HOBt(1-羥基苯并三唑)，HPLC(高效液相色譜，tr為保留時間)，MeOH(甲醇)，NMR(核磁共振)，TFA(三氟乙酸)。
實施例11-(4-甲氧基苯甲?；?D-環(huán)丙基甘氨?；?-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪A.D-環(huán)丙基甘氨酸通過使用(R)-(+)-α-甲基芐胺和US 6,090,982的方法，或通過使用其中引用的方法可以很方便地由環(huán)丙烷甲醛得到該氨基酸。
B.Boc-D-環(huán)丙基甘氨酸將D-環(huán)丙基甘氨酸(46.1克，0.4摩爾)在二噁烷(600毫升)、水(300毫升)及1N NaOH(480毫升，0.48摩爾)的混合物中形成的溶液在冰浴中攪拌冷卻到0-5℃。慢慢地加入二碳酸二叔丁酯(105克，0.48摩爾)，繼續(xù)在室溫下攪拌0.5小時。將溶液真空濃縮到約500毫升，在冰水浴中冷卻，用一層乙酸乙酯(500毫升)覆蓋，然后用稀的KHSO4水溶液酸化到pH值為2-3。水相用乙酸乙酯(500毫升)萃取，反復(fù)進(jìn)行萃取直到不殘余有產(chǎn)物。將乙酸乙酯萃取物合并，用水(0.5升)、鹽水(0.5升)洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并濃縮，得到白色固體(78克，90.6％)。D20＝-31°(c＝1.02，MeOH)。
1HNMR(CDCl3)δ5.9(sb，1H)，5.09(sb，1H)，3.75(m，1H)，1.42(s，9H)，1.10(d，1H)，0.4-0.7(m，4H)。
C.1-(Boc-D-環(huán)丙基甘氨?；?-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪將Boc-D-環(huán)丙基甘氨酸(216克，1.0摩爾)和1-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪(192克，1.05摩爾)在N2下，在無水CH2Cl2中成漿。然后把混合物在冰浴中冷卻到0-5℃。向該混合物中加入1-羥基苯并三唑(HOBt)一水合物(149克，1.1摩爾)和二異丙基乙胺(136克，1.05摩爾)，隨后緩慢加入1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)(211克，1.1摩爾)，在0-5℃下保持1小時。允許反應(yīng)混合物升溫至室溫，反應(yīng)過夜。然后通過加入飽和NaHCO3水溶液(3升)來中止反應(yīng)，用二氯甲烷(2升)萃取。分離各層。有機(jī)層再次用飽和NaHCO3(3升)、鹽水(2升)洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，過濾并濃縮，得到粗產(chǎn)物，為粘性油狀物(415克，109％)，直接使用。
1HNMR(DMSO-d6)δ6.91(d，1H)，3.97(t，1H)，3.41(sb，4H)，2.74(d，2H)，2.40(sb，4H)，2.10(m，1H)，2.09(s，3H)，1.79(t，2H)，1.65(d，2H)，1.40(m，2H)，1.36(s，9H)，1.05(m，1H)，0.93(d，1H)，0.40(m，2H)，0.26(m，1H)。
D.1-(D-環(huán)丙基甘氨酰基)-4-(1-甲基哌啶-4-基)-哌嗪三鹽酸鹽將1-(Boc-D-環(huán)丙基甘氨?；?-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪(粗品，415克，1.0摩爾)溶于無水甲醇(1.5升)中，在0℃下，向該溶液中加入HCl-MeOH(380克/1.5升，10.4摩爾)溶液。將反應(yīng)混合物攪拌并慢慢升溫到室溫，反應(yīng)2小時。然后在攪拌下加入乙酸乙酯(2升)。繼續(xù)在0-5℃攪拌1小時，沉淀析出產(chǎn)物，為白色粉末，經(jīng)過濾和在45℃進(jìn)行真空干燥，得到標(biāo)題化合物，為白色固體(357克，91.7％)。
1HNMR(DMSO-d6+D2O)δ8.4(bs，1H)，4.5(bs，2H)，3.0(t，4H)，2.78(m，1H)，2.74(s，3H)，2.35(m，2H)，2.20(m，1H)，2.08(m，2H)，1.06(bd，1H)，0.60(m，4H)。
E.1-(4-甲氧基苯甲酰基-D-環(huán)丙基甘氨?；?-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪將1-(D-環(huán)丙基甘氨酰基)-4-(1-甲基哌啶-4-基)-哌嗪三鹽酸鹽(300克，0.77摩爾)在N2下，在無水CH2Cl2中成漿。然后把混合物在冰浴中冷卻到0-5℃。慢慢加入三乙胺(450毫升，3.23摩爾)，同時將溫度保持在0-5℃，隨后緩慢加入對甲氧苯甲酰氯(142克，0.83摩爾)，再次將溫度保持在0-5℃。允許反應(yīng)混合物升溫至室溫，反應(yīng)2小時。然后通過加入飽和NaHCO3(1升)來中止反應(yīng)，并分離各層。然后，用CH2Cl2(2升)萃取水層。合并有機(jī)層，用鹽水(1升)洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，過濾并濃縮，得到標(biāo)題化合物(326克，102％)。
1HNMR(DMSO-d6)δ8.55(d，J＝7.7Hz，1H)，7.88(d，2H)，6.96(d，2H)，4.39(t，1H)，3.79(s，3H)，3.45(s，4H)，2.74(d，2H)，2.40(m，4H)，2.09(s，3H)，2.08(m，1H)，1.79(dt，2H)，1.62(d，2H)，1.38(m，2H)，1.26(m，1H)，0.43(m，2H)，0.35(m，2H)。
實施例1a1-(4-甲氧基苯甲?；?D-環(huán)丙基甘氨?；?-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪二富馬酸鹽向升溫到65℃的1-(4-甲氧基苯甲?；?D-環(huán)丙基甘氨酰基)-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪(315克，0.76摩爾)的95％乙醇(4.2升)溶液中加入富馬酸(177克，1.52摩爾)的熱乙醇(65℃，2.8升)溶液。將最終的澄清溶液在65℃攪拌并慢慢冷卻到室溫(在2小時內(nèi))，然后冷卻到0-5℃。通過過濾收集白色晶體，用95％的乙醇(1升)洗滌，45℃下真空干燥，得到標(biāo)題鹽(448克，91.2％)，mp＝205-207℃。
1HNMR(DMSO-d6)δ11.35(s，1H)，8.58(d，1H)，7.86(d，2H)，6.96(d，2H)，6.55(s，4H)，4.39(t，1H)，3.79(s，3H)，3.45(s，4H)，3.20(d，2H)，2.62(t，2H)，2.55(s，3H)，2.42(m，6H)，1.80(d，2H)，1.62(d，2H)，1.28(m，1H)，0.43(m，2H)，0.35(m，2H)。D20＝-37.7°(c＝0.836，H2O)實施例1b1-(4-甲氧基苯甲?；?D-環(huán)丙基甘氨?；?-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪鹽酸鹽將1-(4-甲氧基苯甲?；?D-環(huán)丙基甘氨酰基)-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪(3.04克，6.73毫摩爾)溶于大約0.2M的HCl(37毫升)中，冷凍干燥，得到2.98克(定量)標(biāo)題化合物。
部分1HNMR譜(DMSO-d6)δ10.63(br，1H)，8.59(br，1H)，7.88(d，2H)，6.98(d，2H)，436(brt，1H)，3.82(s，3H)，2.70(s，3H)，1.29(m，1H)，0.48(m，2H)，0.36(m，2H)。
ES-MS，m/z 415.5(M+1)+.
C23H34N4O3·1.25HCl·1.0H2O的分析
計算值C57.78；H7.85；N11.72；Cl9.30；實測值C57.79；H7.93；N11.74；Cl9.64。
分析HPLC(Xterra RP18，4.6×150cm，10％的乙腈/水(0.1％TFA)到50％的乙腈/水(0.1％TFA)，整個過程持續(xù)40分鐘)，1mL/min99％，tr＝10.66分鐘。
實施例21-[(3-氟-4-甲氧基苯甲?；?-D-環(huán)丙基甘氨?；鵠-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪向攪拌的1-D-環(huán)丙基甘氨?；?4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪三鹽酸鹽(1.5克，3.85毫摩爾)的二氯甲烷(30毫升)懸浮液中加入三乙胺(1.36克，13.5毫摩爾)，隨后加入3-氟-4-甲氧基苯甲酸(0.622克，3.66毫摩爾)、HOBt(0.573克，4.24毫摩爾)和EDCI(0.813克，4.24毫摩爾)。攪拌過夜之后，使混合物在二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉水溶液之間分配。然后對有機(jī)相再次先用飽和碳酸氫鈉水溶液，隨后用鹽水洗滌，之后經(jīng)MgSO4干燥，過濾并真空濃縮。此后，把殘余物溶于二氯甲烷中，通過硅膠色譜純化，用處于二氯甲烷中的0-12％的2N氨/甲醇梯度洗脫。合并含有純產(chǎn)物的級分，真空濃縮得到1.03克(61％)標(biāo)題化合物。
ES-MS，m/z433.5(M+1)+分析HPLC(Vydac C18，4.6×150cm，10％的乙腈/水(0.1％TFA)到50％的乙腈/水(0.1％TFA)，整個過程持續(xù)40分鐘)，1mL/min95％，tr＝13.16分鐘實施例2a1-[(3-氟-4-甲氧基苯甲酰基)-D-環(huán)丙基甘氨?；鵠-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪鹽酸鹽將1-[(3-氟-4-甲氧基苯甲?；?-D-環(huán)丙基甘氨?；鵠-4-(1-甲基哌啶-4-基]哌嗪(1克，2.31毫摩爾)溶于大約0.2M的HCl(12.7毫升)中，冷凍干燥，得到1.03克(定量)標(biāo)題化合物。
部分1HNMR譜(DMSO-d6)δ10.36(br，1H)，8.73(d，1H)，7.75-7.83(m，2H)，7.25(t，1H)，4.36(t，1H)，3.90(s，3H)，2.70(s，3H)，1.28(m，1H)，0.48(m，2H)，0.36(m，2H)。
ES-MS，m/z 433.3(M+1)+。
C23H33FN4O3-1.6HCl-0.5H2O的分析計算值C55.26；H7.18；N11.21；F3.80；Cl11.35；實測值C55.31；H7.24；N11.38；F3.64；Cl11.36。
分析HPLC(Xterra RP18，4.6×150cm，10％的乙腈/水(0.1％TFA)到50％的乙腈/水(0.1％TFA)，整個過程持續(xù)40分鐘)，1mL/min98％，tr＝8.067分鐘。
酶抑制試驗可采用以下一或多種酶抑制試驗法或者本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它標(biāo)準(zhǔn)試驗法，測定試驗化合物抑制Xa因子的能力。
酶抑制試驗人Xa因子和人凝血酶購自Enzyme Research Laboratories(South Bend，Indiana，USA)。其它蛋白酶從其它商業(yè)渠道獲得。顯色的對硝基苯胺肽蛋白酶底物購自Midwest Biotech(Fishers，Indiana，USA)。
按先前文獻(xiàn)說明a、b、c、d，根據(jù)從蛋白酶抑制動力學(xué)中得到的表觀締合常數(shù)(Kass)，測定人Xa因子的結(jié)合親和力。采用在96孔微量滴定板上自動(BioMek-1000)抑制劑稀釋系統(tǒng)獲得該表觀Kass值(分別在4-8個抑制劑濃度下，一式三份進(jìn)行Kass測定)，采用分子儀(Molecular Devices)(San Francisco)的Thermomax平板讀數(shù)器，在405nm處測定顯色底物水解速率。對于Xa因子抑制作用，試驗方案如下在2分鐘內(nèi)，加入50μl緩沖液(0.06M tris、0.3M NaCl，pH7.4)；25μl抑制劑試驗溶液(MeOH溶液)；25μl人Xa因子(32nM在0.03M tris、0.15M NaCl，1mg/ml HSA中)；最后150μlBzIleGluGlyArgpNA(0.3mM水溶液)，開始水解。終Xa因子濃度為3.2nM。對于各抑制劑濃度和計算的各抑制劑濃度下的表觀Kass，通過應(yīng)用SoftmaxPro軟件，在同一滴定板上，由線性標(biāo)準(zhǔn)曲線測定游離[Xa]和結(jié)合[Xa]，所述表觀Kass是由使對照(3.2nM Xa因子)產(chǎn)生20％-80％之間水解抑制作用的各抑制劑濃度計算的表觀Kass＝[E:I]/[Ef][If]＝[Eb]/[Ef][I°-Ib]。這樣得到的表觀Kass值大約是各抑制劑的Ki的倒數(shù)[1/appKass＝app Ki]。單個底物濃度下測定的平均表觀Kass值變異度為+/-15％。試驗系統(tǒng)Km測得為0.347+/-0.031mM[n＝4]；Vmax為13.11+/-0.76μl/min。
采用相同方案，用以下酶和底物濃度，測定凝血酶和其它蛋白酶的Kass值帶有0.2mM BzPheValArgpNA的5.9nM凝血酶；帶有0.4mM pyroGluProArgpNA的1.2nM XIa；帶有0.2mM HDProPheArgpNA的10nM XIIa；帶有0.5mM HDValLeuLyspNA的3.4nM血纖蛋白溶酶；帶有0.8mM HDIleProArgpNA的1.2nM nt-PA；和帶有0.4mMpyroGluGlyArgpNA的0.4nM尿激酶；帶有0.174mMpyroGluProArgpNA的3nM aPC；帶有D-ProPheArgpNA的1.9nM血漿激肽釋放酶；帶有0.18mM BzPheValArgpNA的1.4nM牛胰蛋白酶。
參考文獻(xiàn)(a)Sall DJ，JA Bastian，SL Briggs，JA Buben，NY Chirgadze，DK Clawson，ML Denny，DD Giera，DS Gifford-Moore，RW Harper，KL Hauser，VJ Klimkowski，TJ Kohn，H-S Lin，JR McCowan，ADPalkowitz，GF Smith，ME Richett，K Takeuchi，KJ Thrasher，JMTinsley，BG Utterback，S-CB Yan，M Zhang.作為一類新的直接作用于活性部位的凝血酶抑制劑的二元苯并[b]噻吩衍生物.1.絲氨酸蛋白酶選擇性的測定，構(gòu)效關(guān)系和結(jié)合定向性.J Med Chem 403489-3493(1997)。
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已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這里示例的式(I)化合物在酶抑制試驗中顯示出約14×106到35×106L/mol的Kass值。
試驗化合物延長部分凝血致活酶時間(凝血酶原時間)的能力可通過以下試驗方案測定。
部分凝血致活酶時間(凝血酶原時間)試驗方案將靜脈血以1體積抗凝血劑比9體積血液的量，收集到裝有3.2％(0.109m)檸檬酸三鈉的真空管中。通過以700g離心10分鐘來分離血細(xì)胞，得到血漿，在-70℃下冷凍備用。
為進(jìn)行該試驗，將100μl血漿用吸管吸至一玻璃試管中，加入1μl試驗化合物的DMSO溶液，用2分鐘溫?zé)嶂?7℃。加入100μl溫?zé)?37℃)Manchester(組織凝血致活酶)試劑(Helena Biosciences，UK)，平衡2分鐘。加入100μl溫?zé)?37℃)的25mM氯化鈣溶液，開始凝血。每5秒鐘，將該試管通過90°角翻轉(zhuǎn)3次以將所述試劑混合，記錄血凝塊形成的時間。通過SAS統(tǒng)計分析程序分析一系列觀測值和試驗化合物濃度的數(shù)據(jù)，導(dǎo)出每種化合物的CT2(使血凝固時間加倍所需要的濃度)。
發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物能明顯延長部分凝血致活酶時間(凝血酶原時間)。
另一凝血酶原時間和APTT方案凝聚測定。用STA儀器(Stago)，在人體血漿中測定凝血酶原時間和APTT值。BioPT是由人組織因子(Innovin)啟動的一種特別的非血漿凝結(jié)試驗。通過比較在30mg/ml人血清白蛋白(HAS)和1mg/ml磷脂酰膽堿(PC)存在或不存在時該BioPT的影響，測定與血清白蛋白或質(zhì)脂的可能結(jié)合。將抑制劑在50％MeOH水溶液載體中轉(zhuǎn)送。
APTT試驗75μl血漿Citrol Baxter-Dade含檸檬酸鹽的正常人血漿25μl試驗溶液75μl肌動蛋白Baxter-Dade活化的頭肌動蛋白 于37℃培養(yǎng)2分鐘。
75μl CaCl2(0.02M)PT試驗75μl血漿25μl試驗溶液75μl鹽水于37℃培養(yǎng)1分鐘。
75μl血漿Innovin Baxter-Dade重組人組織因子式(I)化合物另外的有益性能可以通過在實驗動物種如貓和狗身上，在禁食與進(jìn)食狀態(tài)下口服劑量之后測定其藥效(PD)與藥代動力學(xué)(PK)性能來表明。
權(quán)利要求
1.式(I)的化合物 其中，R表示氫原子或氟原子，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
2.如權(quán)利要求1所要求的化合物，其中R表示氫原子。
3.如權(quán)利要求2所要求的化合物，其選自1-(4-甲氧基苯甲酰基-D-環(huán)丙基甘氨?；?-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪和其鹽酸鹽、富馬酸鹽和馬來酸酸加成鹽。
4.如權(quán)利要求3所要求的化合物，其選自結(jié)晶形態(tài)的二鹽酸鹽、二富馬酸鹽和二馬來酸酸加成鹽。
5.如權(quán)利要求4所要求的化合物，其為結(jié)晶形態(tài)的1-(4-甲氧基苯甲?；?D-環(huán)丙基甘氨?；?-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪二富馬酸鹽。
6.如權(quán)利要求1所要求的化合物，其中R表示氟原子。
7.如權(quán)利要求6所要求的化合物，其選自1-(3-氟-4-甲氧基苯甲?；?D-環(huán)丙基甘氨?；?-4-(1-甲基哌啶-4-基)哌嗪；和其鹽酸酸加成鹽。
8.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-7任一項要求的化合物，以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。
9.制備權(quán)利要求1-7任一項的化合物的方法，其包括(a)使式(II)化合物 或其鹽與式(III)化合物 或其活性衍生物反應(yīng)；或(b)使式(IV)化合物 或其鹽，與式(V)化合物 或其活性衍生物反應(yīng)；隨后，如果希望藥學(xué)上可接受的鹽的話，形成藥學(xué)上可接受的鹽。
10.式(II)的化合物或其鹽
11.式(V)的化合物
12.用于治療的如權(quán)利要求1-7任一項所要求的化合物。
13.權(quán)利要求1-7任一項所要求的化合物在制備用于治療血栓形成病癥的藥物方面的用途。
14.一種在需要治療的對象中治療血栓形成病癥的方法，其包括施用有效量的權(quán)利要求1所要求的化合物。
全文摘要
式(I)的化合物，其中R表示氫原子或氟原子，或者其藥學(xué)上可接受的鹽是用于治療血栓形成病癥的XA因子抑制劑。
文檔編號C07D211/58GK1642914SQ03807414
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月1日
發(fā)明者M·R·維利, G·L·恩格爾 申請人:伊萊利利公司