專利名稱：G蛋白偶聯(lián)受體的配體與方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及G蛋白偶聯(lián)受體及結(jié)合該受體的配體的鑒定。更具體地講，本發(fā)明涉及到利用該受體在篩選系統(tǒng)中鑒定該受體的激動劑和拮抗劑的方法。本發(fā)明也涉及該受體新穎的肽配體、編碼這類肽配體的核酸以及制備和使用這類肽配體的方法。
背景技術(shù)：
G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答各種信號分子，包括激素、神經(jīng)遞質(zhì)和局部介質(zhì)，這些分子具有結(jié)構(gòu)和功能的多樣性包括蛋白質(zhì)和小肽以及氨基酸和脂肪酸衍生物。
盡管結(jié)合受體的信號分子具有化學(xué)和功能的多樣性，但所有的G蛋白偶聯(lián)受體，根據(jù)DNA測序研究，獲知其氨基酸序列具有相似的結(jié)構(gòu)，且?guī)缀蹩隙檫M化上相關(guān)的。它們由來回穿行于脂雙層七次的單個多肽鏈組成。這個受體家族的成員不僅已其氨基酸序列保守，而且同G蛋白的功能關(guān)系保守，即在細(xì)胞外配體存在下將信息放大傳送到細(xì)胞內(nèi)部。
G蛋白偶聯(lián)受體是一類存在于所有細(xì)胞膜表面的重要的藥物靶，并且與各種各樣的治療類別相關(guān)，包括疼痛控制和痛覺缺失、哮喘、炎癥、肥胖癥、癌癥、心血管病、代謝病、病毒病、免疫調(diào)節(jié)疾病、胃腸疾病與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。估計人類基因組中有超過1,000種G蛋白偶聯(lián)受體具有潛在的治療效用。雖然，GPCR在歷史上已經(jīng)成為有價值的藥物靶，但到目前為止僅有大約200個研究透徹的GPCR具有已知的配體，其中所述僅有約一半是現(xiàn)在商業(yè)化藥物的靶。余下的未鑒定出配體的GPCR通常被稱為“孤兒GPCR”。
一種特別重要的孤兒G蛋白偶聯(lián)受體是hRUP4受體，在下文稱為SP9155受體。SP9155受體也曾經(jīng)被稱為vc-38_1、AXOR16和GP103。該受體的氨基酸序列以前例如在數(shù)個國際申請中已公開，包括PCT/US99/19351(WO 00/11015)、PCT/US99/24065(WO00/22131)、PCT/US99/23687(WO 00/31258)、PCT/US00/16869(WO00/78809)、PCT/JP00/05684(WO 01/16316)和PCT/JP00/09409(WO 01/48189)。然而，在這些公開說明書中沒有公開SP9155受體的配體。SP9155受體具有與食欲肽A(orexin A)、食欲肽B和NPFF受體同源的氨基酸序列。已表明食欲肽A和B受體與代謝病如肥胖癥有關(guān)(Shiraish等，(2000)Physiol.Behav.71251-61；Mondal等，(1999)Neurosci.Lett.27345-48和Dun等，(2000)Regul.Pept.9665-70)。已表明NPFF受體與疼痛控制和痛覺缺失有關(guān)(Lake等，(1991)Neurosci.Lett.13229-32；Kavaliers等，(1992)Peptides 13603-607和Dong等，(2001)Cell 106619-632)。因此，對SP9155受體的配體的鑒定將對開發(fā)治療代謝紊亂和神經(jīng)障礙具有潛在的作用。
神經(jīng)肽是一類重要的具治療意義的GPCR配體，在大多數(shù)生物體(包括哺乳動物)的神經(jīng)系統(tǒng)中，這類配體用作信號分子。例如，已顯示RF-酰胺神經(jīng)肽具有不同的功能，包括興奮心臟(Greenberg等，(1979)，Am.Zoologist 19163-167和Groome等，(1994)Biol.Bull.186309-318)、控制肌肉收縮(Bowman等，(1996)Peptides 17381-387和Franks等，(1994)Parasitology 108229-236)、無脊椎動物的神經(jīng)調(diào)節(jié)(Brownlee等，(1995)Parasitology 111379-384和Cottrell等，(1983)Nature 304638-640)以及脊椎動物的抗阿片效應(yīng)(Kavaliers等，(1985)Neuroendocrinology 40533-535和Yang等，(1985)Prog.Clin.Biol.Res.192313-322)。因此，對與神經(jīng)肽如RF-酰胺結(jié)合的GPCR的鑒定也將可用于開發(fā)潛在的治療藥物。
發(fā)明概要本發(fā)明人在前已闡明了鑒定孤兒GPCR SP9155的配體的需要，使得有方法可篩選該受體的激動劑和拮抗劑。另外，本發(fā)明人也已鑒定出SP9155的新型肽配體和編碼SP9155配體的cDNA。
本發(fā)明提供一種鑒定SP9155的激動劑或拮抗劑的方法，所述方法包括下述步驟(a)在已知量的標(biāo)記SP9155配體存在下，使SP9155或其功能片段與需要測試所述激動劑或拮抗劑存在的樣品接觸；和(b)測量所述配體與所述受體特異性結(jié)合的量。在所述方法中，與不存在所述樣品的情況下測得的結(jié)果相比，測量到所述標(biāo)記配體與所述受體的結(jié)合顯著降低，則所述樣品被鑒定為含有激動劑或拮抗劑。優(yōu)選所述配體是包含SEQ ID No4-11或SEQ ID No13-18中任一個的氨基酸序列的多肽。優(yōu)選所述多肽是羧基末端酰胺化的。優(yōu)選所述受體包含SEQ ID No2或SEQ ID No20的氨基酸序列。優(yōu)選所述SP9155受體的來源是從表達(dá)所述受體的哺乳動物細(xì)胞中分離到的細(xì)胞膜。
本發(fā)明也提供一種鑒定SP9155受體或其功能片段的激動劑或拮抗劑的方法，所述方法包括下述步驟(a)在已知量的SP9155配體存在下，使表達(dá)所述受體的細(xì)胞與需要測試所述激動劑或拮抗劑存在的樣品接觸；和(b)測量所述細(xì)胞的鈣活動化。在所述方法中，與不存在所述樣品的情況下測得的結(jié)果相比，測量到鈣活動化顯著降低，則所述樣品被鑒定為含有拮抗劑；而與不存在所述樣品的情況下測得的結(jié)果相比，測量到鈣活動化顯著增加，則所述樣品被鑒定為含有激動劑。優(yōu)選細(xì)胞的鈣活動化如下測量使鈣與鈣指示劑接觸，然后測量所述指示劑的熒光，所述鈣指示劑例如1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羥基-3-氧-9-呫噸基)苯氧基]-2-(2′-氨基-5′-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸，五乙酰氧基甲酯(Fluor-3-AM)。優(yōu)選所述配體是包含SEQ ID NO4-11或SEQ ID NO13-18中任一個的氨基酸序列的多肽。優(yōu)選所述多肽是羧基末端酰胺化的。優(yōu)選所述SP9155受體包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO20的氨基酸序列。
本發(fā)明提供小鼠RF-酰胺前體和人RF-酰胺前體，所述前體分別包含SEQ ID NO3和SEQ ID NO4以及SEQ ID NO12和SEQ IDNO13所示的氨基酸序列和核苷酸序列。人前體和小鼠前體分別包括若干個較小的內(nèi)部肽，優(yōu)選為抗原肽，優(yōu)選包含SEQ ID NO5-11和SEQ ID NO12-18中任一個所示的氨基酸序列。人前體在腦、心臟和肝臟組織中表達(dá)。本發(fā)明也提供一種分離的抗原多肽，所述抗原多肽包含選自SEQ ID NO4(人前體)和SEQ ID NO13(小鼠前體)的氨基酸序列的7個或更多個連續(xù)殘基。在優(yōu)選的實施方案中，所述多肽是標(biāo)記的。所述多肽可包含一個未修飾或修飾的(如酰胺化)羧基末端。本發(fā)明也包括特異性結(jié)合本發(fā)明多肽的抗體分子。
本發(fā)明也提供一種編碼前體多肽(SEQ ID NO4或SEQ ID NO13)的分離的核酸，所述核酸最好分別包含SEQ ID NO3或SEQ IDNO12所示的核苷酸序列。還提供一種編碼抗原多肽、優(yōu)選編碼包含選自SEQ ID NO4(人前體)和SEQ ID NO13(小鼠前體)的氨基酸序列的7個或更多個連續(xù)殘基的抗原多肽的分離的核酸。優(yōu)選所述核酸包含SEQ ID NO3或SEQ ID NO12所示的核苷酸序列中的21或更多個連續(xù)核苷酸。
本發(fā)明還提供包含本發(fā)明核酸的重組載體和包含所述載體的宿主細(xì)胞。
小鼠SP91 55受體(如SEQ ID NO19和SEQ ID NO20)及其任何功能片段以及包含SEQ ID NO20所示的氨基酸序列的7個或更多個連續(xù)殘基的肽和編碼所述肽的核酸(如包含SEQ ID NO19所示的核苷酸序列的21或更多個連續(xù)核苷酸的核酸)是本發(fā)明的另一方面。
本發(fā)明還提供一種制備本發(fā)明多肽的方法，所述方法包括在載體中存在的核酸表達(dá)的條件下，培養(yǎng)包含本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選從所述培養(yǎng)物中分離所述多肽。
本發(fā)明也提供一種使包含選自SEQ ID NO4和SEQ ID NO13的氨基酸序列的7個或更多個連續(xù)殘基的抗原肽與識別所述肽的抗體分子結(jié)合的方法，所述方法包括使所述肽與所述抗體分子接觸的步驟。
本發(fā)明也提供一種治療或預(yù)防患者的由SP9155受體介導(dǎo)的醫(yī)學(xué)病癥的方法，所述方法包括給予所述患者包括識別本發(fā)明多肽的抗體分子以及藥學(xué)上可接受的載體的藥用組合物的步驟。所述方法可以用來治療疼痛或肥胖癥等醫(yī)學(xué)病癥。
本發(fā)明的RF-酰胺肽尤其可用于結(jié)合并調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的活性，所述受體如人SP9155受體(如SEQ ID NO1和2；另見WO 00/11015、WO 00/22131、WO 00/31256、WO 00/78809、WO 01/16316和WO 01/48189)或小鼠SP9155受體(如SEQ ID NO19和20)。人SP9155受體在腦、心臟、腎臟和結(jié)腸組織中表達(dá)。本發(fā)明的RF-酰胺肽也可以用作抗原肽，以產(chǎn)生識別人前體和小鼠前體或其任何亞序列的抗體分子。
發(fā)明詳述試驗本發(fā)明包括發(fā)現(xiàn)SP91 55受體或其功能片段的激動劑和拮抗劑可用于治療和處理多種由受體與其配體結(jié)合所介導(dǎo)的醫(yī)學(xué)病癥的試驗，所述醫(yī)學(xué)病癥例如代謝紊亂(如肥胖癥)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病(如疼痛)。具體地講，本發(fā)明的SP9155受體或其功能片段和RF-酰胺肽配體能用于這類篩選方法中。本質(zhì)上，這些方法包括使SP9155受體(如SEQ ID NO2或SEQ ID NO20)或其功能片段同SP9155配體(如SEQ ID NO4-11和SEQ ID NO13-18中任一個或其任何亞序列)與需要測試SP9155受體激動劑或拮抗劑存在的樣品接觸。
“樣品”或“侯選物”是指在實驗或測定中評價例如激動或拮抗SP9155受體(如SEQ ID NO2或SEQ ID NO20)或其功能片段的能力的組合物。樣品可以包括小分子、肽、核苷酸、多核苷酸、亞原子微粒和放射物(如α粒子、β粒子、γ射線、X射線)和抗體分子。
拮抗劑和激動劑可以調(diào)節(jié)SP9155受體(如SEQ ID NO2或SEQID NO20)或其功能片段結(jié)合配體例如RF-酰胺肽(如SEQ ID NO4-11和SEQ ID NO13-18中任一個或其任何亞序列)的能力，和/或調(diào)節(jié)SP9155受體或其功能片段產(chǎn)生胞內(nèi)信號(如G蛋白偶聯(lián)、鈣活動化)的能力。
優(yōu)選兩個基本類型的篩選系統(tǒng)，即標(biāo)記配體的結(jié)合試驗和“功能”分析。通過用可檢測標(biāo)記(如125I或3H)標(biāo)記SP9155受體的配體(如SEQ ID NO4-11和SEQ ID NO13-18中任一個或其任何亞序列)或已知的SP9155受體激動劑或拮抗劑，可以獲得結(jié)合試驗中所用的標(biāo)記配體。通常，使給定量的本發(fā)明SP9155受體(如SEQ ID NO2或SEQ ID NO20)與增量的標(biāo)記配體(如3H-p52)接觸，在通過洗滌除去未結(jié)合的標(biāo)記配體后，測定標(biāo)記配體的結(jié)合量。由于標(biāo)記配體的量是增加的，因此終點是達(dá)到所有受體結(jié)合位點都被占用或被飽和。通過大量超量的未標(biāo)記配體，可消除標(biāo)記配體的特異性受體結(jié)合。
優(yōu)選使用其中所述標(biāo)記配體與所述受體的非特異性結(jié)合最小的試驗系統(tǒng)。非特異性結(jié)合占所述標(biāo)記配體總結(jié)合的量通常小于50％、優(yōu)選小于15％、更優(yōu)選小于10％。
術(shù)語“SP9155受體的配體”包括本發(fā)明的RF-酰胺肽，例如，如表1中所述(如SEQ ID NO4-11或SEQ ID NO13-18中任一個)或其任何類似物。所述術(shù)語也包括含任何來自SEQ ID NO4或SEQ IDNO13的7個或更多個連續(xù)氨基酸的肽(下面有討論)。優(yōu)選所述肽配體是羧基末端酰胺化的。
原則上，利用本發(fā)明的可溶性受體可實施本發(fā)明的結(jié)合試驗，例如，在由標(biāo)準(zhǔn)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)方法制備和重折疊后，可以例如使用抗所述受體的抗體，使所得受體-標(biāo)記配體復(fù)合物沉淀。隨后對所述沉淀物進行洗滌，并且可以測量所述結(jié)合標(biāo)記受體的量。
然而，優(yōu)選將編碼本發(fā)明SP9155受體的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(例如HEK293或CHO)中，其中所述受體摻入到細(xì)胞膜中。然后可以從所述細(xì)胞中分離膜部分，作為供試驗用的受體源。優(yōu)選所述標(biāo)記配體與未轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜部分的特異性結(jié)合可忽略不計。
本發(fā)明的結(jié)合試驗可用于鑒定SP9155受體或其功能片段的激動劑和拮抗劑，因為，通常它們兩者均調(diào)節(jié)所述標(biāo)記配體與所述受體的結(jié)合。
在基礎(chǔ)的結(jié)合測定中，SP9155受體激動劑或拮抗劑的鑒定方法包括下述步驟(a)在已知量的標(biāo)記SP9155受體的配體(如SEQ ID NO4-11或SEQ ID NO13-18中任一個或其任何亞序列)存在下，使SP9155受體(如SEQ ID NO2、SEQ ID NO20或其功能片段)與樣品接觸；和(b)測量所述配體與所述受體特異性結(jié)合的量。
與不存在所述樣品的情況下測得的結(jié)果相比，測量到所述配體與所述受體的結(jié)合顯著降低，則所述樣品可被鑒定為含有激動劑或拮抗劑。
在本發(fā)明的一個實施方案中，上述方法包括在獨立的對照實驗中進行的額外步驟(c)在已知量的標(biāo)記配體存在下，使SP9155受體或其功能片段與已知是SP9155受體激動劑或拮抗劑的化合物接觸；和(d)測量所述標(biāo)記配體與所述受體結(jié)合的量。
細(xì)胞試驗或功能分析也可以用于測定樣品中是否含有SP9155受體的激動劑或拮抗劑。在這些試驗中，可利用公開的方法評價樣品調(diào)節(jié)SP9155受體(如SEQ ID NO2或SEQ ID NO20)介導(dǎo)的細(xì)胞參數(shù)的能力；這些參數(shù)包括但不限于由受體激活的胞內(nèi)第二信使途徑、細(xì)胞生長速率的變化、激素的分泌、鈣的活動化等。這些方法的實例包括測定所述配體對以下受體介導(dǎo)的抑制的影響毛喉素刺激的胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生(Parker等，(1995)Mol.Brain Res.34179-189)、受體刺激的Ca2+活動化和促有絲分裂效應(yīng)(Sethi等，(1991)Cancer Res.511674-1679)以及肌醇磷酸的產(chǎn)生和MAP激酶的誘導(dǎo)(Wang等，(1998)Biochemistry 376711-17)。在優(yōu)選的實施方案中，可利用熒光成像讀板儀(FLIPR)試驗，測定表達(dá)SP9155受體的細(xì)胞的鈣活動化，例如，Zhang等，(2001)Journal of Biol.Chem.276(11)8608-8615中所描述的那樣。一般而言，F(xiàn)LIPR試驗包括下述步驟(a)在已知量的SP9155受體的配體(如SEQ ID NO4-11或13-18中任一個或其任何亞序列)存在下，使表達(dá)SP9155受體(如SEQ ID NO2、SEQ ID NO20或其功能片段)的細(xì)胞(如HEK293細(xì)胞或CHO細(xì)胞)與樣品接觸；和(b)測定所述細(xì)胞的鈣活動化。
將細(xì)胞暴露于鈣指示劑可測定鈣活動化，所述指示劑如Fluor-3-Am(Molecule Probes；Eugene，OR；1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羥基-3-氧-9-呫噸基)苯氧基]-2-(2′-氨基-5′-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸，五乙酰氧基甲酯)。在Ca2+離子存在下，該指示劑發(fā)出熒光。通過例如用熒光成像讀板儀分析所述細(xì)胞，可以對熒光進行檢測。
與不存在所述樣品的情況下測得的結(jié)果相比，測量到鈣活動化顯著降低，則所述樣品可被鑒定為含有拮抗劑；而與不存在所述樣品的情況下測得的結(jié)果相比，測量到鈣活動化顯著增加，則所述樣品可被鑒定為含有激動劑。
分子生物學(xué)本發(fā)明的多肽和核酸的氨基酸序列和核苷酸序列示于所附序列表中，而且概述于下面的表1中。
表1.本發(fā)明的多肽和核酸

通常，前體在體內(nèi)識別位點上被切割，例如被蛋白酶(如弗林蛋白酶或激素原轉(zhuǎn)化酶)切割，產(chǎn)生包含羧基末端Arg-Phe(RF)基序的RF-酰胺肽。所述羧基末端隨后可由細(xì)胞酰胺酶酰胺化，產(chǎn)生一個Arg-Phe-C(＝O)-NH2(RF-酰胺)基序。具有SEQ ID NO4-11和SEQ IDNO13-18中任一個的氫基酸序列的肽可包含一游離的、未經(jīng)修飾的羧基末端，或者優(yōu)選包含酰胺化羧基末端。
標(biāo)有“*”號的SEQ ID NO5-11行括號內(nèi)數(shù)字表示這些肽所來源的人前體(SEQ ID NO4)的部分。同樣，標(biāo)有“*”號的SEQ ID NO14-18行括號內(nèi)數(shù)字表示這些肽所來源的小鼠前體(SEQ ID NO13)的部分。標(biāo)有
號的括號內(nèi)數(shù)字表示編碼所示肽的相應(yīng)人或小鼠前體基因的核苷酸。
雖然SEQ ID NO3和SEQ ID NO12所示的核苷酸序列是脫氧核糖核苷酸，但包含相應(yīng)核糖核苷酸序列的核酸也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。包括SEQ ID NO3和SEQ ID NO12的反義鏈或其任何亞序列的核酸也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在人SP9155基因中，已鑒定出若干個編碼單核苷酸多態(tài)性(cSNP)。每個cSNP(即g154a-G52S；t181g-F61V；t206g-V69G；g208t-V70L；t447g-H149Q；g748t-G250C；t1031c-L344S；c1111t-R371W；g1162a-G388R和c1228t-L410F)示于所附序列表中。此外，在人前體中，已鑒定出若干個cSNP。每個也示于所附序列表中的cSNP概述于下面的表2中。
表2.人前體的編碼單核苷酸多態(tài)性
依照本發(fā)明，可使用本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)、微生物學(xué)技術(shù)和重組DNA技術(shù)等。這些技術(shù)在文獻中已作充分地說明。參見如Sambrook，F(xiàn)ritsch & Maniatis，Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York(本文中″Sambrook等，1989″)；DNA CloningA Practical Approach，第I卷和第II卷(D.N.Glover主編，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait主編，1984)；Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins編著(1985))；TranscriptionAnd Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins編著(1984))；Animal CellCulture(R.I.Freshney主編，(1986))；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，(1986))；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等(編著)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“RF-酰胺”或“RF-酰胺肽”或“RF-酰胺多肽”包括本發(fā)明的任何肽(例如參見表1)或其任何形式的任何類似物。例如，所述術(shù)語包括含酰胺化羧基末端和含未修飾的羧基末端的肽。
術(shù)語“SP9155”或“SP9155受體”包括人受體(如SEQ ID NO1和2)和小鼠受體(如SEQ ID NO19和20)。
術(shù)語“受治療者”或“患者”是指任何生物體，優(yōu)選動物，更優(yōu)選哺乳動物(如小鼠、大鼠、兔、牛、狗、貓、牛、黑猩猩、大猩猩)，最優(yōu)選人。
本發(fā)明包括本發(fā)明RF-酰胺肽的重組形式。術(shù)語“重組體”可表示天然并不鄰接且彼此融合在一起的兩種或更多種的核酸或蛋白。所述術(shù)語也可以指因人為干涉而改變(如翻譯后修飾或突變)的核酸或蛋白。例如，野生型密碼子可被編碼相同氨基酸殘基的冗余密碼子或保守置換所取代，同時引入或去除核酸序列識別位點。同樣，可以將編碼所需功能的核酸區(qū)段融合在一起，產(chǎn)生自然界中并不存在的、編碼所需功能組合的一種遺傳實體。雖然限制性酶識別位點通常是所述人工操作的靶，但是也可以設(shè)計引入其他的位點特異性靶，如啟動子、DNA復(fù)制位點、調(diào)節(jié)序列、控制序列或其它有用的特征。如下所述，也可摻入用于檢測或純化的編碼附加表位的序列。
“多核苷酸序列”、“核酸序列”或“核苷酸序列”是核酸如DNA或RNA中連續(xù)的兩個或更多個核苷酸堿基(也稱為“核苷酸”)。
本發(fā)明包括表1中所述的任何多核苷酸的核酸片段(如SEQ IDNO3或12)。核酸“片段”包括例如SEQ ID NO3和SEQ ID NO12中任一個的以下數(shù)目的連續(xù)核苷酸至少約12、15、18或21(如22、23或24)，通常至少約25(如26、27、28、29、30、31、32、33或34)，優(yōu)選至少約35(如36、37、38、39、40、41、42、43或44)，更優(yōu)選至少約45(如46、47、48、49、50、51、52、53或54)，最優(yōu)選至少約55或更多個(如56、57、58、59、60、100、200、300、400、500、1000或1200)。
短核酸片段(如介于約10個核苷酸和約100個核苷酸之間)也可以被稱為“寡核苷酸”。寡核苷酸能用作PCR擴增的引物。本文所用的DNA“擴增”可表示使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)使DNA序列混合物中的特殊DNA序列的濃度增加。有關(guān)PCR的描述，參見Saiki等，(1988)Science 239487。通過摻入如32P-核苷酸、3H-核苷酸、14C-核苷酸、35S-核苷酸或是已共價綴合了標(biāo)記(如生物素)的核苷酸，可以標(biāo)記寡核苷酸和核酸片段。在一個實施方案中，標(biāo)記的寡核苷酸可用作檢測核酸存在的探針。在另一個實施方案中，寡核苷酸(可標(biāo)記它們中的一個或兩個)可用作PCR引物，以克隆全長基因或者基因片段，或者檢測核酸的存在。通常，寡核苷酸可合成制備，優(yōu)選在核酸合成儀上合成。
“蛋白質(zhì)序列”、“肽序列”或“多肽序列”或“氨基酸序列”可以指蛋白質(zhì)、肽或多肽中連續(xù)的兩個或更多個氨基酸。
“蛋白質(zhì)”、“肽”或“多肽”包括氨基酸的連續(xù)序列段。本發(fā)明的優(yōu)選肽包括在表1中所述的肽及其變異體(如羧基末端酰胺化變異體)和片段。所述片段優(yōu)選包含SEQ ID NO4和SEQ ID NO13中任一個以下數(shù)目的氨基酸殘基至少約4、5、6或7(如8、9、10或11)，優(yōu)選至少約12(如13、14、15、16、17、18或19)，更優(yōu)選至少約20(如21、22、23、24、25、26、27、28或29)，最優(yōu)選至少約30(如31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、124或136)或更多個。如以下所討論的，所述肽可用作抗原，以產(chǎn)生識別RF-酰胺肽前體肽(如SEQ ID NO4和SEQ ID NO13)的抗體分子或其任何片段。
本發(fā)明的多肽可由完整肽的蛋白酶剪切、化學(xué)合成或應(yīng)用重組DNA技術(shù)制備，并且不限于由蛋白酶切割位點描述的多肽。所述多肽用作抗原，可單獨或者交聯(lián)或綴合到載體分子，以使其更具免疫原性，誘發(fā)抗體及其片段的產(chǎn)生?？贵w可用于如供免疫親和純化等用的免疫測定中。
術(shù)語“分離的核酸”或“分離的多肽”可分別指如RNA或DNA分子或混合聚合物的核酸或多肽，所述核酸或多肽可部分或完全地從其它的成分中，通常從細(xì)胞或重組DNA表達(dá)系統(tǒng)中分離得到。這些成分包括但不限于細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、核糖體、聚合酶、血清組分和側(cè)翼基因組序列。因而所述術(shù)語包括已從天然環(huán)境中取出的核酸、也包括重組體或克隆DNA分離物以及化學(xué)合成的類似物或異種系統(tǒng)生物合成的類似物。
分離的核酸或多肽最好是基本同源的分子成分，但可以包含若干異質(zhì)成分。
術(shù)語“大致純的”可指RF-酰胺肽、核酸或其它物質(zhì)不含其它污染蛋白質(zhì)、核酸及其它來自原始生物體或重組DNA表達(dá)系統(tǒng)的生物學(xué)物質(zhì)。純度可由標(biāo)準(zhǔn)方法測定，通常純度超過至少約50％，優(yōu)選至少約75％，更優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％(如約100％)。純度評價基于質(zhì)量或摩爾數(shù)。
本發(fā)明還包括其氨基酸或核苷酸序列分別與表1中敘述的蛋白質(zhì)和核酸序列有序列同一性或相似性的蛋白質(zhì)和核酸。序列“同一性”是指相比較的兩個核苷酸序列或氨基酸序列之間完全匹配。序列“相似性”或“同源性”是指相比較的兩個多肽的氨基酸間的完全匹配和不完全相同的、生物化學(xué)上相關(guān)的氨基酸之間的完全匹配。生物化學(xué)相關(guān)的氨基酸共享相似的性質(zhì)并可互換。具有相似性質(zhì)并可互換的氨基酸是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，可互換的極性/親水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；可互換的非極性/疏水性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；可互換的酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；可互換的堿性氨基酸包括組氨酸、賴氨酸和精氨酸。
可通過已知方法容易地計算出序列“同一性”和“相似性”，所述已知方法包括但不限于以下文獻中介紹的那些方法(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.主編，Oxford UniversityPress，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.主編，Academic Press，New York，1993；Computer Analysisof Sequence Data，第I部，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.主編，HumanaPress，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，yonHeinje，G.主編，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.主編，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.等，(1988)，SIAM J.Applied Math.，481073。設(shè)計優(yōu)選同一性測定方法，以給出所測序列間的最大匹配。同一性和相似性的測定方法已編纂成公眾可得到的計算機程序。測定兩序列間同一性和相似性的優(yōu)選計算機程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等，(1984)Nucleic Acids Research 12(1)387)、BestFit、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等，(1990)J.Mol.Biol.215403-410。所述BLASTX程序公眾可得自NCBI以及其它資源(BLASTManual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.等，(1990)J.Mol.Biol.215403-410。也可以用熟知的史密斯沃特曼(Smith Waterman)算法來測定同一性。
多肽序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括下列參數(shù)1)算法Needleman等，(1970)，J.Mol.Biol.48443-453比較矩陣BLOSSUM62，得自Hentikoff等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.8910915-10919空位罰分(Gap Penalty)12空位長度罰分(Gap Length Penalty)4具備這些參數(shù)的有用程序稱為“gap”程序，公眾可得自GeneticsComputer Group，位于Madison，WI。上述參數(shù)為肽比較的默認(rèn)參數(shù)(連同無末端空位罰分一起)。
使用gap程序，優(yōu)選的多核苷酸比較參數(shù)包括下列參數(shù)1)算法Needleman等，(1970)J.Mol.Biol.48443-453比較矩陣匹配＝+10，錯配＝0空位罰分50空位長度罰分3本發(fā)明包括編碼表1中描述的多肽(如SEQ ID NO4-11和SEQ IDNO13-18)的核酸(如SEQ ID NO3和SEQ ID NO12)、其片段(上文所討論的)及與其雜交的核酸。核酸優(yōu)選在低嚴(yán)格性條件下雜交，更優(yōu)選在中等嚴(yán)格性條件下雜交，最優(yōu)選在高嚴(yán)格性條件下雜交。在適宜的溫度和溶液離子強度條件下，當(dāng)一條單鏈核酸分子可退火至另一條核酸分子時，所述核酸分子可與另一核酸分子如cDNA、基因組DNA或RNA“雜交”(參見Sambrook等，同上)。溫度和離子強度條件決定雜交的“嚴(yán)格性”。通常，低嚴(yán)格性雜交條件可以是55℃、5X SSC、0.1％SDS、0.25％乳汁并且不含甲酰胺；或30％甲酰胺、5X SSC、0.5％SDS。通常，中等嚴(yán)格性雜交條件與低嚴(yán)格性條件相似，只是在40％甲酰胺、5X SSC或6X SSC條件下進行雜交。高嚴(yán)格性雜交條件與低嚴(yán)格性條件相似，只是可以在50％甲酰胺、5XSSC或6X SSC和任選在較高的溫度(如57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃或68℃)下進行雜交。通常，SSC為0.15M氯化鈉和0.015M檸檬酸鈉。雜交需要兩核酸鏈含有互補序列，雖然根據(jù)雜交的嚴(yán)格性，堿基間的錯配是可能的。適宜的核酸雜交嚴(yán)格性取決于核酸的長度和互補的程度，所述程度的可變度是本領(lǐng)域眾所周知的。兩個核苷酸序列間的相似性或同源性程度越高，核酸可雜交的嚴(yán)格性也越高。通常，在至少約30個核苷酸的序列段上有至少約55％同一性，優(yōu)選在至少約25個核苷酸內(nèi)有至少約65％同一性，更優(yōu)選在約20個核苷酸或以上有至少約75％到約95％或更高的同一性時，可發(fā)生選擇性雜交。對于長度大于100個核苷酸的雜交體，已有計算其解鏈溫度的方程式(參見Sambrook等，同上，9.50-9.51)。對于較短核酸即寡核苷酸的雜交，錯配發(fā)生的位置變得更加重要，且寡核苷酸的長度決定它的特異性(參見Sambrook等，同上，11.7-11.8)。
需要進一步指出的是，編碼兩條多肽的兩條核酸是基本相同的，即第一條核酸編碼的多肽與第二條核酸編碼的多肽具有免疫學(xué)交叉反應(yīng)性。通常，如這兩條肽主要由于保守取代而不同時，可認(rèn)定一條多肽與第二條多肽是基本相同。
本發(fā)明也包括含核苷酸序列的核酸和含氨基酸序列的多肽，其序列與表1中的參比核苷酸序列和參比氨基酸序列有至少約70％同一性，優(yōu)選至少約80％同一性，更優(yōu)選至少約90％同一性，最優(yōu)選至少約95％同一性(如95％、96％、97％、98％、99％、100％)。本發(fā)明也包括含氨基酸序列的多肽，其序列與表1中的參比氨基酸序列(如SEQ ID NO4-11和SEQ ID NO13-18)有至少約70％相似性或同一性，優(yōu)選至少約80％相似性或同一性，更優(yōu)選至少約90％相似性或同一性，最優(yōu)選至少約95％相似性或同一性(如95％、96％、97％、98％、99％、100％)。此外，本發(fā)明包括編碼多肽的核酸，這些多肽的氨基酸序列與那些在表1中所述的氨基酸序列(如SEQ ID NO4-11和SEQID NO13-18)有至少約70％相似性或同一性，優(yōu)選至少約80％相似性或同一性，更優(yōu)選至少約90％相似性或同一性，最優(yōu)選至少約95％同一性或相似性(如96％、97％、98％、99％、100％)。
某些自然的變異體與本發(fā)明的RF-酰胺肽的氨基酸序列有大致氨基酸序列同源性。在本發(fā)明中，氨基酸序列同源性或序列同一性可由優(yōu)化殘基匹配，必要時，引入所需的空位來決定。通常，同源氨基酸序列在各自相應(yīng)序列中包括等位基因、多態(tài)性和種間變異。通常，同源蛋白質(zhì)或肽與所述RF-酰胺肽的氨基酸序列的同源性將由約25-100％(如果可以引入空位的話)到約50-100％(如果包括保守取代)。所觀察到的同源性通常是至少約35％，優(yōu)選至少約50％，更優(yōu)選至少約75％，最優(yōu)選至少約80％或以上。參見Needleham等，(1970)J.Mol.Biol.48443-453；Sankoff等，Time Warps，String Edits，andMacromoleculesThe Theory and Practice of Sequence Comparison，1983，Addison-Wesley，Reading，MA；及IntelliGenetics公司軟件包，MountainView，CA和the University of Wisconsin Genetics Computer Group，Madison，WI。
可用標(biāo)準(zhǔn)方法制備編碼RF-酰胺肽或其片段的核酸。例如可利用諸如以下的方法化學(xué)合成DNAMatteucci等的亞磷酰胺固相支持法(1981)(J.Am.Chem.Soc.1033185)、Yoo等的方法(1989)(J.Biol.Chem.76417078)或其它熟知的方法。如下所述，也可按順序連接一系列含成對合成寡核苷酸的寡核苷酸盒合成DNA。
當(dāng)然，由于遺傳密碼的簡并性，許多不同的核苷酸序列可以編碼本發(fā)明的RF-酰胺肽。選擇可優(yōu)化在原核或真核系統(tǒng)中表達(dá)的密碼子。當(dāng)然，本發(fā)明也包括這樣的簡并變異體。此外，可容易地通過核苷酸取代、核苷酸缺失、核苷酸插入和核苷酸序列段倒位等，修飾編碼本發(fā)明的RF-酰胺肽的核酸。這樣的修飾可產(chǎn)生可編碼其免疫原性或抗原活性與野生型肽相同的抗原的新的DNA序列。這些修飾序列可用于制備野生型或突變型肽或增強重組DNA系統(tǒng)的表達(dá)。
本發(fā)明的核酸可與控制轉(zhuǎn)錄(如啟動子；如在下文所討論的)、翻譯(如Kozak序列，(Kozak(1991)J.Biol.Chem.25519867-19870或Kozak(1991)J.Cell.Biol.115887-903)和/或DNA復(fù)制(如復(fù)制起點如ori)的DNA序列段在操作上連接。
當(dāng)核酸指導(dǎo)RNA聚合酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄編碼序列成為RNA、優(yōu)選mRNA，隨后RNA可被剪接(如果含有內(nèi)含子的話)且任選翻譯成由所述編碼序列編碼的蛋白時，所述核酸序列“處于轉(zhuǎn)錄和/或翻譯控制序列的控制之下”、“與轉(zhuǎn)錄和/或翻譯控制序列功能性連接”、“與轉(zhuǎn)錄和/或翻譯控制序列在操作上連接”和/或“與轉(zhuǎn)錄和/或翻譯控制序列在操作上相關(guān)”。
術(shù)語“表達(dá)”是指允許或促使基因即RNA或DNA序列中的信息變成表現(xiàn)形式；如通過激活參與相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的細(xì)胞功能而產(chǎn)生蛋白質(zhì)?；蛘撸蚩稍隗w外表達(dá)；含有所述基因的DNA可由重組RNA聚合酶進行轉(zhuǎn)錄，并且任選由如兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物進行翻譯(Promega Corporation，Madison，WI)。DNA序列可在細(xì)胞內(nèi)或由細(xì)胞表達(dá)，或者在體外表達(dá)，產(chǎn)生“表達(dá)產(chǎn)物”如RNA(如mRNA)和蛋白質(zhì)。表達(dá)產(chǎn)物本身也可以稱為是“已表達(dá)”的。
插入了本發(fā)明核酸的載體包括微生物質(zhì)粒、病毒、噬菌體、整合型DNA片段及其它能將核酸導(dǎo)入宿主基因組的媒介物。質(zhì)粒為最常用載體的形式，然而具有相似功能而且本領(lǐng)域已知或?qū)楸绢I(lǐng)域所知的所有其它形式載體也適用本發(fā)明。參見例如Pouwels等，(1985和增刊)Cloning VectorsA Laboratory Manual，Elsevier，N.Y.，和Rodriguez等(主編)，VectorsA Survey of Molecular Cloning Vectors andTheir Uses，1988，Buttersworth，Boston，MA。
如果DNA和載體的末端都包含匹配的限制性位點，則可容易地完成將編碼RF-酰胺肽或編碼SP9155受體或其功能片段的DNA插入載體中。如果DNA不能插入到載體中，則可能有必要修飾DNA和/或載體的末端，所述修飾可通過重新消化限制性內(nèi)切核酸酶切割產(chǎn)生的單鏈DNA的突出端而產(chǎn)生平頭末端，或者通過用適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶(如Klenow)補平單鏈末端達(dá)到同樣的效果。或者，所需的位點可由在末端上連接核苷酸序列(接頭)而產(chǎn)生。這些接頭可包含決定所需限制性位點的特異性寡核苷酸序列。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)也能產(chǎn)生限制性位點。參見例如Saiki等，Science 239487(1988)。如果有必要，經(jīng)切割的載體和DNA片段也可通過同聚物加尾反應(yīng)進行修飾。
本發(fā)明中使用的重組表達(dá)載體通常為自我復(fù)制型DNA或RNA構(gòu)建體，其包含編碼RF-酰胺肽或編碼SP9155受體或其功能片段的核酸，通常在匹配宿主細(xì)胞中與能夠調(diào)節(jié)核酸表達(dá)的合適遺傳控制元件在操作上連接。遺傳控制元件可包括原核啟動子系統(tǒng)或真核啟動子表達(dá)控制系統(tǒng)，通常包括轉(zhuǎn)錄啟動子、任選控制轉(zhuǎn)錄起始的操縱子、提高mRNA表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄增強子、編碼合適核糖體結(jié)合位點的序列以及終止轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列?？梢杂脕砜刂苹虮磉_(dá)的啟動子包括但不限于色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel等，(1980)NucleicAcids Res.84057)、λPL啟動子系統(tǒng)(Shimatake等，(1981)Nature292128)、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子(美國專利第5,385,839號和第5,168,062號)、SV40早期啟動子區(qū)(Benoist等，(1981)Nature290304-310)、勞氏肉瘤病毒3′長末端重復(fù)中所包含的啟動子(Yamamoto等，Cell(1980)22787-797)、皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner等，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781441-1445)、金屬硫蛋白基因調(diào)節(jié)序列(Brinster等，(1982)Nature 29639-42)、β-內(nèi)酰胺酶啟動子(Villa-Komaroff等，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 753727-3731)或tac啟動子(DeBoer等，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8021-25)；另見《科學(xué)美國人》之“重組細(xì)菌的有益蛋白質(zhì)”(1980)24274-94；酵母或其它真菌的啟動子元件如Gal4啟動子、ADC(醇脫氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子或堿性磷酸酶啟動子也可與本發(fā)明核酸在操作上連接。表達(dá)載體也可包含復(fù)制起點，使得所述載體可以在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立復(fù)制。
術(shù)語“宿主細(xì)胞”可指任何有機體的任何細(xì)胞，以任何方式選擇、修飾、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、生長、使用或操作，而由細(xì)胞產(chǎn)生如基因、DNA或RNA分子、載體、蛋白質(zhì)或酶等表達(dá)物或復(fù)制物。優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌(E.coli)(如BL21(DE3)、DH5或HB101)和真核細(xì)胞(如HEK293細(xì)胞或CHO細(xì)胞)。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化”可指將核酸(如SEQ ID NO3或12、其片段或編碼SEQ ID NO4-11和SEQ ID NO13-18中任一個或其任何片段的核酸)導(dǎo)入細(xì)胞。導(dǎo)入的基因或序列可被稱為“克隆”。接受導(dǎo)入的DNA或者RNA的宿主細(xì)胞必定是“已轉(zhuǎn)化的”且是“轉(zhuǎn)化子”或者是“克隆”。導(dǎo)入宿主細(xì)胞的DNA或RNA可來自任何來源，包括與宿主細(xì)胞同屬或同種的細(xì)胞，或者不同屬或不同種的細(xì)胞。
編碼本發(fā)明RF-酰胺肽的核酸可通過常規(guī)方法在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中進行表達(dá)。雖然大腸桿菌宿主細(xì)胞是最常用的原核系統(tǒng)，但許多其它的細(xì)菌如多種假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株和芽孢桿菌屬(Bacilus)菌株是本領(lǐng)域已知的，也可使用。可表達(dá)編碼RF-酰胺肽或SP9155受體或其功能片段的核酸的合適宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞和高等真核細(xì)胞。原核細(xì)胞包括革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌，如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。高等真核生物包括建立的動物細(xì)胞的組織培養(yǎng)細(xì)胞系、非哺乳動物來源的如昆蟲細(xì)胞和鳥類細(xì)胞、哺乳動物來源的如人類、靈長類和嚙齒動物的細(xì)胞。
原核宿主-載體系統(tǒng)包括各種各樣的許多不同種的載體。用于擴增DNA的代表性載體是pBR322或其許多衍生物(如pUC 18或19)?？梢杂糜诒磉_(dá)RF-酰胺肽的載體包括但不限于包含以下啟動子的載體lac啟動子(pUC系列)；trp啟動子(pBR322-trp)；Ipp啟動子(pIN系列)；λ-pP或pR啟動子(pOTS)；或者雜合啟動子如ptac(pDR540)。參見Brosius等，“應(yīng)用λ-，trp-，lac-和Ipp-衍生啟動子的表達(dá)載體”，載于Rodriguez和Denhardt(主編)VectorsA Survey of MolecularCloning Vectors and Their Uses，1988，Buttersworth，Boston，第205-236頁。本發(fā)明的肽可在大腸桿菌/T7表達(dá)系統(tǒng)中高水平表達(dá)，所述表達(dá)系統(tǒng)公開于美國專利第4,952,496號、第5,693,489號和第5,869,320號和Davanloo，P.等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 812035-2039；Studier，F(xiàn).W.等，(1986)J.Mol.Biol.189113-130；Rosenberg，A.H.等，(1987)Gene 56125-135；和Dunn，J.J.等，(1988)Gene 68259。
也可用高等真核組織培養(yǎng)細(xì)胞重組制備本發(fā)明的RF-酰胺肽。雖然可以使用任何高等真核組織培養(yǎng)細(xì)胞系，包括昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，然而優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞。所述細(xì)胞的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染以及繁殖已成為常規(guī)方法。有用的細(xì)胞系實例包括人胚腎(HEK293)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系、幼齡大鼠腎(BRK)細(xì)胞系、昆蟲細(xì)胞系、鳥類細(xì)胞系和猴(COS)細(xì)胞系。所述細(xì)胞系的表達(dá)載體通常包括復(fù)制起點、啟動子、翻譯起始位點、RNA剪切位點、聚腺苷酸化位點和/或轉(zhuǎn)錄終止位點。這些載體還常包含有選擇基因或擴增基因。合適表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、病毒或攜帶的啟動子來源于以下病毒的反轉(zhuǎn)錄病毒例如腺病毒、SV40、細(xì)小病毒、痘苗病毒或巨細(xì)胞病毒。合適表達(dá)載體的代表性實例包括PCR3.1、pCDNA1、pCD(Okayama等，(1985)Mol.Cell Biol.51136)、pMClneo Poly-A(Thomas等，(1987)Cell 51503)、pREP8、pSVSPORT及其衍生物以及桿狀病毒載體如pAC373或pAC610。
本發(fā)明也包括含本發(fā)明多肽和多核苷酸以及另一種多肽或多核苷酸部分的融合物，所述部分可被稱為“標(biāo)志”。本發(fā)明的融合物可以包含表1所述的任何多核苷酸或多肽或其任何亞序列或片段?？梢苑奖愕貥?gòu)建本發(fā)明的融合多肽，例如將本發(fā)明的多核苷酸或其片段插入到如上所述的表達(dá)載體中。本發(fā)明的融合物可以包含便于純化或檢測的標(biāo)志。所述標(biāo)志包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、六組氨酸(His6)標(biāo)志、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標(biāo)志、血凝素(HA)標(biāo)志、纖維素結(jié)合蛋白(CBP)標(biāo)志和myc標(biāo)志。也可用可檢測標(biāo)記或標(biāo)志如32P、35S、14C、3H、99mTc、111In、68Ga、18F、125I、131I、113mIn、76Br、67Ga、99mTc、123I、111In和68Ga等標(biāo)記本發(fā)明的多肽。構(gòu)建和使用所述的融合物的方法在本領(lǐng)域中是非常便利和熟知的。
多肽中的修飾(如翻譯后修飾)常常是其功能如何形成的原因。例如，對于宿主中表達(dá)克隆基因制備的多肽，修飾的性質(zhì)和程度，很大部分將由宿主細(xì)胞的翻譯后修飾能力和存在于多肽的氨基酸序列中的修飾信號決定。例如，眾所周知的是，糖基化通常不會在細(xì)菌宿主如大腸桿菌中發(fā)生。因此，如果需要糖基化，可在能進行糖基化的宿主中表達(dá)多肽，通常為真核細(xì)胞。昆蟲細(xì)胞常常進行翻譯后糖基化，這點與哺乳動物細(xì)胞的糖基化是一樣的。因為這一原因，已經(jīng)開發(fā)出昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，以有效地表達(dá)具有天然糖基化形式的哺乳動物蛋白質(zhì)?；蛘撸ヌ腔缚梢杂脕砣コ谡婧吮磉_(dá)系統(tǒng)中制備期間連接的糖。
其它的修飾也包括在多肽羧基末端添加酰胺或脂族酯。本發(fā)明也包括含有修飾的RF-酰胺肽的類似物，所述修飾例如摻入非天然氨基酸殘基或磷酸化氨基酸殘基如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸殘基。其它可能的修飾包括磺化、生物素化或其添加其它部分，特別是那些分子形態(tài)與磷酸酯基團相似的部分。
本發(fā)明的肽也可環(huán)化。具體地講，本發(fā)明肽的氨基和羧基末端殘基或兩個內(nèi)部殘基可以融合產(chǎn)生環(huán)化肽。優(yōu)選可在所述肽的羧基末端游離時進行環(huán)化。當(dāng)氨基末端游離時也可進行肽的環(huán)化。肽的環(huán)化方法在本領(lǐng)域中是容易的和非常熟知的；例如參見Gurrath等，(1992)Eur.J.Biochem 210911-921。
本發(fā)明的RF-酰胺肽可以添加聚合物以增加所述肽在患者體內(nèi)的半壽期。優(yōu)選的聚合物包括聚乙二醇(PEG)(如分子量為2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa的PEG)，葡聚糖和單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
人們將會認(rèn)識到，在特定多肽的數(shù)個位點上，可以存在相同或不同程度的同一類型修飾。另外，特定的多肽也包括多種類型的修飾。
本發(fā)明的RF-酰胺肽的類似物可由化學(xué)合成或者利用以下方法制備定點誘變(Gillman等，(1979)Gene 881；Roberts等，(1987)Nature，328731或Innis(主編)，1990，PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications，Academic Press，New York，NY，或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法PCR；Saiki等，(1988)Science 239487，如Daugherty等示例的修飾編碼肽的核酸(1991)(Nucleic Acids Res.192471)等方法?？梢栽O(shè)想添加用于純化或檢測重組產(chǎn)物的附加表位。
其它的類似物可通過利用本領(lǐng)域已知的試劑進行制備，此類試劑的用途在于通過活性側(cè)基與蛋白質(zhì)交聯(lián)。優(yōu)選的交聯(lián)劑衍生化位點是游離的氨基或羧基、糖部分和半胱氨酸殘基。
術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”包含所有這樣的修飾，特別是那些由宿主細(xì)胞表達(dá)多核苷酸合成的多肽中存在的修飾。
蛋白質(zhì)純化通常，在培養(yǎng)物(如液體培養(yǎng)物，例如luria肉湯)中生長的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼多肽的核酸可以制備本發(fā)明的肽。例如，核酸可能是宿主細(xì)胞中存在的載體(例如質(zhì)粒)的一部分。表達(dá)后，可從培養(yǎng)的細(xì)胞中分離出本發(fā)明的肽。包括但不限于鹽或乙醇沉淀、親和層析(例如利用如上所討論的綴合了純化標(biāo)記肽)、制備型圓盤凝膠電泳、等點聚焦、高壓液相層析(HPLC)、反相HPLC、凝膠過濾、陽離子和陰離子交換和分配層析和逆流分布等標(biāo)準(zhǔn)分離方法全都可以純化本發(fā)明的肽。這些純化方法在本領(lǐng)域已非常熟知并已公開，例如“蛋白質(zhì)純化指南”，Methods in Enzymology，第182卷，M.Deutscher主編，1990，Academic Press，New York，NY。
遵循純化步驟來進行如下描述的受體結(jié)合活性測定。特別當(dāng)RF-酰胺肽由細(xì)胞或組織中分離出來時，測定系統(tǒng)中優(yōu)選包含一個或多個蛋白水解酶的抑制劑，例如甲苯磺酰氟(PMSF)、Pefabloc SC、抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、胰凝乳蛋白酶抑制劑和乙二胺四乙酸(EDTA)。
抗體分子本發(fā)明RF-酰胺肽的抗原(如免疫原)片段，無論是否可以結(jié)合SP9155或其功能片段，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。所述抗原肽可用于制備識別RF-酰胺肽前體的抗體分子或其任何片段。
雖然并不總是必需的，但是當(dāng)RF-酰胺肽用作抗原以在免疫感受態(tài)宿主中誘發(fā)抗體產(chǎn)生時，首先優(yōu)選通過下述方法使較小的抗原片段更具免疫原性與免疫原性載體分子(即具有在宿主動物中獨立誘發(fā)免疫應(yīng)答性質(zhì)的大分子，如白喉毒素或破傷風(fēng)毒素)交聯(lián)或串聯(lián)、或偶聯(lián)。因為小的多肽片段有時只用作半抗原(能特異性結(jié)合抗體但不能誘發(fā)抗體產(chǎn)生的分子，即它們不具有免疫原性)，所以可能需要與載體分子交聯(lián)或綴合。所述片段與免疫原性載體分子的綴合可使其通過通常稱為“載體效應(yīng)”而更具免疫原性。
載體分子包括如蛋白質(zhì)和天然的或合成的聚合物如多肽、多糖、脂多糖等。特別優(yōu)選為蛋白載體分子，包括但不限于匙孔血藍(lán)蛋白和哺乳動物血清蛋白如人丙種球蛋白或牛丙種球蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白或兔血清白蛋白、或甲基化蛋白或此類蛋白的其它衍生物。其它的蛋白載體對本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見的。對于將要誘發(fā)抗所述片段的抗體的宿主動物而言，蛋白載體優(yōu)選為外源的。
利用本領(lǐng)域已熟知的方法可以共價偶聯(lián)載體分子；選擇準(zhǔn)確的方法將由使用的載體分子的性質(zhì)決定。當(dāng)免疫原性載體分子是蛋白質(zhì)時，可利用如水溶性碳二亞胺例如二環(huán)己基碳二亞胺或戊二醛來偶聯(lián)本發(fā)明的片段。
這類偶聯(lián)劑可不使用單獨的載體分子，將片段與自身交聯(lián)。如此交聯(lián)而成的聚集體也可增加免疫原性。利用已知的佐劑，單獨使用或與偶聯(lián)作用或聚集聯(lián)合使用，也能增加免疫原性。
接種動物用的佐劑包括但不限于佐劑65(含有花生油、二縮甘露醇一油酸酯和一硬脂酸鋁)；弗氏完全或不完全佐劑；礦物凝膠如氫氧化鋁、磷酸鋁和明礬；表面活性劑如十六胺、十八胺、溶血卵磷脂、二甲基二(十八烷基)溴化銨、N,N-二(十八烷基)-N′，N′-雙(2-羥甲基)丙二胺、甲氧基十六烷基甘油和多元醇；聚陰離子如吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC、聚丙烯酸和卡波普；肽類如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸和吞噬作用激素；以及油乳劑。多肽也可在摻入脂質(zhì)體及其它微載體后給藥。
有關(guān)佐劑和免疫測定的各方面信息已公開，例如以下系列叢書所公開的Practice and Theory of Enzyme Immunoassays，第3版，P.Tijssen，1987，Elsevier，New York。其它涵蓋了多克隆抗血清制備方法的有用參考文獻包括Microbiology，1969，Hoeber Medical Division，Harper和Row；Landsteiner，Specificity of Serological Reactions，1962，Dover Publications，New York，和Williams等，Methods in Immunologyand Immunochemistry，第1卷，1967，Academic Press，New York。
本發(fā)明的抗RF-酰胺肽“抗體分子”包括但決不限于抗RF-酰胺肽抗體(如單克隆抗體、多克隆抗體、雙特異性抗體和抗獨特型抗體)和片段，優(yōu)選抗原結(jié)合片段或其功能片段，如Fab抗體片段、F(ab)2抗體片段、Fv抗體片段(如VH或VL)、單鏈Fv抗體片段和dsFV抗體片段。此外，本發(fā)明的抗體分子可以是完全的人抗體、小鼠抗體、兔抗體、雞抗體、人/鼠嵌合抗體或人源化抗體。
本發(fā)明的抗RF-酰胺肽抗體分子優(yōu)選識別本發(fā)明的人或小鼠RF-酰胺肽；然而，本發(fā)明包括識別不同種來源、優(yōu)選哺乳動物(如大鼠、兔、山羊或狗)的RF-酰胺肽的抗體分子。本發(fā)明也包括含本發(fā)明的RF-酰胺肽和一種或多種抗體分子的復(fù)合物。此類復(fù)合物可簡單地由抗體分子及其關(guān)連肽接觸制備。
多種方法可用于制備本發(fā)明的抗體分子。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體可由類似于公開在美國專利第5,625,126號、第5,877,397號、第6,255,458號、第6,023,010號和第5,874,299號的方法制備。產(chǎn)生單克隆、完全的人抗RF-酰胺肽抗體的雜交瘤細(xì)胞可以由本領(lǐng)域中通常已知的方法制備。這些方法包括但不限于由Kohler等，(1975)(Nature 256495-497)原創(chuàng)開發(fā)的雜交瘤技術(shù)以及trioma技術(shù)(Hering等，(1988)Biomed.Biochim.Acta.47211-216和Hagiwara等，(1993)Hum.Antibod.Hybridomas 415)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，(1983)Immunology Today 472和Cote等，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 802026-2030)和EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy。Alan R.Liss，Inc.，第77-96頁，1985)。再者，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法可以用來測定雜交瘤細(xì)胞是否表達(dá)抗RF-酰胺肽的抗體。
也可重組制備本發(fā)明的抗RF-酰胺肽的抗體分子(如在上述討論的大腸桿菌/T7表達(dá)系統(tǒng)中制備)。在這個實施方案中，編碼本發(fā)明的抗體分子的核酸(如VH或VL)可插入到偏愛的質(zhì)粒中并在大腸桿菌/T7系統(tǒng)中表達(dá)。有數(shù)個本領(lǐng)域中已知的方法可制備重組抗體。一個例子是美國專利第4,816,567號公開了一種制備重組抗體的方法。
術(shù)語“單克隆抗體”包括得自大致同源的抗體群的抗體，即所述群的各個抗體除可能少量的天然存在的突變之外是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，可針對抗單個抗原位點。單克隆抗體的優(yōu)勢是可由雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)合成，本質(zhì)上無其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆”指抗體的性質(zhì)包含于大致同源的抗體群中，并且不需要任何特別方法制備抗體。如上所述，依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可由Kohler等，(1975)Nature 256495描述的雜交瘤方法制備。
術(shù)語“多克隆抗體”包括在一個或多個其它的不全同抗體存在下制備的抗體。一般而言，在其它幾種制備不全同抗體的B淋巴細(xì)胞存在下，由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生多克隆抗體。通常，可直接由免疫的動物獲得多克隆抗體。
“雙特異性抗體”包含兩種不同的可結(jié)合獨特抗原的抗原結(jié)合區(qū)。雙特異性抗體以及所述抗體的制備方法和使用方法在本領(lǐng)域中是常規(guī)的和熟知的。
抗獨特型抗體或抗獨特型是抗另一抗體分子的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)(稱作獨特型)的抗體。如由Jerne等公開的(Jerne，N.K.，(1974)Ann.Immunol.(巴黎)125c373和Jerne，N.K.等，(1982)EMBO 1234)，用表達(dá)特定抗原(如RF-酰胺肽)的互補位(抗原結(jié)合位點)的抗體分子免疫接種將產(chǎn)生一組抗抗體，其中一些與抗原共享互補位的互補結(jié)構(gòu)。用抗獨特型抗體的亞類免疫接種，將依次產(chǎn)生抗體的亞類或能與初始抗原反應(yīng)的免疫細(xì)胞亞集。
術(shù)語“完全人抗體”是指僅包含人免疫球蛋白序列的抗體。同樣，“小鼠抗體”是指僅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗體，“雞抗體”是指僅包含雞免疫球蛋白序列的抗體。
“人/小鼠嵌合抗體”是指包含有小鼠可變區(qū)(VH和VL)融合到人恒定區(qū)的抗體。
“人源化”抗RF-酰胺肽抗體也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。非人類(如鼠或雞)抗體的人源化形式是嵌合免疫球蛋白，包含非人類免疫球蛋白的最低限度的序列。多數(shù)情況下，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的互補決定區(qū)的殘基被由具有所需的特異性、親合性和結(jié)合能力的非人類(供體抗體)如小鼠、雞、大鼠或兔等的互補決定區(qū)取代。在某些例子中，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架殘基也被相應(yīng)的非人類殘基所取代。
“單鏈Fv”或“sFv”抗體片段包含抗體的VH區(qū)和/或VL區(qū)，其中這些區(qū)存在于單多肽鏈中。一般而言，sFv多肽在VH區(qū)和/或VL區(qū)間還包含一個多肽接頭，可使sFv形成所需的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。描述制備單鏈抗體的技術(shù)(美國專利第5,476,786號；第5,132,405號和第4,946,778號)適合于制備抗RF-酰胺肽特異性單鏈抗體。有關(guān)sFv的綜述參見PluckthunThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore主編，Springer-Verlag，N.Y.，第269-315頁(1994)。
“二硫化物穩(wěn)定的Fv片段”和“dsFV”包括通過二硫鍵連接的、具有可變區(qū)重鏈(VH)和/或可變區(qū)輕鏈(VL)的分子。
包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的抗體片段也包括F(ab)2片段，它可由IgG酶解如由胃蛋白酶酶解制備。Fab片段可由例如用二硫蘇糖醇和巰基乙胺還原F(ab)2制備。Fab片段是通過二硫鍵添加到VH-CH1鏈上的VL-CL鏈。F(ab)2片段是兩個Fab片段，進而依次經(jīng)二個硫鍵添加而成。F(ab)2分子的Fab部分包括位于二硫鍵間的Fc區(qū)。
Fv片段是VL區(qū)或VH區(qū)。
根據(jù)重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可分為不同的類別。至少有五種主要的免疫球蛋白類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它們可進一步分為亞類(同種型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。
本發(fā)明的抗RF-酰胺肽抗體分子也可與化學(xué)部分綴合?；瘜W(xué)部分尤其可以是聚合物、放射性核素或細(xì)胞毒性因子。優(yōu)選的化學(xué)部分是可增加抗體分子在患者體內(nèi)半壽期的聚合物。合適的聚合物包括但決不限于聚乙二醇(PEG)(如分子量為2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa的PEG)、葡聚糖和單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。美國專利第6,133,426號描述的制備PEG化抗IL8抗體方法，可用于本發(fā)明的PEG化抗RF-酰胺肽抗體的制備，所述文獻通過引用結(jié)合到本文中。Lee等，(1999)(Bioconj.Chem.10973-981)公開了PEG綴合的單鏈抗體。Wen等，(2001)(Bioconj.Chem.12545-553)公開了抗體與連接放射性金屬螯合劑(二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)的PEG綴合的方法。
本發(fā)明的抗體分子可以綴合放射性同位素標(biāo)記如99Tc、90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67CU、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th和40K以及非放射性同位素標(biāo)記如157Gd、55Mn、52Tr、56Fe。
本發(fā)明的抗體分子也可以綴合熒光標(biāo)記或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，包括熒光團如稀土元素螯合物、熒光素及其衍生物、羅丹明及其衍生物、異硫氰酸酯、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛、熒光胺、152Eu、丹酰、傘形酮、螢光素、魯米諾標(biāo)記、異魯米諾標(biāo)記、芳香吖啶酯標(biāo)記、咪唑標(biāo)記、吖啶鹽標(biāo)記、草酸酯標(biāo)記、發(fā)光蛋白質(zhì)標(biāo)記、2，3-二氫2，3-二氮雜萘二酮、生物素/親和素、自旋標(biāo)記和穩(wěn)定的自由基。
抗體分子也可以綴合細(xì)胞毒性因子如白喉毒素、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A鏈、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、莫迪毒蛋白A鏈、α-八疊球菌素、Aleurites fordii蛋白及化合物(如脂肪酸)、dianthin蛋白、Phytoiacca americana蛋白PAPI、PAPII和PAP-S、momordica charantia抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、saponaria officinalis抑制劑、絲林霉素、局限曲菌素、酚霉素和伊諾霉素。
可利用本領(lǐng)域已知的任何方法將本發(fā)明的抗體分子與各種成分綴合，包括那些由Hunter等，(1962)Nature 144945；David等，(1974)Biochemistry 131014；Pain等，(1981)J.Immunol.Meth.40219和Nygren，J.，(1982)Histochem.and Cytochem.30407描述的方法。
抗體的綴合方法在本領(lǐng)域中是常規(guī)和非常熟知的。
藥用組合物以治療為目的，本發(fā)明的RF-酰胺肽和抗體分子可優(yōu)選以藥用組合物形式給予患者。藥用組合物優(yōu)選包括藥學(xué)上可接受的載體。RF-酰胺肽和抗體分子可用于治療性(如在藥用組合物內(nèi))刺激或阻斷SP9155受體的活性，從而治療由所述受體引起或介導(dǎo)的任何醫(yī)學(xué)病癥。阻斷本發(fā)明的RF-酰胺肽和SP9155受體的結(jié)合可以阻斷所述肽在所述受體上的活性效應(yīng)。如上所討論的，SP9155受體已經(jīng)與代謝紊亂如肥胖癥和如疼痛和痛覺缺失等機制有聯(lián)系。
藥學(xué)上可接受的載體在本領(lǐng)域中是常規(guī)的和非常熟知的。實例包括水性或非水性載體、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗微生物劑、緩沖液、血清蛋白、等滲和吸收延遲劑以及生理兼容物質(zhì)等。載體優(yōu)選適合于注射到患者體內(nèi)。一般而言，這類利于胃腸外給藥的藥用組合物已經(jīng)熟知；如Remington’s PharmaceuticalScience，第17版，(Mack Publishing Company，Easton，PA，1990)。
在本發(fā)明藥用組合物中可用的水性和非水性載體的實例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適合的混合物、植物油如橄欖油和注射用有機脂如油酸乙脂。使用包衣材料如卵磷脂，在分散情況下保持所需的顆粒大小以及使用表面活性劑等可維持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴?br> 本發(fā)明的藥用組合物可與第二藥用組合物或物質(zhì)聯(lián)合給藥。在優(yōu)選的實施方案中，第二組合物為減肥藥或鎮(zhèn)痛藥。當(dāng)使用聯(lián)合療法時，兩組組合物可配制成同時遞藥的一種組合物或者獨立配制成兩種或兩種以上的組合物(如藥盒)。
減肥藥可以包括西布曲明、芬特明或奧利司他。
鎮(zhèn)痛藥包括阿斯匹林、acetominophen、可待因、嗎啡、aponorphine、去甲嗎啡、埃托啡、丁丙諾啡、氫可酮、消旋啡烷、左啡諾、butorphand、美沙酮、德美羅、布洛芬或鹽酸羥考酮。
本發(fā)明的藥用組合物也可包括其它類型的物質(zhì)，包括用本文描述的測定方法鑒定的有機小分子和抑制配體類似物。
制劑通常呈單位劑量形式，并可以用藥劑學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的任何方法制備。參見Gilman等(編著)(1990)，The Pharmacological Basesof Therapeutics，第8版，Pergamon Press；和Remington’s PharmaceuticalSciences，參見上文，Easton，Penn.；Avis等(編著)(1993)PharmaceuticalDosage FormsParenteral MedicationsDekker，New York；Lieberman等(編著)(1990)Pharmaceutical Dosage FormsTablets，Dekker，NewYork；和Lieberman等(編著)(1990)，Pharmaceutical Dosage FormsDisperse SystemsDekker，New York。
考慮到多種因素可能改變所述治療物質(zhì)的作用，如患者的病癥、體重、性別和飲食、任何感染的嚴(yán)重程度、給藥時間及其它臨床因素等，因此，包括治療應(yīng)用的給藥方案將由主治醫(yī)師決定。
通常，測定治療劑量由低水平開始逐步增加，直至達(dá)到最優(yōu)化安全性和功效。劑量可以根據(jù)給藥后變小的分子形狀和可能減少的半壽期(清除時間)進行調(diào)整。
本發(fā)明組合物的“有效量”可以是改善一個或多個熟知的參數(shù)的量，這些參數(shù)表征了SP9155受體或其功能片段引起或介導(dǎo)的醫(yī)學(xué)病癥。
這類物質(zhì)具體的治療性給藥方案是本領(lǐng)域眾所周知的。本發(fā)明的藥用組合物可以通過例如胃腸外途徑(如靜脈注射、肌內(nèi)注射、皮下注射、瘤內(nèi)注射或輸注)或非胃腸外途徑給藥(如口服、肺部給藥或局部給藥)。
組合物可用本領(lǐng)域已知的醫(yī)學(xué)裝置給藥。例如，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的藥用組合物可通過皮下針頭注射給藥。
本發(fā)明的藥用組合物也可通過無針頭皮下注射裝置給藥。這類裝置公開于美國專利第5,399,163號；第5,383,851號；第5,312,335號；第5,064,413號；第4,941,880號；第4,790,824號或第4,596,556號。
熟知的可用于本發(fā)明的植入物和模塊的實例包括美國專利第4,487,603號，公開了用于以可控速率分散藥物的可植入微輸注泵；美國專利第4,447,233號，公開了用于精確以輸注速率遞藥的藥物輸注泵；美國專利第4,447,224號，公開了用于連續(xù)遞藥的變化流量可植入輸注裝置；美國專利第4,439,196號，公開了具有多區(qū)室的滲透性遞藥系統(tǒng)。
反義分子本發(fā)明也包括能特異性與編碼本發(fā)明的RF-酰胺肽的核酸(如基因組DNA或mRNA)雜交的反義寡核苷酸，本發(fā)明的RF-酰胺肽優(yōu)選具有SEQ ID NO4-11或SEQ ID NO13-18中任一個或其亞序列限定的氨基酸序列，以阻止所述核酸的表達(dá)。
本發(fā)明還提供藥用組合物，所述藥用組合物包含(a)有效量的寡核苷酸，以調(diào)節(jié)SP9155受體活性，所述寡核苷酸可穿過細(xì)胞膜并與細(xì)胞中編碼本發(fā)明RF-酰胺肽的mRNA特異性結(jié)合，從而阻止其翻譯；和(b)藥學(xué)上可接受的、能穿過細(xì)胞膜的載體。在一個實施方案中，所述寡核苷酸與使mRNA失活的物質(zhì)(如核酶)偶聯(lián)。
實施例以下實施例僅用于舉例說明本發(fā)明，而不應(yīng)認(rèn)為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
縮寫GenScan基因預(yù)測算法(Burge等，(1997)J.Mol.Biol.268(1)78-94)。
Human virtual transcripts database(VTS)運行GenScan，從公開數(shù)據(jù)庫獲得的人類基因組DNA中預(yù)測基因或外顯子。VTS是一個所有的已預(yù)測的人類基因或外顯子的收集庫。VTS的DNA和蛋白質(zhì)版本均已產(chǎn)生。
實施例1人RF-酰胺肽前體蛋白的鑒定。
RF-酰胺肽是熟知的神經(jīng)肽家族成員，并且由羧基末端帶“RFG(K/R)”基序的前肽衍生。一般而言，“G(K/R)”是蛋白酶消化和酰胺化信號。如果發(fā)生蛋白水解消化和酰胺化步驟，則前肽被加工成帶RF-酰胺羧基末端的成熟肽。
因為大多數(shù)RF-酰胺肽前體含有不止一個RFG(K/R)基序，所以需搜索VTS蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中具有一個或多個RFGR基序的肽。我們鑒定出VTS164407，發(fā)現(xiàn)它包含一個具有兩個RFG(K/R))基序的外顯子。進一步分析揭示這個外顯子包含一個開始部位的起始密碼子和一個末端部位的終止密碼子。用PSORT(蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測的免費軟件，Nakai等，(1999)Trends Biochem.Sci.24(1)34-36)分析所述外顯子，預(yù)測此外顯子具有前導(dǎo)肽而無跨膜結(jié)構(gòu)域，表明所述外顯子編碼分泌型蛋白。所述外顯子可被稱為“RF-酰胺肽前體”。
一般而言，因為RF-酰胺肽前體也是可分泌的，所以可分離出編碼所述基因的cDNA。在基因組外顯子和cDNA克隆間鑒別出一個核苷酸的差異。這個差異可表現(xiàn)出多態(tài)性。其核苷酸序列和相應(yīng)推導(dǎo)出的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。
實施例2人RF-酰胺肽前體基因的小鼠同源基因的鑒定。
利用人RF-酰胺肽前體基因作為查詢序列，通過BLAST搜索公開的已表達(dá)序列標(biāo)志(EST)數(shù)據(jù)庫，鑒定出人RF-酰胺肽前體基因的小鼠同源基因。在所述搜索中，鑒定出與人RF-酰胺肽前體同源的小鼠EST BF167714。另外，利用人RF-酰胺肽前體基因作為查詢序列，搜索公開的小鼠基因組DNA數(shù)據(jù)庫，再者，通過與第一輪搜索鑒定的小鼠同源基因的序列比對鑒定，第二輪搜索鑒定出小鼠同源基因。小鼠全長RF-酰胺肽前體基因由鑒定的克隆中推導(dǎo)獲得。
基于推導(dǎo)出的小鼠RF-酰胺肽前體DNA序列，克隆了小鼠RF-酰胺肽前體的cDNA。其核苷酸序列和相應(yīng)推導(dǎo)出的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO12和SEQ ID NO13。
實施例3源自人和小鼠的RF-酰胺肽前體基因的可能的功能肽。
我們根據(jù)RFG(K/R)可能位于羧基末端的假設(shè)，推導(dǎo)出以下可能的功能性RF-酰胺肽。
源于人RF-酰胺肽前體的肽如下人P51EHAGCRFRF-酰胺(SEQ ID NO5)人P242GLQTSGREHAGCRFRF-酰胺(SEQ ID NO6)人P552ASQPQALLVIARGLQTSGREHAGCRFRF-酰胺(SEQ IDNO7)人P52GGFSFRF-酰胺(SEQ ID NO8)人P513KGGFSFRF-酰胺(SEQ ID NO9)人P517KKGGFSFRF-酰胺(SEQ ID NO10)人P518TSGPLGNLAEELNGYSRKKGGFSFRF-酰胺(SEQ IDNO11)源于小鼠RF-酰胺肽前體的肽如下小鼠P51EHTGFRL-酰胺(SEQ ID NO14)小鼠P52GGFSFRF-酰胺(SEQ ID NO15)小鼠P513KGGFSFRF-酰胺(SEQ ID NO16)小鼠P517RKGGFSFRF-酰胺(SEQ ID NO17)小鼠P518ASGPLGTLAEELSSYSRRKGGFSFRF-酰胺(SEQ IDNO18)實施例4試驗。
a.胞內(nèi)Ca2+濃度測定。
在以下實施例中，用熒光成像讀板儀(FLIPR)試驗測定出人P518、P517、P52、P513和P51是人SP9155受體的配體。如下所討論的，所述試驗適于測定樣品是所述受體的激動劑還是所述受體的拮抗劑。
使用SuperFect轉(zhuǎn)染試劑，用攜帶SP9155受體cDNA的表達(dá)載體或缺乏SP9155受體DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染在含10％FCS的DMEM培養(yǎng)基中生長到80-90％匯合的HEK293細(xì)胞。第二天，將細(xì)胞用胰蛋白酶從培養(yǎng)板上消化下來并用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗滌。然后，將細(xì)胞按每100μl培養(yǎng)基35,000個細(xì)胞的密度接種到用多聚-D-賴氨酸(Becton Dickinson)預(yù)包被的96孔板內(nèi)。轉(zhuǎn)染后第三天，去除細(xì)胞中的培養(yǎng)基，加入100μl含4μM Fluo-3、AM(Molecular Probes)、20mMHepes pH7.4、0.1％(w/v)BSA和250mM丙磺舒的Hank氏平衡鹽溶液(不含酚紅)，在37℃、5％CO2的條件下孵育1小時。然后將細(xì)胞用150μl含HANK氏BSS、40mM Hepes pH7.4和250mM丙磺舒的洗滌緩沖液洗滌三次。最后一次洗滌后，加入100μl洗滌緩沖液，并且在加入40μl含有各自相應(yīng)的肽洗滌緩沖液后測定Ca2+流出。Ca2+流出可用FLIPR儀器(Molecular Device)測定。
這些試驗所獲得的數(shù)據(jù)示于下表3表3肽的效價
1每一待測肽均為羧基末端酰胺化的。
2數(shù)值表示平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差；n＝5FLIPR試驗也可用于篩選樣品的激動劑或拮抗劑活性。在這些試驗中，使試驗細(xì)胞可同時與肽配體(或與任何其它SP9155受體的配體)和樣品接觸。陰性對照實驗可以包括使試驗細(xì)胞與配體和空白樣品(如水或其它已知不是激動劑或拮抗劑的物質(zhì))接觸。陽性對照實驗可以包括使試驗細(xì)胞與配體和已知能激動或拮抗SP9155受體/配體結(jié)合的物質(zhì)接觸。
根據(jù)樣品降低由配體/受體結(jié)合引起的Ca2+活動化程度的能力(即減少FLIPR信號)，并將其與無樣品時進行的相同實驗所獲得的結(jié)果進行比較，樣品可被鑒定為含有拮抗劑。相反，根據(jù)樣品增加由配體/受體結(jié)合引起的Ca2+活動化程度的能力(即增加FLIPR信號)，并將其與無樣品時進行的相同實驗所獲得的結(jié)果進行比較，樣品可被鑒定為含有激動劑。
b.放射性配體結(jié)合試驗。
在本實施例中，用放射性配體結(jié)合試驗測定人P518是人SP9155受體的配體。如下所討論的，所述試驗適于測定樣品是激動劑還是拮抗劑。
進行放射性配體結(jié)合試驗以測試SP9155受體在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)時結(jié)合3H-標(biāo)記的P518的能力。SP9155的可讀框克隆在表達(dá)載體pCR3.1(pCR3.1-SP9155)中。用pCR3.1-SP9155或單獨用pCR3.1(模擬轉(zhuǎn)染)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后兩天，將正常生長培養(yǎng)基DMEM/10％FCS更換為Opti-MEM或DMEM-Opti-MEM/5％FCS。允許細(xì)胞再生長一天，然后制備用于結(jié)合實驗的細(xì)胞膜。1μM未標(biāo)記的P518用于測定非特異性結(jié)合。自轉(zhuǎn)染總共三天后，用轉(zhuǎn)染細(xì)胞制備細(xì)胞膜，并且觀察到其特異性結(jié)合3H-P518。
對于飽和結(jié)合，將150μl含24μg細(xì)胞膜的結(jié)合測定緩沖液(HepespH7.4、10mM CaCl2、10mM MgCl2、0.05％不含脂肪酸的BSA(w/v)，置于冰上保持低溫)和50μl含2％(v/v)DMSO冷卻的P518(1μM)的結(jié)合測定緩沖液混合。按遞增濃度加入3H-P518/乙醇到測定物中。反應(yīng)物在4℃孵育1小時，同時緩慢地旋轉(zhuǎn)。用Multiscreen FB濾膜(Millipore)過濾所述結(jié)合測定物，Multiscreen FB濾膜在室溫下用50μl結(jié)合測定緩沖液預(yù)先浸泡1小時，濾液用100ul 50mM Tris-Cl pH7.5(冰冷)洗滌兩次。向濾液中加入50μl閃爍液，進行計數(shù)，以檢測結(jié)合的放射性配體。
對于放射性配體競爭性試驗，可將160μl含適當(dāng)細(xì)胞膜的結(jié)合測定緩沖液與201μl含6％DMSO(v/v)和不同濃度的侯選競爭化合物的結(jié)合測定緩沖液混合。最終加入20μl含6％DMSO(v/v)和1μl3H-P518/乙醇(NEN，50nM)的結(jié)合測定緩沖液，啟動結(jié)合反應(yīng)。放射性配體的終濃度為0.25nM。孵育條件與上述飽和試驗所用的條件相同。根據(jù)樣品降低所述配體與所述受體結(jié)合的能力，并將其與無樣品時進行的相同實驗所獲得的結(jié)果進行比較，樣品可被鑒定為含有激動劑或拮抗劑。
陰性對照實驗可以包括使所述細(xì)胞膜與配體和空白樣品(如水或其它已知不是激動劑或拮抗劑的物質(zhì))接觸。陽性對照實驗可以包括使試驗細(xì)胞與配體和已知能激動或拮抗SP9155受體/配體結(jié)合的物質(zhì)接觸。
**********************************本發(fā)明不受本文描述的具體實施方案范圍的限制。事實上，根據(jù)上述說明書和附圖
，對本發(fā)明進行除以上所述以外的各種修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將會是顯而易見的。這樣的修改將落入所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
在本申請中引用了專利、專利申請、出版物、產(chǎn)品說明書和方案，其公開內(nèi)容通過引用全部結(jié)合到本文中用于所有目的。
序列表<110>先靈公司(Schering Corporation)<120>G蛋白偶聯(lián)受體的配體與方法<130>CN01530-WI<140>PCT/US03/11159<141>2003-04-10<150>60/372,640<151>2002-04-12<160>20<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1296<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>1..1296<223>
<220>
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<221>變異體<222>1228<223>y<400>1atg cag gcg ctt aac att acc ccg gag cag ttc tct cgg ctg ctg cgg 48Met Gln Ala Leu Asn Ile Thr Pro Glu Gln Phe Ser Arg Leu Leu Arg15 10 15gac cac aac ctg acg cgg gag cag ttc atc gct ctg tac cgg ctg cga 96Asp His Asn Leu Thr Arg Glu Gln Phe Ile Ala Leu Tyr Arg Leu Arg20 25 30ccg ctc gtc tac acc cca gag ctg ccg gga cgc gcc aag ctg gcc ctc 144Pro Leu Val Tyr Thr Pro Glu Leu Pro Gly Arg A la Lys Leu Ala Leu35 40 45gtg ctc acc ggc gtg ctc atc ttc gcc ctg gcg ctc ttt ggc aat gct 192Val Leu Thr Gly Val Leu Ile Phe Ala Leu Ala Leu Phe Gly Asn Ala50 55 60
ctg gtg ttc tac gtg gtg acc cgc agc aag gcc atg cgc acc gtc acc 240Leu Val Phe Tyr Val Val Thr Arg Ser Lys Ala Met Arg Thr Val Thr65 70 75 80aac atc ttt atc tgc tcc ttg gcg ctc agt gac ctg ctc atc acc ttc 288Asn Ile Phe Ile Cys Ser Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Ile Thr Phe85 90 95ttc tgc att ccc gtc acc atg ctc cag aac att tcc gac aac tgg ctg 336Phe Cys Ile Pro Val Thr Met Leu Gln Asn Ile Ser Asp Asn Trp Leu100 105 110ggg ggt gct ttc att tgc aag atg gtg cca ttt gtc cag tct acc gct 384Gly Gly Ala Phe Ile Cys Lys Met Val Pro Phe Val Gln Ser Thr Ala115 120 125gtt gtg aca gaa atc ctc act atg acc tgc att gct gtg gaa agg cac 432Val Val Thr Glu Ile Leu Thr Met Thr Cys Ile Ala Val Glu Arg His130 135 140cag gga ctt gtg cat cct ttt aaa atg aag tgg caa tac acc aac cga 480Gln Gly Leu Val His Pro Phe Lys Met Lys Trp Gln Tyr Thr Asn Arg145 150 155 160agg gct ttc aca atg cta ggt gtg gtc tgg ctg gtg gca gtc atc gta 528Arg Ala Phe Thr Met Leu Gly Val Val Trp Leu Val Ala Val Ile Val165 170 175gga tca ccc atg tgg cac gtg caa caa ctt gag atc aaa tat gac ttc 576Gly Ser Pro Met Trp His Val Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe180 185 190cta tat gaa aag gaa cac atc tgc tgc tta gaa gag tgg acc agc cct 624Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro195 200 205gtg cac cag aag atc tac acc acc ttc atc ctt gtc atc ctc ttc ctc 672Val His Gln Lys Ile Tyr Thr Thr Phe Ile Leu Val Ile Leu Phe Leu210 215 220ctg cct ctt atg gtg atg ctt att ctg tac agt aaa att ggt tat gaa 720Leu Pro Leu Met Val Met Leu Ile Leu Tyr Ser Lys Ile Gly Tyr Glu225 230 235 240ctt tgg ata aag aaa aga gtt ggg gat ggt tca gtg ctt cga act att 768Leu Trp Ile Lys Lys Arg Val Gly Asp Gly Ser Val Leu Arg Thr Ile245 250 255cat gga aaa gaa atg tcc aaa ata gcc agg aag aag aaa cga gct gtc 816His Gly Lys Glu Met Ser Lys Ile Ala Arg Lys Lys Lys Arg Ala Val260 265 270att atg atg gtg aca gtg gtg gct ctc ttt gct gtg tgc tgg gca cca 864Ile Met Met Val Thr Val Val Ala Leu Phe Ala Val Cys Trp Ala Pro275 280 285ttc cat gtt gtc cat atg atg att gaa tac agt aat ttt gaa aag gaa 912Phe His Val Val His Met Met Ile Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu290 295 300
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Phe Cys Ile Pro Val Thr Met Leu Gln Asn Ile Ser Asp Asn Trp Leu100 105 110Gly Gly Ala Phe Ile Cys Lys Met Val Pro Phe Val Gln Ser Thr Ala115 120 125Val Val Thr Glu Ile Leu Thr Met Thr Cys Ile Ala Val Glu Arg His130 135 140Gln Gly Leu Val Xaa Pro Phe Lys Met Lys Trp Gln Tyr Thr Asn Arg145 150 155 160Arg Ala Phe Thr Met Leu Gly Val Val Trp Leu Val Ala Val Ile Val165 170 175Gly Ser Pro Met Trp His Val Gln Gln Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe180 185 190Leu Tyr Glu Lys Glu His Ile Cys Cys Leu Glu Glu Trp Thr Ser Pro195 200 205Val His Gln Lys Ile Tyr Thr Thr Phe Ile Leu Val Ile Leu Phe Leu210 215 220Leu Pro Leu Met Val Met Leu Ile Leu Tyr Ser Lys Ile Gly Tyr Glu225 230 235 240Leu Trp Ile Lys Lys Arg Val Gly Asp Xaa Ser Val Leu Arg Thr Ile245 250 255His Gly Lys Glu Met Ser Lys Ile Ala Arg Lys Lys Lys Arg Ala Val260 265 270Ile Met Met Val Thr Val Val Ala Leu Phe Ala Val Cys Trp Ala Pro275 280 285Phe His Val Val His Met Met Ile Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu290 295 300Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys Met Ile Phe Ala Ile Val Gln Ile Ile305 310 315 320Gly Phe Ser Asn Ser Ile Cys Asn Pro Ile Val Tyr Ala Phe Met Asn325 330 335Glu Asn Phe Lys Lys Asn Val Xaa Ser Ala Val Cys Tyr Cys Ile Val340 345 350Asn Lys Thr Phe Ser Pro Ala Gln Arg His Gly Asn Ser Gly Ile Thr355 360 365Met Met Xaa Lys Lys Ala Lys Phe Ser Leu Arg Glu Asn Pro Val Glu370 375 380Glu Thr Lys Xaa Glu Ala Phe Ser Asp Gly Asn Ile Glu Val Lys Leu385 390 395 400Cys Glu Gln Thr Glu Glu Lys Lys Lys Xaa Lys Arg His Leu Ala Leu405 410 415
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<221>變異體<222>139<223>y<220>
<221>變異體<222>203<223>w<220>
<221>變異體<222>239<223>r<400>3atg gta agg cct tac ccc ctg atc tac ttc ctc ttc ctg ccg ctg ggc 48Met Val Arg Pro Tyr Pro Leu Ile Tyr Phe Leu Phe Leu Pro Leu Gly1 5 10 15gcc tgc ttc cct cta ctg gac aga aga gag ccc aca gac gcc atg ggt 96Ala Cys Phe Pro Leu Leu Asp Arg Arg Glu Pro Thr Asp Ala Met Gly20 25 30ggc ctc gga gct gga gaa cgc tgg gcc gac ctg gcc atg ggg ccc cga 144Gly Leu Gly Ala Gly Glu Arg Trp Ala Asp Leu Ala Met Gly Pro Arg35 40 45
ccc cac tcc gtg tgg ggt tcc tct cgg tgg ctg aga gct tca cag cca 192Pro His Ser Val Trp Gly Ser Ser Arg Trp Leu Arg Ala Ser Gln Pro50 55 60cag gcc ctg ctt gtc ata gcc agg ggg ctg cag aca tcg ggc aga gag 240Gln Ala Leu Leu Val Ile Ala Arg Gly Leu Gln Thr Ser Gly Arg Glu65 70 75 80cat gct ggc tgc aga ttc cgc ttc ggg agg cag gac gaa ggc agt gag 288His Ala Gly Cys Arg Phe Arg Phe Gly Arg Gln Asp Glu Gly Ser Glu85 90 95gcc acc ggc ttc ctc cct gct gcg ggg gag aag acc agc ggc ccg tta 336Ala Thr Gly Phe Leu Pro Ala Ala Gly Glu Lys Thr Ser Gly Pro Leu100 105 110ggg aac ctg gct gag gag ctc aat ggc tac agc agg aag aaa ggc ggc 384Gly Asn Leu Ala Glu Glu Leu Asn Gly Tyr Ser Arg Lys Lys Gly Gly115 120 125ttc agc ttc cgc ttc ggt cgg cgg tga 411Phe Ser Phe Arg Phe Gly Arg Arg130 135<210>4<211>136<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>47<223>Ser或Pro<220>
<221>MISC_FEATURE<222>80<223>Gly或Glu<220>
<221>MISC_FEATURE<222>68<223>His或Leu<220>
<221>MISC_FEATURE<222>35<223>Arg或Gly<220>
<221>MISC_FEATURE<222>26
<223>Gln或Glu<400>4Met Val Arg Pro Tyr Pro Leu Ile Tyr Phe Leu Phe Leu Pro Leu Gly1 5 10 15Ala Cys Phe Pro Leu Leu Asp Arg Arg Xaa Pro Thr Asp Ala Met Gly20 25 30Gly Leu Xaa Ala Gly Glu Arg Trp Ala Asp Leu Ala Met Gly Xaa Arg35 40 45Pro His Ser Val Trp Gly Ser Ser Arg Trp Leu Arg Ala Ser Gln Pro50 55 60Gln Ala Leu Xaa Val Ile Ala Arg Gly Leu Gln Thr Ser Gly Arg Xaa65 70 75 80His Ala Gly Cys Arg Phe Arg Phe Gly Arg Gln Asp Glu Gly Ser Glu85 90 95Ala Thr Gly Phe Leu Pro Ala Ala Gly Glu Lys Thr Ser Gly Pro Leu100 105 110Gly Asn Leu Ala Glu Glu Leu Asn Gly Tyr Ser Arg Lys Lys Gly Gly115 120 125Phe Ser Phe Arg Phe Gly Arg Arg130 135<210>5<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Glu His Ala Gly Cys Arg Phe Arg Phe1 5<210>6<211>16<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>6Gly Leu Gln Thr Ser Gly Arg Glu His Ala Gly Cys Arg Phe Arg Phe15 10 15<210>7<211>28<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>7
Ala Ser Gln Pro Gln Ala Leu Leu Val Ile Ala Arg Gly Leu Gln Thr1 5 10 15Ser Gly Arg Glu His Ala Gly Cys Arg Phe Arg Phe20 25<210>8<211>7<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>8Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe15<210>9<211>8<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>9Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe15<210>10<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>10Lys Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe1 5<210>11<211>26<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>11Thr Ser Gly Pro Leu Gly Asn Leu Ala Glu Glu Leu Asn Gly Tyr Ser15 10 15Arg Lys Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe20 25<210>12<211>375<212>DNA<213>未知
<220>
<223>小鼠<220>
<221>CDS<222>1..375<223>
<400>12atg agg ggc ttc cgg cct ttg ctt tcc cta ctt ctc cct ctg agt gcc 48Met Arg Gly Phe Arg Pro Leu Leu Ser Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ala15 10 15tgc ttt ccc ctg ctg gac aga agg gga ccc aca gac atc ggt gac atc 96Cys Phe Pro Leu Leu Asp Arg Arg Gly Pro Thr Asp Ile Gly Asp Ile20 25 30gga gcc agg atg aac tgg gcc cag ctg gct gag gga cat ccc ccc aac 144Gly Ala Arg Met Asn Trp Ala Gln Leu Ala Glu Gly His Pro Pro Asn35 40 45tcg gtt caa aat cca cag cca cag gcc ctg ctt gtg gtg gcc agg gag 192Ser Val Gln Asn Pro Gln Pro Gln Ala Leu Leu Val Val Ala Arg Glu50 55 60cag cag gcc tcc cac agg gag cac acc ggc ttc cgt cta ggg agg caa 240Gln Gln Ala Ser His Arg Glu His Thr Gly Phe Arg Leu Gly Arg Gln65 70 75 80gac ggt agc agt gag gcc gca ggg ttc ctg ccc gcc gac tcg gag aag 288Asp Gly Ser Ser Glu Ala Ala Gly Phe Leu Pro Ala Asp Ser Glu Lys85 90 95gcc agc ggc cct ctg ggg act ctg gca gag gag ctg agc agc tac agc 336Ala Ser Gly Pro Leu Gly Thr Leu Ala Glu Glu Leu Ser Ser Tyr Ser100 105 110
cgg agg aag gga ggc ttc agc ttc cgc ttt gga cgg tga 375Arg Arg Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe Gly Arg115 120<210>13<211>124<212>PRT<213>未知<220>
<223>小鼠<400>13Met Arg Gly Phe Arg Pro Leu Leu Ser Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ala1 5 10 15Cys Phe Pro Leu Leu Asp Arg Arg Gly Pro Thr Asp Ile Gly Asp Ile20 25 30Gly Ala Arg Met Asn Trp Ala Gln Leu Ala Glu Gly His Pro Pro Asn35 40 45Ser Val Gln Asn Pro Gln Pro Gln Ala Leu Leu Val Val Ala Arg Glu50 55 60Gln Gln Ala Ser His Arg Glu His Thr Gly Phe Arg Leu Gly Arg Gln65 70 75 80Asp Gly Ser Ser Glu Ala Ala Gly Phe Leu Pro Ala Asp Ser Glu Lys85 90 95Ala Ser Gly Pro Leu Gly Thr Leu Ala Glu Glu Leu Ser Ser Tyr Ser100 105 110
Arg Arg Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe Gly Arg115 120<210>14<211>7<212>PRT<213>未知<220>
<223>小鼠<400>14Glu His Thr Gly Phe Arg Leu15<210>15<211>7<212>PRT<213>未知<220>
<223>小鼠<400>15Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe15<210>16<211>8<212>PRT<213>未知<220>
<223>小鼠<400>16Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe1 5<210>17
<211>9<212>PRT<213>未知<220>
<223>小鼠<400>17Arg Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe15<210>18<211>26<212>PRT<213>未知<220>
<223>小鼠<400>18Ala Ser Gly Pro Leu Gly Thr Leu Ala Glu Glu Leu Ser Ser Tyr Ser15 10 15Arg Arg Lys Gly Gly Phe Ser Phe Arg Phe20 25<210>19<211>1302<212>DNA<213>未知<220>
<223>小鼠<220>
<221>CDS<222>(1)..(1302)<223>
<400>19atg cag gcg ctc aac atc acc gcg gag cag ttt tcc cgg ctg ctg agc 48Met Gln Ala Leu Asn Ile Thr Ala Glu Gln Phe Ser Arg Leu Leu Ser15 10 15gca cac aac ctg act cgg gaa cag ttc att cat cgc tat ggg ctg cga 96Ala His Asn Leu Thr Arg Glu Gln Phe Ile His Arg Tyr Gly Leu Arg20 25 30
ccg ctg gtc tac acc ccg gag ctg ccc gcg cgc gct aaa ctg gcc ttt 144Pro Leu Val Tyr Thr Pro Glu Leu Pro Ala Arg Ala Lys Leu Ala Phe35 40 45gcg ctg gct gga gca ctc att ttt gcc ctg gcg ctc ttt ggc aac tct 192Ala Leu Ala Gly Ala Leu Ile Phe Ala Leu Ala Leu Phe Gly Asn Ser50 55 60ctg gtc atc tat gtg gtg acc cgc agc aag gcc atg cac acc gtc acc 240Leu Val Ile Tyr Val Val Thr Arg Ser Lys Ala Met His Thr Val Thr65 70 75 80aac atc ttc atc tgc tct ctg gca ctc agt gat ctg ctc att gcc ttc 288Asn Ile Phe Ile Cys Ser Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Ile Ala Phe85 90 95ttc tgc atc ccc gtc acg atg ctc cag aac atc tcc gac aag tgg ctg 336Phe Cys Ile Pro Val Thr Met Leu Gln Asn Ile Ser Asp Lys Trp Leu100 105 110ggt ggt gcc ttc atc tgc aag atg gtg ccc ttc gtc cag tcc act gct 384Gly Gly Ala Phe Ile Cys Lys Met Val Pro Phe Val Gln Ser Thr Ala115 120 125gtt gtg acg gaa atc ctc acc atg act tgc atc gct gtt gag agg cac 432Val Val Thr Glu Ile Leu Thr Met Thr Cys Ile Ala Val Glu Arg His130 135 140caa gga ctc atc cat cct ttt aaa atg aag tgg cag tac act acc cga 480Gln Gly Leu Ile His Pro Phe Lys Met Lys Trp Gln Tyr Thr Thr Arg145 150 155 160agg gct ttc aca atc ttg ggt gtg gtc tgg ttg gca gcc atc atc gta 528Arg Ala Phe Thr Ile Leu Gly Val Val Trp Leu Ala Ala Ile Ile Val165 170 175gga tca ccc atg tgg cac gta caa cgc ctc gag att aag tat gac ttc 576Gly Ser Pro Met Trp His Val Gln Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe180 185 190ctc tat gag aaa gaa cat gtc tgc tgt ttg gaa gag tgg gcc agc ccc 624Leu Tyr Glu Lys Glu His Val Cys Cys Leu Glu Glu Trp Ala Ser Pro195 200 205atg cac cag aga atc tac acc acc ttc atc ctc gtc atc ctc ttc ctc 672Met His Gln Arg Ile Tyr Thr Thr Phe Ile Leu Val Ile Leu Phe Leu210 215 220ctg ccg ctt gtg gtg atg ctt gtc ctc tac agc aag att ggc tat gaa 720Leu Pro Leu Val Val Met Leu Val Leu Tyr Ser Lys Ile Gly Tyr Glu225 230 235 240ctg tgg atc aag aag aga gtt gga gac agt tca gca ctt cag act atc 768Leu Trp Ile Lys Lys Arg Val Gly Asp Ser Ser Ala Leu Gln Thr Ile245 250 255cac ggg aaa gaa atg tcc aaa ata gcc agg aag aag aag cgg gct gtc 816His Gly Lys Glu Met Ser Lys Ile Ala Arg Lys Lys Lys Arg Ala Val260 265 270
gtt atg atg gtg aca gtg gtg gct ctc ttc gct gcg tgc tgg gca cct 864Val Met Met Val Thr Val Val Ala Leu Phe Ala Ala Cys Trp Ala Pro275 280 285ttc cat gtt gtt cac atg atg gtt gag tac agt aac ttt gaa aaa gag 912Phe His Val Val His Met Met Val Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu290 295 300tat gat gat gtc aca atc aag atg gtt ttt gct gtt gca caa aca att 960Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys Met Val Phe Ala Val Ala Gln Thr Ile305 310 315 320ggc ttt ttc aac tcc atc tgt aat ccc ttt gtg tat gca ttt atg aat 1008Gly Phe Phe Asn Ser Ile Cys Asn Pro Phe Val Tyr Ala Phe Met Asn325 330 335gaa aac ttc aaa aag aat ttt ttg tct gcg gtt tgt tat tgc ata gta 1056Glu Asn Phe Lys Lys Asn Phe Leu Ser Ala Val Cys Tyr Cys Ile Val340 345 350aaa gaa acc ttc tcc cca gga cag aag cct gga aat tct ggg att tca 1104Lys Glu Thr Phe Ser Pro Gly Gln Lys Pro Gly Asn Ser Gly Ile Ser355 360 365atg atg caa aag aga gca aag tta tca cga tca cag cgt cca gtg gcg 1152Met Met Gln Lys Arg Ala Lys Leu Ser Arg Ser Gln Arg Pro Val Ala370 375 380gaa gcc aaa gga gac tta ttc agc gat gcc aac gtt gat gtc aaa ttg 1200Glu Ala Lys Gly Asp Leu Phe Ser Asp Ala Asn Val Asp Val Lys Leu385 390 395 400tgt gag cag cca ggg gag aaa agg caa ctc aag cga cag ctt gcc ttc 1248Cys Glu Gln Pro Gly Glu Lys Arg Gln Leu Lys Arg Gln Leu Ala Phe405 410 415ttt agt tct gaa ctt tct gaa aac tct act ttc ggc agt gga cat gaa 1296Phe Ser Ser Glu Leu Ser Glu Asn Ser Thr Phe Gly Ser Gly His Glu420 425 430ctg taa 1302Leu<210>20<211>433<212>PRT<213>未知<220>
<223>小鼠<400>20Met Gln Ala Leu Asn Ile Thr Ala Glu Gln Phe Ser Arg Leu Leu Ser15 10 15
Ala His Asn Leu Thr Arg Glu Gln Phe Ile His Arg Tyr Gly Leu Arg20 25 30Pro Leu Val Tyr Thr Pro Glu Leu Pro Ala Arg Ala Lys Leu Ala Phe35 40 45Ala Leu Ala Gly Ala Leu Ile Phe Ala Leu Ala Leu Phe Gly Asn Ser50 55 60Leu Val Ile Tyr Val Val Thr Arg Ser Lys Ala Met His Thr Val Thr65 70 75 80Asn Ile Phe Ile Cys Ser Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Ile Ala Phe85 90 95Phe Cys Ile Pro Val Thr Met Leu Gln Asn Ile Ser Asp Lys Trp Leu100 105 110Gly Gly Ala Phe Ile Cys Lys Met Val Pro Phe Val Gln Ser Thr Ala115 120 125Val Val Thr Glu Ile Leu Thr Met Thr Cys Ile Ala Val Glu Arg His130 135 140Gln Gly Leu Ile His Pro Phe Lys Met Lys Trp Gln Tyr Thr Thr Arg145 150 155 160Arg Ala Phe Thr Ile Leu Gly Val Val Trp Leu Ala Ala Ile Ile Val165 170 175Gly Ser Pro Met Trp His Val Gln Arg Leu Glu Ile Lys Tyr Asp Phe180 185 190Leu Tyr Glu Lys Glu His Val Cys Cys Leu Glu Glu Trp Ala Ser Pro195 200 205Met His Gln Arg Ile Tyr Thr Thr Phe Ile Leu Val Ile Leu Phe Leu210 215 220Leu Pro Leu Val Val Met Leu Val Leu Tyr Ser Lys Ile Gly Tyr Glu225 230 235 240Leu Trp Ile Lys Lys Arg Val Gly Asp Ser Ser Ala Leu Gln Thr Ile245 250 255His Gly Lys Glu Met Ser Lys Ile Ala Arg Lys Lys Lys Arg Ala Val260 265 270Val Met Met Val Thr Val Val Ala Leu Phe Ala Ala Cys Trp Ala Pro275 280 285Phe His Val Val His Met Met Val Glu Tyr Ser Asn Phe Glu Lys Glu290 295 300Tyr Asp Asp Val Thr Ile Lys Met Val Phe Ala Val Ala Gln Thr Ile305 310 315 320
Gly Phe Phe Asn Ser Ile Cys Asn Pro Phe Val Tyr Ala Phe Met Asn325 330 335Glu Asn Phe Lys Lys Asn Phe Leu Ser Ala Val Cys Tyr Cys Ile Val340 345 350Lys Glu Thr Phe Ser Pro Gly Gln Lys Pro Gly Asn Ser Gly Ile Ser355 360 365Met Met Gln Lys Arg Ala Lys Leu Ser Arg Ser Gln Arg Pro Val Ala370 375 380Glu Ala Lys Gly Asp Leu Phe Ser Asp Ala Asn Val Asp Val Lys Leu385 390 395 400Cys Glu Gln Pro Gly Glu Lys Arg Gln Leu Lys Arg Gln Leu Ala Phe405 410 415Phe Ser Ser Glu Leu Ser Glu Asn Ser Thr Phe Gly Ser Gly His Glu420 425 430Leu
權(quán)利要求
1.一種鑒定SP9155受體激動劑或拮抗劑的方法，所述方法包括(a)在已知量的標(biāo)記SP9155受體的配體的存在下，使SP9155受體或其功能片段與需要測試所述激動劑或拮抗劑存在的樣品接觸；和(b)測定特異性結(jié)合所述受體的配體量；其中與不存在所述樣品的情況下測得的結(jié)果相比，測量到所述標(biāo)記配體與所述受體的結(jié)合顯著降低，則所述樣品被鑒定為含有拮抗劑或激動劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述標(biāo)記配體是包含選自SEQ ID NO4-11和SEQ ID NO13-18的氨基酸序列的羧基末端酰胺化多肽。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述受體包含SEQ ID NO2或SEQID NO20的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述受體的來源包含從含有所述受體的哺乳動物細(xì)胞中分離的膜。
5.一種鑒定SP9155受體激動劑或拮抗劑的方法，所述方法包括(a)在已知量的SP9155受體的配體的存在下，使表達(dá)SP9155受體或其功能片段的細(xì)胞與需要測試所述激動劑或拮抗劑存在的樣品接觸；和(b)測定所述細(xì)胞的鈣活動化；其中與不存在所述樣品的情況下測得的結(jié)果相比，測量到鈣活動化顯著降低，則所述樣品被鑒定為含有拮抗劑；并且其中與不存在所述樣品的情況下測得的結(jié)果相比，測量到鈣活動化顯著增加，則所述樣品被鑒定為含有激動劑。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述配體是包含選自SEQ ID NO4-11和SEQ ID NO13-18的氨基酸序列的羧基末端酰胺化多肽。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述受體包含SEQ ID NO2或SEQID NO20的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求5的方法，其中通過使鈣與鈣指示劑接觸，然后測量所述指示劑的熒光，來測量鈣活動化。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述鈣指示劑是1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羥基-3-氧-9-呫噸基)苯氧基]-2-(2′-氨基-5′-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸，五乙酰氧基甲酯。
10.一種制備多肽的方法，所述方法包括在編碼抗原多肽的核酸表達(dá)的條件下，培養(yǎng)包含重組載體的宿主細(xì)胞，所述載體包含編碼抗原多肽的核酸，所述抗原多肽包含SEQ ID NO4或SEQ ID NO13的7個或7個以上的連續(xù)氨基酸。
11.權(quán)利要求10的方法，其中從所述培養(yǎng)物中分離所述多肽。
12.一種在抗原肽與抗體分子之間形成復(fù)合物的方法，所述抗原肽包含選自SEQ ID NO4和SEQ ID NO13的氨基酸序列的7個或7個以上的連續(xù)殘基，而所述抗體分子特異性結(jié)合所述肽，所述方法包括使所述肽與所述抗體分子接觸。
13.一種治療或預(yù)防患者的由SP9155受體介導(dǎo)的醫(yī)學(xué)病癥的方法，所述方法包括給予所述患者包含抗體或其抗原結(jié)合片段以及藥學(xué)上可接受的載體的藥用組合物，所述抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合包含SEQ ID NO4或SEQ ID NO13的7個或7個以上的連續(xù)氨基酸的多肽。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述醫(yī)學(xué)病癥選自疼痛和肥胖癥。
15.一種分離的抗原多肽，所述抗原多肽包含選自SEQ ID NO4和SEQ ID NO13的氨基酸序列的7個或7個以上的連續(xù)殘基。
16.一種分離的多肽，所述多肽包含選自SEQ ID NO4-11和SEQID NO13-18的氨基酸序列。
17.權(quán)利要求15的分離的抗原多肽，所述多肽是羧基末端酰胺化的。
18.一種抗體或其功能片段，所述抗體或其功能片段特異性結(jié)合權(quán)利要求15的多肽。
19.一種分離的核酸，所述核酸編碼權(quán)利要求15的多肽。
20.權(quán)利要求19的核酸，所述核酸編碼包含選自SEQ ID NO4-11和SEQ ID NO13-18的氨基酸序列的多肽。
21.權(quán)利要求20的核酸，所述核酸包含選自SEQ ID NO3和SEQID NO12的核苷酸序列。
22.一種重組載體，所述重組載體包含權(quán)利要求19的核酸。
23.一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求22的載體。
24.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含權(quán)利要求15的多肽和藥學(xué)上可接受的載體。
25.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含權(quán)利要求18的抗體分子和藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及RF－酰胺肽及其在治療、預(yù)防和治愈神經(jīng)障礙和代謝紊亂中的用途。本發(fā)明也涉及用于調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體的方法以及用于鑒定調(diào)節(jié)該受體的物質(zhì)的方法。
文檔編號C07H21/04GK1659438SQ03813123
公開日2005年8月24日 申請日期2003年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月12日
發(fā)明者Y·蔣, F·L·張, N·J·穆爾戈羅, L·羅, J·S·西蒙 申請人:先靈公司