專利名稱：改變紫杉烷類和紫杉烷類相關(guān)化合物的生物合成的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請要求享有于2002年2月8號(hào)提交的第60/355,144號(hào)美國申請的專利優(yōu)先權(quán)益，其全部公開內(nèi)容均引入本文以供參考。
本發(fā)明提供了苯丙氨酸氨基變位酶的分離的核苷酸以及推得的氨基酸序列，還提供了純化此酶的方法。本發(fā)明還提供了利用苯丙氨酸氨基變位酶基因改變植物細(xì)胞培養(yǎng)物中化合物的生物合成的方法。例如，將苯丙氨酸氨基變位酶基因轉(zhuǎn)移到紫杉屬植物細(xì)胞中改變這些細(xì)胞的紫杉烷類和紫杉烷類相關(guān)化合物的生物合成。本發(fā)明還涉及通過在生產(chǎn)培養(yǎng)基中給細(xì)胞單獨(dú)補(bǔ)加β-苯丙氨酸或者補(bǔ)加β-苯丙氨酸與苯甲酸或其鹽來改變體內(nèi)紫杉烷類和紫杉烷類相關(guān)化合物的產(chǎn)生的方法。
背景技術(shù)：
紫杉醇用于各種癌癥的治療，包括但不僅限于卵巢癌、乳腺癌和肺癌。這個(gè)紫杉烷類雙萜化合物首先由紫杉屬紫杉科的植物短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)NUTT分離鑒定得到。紫杉醇在此植物體各部分均有存在，在樹皮中含量最高。當(dāng)前，紫杉醇由天然或種植的植物體收集得到。然而，紫杉屬的植物生長極為緩慢，大約需要超過十年的時(shí)間才能長到離地面20厘米高度。而且，剝?nèi)淦ねǔ?huì)導(dǎo)致樹木死亡。這樣，要從天然資源中獲取治療需要的大量紫杉醇如果不說是不可能，至少也會(huì)是極端的困難。
人們已經(jīng)嘗試用化學(xué)的方法合成紫杉醇。然而，紫杉醇分子很大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，由可得到的簡單化合物原料進(jìn)行大規(guī)模的合成目前在商業(yè)上不是一個(gè)可行的選擇。
用種植得到的紫杉醇前體10-去乙?；鶟{果赤霉素經(jīng)過化學(xué)連接上側(cè)鏈來半合成生產(chǎn)的方法也已經(jīng)有提出(美國專利4,924,011；美國專利5,015,744)。10-去乙?；鶟{果赤霉素來自紫杉種樹木的針狀葉。但是，要獲得這種前體決不簡單并且針狀葉中10-去乙?；鶟{果赤霉素可能不像最初報(bào)道的那么高。因此，半合成制造的方法相當(dāng)昂貴而且也不大可能滿足化療所需要的紫杉醇量。
最能夠保證獲得治療需要的足量紫杉醇的方法是植物細(xì)胞培養(yǎng)。
多種通過植物細(xì)胞培養(yǎng)來生產(chǎn)紫杉醇和其它紫杉烷類或紫杉烷類相關(guān)化合物的方法已經(jīng)有了描述。
美國專利5,019,504說明了通過培養(yǎng)短葉紅豆杉細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇及其衍生物的方法。然而，其產(chǎn)量為1到3mg/L，并不足以用于工業(yè)生產(chǎn)。
美國專利5,015,744說明了通過植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)漿果赤霉素III的方法，可用于半合成生產(chǎn)紫杉醇。
美國專利5,407,816和WO 93/17121說明了由接種到營養(yǎng)培養(yǎng)基上的紫杉細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇以及紫杉醇類似化合物的方法。用這種方法，可以得到至少十倍于天然紫杉細(xì)胞的紫杉醇。利用該方法，紅豆杉(Taxus chinensis)細(xì)胞紫杉醇和紫杉烷類的產(chǎn)量可達(dá)到153mg/L。然而，對營養(yǎng)培養(yǎng)基的要求相當(dāng)復(fù)雜并且生長條件非常限定，這樣工業(yè)應(yīng)用此方法也很成問題。
利用在植物細(xì)胞培養(yǎng)基中添加刺激物來增加紫杉醇產(chǎn)量的方法也已經(jīng)提出。例如，美國專利5,637,484說明了在培養(yǎng)基中加入茉莉酮酸酯和含銀化合物來增加紫杉醇產(chǎn)量的方法。Yukimune等人(NatureBiotechnology 1996 141129-1132)和Mirjalili及Linden(Biotechnol.Prog.1996 12110-118)也發(fā)現(xiàn)添加茉莉酮酸甲酯以增加紫杉細(xì)胞培養(yǎng)中紫杉醇的產(chǎn)量。WO 97/44476說明了獲得高產(chǎn)量的紫杉醇、漿果赤霉素III以及其它紫杉醇類似化合物的方法，該方法在培養(yǎng)紫杉細(xì)胞時(shí)增高了諸如銀離子或復(fù)合物、茉莉酮酸、植物激素相關(guān)生長調(diào)節(jié)因子、苯丙酮酸通路抑制劑如3，4-亞甲二氧基-6-硝基肉桂酸等試劑。美國專利5,871,979說明了在含糖培養(yǎng)基中接種紫杉屬植物細(xì)胞半連續(xù)培養(yǎng)以獲得高產(chǎn)量的紫杉醇的方法。美國專利6,248,572也描述了在單獨(dú)含糖或與AgNO3結(jié)合的含糖培養(yǎng)基中大規(guī)模培養(yǎng)紫杉屬植物細(xì)胞生產(chǎn)紫杉醇的方法。EP 0 727 492 A2說明了植物細(xì)胞或組織中生產(chǎn)紫杉烷類雙萜化合物的方法，該方法要求在冠纓堿、冠纓堿產(chǎn)生菌、這樣的細(xì)菌的培養(yǎng)液或提取物、環(huán)多糖、脂肪酸或茉莉酮酸的亞氨基或氨基衍生物存在的條件下培養(yǎng)細(xì)胞或組織。Furmanowa等(Biotechnology Letters 2000 221449-1452)描述了通過添加硫酸氧釩、苯丙氨酸或殼聚糖在培養(yǎng)東北紅豆杉(Taxuscuspidate)細(xì)胞時(shí)增加紫杉醇產(chǎn)量的方法以及通過添加氨基苯甲酸在培養(yǎng)Taxus media細(xì)胞時(shí)增加漿果赤霉素III產(chǎn)量的方法。此外，通過研究可以在體內(nèi)增加紫杉醇產(chǎn)量的化合物發(fā)現(xiàn)β-苯丙氨酸可以提高紫杉醇產(chǎn)量；但是，在研究中使用的是α和β-苯丙氨酸的混合物。并沒有單獨(dú)使用β-苯丙氨酸(WO 97/44476)。
發(fā)明概要本發(fā)明的一個(gè)目的是提供從植物細(xì)胞純化苯丙氨酸氨基變位酶的方法。作為一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，苯丙氨酸氨基變位酶由紫杉屬植物細(xì)胞純化得到。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供純化的苯丙氨酸氨基變位酶。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供編碼苯丙氨酸氨基變位酶的分離的核酸序列。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供含有編碼苯丙氨酸氨基變位酶的核酸序列的載體以及提供含有可表達(dá)苯丙氨酸氨基變位酶的這些載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明再有一個(gè)目的是提供通過苯丙氨酸氨基變位酶基因遺傳轉(zhuǎn)化來改變植物細(xì)胞培養(yǎng)物生物合成化合物的方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，苯丙氨酸氨基變位酶基因遺傳轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中，優(yōu)選紫杉屬植物細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而改變紫杉烷類和紫杉烷類相關(guān)化合物的生物合成。在此實(shí)施方案中，可將含有編碼苯丙氨酸氨基變位酶的核酸序列的載體轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中從而增加了苯丙氨酸氨基變位酶的表達(dá)。
本發(fā)明再有一個(gè)目的是提供改變植物細(xì)胞培養(yǎng)物中紫杉烷類和紫杉烷類相關(guān)化合物的水平的方法，包括用β-苯丙氨酸(3-氨基-3-苯丙酸)培養(yǎng)植物細(xì)胞。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，此方法還包括向植物細(xì)胞培養(yǎng)物中添加苯甲酸或其鹽。
本發(fā)明再有一個(gè)目的是提供改變植物細(xì)胞培養(yǎng)物中紫杉醇與漿果赤霉素III比例的方法，包括用β-苯丙氨酸和/或苯甲酸或其鹽培養(yǎng)植物細(xì)胞。
本發(fā)明仍有一個(gè)目的是利用純化的苯丙氨酸氨基變位酶和/或編碼苯丙氨酸氨基變位酶的分離的核酸序列鑒定其它物種的苯丙氨酸氨基變位酶基因，鑒定改變了其編碼的蛋白的生物催化活性的苯丙氨酸基因突變，分離植物細(xì)胞中與苯丙氨酸氨基變位酶基因毗鄰的基因組序列的方法。
附圖簡述

圖1提供了一種生物合成紫杉醇的方案。數(shù)字標(biāo)記的結(jié)構(gòu)的化合物名稱如下1，二磷酸香葉基香葉基酯；2，紫杉烷二烯；3，紫杉烷-4(20)，11-二烯-2-α-9，10β-13α-四羥基-5α-乙酸酯；4，苯甲?；鵆oA；5，9，10β-13α-三羥基-5α-乙酸酯-2α-苯甲酸酯-紫杉烷-4(20)，11-二烯；6，α-苯丙氨酸；7，β-苯丙氨酸；8，苯基異絲氨酸；9，漿果赤霉素III；10，苯甲酸；11，去苯甲?；仙即?；12，紫杉醇。
圖2提供了編碼苯丙氨酸氨基變位酶的核酸序列(SEQ ID NO1)，它起始于第9位核苷酸終止與2069位核苷酸。
圖3為推得的苯丙氨酸氨基變位酶的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖4提供了源自紅豆杉的苯丙氨酸氨基變位酶(PAM)基因組聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物(SEQ ID NO3)的核酸序列。起始的甲硫氨酸密碼子(ATG)起始在63位核苷酸，終止密碼子(TAG)起始在2239位核苷酸，片段全長2411個(gè)核苷酸?；蚪M片段含有一個(gè)起始于1154位核苷酸終止于1322位核苷酸的內(nèi)含子。
圖5提供了源自T.Media的苯丙氨酸氨基變位酶基因組PCR產(chǎn)物(SEQ ID NO4)的核酸序列。起始的甲硫氨酸密碼子(ATG)起始在1位核苷酸，終止密碼子(TAG)起始在2231位核苷酸，片段全長2233個(gè)核苷酸?；蚪M片段含有一個(gè)起始于1091位核苷酸終止于1260位核苷酸的內(nèi)含子。
圖6提供了源自加拿大紅豆杉(T.Canadensis)的苯丙氨酸氨基變位酶基因組PCR產(chǎn)物(SEQ ID NO5)的核酸序列。起始的甲硫氨酸密碼子(ATG)起始在1位核苷酸，終止密碼子(TAG)起始在2231位核苷酸，片段全長2235個(gè)核苷酸。基因組片段含有一個(gè)起始于1091位核苷酸終止于1260位核苷酸的內(nèi)含子。
圖7是顯示DL-β-苯丙氨酸(DL-3-氨基-3-苯丙酸)對分批培養(yǎng)紅豆杉細(xì)胞中紫杉醇和漿果赤霉素III產(chǎn)量影響的條線圖。每一個(gè)數(shù)值代表四個(gè)樣本的平均數(shù)值。圖7A顯示在DL-β-苯丙氨酸為0(空心柱)、1mM(灰色柱)和5mM(實(shí)心柱)條件下培養(yǎng)1、2、3、4和5周后植物細(xì)胞中紫杉醇的產(chǎn)量。圖7B顯示在DL-β-苯丙氨酸為0(空心柱)、1mM(灰色柱)和5mM(實(shí)心柱)條件下培養(yǎng)1、2、3、4和5周后植物細(xì)胞中漿果赤霉素III的產(chǎn)量。
圖8是顯示DL-β-苯丙氨酸(DL-3-氨基-3-苯丙酸)和苯甲酸對分批培養(yǎng)紅豆杉細(xì)胞中紫杉醇和漿果赤霉素III產(chǎn)量影響的條線圖。每一個(gè)數(shù)值代表六個(gè)樣本的平均數(shù)。圖8A顯示對照細(xì)胞(空心柱)、暴露在DL-β-苯丙氨酸下的細(xì)胞(灰色柱)和暴露在DL-β-苯丙氨酸和苯甲酸下(實(shí)心柱)培養(yǎng)2、3、4和5周后細(xì)胞中紫杉醇的產(chǎn)量。圖8B顯示對照細(xì)胞(空心柱)、暴露在DL-β-苯丙氨酸下的細(xì)胞(灰色柱)和暴露在DL-β-苯丙氨酸和苯甲酸下(實(shí)心柱)培養(yǎng)2、3、4和5周后細(xì)胞中漿果赤霉素III的產(chǎn)量。
圖9提供了苯丙氨酸氨基變位酶與源自火炬松(Pinus taeda)的苯丙氨酸氨基裂解酶的推得的氨基酸序列的對比。相同的氨基酸殘基以高亮顯示。
發(fā)明詳述紫杉醇是由衍生自苯丙氨酸的C13側(cè)鏈與高度修飾的二萜(漿果赤霉素III)構(gòu)成的很復(fù)雜的二萜類生物堿。就C13側(cè)鏈針對多種潛在中間體進(jìn)行補(bǔ)料研究得到的生物化學(xué)證據(jù)提供了以下的生物合成方案(也見圖1)。第一步是將α-苯丙氨酸變成β-苯丙氨酸(3-氨基-3-苯丙酸)。接著羥化β-苯丙氨酸生成苯基異絲氨酸，將苯基異絲氨酸轉(zhuǎn)移到漿果赤霉素III的C13羥基基團(tuán)上(Fleming等人.J.Am.Chem.Soc.1994 1164137-4138)。得到的去苯甲?；仙即荚俦郊柞；瓷闪俗仙即?Fleming等人.J.Am.Chem.Soc.1994 1164137-4138)。另已發(fā)現(xiàn)β-苯丙氨酸是紫杉醇合成最終酶促步驟里轉(zhuǎn)移到C13側(cè)鏈上的苯甲酸部分的來源(Fleming等人.J.Am.Chem.Soc.1994 1164137-4138)。
漿果赤霉素III的生物合成路徑由普遍存在的初級(jí)代謝物二磷酸香葉基香葉基酯開始，經(jīng)過隨后的13到15個(gè)酶促步驟，最后對10-去乙?；鶟{果赤霉素III進(jìn)行?；D(zhuǎn)移得到漿果赤霉素III(Fleming等人.J.Am.Chem.Soc.1994 1164137-4138)。如圖1所示，漿果赤霉素III在C2位苯甲?；@表明漿果赤霉素III的生物合成需要苯甲酸的來源。使用苯甲酸和β-苯丙氨酸進(jìn)行的補(bǔ)料研究顯示苯甲酸來源于將并入紫杉醇C13側(cè)鏈的β-苯丙氨酸，這就說明紫杉細(xì)胞內(nèi)有兩種苯甲酸供應(yīng)池，針對C13側(cè)鏈的一種源于β-苯丙氨酸，而另一種針對漿果赤霉素III的源于傳統(tǒng)的苯丙氨酸到肉桂酸通路(Bjorklund and Leete，Phytochemistry 1992 313883)。兩種截然不同的苯甲酸供應(yīng)池的存在表明了在漿果赤霉素III生物合成路徑與C13側(cè)鏈/紫杉醇之間存在空間的分隔。
在紫杉醇的生物合成中苯丙氨酸氨基變位酶催化α-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成β-苯丙氨酸是實(shí)行的第一步反應(yīng)，而且β-苯丙氨酸經(jīng)鑒定是側(cè)鏈生物合成的第一個(gè)中間體，這表明對β-苯丙氨酸和苯丙氨酸氨基變位酶的調(diào)控會(huì)對紫杉醇的生物合成產(chǎn)生直接的影響。本發(fā)明通過提供苯丙氨酸氨基變位酶的純化方法、分離苯丙氨酸氨基變位酶的cDNA、闡明添加β-苯丙氨酸和/或苯甲酸對紫杉醇的產(chǎn)量和紫杉醇與漿果赤霉素III的比例的改變來實(shí)現(xiàn)對紫杉烷類成分及其水平的調(diào)控。因此，本發(fā)明提供了用于改變?nèi)缱仙即己拖駶{果赤霉素III、漿果赤霉素VI這樣的紫杉烷類相關(guān)化合物的生物合成的組合物和方法。此外，本發(fā)明的組合物可按照眾所周知的技術(shù)用來鑒定其它物種的苯丙氨酸氨基變位酶基因。能產(chǎn)生生物催化活性改變的酶的苯丙氨酸氨基變位酶基因突變體也可用眾所周知的技術(shù)得到。而且，利用苯丙氨酸氨基變位酶基因序列采取常規(guī)技術(shù)可分離毗鄰此基因的含有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的順式作用元件的基因組序列。
“苯丙氨酸氨基變位酶”是一種能夠催化氨基基團(tuán)從L-α-苯丙氨酸2位轉(zhuǎn)移以形成3-氨基-3-苯丙酸(β-苯丙氨酸)的酶。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了從植物細(xì)胞培養(yǎng)物純化同性質(zhì)的苯丙氨酸氨基變位酶的方法。而且，還提供了純化的苯丙氨酸氨基變位酶。
這里的“純化”或“純化的”是指苯丙氨酸氨基變位酶經(jīng)SDS-PAGE檢測同質(zhì)性等于或者更優(yōu)選大于95％。
這樣的純化方法中，首先制得植物細(xì)胞的粗提物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，粗提物經(jīng)將冰凍的植物細(xì)胞懸浮在含有二硫蘇糖醇(DTT)的磷酸鉀緩沖液中。處理提取物以除去苯酚化合物，優(yōu)選通過添加XAD-4樹脂(Sigma Aldrich Corp.，St.Louis，MO)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP；Sigma Aldrich Corp.，St.Louis，MO)來進(jìn)行。接著在4℃攪拌提取物數(shù)小時(shí)后再離心，優(yōu)選以10,000×g離心兩小時(shí)以除去細(xì)胞碎片和苯酚化合物。而后濃縮上清液，優(yōu)選濃縮至約50ml，并且通過加入至少200ml含有DTT的磷酸鉀緩沖液來透析該濃縮級(jí)分。透析后的級(jí)分通過超濾去除其中的β-苯丙氨酸而濃縮。粗提物經(jīng)過上述步驟后的全部體積約為約40到50ml并含有100到150mg蛋白。
接著將蛋白從粗提物中沉淀下來，優(yōu)選通過添加分成兩等份的固體硫酸銨的方法。硫酸銨分級(jí)沉淀的方法可得到良好的收率和適中的純度。在此步驟中，攪拌加入一等份的硫酸銨固體成30％飽和度的溶液。將溶液離心，優(yōu)選以10,000×g離心60分鐘，棄去沉淀。而后，攪拌加入另一等份的硫酸銨固體成50％飽和度的溶液，再次以10,000×g將溶液離心60分鐘，留得沉淀。苯丙氨酸氨基變位酶接著通過兩步附加步驟純化150倍以上。
這些附加步驟的第一步，第二次加硫酸銨濃度為50％時(shí)得到的沉淀溶解于含1mM DTT和1mM MgCl2的Tris-HCl(pH7.0)緩沖液。此溶液接著上用同樣的緩沖液平衡過的親和色譜柱，例如含有連接到葡聚糖上的染料的Reactive Green 19(Sigma Aldrich Corp.，St.Louis，MO)色譜柱(2×10cm)，收集流出液和額外的15ml洗滌液。這步親和層析步驟對于純化方案中將苯丙氨酸氨基變位酶同另一種緊密相關(guān)的酶，即苯丙氨酸氨基裂解酶分離開至關(guān)重要。苯丙氨酸氨基裂解酶與之有相同的底物并且分子量也近似。因?yàn)楸奖彼岚被呀饷钢挥性贛g2+存在的條件下才與親和色譜柱相結(jié)合，因而Mg2+對于此步驟也極為重要。
接著，經(jīng)過超濾混合并且透析流出液和洗滌液級(jí)分，最后的緩沖液變?yōu)楹?mM DTT和1mM MgCl2，pH為9.0的Tris-HCl緩沖液，終體積為7-8ml。
得到的7-8ml再過第二個(gè)親和層析柱，優(yōu)選含有Heparin-Agarose Type I(Sigma Aldrich Corp.，St.Louis，MO)的10ml(2×10cm)柱，該柱用含1mM DTT和1mM MgCl2、pH為9.0的Tris-HCl緩沖液平衡。用約30ml的這種緩沖液洗柱。用含有0.1M NaCl的此緩沖液將酶洗脫。洗脫液可進(jìn)一步濃縮。最后一步的產(chǎn)量相對較低，主要原因是肝素-瓊脂糖與苯丙氨酸結(jié)合作用弱。典型的結(jié)合在緩沖液的pH低于9.0時(shí)不會(huì)發(fā)生。相應(yīng)的，緩沖液的pH值優(yōu)選為至少9.0。
從植物細(xì)胞培養(yǎng)中典型的純化苯丙氨酸氨基變位酶的結(jié)果總結(jié)在表1中。
表1.苯丙氨酸氨基變位酶的純化(PAM)
每一步都用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離蛋白來驗(yàn)證苯丙氨酸氨基變位酶的純化均一。
接著測定純化的苯丙氨酸氨基變位酶的特性。經(jīng)SDS-PAGE檢測變性的苯丙氨酸氨基變位酶的分子量約為80KDa，而天然的苯丙氨酸氨基變位酶的分子量測定為162KDa。這些結(jié)果顯示苯丙氨酸氨基變位酶是同源二聚體蛋白。不同于賴氨酸氨基變位酶，純化的苯丙氨酸氨基變位酶的活性不依賴于任何輔助因子。吡啶醇-5-磷酸酯(PLP)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)都不能影響酶的活性，并且酶在沒有任何輔助因子的情況下也會(huì)發(fā)揮完全的功能。底物特異性研究顯示L-α-苯丙氨酸是該酶的唯一底物。D-α-苯丙氨酸或其它氨基酸經(jīng)檢驗(yàn)都不能作為純化的苯丙氨酸氨基變位酶的底物。
用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模式測量純化的苯丙氨酸氨基變位酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)。當(dāng)Vmax值是303.1μg/min/mg蛋白時(shí)L-α-苯丙氨酸的Km值是1.1mM。純化的苯丙氨酸氨基變位酶在4℃和室溫下都相對穩(wěn)定。
用乙酸鈉、磷酸鉀和不同pH的Tris-HCl來測定苯丙氨酸氨基變位酶的最佳pH值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在50mM磷酸鉀或50mM的Tris-HCl緩沖液存在下苯丙氨酸氨基變位酶的最佳pH值在7.5到8.0之間。
對純化的苯丙氨酸氨基變位酶進(jìn)行了測序。更具體的，用EnhancedHewlett-Packard G1005A氨基酸測序儀(Hewlett-Packard，PaloAlto，CA)對全蛋白和用反相HPLC純化的胰酶消化片段進(jìn)行N-末端測序。每個(gè)樣本都分析15到20個(gè)循環(huán)并且將測定的氨基酸殘基和循環(huán)列在表2中。
大寫字母代表最高可信度的，小寫字母代表適中的可信度的，在圓括號(hào)的小寫字母代表低可信度的。
表2PAM肽的氨基酸序列
在本發(fā)明的另一方面，提供了編碼苯丙氨酸氨基變位酶的分離的核酸序列并因而提供了其編碼的多肽。編碼苯丙氨酸氨基變位酶的cDNA在圖2中SEQ ID NO1有列出。甲硫氨酸起始密碼子(ATG)開始于第9位核苷酸，終止密碼子(TAG)開始于第2136位核苷酸，cDNA全長2277個(gè)核苷酸。推得的苯丙氨酸氨基變位酶多肽的氨基酸序列在圖3中SEQ ID NO2有列出。由純化的苯丙氨酸氨基變位酶得到的九個(gè)肽中(表二中所列)有八個(gè)在推得的苯丙氨酸氨基變位酶氨基酸序列里出現(xiàn)，這確證已單獨(dú)的正確的cDNA。
用Basic Logic Alignment Search Tool(BLAST，MCBI，Bethesda，MD；Altschul等人.J.Mol.Biol.215(3)4-3-410(1990))搜索顯示苯丙氨酸氨基變位酶與苯丙氨酸氨基裂解酶相關(guān)。例如，BLAST搜索顯示，從火炬松分離的cDNA所推得的苯丙氨酸氨基裂解酶氨基酸序列(Genbank Accession number AAA84889)與苯丙氨酸氨基變位酶的有43％相同和68％近似。圖9提供了這些序列的對比，揭示至少有四個(gè)確信為有顯著功能且可用于設(shè)計(jì)簡并PCR引物以從其它植物物種中獲得苯丙氨酸氨基變位酶的高度保守的氨基酸區(qū)域。這四個(gè)區(qū)域位于圖9所示苯丙氨酸氨基變位酶氨基酸序列的79-87，423-428，453-460和477-482處。
三種名為紅豆杉、T.Media和加拿大紅豆杉的不同紫杉中編碼苯丙氨酸氨基變位酶的基因組PCR產(chǎn)物的核酸序列分別在圖4(SEQ IDNO3)、圖5(SEQ ID NO4)和圖6(SEQ ID NO5)中列出。在SEQ IDNO3核酸序列中，甲硫氨酸起始密碼子(ATG)開始于第63位核苷酸，終止密碼子(TAG)開始于第2293位核苷酸，片段全長2411個(gè)核苷酸。基因組片段含有一個(gè)起始于1154位核苷酸終止于1312位核苷酸的內(nèi)含子。在SEQ ID NO4核酸序列中，甲硫氨酸起始密碼子(ATG)開始于第1位核苷酸，終止密碼子(TAG)開始于第2231位核苷酸，片段全長2233個(gè)核苷酸。基因組片段含有一個(gè)起始于1091位核苷酸終止于1260位核苷酸的內(nèi)含子。在SEQ ID NO5核酸序列中，甲硫氨酸起始密碼子(ATG)開始于第1位核苷酸，終止密碼子(TAG)開始于第2231位核苷酸，片段全長2235個(gè)核苷酸。基因組片段含有一個(gè)起始于1091位核苷酸終止于1260位核苷酸的內(nèi)含子。
用反向的遺傳學(xué)方法實(shí)現(xiàn)苯丙氨酸氨基變位酶cDNA的分離和功能表達(dá)。由純化的苯丙氨酸氨基變位酶蛋白產(chǎn)生的九個(gè)肽(見表2)中的四個(gè)設(shè)計(jì)得到表3所示的簡并引物。
表3選擇的苯丙氨酸氨基變位酶肽的簡并引物
在基于八個(gè)肽序列中的四個(gè)重新設(shè)計(jì)簡并引物之后，經(jīng)3’RACE PCR合成兩個(gè)DNA片段(長度約800和600bps)。反應(yīng)的體系包括誘導(dǎo)的載體cDNA文庫模板和用于定位的簡并引物PAM1.2(設(shè)計(jì)針對中間肽，LSDRLENEMTAVR(SEQ ID NO10))和M13F引物(5’TGACCGGCAGCAAAATG3’(SEQ ID NO30))。對兩個(gè)片段測序顯示與由poly A添加位點(diǎn)起600bp的片段100％相同，而800bp片段則是在3’端再伸長200bp，這說明這些片段是同一基因利用不同poly(A)添加位點(diǎn)的例子。
為了克隆cDNA的5’末端，用MARATHONTMcDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech，Palo Alto，CA)合成RACE(Rapid Amplification of cDNAEnds)文庫。該文庫是利用分離自在生產(chǎn)培養(yǎng)基中生長6天的紅豆杉細(xì)胞的mRNA構(gòu)建的。針對600bp PAM 3’RACE片段設(shè)計(jì)5’RACE基因特異性引物(5’TGCATCGAACACTTTCTGCACGTCCTCT3’)。PCR得到的擴(kuò)增片段長為2.2kb，將其亞克隆到PCR-ScriptTM(Stratagene，La Jolla，CA)中。全長的cDNA采用在起始的ATG處含有限制性酶NdeI酶切位點(diǎn)的5’特異引物pam93mutTCCTTGCTCTCATATTATGGGGTTTGC(SEQ IDNO32)，以及含有限制性酶BamHI酶切位點(diǎn)并含有227個(gè)核苷酸的3’非翻譯區(qū)的3’特異引物pam2350mutcGGGATCCTTTTAAAACAAAAATTAATTAGGGTT(SEQ ID NO33)單獨(dú)的。獲得的全長的苯丙氨酸氨基變位酶cDNA亞克隆到PCR-ScriptTM(Stratagene，La Jolla，CA)中并且測序。此序列在圖2中列出。經(jīng)NdeI、BamHI酶切的苯丙氨酸氨基變位酶DNA片段亞克隆到pBMS2000大腸桿菌蛋白表達(dá)載體(在美國專利6,068,991中有說明，在此完整的引入作為參考)并且接著轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株EpicuriancoliXL1-Blue(Stratagene，La Jolla，CA)。接下來進(jìn)行表達(dá)和酶活性分析，每毫克大腸桿菌蛋白中此功能性的酶平均合成558ng的β-苯丙氨酸。表達(dá)具有此功能的酶決定性的證明了已經(jīng)擴(kuò)增和克隆了苯丙氨酸氨基變位酶cDNA。
圖4中列出了基因組DNA，SEQ ID NO3。它由基因特異性引物PAM5F2TCAGTTTTATCTCGCTCAAGT(SEQ ID NO34)以及PAM3RTACAGTCGCTTCTGCGGAAT(SEQ ID NO34)經(jīng)PCR產(chǎn)生，引物設(shè)計(jì)針對的是苯丙氨酸氨基變位酶cDNA和由紅豆杉細(xì)胞系P97-1細(xì)胞培養(yǎng)物中分離的基因組DNA的5’和3’非翻譯區(qū)?；蚪MPCR的產(chǎn)物直接測序。這樣，由于產(chǎn)物僅有很小百分比的序列不一致，在等位基因間只引起輕微的不同，可認(rèn)為該序列與苯丙氨酸氨基變位酶序列一致?？寺〉玫降腸DNA和基因組PCR產(chǎn)物在核苷酸水平上有99.8％的一致性，在氨基酸水平上也有99.7％一致性(見表4)。
源自其它兩種T.Media和加拿大紅豆杉的基因組PCR產(chǎn)物也用類似的方法合成和測序。為了確保PCR得到特異性的產(chǎn)物，設(shè)計(jì)針對苯丙氨酸氨基變位酶編碼區(qū)的起始和終止處的5’引物pam63ATGGGGTTTGCCGTGGAATCG(SEQ ID NO36)和3’引物pam2173cCTAGACGCCGTTGGCGCA(SEQ ID NO37)。T.Media的序列在圖5 SEQID NO4中列出，加拿大紅豆杉的序列在圖6 SEQ ID NO5中列出。兩序列都含有一個(gè)起始于1091位核苷酸終止于1260位核苷酸的內(nèi)含子。
所有三種苯丙氨酸氨基變位酶序列都高度保守。紅豆杉在核苷酸水平上與T.Media有98.6％相同，與加拿大紅豆杉有98.7％相同。導(dǎo)致氨基酸改變的不同之處列在表4中。
表4在苯丙氨酸氨基變位酶cDNA和基因組PCR片段中鑒定的氨基酸差異。
I為PAM紅豆杉cDNAII為PAM紅豆杉基因組III為PAM T.Media cDNAIV為PAM加拿大紅豆杉cDNA由于遺傳密碼有簡并性，本發(fā)明相關(guān)的核酸序列也可以含有不同于圖2、4和5所示的核酸序列，它們編碼同樣的苯丙氨酸氨基變位酶。本發(fā)明相關(guān)核酸序列還包括在嚴(yán)格的條件下能與上述核酸序列雜交的多聚核苷酸。在此處，“嚴(yán)格的條件”是指至少有60％，更優(yōu)選至少80％同源性，在60℃、2×SSC緩沖液條件下進(jìn)行雜交。更優(yōu)選的是能與圖2、4或5所示核酸序列或者與圖2、4或5所示核酸序列的互補(bǔ)序列雜交的分離的核酸分子，雜交的條件3×SSC緩沖液、65℃下16小時(shí)，且這些核酸分子在0.5×SSC緩沖液、55℃下30分鐘的洗滌條件下能與圖2、4或5所示核酸序列或者圖2、4或5所示核酸序列的互補(bǔ)序列保持雜交狀態(tài)。本發(fā)明相關(guān)的核酸序列也包含片段、衍生物或者各種編碼這些酶的衍生物、突變型或活性片段的核酸序列。術(shù)語“突變型”包括天然產(chǎn)生的突變型如等位基因突變型，也包括用眾所周知的誘變技術(shù)產(chǎn)生的誘變型。對于突變型或核酸序列衍生物來說，差異一般有限，這樣由這些核苷酸編碼的多肽具有與苯丙氨酸氨基變位酶近似的活性。本發(fā)明“近似的活性”意味著酶的變異型依然能夠催化氨基基團(tuán)從L-α-苯丙氨酸2位轉(zhuǎn)移形成3-氨基-3-苯丙酸。因此，本發(fā)明相關(guān)的突變型或衍生物的核酸序列的改變可能屬于沉默突變。這就是說，它們可能不更改核苷酸編碼的氨基酸。另一種情況是，核酸序列的改變與苯丙氨酸氨基變位酶相比改變了氨基酸序列。這樣的改變可能包括與苯丙氨酸氨基變位酶相比氨基酸的替代、添加、刪除、融合和截短?！捌巍笔侵概cSEQ ID NO1、3、4或5或2相比分別含有較少的核苷酸或氨基酸的核酸序列或編碼多肽。當(dāng)提到核酸序列時(shí)，本發(fā)明優(yōu)選的片段、突變型和衍生物是那些編碼保留有如同苯丙氨酸氨基變位酶的生物功能的多肽的核酸序列。當(dāng)提到多肽時(shí)，本發(fā)明優(yōu)選的片段、突變型和衍生物是那些編碼保留有如同苯丙氨酸氨基變位酶的生物功能的多肽。這樣的優(yōu)選片段可通過測定其催化氨基基團(tuán)從L-α-苯丙氨酸2位轉(zhuǎn)移形成3-氨基-3-苯丙酸的酶活性來鑒定。
除了在生產(chǎn)苯丙氨酸氨基變位酶方面有用外，本發(fā)明的核酸序列也用于分離毗鄰苯丙氨酸氨基變位酶基因的基因組序列，作為雜交探針分離其它物種的苯丙氨酸氨基變位酶基因或近似基因，鑒定改變了其編碼的酶的生物催化特性的突變。
例如，毗鄰苯丙氨酸氨基變位酶基因的調(diào)控基因組序列可以采用眾所周知的技術(shù)確定基因中本發(fā)明相關(guān)的核酸序列并分離毗鄰的基因組序列而鑒定出來。這些序列含有調(diào)控基因表達(dá)的順式作用元件。因此，這些序列的獲得可能對于鑒定苯丙氨酸氨基變位酶基因表達(dá)的調(diào)控單位有用。
本發(fā)明的核酸序列，特別是其片段也可作為雜交探針用于在其它物種中鑒定和分離苯丙氨酸氨基變位酶基因或近似基因。這些探針的制備和使用采用與這里提供的常用方法一致的手段，與眾所周知的技術(shù)一致。
本發(fā)明相關(guān)的核酸序列還用來鑒定編碼那些與野生型苯丙氨酸氨基變位酶相比生物催化活性改變的蛋白的突變型苯丙氨酸氨基變位酶基因。在本發(fā)明的這個(gè)方面，編碼野生型苯丙氨酸氨基變位酶的分離的核酸序列，例如圖2、4或5所示的核酸序列，用眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行突變。接著表達(dá)由這些突變的核酸序列編碼的多肽，并且評估表達(dá)的多肽的一個(gè)或更多的生物催化性質(zhì)。可檢測的多肽的生物催化性質(zhì)包括但不限于底物特異性、Km、轉(zhuǎn)化率、最佳pH、最佳溫度和溶劑環(huán)境。接著將表達(dá)的多肽中一個(gè)或更多的生物催化性質(zhì)與苯丙氨酸氨基變位酶作相應(yīng)的比較，鑒定出使多肽相對于野生型的苯丙氨酸氨基變位酶生物催化活性發(fā)生變化的任何核酸序列突變。
已知有多種增加植物細(xì)胞中生物合成酶的基因表達(dá)水平致使全部特異的次級(jí)代謝產(chǎn)物增加的例子。例如，紫花苜蓿對受傷的反應(yīng)是合成大量的異黃酮類植物抗毒素。因?yàn)榇松锖铣赏緩叫枰?到12種酶，它與紫杉醇需要12到14種酶的路徑類似。已經(jīng)證實(shí)通過增強(qiáng)甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)植物抗毒素顯著增加(He，X.Z.and Dixon，R.A.ThePlant Cell 2000 12(9)1689-1702)。此外，當(dāng)薄荷中生物合成路徑中一種還原異構(gòu)酶在遺傳上過表達(dá)時(shí)，單萜的產(chǎn)量增加(Mahmound，S.S.and Croteau，R.B.Proc.Natl Acad.Sci.USA2001 988915-8920)。有趣的是，Mahmoud和Croteau還發(fā)現(xiàn)在基因經(jīng)遺傳調(diào)控使其低表達(dá)時(shí)單萜的成分可發(fā)生改變。過度表達(dá)苯丙氨酸氨基變位酶可望增加紫杉醇的滴度并且在下游步驟中以相似的方式提高紫杉醇與漿果赤霉素III的比例。作為對比，顯著減少苯丙氨酸氨基變位酶的表達(dá)可望降低紫杉醇的水平并且增加包括但不僅限于漿果赤霉素III、漿果赤霉素IV的漿果赤霉素含量。
在將編碼苯丙氨酸氨基變位酶的核酸序列加入植物細(xì)胞的實(shí)施方案中，優(yōu)選的是用含有核酸序列的載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。在含有本發(fā)明相關(guān)核酸序列的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞中酶可以實(shí)現(xiàn)過度表達(dá)。例如，本申請書實(shí)施例4說明了用含有本發(fā)明相關(guān)核酸序列的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌并在宿主細(xì)胞中表達(dá)苯丙氨酸氨基變位酶的一種方法。然而，苯丙氨酸氨基變位酶的底物L(fēng)-α-苯丙氨酸在所有的活生物中廣泛存在。因此，苯丙氨酸氨基變位酶基因可能在幾乎所有的酵母、細(xì)菌或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及含有編碼苯丙氨酸氨基變位酶的核酸序列的載體以及含有這些載體并表達(dá)苯丙氨酸氨基變位酶的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面涉及改變通過生物合成生產(chǎn)紫杉烷類和紫杉烷類相關(guān)化合物產(chǎn)量的方法，包括給生產(chǎn)培養(yǎng)基補(bǔ)加β-苯丙氨酸和/或苯甲酸或其鹽。此外，給生產(chǎn)培養(yǎng)基補(bǔ)加β-苯丙氨酸和/或苯甲酸或其鹽提高了紫杉烷類相對于紫杉烷類相關(guān)化合物的比例。
在添加有1mM DL-β-苯丙氨酸的情況下分批培養(yǎng)紅豆杉細(xì)胞，觀察到紫杉醇的產(chǎn)率得到了提高。進(jìn)而，僅到了培養(yǎng)的第二周，對照組漿果赤霉素III的滴度就與5mM DL-β-苯丙氨酸的一批顯示出顯著的差別。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖7中。在添加有5mM DL-β-苯丙氨酸的情況下，觀察發(fā)現(xiàn)在第二周末紫杉醇增加了40％(見圖7A)并且漿果赤霉素III減少了80％(見圖7B)。然而，紫杉醇產(chǎn)量的增加程度在隨后的幾周降低了并且在第五周末與對照組相比不再顯著增加。這些結(jié)果告訴我們5mM DL-β-苯丙氨酸在短期內(nèi)可保證漿果赤霉素III向紫杉醇的快速轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)基中添加有1mM DL-β-苯丙氨酸的細(xì)胞同樣表現(xiàn)出紫杉醇產(chǎn)率的增高，并且在第五周末與對照組相比多產(chǎn)了26％的紫杉醇(192單位/L對對照組的152單位/L)。
在用DL-β-苯丙氨酸和苯甲酸分批培養(yǎng)的紅豆杉細(xì)胞中也同樣觀察到了紫杉醇產(chǎn)量的上升。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在圖8中。在2.2mM DL-β-苯丙氨酸存在下，細(xì)胞在第五周末與對照組相比多產(chǎn)生了29％的紫杉醇(171單位/L對對照組的132單位/L)(見圖8A)。在培養(yǎng)基中補(bǔ)加DL-β-苯丙氨酸和苯甲酸的混合物，細(xì)胞在第五周末與對照組相比進(jìn)一步提高到多產(chǎn)生43％的紫杉醇(189單位/L對對照組的132單位/L)(見圖8A)。而在任何補(bǔ)料分批培養(yǎng)中都沒觀察到漿果赤霉素III滴度有降低，在單獨(dú)補(bǔ)加DL-β-苯丙氨酸(2.9)或同時(shí)添加苯甲酸(3.6)時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞中紫杉醇與漿果赤霉素III的比例都高于對照組的(2.2)(見圖8B)。
這些結(jié)果表明β-苯丙氨酸和苯甲酸都提高了紅豆杉細(xì)胞中紫杉醇的產(chǎn)量。相應(yīng)的，在植物細(xì)胞培養(yǎng)基中單獨(dú)補(bǔ)加β-苯丙氨酸或者苯甲酸或其鹽，或者更優(yōu)選的將β-苯丙氨酸與苯甲酸或其鹽一起補(bǔ)加，為提高如紫杉醇這樣的紫杉烷類的產(chǎn)量提供了有效手段。
現(xiàn)舉出如下非限定性的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1苯丙氨酸氨基變位酶蛋白的分離和表征酶的分析和HPLC方法標(biāo)準(zhǔn)的PAM活性分析體系中含有5mM L-α-苯丙氨酸、1到10μg酶及50mM Tris-HCl緩沖液(pH7.5)，終體積為0.5ml。酶反應(yīng)在28℃下150rpm進(jìn)行18個(gè)小時(shí)后加50μl乙醇沉淀蛋白來終止。離心5分鐘后，用反相HPLC分析上清液。生成的β-苯丙氨酸由其峰區(qū)域同β-苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的對比來進(jìn)行定量。酶活性是通過每小時(shí)每毫克蛋白生成多少微克β-苯丙氨酸來表述的。HPLC使用的是YMC Ph柱(4.6×150mm；Waters，Milford，MA)，流速1.2ml/min。在210nm波長監(jiān)測吸收情況。此方法使用兩種溶劑A水和B CH3CN，0％到12％B的梯度6分鐘，1分鐘后12％到90％的B，再1分鐘回到0％。L-α-苯丙氨酸和β-苯丙氨酸的保留時(shí)間分別為4.3分鐘和3.5分鐘。
蛋白分析用正比(propositional)蛋白結(jié)合染色法和由Bio-RadLaboratories(Hercules，CA)購買的微量分析試劑盒來檢測蛋白的濃度。
酶的純化為制備粗提物，將100克(濕重)冰凍的植物細(xì)胞懸浮于含有1mM二硫蘇糖醇(DTT)、50mM磷酸鉀的500ml冷的緩沖液(pH7.5)中。加入50克非離子聚合吸附劑的XAD-4樹脂(Sigma Aldrich Corp.，St.Louis，MO)和50克PVP后，提取物在4℃攪拌2小時(shí)，接著在10,000×g下離心2小時(shí)。通過用PM-30膜(Amicon，Inc.Beverly，MA)經(jīng)超濾濃縮儀將上清濃縮到約50ml，濃縮的級(jí)分進(jìn)一步用至少200ml的緩沖液透析并用超濾濃縮去除內(nèi)源的β-苯丙氨酸。一般經(jīng)過上述步驟后粗提物的終體積約40到50ml，含蛋白100到150mg。
在攪拌下向粗提物中加入硫酸銨固體成30％飽和度的溶液。將溶液離心，優(yōu)選以10,000×g離心60分鐘，棄去沉淀。而后，在攪拌下加入硫酸銨固體成50％飽和度的溶液，再次以10,000×g將溶液離心60分鐘，留取沉淀。
硫酸銨濃度為50％時(shí)得到的沉淀溶解于15ml含1mM DTT和1mMMgCl2的10mM Tris-HCl(pH7.0)緩沖液。將此溶液接著上含有連接到葡聚糖上的染料的Reactive Green 19(Sigma Aldrich Corp.，St.Louis，MO)色譜柱(2×10cm)，親和色譜柱先用含1mM DTT和1mM MgCl2的10mM Tris-HCl(pH7.0)緩沖液平衡過，收集流出液和額外的15ml洗滌緩沖液。經(jīng)過超濾混合并且透析流出液和洗滌液級(jí)分，最后的緩沖液變?yōu)楹?mM DTT(二硫蘇糖醇)和1mM MgCl2的Tris-HCl緩沖液(pH9.0)，終體積為7-8ml。
接著將活性級(jí)分上10ml Heparin-Agarose Type I(SigmaAldrich Corp.，St.Louis，MO)柱(2×10cm)，色譜柱預(yù)先用含1mM DTT和1mM MgCl2的Tris-HCl(pH 9.0)緩沖液平衡過。用約30ml的這種緩沖液洗柱，用含有0.1M NaCl的此緩沖液將酶洗脫。洗脫液可進(jìn)一步濃縮到很小的體積。
SDS-PAGE用來自Bio-Rad(Hercules，CA)的10％成品凝膠來進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色。用來自Bio-Rad(Hercules，CA)的大范圍蛋白標(biāo)準(zhǔn)品來估計(jì)變性的酶的分子量大小。
測定天然分子量用含1mM DTT的10mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)平衡的SephacrylS-200 HR(Sigma Aldrich Corp.，St.Louis，MO)100ml凝膠過濾柱(2.5×3.5cm)，進(jìn)行分子排阻色譜分析。將酶的樣品和來自Bio-Rad(Hercules，CA)的分子量標(biāo)準(zhǔn)品(670KDa、158KDa、44KDa、17KDa、1.35KDa)上柱。柱子用緩沖液以1ml/min的速度洗脫，每4ml收集一次在280nm監(jiān)測的級(jí)分。酶的天然分子量通過與洗脫體積的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可計(jì)算得到。
其它測定制備純化的酶用來測定酶得性質(zhì)，包括所需輔助因子、底物特異性、動(dòng)力學(xué)常數(shù)、熱穩(wěn)定性和最佳pH。測定所需輔助因子時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系含有1mM的吡啶醇-5-磷酸酯(PLP)或S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，用HPLC分析生成的β-苯丙氨酸。為測定底物特異性，L-和D-型的各種氨基酸，包括但不僅限于賴氨酸、酪氨酸、色氨酸和組氨酸以5mM的濃度替代標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中的L-α-苯丙氨酸。測定動(dòng)力學(xué)常數(shù)時(shí)，反應(yīng)混合液中L-α-苯丙氨酸的濃度在0.156mM到15mM的范圍內(nèi)變動(dòng)以測量酶的活性。熱穩(wěn)定性和最佳pH通過在不同溫度或不同pH的緩沖液中培養(yǎng)酶反應(yīng)混合物來測得。
苯丙氨酸氨基變位酶肽譜純化的苯丙氨酸氨基變位酶蛋白跑SDS-PAGE膠，用PVDF(聚二氟乙二烯)膜(Bio-Rad，Hercules，CA)上進(jìn)行印跡實(shí)驗(yàn)，且下約80KDa處的條帶。所有的蛋白分析操作都按照Hewlett-Packard(PaloAlto，CA)測序方案來進(jìn)行(Miller C.G..，蛋白序列分析和化學(xué)修飾中的二相吸附柱技術(shù)。方法酶學(xué)方法的伙伴第6卷No.3，315-333頁，(Academic Press)，1994年9月)。結(jié)合到PVDF的樣品(約4μg)和PVDF對照樣品均用Hewlett-Packard Protein Chemistrystation進(jìn)行烷化。PVDF條在50℃下氬氣的環(huán)境中用含有10mM二硫蘇糖醇用pH8.3的6M胍處理，隨后用溶于同樣溶媒的2M丙烯酰胺進(jìn)行烷化。PVDF條接著置于含有100ng修飾的豬胰蛋白酶(Promega，Madison，WI)、1％氫化的Triton X-100、10％乙腈、20mM碳酸氫銨和5mM碳酸銨(pH 8)的溶液中。接著在40℃溫育4小時(shí)，向反應(yīng)混合物另加100ng胰酶繼續(xù)溫育到總共12小時(shí)。將溶液上RP-18柱(EMScience，Hawthorne，NY)，接著在進(jìn)行HPLC分析前用1ml 2％三氟乙酸(TFA)洗柱。
實(shí)施例2分離苯丙氨酸氨基變位酶cDNARNA的提取從在營養(yǎng)培養(yǎng)基(對照)和生產(chǎn)培養(yǎng)基(誘導(dǎo))生長6天的紫杉細(xì)胞中提取RNA。用Qiagen，Inc.(Valencia，CA)的RNA提取試劑盒按照產(chǎn)品說明提取總RNA，其中兩處有所修改。提取緩沖液的體積增加兩倍以保證說明書上建議的組織重量與緩沖液體積的比例。按照Levinsohn等人(Plant Mol.Bio.Rep.1994 12(1)20-25)用10％乙醇沉淀來去除多聚糖雜質(zhì)。按照產(chǎn)品說明書用Qiagen，Inc.(Valencia，CA)的乳膠珠分離得到Poly A RNA。
載體cDNA文庫的構(gòu)建，噬菌體DNA的分離以及RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增)cDNA文庫的構(gòu)建用Stratagene(La Jolla，CA)的cDNA合成試劑盒以5μg誘導(dǎo)mRNA按產(chǎn)品說明書合成載體cDNA。用Ausubel等人(分子生物學(xué)的當(dāng)前方案當(dāng)前方案1987卷11.13.7)中描述的方法將含有紫杉cDNA的細(xì)菌噬菌體DNA從大腸肝菌DNA雜質(zhì)中分離出來。用MARATHONTMcDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech，Palo Alto，CA)以1μg誘導(dǎo)的poly A RNA按照產(chǎn)品說明書構(gòu)建RACE文庫。
PCR方案和DNA測序用Taq DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR采用RACE文庫為模板，用ADVANTAGETM2 PCR試劑盒Clontech，Palo Alto，CA)按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。DNA測序用ABIPRISMBig DyeTM終止循環(huán)測序試劑盒(Applied Biosystem，F(xiàn)osterCity，CA)按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。
實(shí)施例3通過給生產(chǎn)培養(yǎng)基補(bǔ)加DL-β-苯丙氨酸和苯甲酸來提高紫杉醇的生物合成將紅豆杉植物細(xì)胞以200克/L的密度接種到生產(chǎn)培養(yǎng)基中。采用以下兩步進(jìn)行培養(yǎng)。
首先用含有1或5mM的DL-β-苯丙氨酸的TAXOL生產(chǎn)培養(yǎng)基進(jìn)行分批培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含培養(yǎng)基N另加上α-萘乙酸、3，4-(亞甲二氧基)肉桂酸、茉莉酮酸甲酯和硫代硫酸銀(WO97/44476)。未加入DL-β-苯丙氨酸的生產(chǎn)培養(yǎng)基作為對照。連續(xù)五周每周收集樣品用高壓液相色譜法(HPLC)分析。
第二個(gè)培養(yǎng)步驟是補(bǔ)料分批培養(yǎng)，它最開始使用的培養(yǎng)基中含1.2X強(qiáng)度的缺乏谷氨酰胺的培養(yǎng)基N，另加上3，4-(亞甲氧基)肉桂酸和硫代硫酸銀(WO97/44476)。接著從第3天到第35天添加甲基茉莉酮酸酯、α-萘乙酸、谷氨酰胺和DL-β-苯丙氨酸。按5ml/L/天的添加比例每三到四天添加一次。在五周的生產(chǎn)期內(nèi)添加的DL-β-苯丙氨酸總量是2.2mmol/L。用缺乏DL-β-苯丙氨酸的補(bǔ)料溶液進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)作為對照。同時(shí)也進(jìn)行使用DL-β-苯丙氨酸以及苯甲酸的補(bǔ)料分批培養(yǎng)。在五周的生產(chǎn)期內(nèi)補(bǔ)加的DL-β-苯丙氨酸和苯甲酸總量都是2.2mmol/L。在第2、3、4和5周末取樣作HPLC分析。
實(shí)施例4在大腸桿菌表達(dá)體系中表達(dá)苯丙氨酸氨基變位酶為在大腸桿菌中表達(dá)苯丙氨酸氨基變位酶，將cDNA(SEQ ID NO1)亞克隆到pBMS2000大腸桿菌蛋白表達(dá)載體并且接著轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株Epicurian coliXL1-Blue(Stratagene，La Jolla，CA)。接下來通過NdeI、BamHI酶切來確認(rèn)克隆的正確，將質(zhì)粒命名為pPAM2000而且開始苯丙氨酸氨基變位酶cDNA的蛋白表達(dá)。
將含有pPAM2000或pBMS2000的XL1-Blue細(xì)胞培養(yǎng)過夜并接種到新鮮的LB培養(yǎng)基上30℃下培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物的光密度為0.5-1.0時(shí)，加入100μM IPTG誘導(dǎo)它們合成苯丙氨酸氨基變位酶蛋白。以5000×g離心10分鐘的條件下收集菌體，在檢測緩沖液(50mM Tris pH7.5)中洗滌，重懸于檢測緩沖液。用超聲裂解菌體(2×20脈沖，冰上)。加入L-α-苯丙氨酸檢測酶活。樣品在18℃下反應(yīng)過夜后加乙醇終止。樣品16,000g下離心10分鐘。上清轉(zhuǎn)移到HPLC儀上分析L-β-苯丙氨酸的產(chǎn)量。此HPLC法使用μBONDAPAKTMC18柱(Millipore，Milford，MA)和反相的層析，水(A)對乙酰腈(B)梯度變化為1分鐘后0％到20％B、6分鐘20％到30％B、再1分鐘30％到90％B。L-α-苯丙氨酸在5.2分鐘洗脫而L-β-苯丙氨酸在4.9分鐘洗脫。在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，重組PAM產(chǎn)生了694和483ng的β-苯丙氨酸/mg大腸桿菌蛋白，而含有pBMS2000的大腸桿菌提取物沒有合成足可檢測到的β-苯丙氨酸。
權(quán)利要求
1.從植物細(xì)胞純化苯丙氨酸氨基變位酶的方法，包括(a)制備植物細(xì)胞粗提物；(b)從粗提物中沉淀出蛋白；(c)通過以下步驟將苯丙氨酸氨基變位酶與其它沉淀的蛋白分離開(i)在Mg2+存在下將含有沉淀的蛋白和pH7.0的緩沖液的溶液用親和色譜處理；(ii)通過超濾法透析步驟(i)中的流出及洗滌得到的級(jí)分，使緩沖液變?yōu)閜H至少達(dá)到9.0的緩沖液；并且(iii)對步驟(ii)中透析和超濾獲得的級(jí)分進(jìn)行親和色譜分離；并且(d)將經(jīng)步驟(iii)親和色譜處理得到的純化的苯丙氨酸氨基變位酶用含有0.1M NaCl的緩沖液洗脫下來。
2.純化的苯丙氨酸氨基變位酶。
3.權(quán)利要求2的純化的苯丙氨酸氨基變位酶，其中所述酶是從紫杉屬物種分離的。
4.含有SEQ ID NO2的權(quán)利要求2的純化的苯丙氨酸氨基變位酶。
5.編碼苯丙氨酸氨基變位酶的分離的核酸序列。
6.含有SEQ ID NO1、3、4或5或其片段或變型的權(quán)利要求5的分離的核酸序列。
7.權(quán)利要求5的分離的核酸序列，其中苯丙氨酸氨基變位酶含有SEQ ID NO2或其片段或其變型。
8.含有權(quán)利要求5的核酸序列的載體。
9.表達(dá)權(quán)利要求8的載體的宿主細(xì)胞。
10.分離毗鄰苯丙氨酸氨基變位酶基因的調(diào)控基因組序列的方法，包括(a)在基因中鑒定權(quán)利要求5的分離的核酸序列；并且(b)分離與所鑒定的序列毗鄰的基因組序列。
11.鑒定物種中苯丙氨酸氨基變位酶基因的方法，包括將得自所述物種的DNA或RNA與能夠同權(quán)利要求5的分離的核酸序列雜交的探針接觸。
12.鑒定編碼與野生型苯丙氨酸氨基變位酶相比生物催化活性改變的蛋白的突變型苯丙氨酸氨基變位酶基因的方法，包括(a)使權(quán)利要求5的分離的核酸序列突變；(b)表達(dá)由此突變型分離的核酸序列編碼的多肽；并且(c)將表達(dá)的多肽的生物催化特性與野生型苯丙氨酸氨基變位酶的同樣生物催化特性相比較。
13.改變植物細(xì)胞培養(yǎng)物生物合成化合物的方法，包括改變植物細(xì)胞培養(yǎng)物中的苯丙氨酸氨基變位酶的水平或活性。
14.權(quán)利要求13的方法，其中通過用含有苯丙氨酸氨基變位酶的核酸序列的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞培養(yǎng)物來提高苯丙氨酸氨基變位酶的水平。
15.權(quán)利要求13的方法，其中植物細(xì)胞培養(yǎng)物包括紫杉屬物種，并且生物合成的化合物包括紫杉烷類和紫杉烷類相關(guān)化合物。
16.改變植物細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的紫杉烷類和紫杉烷類相關(guān)化合物水平的方法，包括用β-苯丙氨酸培養(yǎng)植物細(xì)胞。
17.權(quán)利要求16的方法，所述方法還包括用苯甲酸或其鹽培養(yǎng)植物細(xì)胞。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其中植物細(xì)胞培養(yǎng)物所產(chǎn)生的紫杉烷類水平得到增加。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述紫杉烷類為紫杉醇。
20.改變植物細(xì)胞培養(yǎng)物中紫杉醇與漿果赤霉素III的比例的方法，包括用β-苯丙氨酸培養(yǎng)植物細(xì)胞。
21.權(quán)利要求20的方法，所述方法還包括用苯甲酸或其鹽培養(yǎng)植物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了苯丙氨酸氨基變位酶的分離的核酸和氨基酸序列以及純化此酶的方法。本發(fā)明還提供了改變植物細(xì)胞培養(yǎng)物中化合物生物合成的方法。本發(fā)明尤其提供了改變紫杉烷類和紫杉烷類相關(guān)化合物的生產(chǎn)的方法。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1871357SQ03807679
公開日2006年11月29日 申請日期2003年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月8日
發(fā)明者C·L·斯特勒, 陳宜俊, B·A·杜赫爾蒂, S·霍夫斯蒂, 林劍聲, 李文瑩, 邢自琢 申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司