專利名稱：抗ccr5抗體的制作方法
本申請是2002年2月22日提交的美國申請序列號10/081,128的部分繼續(xù)申請并要求其優(yōu)先權(quán)，在此將其內(nèi)容結(jié)合于本申請作為參考。
貫穿本申請，以阿拉伯?dāng)?shù)字提及了多份出版物。在緊鄰權(quán)利要求之前的說明書末尾可以找到這些出版物的完整引述。在此將這些出版物的公開內(nèi)容結(jié)合于本申請作為參考，從而更加完整的描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)誘導(dǎo)病毒-細(xì)胞膜融合，從而能夠進(jìn)入靶細(xì)胞(8，15，66)。病毒粒體與細(xì)胞表面之間的第一步高親和力相互作用是病毒表面糖蛋白gp120結(jié)合CD4抗原(13，30，41，42)，繼而誘導(dǎo)gp120的構(gòu)象變化，使之能夠與幾種趨化因子受體之一相互作用(4，5，21，36)。CC趨化因子受體CCR5是巨噬細(xì)胞向性(R5)毒株的主要輔助受體(co-receptor)，并且在HIV-1的有性傳播中發(fā)揮關(guān)鍵作用(4，5，21，36)。T細(xì)胞系向性(X4)病毒利用CXCR4進(jìn)入靶細(xì)胞，并且常常而非總是在疾病進(jìn)展中較晚顯現(xiàn)或者作為組織培養(yǎng)中病毒繁殖的結(jié)果(4，5，21，36)。有些原代HIV-1分離株具有雙重向性(R5X4)，因?yàn)樗鼈兡軌蚶眠@兩種輔助受體，盡管效率并非總是相同(11，57)。偶聯(lián)gp120核晶體結(jié)構(gòu)解析的誘變研究證明gp120上的輔助受體結(jié)合位點(diǎn)包含幾個保守殘基(32，53，65)。
已經(jīng)證明CCR5氨基末端結(jié)構(gòu)域(Nt)的酪氨酸和帶負(fù)電殘基是gp120結(jié)合輔助受體以及HIV-1融合和侵入所必需的(6，18，20，22，28，31，52，54)。CCR5胞外環(huán)(ECL)1-3中的殘基不是輔助受體功能所必需的，然而，為了實(shí)現(xiàn)最佳病毒融合和侵入，必需維持CCR5結(jié)構(gòu)域間構(gòu)型(24)。從而得出結(jié)論gp120與ECL的擴(kuò)散表面形成相互作用，或者通過與ECL中殘基的鍵合來維持Nt的功能構(gòu)象。嵌合輔助受體與抗CCR5單克隆抗體的研究也顯示了胞外環(huán)對病毒侵入的重要性(5，54，64)。
特異結(jié)合CCR5和CXCR4并阻斷與其配體相互作用的分子是進(jìn)一步探查輔助受體結(jié)構(gòu)/功能相互關(guān)系的有效工具。鑒定這些化合物也有助于設(shè)計(jì)靶向由輔助受體介導(dǎo)的病毒侵入步驟的有效治療劑。至今鑒定的CCR5或CXCR4輔助受體功能抑制劑在本質(zhì)上是多樣的，包括小分子、肽、趨化因子及其衍生物、和單克隆抗體(mAb)。通過干預(yù)CXCR4輔助受體功能而阻斷侵入的小分子的作用機(jī)制尚未深入理解(17，49，55，68)。這樣的一種抑制劑即陰離子小分子AMD3100依賴CXCR4的ECL2和第四個跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域中的殘基來抑制病毒侵入，但是尚不清楚它是通過破壞gp120結(jié)合CXCR4還是通過導(dǎo)致膜融合的結(jié)合后步驟來實(shí)現(xiàn)的(16，34，55)。至今尚無報(bào)道特異阻斷由CCR5介導(dǎo)的HIV-1侵入的小分子。趨化因子抑制HIV-1侵入是由至少兩種不同機(jī)制介導(dǎo)的gp120/輔助受體相互作用的阻斷和趨化因子/受體復(fù)合物的內(nèi)在化(3，26，59，63)。變體AOP-RANTES也抑制CCR5循環(huán)至細(xì)胞表面(40，56)。變體諸如RANTES9-68和Met-RANTES只防止gp120/CCR5相互作用，而并不下調(diào)CCR5(67)。SDF-1變體大概通過相似機(jī)制作用而阻斷由CXCR4介導(dǎo)的病毒侵入(12，27，39)。只有一種抗CXCR4單抗即12G5已經(jīng)鑒定了其抗病毒特性。已經(jīng)報(bào)道了12G5抑制病毒侵入的效率既依賴細(xì)胞又依賴分離株(43，58)。這種單抗結(jié)合CXCR4的ECL2，但是尚不知道它抑制侵入的機(jī)制(7)。至今鑒定的少數(shù)抗CCR5單抗有效預(yù)防HIV-1侵入(28，64)。有趣的是，表位位于CCR5Nt結(jié)構(gòu)域(包含gp120結(jié)合位點(diǎn))中的單抗抑制病毒融合和侵入的效率不如表位位于ECL2中的單抗2D7。2D7還拮抗CC趨化因子活性(64)。
已經(jīng)分離和鑒定了一組六種鼠單抗，命名為PA8、PA9、PA10、PA11、PA12和PA14。所有六種單抗都特異結(jié)合CCR5+細(xì)胞，但是效率不同且依賴細(xì)胞類型。表位作圖研究確定了對單抗結(jié)合重要的殘基，還揭示了關(guān)于折疊和CCR5胞外結(jié)構(gòu)域相互作用的信息。所有單抗都抑制HIV-1融合和侵入，但是在單抗抑制融合和侵入的能力與其抑制gp120/sCD4結(jié)合CCR5+細(xì)胞的能力之間沒有關(guān)聯(lián)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了抗CCR5抗體或其結(jié)合人類細(xì)胞表面上CCR5的片段，所述抗體包含(i)兩條輕鏈，每條輕鏈包含質(zhì)粒pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)的表達(dá)產(chǎn)物，和(ii)兩條重鏈，每條重鏈包含質(zhì)粒pVg1HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)的表達(dá)產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供了包含兩條輕鏈和兩條重鏈的抗CCR5抗體，其中每條輕鏈包含連續(xù)氨基酸，其氨基酸序列在SEQ ID NO6中列出，每條重鏈包含連續(xù)氨基酸，其氨基酸序列在SEQ ID NO9中列出。
本發(fā)明還提供了包含兩條輕鏈和兩條重鏈的抗CCR5抗體，其中每條輕鏈包含連續(xù)氨基酸，其氨基酸序列在SEQ ID NO6中列出，每條重鏈包含連續(xù)氨基酸，其氨基酸序列在SEQ ID NO12中列出。
本發(fā)明還提供了編碼包含連續(xù)氨基酸的多肽的分離核酸，SEQ IDNO6列出了其氨基酸序列。在本實(shí)施方案中，核酸包含SEQ ID NO5所列出的序列。
本發(fā)明還提供了編碼包含連續(xù)氨基酸的多肽的分離核酸，SEQ IDNO9列出了其氨基酸序列。在本實(shí)施方案中，核酸包含SEQ ID NO8所列出的序列。
本發(fā)明還提供了編碼包含連續(xù)氨基酸的多肽的分離核酸，SEQ IDNO12列出了其氨基酸序列。在本實(shí)施方案中，核酸包含SEQ ID NO11所列出的序列。
本發(fā)明還提供了包含至少一種上文所述的抗CCR5抗體或其片段以及載體的組合物。
本發(fā)明還提供了包含抗CCR5抗體或其片段且其附著于諸如放射性同位素、毒素、聚乙二醇、細(xì)胞毒性試劑和/或可檢測標(biāo)記物等材料的組合物。
本發(fā)明還提供了抑制CD4+細(xì)胞的HIV-1感染的方法，包括使CD4+細(xì)胞接觸抗CCR5抗體或其結(jié)合CD4+細(xì)胞表面上CCR5的片段，這些抗體包含(i)兩條輕鏈，每條輕鏈包含質(zhì)粒pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)的表達(dá)產(chǎn)物，和(ii)兩條重鏈，每條重鏈包含質(zhì)粒pVg1HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)的表達(dá)產(chǎn)物，接觸的數(shù)量和條件使得HIV-1或HIV-1感染細(xì)胞與CD4+細(xì)胞的融合得到抑制，從而抑制CD4+細(xì)胞的HIV-1感染。
本發(fā)明還提供了治療受HIV-1之苦的受試者的方法，包括對受試者施用有效HIV-1治療劑量的抗CCR5抗體或其結(jié)合人類細(xì)胞表面上CCR5的片段，這些抗體包含(i)兩條輕鏈，每條輕鏈包含質(zhì)粒pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)的表達(dá)產(chǎn)物，和(ii)兩條重鏈，每條重鏈包含質(zhì)粒pVg1HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)的表達(dá)產(chǎn)物，施用的條件使得有效治療HIV-1感染受試者。
本發(fā)明還提供了預(yù)防受試者免于感染HIV-1感染的方法，包括對受試者施用有效HIV-1感染預(yù)防劑量的抗CCR5抗體或其結(jié)合人類細(xì)胞表面上CCR5的片段，這些抗體包含(i)兩條輕鏈，每條輕鏈包含質(zhì)粒pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)的表達(dá)產(chǎn)物，和(2)兩條重鏈，每條重鏈包含質(zhì)粒pVg1HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)的表達(dá)產(chǎn)物，施用的條件使得在受試者中有效預(yù)防HIV-1感染。
本發(fā)明還提供了包含抗CCR5抗體或其結(jié)合人類細(xì)胞表面上CCR5的片段且其偶聯(lián)至少一種聚合物的抗CCR5抗體偶聯(lián)物，所述抗體包含(i)兩條輕鏈，每條輕鏈包含質(zhì)粒pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)的表達(dá)產(chǎn)物，和(ii)兩條重鏈，每條重鏈包含質(zhì)粒pVg1HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)的表達(dá)產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供了抑制HIV-1感染CCR5+細(xì)胞的方法，包括對有HIV-1感染風(fēng)險(xiǎn)的受試者施用上文所述偶聯(lián)物，施用的數(shù)量和條件有效抑制HIV-1感染受試者的CCR5+細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了治療受試者中的HIV-1感染的方法，包括對HIV-1感染受試者施用上文所述偶聯(lián)物，施用的數(shù)量和條件有效治療受試者的HIV-1感染。
本發(fā)明還提供了包含至少兩種載體的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中至少一種載體包含編碼抗CCR5抗體重鏈的核酸序列，且至少一種載體包含編碼抗CCR5抗體輕鏈的核酸序列，其中抗CCR5抗體包含具有SEQ ID NO9所列出的氨基酸序列的兩條重鏈和具有SEQ ID NO6所列出的氨基酸序列的兩條輕鏈。
本發(fā)明還提供了包含至少兩種載體的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中至少一種載體包含編碼抗CCR5抗體重鏈的核酸序列，且至少一種載體包含編碼抗CCR5抗體輕鏈的核酸序列，其中抗CCR5抗體包含具有SEQ ID NO12所列出的氨基酸序列的兩條重鏈和具有SEQ ID NO6所列出的氨基酸序列的兩條輕鏈。
本發(fā)明還提供了包含編碼抗CCR5抗體重鏈的核酸序列的載體，其中重鏈包含SEQ ID NO9所列出的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了包含編碼抗CCR5抗體重鏈的核酸序列的載體，其中重鏈包含SEQ ID NO12所列出的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)抗CCR5抗體的方法，包括在容許生產(chǎn)抗體的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞從而生產(chǎn)抗CCR5抗體，所述宿主細(xì)胞包含(i)質(zhì)粒pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)，和(ii)質(zhì)粒pVg1HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)，所述抗體包含由質(zhì)粒pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)編碼的兩條輕鏈和由質(zhì)粒pVg1HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)編碼的兩條重鏈。
本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)抗CCR5抗體的方法，包括a)用(i)質(zhì)粒pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)和(ii)質(zhì)粒pVg1HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；并b)在容許生產(chǎn)抗體的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞從而生產(chǎn)抗CCR5抗體，所述抗體包含由質(zhì)粒pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)編碼的兩條輕鏈和由質(zhì)粒pVg1HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)編碼的兩條重鏈。
本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)抗CCR5抗體的方法中的試劑盒，包含a)包含編碼抗CCR5抗體輕鏈的核酸序列的載體，其中輕鏈包含SEQ ID NO6所列出的氨基酸序列；和b)包含編碼抗CCR5抗體重鏈的核酸序列的載體，其中重鏈包含SEQ ID NO9所列出的氨基酸序列，或者包含編碼抗CCR5抗體重鏈的核酸序列的載體，其中重鏈包含SEQ ID NO12所列出的氨基酸序列。
附圖簡述

圖1抗CCR5單克隆抗體與CCR5+細(xì)胞的結(jié)合使用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)來檢測L1.2-CCR5+細(xì)胞和新鮮分離的PHA/IL-2刺激PBMC表面的CCR5蛋白質(zhì)表達(dá)。將細(xì)胞與飽和濃度的每種mAb一起溫育，并用PE標(biāo)記的抗小鼠IgG報(bào)道抗體進(jìn)行檢測。顯示了來自代表性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。每種mAb的結(jié)果表述成平均熒光強(qiáng)度(m.f.i.)和選通細(xì)胞％兩種形式。由于PA8-PA12及PA14都屬于IgG1亞類，因此可以直接比較它們的m.f.i.。2D7屬于IgG2a。
圖2不同mAb與病毒抑制劑組合的CI值對病毒侵入抑制劑的不同組合進(jìn)行像圖7圖例中所描述的實(shí)驗(yàn)。測試抗CCR5 mAb彼此、與CC趨化因子、和CD4-IgG2(抑制HIV-1附著于靶細(xì)胞)的組合。PA11和PA12濃度范圍為0-250μg/ml；2D7和PA14濃度范圍為0-25μg/ml；RANTES濃度范圍為0-250ng/ml；CD4-IgG2濃度范圍為0-25μg/ml。在數(shù)量上比較產(chǎn)生50％和90％融合或侵入抑制所需要的單一試劑或其混合物的濃度即稱為聯(lián)合指數(shù)(Combination Index，CI)的術(shù)語。
圖3抗CCR5 mAb抑制細(xì)胞-細(xì)胞融合、病毒侵入和gp120/sCD4結(jié)合的IC50值出于比較目的，我們總結(jié)了在測試抗CCR5 mAb的不同測定中獲得的IC50值。只對能夠抑制＞90％融合、侵入或結(jié)合的mAb計(jì)算IC50值。
圖4抗CCR5 mAb的表位制圖將雙色染色方案用于評估m(xù)Ab與C末端以HA肽標(biāo)記的突變體CCR5蛋白質(zhì)的結(jié)合。將表達(dá)CCR5點(diǎn)突變體的HeLa細(xì)胞與飽和濃度的每種mAb一起溫育，隨后檢測經(jīng)PE標(biāo)記的抗小鼠IgG。通過用FITC標(biāo)記抗HA mAb雙重染色細(xì)胞來測量細(xì)胞表面的輔助受體表達(dá)。四個柵格對應(yīng)于CCR5的四個胞外結(jié)構(gòu)域。每個柵格的第一行指示相應(yīng)CCR5胞外結(jié)構(gòu)域的氨基序列(SEQ ID NO1-4)?？笴CR5 mAb與每個殘基的丙氨酸突變體的結(jié)合表述成與野生型CCR5結(jié)合的百分比，正如測量和方法中所述。
圖5抗CCR5 mAb對進(jìn)入CCR5+細(xì)胞的鈣轉(zhuǎn)移的抑制將L1.2-CCR5+細(xì)胞加載吲哚-1AM繼而用抗CCR5mAb或PBS進(jìn)行刺激，隨后是RANTES(a)。使用分光熒光計(jì)測量熒光變化，追蹤(tracing)來自代表性實(shí)驗(yàn)。對PA14和2D7測試廣泛mAb濃度的鈣流抑制(b)。將結(jié)果繪圖鈣流抑制％＝[1-(存在mAb時的相對熒光÷不含mAb時的相對熒光)]×100％，并由三次獨(dú)立試驗(yàn)取平均值。
圖6CCR5 mAb對CCR5輔助受體功能的抑制在RET測定法中測試抗CCR5 mAb對細(xì)胞-細(xì)胞融合的抑制(a)。將0-250μg/ml PA8-PA12或0-25μg/ml PA14或2D7加到分別經(jīng)F18和R18標(biāo)記的HeLa-EnvJR-FL+細(xì)胞與PM1細(xì)胞混合物中。溫育4小時后測量熒光RET。結(jié)果是來自三次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值，并表述成融合抑制％＝[1-(存在mAb時的％RET÷不含mAb時的％RET)]×100％。在單輪基于復(fù)制熒光素酶的侵入測定法中測試抗CCR5 mAb對HIV-1侵入的抑制(b)。在存在0-250μg/ml PA8-PA12或0-25μg/ml PA14或2D7時用攜帶JR-FL包膜的NLluc+env-報(bào)道病毒感染U87-CD4+CCR5+細(xì)胞。感染后72小時測量細(xì)胞裂解物中的熒光素酶活性(相對光單位，r.l.u.)。結(jié)果來自代表性試驗(yàn)，并表述成侵入抑制％＝[1-(存在mAb時的r.l.u.÷不含mAb時的r.l.u.)]×100％。生物素化[b]gp120、sCD4和b-gp120-CD4復(fù)合物與L1.2-CCR5+細(xì)胞的結(jié)合(c)。當(dāng)衍生自R5病毒HIV-1JR-FL的gp120與等摩爾量的sCD4復(fù)合時觀察到強(qiáng)結(jié)合。在不含sCD4或衍生自X4病毒HIV-1LAI的gp120時沒有觀察到結(jié)合。由所有曲線扣除CCR5-L.1.2細(xì)胞的背景結(jié)合。測試存在不同濃度每種抗體時對gp120/sCD4結(jié)合L1.2-CCR5+細(xì)胞的抑制(d)。在96孔板中將細(xì)胞與抗CCR5 mAb一起預(yù)溫育，隨后與飽和濃度的生物素化gp120/sCD4一起溫育。最后，使用熒光讀板器測量PE標(biāo)記鏈霉親和素與細(xì)胞的結(jié)合。結(jié)果來自代表性試驗(yàn)，并表述成gp120/sCD4結(jié)合抑制百分比＝[1-(存在mAb時的m.f.i.÷不含mAb時的m.f.i.)]×100％。
圖7PA12和2D7對細(xì)胞-細(xì)胞融合的協(xié)同抑制獲得了mAb單獨(dú)和聯(lián)合使用時的劑量應(yīng)答曲線。將0-50μg/ml PA12、0-25μg/ml 2D7、或這兩種抗體的2∶1比例聯(lián)合加到分別經(jīng)R18和F18標(biāo)記的HeLa-EnvJR-FL+細(xì)胞與PM1細(xì)胞混合物中。溫育4小時后測量熒光RET。結(jié)果表述成融合抑制百分比，而且是三次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值。使用中值效應(yīng)(median effect)原理分析數(shù)據(jù)，所述原理可以表述成f＝1/[1+(K/c)m](1)其中f是受到影響/抑制的分?jǐn)?shù)，c是濃度，K是產(chǎn)生中值效應(yīng)所需要的試劑濃度，而m是描述劑量應(yīng)答曲線形狀的經(jīng)驗(yàn)系數(shù)。方程(1)是描述Michaelis-Menton酶促動力學(xué)、Langmuir吸收等溫線、和Henderson-Hasselbalch電離平衡的方程的廣義形式，其中m＝1。在目前的情況中，K等于IC50值。通過擬合曲線的劑量應(yīng)答曲線測定K和m，并重排方程(1)以計(jì)算指定f的c。K和c的最佳擬合參數(shù)是8.8μg/ml和0.54(對于PA12而言)、0.36μg/ml和0.68(對于2D7而言)、以及0.11μg/ml和1.1(對于它們的聯(lián)合而言)。將這些曲線繪圖，并指示實(shí)驗(yàn)與理論之間的合理吻合度。
圖8依照本發(fā)明，此圖顯示了人源化形式小鼠抗CCR5抗體PA14輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO6)以及編碼其的核酸序列(SEQ ID NO5)。SEQ ID NO7鑒定了SEQ ID NO5中編碼SEQ ID NO6所列出的氨基酸序列的區(qū)域。此輕鏈可變區(qū)存在于本文稱為PRO 140#1和#2的抗體中?；パa(bǔ)決定區(qū)(“CDR”)標(biāo)有下劃線。
圖9依照本發(fā)明，此圖顯示了人源化形式小鼠抗CCR5抗體PA14重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO9)以及編碼其的核酸序列(SEQ ID NO8)。SEQ ID NO10鑒定了SEQ ID NO8中編碼SEQ ID NO9所列出的氨基酸序列的區(qū)域。此輕鏈可變區(qū)存在于本文稱為PRO 140#2的抗體中。CDR標(biāo)有下劃線。
圖10依照本發(fā)明，此圖顯示了人源化形式小鼠抗CCR5抗體PA14重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO12)以及編碼其的核酸序列(SEQ ID NO11)。SEQ ID NO13鑒定了SEQ ID NO11中編碼SEQ ID NO12所列出的氨基酸序列的區(qū)域。此輕鏈可變區(qū)存在于本文稱為PRO 140#1的抗體中。CDR標(biāo)有下劃線。
圖11有效減少體內(nèi)病毒負(fù)荷的單劑量人源化CCR5抗體用正常人PBMC重建SCID小鼠，并感染HIV-1JR-CSF。在達(dá)到病毒穩(wěn)定狀態(tài)時，用單劑1毫克i.p.劑量的人源化CCR5抗體(PRO 140)或同種型對照抗體處理動物，并監(jiān)測血漿HIV RNA(Roche Amplicor Assay)。
圖12病毒負(fù)荷的持續(xù)減少用正常人PBMC重建SCID小鼠，并感染HIV-1JR-CSF。在達(dá)到病毒穩(wěn)定狀態(tài)時，每三天用0.1mg劑量的人源化CCR5抗體(PRO 140)i.p.處理動物，并監(jiān)測血漿HIV RNA(Roche Amplicor Assay)。
圖13在使用依照本發(fā)明制備的CCR5抗體(PRO 140)時展示沒有淋巴細(xì)胞損耗。
圖14有效阻斷由CCR5介導(dǎo)的HIV-1細(xì)胞-細(xì)胞融合的人源化CCR5抗體(PRO 140)使用互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植和框架替代方法人源化鼠CCR5抗體。在Sp2/0細(xì)胞中表達(dá)人源化CCR5抗體(PRO 140#1和PRO 140#2)，通過蛋白A層析進(jìn)行純化，并如Litwin等，J.Virol.，706437，1996中所述測試阻斷由HIV-1JR-FLenv介導(dǎo)的膜融合復(fù)制的能力。
圖15人源化CCR5抗體(PRO 140)介導(dǎo)有效的、不依賴亞型的HIV-1抑制如Trkola等，J.Virol.，72396，1998中所述對依照本發(fā)明的CCR5抗體(PRO 140#1和#2)測試阻斷野生型HIV-1在外周血單核細(xì)胞(PBMC)中復(fù)制的能力。通過測定7天PBMC培養(yǎng)物上清液中的p24抗原含量來測量病毒復(fù)制程度。
圖16此圖提供了編碼圖8中所示輕鏈可變區(qū)以及Co等，J.Immunol.，1481149，1992中所述人κ恒定區(qū)的質(zhì)粒pVK-HuPRO140的圖譜。
圖17此圖提供了編碼圖9中所示重鏈可變區(qū)以及Co等，見上文中所述人IgG4的人重鏈恒定區(qū)、CH1、鉸鏈、CH2、和CH3的質(zhì)粒pVg4-HuPRO140HG2的圖譜。
圖18此圖提供了編碼圖10中所示重鏈可變區(qū)以及Co等，見上文中所述人IgG4的人重鏈恒定區(qū)、CH1、鉸鏈、CH2、和CH3的質(zhì)粒pVg4-HuPRO140(mut B+D+I)的圖譜。
圖19Hu PRO140阻斷HIV-1而非RANTES信號對依照本發(fā)明的PRO140抗體測試在L1.2-CCR5細(xì)胞中阻斷由RANTES誘導(dǎo)的鈣轉(zhuǎn)移的能力(Olson等人，J.Virol.，72396，1998)。此圖顯示了人源化CCR5抗體(huPRO140)阻斷HIV-1而非RANTES信號。
發(fā)明詳述分別命名為HuPRO140-VK、HuPRO140(mut+B+D+I)-VH和HuPRO140 HG2-VH且在圖16、18和17中稱為pVK-HuPRO140、pVg4-HuPRO140(mut B+D+I)-VH和pVg4-HuPRO140 HG2的質(zhì)粒于2002年2月22日保藏于美國弗吉尼亞州馬納薩斯(20108)的美國典型培養(yǎng)物收藏中心(American Type Culture Collection)，ATCC編號分別為PTA 4097、PTA 4099和PTA 4098。這些保藏物遵循布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)關(guān)于出于專利程序目的的微生物保藏物的國際公認(rèn)的條款。
本發(fā)明提供了用于抑制HIV-1感染的組合物，所述組合物包含對于抑制HIV-1感染而言協(xié)同有效量的至少兩種化合物，其中至少一種化合物預(yù)防HIV-1與HIV-1融合輔助受體之間的生產(chǎn)性相互作用。
在用于本文時，“組合物”指混合物。組合物包括但不限于那些適合于口服、直腸、陰道內(nèi)、局部、鼻腔、視網(wǎng)膜、或腸胃外施用于受試者的組合物。在用于本文時，“腸胃外”包括但不限于皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、或膜內(nèi)注射或輸注技術(shù)。
在用于本文時，“HIV-1”指1型人類免疫缺陷病毒。HIV-1包括但不限于胞外病毒顆粒和在HIV-1感染細(xì)胞中找到的HIV-1形式。
在用于本文時，“HIV-1感染”指將HIV-1遺傳信息導(dǎo)入靶細(xì)胞，諸如通過靶細(xì)胞膜與HIV-1或HIV-1包膜糖蛋白+細(xì)胞的融合。靶細(xì)胞可以是受試者的體細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是來自人類受試者的體細(xì)胞。
在用于本文時，“抑制HIV-1感染”指與不使用所述組合物時導(dǎo)入的量相比導(dǎo)入靶細(xì)胞群的HIV-1遺傳信息的量得到減少。
在用于本文時，“化合物”指分子實(shí)體，包括但不限于肽、多肽、和其它有機(jī)或無機(jī)分子及其組合。
在用于本文時，“協(xié)同有效”指化合物聯(lián)合使用時的聯(lián)合效應(yīng)大于它們分別使用時的效果的總和。
在用于本文時，“生產(chǎn)性相互作用”指HIV-1與HIV-1輔助受體的相互作用將導(dǎo)致所述HIV-1或HIV-1包膜糖蛋白+細(xì)胞與含有輔助受體的膜的融合。
在用于本文時，“預(yù)防生產(chǎn)性相互作用”指與不使用化合物時存在的量相比相互作用的量得到了降低。可以通過掩飾或改變輔助受體或HIV-1上的相互作用區(qū)域或者通過改變輔助受體的表達(dá)、聚集、構(gòu)象、或聯(lián)合狀態(tài)來預(yù)防相互作用。
在用于本文時，“HIV-1融合輔助受體”指介導(dǎo)表達(dá)受體的靶細(xì)胞與HIV-1或HIV-1包膜糖蛋白+細(xì)胞之間融合的細(xì)胞受體。HIV-1融合輔助受體包括但不限于CCR5、CXCR4和其它趨化因子受體。
本發(fā)明還提供了抑制HIV-1或HIV-1包膜糖蛋白+細(xì)胞與靶細(xì)胞融合的組合物，所述組合物包含對于抑制HIV-1或HIV-1包膜糖蛋白+細(xì)胞與靶細(xì)胞融合而言協(xié)同有效量的至少兩種化合物，其中至少一種化合物預(yù)防HIV-1與HIV-1融合輔助受體之間的生產(chǎn)性相互作用。
在用于本文時，“融合”指在哺乳動物細(xì)胞或諸如HIV-1的病毒上發(fā)現(xiàn)的脂雙層膜的連接或聯(lián)合。該過程不同于HIV-1附著于靶細(xì)胞。附著是由HIV-1外部糖蛋白結(jié)合人CD4受體(并非融合輔助受體)介導(dǎo)的。
在用于本文時，“抑制”指與不使用組合物時存在的量相比量得到了降低。
在用于本文時，“靶細(xì)胞”指能夠被HIV-1或HIV-1感染細(xì)胞感染或融合的細(xì)胞。
在用于本文時，“趨化因子”指能夠刺激白細(xì)胞運(yùn)動的細(xì)胞因子。根據(jù)兩個氨基末端半胱氨酸殘基是直接毗鄰或是由一個氨基酸分開，它們可以表征為cys-cys或cys-X-cys。它包括但不限于RANTES、MIP-1α、MIP-1β、SDF-1或阻斷HIV-1感染的另一種趨化因子。
在上述組合物的一個實(shí)施方案中，輔助受體是趨化因子受體。在上述組合物的優(yōu)選實(shí)施方案中，趨化因子受體是CCR5或CXCR4。已知發(fā)揮HIV輔助受體功能的其它幾種趨化因子和相關(guān)受體包括但不限于CCR2、CCR3、CCR8、STRL33、GPR-15、CX3CR1和APJ(69)。
在用于本文時，“趨化因子受體”指結(jié)合趨化因子的七個跨膜細(xì)胞表面蛋白同源家族的成員。
在用于本文時，“CCR5”指結(jié)合趨化因子C-C組的成員且其氨基酸序列包含Genbank編號1705896所提供的氨基酸序列的趨化因子受體及其相關(guān)多態(tài)性變體。
在用于本文時，“CXCR4”指結(jié)合趨化因子C-X-C組的成員且其氨基酸序列包含Genbank編號400654所提供的氨基酸序列的趨化因子受體及其相關(guān)多態(tài)性變體。
在上述組合物的一個實(shí)施方案中，至少一種化合物是非肽分子。在一個實(shí)施方案中，非肽分子是雙磺酸鈉(bicyclam)化合物AMD3100(16)。
在用于本文時，“非肽分子”指不是完全由通過肽鍵相連的氨基酸線性序列構(gòu)成的分子。然而，非肽分子可以包含一個或多個肽鍵。
在上述組合物的一個實(shí)施方案中，至少一種化合物是抗體。在一個實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。在另一個實(shí)施方案中，抗體是抗趨化因子受體抗體。在一個實(shí)施方案中，抗體是抗-CXCR4抗體。在另一個實(shí)施方案中，抗CXCR4抗體是12G5(43)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體是抗CCR5抗體。抗CCR5抗體包括但不限于PA8、PA9、PA10、PA11、PA12、PA14和2D7。在此組合物中，化合物處于適當(dāng)比例中。比例范圍是1∶1至1000∶1。
單克隆抗體PA8、PA9、PA10、PA11、PA12和PA14于1998年12月2日保藏于美國弗吉尼亞州馬納薩斯大學(xué)大道10801號(20110-2209)的美國典型培養(yǎng)物收藏中心(American Type Culture Collection)，ATCC編號分別為ATCC編號HB-12605(PA8)、ATCC編號HB-12606(PA9)、ATCC編號HB-12607(PA10)、ATCC編號HB-12608(PA11)、ATCC編號HB-12609(PA12)和ATCC編號HB-12610(PA14)，保藏遵循且滿足布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)關(guān)于出于專利程序目的的微生物保藏物的國際公認(rèn)的要求。
在上述組合物的另一個實(shí)施方案中，兩種或多種化合物是抗體。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，抗體包括但不限于PA8、PA9、PA10、PA11、PA12、PA14和2D7。在此組合物中，抗體處于適當(dāng)比例中。比例范圍是1∶1至50∶1。
在用于本文時，“抗體”指包含兩條重鏈和兩條輕鏈并識別抗原的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白分子可以衍生自任何普遍知道的類型，包括但不限于IgA、分泌性IgA、IgG和IgM。IgG亞類同樣是本領(lǐng)域眾所周知的，包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。作為例示，它包括天然發(fā)生的和非天然發(fā)生的兩類抗體。具體而言，“抗體”包括多克隆和單克隆抗體及其單價(jià)和雙價(jià)片段。另外，“抗體”包括嵌合抗體、完全合成的抗體、單鏈抗體及其片段。任選的是，可以用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記抗體。例如，可檢測標(biāo)記物包括放射性或熒光標(biāo)記物?？贵w可以是人的或非人的抗體?？梢酝ㄟ^重組法將非人抗體人源化以降低其在人體內(nèi)的免疫原性。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道用于人源化抗體的方法。
在用于本文時，“單克隆抗體”也稱為mAb，用于描述一級序列基本上相同且展示相同抗原特異性的抗體分子?？梢酝ㄟ^雜交瘤、重組、轉(zhuǎn)基因或本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其它技術(shù)來生產(chǎn)單克隆抗體。
在用于本文時，“抗趨化因子受體抗體”指識別并結(jié)合趨化因子受體上的表位的抗體。在用于本文時，“抗CCR5抗體”指識別并結(jié)合CCR5趨化因子受體上的表位的單克隆抗體。
在用于本文時，“適當(dāng)比例”指協(xié)同有效的化合物的質(zhì)量或摩爾比例。
在上述組合物的一個實(shí)施方案中，至少一種化合物是趨化因子或趨化因子衍生物。趨化因子包括但不限于RANTES、MIP-1α、MIP-1β、SDF-1或其組合。在此組合物中，化合物處于適當(dāng)比例中。趨化因子衍生物包括但不限于Met-RANTES、AOP-RANTES、RANTES 9-68或其組合。
在用于本文時，“趨化因子衍生物”指經(jīng)過化學(xué)修飾的趨化因子?；瘜W(xué)修飾包括但不限于氨基酸替代、添加或刪除、非肽添加或氧化。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠生產(chǎn)這些衍生物。
在上述組合物的另一個實(shí)施方案中，至少一種化合物是抗體且至少一種化合物是趨化因子或趨化因子衍生物。在此組合物中，化合物處于適當(dāng)比例中。比例范圍是100∶1至1000∶1。
在上述組合物的另一個實(shí)施方案中，至少一種化合物結(jié)合HIV-1包膜糖蛋白的gp41亞基。在一個實(shí)施方案中，至少一種化合物是HIV-1侵入的T-20肽抑制劑(70)。
在上述組合物的另一個實(shí)施方案中，至少一種化合物抑制HIV-1附著于靶細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，至少一種化合物結(jié)合CD4。在一個實(shí)施方案中，至少一種化合物是HIV-1包膜糖蛋白。在一個實(shí)施方案中，至少一種化合物是抗CD4抗體。在一個實(shí)施方案中，至少一種化合物結(jié)合HIV-1包膜糖蛋白。在一個實(shí)施方案中，至少一種化合物是針對HIV-1包膜糖蛋白的抗體。在一個實(shí)施方案中，至少一種化合物是基于CD4的蛋白質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，至少一種化合物是CD4-IgG2。
在上述組合物的另一個實(shí)施方案中，至少一種化合物是抗體且至少一種化合物結(jié)合HIV-1包膜糖蛋白。在一個實(shí)施方案中，化合物是基于CD4的蛋白質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，化合物是CD4-IgG2。在此組合物中，化合物處于適當(dāng)比例中。比例范圍是1∶1至10∶1。
在用于本文時，“附著”指由HIV-1包膜糖蛋白結(jié)合人CD4受體(并非融合輔助受體)介導(dǎo)的過程。
在用于本文時，“CD4”指包含一個胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、一個疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和一個結(jié)合HIV-1 gp120包膜糖蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的成熟、天然、膜結(jié)合的CD4蛋白質(zhì)。
在用于本文時，“HIV-1包膜糖蛋白”指包含gp120表面蛋白、gp41跨膜蛋白及其寡聚物和前體的HIV-1編碼蛋白質(zhì)。
在用于本文時，“基于CD4的蛋白質(zhì)”指包含對應(yīng)于CD4中CD4與HIV-1 gp120包膜糖蛋白形成復(fù)合物所必需的那部分的至少一段氨基酸殘基序列的任何蛋白質(zhì)。
在用于本文時，“CD4-IgG2”指由以ATCC編號75193和75194保藏的表達(dá)載體編碼的CD4與人IgG2融合蛋白異四聚物。
在上述組合物的一個實(shí)施方案中，至少一種化合物包含結(jié)合CCR5表位的多肽。在一個實(shí)施方案中，表位位于N末端、三個胞外環(huán)區(qū)域之一或其組合。在一個實(shí)施方案中，表位位于N末端。表位可以包含N末端的N13和Y15。表位可以包含N末端的Q4。在另一個實(shí)施方案中，表位包含N末端和第二個胞外環(huán)中的殘基。表位可以包含N末端的D2、Y3、Q4、S7、P8和N13以及第二個胞外環(huán)的Y176和T177。表位可以包含N末端的D2、Y3、Q4、P8和N13以及第二個胞外環(huán)的Y176和T177。表位可以包含N末端的D2以及第二個胞外環(huán)的R168和Y176。在一個實(shí)施方案中，表位位于第二個胞外環(huán)。表位可以包含第二個胞外環(huán)的Q170和K171。表位可以包含第二個胞外環(huán)的Q170和E172。
在用于本文時，貫穿說明書全文使用下列標(biāo)準(zhǔn)縮寫來指示特定氨基酸A＝ala＝丙氨酸 R＝arg＝精氨酸N＝asn＝天冬酰胺D＝asp＝天冬氨酸C＝cys＝半胱氨酸Q＝gln＝谷氨酰胺E＝glu＝谷氨酸 G＝gly＝甘氨酸H＝his＝組氨酸 I＝ile＝異亮氨酸L＝leu＝亮氨酸 K＝lys＝賴氨酸M＝met＝甲硫氨酸F＝phe＝苯丙氨酸P＝pro＝脯氨酸 S＝ser＝絲氨酸T＝thr＝蘇氨酸 W＝trp＝色氨酸Y＝tyr＝酪氨酸 V＝val＝纈氨酸在用于本文時，“多肽”指通過肽鍵相連的兩個或多個氨基酸。
在用于本文時，“表位”指分子中形成結(jié)合抗體或其它化合物的表面的那部分。表位可以包含連續(xù)或不連續(xù)的氨基酸、碳水化合物或其它非肽部分或寡聚物特異表面。
在用于本文時，“N末端”指橫跨起始甲硫氨酸和第一個跨膜區(qū)的氨基酸序列。
在用于本文時，“第二個胞外環(huán)”指橫跨第四個和第五個跨膜區(qū)且位于表面的氨基酸序列。
在上述組合物的一個實(shí)施方案中，至少一種化合物包含抗體的輕鏈。在上述組合物的另一個實(shí)施方案中，至少一種化合物包含抗體的重鏈。在上述組合物的另一個實(shí)施方案中，至少一種化合物包含抗體的Fab片段。在上述組合物的另一個實(shí)施方案中，至少一種化合物包含抗體的可變結(jié)構(gòu)域。在另一個實(shí)施方案中，抗體是作為單一多肽或“單鏈”抗體生產(chǎn)的，它包含經(jīng)間隔氨基酸序列遺傳連鎖的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在上述組合物的另一個實(shí)施方案中，至少一種化合物包含抗體的一個或多個CDR片段。
在用于本文時，“重鏈”指抗體分子中由一個可變結(jié)構(gòu)域(VH)和三個或四個恒定結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2、CH3、和CH4)構(gòu)成的較大多肽或其片段。
在用于本文時，“輕鏈”指抗體分子中由一個可變結(jié)構(gòu)域(VL)和一個恒定結(jié)構(gòu)域(CL)構(gòu)成的較小多肽或其片段。
在用于本文時，“Fab”指免疫球蛋白中由一條輕鏈和一條重鏈的一部分構(gòu)成的單價(jià)抗原結(jié)合片段。它可以通過簡單的木瓜蛋白酶消化或者通過重組法來獲得。
在用于本文時，“F(ab’)2”指免疫球蛋白中由兩條輕鏈和兩條重鏈的一部分構(gòu)成的二價(jià)抗原結(jié)合片段。它可以通過簡單的胃蛋白酶消化或重組法來獲得。
在用于本文時，“CDR”或“互補(bǔ)決定區(qū)”指抗體可變結(jié)構(gòu)域中高度可變的氨基酸序列。
本發(fā)明提供了上述組合物和藥用載體。藥用載體對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的。這些藥用載體可以包括但不限于水性或非水性溶液、懸浮液和乳狀液。非水性溶劑的實(shí)例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油諸如橄欖油、和可注射有機(jī)酯諸如油酸乙酯。水性載體包括水、乙醇/水性溶液、乳狀液或懸浮液、鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外載體包括氯化鈉溶液、Ringer氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸化Ringer氏或不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)載體包括流體和營養(yǎng)補(bǔ)充物、電解質(zhì)補(bǔ)充物諸如基于Ringer氏右旋糖的補(bǔ)充物、諸如此類。還可以存在防腐劑和其它添加劑，諸如例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體、諸如此類。
本發(fā)明提供了治療受HIV-1之苦的受試者的方法，包括對受試者施用有效劑量的上述組合物。
在用于本文時，“受試者”指能夠遭受HIV-1感染的任何動物或經(jīng)過人工修飾的動物。經(jīng)過人工修飾的動物包括但不限于具有人類免疫系統(tǒng)的SCID小鼠。動物包括但不限于小鼠、大鼠、狗、豚鼠、雪貂、兔、和靈長類動物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者是人。
在用于本文時，“治療”指減緩、終止或逆轉(zhuǎn)HIV-1病癥的進(jìn)展。在優(yōu)選實(shí)施方案中，“治療”指將進(jìn)展逆轉(zhuǎn)至消除病癥的點(diǎn)。在用于本文時，“治療”也指減少病毒感染的數(shù)目、減少感染性病毒顆粒的數(shù)目、減少病毒感染細(xì)胞的數(shù)目、或改善與HIV-1有關(guān)的癥狀。
在用于本文時，“受HIV-1之苦”指受試者具有至少一個已經(jīng)受到HIV-1感染的細(xì)胞。
在用于本文時，“施用”可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何方法來實(shí)現(xiàn)和進(jìn)行。所述方法可以包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下途徑。
本發(fā)明組合物的劑量將根據(jù)受試者和所用具體施用途徑而變化。劑量范圍可以是0.1-100,000μg/kg?？梢愿鶕?jù)組合物連續(xù)傳遞劑量，諸如通過連續(xù)泵，或者以定期間隔傳遞劑量。例如，在一個或多個分開的情形傳遞劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員無需過度試驗(yàn)就可以確定多劑量特定組合物的期望時間間隔。
在用于本文時，“有效劑量”指足以治療受試者或預(yù)防受試者免于HIV-1感染的數(shù)量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠進(jìn)行簡單的滴定實(shí)驗(yàn)來確定治療受試者所需要的數(shù)量。
本發(fā)明提供了預(yù)防受試者免于感染HIV-1的方法，包括對受試者施用有效劑量的上述組合物。
在用于本文時，“感染HIV-1”指受到HIV-1感染，其遺傳信息在宿主細(xì)胞中復(fù)制和/或摻入。
本發(fā)明提供了抗CCR5單克隆抗體。所述抗體包括但不限于PA8(ATCC登記號HB-12605)、PA9(ATCC登記號HB-12606)、PA10(ATCC登記號HB-12607)、PA11(ATCC登記號HB-12608)、PA12(ATCC登記號HB-12609)和PA14(ATCC登記號HB-12610)。
本發(fā)明提供了上述抗體的人源化形式。
在用于本文時，“人源化”描述了其中CDR區(qū)域外的一些、大多數(shù)或所有氨基酸被衍生自人免疫球蛋白分子的對應(yīng)氨基酸替代的抗體。在人源化形式抗體的一個實(shí)施方案中，CDR區(qū)域外的一些、大多數(shù)或所有氨基酸已經(jīng)被來自人免疫球蛋白分子的氨基酸替代，但是一個或多個CDR區(qū)域內(nèi)的一些、大多數(shù)或所有氨基酸未曾改變。小型氨基酸添加、刪除、插入、替代或修飾是允許的，只要它們不會消除抗體結(jié)合指定抗原的能力。合適的人免疫球蛋白分子將包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgM分子?！叭嗽椿笨贵w將保留與原始抗體相似的抗原特異性，即本發(fā)明中的結(jié)合CCR5的能力。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道如何生產(chǎn)本發(fā)明的人源化抗體。多種出版物(由此將其中一些結(jié)合于本申請作為參考)也描述了如何生產(chǎn)人源化抗體。例如，美國專利號4,816,567(71)中描述的方法包括生產(chǎn)具有一種抗體的可變區(qū)和另一種抗體的恒定區(qū)的嵌合抗體。
美國專利號5,225,539(72)描述了用于生產(chǎn)人源化抗體的另一種方法。此專利描述了重組DNA技術(shù)用于生產(chǎn)人源化抗體的用法，其中一種免疫球蛋白的可變區(qū)的CDR被來自具有不同特異性的另一種免疫球蛋白的CDR替代，使得人源化抗體將識別期望靶而不會以顯著地方式被人類受試者的免疫系統(tǒng)所識別。具體而言，將定點(diǎn)誘變用于將CDR移植到框架上。
用于人源化抗體的其它方法描述于美國專利號5,585,089(73)和5,693,761(74)以及WO 90/07861，它們描述了用于生產(chǎn)人源化免疫球蛋白的方法。這些人源化抗體具有來自供體免疫球蛋白的一個或多個CDR和可能的額外氨基酸以及來自受體人免疫球蛋白的框架區(qū)。這些專利描述了用于提高抗體對期望抗原的親合力的方法。框架中的有些氨基酸選擇與供體中而非受體中那些位置的氨基酸相同。具體而言，這些專利描述了通過聯(lián)合小鼠單克隆抗體的CDR與人免疫球蛋白框架和恒定區(qū)來制備結(jié)合受體的人源化抗體?？梢赃x擇人框架區(qū)使與小鼠序列的同源性最大化?？梢允褂糜?jì)算機(jī)模型來鑒定框架區(qū)中有可能與CDR或特異抗原相互作用的氨基酸，然后可以在這些位置使用小鼠氨基酸以生產(chǎn)人源化抗體。
上述專利5,585,089和5,693,761以及WO 90/07861(75)還提出了可用于設(shè)計(jì)人源化抗體的四條可能標(biāo)準(zhǔn)。第一條建議是對于受體而言，使用來自與待人源化的供體免疫球蛋白異常同源的特定人免疫球蛋白的框架，或者使用來自許多人抗體的保守框架。第二條建議是如果人免疫球蛋白框架中的氨基酸是異常的且該位置的供體氨基酸對人序列而言是典型的，那么可以選擇供體氨基酸而非受體。第三條建議是在緊挨著人源化免疫球蛋白鏈中3個CDR的位置可以選擇供體氨基酸而非受體氨基酸。第四條建議是在預(yù)測抗體三維模型中氨基酸有側(cè)鏈原子位于CDR的3A以內(nèi)且預(yù)測能夠與CDR相互作用的框架位置使用供體氨基酸殘基。上述方法僅僅是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠用來生產(chǎn)人源化抗體的一些方法的例示。可以使用Wu等，J.Mol.Biol.，284151，1999和美國專利號6,165,793、6,365,408和6,413,774中描述的定向進(jìn)化來提高人源化抗體的結(jié)合親合力和/或特異性。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，人源化形式抗體包含SEQ ID NO6所列出的輕鏈可變氨基酸序列。在另一個實(shí)施方案中，抗體包含SEQ ID NO9所列出的重鏈可變氨基酸序列。在又一個實(shí)施方案中，抗體可以包含SEQID NO12所列出的重鏈可變氨基酸序列。
在另一個實(shí)施方案中，人源化抗體包含SEQ ID NO6所列出的輕鏈可變氨基酸序列和SEQ ID NO9所列出的重鏈可變氨基酸序列。備選地，抗體可以包含SEQ ID NO6所列出的輕鏈可變氨基酸序列和SEQ ID NO12所列出的重鏈可變氨基酸序列。
人源化抗體的可變區(qū)可以連接人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一部分。在一個實(shí)施方案中，人源化抗體包含輕鏈和重鏈恒定區(qū)二者。重鏈恒定區(qū)通常包含CH1、鉸鏈、CH2、CH3和有時的CH4區(qū)。在一個實(shí)施方案中，人源化抗體的恒定區(qū)屬于人IgG4同種型。
本發(fā)明提供了編碼這些抗CCR5單克隆抗體或其人源化形式的分離的核酸分子。核酸分子可以是RNA、DNA或cDNA。在一個實(shí)施方案中，核酸分子編碼輕鏈。在一個實(shí)施方案中，核酸分子編碼重鏈。在一個實(shí)施方案中，核酸編碼重鏈和輕鏈二者。在一個實(shí)施方案中，一個或多個核酸分子編碼Fab片段。在一個實(shí)施方案中，一個或多個核酸分子編碼CDR片段。在一個實(shí)施方案中，核酸分子編碼可變結(jié)構(gòu)域。在另一個實(shí)施方案中，核酸分子編碼一個可變結(jié)構(gòu)域和一個或多個恒定結(jié)構(gòu)域。
優(yōu)選的是，例示人源化抗CCR5抗體類似物因保守氨基酸替代而不同于例示人源化抗CCR5抗體。為了將氨基酸替代分類成保守的或非保守的，可以將氨基酸如下分組第一組(疏水性側(cè)鏈)met、ala、val、leu、ile；第二組(中性親水性側(cè)鏈)cys、ser、thr；第三組(酸性側(cè)鏈)asp、glu；第四組(堿性側(cè)鏈)asn、gln、his、lys、arg；第五組(影響鏈取向的殘基)gly、pro；和第六組(芳香組側(cè)鏈)trp、tyr、phe。保守替代涉及相同類型氨基酸之間的替代。非保守替代構(gòu)成這些類型之一的成員與另一類的成員之間的交換。
人源化抗CCR5抗體類似物顯示與本文例示的人源化PRO 140#1或人源化PRO 140#2的基本的氨基酸序列同一性。編碼類似物重鏈和輕鏈可變區(qū)的核酸序列能夠與編碼人源化PRO 140#1或人源化PRO 140#2重鏈和輕鏈可變區(qū)的核酸或其簡并形式在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。
由于遺傳密碼的簡并性，多種核酸序列編碼本發(fā)明的人源化抗CCR5抗體。在某些實(shí)施方案中，抗體是由與前述核酸分子高度同源的核酸分子編碼的。優(yōu)選的是，同源核酸分子包含與本文提供的核苷酸序列至少大約90％同一的核苷酸序列。更優(yōu)選的是，核苷酸序列與本文提供的核苷酸序列至少大約95％同一，至少大約97％同一，至少大約98％同一，或者至少大約99％同一。可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的多種公用軟件工具來計(jì)算同源性。例示性工具包括可以由位于(美國)全國衛(wèi)生研究所(National Institute of Health)的(美國)國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)的網(wǎng)站獲得的BLAST系統(tǒng)。
鑒定高度同源核苷酸序列的一種方法經(jīng)由核酸雜交。因此，本發(fā)明還包括由在高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與前述核酸分子雜交的核酸分子編碼的、具有CCR5結(jié)合特性和本文所述其它功能特性的人源化CCR5抗體。還可以使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和適用于克隆相關(guān)核酸序列的其它擴(kuò)增技術(shù)來實(shí)現(xiàn)相關(guān)序列的鑒定。優(yōu)選的是，選擇PCR引物來擴(kuò)增目的核酸序列的片段，諸如CDR。
術(shù)語“高嚴(yán)謹(jǐn)度條件”在用于本文時指本領(lǐng)域所熟悉的參數(shù)。可以在編輯這些方法的參考文獻(xiàn)中找到核酸雜交參數(shù)，如J.Sambrook等編輯的《Molecular CloningA Laboratory Manual》即分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989，或者F.M.Ausubel等編輯的《Current Protocols in Molecular Biology》即分子生物學(xué)現(xiàn)行方案，John Wiley父子公司，紐約。高嚴(yán)謹(jǐn)度條件的一個實(shí)例是于65℃在雜交緩沖液(3.5×SSC、0.02％Ficoll、0.02％聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛血清清蛋白、2.5mM NaH2PO4pH 7、0.5％SDS、2mM EDTA)中雜交。SSC即0.15M氯化鈉/0.015M檸檬酸鈉pH 7；SDS即十二烷基磺酸鈉；而EDTA即乙二胺四乙酸。雜交后，例如于室溫用2×SSC，然后在高達(dá)68℃的溫度用0.1-0.5×SSC/0.1×SDS，清洗核酸轉(zhuǎn)移其上的膜。
將核酸序列可操作連接表達(dá)控制序列(即為了確保后者發(fā)揮功能而安置前者)后，在宿主中表達(dá)序列。這些表達(dá)載體通常能夠在宿主生物體中復(fù)制，或是作為游離體或是作為宿主染色體DNA的整合部分。通常，表達(dá)載體將包含選擇標(biāo)記，如四環(huán)素或新霉素，從而容許檢測經(jīng)期望DNA序列轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞(參閱如美國專利號4,704,362，收入本文作為參考)。
大腸桿菌(E.coli)是對于克隆本發(fā)明DNA序列而言特別有用的一種原核宿主。適于使用的其它微生物宿主包括桿菌(bacilli)，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus substilus)，以及其它腸桿菌科(enterobacteriaccae)，諸如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和多種假單胞菌(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，也可以構(gòu)建表達(dá)載體，它通常包含與宿主細(xì)胞相容的表達(dá)控制序列(如復(fù)制起點(diǎn))。另外，可以存在任何數(shù)目的多種眾所周知的啟動子，諸如乳糖啟動子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、β-內(nèi)酰胺酶啟動子系統(tǒng)、或來自噬菌體λ的啟動子系統(tǒng)。啟動子通常將控制表達(dá)，任選與操縱子序列一起，而且具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列諸如此類，用于啟動和完成轉(zhuǎn)錄和翻譯。
其它微生物，諸如酵母，也可用于表達(dá)。酵母屬是優(yōu)選的宿主，且合適載體具有表達(dá)控制序列，諸如啟動子，包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶以及復(fù)制起點(diǎn)、終止序列諸如此類。
除了微生物以外，哺乳動物組織細(xì)胞培養(yǎng)物也可用于表達(dá)和生產(chǎn)本發(fā)明的多肽(參閱Winnacker著的《From Genes to Clones》即由基因到克隆，VCH出版社，紐約州，紐約市，1987)。真核細(xì)胞實(shí)際上是優(yōu)選的，因?yàn)楸绢I(lǐng)域已經(jīng)開發(fā)了能夠分泌完整免疫球蛋白的許多合適宿主細(xì)胞系，包括CHO細(xì)胞系、多種COS細(xì)胞系、HeLa細(xì)胞、優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系等，以及轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞或雜交瘤。用于這些細(xì)胞的表達(dá)載體可以包含表達(dá)控制序列，諸如復(fù)制起點(diǎn)、啟動子、增強(qiáng)子(Queen等，Immunol.Rev.，8949-68，1986，收入本文作為參考)、以及必需的加工信息位點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子序列。優(yōu)選的表達(dá)控制序列是衍生自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、細(xì)胞肥大病毒、牛乳頭瘤病毒、諸如此類的啟動子。
根據(jù)細(xì)胞宿主的類型，可以通過眾所周知的方法將包含目的DNA區(qū)段(如重鏈和輕鏈編碼序列以及表達(dá)控制序列)的載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中。例如，氯化鈣轉(zhuǎn)染常用于原核細(xì)胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用于其它細(xì)胞宿主(一般參閱Maniatis等，《Molecular CloningA Laboratory Manual》及分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南，冷泉港出版社，1982，收入本文作為參考)。
一旦表達(dá)，可以依照本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法來純化本發(fā)明的完整抗體、其二聚體、單個輕鏈和重鏈、或其它免疫球蛋白形式，包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析、凝膠電泳、諸如此類(一般參閱R.Scopes，《ProteinPurification》即蛋白質(zhì)純化，Springer-Verlag，紐約，1982)。制藥學(xué)用途優(yōu)選至少大約90-95％同質(zhì)、最優(yōu)選98-99％或更高均質(zhì)的基本純的免疫球蛋白。一旦根據(jù)需要部分純化或純化至均質(zhì)，可以將多肽用于治療(包括體外的)，或者用于開發(fā)和執(zhí)行測定流程、免疫熒光染色、諸如此類(一般參閱Lefkovits和Pernis編輯的《Immunological Methods》即免疫學(xué)方法，第1和2卷，Academic出版社，紐約州，紐約市，1979和1981)。
出于診斷或檢測目的，抗體可以是經(jīng)標(biāo)記的或是未標(biāo)記的。未標(biāo)記抗體在使用時可以聯(lián)合能夠與人源化抗體反應(yīng)的其它經(jīng)標(biāo)記抗體(二抗)，諸如對人免疫球蛋白恒定區(qū)特異的抗體。備選地，可以直接標(biāo)記抗體。可以采用廣泛的標(biāo)記物，諸如放射性核素、熒光染料、酶、酶底物、酶輔助因子、酶抑制劑、配體(特別半抗原)、等。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知且可以利用多種免疫測定法來檢測CCR5表達(dá)細(xì)胞或檢測能夠表達(dá)CCR5的細(xì)胞上的CCR5調(diào)控。
本發(fā)明還提供了具有有效大小或分子量且相對于未衍生化抗體片段而言賦予血清半衰期延長、平均循環(huán)滯留時間(MRT)延長和/或血清清除率減小的抗體片段-聚合物偶聯(lián)物。
可以通過用惰性聚合物衍生期望抗體片段來生產(chǎn)本發(fā)明的抗體片段-聚合物偶聯(lián)物。應(yīng)當(dāng)理解為偶聯(lián)物提供期望表觀大小或具有所選真實(shí)分子量的任何惰性聚合物都適用于構(gòu)建本發(fā)明的抗體片段-聚合物偶聯(lián)物。
許多惰性聚合物都適用于藥品。參閱如Davis等，《BiomedicalPolymersPolymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use》即生物醫(yī)學(xué)聚合物用于生物醫(yī)學(xué)用途的聚合材料和藥品，第441-451頁，1980。在本發(fā)明的所有實(shí)施方案中，使用了非蛋白質(zhì)聚合物。非蛋白質(zhì)聚合物通常是親水性合成聚合物，即在其它情況中在自然界不會找到的聚合物。然而，天然存在且可通過重組或體外方法生產(chǎn)的聚合物也是有用的，正如由天然來源分離的聚合物。親水性聚乙烯聚合物屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)，如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。特別有用的是聚烷撐醚諸如聚乙二醇(PEG)；聚氧化烯諸如聚氧乙烯、聚氧丙烯以及聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物(Pluronics即聚丙二醇與環(huán)氧乙烷的加聚物)；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆；包含糖單體D-甘露糖、D-和L-半乳糖、海藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(如聚甘露糖醛酸或褐藻酸)、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神經(jīng)氨酸的支鏈或無支鏈多糖，包括同多糖和雜多糖，諸如乳糖、支鏈淀粉、淀粉、羥乙基淀粉、直鏈淀粉、硫酸右旋糖酐、右旋糖酐、糊精、糖原、或酸性粘多糖的多糖亞基，如透明質(zhì)酸，糖醇聚合物諸如聚山梨糖醇和聚甘露糖醇、肝素或類肝素(heparon)。聚合物在交聯(lián)前不必但優(yōu)選是水溶性的，但是最終的偶聯(lián)物必須是水溶性的。優(yōu)選的是，偶聯(lián)物展示至少大約0.01mg/ml的水溶解度，更優(yōu)選至少大約0.1mg/ml，仍更優(yōu)選至少大約1mg/ml。另外，聚合物在偶聯(lián)物形式中不應(yīng)當(dāng)是高度免疫原性的，而且它不應(yīng)答具有與靜脈內(nèi)輸注或注射不相容的粘度，如果偶聯(lián)物意欲通過這些途徑施用的話。
在一個實(shí)施方案中，聚合物只包含一個反應(yīng)性基團(tuán)。這有助于避免蛋白質(zhì)分子的交聯(lián)。然而，優(yōu)化反應(yīng)條件以減少交聯(lián)或者通過凝膠過濾或離子交換層析來純化反應(yīng)產(chǎn)物以回收基本同質(zhì)的衍生物屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在另一個實(shí)施方案中，為了將多個抗體片段連接到聚合物主鏈上，聚合物包含兩個或多個反應(yīng)性基團(tuán)。此外，凝膠過濾或離子交換層析可用于回收基本同質(zhì)形式的期望衍生物。
聚合物分子量的范圍可以高達(dá)大約500,000D，且優(yōu)選至少大約20,000D，或至少大約30,000D，或至少大約40,000D。選擇的分子量可能取決于待達(dá)到的偶聯(lián)物有效大小、聚合物的本質(zhì)(如結(jié)構(gòu)諸如線性或分支)和衍生度即每個抗體片段的聚合物分子數(shù)目以及抗體片段上的聚合物附著位點(diǎn)。
可以通過能夠與待連接的聚合物和抗體片段的一個或多個氨基酸殘基反應(yīng)的多功能交聯(lián)劑將聚合物共價(jià)連接抗體片段。然而，通過衍生聚合物與抗體片段反應(yīng)而直接交聯(lián)也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)，反之亦然。
抗體片段上的共價(jià)交聯(lián)位點(diǎn)包括N末端氨基和賴氨酸殘基的ε-氨基，以及其它氨基、亞氨基、羧基、巰基、羥基或其它親水性基團(tuán)。聚合物可以直接與抗體片段共價(jià)結(jié)合而無需使用多功能(通常是雙功能)交聯(lián)劑，正如美國專利號6,458,355中所述。
這種聚合物的替代程度將隨著抗體片段上反應(yīng)位點(diǎn)數(shù)目、分子量、親水性和聚合物的其它特征、以及所選擇的具體抗體片段衍生位點(diǎn)而變化。一般而言，偶聯(lián)物包含1-大約10個聚合物分子，但是也設(shè)想了將更多數(shù)目的聚合物分子附著到本發(fā)明的抗體片段上。通過使用實(shí)驗(yàn)矩陣輕松實(shí)現(xiàn)了期望的衍生數(shù)量，其中改變時間、溫度和其它反應(yīng)條件以改變替代程度，其后通過大小排阻層析或本領(lǐng)域知道的其它手段測定了偶聯(lián)物的聚合物替代水平。
可以由Shearwater聚合物公司(亨茨維爾，阿拉巴馬州)獲得用于修飾本發(fā)明抗體片段的功能化PEG聚合物。這些商品化PEG衍生物包括但不限于氨基-PEG、PEG氨基酸酯、PEG-酰肼、PEG-硫醇、PEG-琥珀酸酯、羧甲基化PEG、PEG-丙酸、PEG氨基酸、PEG琥珀酰亞胺琥珀酸酯、PEG琥珀酰亞胺丙酸酯、羧甲基化PEG的琥珀酰亞胺酯、PEG的琥珀酰亞胺碳酸酯、氨基酸PEG的琥珀酰亞胺酯、PEG-氧羰基咪唑、PEG-硝基苯基碳酸酯、PEG tresylate、PEG-縮水甘油基醚、PEG-醛、PEG-乙烯砜、PEG-馬來酰亞胺、PEG-正吡啶基-二硫化物、雜功能PEG、PEG乙烯基衍生物、PEG硅烷和PEG phospholide。用于偶聯(lián)這些PEG衍生物的反應(yīng)條件將隨著蛋白質(zhì)、期望的PEG化程度和所使用的PEG衍生物而變化。涉及PEG衍生物選擇的一些因素包括衍生物的期望附著點(diǎn)(諸如賴氨酸或半胱氨酸R-基團(tuán))、水解穩(wěn)定性和反應(yīng)性，接頭的穩(wěn)定性、毒性和抗原性，分析的適用性，等等?？梢杂芍圃焐太@得使用任何具體衍生物的具體指示。通過凝膠過濾或離子交換HPLC將本發(fā)明的偶聯(lián)物與未反應(yīng)的起始材料分開。
抗CCR5抗體或其片段可以在使用時聯(lián)合選自下組的一種或多種額外抗病毒試劑非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)、核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、HIV-1蛋白酶抑制劑、病毒侵入抑制劑及其組合。
可用于本發(fā)明組合物的已知NNRTI化合物包括但不限于依法韋侖、UC-781、HBY 097、奈韋拉平(11-環(huán)丙基-5，11-二氫-4-甲基-6H-二吡啶[3，2-b2’3’-][1，4]二氮雜草-6-酮)、地位韋啶((RescriptorTM；PharmaciaUpjohn)(哌嗪，1-[3-[(1-甲基-乙基)氨基]-2-吡啶基]-4-[[5-[(甲磺酰)氨基]-1H-吲哚-2-基]羰基]-單甲基磺酸酯)、SJ-3366(1-(3-環(huán)戊烯-1-基)甲基-6-(3，5-二甲基苯甲?；?-5-乙基-2，4-嘧啶二酮)、MKC-442(6-苯甲基-1-(乙氧基甲基)-5-異丙基尿嘧啶)、GW420867x(S-3-乙基-6-氟-4-異丙氧基羰基-3，4-二氫-喹啉-2(1H)-酮；Glaxo)、HI-443(N’-[2-(2-噻吩)乙基]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]-硫脲)、諸如此類。
可用于本發(fā)明組合物并聯(lián)合至少一種本發(fā)明抗CCR5抗體或其片段的核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑包括但不限于阿巴卡韋(ZiagenTM，GlaxoSmithKline)((1S，順)-4-[2-氨基-6-(環(huán)丙基氨基)-9H-嘌呤-9-基]-2-環(huán)戊烯-1-甲醇硫酸(鹽))、拉米夫定(EpivirTM，GlaxoSmithKline)((2S，順)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮)、齊多夫定(RetrovirTM；GlaxoSmithKline)(3’疊氮-3’-脫氧胸腺嘧啶核苷)、司他夫定(Zerit；Bristol-Myers-Squibb)(2’，3’-雙脫氫-3’-脫氧胸腺嘧啶核苷)、zacitabine(HividTM；Roche Laboratories)(4-氨基-1-β-D2’，3’-雙脫氧核糖呋喃糖基-2-(1H)-嘧啶酮)、去羥肌苷、諸如此類。
可以在組合物中聯(lián)合本發(fā)明抗CCR5抗體或其片段使用的HIV-1蛋白酶抑制劑包括但不限于洛匹那韋(1S-[1R*，(R*)，3R*，4R*]-N-4-[[(2，6-二甲苯氧基)乙?；鵠氨基]-3-羥基-5-苯基-1-(苯甲基)戊基)]四氫-α-(1-甲基乙基)-2-氧橋(2H)-嘧啶乙酰胺)、沙奎那韋(N-叔丁基-十氫-2-[2(R)-羥基-4-苯基-3(S)-[[N-(2-喹啉基羰基)-L-天冬酰胺酰]氨基]丁基]-(4aS，8aS)-異喹啉-(3S)-羧酰胺)、奈非那韋甲磺酸鹽([3S-[2(2S*，3S*)，3α，4β，8αβ]]-N-(1，1-二甲基乙基)十氫-2[2-羥基-3-[(3-羥基-3-甲基苯甲?；?氨基]-4-(苯基硫)丁基]-3-異喹啉氨甲酰單甲烷磺酸酯)、硫酸茚地那韋(([1(1S，2R)，5(S)]-2，3，5-三脫氧-N-(2，3-二氫-2-羥基-1H-茚-1-基)-5-[2-[[(1，1-二甲基乙基)氨基]羰基]-4-(3-嘧啶基甲基)-1-哌嗪基]-2-(苯甲基)-D-赤型纈烯酰胺硫酸(1∶1)鹽)、氨普奈韋((3S)-四氫-3-呋喃基N-[(1S，2R)-3-(4-氨基-N-異丁基苯亞磺酰氨基)-1-苯甲基-2-羥丙基]氨基甲酸酯)、利托那韋((10-羥基-2-甲基-5-(1-甲基乙基)-1-[2-(1-甲基乙基)-4-噻唑基]-3，6-二氧-8，11-雙(苯基甲基)-2，4，7，12-四氮十三烷-13-酸，5-噻唑基甲酯，[5S-(5R*，8R*，10R*，11R*)])、諸如此類。
可以聯(lián)合本發(fā)明抗CCR5抗體或其片段使用的HIV-1融合或病毒侵入抑制劑包括PRO 542(Progenics藥品公司，塔利頓，紐約州)、T-20(Trimeris公司，達(dá)勒姆，北卡羅來納州)(美國專利號5,464,933；6,133,418；6,020,459)、T-1249(美國專利號6,345,568；6,258,782)、諸如此類。
對于聯(lián)合療法，可以給受試者在一種或多種常規(guī)抗病毒試劑之前、隨后、或同時提供本發(fā)明的抗CCR5抗體或其片段。
借助隨后的試驗(yàn)詳述將更好的理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于認(rèn)識到所討論的特定方法和結(jié)果僅僅是本發(fā)明的例示，本發(fā)明在其后權(quán)利要求書中更完整地描述。
試驗(yàn)詳述實(shí)施例1A.材料和方法
1)試劑MAb 2D7購自Pharmingen(圣迭哥，加利福尼亞州)，而CC-和CXC-趨化因子得自R&D Systems(明尼阿波利斯，明尼蘇達(dá)州)。CD4-IgG2(1)、可溶性(s)CD4(2)和重組HIV-1JR-FLgp120是由Progenics Pharmaceuticals公司生產(chǎn)的(59)。
2)抗CCR5 mAb的分離和純化將L1.2-CCR5+細(xì)胞(63)在存在5mM丁酸鈉時溫育16小時，它激活來自控制CCR5表達(dá)的細(xì)胞肥大病毒(CMV)啟動子的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞表面輔助受體密度增長了10倍。將雌性Balb/c小鼠腹膜內(nèi)免疫107個L1.2-CCR5+細(xì)胞，以3周為間隔，并在脾切除前三天施行107個L1.2-CCR5+細(xì)胞的靜脈內(nèi)加強(qiáng)。將脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞系融合。在初步篩選中，測試來自104份雜交瘤培養(yǎng)物的上清液；這其中的120份在共振能轉(zhuǎn)移(RET)測定法中抑制天然表達(dá)CCR5和CD4的PM1細(xì)胞與HeLa-EnvJR-FL+細(xì)胞之間由HIV-1包膜介導(dǎo)的融合(10)，正如先前所述(19，38)。通過有限稀釋亞克隆生產(chǎn)最有效抑制性上清液和還將CCR5+細(xì)胞染色的雜交瘤。通過Harlan Bioproducts for Science公司(印第安納波利斯，印第安納州)給Balb/c小鼠注射生產(chǎn)抗CCR5 mAb PA8、PA9、PA10、PA11、PA12和PA14的雜交瘤來制備腹水。通過硫酸銨沉淀及隨后的蛋白A層析將mAb個別純化至＞95％同質(zhì)。將所有mAb重懸于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，終濃度5mg/ml。
3)抗CCR5 mAb的熒光激活細(xì)胞分類(FACS)分析和表位作圖將流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)用于檢測mAb PA8-PA12和PA14對CCR5的細(xì)胞表面反應(yīng)性。將經(jīng)丁酸鈉處理的L1.2-CCR5+細(xì)胞(106個)與0.25μg抗體一起在溶于50μl Dulbecco氏PBS(DPBS)的0.1％疊氮鈉(NaN3)中于4℃溫育20分鐘。將CCR5 mAb 2D7用作陽性對照，將非特異性鼠IgG1用作陰性對照。將細(xì)胞離心沉降下來，清洗，并與1∶100稀釋的經(jīng)藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(Caltag，伯林格姆，加利福尼亞州)一起在與第一次抗體溫育相同的條件下溫育。最后，通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析細(xì)胞。分離PBMC，如先前所述(60)進(jìn)行刺激，并使用相似方法進(jìn)行染色。
將相似流程用于抗CCR5 mAb的表位作圖。已經(jīng)描述了一組70種CCR5點(diǎn)突變體(20，24，52)。將這些蛋白質(zhì)的編碼序列亞克隆到pcDNA3.1載體(Stratagene)中，其中可以由5′T7-聚合酶啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)錄。CCR5突變體在C端攜帶9個殘基的血球凝集素(HA)標(biāo)簽以便于檢測細(xì)胞裂解物中的蛋白質(zhì)，或者通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)進(jìn)行檢測。將HeLa細(xì)胞(2×106個)與20μg/ml lipofectin和等量的野生型或突變型CCR5表達(dá)質(zhì)粒一起在OPTI-MEM(Life Technologies，蓋瑟斯堡，馬里蘭州)中溫育5小時。然后用2×107p.f.u.vTF7(23)感染細(xì)胞12小時以加強(qiáng)CCR5表達(dá)，用溶于PBS的2mM乙二胺四乙酸(EDTA)分離，并用結(jié)合緩沖液(溶于DPBS的1％BSA、0.05％NaN3)清洗一次。如前面段落中所述用mAb表面標(biāo)記細(xì)胞(1×106個)，用溫育緩沖液清洗一次，并重懸于溶于水的1ml 1×FACSlyse(Becton Dickinson)，于室溫溫育30分鐘以滲透細(xì)胞膜。然后將細(xì)胞離心沉降下來，用溫育緩沖液進(jìn)行清洗，并與4μg/ml經(jīng)熒光素異硫氰酸鹽(FITC)標(biāo)記的小鼠抗-HAmAb(BabCo，里士滿，加利福尼亞州)一起于37℃溫育1小時以進(jìn)行胞內(nèi)標(biāo)記。最后，將細(xì)胞用結(jié)合緩沖液清洗一次，用DPBS清洗一次，重懸于溶于PBS的1％甲醛，并通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)進(jìn)行分析。通過下面的方程來確定mAb結(jié)合突變型CCR5的程度(突變型CCR5 PE m.f.i./野生型CCR5 PE m.f.i.)/(突變型CCR5 FITCm.f.i./野生型CCR5 FITC m.f.i.)×100％。這將突變型輔助受體表達(dá)水平的mAb結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化。
4)gp120/sCD4結(jié)合測定法使用NHS-生物素(Pierce，羅克福德，伊利諾斯州)依照制造商的指示生物素化gp120，并通過滲濾除去未偶聯(lián)的生物素。將經(jīng)丁酸鈉處理的L1.2-CCR5+細(xì)胞與不同稀釋度的sCD4與生物素化gp120的等摩爾混合物或1.25μg/ml sCD4和2.5μg/ml生物素化gp120一起在存在不同濃度的抗CCR5 mAb PA8-PA12、PA14、2D7或非特異性鼠IgG1時在溶于DPBS的0.1％NaN3中于室溫溫育1小時。用溫育緩沖液清洗細(xì)胞，并與1∶50稀釋的鏈霉親和素-PE(Becton Dickinson)一起于室溫溫育1小時。最后，用結(jié)合緩沖液清洗細(xì)胞，并使用熒光讀板器進(jìn)行分析(PerspectiveBiosystems，弗雷明漢，馬薩諸塞州)。
5)抗CCR5 mAb對由包膜介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合和HIV-1侵入的抑制使用RET測定法檢測HeLa-EnvJR-FL+與PM1細(xì)胞之間由HIV-1包膜介導(dǎo)的融合。將相同數(shù)目(2×104個)的經(jīng)熒光素十八烷醇酯(F18)標(biāo)記的包膜表達(dá)細(xì)胞與經(jīng)十八烷基若丹明(R18)標(biāo)記的PM1細(xì)胞分布到96孔板中溶于DPBS中的15％胎牛血清中，并在存在不同濃度的抗CCR5 mAb即PA8-PA12、PA14、2D7或非特異性鼠IgG1時于37℃溫育4小時。使用Cytofluor讀板器(PerSeptive Biosystems)測量熒光RET，并如先前所述(38)確定RET百分比。
如先前所述(20)，通過來自JR-FL或Gun-1的包膜糖蛋白生產(chǎn)反式補(bǔ)充的NLluc+env-病毒。在存在不同濃度的單個mAb時，用包含50-100ng/ml p24的嵌合型報(bào)道病毒感染U87MG-CD4+CCR5+細(xì)胞(14)。于37℃溫育2小時后，用新鮮的含mAb的培養(yǎng)基替代含病毒的培養(yǎng)基。12小時后再次加入不含抗體的新鮮培養(yǎng)基?？偣?2小時后，向細(xì)胞中加入100μl裂解緩沖液(Promega)，并如(20)所述測量螢光素酶活性(r.l.u.)。HIV-1感染抑制百分比定義為[1-(存在抗體時的r.l.u./不含抗體時的r.l.u.)]×100％。
6)鈣信號測定法向經(jīng)丁酸鈉處理的L1.2-CCR5+細(xì)胞中加入熒光染料吲哚-1AM(Molecular Probes，尤金，俄勒岡州)至終濃度5μM。于37℃溫育30分鐘后，將細(xì)胞清洗一次，并重懸于Hank氏緩沖鹽水。用抗CCR5 mAb或PBS刺激細(xì)胞(106個)，60秒后繼以RANTES。MAb PA8-PA12和PA14的使用濃度是100μg/ml，2D7是20μg/ml，而RANTES是250ng/ml。還對PA14和2D7測試廣泛mAb濃度的鈣流抑制，范圍為0-100μg/ml。使用Perkin-Elmer LS-50S熒光分光光度計(jì)通過測量358nm激發(fā)后402nm(所結(jié)合的染料)和486nm(游離的染料)的熒光發(fā)射比例來監(jiān)測胞內(nèi)鈣水平。
B.結(jié)果和討論1)分離抗CCR5單克隆抗體PA8、PA9、PA10、PA11、PA12和PA14發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于CCR5胞外結(jié)構(gòu)域的肽不足以引發(fā)針對天然細(xì)胞表面受體的特異性、高滴度抗體應(yīng)答(50)。因此，用L1.2-CCR5+細(xì)胞免疫Balb/c小鼠，并在RET測定法中對雜交瘤培養(yǎng)物上清液測試它們抑制與CD4+CCR5+PM1細(xì)胞進(jìn)行由JR-FL包膜介導(dǎo)的膜融合的能力(19，38)。盡管超過100個孔的上清液將細(xì)胞-細(xì)胞融合抑制了＞50％，然而只有6份-命名為PA8、PA9、PA10、PA11、PA12和PA14-特異且強(qiáng)烈染色L1.2-CCR5+細(xì)胞而非親本L1.2細(xì)胞，正如流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)所證明的(未展示數(shù)據(jù))。根據(jù)先前的經(jīng)驗(yàn)，假設(shè)能夠抑制細(xì)胞-細(xì)胞融合的其它mAb有可能針對細(xì)胞表面粘附分子諸如LFA-1(37)。通過同種型ELISA(Cappell，達(dá)勒姆，北卡羅來納州)確定了雜交瘤PA8-PA12和PA14分泌IgG1 mAb。由注射了六種雜交瘤的Balb/c小鼠制備腹水，并純化IgG1級分。PA8、PA9、PA11、PA12和PA14展示不同的等電聚焦特性，而PA10具有與PA9非常相似的特性，因此可能是相同mAb的第二個分離株(未顯示數(shù)據(jù))。
2)結(jié)合CCR5+細(xì)胞的mAb所有純化的抗CCR5 mAb都不能將親本L1.2細(xì)胞系染色(未顯示數(shù)據(jù))。然而，根據(jù)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)的測定，mAb PA9-PA12和PA14將L1.2-CCR5+細(xì)胞染色＞90％，而PA8將細(xì)胞染色約70％，顯示它們識別CCR5(圖1)。在我們的實(shí)驗(yàn)中作為陽性對照的抗CCR5 mAb 2D7也將L1.2-CCR5+細(xì)胞染色＞90％。PA8-PA12和PA14都是IgG1，而且與山羊抗小鼠IgG的反應(yīng)同樣良好，而2D7是IgG2a，而且與報(bào)道抗體的反應(yīng)可能不同。因此，只有用mAb PA8-PA12和PA14測量的平均熒光強(qiáng)度(m.f.i.)直接可比。平均熒光強(qiáng)度(m.f.i.)的排列順序是PA12～PA11＞(2D7＝)PA14～PA10～PA9＞PA8。PA12 m.f.i.與PA8 m.f.i.之間的差異是3倍。PA8與其它mAb之間在染色強(qiáng)度中的差異在廣泛濃度上保持恒定(未顯示數(shù)據(jù))，而且有可能不符合mAb對CCR5親和力的差異。這暗示PA8只與L1.2-CCR5+細(xì)胞表面上存在的CCR5分子的一個子集相互作用。
與L1.2-CCR5+細(xì)胞相比，經(jīng)促細(xì)胞分裂原刺激的PBMC對CCR5 mAb展示不同的染色模式。2D7和PA14將PBMC染色＞20％，PA11和PA12染色約10％，PA8、PA9和PA10染色＜5％(圖1)。染色PBMC的平均熒光強(qiáng)度比每種mAb對L1.2-CCR5+細(xì)胞的染色低大約10倍；它們的排列順序是(2D7＞)PA14＞PA12～PA11～PA10～PA9～PA8。此外，這在一定程度上不同于在CCR5轉(zhuǎn)染子上觀察到的反應(yīng)性。PA9 m.f.i.與PA14 m.f.i.之間的差異是7倍。其它小組在抗CCR5抗體將穩(wěn)定的CCR5+細(xì)胞系與PBMC染色的能力中觀察到相似差異(28)。這可能歸于CCR5構(gòu)象、翻譯后修飾或寡聚化的細(xì)胞特異性差異。備選地，與其它細(xì)胞表面分子的關(guān)聯(lián)在細(xì)胞之間可能是不同的。由于這種分子的一個明顯選擇是L1.2-CCR5+細(xì)胞上不存在的而PBMC上存在的CD4細(xì)胞表面抗原，因此我們還測試了PA8-PA12、PA14和2D7將瞬時表達(dá)CCR5(單獨(dú)或與CD4一起)的HeLa細(xì)胞染色的能力。在存在CD4時在任何mAb將細(xì)胞表面CCR5染色的能力中都沒有觀察到差異(未顯示數(shù)據(jù))。如果這兩種蛋白質(zhì)之間存在關(guān)聯(lián)，那么它不包括我們能夠得到的抗CCR5 mAb識別的表位?；蛘撸珻CR5與CD4之間的關(guān)聯(lián)可能只發(fā)生在原代淋巴細(xì)胞上。
3)使用CCR5丙氨酸突變體的mAb表位作圖所有抗體都不能通過Western印跡來檢測還原和變性CCR5蛋白質(zhì)，指示它們識別構(gòu)象敏感性表位(未顯示數(shù)據(jù))。使用CCR5 Nt和ECL中殘基的一組70種丙氨酸點(diǎn)突變體進(jìn)行mAb表位作圖研究。用附加了C末端HA標(biāo)簽的突變型或野生型CCR5表面序列脂轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，并感染vTF7(23)以加強(qiáng)輔助受體表達(dá)。然后將細(xì)胞與抗-CCR5 mAb一起溫育，并通過將PE標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG揭示它們的結(jié)合。使用經(jīng)FITC標(biāo)記的抗HA mAb(BabCo)進(jìn)行第二輪胞內(nèi)染色。這種內(nèi)部對照容許我們將抗CCR5mAb對細(xì)胞表面上突變型感受態(tài)表達(dá)水平的染色直接標(biāo)準(zhǔn)化。由此，將每種突變體的mAb結(jié)合表述成與野生型CCR5的結(jié)合百分比(圖4)。
某些點(diǎn)突變將所有抗體與CCR5的結(jié)合降低＞50％。一般而言，PA8-PA12受到此類突變體的影響最大，PA14和2D7受到的影響最小，這類突變體包括半胱氨酸對C110A和C178A；Nt突變體Y10A、D11A、K25A；ECL1突變體D95A；ECL2突變體K171A/E172A、Q188A、K191A/N192A；和ECL3突變體F263A和F264A(圖1)。一種解釋是這些殘基本質(zhì)上不是mAb表位的一部分，但是將它們變成丙氨酸引起對所有mAb結(jié)合具有共同效果的構(gòu)象擾動。我們假設(shè)，如果突變將個別mAb的結(jié)合降低＞75％，但是不降低大多數(shù)其它抗體的結(jié)合，那么該殘基可能是由該mAb識別的表位的直接貢獻(xiàn)者。使用這些嚴(yán)謹(jǐn)方針，得出下面的結(jié)論7種抗CCR5mAb識別交疊但不同的表位(圖4)。MAb PA8與CCR5的結(jié)合依賴Nt中的N13和Y15。MAb PA9和PA10需要Nt中的D2、Y3、Q4、P8和N13以及ECL2中的Y176和T177。Mab PA9還需要Nt中的S7。MAb PA11和PA12結(jié)合依賴Nt中的Q4。PA14需要Nt中的D2以及ECL2中的R168和Y176。最后，mAb 2D7為了結(jié)合CCR5需要ECL2中的Q170和K171/E172。
4)存在抗CCR5 mAb時的趨化因子信號趨化因子受體結(jié)合劑可以是由受體介導(dǎo)的胞內(nèi)信號的拮抗劑或(更少見的)激動劑?；蛘?，它們可能對信號沒有影響。CCR5能夠結(jié)合3種CC-趨化因子即RANTES、MIP-1α和MIP-1β，并轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控胞質(zhì)鈣水平的信號。因此，我們測試了多種濃度的mAb PA8-PA12、PA14和2D7的激動劑/拮抗劑活性。在加載了1-吲哚的L1.2-CCR5+細(xì)胞中測量胞內(nèi)鈣濃度(Ca2+)i的變化。所有mAb都不能刺激(Ca2+)i變化，指示它們不是CCR5的激動劑。甚至在高到100μg/ml的濃度，PA8-PA12同樣不能抑制由RANTES誘導(dǎo)的Ca2+流(圖5A和未顯示數(shù)據(jù))，顯示它們也不是拮抗劑。這些濃度提供了mAb對L1.2-CCR5+細(xì)胞的飽和結(jié)合，正如流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)和gp120/CCR5結(jié)合測定法所顯示的(圖6D和未顯示數(shù)據(jù))。然而，MAb PA14和2D7阻斷由RANTES誘導(dǎo)的鈣轉(zhuǎn)移，盡管效力不同(圖5A、5B)。PA14鈣流抑制的IC50是50μg/ml，比2D7的IC50高大約8倍(圖5B)。由RANTES、MIP-1α和MIP-1β誘導(dǎo)的鈣流都被相似濃度的PA14所抑制(未顯示數(shù)據(jù))。所有mAb都不能在內(nèi)源表達(dá)CXCR4的L1.2-CCR5+細(xì)胞中影響由SDF-1誘導(dǎo)的鈣轉(zhuǎn)移(未顯示數(shù)據(jù))。最后，mAb或CC趨化因子都不能在親本L1.2細(xì)胞中影響胞質(zhì)鈣水平(未顯示數(shù)據(jù))。
5)mAb對CCR5輔助受體功能的抑制最初是根據(jù)它們抑制由HIV-1包膜介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合的能力而選擇了mAb PA8-PA12和PA14。對純化的mAb的這種能力進(jìn)行了確認(rèn)和定量。正如預(yù)料的，所有六種mAb以及mAb 2D7都在RET測定法中阻斷CD4+CCR5+PM1細(xì)胞與HeLa-EnvJR-FL+細(xì)胞之間的融合。效力的排列順序是2D7～PA14＞PA12＞PA11＞PA10～PA9～PA8(圖6A)。PA14和2D7的IC50值分別是1.7μg/ml和1.6μg/ml，PA11和PA12分別是25.5μg/ml和10.0μg/ml(圖3)。PA8、PA9和PA10在300μg/ml將融合抑制了只有10-15％。所有mAb都不能抑制PM1細(xì)胞與表達(dá)來自X4病毒的全長包膜蛋白的HeLa-EnvLAI+細(xì)胞之間的融合(未顯示數(shù)據(jù))。
還測試了不同抗CCR5 mAb在單輪復(fù)制、基于熒光素酶的侵入測定法中抑制原型R5病毒、JR-FL、和R5X4病毒Gun-1的能力。在侵入測定法中的效力的排列順序與在細(xì)胞-細(xì)胞融合測定法中測定得到的相似(圖6B)。使用PA8-PA11不能得到對JR-FL或Gun-1侵入的＞50％抑制。PA12的IC50值是2.5μg/ml。然而，對于這種mAb不能得到＞60％的侵入抑制。PA14和2D7抑制JR-FL侵入的IC50值分別測定為0.024和0.026μg/ml(圖3)，比在融合測定法中獲得的低60倍。雙重向性Gun-1的侵入對抗CCR5mAb的抑制比JR-FL侵入敏感2-3倍(未顯示數(shù)據(jù))。
抗輔助受體mAb可能或是通過直接影響gp120/CCR5相互作用或是通過阻止涉及活性融合復(fù)合物形成的結(jié)合后步驟來抑制由包膜介導(dǎo)的融合。為了確定PA8-PA12和PA14抑制病毒融合和侵入的機(jī)制，還測試了不同mAb阻斷gp120/CCR5相互作用的能力。為此，使用了檢測復(fù)合了sCD4的生物素化HIV-1JR-FLgp120結(jié)合L1.2-CCR5+細(xì)胞的測定法。在缺乏sCD4或CCR5時，或者在使用HIV-1LAIgp120時，沒有觀察到生物素化gp120的結(jié)合(圖6C)。
除了PA8以外，所有mAb都能消除gp120/sCD4結(jié)合L1.2-CCR5+(圖6D)。PA8的抑制在約40％時飽和，這與流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)的數(shù)據(jù)一致(圖1)，說明這種mAb只結(jié)合L1.2-CCR5+細(xì)胞上CCR5分子的一個子集。mAbPA9、PA10、PA11和PA12抑制結(jié)合，IC50值分別為0.24、0.13、0.33和0.24μg/ml(圖3)。令人驚訝的是，mAb PA14和2D7是gp120/sCD4結(jié)合的兩種最低效率的抑制劑，IC50值分別為1.58和1.38μg/ml(圖3)。因此，mAb抑制由gp120/CD4/CCR5介導(dǎo)的融合和侵入的能力與其阻斷gp120/sCD4結(jié)合輔助受體的能力之間沒有關(guān)聯(lián)。
6)抗CCR5 mAb與其它病毒侵入抑制劑聯(lián)合對HIV-1融合的協(xié)同抑制輔助受體特異性試劑可以在侵入過程的多個階段發(fā)揮作用，并在聯(lián)合使用時展示非添加效應(yīng)。從臨床觀點(diǎn)上說，重要的是要測定輔助受體特異性藥物候選物與可能提供某種水平針對疾病進(jìn)展起保護(hù)作用的內(nèi)源趨化因子的相互作用。因此，測試CCR5 mAb彼此、或與RANTES、或與結(jié)合HIV-1 gp120而抑制附著于靶細(xì)胞的CD4-IgG2的聯(lián)合。在病毒融合和侵入測定法中獲得試劑單獨(dú)和聯(lián)合使用時的劑量應(yīng)答曲線。使用中值效應(yīng)原理(9)分析數(shù)據(jù)。在數(shù)量上比較產(chǎn)生指定效應(yīng)所需要的單一試劑或其混合物的濃度即稱為聯(lián)合指數(shù)(CI)的術(shù)語。CI值超過1指示拮抗劑，CI約為1指示添加效應(yīng)，而CI低于1指示協(xié)同效應(yīng)即一種試劑的存在增強(qiáng)另一種試劑的效果。
PA12和2D7的聯(lián)合具有最強(qiáng)協(xié)同效力，根據(jù)抗體比例CI值的范圍在0.02-0.29之間(圖7和圖2)。已知協(xié)同程度隨著試劑的化學(xué)計(jì)量而變化。病毒侵入和融合測定法在鑒定高度協(xié)同的PA12和2D7、中度協(xié)同的PA12和PA14、添加的PA11和PA12、以及微弱拮抗的PA14和2D7 mAb聯(lián)合時是一致的?？紤]到根據(jù)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)的測定(未顯示數(shù)據(jù))PA14與2D7交叉競爭與CCR5+細(xì)胞的結(jié)合，這兩種mAb之間缺乏協(xié)同并不出人意料。PA11與PA12之間添加效應(yīng)的觀察結(jié)果可能指示CCR5中略微不同的表位，它們共享對Nt中殘基Q4的依賴型。
還測試了mAb PA12、PA14和2D7與RANTES協(xié)同阻斷細(xì)胞-細(xì)胞融合的能力。PA12與RANTES的聯(lián)合展示中度協(xié)同(圖2)。PA14和2D7展示與RANTES沒有協(xié)同，這與這些mAb抑制RANTES結(jié)合和信號是一致的(圖5A、5B)。最后，我們測試了mAb PA12、PA14、2D7和與gp120相互作用的CD4-IgG2之間的協(xié)同。我們觀察到PA12與CD4-IgG2之間的中度協(xié)同，而PA14或2D7與CD4-IgG2之間沒有協(xié)同(圖2)。
C.試驗(yàn)討論分離并表征了六種鼠抗CCR5 IgG1 mAb。盡管PA8、PA9、PA11、PA12和PA14屬于不同的分子種類，而PA9和PA10通過分析不能區(qū)分，因而可能是相同的mAb。分離的所有mAb都識別復(fù)雜的構(gòu)象表位，正如針對天然的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)所生產(chǎn)的mAb的常見情況。使用一組CCR5丙氨酸點(diǎn)突變體對所有mAb進(jìn)行了表位作圖。假設(shè)相似影響所有mAb結(jié)合的殘基引起輔助受體的構(gòu)象擾動但不構(gòu)成mAb表位的一部分。只有兩個這樣的殘基即Y10和D11顯示影響HIV-1侵入(20，52)。PA8、PA11和PA12表位完全位于Nt結(jié)構(gòu)域內(nèi)。與此結(jié)果一致，PA8能夠在ELISA中結(jié)合包含殘基D2至R31的生物素化Nt肽(未顯示數(shù)據(jù))。然而，其結(jié)合只強(qiáng)烈依賴Q4的PA11和PA12在溶液中不結(jié)合Nt肽(未顯示數(shù)據(jù))。一種可能性是Nt肽不采取PA11和PA12所識別的正確構(gòu)象，而PA8結(jié)合可能不太依賴構(gòu)象。或者，PA11和PA12可能與我們尚未突變的殘基相互作用，或者位于CCR5其它結(jié)構(gòu)域中的氨基酸形成弱鍵，或者結(jié)合其呈現(xiàn)未曾因誘變而改變的肽主鏈原子。抗體PA9、PA10和PA14識別包含CCR5 Nt和ECL2兩個結(jié)構(gòu)域中的殘基的表位，而2D7表位完全位于ECL2中。
PA14表位包含Nt中的D2和ECL2中的R168二者，指示這兩個殘基在mAb足跡(footprint)圖譜的內(nèi)容中彼此鄰近。它們甚至可能通過它們的相反電荷而彼此直接相互作用。
mAb PA8-PA12和PA14以不同強(qiáng)度且以依賴細(xì)胞類型的方式將CCR5+細(xì)胞染色。除了PA8以外，所有mAb將染色＞90％的L1.2-CCR5+細(xì)胞，使用PA11和PA12時觀察到最高平均熒光強(qiáng)度。然而，PA14和2D7將最高百分比的PBMC染色，也在這些細(xì)胞上產(chǎn)生最高平均熒光強(qiáng)度。Hill等人(28)最近鑒定了將轉(zhuǎn)染細(xì)胞相似染色的一組抗CCR5 mAb，但是八種中只有兩種將PBMC染色，而且都不能將原代單核細(xì)胞染色。對CCR5的低親和力可能是這兩種mAb與原代細(xì)胞沒有反應(yīng)性的原因，但是這不可能是其它四種不能反應(yīng)的解釋。在我們的mAb組中，我們觀察到mAb 2D7和PA14對PBMC的最大強(qiáng)度染色，它們的表位完全或部分位于ECL2的前十個殘基中。然而，Hill等人報(bào)道了對Nt和ECL1特異的mAb將PBMC染色，而針對ECL2和ECL3的mAb不能將PBMC染色，因而尚未鑒定反應(yīng)性的一致模式。mAb的細(xì)胞類型特異性染色的一種解釋是激活后的PBMC(和單核細(xì)胞)分泌CC-趨化因子，它們結(jié)合細(xì)胞表面CCR5而掩蓋有些mAb表位。然而，希望這對PA14和2D7尤其正確，它們是由趨化因子誘導(dǎo)的鈣轉(zhuǎn)移的拮抗劑，并且大概與CC-趨化因子競爭CCR5結(jié)合。至今這些mAb將PBMC染色的強(qiáng)度最大?；蛘?，不同CCR5表位暴露可能反映了細(xì)胞類型特異性受體的寡聚化、與其它細(xì)胞表面分子的關(guān)聯(lián)、或不同翻譯后修飾諸如糖基化。我們已經(jīng)顯示了mAb結(jié)合的差異可能不反映CD4/CCR5相互作用中的細(xì)胞類型特異性差異。
MAb PA8-PA12在CCR5+細(xì)胞中不抑制由CC-趨化因子誘導(dǎo)的鈣轉(zhuǎn)移，它們也不介導(dǎo)經(jīng)由CCR5的信號。MAb 2D7和PA14是由CC-趨化因子誘導(dǎo)的鈣轉(zhuǎn)移的抑制劑，但是2D7的效力幾乎比PA14高一個數(shù)量級。這可能是因?yàn)镻A14表位與CCR5上CC-趨化因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重疊程度低于2D7表位。所有mAb也都阻斷HIV-1侵入和由包膜介導(dǎo)的膜融合，但是在某些情況中細(xì)胞-細(xì)胞融合抑制所需要的抗體比阻斷病毒侵入的需要幾乎高兩個數(shù)量級。與病毒-細(xì)胞融合相比，大概在細(xì)胞-細(xì)胞融合過程中建立了更多的gp120/CD4/CCR5相互作用以及粘附分子之間的相互作用并且協(xié)同作用，使之更難以抑制。在使用針對LFA-1或HIV-1包膜糖蛋白的抗體時常常觀察到這種現(xiàn)象(45，51)。甚至在最高抗體濃度，PA8、PA9和PA10也不能將細(xì)胞-細(xì)胞融合阻斷＞15％，而且不能將病毒侵入阻斷＞40％。然而，使用PA11、PA12和PA14能夠獲得＞90％的融合抑制，而且使用PA14能夠獲得＞90％的侵入抑制。六種mAb中阻斷融合和侵入效力最大的是PA14，它像2D7一樣有效。令人驚訝的是，PA14和2D7是gp120/sCD4結(jié)合L1.2-CCR5+細(xì)胞的最小效力抑制劑，而PA9-PA12的阻斷效力相似，而PA8不能將gp120/sCD4結(jié)合阻斷＞40％。這些觀察結(jié)果提出了關(guān)于不同細(xì)胞上展示的CCR5分子的本質(zhì)以及病毒融合和侵入的抑制機(jī)制的問題?？赡躮Ab和gp120結(jié)合測定法中所使用的L1.2細(xì)胞上的CCR5與mAb結(jié)合測定法中所使用的PBMC上的CCR5或者與融合和侵入測定法中所使用的PM1和U87MG細(xì)胞上的CCR5并非處于相同構(gòu)象。
我們的一些mAb對PBMC的低染色以及對融合和侵入的部分抑制指示它們只能夠結(jié)合原代淋巴細(xì)胞、PM1和U87MG-CD4+CCR5+細(xì)胞系上表達(dá)的CCR5分子的一個子集。然而，除了PA8以外，所有mAb都能夠?qū)1.2-CCR5+細(xì)胞染色＞90％，而且能夠完全阻斷gp120/sCD4復(fù)合物與這些細(xì)胞的結(jié)合。L1.2-CCR5+細(xì)胞與我們已經(jīng)使用的其它細(xì)胞之間的至少一個差異是細(xì)胞表面輔助受體蛋白質(zhì)的密度。事實(shí)上，我們估計(jì)L1.2-CCR5+細(xì)胞比PM1和U87MG-CD4+CCR5+細(xì)胞多表達(dá)10-100倍細(xì)胞表面輔助受體。但是，在改造HeLa細(xì)胞瞬時表達(dá)與L1.2-CCR5+細(xì)胞系同樣多的輔助受體后，我們?nèi)匀徊荒軝z測到與它們結(jié)合的gp120/sCD4(未顯示數(shù)據(jù))。因此，L1.2上CCR5的過度表達(dá)以及其它細(xì)胞特異性因子可能促成顯著暴露Nt使之更易于mAb和gp120二者接近的輔助受體構(gòu)象。這種構(gòu)象可能是由受體寡聚化、細(xì)胞表面蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)的減少或改變、或者受體與G蛋白的相互作用所誘導(dǎo)的(25，62)。細(xì)胞表面是否共存多種CCR5構(gòu)象，而且它們是否都容許病毒侵入？mAb的反應(yīng)性模式將回答它，因?yàn)樵趍Ab濃度飽和gp120結(jié)合L1.2-CCR5+細(xì)胞所需要的表位時，HIV-1侵入和融合也能夠發(fā)生，盡管水平降低。我們支持下面的假說L1.2-CCR5+細(xì)胞上存在的輔助受體分子具有HIV-1侵入受納構(gòu)象，而PBMC、PM1和CCR5+U87MG上的CCR5分子存在展示不同mAb反應(yīng)性的多種侵入受納狀態(tài)。雖然PA14和2D7可能識別所有構(gòu)象，但是其它mAb可能不行。為什么L1.2細(xì)胞有助于特定融合受納構(gòu)象仍然有待確定。
最近證明了gp120結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于CCR5 Nt結(jié)構(gòu)域的前20個殘基中。針對CCR5上gp120結(jié)合結(jié)構(gòu)域的mAb有效阻斷這種相互作用，但是在抑制HIV-1融合和侵入靶細(xì)胞方面幾乎不像表位位于該區(qū)域以外的PA14和2D7那樣有效。PA14識別Nt尖端和ECL2中的殘基，而2D7表位完全位于ECL2中。只能推測這些mAb的作用機(jī)制?？赡芩鼈兣cECL2前幾個殘基的結(jié)合誘導(dǎo)輔助受體構(gòu)象變化而防止膜融合?；蛘?，ECL2表位位阻可能阻礙了輔助受體寡聚化和融合受納蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。還有另一種可能性是ECL2中的殘基面向融合核的內(nèi)部，而且mAb的結(jié)合阻礙gp41將融合肽插入質(zhì)膜。相反，mAb PA8-PA12可能只是通過直接競爭與gp120/CD4復(fù)合物的結(jié)合來抑制融合和侵入。我們不知道表位暴露和CCR5親和力以外的參數(shù)是否決定這些mAb抑制病毒侵入的功效。尚不清楚為什么gp120/輔助受體相互作用之后的抑制步驟比直接阻斷該相互作用更加有效。一種解釋方式是假設(shè)與CCR5結(jié)合的gp120的解離速率比與CCR5結(jié)合的mAb的結(jié)合速率低得多。因此，每次mAb將自身與輔助受體分子脫離，病毒粒相關(guān)gp120分子就以準(zhǔn)不可逆方式替代它，因?yàn)檫@種相互作用導(dǎo)致膜融合。
抗-CCR5 mAb聯(lián)合之間的協(xié)同可能是它們與參與HIV-1侵入相互依賴性連續(xù)步驟的不同表位相互作用的結(jié)果。在PA12與2D7之間觀察到的協(xié)同程度(在許多情形下CI＜0.1)是異常的，因?yàn)閷τ诳笻IV-1抗體(33，35，61)、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(29)、或蛋白酶抑制劑(44)的聯(lián)合很少觀察到CI值＜0.2。由于其效力，在多種測定方式和濃度比例中檢查PA12∶2D7聯(lián)合，觀察到一貫高水平的協(xié)同。對于與PA14聯(lián)合的PA12觀察到中度協(xié)同。我們還觀察到PA12與CD4-IgG2之間的中度協(xié)同。CD4/gp120復(fù)合物是亞穩(wěn)定的，而且若它不能與輔助受體相互作用則衰退成非融合原狀態(tài)(45-48)。由于PA12直接阻斷CCR5上的gp120結(jié)合位點(diǎn)，因此它的存在可能將平衡轉(zhuǎn)向gp120/CD4復(fù)合物的失活。這將解釋為什么我們觀察到CD4-IgG2與mAb PA12之間在抑制融合和侵入方面的協(xié)同。mAb PA14與CD4-IgG2之間缺乏協(xié)同說明它們作用于病毒侵入過程中兩個不連續(xù)的且獨(dú)立的步驟。將需要聯(lián)合進(jìn)一步的研究來確定不同化合物在抑制病毒融合和侵入方面的協(xié)同的精確機(jī)制。
上述結(jié)果與HIV-1侵入以三個不同步驟發(fā)生的模型一致，即受體結(jié)合、輔助受體結(jié)合和由輔助受體介導(dǎo)的膜融合。單克隆抗體阻斷gp120結(jié)合以及HIV-1融合/侵入的能力之間缺乏聯(lián)系說明輔助受體結(jié)合與融合事件是分開的。觀察到的協(xié)同模式進(jìn)一步說明了融合過程中各個事件的順序。有效抑制該過程中間步驟即gp120結(jié)合的試劑諸如PA12與其之前和之后步驟的抑制劑協(xié)同作用。
實(shí)施例2背景日益增多的多藥抗性HIV-1要求尋找新型抗逆轉(zhuǎn)錄病毒試劑。CCR5是原代HIV-1分離株的必需融合輔助受體，而且為抗病毒療法提供了有希望的靶。PRO140是在體外在不影響CCR5趨化因子受體活性的濃度下有效抑制HIV-1侵入和復(fù)制的抗-CCR5單克隆抗體。在本研究中，我們使用HIV-1感染的治療性動物模型評估了PRO 140的體內(nèi)治療潛力。
方法用正常人PBMC重建CD-17 SCID小鼠，并感染R5分離株HIV-1JR-CSF。在達(dá)到病毒穩(wěn)定狀態(tài)時，用PRO 140或?qū)φ湛贵w腹膜內(nèi)處理動物，并使用Roche Amplicor測定法監(jiān)測病毒負(fù)荷。初步研究檢驗(yàn)了單劑1mg劑量的PRO 140。在多劑量研究中，每三天施用一次PRO 140達(dá)三周，劑量范圍0.1-1.0mg。在分開的試驗(yàn)中，使用流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)來檢驗(yàn)PRO140注射后淋巴細(xì)胞損耗的可能性。
結(jié)果單劑和多劑PRO 140都將所有經(jīng)處理動物中的病毒負(fù)荷降低至檢測不到的水平，而且病毒負(fù)荷降低的范圍達(dá)到1.8log10。單次注射PRO 140后觀察到病毒復(fù)制的暫時控制，而多次注射導(dǎo)致控制延長，而且沒有證據(jù)表明治療過程中發(fā)生病毒反彈。在由PRO 140介導(dǎo)的病毒負(fù)荷降低的動力學(xué)中觀察到依賴劑量的差異。流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析顯示PRO 140處理不導(dǎo)致淋巴細(xì)胞損耗，確認(rèn)了對體內(nèi)病毒復(fù)制的影響只是歸于CCR5阻斷。
結(jié)論P(yáng)RO 140在控制HIV-1感染hu-PBL-SCID小鼠模型中建立的HIV-1感染方面高度有效。這些發(fā)現(xiàn)為概念即具體而言的PRO 140療法和一般而言的CCR5抑制劑療法提供了體內(nèi)證據(jù)。
實(shí)施例3方法使用本文描述的方法，對人源化CCR5抗體(huPRO 140)測試在L1.2-CCR5細(xì)胞中阻斷由RANTES誘導(dǎo)的鈣轉(zhuǎn)移的能力和在人PBMC中阻斷HIV-1 CASE C 1/85復(fù)制的能力。
結(jié)果圖19中所示結(jié)果顯示了人源化CCR5抗體有效阻斷HIV-1而非RANTES。
參考文獻(xiàn)1.G.P.Allaway，K.L.Davis-Bruno，B.A.Beaudry，E.B.Garcia，E.L.Wong，A.M.Ryder，K.W.Hasel，M.C.Gauduin，R.A.Koup，J.S.McDougal和P.J.Maddon，1995，Expression and characterization of CD4-IgG2，a novelheterotetramer that neutralizes primary HIV type 1 isolates(中和原代HIV1型分離株的新型異四聚體的表達(dá)和鑒定)，AIDS Res.Hum.Retroviruses，11533-539。
2.G.P.Allaway，A.M.Ryder，G.A.Beaudry和P.J.Maddon，1993，Synergistic inibition of HIV-1 envelope-mediated cell fusion byCD4-based molecules in combination with antibodies to gp 120 or gp41(基于CD4的分子聯(lián)合針對gp120或gp41的抗體對由HIV-1包膜介導(dǎo)的細(xì)胞融合的協(xié)同抑制)，AIDS Res.Hum.Retroviruses，958l-587。
3.A.Amara，S.L.Gall，O.Schwartz，J.Salamero，M.Montes，P.Loetscher，M.Baggiolini，J.L.Virelizier和F.Arenzana-Seisdedos，1997，HIV coreceptordownregulation as antiviral principleSDF-1a-dependent internalization ofthe chemokine receptor CXCR4 contributes to inhibition of HIV replication(HIV輔助受體下調(diào)作為抗病毒原理趨化因子受體CXCR4的SDF-1a依賴性內(nèi)在化有助于抑制HIV復(fù)制)，J.Exp.Med.，186139-146。
4.E.A.Berger，1997，HIV entry and tropismthe chemokine receptorconnection(HIV侵入和向性趨化因子受體連接)，AIDS，11(增刊A)S3-S16。
5.P.D.Bieniasz和B.R.Cullen，1998，Chemokine receptors and humanimmunodeficiency virus infection(趨化因子受體和人類免疫缺陷病毒感染)，F(xiàn)rontiers in Bioscience，3d44-58。
6.P.D.Bieniasz，R.A.Fridell，I.Aramori，S.S.G.Ferguson，M.C.Caron和B.R.Cullen，1997，HIV-1-induced cell fusion is mediated by multipleregions within both the viral envelope and the CCR5 co-receptor(由HIV-1誘導(dǎo)的細(xì)胞融合是由病毒包膜和CCR5輔助受體內(nèi)的多個區(qū)域介導(dǎo)的)，EMBO，162599-2609。
7.A.Brelot，N.Heveker，O.Pleskoff，N.Sol和M.Alizon，1997，Role of thefirst and third extracellular domains of CXCR4 in humanimmunodeficiency virus coreceptor activity(CXCR4第一個和第三個胞外結(jié)構(gòu)域在人類免疫缺陷病毒輔助受體活性中的作用)，J.Virol.，714744-4751。
8.D.C.Chan和P.S.Kim，1998，HIV entry and its inhibition(HIV侵入及其抑制)，Cell，93681-684。
9.T.C.Chou和D.C.Rideout，Synergism and antagonism in chemotherapy(化療中的協(xié)同和拮抗)，紐約，Academic出版社，1991。
10.F.Cocchi，A.L.DeVico，A.Garzino-Derno，S.K.Arya，R.C.Gallo和P.Lusso，1995，Identification of RANTES，MIP-1αand MIP-1βas the majorHIV-suppressive factors produced by CD8 T-cells(RANTES、MIP-1α和MIP-1β作為由CD8 T細(xì)胞生產(chǎn)的主要HIV遏制因子的鑒定)，Science，2701811-1815。
11.R.I.Connor，K.E.Sheridan，D.Ceradini，S.Choe和N.R.Landau，1997，Change in co-receptor use correlates with disease progression in HIV-1infected individuals(輔助受體用途的變化與HIV-1感染個體中的疾病進(jìn)展有關(guān))，J.Exp.Med.，185621-628。
12.M.P.Crump，J.H.Gong，P.Loetscher，K.Rajarathnam，A.Amara，F(xiàn).Arenzana-Seisdedos，J.L.Virelizie，M.Baggiolini，B.D.Sykes和I.Clark-Lewis，1997，Solution structure and basis for functional activity ofstromal-cell derived factor-1；disassociation of CXCR4 activiation frombinding and inhibition of HIV-1(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1的溶液結(jié)構(gòu)和功能活性的基礎(chǔ)；CXCR4激活與HIV-1結(jié)合和抑制的分離)，EMBO，166996-7007。
13.A.G.Dalgleish，P.C.L.Beverly，P.R.Clapham，D.H.Crawford，M.F.Greaves和R.A.Weiss，1984，The CD4(T4)antigen is an essentialcomponent of the receptor for the AIDS retrovirus(CD4(T4)抗原是AIDS逆轉(zhuǎn)錄病毒受體的實(shí)質(zhì)成分)，Nature，312763-766。
14.H.D.Deng，R.Liu，W.Ellmeier，S.Choe，D.Unutmaz，M.Burkhart，P.DiMarizio，S.Marmon，R.E.Sutton，C.M.Hill，S.C.Peiper，T.J.Schall，D.R.Littman和N.R.Landau，1996，Identification of a major co-receptor forprimary isolates of HIV-1(HIV-1原代分離株的主要輔助受體的鑒定)，Nature，381661-666。
15.D.S.Dimitrov，1997，How do viruses enter cell？The HIV Co-receptorsteach us a lesson ofcomplexity(病毒如何進(jìn)入細(xì)胞？HIV輔助受體給我們上了一堂復(fù)雜性的課)，Cell，91721-730。
16.G.A.Donzella，D.Schols，S.W.Lin，K.A.Nagashima，P.J.Maddon，G.P.Allaway，T.P.Sakmar，E.D.Clercq和J.P.Moore，1998，JM3100，a smallmolecular that interacts with the CXCR4 co-receptor to prevent HIV-1 entty(JM3100，與CXCR4輔助受體相互作用以防止HIV-1侵入的小分子)，Nat.Med.，472-77。
17.B.J.Doranz，K.Grovit-Ferbas，M.P.Sharron，S.H.Mao，M.B.Goetz，E.S.Daar，R.W.Doms和W.A.O’Brien，1997，A small molecule inhibitordirected against the chemokine receptor CXCR4 prevents its use as anHIV-1 co-receptor(針對趨化因子受體CXCR4以防止其作為HIV-1輔助受體的用途的小分子抑制劑)，J.Exp.Med.，1861395-1400。
18.B.J.Doranz，Z.-H.Lu，J.Rucker，T.-Y.Zhang，M.Sharron，Y.-H.Cen，Z.-X.Wang，H.-H.Guo，J.-G.Du，M.A.Accavitti，R.W.Doms和S.C.Peiper，1997，Two distinct CCR5 domains can mediate co-receptor usage byhuman immunodeficiency virus type 1(兩個不同的CCR5結(jié)構(gòu)域能夠介導(dǎo)1型人類免疫缺陷病毒對輔助受體的利用)，J.Virol.，716305-6314。
19.T.Dragic，V.Litwin，G.P.Allaway，S.R.Martin，Y.Huanh，K.A.Nagashima，C.Cayanan，P.J.Maddon，R.A.Koup，J.P.Moore和W.A.Paxton，1996，HIV-1 entry into CD4+cells is mediated by the chemokinereceptor CC-CKR-5(HIV-1侵入CD4+細(xì)胞是由趨化因子受體CC-CKR-5介導(dǎo)的)，Nature，381667-673。
20.T.Dragic，A.Trkola，X.W.Lin，K.A.Nagashima，F(xiàn).Kajumo，L.Zhao，W.C.Olson，L.Wu，C.R.Mackay，G.P.Allaway，T.P.Sakmar，J.P.Moore和P.J.Maddon，1998，Amino terminal substitutions in the CCR5 co-receptorimpair gp120 binding and human immunodeficiency virus type 1 entry(CCR5輔助受體中的氨基末端替代削弱gp120結(jié)合和1型人類免疫缺陷病毒侵入)，J.Virol.，72279-285。
21.T.Dragic，A.Trkola和J.P.Moore，1997，HIV co-receptorsGateways tothe cell(HIV輔助受體進(jìn)入細(xì)胞的通道)，Advances in Research andTherapy，72-13。
22.M.Farzan，H.Choe，L.Vaca，K.Martin，Y.Sun，E.Deejardins，N.Ruffing，L.Wu，R.Wyatt，N.Gerard，C.Gerard和J.Sodroski，1998，Atyrosine-richregion in the N-terminus of CCR5 is important for humanimmunodeficiency virus type 1 entry and mediates an association betweengp120 and CCR5(CCR5 N末端酪氨酸富含區(qū)對1型人類免疫缺陷病毒侵入而言是重要的而且介導(dǎo)gp120與CCR5之間的結(jié)合)，J.Virol.，721160-1164。
23.T.R.Fuerst，E.G.Niles，F(xiàn).W.Studier和B.Moss，1986，Eukaryotictransient-expression system based on recombinant vaccinia virus thatsynthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase(合成噬菌體T7 RNA聚合酶的基于重組牛痘病毒的真核瞬時表達(dá)系統(tǒng))，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，838122-8126。
24.S.Genoud，F(xiàn).Kajurno，Y.Guo，D.A.D.Thompson和T.Dragic，CCR5-mediated human immunodeficiency virus entry depends on anamino-terminal domain gp120-binding site and on the conformationalintegrity of all four extracellular domains(由CCR5介導(dǎo)的人類免疫缺陷病毒侵入依賴氨基末端結(jié)構(gòu)域gp120結(jié)合位點(diǎn)和所有四個胞外結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象完整性)，J.Virol.，已提交。
25.U.Gether和B.K.Kobilka，1998，G protein-coupled receptors(G蛋白偶聯(lián)受體)，J.Biol.Chem.，27317979-17982。
26.C.Gordon，M.Muesing，A.E.I.Proudfoot，C.A.Power，J.P.Moore和A.Trkola，1998，Enhancement of human immunodeficiency virus type 1infection by the CC-chemokine RANTES is independent of the mechanismof virus-cell fusion(CC趨化因子RANTES對1型人類免疫缺陷病毒感染的增強(qiáng)不依賴病毒—細(xì)胞融合機(jī)制)，J.Virol.，印刷中。
27.N.Heveker，M.Montes，L.Germeroth，A.Amara，A.Trautmann，M.Alizon和J.Schneider-Mergener，1998，Dissociation of the signaling and antiviralproperties of SDF-1-derived small peptides(SDF-1衍生小肽的信號與抗病毒特性的分離)，Current Biology，8369-376。
28.C.M.Hill，D.Kwon，M.Jones，C.B.Davis，S.Marmon，B.L.Daugherty，J.A.DeMartino，M.S.Springer，D.Unutmaz和D.R.Littman，1998，Theamino terminus of human CCR5 is required for its function as a receptor fordiverse human and simian immunodeficiency virus envelope glycoproteins(人CCR5氨基末端是其作為不同人類和猿免疫缺陷病毒包膜糖蛋白受體發(fā)揮功能所需要的)，Virology，248357-371。
29.V.A.Johnson，D.P.Merrill，J.A.Videler，T.C.Chou，R.E.Byington，J.J.Eron，R.T.D’Aquila和M.S.Hirsch，1991，Two-drug combinations ofzidovudine，didanosine and recombinant interferon-alpha A inhibitreplication of zidovudine-resistant human immunodeficiency virus type 1synergistically in vitro即zidovudine、didanosine(重組α-干擾素的二藥組合在體外協(xié)同抑制zidovudine抗性1型人類免疫缺陷病毒的復(fù)制)，J.Infect.Dis.164646-655。
30.D.Klatzmann，E.Champagne，S.Chamaret，J.M.Gruest，D.Guetard，T.Hercent，J.C.Gluckman和L.Montagnier，1984，T-lymphocyte T4molecule behaves as the receptor for human retrovirus LAV(T淋巴細(xì)胞T4分子表現(xiàn)為人類逆轉(zhuǎn)錄病毒LAV受體)，Nature，312382-385。
31.K.E.Kuhmann，E.J.Platt，S.L.Kozak和D.Kabat，1997，Polymorphismin the CCR5 genes of African green monkeys and mice implicate specificamino acids in infections by simian and human immunodeficiency viruses(非洲青猴和小鼠CCR5基因多態(tài)性指示猿和人類免疫缺陷病毒感染中的特異氨基酸)，J.Virol.，718642-8656。
32.P.D.Kwong，R.Wyatt，J.Robinson，R.W.Sweet，J.Sodroski和W.A.Hendrickson，1998，Structure of an HIV gp120 envelope glycoprotein incomplex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody(與CD4受體和中和性人類抗體復(fù)合的HIV gp120包膜糖蛋白的結(jié)構(gòu))，Nature，393648-659。
33.S.Laal，S.Burda，M.K.Gorny，S.Karwowska，A.Buchbinder和S.Zolla-Pazner，1994，Synergistic neutralization of human immunodeficiencyvirus type 1 by combinations of human monoclonal antibodies(人類單克隆抗體組合對1型人類免疫缺陷病毒的協(xié)同中和)，J.Virol.，684001-4008。
34.B.Labrosse，A.Brelot，N.Heveker，N.Sol，D.Schols，E.D.Clercq和M.Alizon，1998，Determinants for sensitivity of human immunodeficiencyvirus co-receptor CXCR4 to the bicyclam AMD3100(人類免疫缺陷病毒輔助受體CXCR4對雙磺酸鈉AMD3100的敏感性的決定因素)，J.Virol.，726381-6388。
35.A.Li，H.Katinger，M.R.Posner，L.Cavacini，S.Zolla-Pazner，M.K.Gorny，J.Sodroski，T.C.Chou，T.W.Baba和R.M.Ruprecht，1998，Synergisticneutralization of simian-human immunodeficiency virus SHIV-vpu+bytriple and quadruple combinations of human monoclonal antibodies andhigh-titer anti-human immunodeficiency virus type 1 immunoglobulins(人類單克隆抗體和高滴度抗1型人類免疫缺陷病毒免疫球蛋白的三重和四重組合對猿—人類免疫缺陷病毒SHIV-vpu+的協(xié)同中和)，J.Virol.，723235-3240。
36.D.R.Littman，1998，Chemokine receptorskeys to AIDS pathogenesis(趨化因子受體AIDS發(fā)病機(jī)理的關(guān)鍵)，Cell，93677-680。
37.V.Litwin，未發(fā)表結(jié)果。
38.V.Litwin，K.Nagashima，A.M.Ryder，C.H.Chang，J.M.Carver，W.C.Olson，M.Alizon，K.W.Hasel，P.J.Maddon和G.P.Allaway，1996，Humanimmunodeficiency virus type 1 membrane fusion mediated by alaboratory-adapted strain and a primary isolate analyzed by resonanceenergy transrer(通過共振能轉(zhuǎn)移分析的由適合實(shí)驗(yàn)室的毒株和原代分離株介導(dǎo)的1型人類免疫缺陷病毒膜融合)，J.Virol.，706437-6441。
39.P.Loetscher，J.H.Gong，B.Dewald，M.Baggioloni和I.Clark-Lewis，1998，N-terminal peptides of stromal cell derived factor-1 with CXCchemokine receptor 4 agonist and antagonist activities(具有CXC趨化因子受體4激動劑和拮抗劑活性的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1的N末端肽)，J.Biol.Chem.，27322279-22283。
40.M.Mack，B.Luckow，P.J.Nelson，J.Cihak，G.Simmons，P.R.Clapham，N.Signoret，M.Marsh，M.Stangassinger，F(xiàn).Borlat，T.N.C.Wells，D.Schlondorff和A.E.I.Proudfoot，1998，Aminooxypentane-RANTESinduces CCR5 internalization but inhibits recyclinga novel inhibitorymechanisms of HIV infectivity(氨基氧戊烷-RANTES誘導(dǎo)CCR5內(nèi)在化但抑制循環(huán)HIV感染的新抑制機(jī)制)，J.Exp.Med.，1871215-1224。
41.P.J.Maddon，A.G.Dalgleish，J.S.McDougal，P.R.Clapham，R.A.Weiss和R.Axel，1986，The T4 gene encodes the AIDS virus receptor and isexpressed in the immune system and the brain(T4基因編碼AIDS病毒受體并且在免疫系統(tǒng)和大腦中表達(dá))，Cell，47333-348。
42.J.S.McDougal，M.S.Kennedy，J.M.Sligh，S.P.Cort，A.Mawle和J.K.A.Nicholson，1986，Binding of HTLVIII/LAV to T4+T cells by a complex ofthe 110K virus protein and the T4 molecule(通過110K病毒蛋白與T4分子的復(fù)合物HTLVIII/LAV結(jié)合T4+T細(xì)胞)，Science，231382-385。
43.A.McKnight，D.Wilkinson，G.Simmons，S.Talbot，L.Picard，M.Ahuja，M.Marsh，J.A.Hoxie和P.R.Clapham，1997，Inhibition of humanimmunodeficiency virus fusion by a monoclonal antibody to a co-receptor(CXCR4)is both cell type and virus strain dependent(針對輔助受體(CXCR4)的單克隆抗體對人類免疫缺陷病毒融合的抑制即依賴細(xì)胞類型又依賴病毒毒株)，J.Virol.，711692-1696。
44.D.P.Merrill，D.J.Manion，T.C.Chou和M.S.Hirsch，1997，Antagonismbetween human immunodeficiency virus type 1 protease inhibitors indinavirand saquinavir in vitro(1型人類免疫缺陷病毒蛋白酶抑制劑indinavir與saquinavir之間的體外拮抗)，J.Infect.Dis.，176265-268。
45.J.P.Moore，Y.Cao，L.Qing，Q.J.Sattentau，J.Pyati，R.Koduri，J.Robinson，C.F.Barbas，D.R.Burton和D.D.Ho，1995，Primary isolates ofhuman immunodeficiency virus type 1 are relatively resistant toneutralization by monoclonal antibodies to gp120 and their neutralization isnot predicted by studies with monomeric gp120(1型人類免疫缺陷病毒的原代分離株相對抵抗針對gp120的單克隆抗體的中和作用而且對單體gp120的研究沒有預(yù)報(bào)它們的中和作用)，J.Virol.，69101-109。
46.J.P.Moore，B.A.Jameson，R.A.Weiss和Q.J.Sattentau，The HIV-cellfusion reaction(HIV-細(xì)胞融合反應(yīng))，伯克萊屯，CRC出版公司，1993，J.Bentz編的《Viral Fusion Mechanisms》(病毒融合機(jī)制)。
47.J.P.Moore，J.A.McKeating，Y.Huang，A.Ashkenazi和D.D.Ho，1992，Viridons of primary human immunodeficiency virus type 1 isolates resistantto soluble CD4(sCD4)neutralization differ in sCD4 binding andglycoprotein gp120 retention from sCD4-sensitive isolates(抵抗可溶性CD4(sCD4)中和的1型人類免疫缺陷病毒原代分離株病毒粒與sCD4敏感性分離株在sCD4結(jié)合和糖蛋白gp120保持方面不同)，J.Virol.，66235-243。
48.J.P.Moore和R.W.Sweet，1993，The HIV gp120-CD4 interactiona targetfor pharmacological and immunological intervention(HIV gp120-CD4相互作用制藥學(xué)和免疫學(xué)干涉的靶)，Prospect in Drug Discovery andDesign，1235-250。
49.T.Murakami，T.Nakajima，Y.Koyanagi，K.Tachibana，N.Fujii，H.Tamamura，N.Yoshida，M.Waki，A.Matsumoto，O.Yoshie，T.Kishimoto，N.Yamamoto和T.Nagasawa，1997，A small molecule CXCR4 inhibitorthat blocks T cell line-tropic HIV-1 infection(阻斷T細(xì)胞系向性HIV-1感染的小分子CXCR4抑制劑)，J.Exp.Med.，1861389-1393。
50.W.C.Olson，未發(fā)表結(jié)果。
51.G.Pantaleo，G.Poli，L.Butini，C.Fox，A.I.Dayton和A.S.Fauci，1991，Dissociation between syncytia formation and HIV spreading.Suppressionof syncytia does not necessarily reflect inhibition of HIV infection(合胞體形成和HIV擴(kuò)散之間的分離。合胞體遏制并非必然反映對HIV感染的抑制)，Eur.J.Immunol.，211771-1774。
52.G.E.E.Rabut，J.A.Konner，F(xiàn).Kajumo，J.P.Moore和T.Dragic，1998，Alanine substitutions of polar and non-polar residues in the amino-terminaldomain of CCR5 differently impair entry of macrophage-and dual-tropicisolates of the human immunodeficiency virus type 1(CCR5氨基末端結(jié)構(gòu)域中極性和非極性殘基的丙氨酸替代不同程度削弱1型人類免疫缺陷病毒巨噬細(xì)胞和雙重向性分離株的侵入)，J.Virol.，723464-3468。
53.C.Rizzuto，R.Wyatt，N.Hernandez-Ramos，Y.Sun，P.Kwong，W.Hendrickson和J.Sodroski，1998，Identification of a conserved humanimmunodeficiency virus gpl20 glycoprotein structure important forchemokine receptor binding(對趨化因子受體結(jié)合重要的人類免疫缺陷病毒gp120糖蛋白保守結(jié)構(gòu)的鑒定)，Science，2801949-1953。
54.J.Rucker，M.Samson，B.J.Doranz，F(xiàn).Libert，J.F.Berson，Y.Yi，R.J.Smyth，R.G.Collman，C.C.Broder，G.Vassart，R.W.Doms和M.Parmentier，1996，Regions in theβ-chemokine receptors CCR-5 andCCR-2b that determine HIV-1 cofactor specificity(β-趨化因子受體CCR-5和CCR-2b中決定HIV-1輔助因子特異性的區(qū)域)，Cell，87437-446。
55.D.Schols，S.Struyf，J.V.Damme，J.A.Este，G.Henson和E.D.Clercq，1997，Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of thechemokine receptor CXCR4(趨化因子受體CXCR4選擇性拮抗對T向性HIV毒株的抑制)，J.Exp.Med.，1861383-1388。
56.G.Simmons，P.R.Clapham，L.Picard，R.E.Offord，M.M.Rosenkilde，T.W.Schwartz，R.Buser，T.N.C.Wells和A.E.I.Proudfoot，1997，Potentinhibition of HIV-1 infectivity in macrophages and lymphocytes by a novelCCR5 antagonist(巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中新型CCR5拮抗劑對HIV-1傳染性的有效抑制)，Science，276276-279。
57.G.Simmons，D.Wilkinson，J.D.Reeves，M.T.Dittmar，S.Beddows，J.Weber，G.Carnegie，U.Desselberger，P.W.Gray，R.A.Weiss和P.R.Clapham，1996，Primary，syncytium-inducing human immunodeficiencyvirus type-1 isolates are dual-tropic and most can use either LESTR orCCR5 as co-receptor for virus entry(原代、合胞體誘導(dǎo)的1型人類免疫缺陷病毒分離株具有雙重向性且大多能夠使用LESTR或CCR5作為病毒侵入的輔助受體)，J.Virol.，708355-8360。
58.J.M.Strizki，J.Davis-Turner，R.G.Collman，J.Hoxie和F.Gonzalez-Scarano，1997，A monoclonal antibody(12G5)directed againstCXCR4 inhibits infection with the dual-tropic human immunodeficiencyvirus type 1 isolate HIV-1 89.6 but not the T-tropic isolate HIV-1 HxB(針對CXCR4的單克隆抗體(12G5)抑制雙重向性1型人類免疫缺陷病毒分離株HIV-1 89.6而非T向性分離株HIV-1 HxB的感染)，J.Virol.，715678-5683。
59.A.Trkola，T.Dragic，J.Arthos，J.Binley，W.C.Olson，G.P.Allaway，C.Cheng-Mayer，J.Robinson，P.J.Maddon和J.P.Moore，1996，CD4-dependent，antibody sensitive interactions between HIV-1 and itsco-receptor CCR-5(HIV-1與其輔助受體CCR-5之間的CD4依賴性、抗體敏感性相互作用)，Nature，384184-187。
60.A.Trkola，W.A.Paxton，S.P.Monard，J.A.Hoxie，M.A.Siani，D.A.Thompson，L.Wu，C.R.Mackay，R.Horuk和J.P.Moore，1997，Geneticsubtype-independent inhibition of human immunodeficiency virus type-1replication by CC-and CXC-chemokines(CC和CXC趨化因子對1型人類免疫缺陷病毒復(fù)制的非遺傳亞型依賴性抑制)，J.Virol.，72396-404。
61.S.Vijh-Warrier，A.Pinter，W.J.Honnen和S.A.Tilley，1996，Synergisticneutralization of human immunodeficiency virus type 1 by a chimpanzeemonoclonal antibody against the V2 domain of gp120 in combination withmonoclonal antibodies against the V3 loop and the CD4-binding site(針對gp120 V2結(jié)構(gòu)域的黑猩猩單克隆抗體聯(lián)合針對V3環(huán)和CD4結(jié)合位點(diǎn)的單克隆抗體對1型人類免疫缺陷病毒的協(xié)同中和)，J.Virol.，704466-4473。
62.S.G.Ward，K.Bacon和J.Westwick，1998，Chemokines and lymphocytesmore than an attraction(趨化因子和淋巴細(xì)胞不只是吸引)，Immunity，91-11。
63.L.Wu，N.P.Gerard，R.Wyatt，H.Choe，C.Parolin，N.Ruffing，A.Borsetti，A.A.Cardoso，E.Desjardin，W.Newman，C.Gerard和J.Sodroski，1996，CD4-induced interaction of primary HIV-1 gp120 glycoproteins with thechemokine receptor CCR-5(原代HIV-1 gp120糖蛋白與趨化因子受體CCR-5之間由CD4誘導(dǎo)的相互作用)，Nature，384179-183。
64.L.Wu，G.LaRosa，N.Kassam，C.J.Gordon，H.Heath，N.Ruffing，H.Chen，J.Humblias，M.Samson，M.Parmentier，J.P.Moore和C.R.Mackay，1997，Interaction of chemokine receptor CCR5 with its ligandsmultiple domains for HIV-1 gp120 binding and a single domain forchemokine binding(趨化因子受體CCR5與其配體之間的相互作用用于HIV-1 gp120結(jié)合的多個結(jié)構(gòu)域和用于趨化因子結(jié)合的單個結(jié)構(gòu)域)，J.Exp.Med.，1861373-1381。
65.R.Wyatt，P.D.Kwong，E.Desjardins，R.Sweet，J.Robinson，W.Hendrickson和J.Sodroski，1998，The antigenic structure of the humanimmunodeficiency virus gp120 envelope glycoprotein(人類免疫缺陷病毒gp120包膜糖蛋白的抗原性結(jié)構(gòu))，Nature，393705-711。
66.R.Wyatt和J.Sodroski，1998，The HIV-1 envelope glycoproteinsfusogens，antigens and immunogens(HIV-1包膜糖蛋白融合原、抗原和免疫原)，Science，2801884-1888。
67.L.Ylisastigui，J.J.Vizzavona，E.Drakopoulou，P.Paindavoine，C.F.Calvo，M.Parmentier，J.C.Gluckman，C.Vita和A.Benjouad，1998，Svnthetic full length and truncated RANTES inhibit HIV-1 infection ofprimary macrophages(合成全長和截短RANTES抑制HIV-1感染原代巨噬細(xì)胞)，AIDS，12977-984。
68.J.L.Zhang，H.Choe，B.J.Dezube，M.Farzan，P.L.Sharma，X.C.Zhou，L.B.Chen，M.Ono，S.Gillies，Y.Wu，J.G.Sodroski和C.S.Crumpacker，1998，The bis-azo compound FP-21399 inhibits HIV-1 replication bypreventing viral entry(二氮化合物FP-21399通過防止病毒侵入來抑制HIV-1復(fù)制)，Virology，244530-541。
69.J.S.Cairns和M.P.D’Souza，1998，Chemokines and HIV-1 secondreceptorsthe therapeutic connection(趨化因子和HIV-1第二受體治療聯(lián)系)，Nature Medicine，1998，Vol.4，No.5563。
70.J.Michael Kilby等人，1998，Potent suppression of HIV-1 replication inhumans by T-20，a peptide inhibitor of gp41-medicated virus entry(由gp41介導(dǎo)的病毒侵入的肽抑制劑T-20在人類中對HIV-1復(fù)制的有效遏制)，Nature Medicine，Vol.3，No.111302。
71.1989年3月28日頒發(fā)給Cabilly等人的美國專利號4,816,567。
72.1993年7月6日頒發(fā)給Gregory Winter的美國專利號5,225,539。
73.1996年12月17日頒發(fā)給Queen等人的美國專利號5,585,089。
74.1997年12月2日頒發(fā)給Queen等人的美國專利號的5,693,761。
75.1989年12月28日提交的PCT國際申請?zhí)朠CT/US89/05857，1990年7月26日發(fā)表的WO 90/07861。
序列表<110>原基因藥物有限公司等<120>抗CCR5抗體<130>2048/57906-D-PCT<140>至今未知<141>HEREWITH<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>31<212>PRT<213>人<400>1Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr1 5 10 15Ser G1u Pro Cys Gln Lys Ile Asn Lys Gln Ile Ala Ala Ala Arg20 25 30<210>2<211>15<212>PRT<213>人<400>2His Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe Gly Asn Thr Met Cys Gln1 5 10 15<210>3<211>27<212>PRT<213>人<400>3Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr Cys Ser Ser His Phe Pro1 5 10 15Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn Phe Gln20 25<210>4<211>17<212>PRT<213>人
<213>HUMAN<400>4Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser Asn Arg Leu Asp1 5 10 15Gln<210>5<211>429<212>DNA<213>智人<400>5tctagaccac catgaagttg cctgttaggc tgttggtgct gatgttctgg attcctgctt 60ccagcagtga tattgtgatg acccaatctc cactctccct gcctgtcact cctggagagc120cagcctccat ctcttgcaga tctagtcagc gccttctgag cagttatgga catacctatt180tacattggta cctacagaag ccaggccagt ctccacagct cctgatctac gaagtttcca240accgattttc tggggtccca gacaggttca gtggcagtgg gtcagggaca gatttcacac300ttaagatcag tagagtggag gctgaggatg tgggagttta ttactgctct caaagtacac360atgttcctct cacgttcgga caggggacca aggtggaaat aaaacgtaag tagtcttctc420aactctaga429<210>6<211>129<212>PRT<213>智人<400>6Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala1 5 10 15Ser Ser Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val20 25 30Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Leu Leu35 40 45Ser Ser Tyr Gly His Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly50 55 60Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly65 70 75 80
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1.抗CCR5抗體或其結(jié)合人類細(xì)胞表面上CCR5的片段，所述抗體包含(i)兩條輕鏈，每條輕鏈包含質(zhì)粒pVKHuPRO 140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)的表達(dá)產(chǎn)物，和(ii)兩條重鏈，每條重鏈包含質(zhì)粒pVg1HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)的表達(dá)產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1的抗CCR5抗體，其中所述重鏈?zhǔn)怯少|(zhì)粒pVg1HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)表達(dá)的。
3.權(quán)利要求1的抗CCR5抗體，其中所述重鏈?zhǔn)怯少|(zhì)粒pVg1HuPRO140(mutB+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)表達(dá)的。
4.包含兩條輕鏈和兩條重鏈的抗CCR5抗體，其中每條輕鏈包含連續(xù)氨基酸，其氨基酸序列在SEQ ID NO6中列出，且每條重鏈包含連續(xù)氨基酸，其氨基酸序列在SEQ ID NO9中列出。
5.包含兩條輕鏈和兩條重鏈的抗CCR5抗體，其中每條輕鏈包含連續(xù)氨基酸，其氨基酸序列在SEQ ID NO6中列出，且每條重鏈包含連續(xù)氨基酸，其氨基酸序列在SEQ ID NO12中列出。
6.編碼包含連續(xù)氨基酸的多肽的分離核酸，SEQ ID NO6列出了其氨基酸序列。
7.權(quán)利要求6的核酸，其中所述連續(xù)氨基酸是由質(zhì)粒pVKHuPRO 140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)表達(dá)的氨基酸。
8.權(quán)利要求6的核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO5所列出的序列。
9.權(quán)利要求6、7或8中任何一項(xiàng)的核酸，其中所述核酸是RNA、DNA或cDNA。
10.編碼包含連續(xù)氨基酸的多肽的分離核酸，SEQ ID NO9列出了所述氨基酸的序列。
11.權(quán)利要求10的核酸，其中所述連續(xù)氨基酸是由質(zhì)粒pVg1HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)表達(dá)的氨基酸。
12.權(quán)利要求10的核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO8所列出的序列。
13.權(quán)利要求10、11或12中任何一項(xiàng)的核酸，其中所述核酸是DNA、RNA或cDNA。
14.編碼包含連續(xù)氨基酸的多肽的分離核酸，SEQ ID NO12列出了所述氨基酸的序列。
15.權(quán)利要求14的核酸，其中所述連續(xù)氨基酸是由質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mutB+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)表達(dá)的氨基酸。
16.權(quán)利要求14的核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO11所列出的序列。
17.權(quán)利要求14、15或16中任何一項(xiàng)的核酸，其中所述核酸是DNA、RNA或cDNA。
18.包含權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)的抗CCR5抗體或其片段中的至少一種以及載體的組合物。
19.一種包含權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)的抗-CCR5抗體或其片段的組合物，所述抗-CCR5抗體或其片段附著于選自下組的材料放射性同位素、毒素、聚乙二醇、細(xì)胞毒性試劑和可檢測標(biāo)記物。
20.抑制CD4+細(xì)胞的HIV-1感染的方法，包括使CD4+細(xì)胞接觸抗CCR5抗體或其結(jié)合CD4+細(xì)胞表面上CCR5的片段，所述抗體包含(i)兩條輕鏈，每條輕鏈包含質(zhì)粒pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)的表達(dá)產(chǎn)物，和(ii)兩條重鏈，每條重鏈包含質(zhì)粒pVg1HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mutB+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)的表達(dá)產(chǎn)物，接觸的數(shù)量和條件使得HIV-1或HIV-1感染細(xì)胞與CD4+細(xì)胞的融合得到抑制，從而抑制CD4+細(xì)胞的HIV-1感染。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述CD4+細(xì)胞表達(dá)CCR5。
22.治療受HIV-1之苦的受試者的方法，包括對受試者施用有效HIV-1治療劑量的抗CCR5抗體或其結(jié)合人類細(xì)胞表面上CCR5的片段，所述抗體包含(i)兩條輕鏈，每條輕鏈包含質(zhì)粒pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)的表達(dá)產(chǎn)物，和(ii)兩條重鏈，每條重鏈包含質(zhì)粒pVg1HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mutB+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)的表達(dá)產(chǎn)物，施用的條件有效治療所述受HIV-1之苦的受試者。
23.預(yù)防受試者免于感染HIV-1感染的方法，包括對受試者施用有效HIV-1感染預(yù)防劑量的抗CCR5抗體或其結(jié)合人類細(xì)胞表面上CCR5的片段，這些抗體包含(i)兩條輕鏈，每條輕鏈包含質(zhì)粒pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)的表達(dá)產(chǎn)物，和(ii)兩條重鏈，每條重鏈包含質(zhì)粒pVg1HuPRO140 HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)的表達(dá)產(chǎn)物，施用的條件在所述受試者中有效預(yù)防HIV-1感染。
24.權(quán)利要求22或23的方法，其中通過選自下組的方法將抗CCR5抗體施用于受試者靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)和皮下途徑。
25.權(quán)利要求22或23的方法，其中將所述抗CCR5抗體連續(xù)施用于所述受試者。
26.權(quán)利要求22或23的方法，其中以預(yù)定的定期間隔將所述抗CCR5抗體施用于所述受試者。
27.權(quán)利要求22或23的方法，還包括用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記所述抗CCR5抗體。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述可檢測標(biāo)記物是放射性或熒光標(biāo)記的物質(zhì)。
29.權(quán)利要求22或23的方法，其中所述抗CCR5抗體的劑量范圍是大約0.1-大約100,000μg/kg所述受試者體重。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述抗CCR5抗體的劑量不抑制所述受試者中內(nèi)源性趨化因子對CCR5的活性。
31.包含偶聯(lián)至少一種聚合物的抗CCR5抗體或其結(jié)合人類細(xì)胞表面上CCR5的片段的抗CCR5抗體偶聯(lián)物，所述抗體包含(i)兩條輕鏈，每條輕鏈包含質(zhì)粒pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)的表達(dá)產(chǎn)物，和(2)兩條重鏈，每條重鏈包含質(zhì)粒pVg1HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mutB+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)的表達(dá)產(chǎn)物。
32.權(quán)利要求31的抗CCR5抗體偶聯(lián)物，其中所述聚合物選自下組親水性聚乙烯聚合物、聚烷撐醚、聚氧化烯、聚甲基丙烯酸酯、卡波姆、支鏈多糖、無支鏈多糖、糖醇聚合物、肝素和類肝素。
33.權(quán)利要求32的抗CCR5抗體偶聯(lián)物，其中所述聚烷撐醚是聚乙二醇(PEG)或其衍生物。
34.權(quán)利要求33的抗CCR5抗體偶聯(lián)物，其中至少一種PEG具有至少20kD的平均分子量。
35.權(quán)利要求31的抗CCR5抗體偶聯(lián)物，其中所述偶聯(lián)物的表觀大小是至少大約500kD。
36.權(quán)利要求31的抗CCR5抗體偶聯(lián)物，其中所述偶聯(lián)物與未偶聯(lián)抗CCR5抗體或其片段相比具有以下各項(xiàng)中的至少一項(xiàng)血清半衰期增加、平均循環(huán)停滯時間增加以及血清清除率減小。
37.抑制HIV-1感染CCR5+細(xì)胞的方法，該方法包括對有HIV-1感染風(fēng)險(xiǎn)的受試者施用權(quán)利要求31的偶聯(lián)物，施用的數(shù)量和條件有效抑制HIV-1感染所述受試者的CCR5+細(xì)胞。
38.治療受試者中的HIV-1感染的方法，該方法包括對HIV-1感染受試者施用權(quán)利要求31的偶聯(lián)物，施用的數(shù)量和條件有效治療受試者的HIV-1感染。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述偶聯(lián)物的量有效降低受試者中的病毒負(fù)荷。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述偶聯(lián)物的量有效增加受試者中的CD4+細(xì)胞計(jì)數(shù)。
41.權(quán)利要求38的方法，其還包括對所述受試者施用至少一種常規(guī)抗病毒試劑。
42.權(quán)利要求37或38的方法，其中通過選自下組的方法將所述偶聯(lián)物施用于受試者靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和皮下途徑。
43.權(quán)利要求37或38的方法，其中將所述偶聯(lián)物連續(xù)施用于所述受試者。
44.權(quán)利要求37或38的方法，其中以預(yù)定的定期間隔將所述偶聯(lián)物施用于所述受試者。
45.權(quán)利要求37或38的方法，還包括用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記所述偶聯(lián)物。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述可檢測標(biāo)記物是放射性或熒光標(biāo)記的物質(zhì)。
47.包含至少兩種載體的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中至少一種載體包含編碼抗CCR5抗體重鏈的核酸序列，且至少一種載體包含編碼抗CCR5抗體輕鏈的核酸序列，其中所述抗CCR5抗體包含具有SEQ ID NO9所列出的氨基酸序列的兩條重鏈和具有SEQ ID NO6所列出的氨基酸序列的兩條輕鏈。
48.包含至少兩種載體的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中至少一種載體包含編碼抗CCR5抗體重鏈的核酸序列，且至少一種載體包含編碼抗CCR5抗體輕鏈的核酸序列，其中所述抗CCR5抗體包含具有SEQ ID NO12所列出的氨基酸序列的兩條重鏈和具有SEQ ID NO6所列出的氨基酸序列的兩條輕鏈。
49.權(quán)利要求47或48的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
50.權(quán)利要求49的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞。
51.權(quán)利要求47或48的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞分泌抗CCR5抗體。
52.權(quán)利要求47的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中所述編碼重鏈的載體是pVg1HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)。
53.權(quán)利要求48的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中所述編碼重鏈的載體是pVg1HuPRO140(mutB+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)。
54.權(quán)利要求47或48的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中所述編碼輕鏈的載體是pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)。
55.權(quán)利要求47的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中所述編碼重鏈的載體是pVg1HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)且所述包含輕鏈的載體是pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)。
56.權(quán)利要求48的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中所述編碼重鏈的載體是pVg1HuPRO140(mutB+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)且編碼所述輕鏈的載體是pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)。
57.權(quán)利要求47的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中所述編碼重鏈的核酸序列具有SEQ ID NO8所列出的核酸序列。
58.權(quán)利要求48的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中所述編碼重鏈的核酸序列具有SEQ ID NO11所列出的核酸序列。
59.權(quán)利要求47或48的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中所述編碼輕鏈的核酸序列具有SEQ ID NO5所列出的核酸序列。
60.包含編碼抗CCR5抗體重鏈的核酸序列的載體，其中所述重鏈包含SEQ ID NO9所列出的氨基酸序列。
61.權(quán)利要求60的載體，其中所述載體是pVg1HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)。
62.包含編碼抗CCR5抗體重鏈的核酸序列的載體，其中所述重鏈包含SEQ ID NO12所列出的氨基酸序列。
63.權(quán)利要求62的載體，其中所述載體是pVg1HuPRO140(mutB+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)。
64.包含編碼抗CCR5抗體輕鏈的核酸序列的載體，其中所述輕鏈包含SEQ ID NO6所列出的氨基酸序列。
65.權(quán)利要求64的載體，其中所述載體是pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)。
66.用于生產(chǎn)抗CCR5抗體的方法，包括在容許生產(chǎn)抗體的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞從而生產(chǎn)抗CCR5抗體，所述宿主細(xì)胞包含(i)質(zhì)粒pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)，和(ii)質(zhì)粒pVg1HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mutB+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)，所述抗體包含由質(zhì)粒pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)編碼的兩條輕鏈和由質(zhì)粒pVg1HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mutB+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)編碼的兩條重鏈。
67.用于生產(chǎn)抗CCR5抗體的方法，包括a)用(i)質(zhì)粒pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)和(ii)質(zhì)粒pVg1HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mutB+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；和b)在容許生產(chǎn)抗體的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞從而生產(chǎn)抗CCR5抗體，所述抗體包含由質(zhì)粒pVKHuPRO140-VK(ATCC保藏編號PTA-4097)編碼的兩條輕鏈和由質(zhì)粒pVg1HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mutB+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)編碼的兩條重鏈。
68.權(quán)利要求66或67的方法，其還包括以分離形式回收如此生產(chǎn)的抗CCR5抗體。
69.權(quán)利要求66或67的方法，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
70.權(quán)利要求69的方法，其中所述哺乳動物宿主細(xì)胞是COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞。
71.權(quán)利要求66或67的方法，其中所述抗CCR5抗體的重鏈?zhǔn)怯少|(zhì)粒pVg1HuPRO140HG2-VH(ATCC保藏編號PTA-4098)編碼的。
72.權(quán)利要求66或67的方法，其中所述抗CCR5抗體的重鏈?zhǔn)怯少|(zhì)粒pVg1HuPRO140(mut B+D+I)-VH(ATCC保藏編號PTA-4099)編碼的。
73.用于生產(chǎn)抗CCR5抗體的方法中的試劑盒，包含a)包含編碼抗CCR5抗體輕鏈的核酸序列的載體，其中所述輕鏈包含SEQ ID NO6所列出的氨基酸序列；和b)包含編碼抗CCR5抗體重鏈的核酸序列的載體，其中所述重鏈包含SEQ ID NO9所列出的氨基酸序列，或者包含編碼抗CCR5抗體重鏈的核酸序列的載體，其中所述重鏈包含SEQ ID NO12所列出的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗CCR5抗體或其結(jié)合人類細(xì)胞表面上CCR5的片段，所述抗體包含(1)兩條輕鏈，每條輕鏈包含質(zhì)粒pVKHuPRO140－VK(ATCC保藏編號PTA－4097)的表達(dá)產(chǎn)物，和(2)兩條重鏈，每條重鏈包含質(zhì)粒pVg1HuPRO140 HG2－VH(ATCC保藏編號PTA－4098)或質(zhì)粒pVg1HuPRO140(mutB+D+I)－VH(ATCC保藏編號PTA－4099)的表達(dá)產(chǎn)物。
文檔編號C07K16/28GK1780907SQ03809060
公開日2006年5月31日 申請日期2003年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月22日
發(fā)明者W·C·奧爾森, P·J·馬東, N·楚魯西塔, P·R·欣頓, M·瓦斯克斯 申請人:原基因藥物有限公司, 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室有限公司