專利名稱：支原體多肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及支原體多肽制品以及含有抗支原體多肽抗體的抗體制品。
2.背景信息支原體是一大群包括柔膜體(Mollicutes)綱類在內的多種原核生物。支原體缺乏細胞壁，基因組很小，種系發(fā)生上與革蘭陽性真細菌類相關，是已知的最小自我復制生物體(Razin，Microbiol.Rev.，49419-455(1985)；Razin，FEMSMicrobiol.Lett.，79423-432(1992)；Razin和Jacobs，J.Gen.Microbiol.，138407-422(1992))。支原體的表面顯然是該微生物與其宿主細胞相互作用的關鍵部位(Freundt和Edward.1979.“分類和分類法”(Classification and taxonomy).1-42頁.M.F.Barile和S.Razin(主編)，《支原體》(The Mycoplasmas).Academicpress，New York，NY；Rogers等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，821160-1164(1985)；Woese等，J.Mol.Evol.，21305-316(1984-1985))。
肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)(Mhyo)是豬支原體肺炎的病原，它不斷導致豬生產商的顯著經濟損失。此生物是一種胞外病原體定居于豬呼吸道上皮。肺炎支原體感染在與其它豬呼吸道病原體相關中的作用重要性增加(Ross，RF，1999.“支原體疾病”(Mycoplasmal diseases)，495-509頁，B.E.Straw，S.D'Allaire，W.L.Mengeling和D.J.Taylor(主編)，《豬疾病》(Diseases ofswine).Iowa State University Press，Ames，IA)。例如，肺炎支原體可加重豬生殖和呼吸道綜合癥、病毒誘導的肺炎(Thacker等，J.Clin.Microbiol.，37620-627(1999))。肺炎支原體首先通過破壞氣管、支氣管和細支氣管纖毛上皮細胞來誘導肺炎(Debey等，Am.J.Vet.Res.，531705-1710(1992)；Mebus和Underdahl，Am.J.Vet.Res.，381249-1254(1977)；Tertyshnikova和Fein，CellCalcium.，21331-344(1997))。然而，肺炎支原體誘導的纖毛損傷或纖毛損失的機制還不太了解。近來，發(fā)展了一種氣管上皮細胞模型，使我們能研究肺炎支原體91-3的致病機理(Zhang等，Infect.Immun.，624367-4373(1994))。
肺炎支原體對纖毛上皮的粘附是誘導該生物定居所必須的，這導致纖毛損失(Mebus和Underdahl，Am.J.Vet.Res.，381249-1254(1977)；Zhang等，Infect.Immun.，621616-1622(1994)；Zhang等，Infect.Immun.，631013-1019(1995))。因此，支原體粘附其宿主細胞是支原體疾病發(fā)病中的一個重要起始步驟。粘附過程主要通過受體-配基相互作用所介導(Zhang等，Infect.Immun.，624367-4373(1994)；Zhang等，Infect.Immun.，621616-1622(1994)；Zhang等，Infect.Immun.，631013-1019(1995)；Zielinski和Ross，Am.J.Vet.Res.，541262-1269(1993))。與此觀念一致的是觀察到肺炎支原體的強毒株體外能粘附氣管組織纖毛，與肺炎支原體無毒株相反(Young等，Vet.Microbiol.，71269-279(1999))。
概述本發(fā)明涉及與支原體多肽制品相關的方法和材料，這些制品能增加豬纖毛氣管細胞的鈣釋放。這種多肽制品可用于產生能阻斷支原體誘導鈣釋放的多肽片段，且可用于產生能結合支原體多肽的抗體。本發(fā)明也提供能結合支原體多肽的抗體。這種抗體可用于抑制支原體誘導的鈣釋放并可用于鑒別致病和非致病性支原體。另外，本發(fā)明提供鑒定支原體誘導豬纖毛氣管細胞鈣釋放的抑制劑。這種抑制劑可用于保護豬不發(fā)生支原體肺炎且可用于治療患支原體肺炎的豬。
一般，本發(fā)明一個方面的特征是一種基本純的多肽，其中該多肽能提高纖毛氣管細胞的鈣釋放，該多肽分子量在約30kDa和約150kDa之間。該多肽可以是支原體多肽。該多肽可獲自致病性肺炎支原體。該多肽可以約80％純度或約90％純度。該多肽的分子量可約30、60、65、90或120kDa。該多肽可以是胰蛋白酶消化的片段。胰蛋白酶消化后的該多肽分子量可約35kDa或50kDa。
另一個方面，本發(fā)明的特征是能結合其多肽的基本純的抗體，其中所述的多肽能提高豬纖毛氣管細胞的鈣釋放，所述多肽的分子量在約30kDa和約150kDa之間。所述抗體可以是單克隆抗體。所述抗體可以是小鼠抗體。所述多肽可以是胰蛋白酶消化的片段。所述多肽可以是支原體多肽。所述多肽可獲自致病性肺炎支原體。所述抗體可以約80％純度或約90％純度。
本發(fā)明又一方面的特征是一種誘導哺乳動物免疫應答反應的方法，其中所述免疫應答是針對支原體多肽的。該方法包括在哺乳動物生成抗支原體多肽抗體的條件下，給予哺乳動物基本純的支原體多肽，其中所述多肽能提高豬纖毛氣管細胞的鈣釋放，所述多肽分子量在約30kDa和約150kDa之間。哺乳動物可以是小鼠、兔或豬。
本發(fā)明另外一方面的特征是使抗體結合多肽的方法，其中所述多肽能提高豬纖毛氣管細胞的鈣釋放，所述多肽分子量在約30kDa和約150kDa之間。該方法包括(a)獲得能結合所述多肽的抗體，(b)在抗體結合所述多肽的條件下使抗體接觸該多肽。所述抗體可以是單克隆抗體。所述抗體可以是小鼠抗體。所述多肽可以是支原體多肽。
本發(fā)明另一方面的特征是鑒定支原體誘導豬纖毛氣管細胞鈣釋放的抑制劑的方法，。該方法包括(a)使細胞(如豬纖毛氣管細胞)接觸支原體多肽和測試化合物，其中所述多肽能提高豬纖毛氣管細胞的鈣釋放，該多肽分子量在約30kDa和約150kDa之間，(b)確定測試化合物是否能抑制細胞釋放鈣，其中測試化合物若能抑制細胞的鈣釋放，表明該測試化合物是抑制劑。測試化合物可以是蛋白酶或抗體。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的特征是鑒定支原體多肽誘導細胞(如豬纖毛氣管細胞)鈣釋放抑制劑的方法，其中所述多肽能提高纖毛氣管細胞的鈣釋放，該多肽分子量在約30kDa和約150kDa之間。該方法包括(a)使細胞(如豬纖毛氣管細胞)接觸已用測試化合物預處理的支原體多肽，(b)確定該測試化合物是否能抑制細胞釋放鈣，其中測試化合物若能抑制細胞的鈣釋放，表明該測試化合物是抑制劑。測試化合物可以是蛋白酶或抗體。
除非另有定義，本文所用的全部技術和科學術語與本發(fā)明涉及領域普通技術人員通常理解的含意相同。盡管與本文所述類似和相同的方法和材料可用于實施或測試本發(fā)明，但下面描述的是適合的方法和材料。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻全部納入本文供參考。萬一沖突，本說明書會予以控制，包括定義。另外，材料、方法和實施例僅用于闡述不應認為是限制。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點可從下列詳細描述和權利要求而明白。


圖1包含描繪纖毛物若能抑制來自細胞豬氣管細胞[Ca2+]i反應的3張圖。資料是代表性掃描圖，顯示(a)致病性肺炎支原體菌株9-13(n＝10，總共47個細胞)、(b)非致病性肺炎支原體菌株(n＝6，總共18個細胞)和(c)絮狀支原體(n＝8，總共24個細胞)的作用。所有三種支原體制品的蛋白濃度是300μg/mL。箭頭表示加入支原體。
圖2是直方狀圖，描繪所示治療的[Ca2+]i升高超過基礎水平。PMH代表致病性肺炎支原體菌株9-13；NPMH代表非致病性肺炎支原體；MF代表絮狀支原體。數據表示為平均值±SE。完整肺炎支原體9-13以30(在6次實驗中n＝18個氣管細胞)、100(在7次實驗中n＝16個細胞)和300μg/mL(在10次實驗中n＝47個細胞)施用。絮狀支原體(在8次實驗中n＝24個細胞)和非致病性肺炎支原體(在6次實驗中n＝18個細胞)以300μg/mL施用。箭頭表示與其它處理相比有顯著性差異(P＜0.05)。
圖3包含描繪接種肺炎支原體菌株9-13豬纖毛氣管細胞的[Ca2+]i反應的4張圖。資料是代表性掃描圖，顯示(a)無Ca2+的培養(yǎng)基(n＝5個細胞)、(b)用毒胡蘿卜素(TG；1μM)預處理30分鐘(n＝5個細胞)、(c)用U-73122(2μM；n＝5個細胞)處理100秒和(d)U-73343(2μM；n＝5個細胞)對肺炎支原體誘導的[Ca2+]i增加的效果。箭頭表示加入完整支原體(300μg/mL)。
圖4包括描繪豬纖毛氣管細胞用百日咳毒素(PTX；100ng/mL)預處理3小時后接種肥大脫粒肽7(Mas7)或肺炎支原體的[Ca2+]i反應的4張圖。資料是(a)肺炎支原體對照(n＝9個細胞)的、(b)用PTX處理的肺炎支原體(n＝11個細胞)、(c)Mas 7(10μM)對照(n＝9個細胞)和(d)用PTX處理的Mas 7(n＝9個細胞)的代表性掃描圖。
圖5是提出的肺炎支原體-纖毛氣管細胞相互作用模型的示意圖。Rc＝受體；ER＝內質網。
圖6包括描繪接種Mhyo膜的豬纖毛氣管細胞中[Ca2+]i反應的4張圖，。各掃描圖表示各氣管細胞中的[Ca2+]i變化。箭頭表示施用的時候。(A)膜制品(100μg/mL)增加了[Ca2+]i。(B)用蛋白酶K消化阻斷了膜誘導的[Ca2+]i增加。將該膜(100μg/0.1mL PBS)37℃與蛋白酶K(2μg)一起孵育8小時，然后加到0.9mLKreb-Ringer重碳酸鹽(KRB)緩沖液中的氣管細胞上。(C)用胰蛋白酶消化加強了膜誘導的[Ca2+]i增加。將此膜(100μg/0.1mL PBS)37℃與胰蛋白酶(6μg)一起孵育30分鐘，然后加到0.9mL KRB中的氣管細胞上。(D)該可溶性膜蛋白比(A)中未消化的膜活性更高。超離心(100,000xg，60分鐘)通過胰蛋白酶消化的膜獲得上清，制備該可溶性蛋白。
圖7是致病性(P)和非致病性(N)Mhyo的Mhyo膜多肽用豬抗Mhyo血清(1∶80)探測的免疫印跡照片。標記物泳道通過以kDa計的表觀分子量(10μg/泳道)鑒定。箭頭表示在致病性Mhyo，而不是非致病性Mhyo中觀察到的多肽條帶。
圖8是致病性(P)和非致病性(N)Mhyo的Mhyo膜多肽的免疫印跡照片。樣品用胰蛋白酶消化并用豬抗Mhyo血清(1∶80)探測。標記物泳道通過以kDa計的表觀分子量(10μg/泳道)鑒定。箭頭表示在致病性Mhyo，但不是非致病性Mhyo中觀察到的多肽帶。
圖9是描繪采用陰離子交換HPLC純化Mhyo膜多肽的胰蛋白酶消化片段的圖。采用Tris緩沖液(pH8.5)而且的0-0.5M NaCl線性梯度液洗脫該多肽。洗脫物以280nm吸光率監(jiān)測。數字3表示組分3；而數字4表示組分4。
圖10是描繪組分4(10μg/mL)誘導豬纖毛氣管細胞(n＝8個細胞)中[Ca2+]i增加的圖。此組分引起了[Ca2+]i增加。箭頭表示加入該多肽組分。
圖11是Mhyo多肽用抗Mhyo豬恢復期血清探測的免疫印跡照片。標記物泳道通過以kDa計的表觀分子量鑒定。泳道1組分#4(10μg/泳道)；泳道2純化前Mhyo的可溶性胰蛋白酶消化片段(10μg/泳道)；泳道3組分#4(另一次純化過程所得；5μg/泳道)；泳道4Mhyo的完整細胞抗原(10μg/泳道)；泳道5空白(無抗原)。第一抗體是豬抗血清(1∶100)。第二抗體是山羊抗豬血清(1∶1000)。陽性條帶見于泳道1和3中約65kDa處。
圖12是描繪用陰離子交換HPLC純化Mhyo膜蛋白的胰蛋白酶消化片段的圖。采用Tris緩沖液(pH8.5)配的0-0.5M NaCl線性梯度液洗脫該多肽。洗脫物以280nm吸光率監(jiān)測。洗脫物的組分8表現出Ca2+釋放能力。
圖13是描繪組分8(1μg)誘導豬纖毛氣管細胞(n＝4個細胞)中[Ca2+]i增加的圖。此組分是引起[Ca2+]i增加的唯一洗脫且分。箭頭表示加入該多肽組分。
圖14是描繪與用大豆胰蛋白酶抑制劑(TI)預處理的胰蛋白酶消化的Myho膜制品孵育后，豬纖毛氣管細胞中[Ca2+]i增加的圖。TI不能抑制Mhyo胰蛋白酶消化的膜制品誘導的纖毛氣管上皮中[Ca2+]i增加。TI在37℃與胰蛋白酶消化的膜制品孵育10分鐘，然后加入?？v座標顯示以nM計的[Ca2+]i。各掃描圖描述一個細胞中的[Ca2+]i變化。
詳細描述本發(fā)明提供涉及支原體的方法和材料。例如，本發(fā)明提供的支原體多肽能增加豬纖毛氣管細胞的鈣釋放以及結合這種支原體多肽的抗體。另外，本發(fā)明提供方法可鑒定支原體誘導豬纖毛氣管細胞鈣釋放的抑制劑，。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供基本純的多肽。如本文所用，術語“多肽”指具有或沒有一種或多種翻譯后修飾(如磷酸化或糖基化)的任何氨基酸殘基鏈。本發(fā)明提供的多肽可是任何大小。例如，能增加豬纖毛氣管細胞鈣釋放的多肽可以長10、25、50、75、100、125、150、175、200個或更多個氨基酸。另外，能增加豬纖毛氣管細胞鈣釋放的多肽分子量可在約10kDa和約150kDa之間。例如，能增加豬纖毛氣管細胞鈣釋放的多肽分子量可以約10、20、30、40、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120kDa。此外，能增加細胞(如豬纖毛氣管細胞)鈣釋放的多肽可以是胰蛋白酶消化的片段。在這種情況中，胰蛋白酶消化后的多肽分子量可在約10kDa和約80kDa之間。例如，胰蛋白酶消化后的多肽分子量可以約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80kDa。在一些實施方案中，能增加細胞(如豬纖毛氣管細胞)鈣釋放的多肽(如全長多肽或胰蛋白酶消化片段)可來自致病性Mhyo菌株(如致病性肺炎支原體菌株9-13)。
如本文所用，術語“氨基酸殘基”指天然氨基酸殘基、非天然氨基酸殘基和氨基酸類似物，如果它們結構允許都可以是其D和L立體異構體。天然氨基酸殘基包括但不限于丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和纈氨酸(Val)。非天然氨基酸殘基包括但不限于吖丁啶羧酸、2-氨基脂肪酸、3-氨基脂肪酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基異丁酸、鎖鏈素、2，2’-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羥基賴氨酸、別羥基賴氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈素、別異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基異亮氨酸、N-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸、六氫吡啶羧酸和N-甲基精氨酸。
如本文所用，術語“氨基酸類似物”所指的化合物，結構類似于天然多肽中通常所見的天然產生氨基酸殘基，但組成不同，其C-末端羧基、N-末端氨基或側鏈官能團被化學修飾成另一種官能團。氨基酸類似物包括但不限于天冬氨酸類似物天冬氨酸-(β-甲酯)；甘氨酸類似物N-乙基甘氨酸和丙氨酸類似物氨甲酰丙氨酸。其它氨基酸殘基和氨基酸類似物的例子列表于Gross和Meienhofer，《肽分析、合成、生物學》(PeptidesAnalysis，Synthesisi，Biology)，Academic Press，Inc.，New York(1983)。氨基酸類似物可天然產生或合成制備。
可通過在氨基和羧基末端加入穩(wěn)定劑以促進多肽體內存活，而修飾多肽用于體內使用。這可用于肽末端傾向于在細胞攝入前被蛋白酶降解的情況。這種阻斷劑可包括但不限于其它相關或不相關的氨基酸序列，這些序列可結合多肽的氨基和/或羧基末端殘基(如能結合N-末端氨基酸的乙?；蚰芙Y合C-末端氨基酸的酰胺基)。這種結合可在多肽合成中通過化學反應，或通過重組DNA技術用標準方法實現。另外，阻斷劑如焦谷氨酸或其它分子可結合氨基和/或羧基末端殘基。在其它實施方案中，氨基末端的氨基和/或羧基末端的羧基可用不同分子取代。
多肽也可包含一氨基酸標志。如本文所用，術語“氨基酸標志”指一般較短的氨基酸序列，它可提供方便的檢測方法和/或通過與該抗標的記抗體相互作用或通過能識別該標記的其它化合物和分子來純化。例如，氨基酸標志如c-myc、紅血球凝聚素、聚組氨酸或Flag有助于純化和檢測多肽。例如，含聚組氨酸標志的多肽可依靠組氨酸殘基對鎳離子的親和性(如在Ni-NTA柱上)而純化，可用抗聚組氨酸抗體(如Penta-His抗體；Qiagen，Valencia，CA)在蛋白質印跡中檢測?？蓪被針酥静迦攵嚯男蛄兄械娜魏蔚胤健＠?，可將氨基酸標志插入多肽的氨基和/或羧基末端。
本文所述多肽可用任何方法獲得。例如，能增加細胞鈣釋放的多肽，可通過從天然來源(如來自Mhyo細胞)提取，通過表達編碼該多肽的重組核酸或通過化學合成(如固相合成或其它本領域熟知的方法，包括用ABI肽合成儀合成；AppliedBiosystems，Foster City，CA)獲得。另外，該多肽可通過例如高壓液相層析(如反相HPLC)純化，或可用凝膠電泳純化。例如，可從凝膠切下對應于特定多肽的條帶并洗脫以獲得多肽制品。
本文提供的多肽可以是基本純化。如本文所用，關于多肽的術語“基本純的”指該多肽基本上沒有其它多肽、脂類、碳水化合物和與其天然相伴隨的核酸。因此，基本純的多肽是從其天然環(huán)境中取得的任何多肽且至少60％優(yōu)選75％，最優(yōu)選90％，沒有其它天然相伴隨成分。本文提供的多肽可以是60％、65、70、75、80、85、90、95或99純。通常，基本純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上產生單個主要條帶。如果純化Mhyo多肽并隨后與例如佐劑或藥學運載體混合就認為它是基本純的，因為Mhyo多肽已與其天然相伴隨的細胞成分分離?？捎萌魏畏椒兓疚奶峁┑亩嚯?。例如，親和層析、免疫沉淀、大小排阻層析和離子交換層析可用于純化Mhyo多肽。純化程度可通過任何適當方法測定，包括但不限于柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相層析。
可用任何方法確定特定多肽是否能增加細胞的鈣釋放。例如，本文所述技術可用于測定豬纖毛氣管細胞的鈣釋放。
本發(fā)明也提供能結合本文所提供多肽的抗體。如本文所用，術語“抗體”指完整抗體以及保持某些選擇性結合抗原表位能力的抗體片段。這種片段包括但不限于Fab、F(ab')2和Fv抗體片段。術語“抗原表位”指抗原上的抗原決定簇，它能與抗體的互補部分結合?？乖砦粵Q定簇通常由分子的化學活性表面基團(如氨基酸或糖殘基)組成且一般具有三維結構特征以及帶電荷特征。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供的抗體對本文所提供多肽具有特異性結合親和力。這種抗體能用于液相或結合固相的免疫試驗。例如，本文提供的抗體可用于直接或間接方式的競爭性和非競爭性免疫試驗。這種免疫試驗的例子包括放射性免疫試驗(RIA)和夾心(免疫測量)試驗。
本文提供的抗體可用任何方法制備。例如，本文提供的任何基本純的多肽或其片段可用作免疫原來誘導動物免疫應答反應，從而產生特異抗體。因此，完整的全長多肽或含小肽的片段可用作免疫用抗原。另外，用于免疫動物的免疫原可用化學合成或獲自翻譯的cDNA。此外，如果需要，可將免疫原與運載體多肽偶聯。常用的化學偶聯免疫多肽的載體，包括但不限于匙孔血藍蛋白(KLH)、甲狀腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和破傷風類毒素。
多克隆抗體的制備是本領域技術人員熟知的(例如Green等，“產生多克隆抗血清”(Production of Polyclonal Antisera)，《免疫化學方案》(ImmunochemicalProtocols)(Manson主編)，1-5頁(Humana Press 1992)和Coligan等，“在兔、大鼠、小鼠和倉鼠中產生多克隆抗血清”(Production of Polyclonal Antisera inRabbits，Rats，Mice and Hamsters)，《免疫學的現代方案》(Current Protocolsin Immunology)，2.4.1章(1992))。另外，可采用免疫學領域的常見多種技術純化和/或濃縮多克隆抗體以及單克隆抗體(Coligan等，第9單元，《免疫學的現代方案》，Wiley Interscience，1994)。
單克隆抗體的制備也是本領域技術人員熟知的(例如Kohler和Milstein，Nature256495(1975)；Coligan等，2.5.1-2.6.7章；Harlow等，《抗體實驗室手冊》(AntibodiesA Laboratory Manual)，726頁(Cold Spring Harbor Pub.1998)。簡言之，獲得單克隆抗體可通過給小鼠注射含抗原的組合物，通過分析血清樣品確認有抗體產生，取出脾臟以獲得B淋巴細胞，將B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合產生雜交瘤，克隆雜交瘤，選擇能產生抗該抗原抗體的陽性克隆，從雜交瘤培養(yǎng)物中分離此抗體。單克隆抗體可通過多種已很好建立的技術從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化。這種分離技術包括但不限于用蛋白A瓊脂糖親和層析、大小排阻層析和離子交換層析(Coligan等，2.7.1-2.7.12章和2.9.1-2.9.3章；Barnes等，“純化免疫球蛋白G(IgG)”(Purificaiton of Immunoglobulin(IgG)，《分子生物方法》(Methods in Molecular Biology)，第10卷，79-104頁(Humana Press1992))。
另外，單克隆抗體的體外和體內增殖方法是本領域技術人員熟知的。體外增殖可在適當的培養(yǎng)基中進行，如Dulbecco改良的Egale培養(yǎng)基(MEM)或RPMI 1640培養(yǎng)基，任選補充哺乳動物血清如胎牛血清或痕量元素和生長維持添加物，如正常小鼠腹膜滲出細胞、脾細胞和骨髓巨噬細胞。體外生產提供了相對純的抗體制品并可放大，產生大量所需抗體。大規(guī)模雜交瘤培養(yǎng)可通過均勻懸浮液培養(yǎng)完成，在氣升式反應器、連續(xù)攪拌反應器、或者固定的或包裹的細胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)。進行體內增殖可通過注射細胞克隆到與親代細胞組織相容的哺乳動物(如osyngeneic小鼠)中以導致產生抗體的腫瘤生長。動物在注射前任選用碳氫化合物預處理，具體是油如姥鮫烷(四甲基十五烷)。1到3周后，從動物體液中回收所需單克隆抗體。
抗體片段可通過蛋白酶水解完整抗體或表達編碼該片段的核酸來制備。抗體片段可通過常規(guī)方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗體來獲得。例如，可用胃蛋白酶切割抗體產生抗體片段以提供名為F(ab')2的5S片段。此片段可用硫醇還原劑進一步切割，并任選用封閉基團封閉二硫鍵斷裂產生的巰基以生成3.5SFab'單價片段。或者，用胃蛋白酶切割直接產生2個單價Fab’片段和Fc片段。這些方法的描述見例如Goldenberg(美國專利號4,036,945和4,331,647)和其他(Nisonhoff等，Arch.Biochem.Biophys.89230(1960)；Porter，Biochem.J.73119(1959)；Edelman等，《酶學方法》(Methods in Enzymology)，第1卷，422頁(Academic Press 1967)；Coligan等，2.8.1-2.8.10章和2.10.1-2.10.4章)。
另外，本發(fā)明提供的方法和材料可用于鑒定能抑制支原體誘導細胞(如豬纖毛氣管細胞)。鈣釋放(如Mhyo多肽誘導的鈣釋放)的化合物。鑒定支原體誘導的細胞鈣釋放的抑制劑的方法，可包括將細胞(如豬纖毛氣管細胞)，在測試化合物存在時與含支原體多肽(如致病性Mhyo的Mhyo多肽)的制品一起培養(yǎng)，確定測試化合物是否能抑制該細胞釋放鈣。在另一個實施方案中，鑒定鈣釋放抑制劑的方法可包括使細胞接觸已預先用支原體多肽制品處理的測試化合物，確定測試化合物是否能抑制該細胞釋放鈣。鈣釋放可用本文所述任何方法測定。制品可以是Mhyo膜多肽粗制品、純化的Mhyo多肽制品或Mhyo膜多肽制品的胰蛋白酶消化產物。如果含支原體多肽的制品誘導的鈣釋放在某化合物存在時與該化合物缺乏時相比減少，該測試化合物可鑒定為支原體誘導鈣釋放的抑制劑?！皽p少”指測試化合物存在時的鈣釋放低于(如低5％、10％、25％、50％、75％或100％)該化合物缺乏時。任何化合物均可用作測試化合物。例如，可用作測試化合物的分子是多肽(如蛋白酶、抗體、10-50個氨基酸的多肽)、寡核苷酸、酯、脂類、酯、碳水化合物或類固醇。本領域技術人員不難確定測試化合物的適當用量和適當的培養(yǎng)時間。
本發(fā)明在下列實施例中作進一步描述，這不限制權利要求所述的本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1-肺炎支原體增加豬纖毛氣管細胞中的胞內鈣釋放測定了整致病性肺炎支原體、非致病性肺炎支原體和絮狀支原體對豬纖毛氣管上皮細胞中胞內游離Ca2+濃度([Ca2+]i)的作用。簡言之，纖毛上皮細胞具有103±3nM的基礎[Ca2+]i(n＝217個細胞)。[Ca2+]i在致病性肺炎支原體菌株91-3(300μg/mL)加入100秒內從基礎水平增加至250±19nM(n＝47個細胞)，持續(xù)約60秒。相反，300μg/mL的非致病性肺炎支原體和絮狀支原體不能增加[Ca2+]i。在無Ca2+的培養(yǎng)基中，致病肺炎支原體仍增加了氣管細胞中的[Ca2+]i。用毒胡蘿卜素預處理(1μM，30分鐘)耗盡內質網中的Ca2+貯存，去除了肺炎支原體的作用。用百日咳毒素(100ng/mL，3小時)或磷脂酶C抑制劑U-73122(2μM，100秒)預處理也去除了肺炎支原體的作用。加入百日咳毒素敏感蛋白(Gi/o)激活劑肥大(細胞)脫粒肽7，增加了纖毛氣管細胞中的[Ca2+]i。這些結果提示致病性肺炎支原體活化了偶聯于Gi/o的受體，進而活化磷脂酶C途徑，導致內質網釋放Ca2+。因此，Ca2+可用作肺炎支原體致病的一種信號。
材料和方法所有試劑購自Sigma Chemical(St.Louis，MO)，除了fura-2AM獲自MolecularProbes(Eugene，OR)，U-73122、U-73343和肥大(細胞)脫粒肽7(Mas 7)獲自Biomol(Plymouth Meeting，PA)。
采用下列完整支原體(1)致病性肺炎支原體菌株91-3，最初克隆自菌株232，它在微量滴定粘附試驗中表現出對纖毛的高粘附性(Zhang等，Infect.Immun.，621616-1622(1994))；(2)非致病性肺炎支原體菌株J(ATCC菌株25934)，它不粘附纖毛(Zielinski和Ross，Am.J.Vet.Res.，541262-1269(1993))；絮狀支原體菌株Ms42(ATCC菌株27399)，它在豬中不致病。將以上支原體在Friis培養(yǎng)基(Friis，Nord.Vet.Med.，27337-339(1975))中培養(yǎng)到對數生長期，以15,000xg離心30分鐘收集。離心后，收集支原體沉淀并用50mL PBS通過15,000xg離心15分鐘洗三次。最終沉淀物通過27-號針頭分散于PBS中。從200mL培養(yǎng)物(3.4±1.7×1011CCU，n＝7)收集的支原體全細胞數用含Friis培養(yǎng)基的試管作系列稀釋測定以顏色變化單位(CCU)表示。如上所述此細胞密度對應于2.70±0.08mg蛋白，用二金雞寧酸方法(Pierce，Rockford，IL)測量，(Zhang等，Infect.Immmun.，624367-4373(1994)和Zhang等，Infect.Immun.，631013-1019(1995))。最終支原體濃度用PBS調至3mg蛋白/mL。
如上所述分離氣管細胞(Young等，Vet.Microbiol.，71269-279(1999))。簡言之，以無菌技術從3-6月齡無特定病原體的用戊巴比妥鈉麻醉的豬取得氣管。用含0.15％鏈霉蛋白酶和0.01％DNA酶的無Ca2+和Mg2+的MEM培養(yǎng)基4℃孵育24小時解離獲得纖毛細胞。上皮細胞通過125xg離心5分鐘收集。將細胞沉淀重懸浮于DMEM(高葡萄糖)和Ham F-12(1∶1)培養(yǎng)基的混合液中，該混合液含有5％FBS、0.12U/mL胰島素和100U/mL青霉素-鏈霉素。細胞懸浮液轉至90mm組織培養(yǎng)皿在5％CO2中培養(yǎng)60-90分鐘以去除成纖維細胞。氣管上皮細胞保存于液氮直到使用。
下列技術用于獲得單個細胞中的[Ca2+]i測定。氣管細胞用Kreb-Ringer重碳酸鹽(KRB)緩沖溶液配的4μM呋喃-2乙酰氧基甲酯(呋喃-2AM)上樣，該溶液含136mM NaCl、4.8mM KCl、1.5mM CaCl2、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4、10mM HEPES、5.5mM葡萄糖和0.1％BSA，pH7.4，37℃孵育30分鐘。離心(700xg，2分鐘)上樣細胞，隨后以500-1000個細胞/mL濃度重懸浮于KRB。用fura-2AM上樣的氣管細胞置于特制培養(yǎng)皿中的聚賴氨酸-包被蓋玻片上。將含呋喃-2上樣細胞的平皿放在倒置熒光顯微鏡(Carl Zeiss，NY)鏡臺上。在24℃時僅聚焦于活的纖毛氣管細胞測定[Ca2+]i。fura-2上樣的豬纖毛氣管細胞在37℃時迅速退化。獲得熒光圖像(激發(fā)波長為334和380nm；發(fā)射波長為510±20nm)，通過減去背景產生[Ca2+]i的空間分辨圖，圖像在像素-像素基礎上劃分。將發(fā)射的信號數字化、記錄和用Attofluor數字熒光成像系統(tǒng)(Atto Instruments，Rockville，MD)加工。讀取熒光150秒后，將支原體與該細胞系統(tǒng)混合。如上所述計算出[Ca2+]i(Grynkiewicz等，J.Biol.Chem.，2603440-3450(1985))。根據Atto Instruments提供的程序原位進行校準，使用Fura-2 penta K+作為標準。
為比較氣管細胞對致病性肺炎支原體菌株91-3、無毒肺炎支原體和絮狀支原體的[Ca2+]i反應，細胞用300μg/mL的相同濃度處理。各實驗中選出1-5個纖毛氣管細胞用于研究[Ca2+]i的變化。這些支原體在加到氣管細胞前保持于冰上。
為研究Ca2+信號傳遞途徑，將百日咳毒素(PTX，100ng/mL)與氣管細胞預先孵育3小時。用毒胡蘿卜素(TG，1μM)37℃預處理細胞30分鐘，然后加入支原體以耗盡ER Ca2+貯存(Thastrup等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，872466-2479(1990))。細胞用磷脂酶C抑制劑U-73122(2μM)(Bleasdale和Fisher，Neuroprotocols，3125-133(1993))或其無活性類似物U-73343 37℃預處理100秒，然后加入支原體。為證實支原體可通過活化Gi/o蛋白來增加[Ca2+]i，用此蛋白的活化劑Mas7(10μM)(Higashijima等，J.Biol.Chem.，26514176-14186(1990))來測定它是否能增加氣管細胞中的[Ca2+]i。另外，測定了PTX是否能阻斷Mas 7所致的[Ca2+]i增加。
用ANOVA或Student t-檢驗分析關于[Ca2+]的數據。顯著水平設置為P＜0.05。支原體對豬纖毛氣管上皮細胞中[Ca2+]i的作用肺炎支原體菌株91-3能結合豬氣管細胞的纖毛(Debey等，Am.J.Vet.Res.，531705-1710(1992)；Mebus和Underdahl，Am.J.Vet.Res.，381249-1254(1977)；Tajima和Yagihashi，Infect.Immun.，371162-1169(1982))。測定了纖毛氣管細胞接種菌株91-3后的[Ca2+]i變化。纖毛上皮細胞具有103±3nM的基礎[Ca2+]I(n＝217個細胞)。接觸300μg/mL的肺炎支原體菌株91-3后，觀察到89％的細胞(10次實驗53個細胞中的47個)中[Ca2+]i增加。如圖1和2所示，加入致病性肺炎支原體菌株91-3(300μg/mL)在100秒內增加了纖毛細胞中的[Ca2+]i。相反，非致病性肺炎支原體(6次實驗中的18個細胞)和絮狀支原體(9次實驗中的24個細胞)在相同濃度(300μg/mL)不增加[Ca2+]i(圖1)。
在劑量-反應研究中，30μg/mL的肺炎支原體菌株91-3(6次實驗中的18個細胞)不顯著改變[Ca2+]i(圖2)。然而，100μg/mL(7次實驗中的16個細胞；84％的細胞有反應)和300μg/mL(10次實驗中的47個細胞；89％的細胞響應)分別使[Ca2+]i增加至110±9nM和250±19nM(圖2)。
由于肺炎支原體菌株91-3可能通過其分泌產物增加纖毛細胞中的[Ca2+]i，15,000xg離心15分鐘后收集支原體(300μg/mL)上清液測試其增加[Ca2+]i的能力。這些上清液不增加纖毛細胞中的[Ca2+]i，。
肺炎支原體菌株91-3在無Ca2+培養(yǎng)液中的作用為確定胞外Ca2+的參與，實驗用無Ca2+培養(yǎng)液進行，培養(yǎng)液中添加了10μMCa2+螯合劑EGTA。肺炎支原體菌株91-3(300μg/mL)仍能增加[Ca2+]i(之前117±6nM，之后324±31nM，4次實驗中的10個細胞；84％的細胞有反應)(圖3a)。這些結果表明增加歸于胞內貯存的Ca2+釋放，而不是通過Ca2+流入機制。
TG對肺炎支原體誘導[Ca2+]i增加的作用為確定內質網(ER)是否是Ca2+釋放的來源，纖毛細胞用1μM微粒體Ca2+-ATP酶抑制劑TG處理30分鐘。在以前的研究中，發(fā)現TG能耗盡ER Ca2+貯存(Thastrup等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，872466-2479(1990))，因為它能去除離子霉素誘導的豬纖毛氣管細胞胞內Ca2+的釋放。類似的，TG處理可去除肺炎支原體菌株91-3(300μg/mL)誘導的[Ca2+]i增加，證明此生物體可引起豬氣管上皮細胞的ER Ca2+釋放。
U-73122和U-73343對肺炎支原體誘導[Ca2+]i增加的作用由于肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)可從ER釋放Ca2+，而IP3的生成受磷脂酶C(PLC)的催化，進行了下列實驗。氣管細胞用2μM特異性PLC抑制劑(Bleasdale和Fisher，Neuroprotocols，3125-133(1993))作預處理，然后接種肺炎支原體菌株91-3，去除了纖毛細胞中支原體誘導的[Ca2+]i增加(圖3c)。相反，U-73122的無活性類似物U-73343不能防止對支原體的[Ca2+]i反應(基礎90±12nM，峰值330±25nM，4次實驗中的10個細胞；82％的細胞有反應)(圖3d)。這些發(fā)現支持肺炎支原體誘導的[Ca2+]i增加是通過活化PLC而介導。
PTX對肺炎支原體和Mas 7誘導[Ca2+]i增加的作用進行了下列實驗以評估PTX敏感G蛋白是否能介導肺炎支原體菌株91-3的作用。在不處理對照細胞中，肺炎支原體菌株91-3增加了[Ca2+]i(254±57nM，3次實驗中的9個細胞；81％的細胞有反應；圖4a)。相反，纖毛細胞用100ng PTX/mL預處理3小時去除了肺炎支原體誘導的[Ca2+]i增加(圖4b)。這些結果表明肺炎支原體活化了偶聯PTX敏感性G蛋白(Gi/o)的受體。為證實Gi/o蛋白參與了氣管細胞中的[Ca2+]i增加，研究了Gi/o活化劑Mas 7(Higashijima等，J.Biol.Chem.，26514176-14186(1990))對[Ca2+]i的作用。將10μM Mas 7加入纖毛氣管細胞在100秒內引起[Ca2+]i從103±4nM的基礎水平增加到351±4nM(3次實驗中n＝9個細胞，82％細胞有反應)(圖4c)。用PTX預處理這些細胞去除了Mas 7的作用(圖4d)。這些結果證明活化纖毛細胞中的Gi/o能增加[Ca2+]i。
肺炎支原體通過結合纖毛上皮細胞而定居于豬呼吸道(Mebus和Underdahl，Am.J.Vet.Res.，381249-1254(1977)；Tajima和Yagihashi，Infect.Immun.，371162-1169(1982)；Zhang等，Infect.Immun.，621616-1622(1994))。粘附通過表面蛋白P97介導(Hsu和Minion，Infect.Immun.，664762-4766(1998)；Hsu等，J.Bacteriol.，1791317-1323(1997)；Minion等，Infect.Immun.，683056-3060(2000))。隨即迅速發(fā)生纖毛運動停滯和纖毛損失(Debey和Ross，Infect.Immun.，625312-5318(1994))。如本文所證明，Ca2+流出與纖毛損失相連系。致病性肺炎支原體菌株91-3增加豬纖毛氣管細胞中的[Ca2+]i。相反，肺炎支原體非致病菌株J和絮狀支原體不能做到這點，表明結合纖毛是Ca2+流出誘導的先決條件。肺炎支原體菌株J不能結合豬纖毛(Zhang等，Infect.Immun.，631013-1019(1995))。[Ca2+]i反應是一種快速反應，其增加取決于支原體濃度。在另一項關于肺炎支原體誘導嗜中性粒細胞中[Ca2+]i增加的研究中，107-1010CCU的致病菌株提高了酵母聚糖誘導的[Ca2+]i增加，而非致病菌株不能(Debey等，Vet.Res.Commun.，17249-257(1993))。加入支原體后90分鐘內，致病性肺炎支原體菌株91-3(109CCU)粘附于呼吸上皮細胞的纖毛導致纖毛混亂、聚集和縱裂，而非致病性肺炎支原體菌株不顯示纖毛破壞(Debey等，Am.J.Vet.Res.，531705-1710(1992)；Young等，Vet.Microbiol.，71269-279(1999))。因此，氣管上皮細胞中的[Ca2+]i變化涉及肺炎支原體的致病作用。
對肺炎支原體反應時分離纖毛細胞中的[Ca2+]i增加量級，隨細胞而不同，但通常隨支原體濃度提高而增加。呼吸道上皮細胞中Ca2+反應的不均一性類似于報道的神經膠質細胞(VandenPol等，J.Neurosci.，122648-2664(1992))、膽管細胞(Nathanson等，Am.J.Physiol.，271G86-G96(1996))、巨核細胞(Tertyshnikova和Fein，Cell Calcium.，21331-344(1997))和軟骨細胞(D’Andrea和Vittur，J.Bone Miner.Res.，11946-954(1996))中的胞外ATP作用。在兔呼吸上皮細胞中，Ca2+反應的不均一性是由于各個細胞對胞外ATP的敏感性不同(Evens和Sanderson，Am.J.Physiol.，277L30-L41(1999)和Korngreen等，J.Physiol.(Lond.)508703-720(1998))。
已報導在其它細菌中[Ca2+]i的增加是由于微生物或其毒素所致。完整的傷寒桿菌腸上皮中的[Ca2+]i，增加介導了這些細胞的IL-8分泌增加(Gewirtz等，J.Clin.Invest.，10579-92(2000)和Pace等，Cell.，72505-514(1993))。傷寒桿菌如何誘導[Ca2+]i增加仍不清楚。大腸桿菌腸毒素可通過從HEp-2細胞釋放ER Ca2+來提高[Ca2+]i(Baldwin等，Infect.Immun.，591599-1604(1991))。此種釋放歸因于ryanodine受體Ca2+釋放通道的活化，因為ryanodine受體拮抗劑硝苯呋海因可阻斷此種作用(Danko等，Biochim.Biophys.Acta.，81618-24(1985)及Heine和Wicher，Neuroreport.，93309-3314(1998))。然而，能產生完整verocytotoxin的大腸桿菌可通過IP3途徑從HEp-2細胞釋放Ca2+(Ismaili等，Infect.Immun.，633316-3326(1995))。綠綠假單胞菌分泌的氧化性毒力因子綠膿素可增加人呼吸道上皮細胞中的IP3形成和[Ca2+]i，但能減少G蛋白偶聯受體拮抗劑誘導的IP3和[Ca2+]i增加(Denning等，Am.J.Physiol.，274L893-L900(1998))。綠膿素誘導的氧化可引起IP3形成增加(Denning等，Am.J.Physiol.，274L893-L900(1998))。巴斯德菌multocida毒素(PMT)通過活化Gq-偶聯PLC-β1同工酶能增加動物不同的完整細胞中的[Ca2+]i(Wilson等，J.Biol.Chem.，2721268-1275(1997))。此PMT作用主要歸于它直接活化Gq-PLC途徑，因為將PMT繞過漿膜受體顯微注射到非洲爪蟾卵母細胞中仍能活化Gq-PLC，(Wilson等，J.Biol.Chem.，2721268-1275(1997))。
一些細菌胞外結構能增加宿主細胞的[Ca2+]i。例如，致病奈瑟球菌(Neisseria)的IV型菌毛能粘附于宮頸癌衍生的上皮樣人細胞系ME180，通過菌毛受體提高[Ca2+]i(Kallstrom等，J.Biol.Chem.，27321777-217782(1998))。[Ca2+]i的增高是建立細菌和宿主細胞間穩(wěn)定接觸起初步驟所必需的(Kallstrom等，J.Biol.Chem.，27321777-217782(1998))。然而，不清楚奈瑟球菌的菌毛如何引起[Ca2+]i增加。
致病性肺炎支原體菌株91-3在無Ca2+培養(yǎng)基中能增加[Ca2+]i，表明[Ca2+]i增加歸因于胞內貯存的Ca2+釋放。氣管細胞用TG預處理以耗盡ER Ca2+貯存，從而消除了支原體的作用，證實此細胞器參與Ca2+釋放。氣管細胞用特異性PLC抑制劑U-73122預處理也防止了支原體誘導的[Ca2+]i增加，表明支原體誘導的ER Ca2+釋放通過PLC途徑。
本文提供的結果說明呼吸上皮中的肺炎支原體受體偶聯于Gi/o?；罨疨LC也與觀察到的A1腺苷受體-介導的現象一致(Tomura等，J.Biol.Chem.，27223130-23137(1997))。Gi/o蛋白通常負責腺苷酰環(huán)化酶的抑制、調節(jié)K+和Ca2+通道、活化cGMP磷酸二酯酶。在Gi/o蛋白中，G12和Gi3能調節(jié)2種信號傳遞途徑；PLC活化由Gβγ二聚體介導，而腺苷酰環(huán)化酶抑制由αi介導(Tomura等，J.Biol.Chem.，27223130-23137(1997))。
總之，本文提供的結果表明致病性肺炎支原體受體偶聯于Gi/o。一旦發(fā)生這些受體的結合，此G蛋白激活PLC途徑通過提高ER的Ca2+釋放來增加[Ca2+]i(圖5)。另外，粘附素實驗證明肺炎支原體的粘附素包括P97不能提高[Ca2+]i。同樣，豬纖毛氣管細胞用肺炎支原體菌株91-3接種在接種3分鐘內增加了纖毛搏動頻率，與這些細胞中的[Ca2+]i增加相一致。這些結果與所見到的綿羊呼吸道上皮細胞中Ca2+對纖毛搏動頻率作用相一致(Salathe和Bookman，J.Physiol.(Lond.)，520851-865(1999))，從而支持[Ca2+]i的變化涉及到支原體的致病作用。
實施例2-可誘導豬纖毛氣管細胞中[Ca2+]i增加的Mhyo多肽的特征分析和純化支原體缺乏細胞壁且只有一種類型的膜即質膜(Razin S.(1993)“在膜研究中作為模型的支原體膜”(Mycoplasma membrances as models in membrancesresearch)(第2章)，《亞細胞生化》(Subcellular Biochemistry).第20卷支原體細胞膜，Rottem S，Kahane I.主編.Plenum Press，New York.1-28頁)。Mhyo膜可通過滲透裂解該生物體來制備并測試以確定纖毛氣管細胞中的[Ca2+]i是否增加。Mhyo膜可提高纖毛氣管細胞中的[Ca2+]i(圖6A)。用蛋白水解酶蛋白酶K或木瓜蛋白酶預處理此膜8小時可消除此膜的作用(圖6B)。這些結果證明有一種膜多肽引起此作用。令人感興趣的是胰蛋白酶預處理30分鐘不僅不能減少[Ca2+]i增加，甚至還加強膜的作用(圖6C)。胰蛋白酶預處理30分鐘仍不能降低此膜對[Ca2+]i的作用。胰蛋白酶消化的膜能產生含更多該受體抗原表位的多肽片段。將支原體的胰蛋白酶消化片段進行超離心(100,000xg，60分鐘)。所得含有可溶性多肽的上清液，也能增加纖毛上皮中的[Ca2+]i。此溶解的膜多肽提高[Ca2+]i的活性至少比未消化膜強10倍(圖6D)。
采用蛋白質印跡技術比較致病性Mhyo(91-3)和非致病性Mhyo(菌株J)的外膜多肽。致病性Mhyo的樣品顯示有5條多肽條帶，在非致病Mhyo的樣品中未顯示(圖7)。5條多肽條帶分別對應于分子量30、60、65、90和120kDa。
采用蛋白質印跡技術比較胰蛋白酶消化后的致病性Mhyo(91-3)和非致病性Mhyo(菌株J)的外膜多肽。致病性Mhyo的樣品顯示有2條多肽條帶在非致病性Mhyo的樣品中未顯示(圖8)。此2條多肽條帶分別對應于分子量35和50kDa。
用凝膠電泳(21cm×50cm)可收集量大于約10μg的這5種多肽。一旦收集到，用該多肽制品進行[Ca2+]i試驗以確定哪種多肽能增加纖毛氣管細胞中的[Ca2+]i。另外，用2維電泳進一步純化各多肽。用質譜在進行N-末端蛋白測序前確認各多肽純度。一旦確定了N-末端氨基酸序列，搜索序列數據庫以鑒定全長Mhyo多肽的氨基酸序列。
溶解的Mhyo多肽通過HPLC用陰離子交換柱，采用Tris緩沖液(pH8.5；圖9)配的0-0.5M NaCl線性梯度液純化。組分#4是早期組分，在纖毛氣管細胞中顯示具有[Ca2+]i提高活性(圖10)。蛋白質印跡分析顯示組分#4含有抗Mhyo恢復期血清識別的65kDa條帶(圖11)。此65kDa多肽條帶也見于Mhyo全細胞制品中。
由于組分#4對應的峰在NaCl梯度應用之前或稍后洗脫，進一步分析了后面的部分。此分析顯示組分#8也能增加纖毛氣管細胞中的[Ca2+]i(圖12和13)。組分#8在0.4M NaCl梯度時洗脫。這些結果表明組分#8含有純化的外膜Mhyo多肽，在纖毛氣管細胞中表現具有[Ca2+]i提高活性。
使用離心過濾器，測定了能增加纖毛氣管上皮中[Ca2+]i的胰蛋白酶消人多肽片段的大小。用30kDa孔徑的濾器的濾過物不能增加[Ca2+]i，而用100kDa孔經濾器的濾過物能增加纖毛氣管上皮中的[Ca2+]i。這些結果表明引起纖毛氣管上皮中[Ca2+]i提高的胰蛋白酶消化多肽片段大小可能在約30和約100kDa之間。
根據最近的報導，0.1U/mL的胰蛋白酶能增加豚鼠氣管上皮中的[Ca2+]I(Oshiro等，Life Sci.，71547-558(2002))。由于本文所述[Ca2+]i實驗中估計的胰蛋白酶濃度約為1U/mL，我們測試了胰蛋白酶是否在觀察到的胰蛋白酶消人片段誘導[Ca2+]i增加中發(fā)揮作用。發(fā)現單用≥1U/mL的胰蛋白酶能增加豬纖毛上皮中的[Ca2+]i。然而，用大豆胰蛋白酶抑制劑(10U/mL)處理抑制了胰蛋白酶(10U/mL)誘導的[Ca2+]i增加，但不能阻斷觀察到的胰蛋白酶消化的Mhyo多肽片段誘導[Ca2+]i增加(圖14)。這些結果證明胰蛋白酶Mhyo制品對[Ca2+]i的刺激作用歸因于Mhyo多肽，而不是胰蛋白酶。
實施例3-獲得能誘導豬纖毛氣管細胞中[Ca2+]i增加的Mhyo多肽的氨基酸序列將有毒Mhyo菌株91-3在添加20％無支原體豬血清的Friis培養(yǎng)基中培養(yǎng)并如上所述離心收集(Zhang等，Infect.Immun.，621616-1622(1994))。生物體進行滲透裂解和離心(35,000xg，60分鐘)獲得上述膜制品(Pollack JD.(1998)“酶分析”(Enzyme analysis)(第10章)，《分子生物學方法》.第104卷支原體操作，Miles R & Nicholas A主編.Humana Press，Iotowa.NJ.79-93頁)。將此膜制品懸浮于PBS并用胰蛋白酶以17∶1比例(w/w)37℃處理30分鐘，接著超離心(10,000xg，60分鐘)。所得上清液含有活性胰蛋白酶消人片段，通過HPLC純化，采用陰離子交換柱(Waters，DEA 5TW型)和Tris緩沖液(pH8.5)配的0-0.5M NaCl線性梯度液。以280nm吸光率監(jiān)測洗脫，收集組分4和8并進一步通過C18反相HPLC純化，采用水中0.08％三氟乙酸水溶液配的0-60％乙腈線性梯度液?；蛘?，用凝膠過濾、疏水相互作用或大小排阻層析柱技術進一步純化此多肽。用Sep-pak濃縮純化多肽，用乙腈-甲醇作為溶劑系統(tǒng)來洗脫。在氮氣流下去除溶劑。此外，用SDS-PAGE確認該多肽的分子量。純化后，測定收集自明顯峰洗脫物的增加纖毛氣管細胞中[Ca2+]i的能力。所得多肽制品的純度通過質譜(Voyager，DE PRO型)測定。
C18HPLC純化和質譜確定的該多肽用Applied Biosystems蛋白測序儀(494型)進行N-末端氨基酸測序?；蛘?，內部序列信息可獲自用溴化氰切割和酶如內切蛋白酶Lys-c切割產生的片段。純化切割片段并進行N-末端氨基酸測序。一旦確定N-末端氨基酸序列，搜索序列數據庫以鑒定全長Mhyo多肽的氨基酸序列。
用下列方法測定纖毛氣管細胞中的[Ca2+]i增加。氣管細胞獲自無Mhyo的豬，如Yamaya等(如.Am.J.Physiol.，262L713-L724(1992))所述。簡言之，纖毛氣管上皮細胞用0.15％鏈霉蛋白酶和0.01％DNA酶在無Ca2+和Mg2+的MEM培養(yǎng)基中通過酶消化分離并在4℃孵育24小時。加入胎牛血清終止酶消化。細胞取自氣管并用Dulbecco MEM和Ham F-12(1∶1)培養(yǎng)液離心洗滌。將這些細胞冷凍于液氮中。當要使用時，37℃迅速解凍細胞使其粘附于特制的30mm培養(yǎng)皿5mm孔中的蓋玻片上，該蓋玻片已用Kreb-Ringer重碳酸鹽(KRB)緩沖液配的聚賴氨酸包被。這類培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)體積為200μL。各個細胞的[Ca2+]i測定方法采用上述圖像系統(tǒng)進行(ZhuGe和Hsu，J.Pharmacol.Exp.Ther.，2751077-1083(1995))。
計算具體實驗的[Ca2+]i數據，平均相同處理組中至少5個細胞中[Ca2+]i增加的峰值，與接受安慰劑(KRB)的對照組比較。重復一次Ca2+生物試驗以確認前面的結果。數據用ANOVA分析，平均值比較用Tukey檢驗進行。α水平設置為P≤0.05。
實施例4-能誘導豬纖毛氣管細胞中[Ca2+]i增加的重組Mhyo多肽的表達和特征分析能提高[Ca2+]i的膜Mhyo重組多肽(或其片段)用類似別處所述的方法獲得(Hsu和Minion，Infect.Immun.，664762-4766(1998))。支原體采用作為色氨酸編碼密碼子的UGA，它通常是終止密碼子。因此，采用抑制子系統(tǒng)在大腸桿菌中表達大部分支原體的基因序列。另外，用定點誘變修飾該UGA密碼子。
將編碼Mhyo多肽(或其片段)的核酸克隆到聚組氨酸融合表達載體如pTrcHis中以促進重組產物的純化。重組大腸桿菌用IPTG誘導，重組Mhyo多肽的產生通過免疫印跡用抗聚組氨酸抗體監(jiān)測。用B-PER試劑(Pierce)滲透誘導的大腸桿菌，離心去除細胞碎片。重組蛋白通過金屬螯合層析用Talon(Clontech)或ProBond(Invitrogen)樹脂純化。測定該多肽的生物活性以證實它增加纖毛氣管細胞中[Ca2+]i的能力。對于大批量生產，采用Bio-Rad的生物層析系統(tǒng)。
測試重組Mhyo多肽增加纖毛氣管細胞中[Ca2+]i和誘導氣管上皮纖毛損壞的能力。將分離自非致病性Mhyo(菌株J)的膜制品用作這些實驗的陰性對照。插入物中的氣管上皮細胞用下列7種處理之一處理(1)陰性對照(自非致病性Mhyo(菌株J)的膜制品，100μg/mL)，(2)陽性對照(如Mhyo菌株91-3的膜制品，100μg/mL)，(3)可溶性胰蛋白酶消化的Mhyo多肽片段(10μg/mL)，(4)重組Mhyo多肽(0.1μg/mL)，(5)重組Mhyo多肽(1μg/mL)，(6)重組Mhyo多肽(10μg/mL)和(7)重組Mhyo多肽(100μg/mL)。各條件進行3次，整個實驗重復至少3遍。如上所述進行[Ca2+]i測定。
用下列技術評估粘附、纖毛破壞和纖毛損失。將用無菌技術制備的酶消化上皮細胞以4-5×105個細胞/cm2的濃度置于Millicell-PCF插入物上(0.45μm孔大小，0.6cm2面積，Millipore，Bedford，MA)，如Young等，Vet.Microbiol.，71269-279(2000)所述那樣。該插入物包被有人胎盤膠原并置于24孔培養(yǎng)板中。細胞生長于空氣-液體界面并從下面無血清的DMEM/F-12(1∶1)中獲得營養(yǎng)，DMEM/F-12含2％ultroser G血清取代物(USG培養(yǎng)基)，添加青霉素和鏈霉素。
采用培養(yǎng)18-22天后的纖毛氣管上皮細胞培養(yǎng)物。棄去培養(yǎng)液用含未處理Mhyo膜蛋白或重組Mhyo多肽的新鮮DMEM/F-12培養(yǎng)液替換，37℃、7.2％CO2培養(yǎng)90分鐘(用于測定粘附和纖毛損壞)或2天(用于測定纖毛損失)。培養(yǎng)后，插入物用PBS洗3次以去除未附著的支原體。用胰蛋白酶-EDTA處理插入物解離細胞并用PBS洗滌。用戊二醛和多聚甲醛原位固定這些細胞并如上述進行掃描電鏡檢查(Young等，Vet.Microbiol.，71269-279(2000))以確定Mhyo與纖毛細胞的粘附以及纖毛破壞和損失程度。照片取自各樣品中的5個隨機視野(16×23μm2)并進行圖像分析獲得纖毛占據區(qū)域(用于確定纖毛損失)和支原體粘附纖毛的數據。
另外，評估粘附和纖毛損失用Zhang等(Infect.Immun.，621616-1622(1994))描述的微量滴定板粘附試驗和/或Debey和Ross(Infect.Immun.，625312-5318(1994))描述的氣管移植模型。
Mhyo多肽的活性位點用缺失突變和/或重疊肽序列作圖。此外用Mhyo多肽制品接種豬以幫助控制豬支原體肺炎，和/或用對應于該活性位點的肽序列類似物阻斷Mhyo膜多肽的細胞受體。
實施例5-產生抗Mhyo多肽抗體，該多肽能誘導豬纖毛氣管細胞中的[Ca2+]i增加5只雌性BALB/c小鼠(8-10周大)用純化Mhyo膜多肽免疫。能使纖毛氣管細胞中[Ca2+]i增加的純化Mhyo多肽經HPLC、SDS-PAGE或其它純化技術獲得。各小鼠給予3次雙周一次的腹膜內注射50μg含弗氏佐劑的多肽。最后一次靜脈內加強是在第3次注射后1個月和與SP2/0骨髓瘤細胞融合前3天給予5μg多肽鹽水溶液。每次融合篩選到約500個單獨克隆，所用的5只小鼠都產生了MAbs。雜交瘤篩選用間接ELISA進行，ELISA板包被純化的Mhyo膜多肽以及對照絮狀支原體和非致病性Mhyo(菌株J)膜多肽。用山羊抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶偶聯物檢測MAbs。
實施例6-能抑制豬纖毛氣管細胞中Mhyo多肽誘導[Ca2+]i增加的抗體鑒定將不同稀釋度的抗體加入支原體膜制品或純化的Mhyo多肽中，然后進行[Ca2+]i測定。也將該抗體加入無抗原的樣品作為非特異性抗體作用的對照。測定[Ca2+]i變化的方法見以上所述。
用下列技術評估抗體抑制Mhyo粘附及Mhyo誘導纖毛破壞和纖毛損失的能力。采用能阻斷Mhyo-和重組Mhyo多肽誘導纖毛細胞中[Ca2+]i增加的多克隆和單克隆抗體。插入物中的氣管上皮細胞用下列處理之一處理(1)對照，(2)Mhyo菌株91-3(109CCU)，(3)抗體制品(A稀釋液)加Mhyo菌株91-3，(5)抗體制品(B稀釋液)加Mhyo菌株91-3，(6)抗體制品(C稀釋液)加Mhyo菌株91-3，(7)抗體制品(D稀釋液)加Mhyo菌株91-3。將該抗體加入無Mhyo的樣品作為非特異性抗體作用的對照。另外，用熱滅活抗體來驗證加熱是否能去除對Mhyo誘導粘附和纖毛損失的特異性抑制作用。各條件進行3次，整個實驗重復至少3遍。
纖毛占據區(qū)域和Mhyo粘附纖毛的數據用ANOVA分析，平均值比較用Tukey檢驗進行。α水平設置為P≤0.05。
其它實施方案可理解盡管本發(fā)明已結合詳細描述進行了闡明，但上面的描述目的是闡明而非限制本發(fā)明范圍，本發(fā)明范圍由所附權利要求限定。其它方面、優(yōu)勢和修改在下列權利要求范圍內。
權利要求
1.一種基本純的多肽，其特征在于，所述多肽能增加豬纖毛氣管細胞的鈣釋放，其中所述多肽的分子量在約30kDa和約150kDa之間。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽是支原體多肽。
3.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽獲自致病性肺炎支原體。
4.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽約80％純。
5.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽約90％純。
6.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的分子量約30kDa。
7.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的分子量約60kDa。
8.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的分子量約65kDa。
9.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的分子量約90kDa。
10.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的分子量約120kDa。
11.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽是胰蛋白酶消化的片段。
12.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的分子量在胰蛋白酶消化后約為35kDa。
13.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的分子量在胰蛋白酶消化后約為50kDa。
14.一種能結合某多肽的基本純的抗體，其特征在于，所述多肽能增加豬纖毛氣管細胞的鈣釋放，其中所述多肽分子量在約30kDa和約150kDa之間。
15.如權利要求14所述的抗體，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體。
16.如權利要求14所述的抗體，其特征在于，所述抗體是小鼠抗體。
17.如權利要求14所述的抗體，其特征在于，所述多肽是胰蛋白酶消化的片段。
18.如權利要求14所述的抗體，其特征在于，所述多肽是支原體多肽。
19.如權利要求14所述的抗體，其特征在于，所述多肽獲自致病性肺炎支原體。
20.如權利要求14所述的抗體，其特征在于，所述抗體約80％純。
21.如權利要求14所述的抗體，其特征在于，所述抗體約90％純。
22.一種誘導哺乳動物中免疫應答反應的方法，其特征在于，所述免疫應答反應是抗支原體多肽的反應，所述方法包括在所述哺乳動物能產生抗所述多肽抗體的條件下，給予所述哺乳動物基本純的支原體多肽，其中所述多肽能增加豬纖毛氣管細胞的鈣釋放，所述多肽分子量在約30kDa和約150kDa之間。
23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物是小鼠、兔或豬。
24.一種使抗體結合某多肽的的方法，其特征在于，所述多肽能增加豬纖毛氣管細胞的鈣釋放，其中所述多肽分子量在約30kDa和約150kDa之間，所述方法包括a)獲得能結合所述多肽的抗體，b)在所述抗體結合所述多肽的條件下，使所述抗體接觸所述多肽。
25.如權利要求24所述的方法，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體。
26.如權利要求24所述的方法，其特征在于，所述抗體是小鼠抗體。
27.如權利要求24所述的方法，其特征在于，所述多肽是支原體多肽。
28.一種鑒定支原體誘導的細胞鈣釋放的抑制劑的方法，其特征在于，所述方法包括a)使細胞接觸支原體多肽和測試化合物，其中所述多肽能增加豬纖毛氣管細胞的鈣釋放，所述多肽分子量在約30kDa和約150kDa之間，b)確定所述測試化合物是否能抑制所述細胞釋放鈣，其中所述測試化合物若能抑制所述細胞的鈣釋放，表明所述測試化合物是所述抑制劑。
29.如權利要求28所述的方法，其特征在于，所述測試化合物是蛋白酶。
30.如權利要求28所述的方法，其特征在于，所述測試化合物是抗體。
31.一種鑒定支原體多肽誘導的細胞鈣釋放的抑制劑的方法，其特征在于，所述多肽能增加豬纖毛氣管細胞的鈣釋放，其中所述多肽分子量在約30kDa和約150kDa之間，所述方法包括a)使細胞接觸已用測試化合物預處理的支原體多肽，b)確定該測試化合物是否能抑制所述細胞釋放鈣，其中所述測試化合物若能抑制所述細胞的鈣釋放，表明所述測試化合物是所述抑制劑。
32.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述測試化合物是蛋白酶。
33.如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述測試化合物是抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供涉及支原體的方法和材料。例如，本發(fā)明提供的支原體多肽能增加細胞(如豬纖毛氣管細胞)的鈣釋放以及提供的抗體能結合這種支原體多肽。另外，本發(fā)明提供鑒定支原體誘導豬纖毛氣管細胞鈣釋放的抑制劑的方法。
文檔編號C07H21/04GK1658906SQ03813128
公開日2005年8月24日 申請日期2003年4月4日 優(yōu)先權日2002年4月5日
發(fā)明者W·H·蘇, T·F·揚, R·F·羅斯, E·M·周 申請人:衣阿華州立大學研究基金會股份有限公司