專利名稱：外淋巴瘺的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及外淋巴瘺的檢測(cè)方法、該檢測(cè)方法中使用的抗體、試劑和試劑盒。
背景技術(shù)：
外淋巴瘺(Perilymph fistula)是存在于內(nèi)耳組織的外淋巴由內(nèi)耳窗(圓窗、卵圓窗其中之一或兩者)或前窗小裂(內(nèi)耳與外耳之間的骨裂隙)向鼓室內(nèi)(中耳)漏出，從而產(chǎn)生聽覺、平衡感障礙的疾病，其發(fā)生原因可能是先天性畸形、梅毒、鐙骨手術(shù)、頭部外傷(包括氣壓傷)、特發(fā)性(原因不明)等。已知例如由擤鼻涕、噴嚏、咳、憋勁、潛水、登山、外傷等日常生活中通常進(jìn)行的行動(dòng)所產(chǎn)生的腦脊液壓、內(nèi)耳壓急劇變化而引起，是在急性感音性耳聾或眩暈·平衡障礙中占一定比例的疾病。
但一直以來，該外淋巴瘺的診斷是按照診斷基準(zhǔn)(淺野等著“耳展”34，4；1991年p.411-425)，通過綜合檢查生理學(xué)診察、癥狀、病史等的方法進(jìn)行的，因此有很多不確定的情況，另外，為確診而選擇進(jìn)行的鼓室開放術(shù)對(duì)患者的侵襲度也成為一個(gè)問題。并且，即使進(jìn)行鼓室開放術(shù)，也無法通過目視確認(rèn)外淋巴的漏出，有很多不能確診的病例。
另一方面，突發(fā)性耳聾是急性感音性耳聾中尚不能明確原因、在急性感音性耳聾中所占比例最高的疾病。但是，有報(bào)告指出對(duì)這種特發(fā)性耳聾患者進(jìn)行試驗(yàn)性鼓室開放術(shù)，結(jié)果11例中有8例被證實(shí)為外淋巴瘺(吉岡邦英著“耳鼻咽喉科展望”Vol.26，Suppl.6；1983年p.517-539)。另外有顯示，已知作為急性感音性耳聾的一種、現(xiàn)代社會(huì)中有上升趨勢(shì)的綜合征—梅尼埃爾氏病中更是包含外淋巴瘺患者。實(shí)際上對(duì)多數(shù)梅尼埃爾氏病患者進(jìn)行分析的結(jié)果顯示，原本診斷為梅尼埃爾氏病的患者中也包含了外淋巴瘺患者，也有報(bào)告對(duì)其進(jìn)行鑒別診斷的必要性進(jìn)行了闡述(D.C.Fitzgerald著“Ann.Otol.Rhinol.Laryngol.”110；2001年p.430-436)。以上表明與上述診斷基準(zhǔn)不符的病例中也包含外淋巴瘺。但是，外淋巴瘺的確診方法尚未建立，目前的現(xiàn)狀是在臨床現(xiàn)場(chǎng)還難以進(jìn)行實(shí)質(zhì)性的鑒別，這些問題尚未解決。外淋巴瘺是急性感音性耳聾中有望通過手術(shù)改善聽覺、平衡感障礙的唯一的疾病，并且及時(shí)的治療左右著治愈率，因此，人們強(qiáng)烈希望開發(fā)出簡(jiǎn)便、可靠、且對(duì)患者的侵襲度低的診斷方法。
目前，雖然已有下述報(bào)告研究可用作外淋巴瘺診斷的標(biāo)記物，提出使用ApoD和ApoJ作為指標(biāo)的報(bào)告(Thalmann等著“Otolaryngology-Head and Neck Surgery”111，3，1；1994年p.273-280)；以GM1(單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂1)為指標(biāo)嘗試診斷外淋巴瘺的報(bào)告(神崎仁等著“厚生勞動(dòng)省特定疾患對(duì)策研究事業(yè)·急性高度感音難聽に関する調(diào)查研究班·平成11年度報(bào)告書”；2000年p.41-43)、提出使用前列腺素D合成酶(Prostagrandin Dsynthase)作為指標(biāo)的報(bào)告(G.Bachmann等著“J.Laryngol.otol.”115；2001年p.132-135)、以運(yùn)鐵蛋白為指標(biāo)嘗試診斷外淋巴瘺的報(bào)告(Rauch S.D.著“Laryngoscope”110(4)；2000年p.545-552)等，但都不是可臨床應(yīng)用的方法。
另一方面，COCH是作為遺傳性無綜合征耳聾DFNA9的原因基因而鑒定出的基因，由該基因編碼的COCH蛋白被命名為Cochlin(N.G.Robertson著“Narure Genet.”20；1998年p.299-303；以及NCBI OMIM主頁(yè)；http//www.ncbi.nlm.nih.goy/)。
本發(fā)明人注意到該Cochlin是人類耳聾中重要的蛋白質(zhì)，對(duì)牛內(nèi)耳組織中的Cochlin進(jìn)行了蛋白質(zhì)組分析，明確了Cochlin具有3個(gè)不同的N末端，存在分別具有63kDa、44kDa和40kDa分子量的3種異構(gòu)體p63、p44和p40。另外，有報(bào)告指出N末端有被稱為L(zhǎng)CCL(Trexler等著“Eur.J.Biochem.”267；2000年p.5751-5757)的模件(modules)，迄今為止發(fā)現(xiàn)的DFNA9有關(guān)的突變?nèi)看嬖谂c該模件內(nèi)，且只包含在異構(gòu)體p63中，在其它異構(gòu)體中不存在(Ikezono等著“Biochem.Biophys.Acta”1535(3)；2001年p.258-265)。但是，上述報(bào)告只是通過牛內(nèi)耳組織的雙向凝膠電泳法(2D-GE)進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析所得，對(duì)于Cochlin的臨床意義等并未進(jìn)行充分的研究。
另外，N.G.Robertson等人制備了抗Cochlin抗體，進(jìn)行內(nèi)耳組織的免疫組織染色等，對(duì)內(nèi)耳組織中Cochlin表達(dá)進(jìn)行了分析(N.G.Robertson著“Hum.Mol.Genet.”10(22)；2001年p.2493-2500)。但是該報(bào)告只是對(duì)蛋白質(zhì)在內(nèi)耳組織中的局部存在等進(jìn)行了分析，并沒認(rèn)識(shí)到Cochlin在外淋巴中的存在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的課題是提供簡(jiǎn)便、可靠、且對(duì)患者的侵襲度低的外淋巴瘺的檢測(cè)方法。本發(fā)明的另一個(gè)要解決的課題是提供本發(fā)明的檢測(cè)方法中使用的抗體、試劑和試劑盒。
本發(fā)明人為解決上述課題進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以存在于被疑為罹患外淋巴瘺患者中耳中的體液為試樣，以該試樣中的Cochlin的存在作為指標(biāo)，可以檢測(cè)外淋巴瘺。本發(fā)明基于這些認(rèn)識(shí)而完成。
即，本發(fā)明提供以下發(fā)明。
(1)外淋巴瘺的檢測(cè)方法，該方法包括檢測(cè)存在于中耳的體液中是否存在Cochlin。
(2)(1)的方法，該方法是檢測(cè)存在于被疑為罹患外淋巴瘺患者的中耳中的體液中是否存在Cochlin，以檢測(cè)的Cochlin的存在作為外淋巴瘺可能性的指標(biāo)。
(3)(1)或(2)的方法，其中檢測(cè)Cochlin是否存在通過檢測(cè)含有Cochlin的N末端片段的蛋白質(zhì)是否存在而進(jìn)行。
(4)(1)-(3)中任一項(xiàng)的方法，其中Cochlin是否存在的檢測(cè)通過免疫學(xué)方法進(jìn)行。
(5)(4)的方法，其中免疫學(xué)方法使用抗Cochlin N末端片段抗體進(jìn)行。
(6)(4)或(5)的方法，其中免疫學(xué)方法使用識(shí)別包含在序列表SEQ ID NO.1的氨基酸編號(hào)36-127所表示的氨基酸序列中的抗原決定基的抗體進(jìn)行。
(7)(4)-(6)中任一項(xiàng)的方法，其中免疫學(xué)方法使用抗CochlinN末端片段抗體進(jìn)行，所述抗Cochlin N末端片段抗體的特征在于識(shí)別包含在序列表SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQID NO.7的氨基酸序列所表示的多肽中的抗原決定基。
(8)抗Cochlin N末端片段抗體，其特征在于識(shí)別包含在序列表SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7的氨基酸序列所表示的多肽中的抗原決定基。
(9)外淋巴瘺檢測(cè)試劑，該試劑含有抗Cochlin抗體。
(10)(9)的外淋巴瘺檢測(cè)試劑，其中所述抗Cochlin抗體是抗Cochlin N末端片段抗體。
(11)(9)或(10)的外淋巴瘺檢測(cè)試劑，其中所述抗Cochlin抗體是識(shí)別包含在序列表SEQ ID NO.1的氨基酸編號(hào)36-127所表示的氨基酸序列中的抗原決定基的抗體。
(12)(9)-(11)中任一項(xiàng)的外淋巴瘺檢測(cè)試劑，其中所述抗Cochlin抗體是抗Cochlin N末端片段抗體，該抗Cochlin N末端片段抗體的特征在于識(shí)別包含在序列表SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7的氨基酸序列所表示的多肽中的抗原決定基。
(13)外淋巴瘺檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有(9)-(12)中任一項(xiàng)的外淋巴瘺檢測(cè)試劑。
附圖簡(jiǎn)述

圖1表示用抗p63/44/40抗體、抗p65/44抗體和抗LCCL抗體3種抗體，通過蛋白質(zhì)印跡法對(duì)人、牛、豚鼠的內(nèi)耳組織提取液和外淋巴進(jìn)行分析的結(jié)果。
圖2表示用抗LCCL抗體，通過蛋白質(zhì)印跡法對(duì)來自人的各種試樣進(jìn)行分析的結(jié)果。圖中，1-12孔號(hào)與表1的各孔號(hào)對(duì)應(yīng)，照片下標(biāo)示了該孔中的試樣。各試樣名下的“+”表示檢出16kDa的蛋白質(zhì)，“-”表示未檢出。
圖3表示用抗LCCL抗體，通過蛋白質(zhì)印跡法對(duì)來自人的各種試樣進(jìn)行分析的結(jié)果。圖中，13-24孔號(hào)與表1的各孔號(hào)對(duì)應(yīng)，照片下標(biāo)示了該孔中的試樣。各試樣名下的“+”表示檢出16kDa的蛋白質(zhì)，“-”表示未檢出。
圖4表示用抗LCCL抗體，通過蛋白質(zhì)印跡法對(duì)來自人的各種試樣進(jìn)行分析的結(jié)果。圖中，25-36孔號(hào)與表1的各孔號(hào)對(duì)應(yīng)，照片下標(biāo)示了該孔中的試樣。各試樣名下的“+”表示檢出16kDa的蛋白質(zhì)，“-”表示未檢出。上面的照片表示通過化學(xué)發(fā)光發(fā)檢測(cè)時(shí)，使膜感光1小時(shí)的結(jié)果，下面的照片表示使同樣的硝基纖維素膜感光10秒的結(jié)果。
圖5表示用抗LCCL抗體，通過蛋白質(zhì)印跡法對(duì)來自人的各種試樣進(jìn)行分析的結(jié)果。圖中，37-48孔號(hào)與表1的各孔號(hào)對(duì)應(yīng)，照片下標(biāo)示了該孔中的試樣。各試樣名下的“+”表示檢出16 kDa的蛋白質(zhì)，“-”表示未檢出?！啊馈北硎緹o法判斷。
圖6表示用抗LCCL抗體，通過蛋白質(zhì)印跡法對(duì)來自人的各種試樣進(jìn)行分析的結(jié)果。圖中，49-60孔號(hào)與表1的各孔號(hào)對(duì)應(yīng)，照片下標(biāo)示了該孔中的試樣。各試樣名下的“+”表示檢出16kDa的蛋白質(zhì)，“-”表示未檢出。
圖7表示用抗LCCL抗體，通過蛋白質(zhì)印跡法對(duì)來自人的各種試樣進(jìn)行分析的結(jié)果。圖中，61-72孔號(hào)與表1的各孔號(hào)對(duì)應(yīng)，照片下標(biāo)示了該孔中的試樣。各試樣名下的“+”表示檢出16kDa的蛋白質(zhì)，“-”表示未檢出。
圖8表示使用抗LCCL抗體、抗LCCL1抗體、抗LCCL2抗體、抗LCCL3抗體四種抗體通過蛋白質(zhì)印跡法對(duì)牛外淋巴及內(nèi)耳組織提取液進(jìn)行分析的結(jié)果。
圖9表示使用抗LCCL3抗體通過蛋白質(zhì)印跡法對(duì)來自人的各種試樣進(jìn)行分析的結(jié)果。下圖是將上圖16kDa附近的分辨率提高得到的圖。圖中，73-83孔號(hào)與表2的各孔號(hào)對(duì)應(yīng)，照片下標(biāo)示了該孔中的試樣。各試樣名下的“+”表示檢出16kDa的蛋白質(zhì)，“-”表示未檢出。
圖10表示用于制備本發(fā)明的抗體的抗原多肽在SEQ ID NO.1的氨基酸序列上的位置關(guān)系。
具體實(shí)施例方式
以下，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行更為詳細(xì)的說明。
本說明書中，如無特別說明，蛋白質(zhì)的純化和分析、以及抗體的制備等方法可按照新生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座(日本生化學(xué)會(huì)編東京化學(xué)同人)、Antibodies-A Laboratory Manual(E.Harlow，等.，Cold SpringHarbor Laboratory(1988))等常規(guī)實(shí)驗(yàn)書記載的方法或參考它們進(jìn)行。
1.外淋巴瘺的檢測(cè)方法本發(fā)明中，外淋巴瘺(Perilymph fistula)是存在于內(nèi)耳組織的外淋巴因某些原因由內(nèi)耳窗(圓窗、卵圓窗其中之一或兩者)或前窗小裂(內(nèi)耳與外耳之間的骨裂隙)向鼓室內(nèi)(中耳)漏出，從而產(chǎn)生聽覺、平衡感障礙的疾病。該疾病可通過確認(rèn)外淋巴向中耳漏出來檢測(cè)。本發(fā)明的外淋巴瘺的檢測(cè)方法的特征是在存在于被疑為罹患該疾病的患者的中耳中的體液中，檢測(cè)是否存在只存在于外淋巴中的Cochlin，以作為該患者罹患外淋巴瘺的可能性的指標(biāo)。根據(jù)本方法，無需依靠外淋巴瘺發(fā)病原因和機(jī)理即可進(jìn)行檢測(cè)。
Cochlin是由作為遺傳性無綜合征耳聾DFNA9的原因基因而鑒定出的基因COCH所編碼的蛋白質(zhì)(N.G.Robertson，Nature Genet.，20，299-303(1998))。該蛋白質(zhì)在人、牛、豚鼠、大鼠等動(dòng)物種類中具有3個(gè)不同的N末端，以具有63kDa、44kDa和40kDa分子量的3種異構(gòu)體p63、p44和p40形式存在(Ikezono等.，Biochem.Biophys.Acta，1535，3，258-265(2001))。本說明書中，序列表SEQ ID NO.1所示的Cochlin的氨基酸序列是Narure Genet.，20，299-303(1998)中記載的人Cochlin的氨基酸序列，本說明書中的氨基酸編號(hào)采用該序列的氨基酸編號(hào)。例如人中，具有最大的63kDa分子量的異構(gòu)體p63是包含該氨基酸序列中氨基酸編號(hào)25-550所表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。異構(gòu)體p44是包含該氨基酸序列中氨基酸編號(hào)133-550所表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，異構(gòu)體p40是包含氨基酸編號(hào)152-550所表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。另外，該氨基酸序列中，氨基酸編號(hào)1-24所表示的部分是信號(hào)序列。
本發(fā)明中，對(duì)于作為外淋巴瘺可能性的指標(biāo)使用的Cochlin，優(yōu)選采用含有包括異構(gòu)體p63 N末端的氨基酸序列的片段(以下將其稱為“N末端片段”)的蛋白質(zhì)。該片段只要包含Cochlin的異構(gòu)體p63 N末端的氨基酸序列即可，可以是具有任意大小的蛋白質(zhì)，例如是SEQ ID NO.1中氨基酸編號(hào)36-127所表示的氨基酸序列，進(jìn)一步優(yōu)選由抗Cochlin N末端片段抗體所識(shí)別的、具有約16kDa分子量的N末端片段，其中所述抗Cochlin N末端片端抗體的特征是識(shí)別包含在后述的SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ IDNO.7的氨基酸序列所表示的多肽中的抗原決定基；特別優(yōu)選由抗體等識(shí)別的具有約16kDa分子量的N末端片段，其中所述抗體等的特征是識(shí)別包含在SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.7的氨基酸序列所表示的多肽中的抗原決定基。另外，除該片段之外，只要是在可存在于人的中耳中的其它體液中基本上不存在的、而只存在于外淋巴中、且具有序列表SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或其部分序列的蛋白質(zhì)，則可以任意使用。具體地說，例如可以是異構(gòu)體p63，也可以是異構(gòu)體p44或p40，還可以是含有它們的片段的蛋白質(zhì)。本說明書中，將上述蛋白質(zhì)簡(jiǎn)稱為“Cochlin”。上述Cochlin的三個(gè)異構(gòu)體和N末端片段的分子量(kDa)均是采用雙向電泳法，利用大小標(biāo)記(size marker)進(jìn)行校正，由此計(jì)算得到的值。
供給本發(fā)明的檢測(cè)方法的試樣采用存在于被疑為罹患外淋巴瘺的患者中耳中的體液?？纱嬖谟谌酥卸鷥?nèi)的體液例如有外淋巴、腦脊液(erebro-Spinal Fluid；以下將其稱為“CSF”)、血液、唾液、由中耳粘膜產(chǎn)生的中耳粘液等。例如已知CSF是由于手術(shù)等經(jīng)由內(nèi)耳道的第8腦神經(jīng)通路或蝸小管流入內(nèi)耳的腦脊液又流入中耳，或由于外傷、骨折、內(nèi)耳畸形等而流入的。血液可因外傷導(dǎo)致的出血、中耳粘膜出血等而存在于中耳中。已知唾液是存在于上咽的唾液由耳管逆流流入中耳。另外滲出性中耳炎患者存在中耳滲出液、慢性中耳炎患者存在耳漏(膿)等。這些體液通過目視無法判別，但采集它們進(jìn)行分析，通過分析該試樣中Cochlin的存在，可以判別作為試樣采集的體液是否為外淋巴，可以作為外淋巴瘺的可能性的指標(biāo)。
采集存在于中耳內(nèi)的體液的方法是盡量不混入血液、藥劑等，也不混入其它蛋白質(zhì)的可采集的方法，只要是對(duì)患者的侵襲度低的方法，可以采用任意方法。例如可以將鼓膜切開微小口子，插入針筒，直接吸取該體液進(jìn)行采集，也可以插入棉棒等，拭取存在的體液進(jìn)行采集。所采集的體液為極微量時(shí)，優(yōu)選采用用針筒等適量注入生理鹽水等適當(dāng)?shù)娜芤?，然后用針筒等回收該溶液的方法。本發(fā)明中，通過這樣的方法回收的溶液稱為“中耳洗滌液”。這里所使用的溶液要選擇在組成、pH、溫度等方面為生理學(xué)可接受、對(duì)患者的負(fù)擔(dān)少的溶液。另外，中耳經(jīng)由咽鼓管與上咽、中咽相通，因此可以采集通過咽鼓管到達(dá)上咽、中咽的來自中耳的體液。具體來說，例如可以由口腔或鼻腔插入棉棒等，通過拭取存在于上咽或中咽的體液來進(jìn)行采集。
上述采集的體液優(yōu)選在采集后立即用于分析，也可以先在4至-80℃、優(yōu)選-20至-70℃等低溫條件下保存。保存時(shí)，可以根據(jù)需要添加抑制蛋白質(zhì)變性等的保存劑、防止腐敗的防腐劑等。另外，這些試樣還可以根據(jù)需要進(jìn)行濃縮、純化等前處理，然后用于分析。這些具體的方法可以采用其本身公知的常用的蛋白質(zhì)濃縮、純化等方法。
在通過如上所述的方法采集的、存在于被疑為罹患外淋巴瘺的患者中耳的體液中，作為檢測(cè)Cochlin存在的方法，只要是公知的蛋白質(zhì)檢測(cè)、分析方法即可，可以使用任意的方法。具體來說，檢測(cè)Cochlin是否存在，可以通過免疫學(xué)方法進(jìn)行，也可以通過非免疫學(xué)方法(液相色譜、雙向電泳、質(zhì)量分析以及它們的組合等)進(jìn)行。其中本發(fā)明中優(yōu)選使用免疫學(xué)方法，該方法使用識(shí)別上述Cochlin或其部分多肽的抗體(以下將其稱為“抗Cochlin抗體”)。作為蛋白質(zhì)免疫學(xué)檢測(cè)方法，例如蛋白質(zhì)印跡法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA法)、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法、熒光抗體法、放射免疫測(cè)定法、膠乳凝集法、免疫比濁法、免疫層析法等其本身為公知的常用方法，可以采用任意的方法，其中優(yōu)選采用蛋白質(zhì)印跡法、ELISA法等。
通過酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA法)、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法、熒光抗體法、放射免疫測(cè)定法等使用標(biāo)記抗體的免疫測(cè)定法實(shí)施本發(fā)明的檢測(cè)方法的情況下，可通過夾心法或競(jìng)爭(zhēng)法進(jìn)行。采用夾心法時(shí)，只要固相抗體和標(biāo)記抗體中的至少一種為抗Cochlin抗體即可。
夾心法中使用的固相載體只要是可用于擔(dān)載抗體的不溶性載體即可，例如可以例舉(1)含有聚苯乙烯樹脂、聚碳酸酯樹脂、硅樹脂或尼綸樹脂等的塑料，或含有玻璃等所代表的水不溶性物質(zhì)的板，試管或管等具有容積的物質(zhì)，珠，球，濾器或膜等；以及(2)纖維素系載體、瓊脂糖系載體、聚丙烯酰胺系載體、葡聚糖系載體、聚苯乙烯系載體、聚乙烯醇系載體、聚氨基酸系載體或多孔性二氧化硅系載體等親和層析中所使用的不溶性載體。
測(cè)定的操作方法可按照公知的方法(例如日本臨床病理學(xué)會(huì)編“臨床病理臨時(shí)增刊特集第53號(hào)用于臨床檢查的免疫測(cè)定—技術(shù)和應(yīng)用—”，臨床病理刊行會(huì)，1983年；石川榮治等編“酶免疫測(cè)定法”，第3版，醫(yī)學(xué)書院，1987年；北川常廣等編“蛋白質(zhì)核酸酵素分冊(cè)No.31酶免疫測(cè)定法”，共立出版，1987年)進(jìn)行。
例如，可以使固相抗體與試樣反應(yīng)，同時(shí)使標(biāo)記抗體反應(yīng)、或洗滌后使標(biāo)記抗體反應(yīng)，形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體的復(fù)合物。洗滌分離未結(jié)合的標(biāo)記抗體，由結(jié)合標(biāo)記抗體的量測(cè)定試樣中的抗原量。具體地說，采用酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA法)時(shí)，在最佳條件下使底物與標(biāo)記酶反應(yīng)，通過光學(xué)方法等測(cè)定該反應(yīng)產(chǎn)物的量。采用熒光免疫測(cè)定法時(shí)，測(cè)定熒光標(biāo)記物產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度；采用放射免疫測(cè)定法時(shí)，測(cè)定發(fā)射性標(biāo)記物產(chǎn)生的放射線量。采用化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法時(shí)，測(cè)定發(fā)光反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的發(fā)光量。
像膠乳凝集反應(yīng)或免疫比濁法等情形那樣，通過由光學(xué)方法測(cè)定其透射光或散射光或目視測(cè)定等測(cè)定方法來測(cè)定免疫復(fù)合物的凝集物的生成，由此實(shí)施本發(fā)明的檢測(cè)方法時(shí)，溶劑可以使用磷酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、Tris緩沖液或good’s buffer等，還可以含有聚乙二醇等反應(yīng)促進(jìn)劑或非特異性反應(yīng)抑制劑。
使抗體擔(dān)載在固相載體上使用時(shí)，固相載體可以使用含有聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、(甲基)丙烯酸酯類聚合物、膠乳、明膠、脂質(zhì)體、微膠囊、紅細(xì)胞、二氧化硅、氧化鋁、碳黑、金屬化合物、金屬、陶瓷或磁性體等材質(zhì)的顆粒。
該擔(dān)載的方法可以使用物理吸附法、化學(xué)結(jié)合法或這些方法結(jié)合使用等公知的方法。測(cè)定的操作方法可按照公知的方法進(jìn)行，例如通過光學(xué)方法測(cè)定時(shí)，使試樣與抗體、或使試樣擔(dān)載于固相載體上的抗體反應(yīng)，通過終點(diǎn)法或比例法測(cè)定透射光或散射光。
另外，目視測(cè)定時(shí)，在孔板或微量滴定板等容器中，使試樣與擔(dān)載于固相載體上的抗體反應(yīng)，目視判定凝集的狀態(tài)。也可以使用酶標(biāo)儀等儀器代替目視測(cè)定來進(jìn)行測(cè)定。
采用上述方法，以存在于患者中耳內(nèi)的體液為試樣進(jìn)行分析，當(dāng)在該試樣中檢測(cè)出Cochlin的存在時(shí)，則可判定該患者有罹患了外淋巴瘺的可能性。另外，通過其本身為公知的常用的蛋白質(zhì)定量法進(jìn)行定量，可以求出該體液中的Cochlin的存在量。
2.用于檢測(cè)Cochlin的抗體以及使用該抗體的試劑在上述的免疫學(xué)方法中使用的抗體只要是識(shí)別Cochlin的抗體均可使用。即，本發(fā)明提供含有抗Cochlin抗體的外淋巴瘺檢測(cè)試劑。
抗Cochlin抗體例如可以以具有序列表SEQ ID NO.1記載的氨基酸序列或其部分序列的多肽(以下也稱為“抗原多肽”)作為抗原來制備。具體來說，例如優(yōu)選使用識(shí)別包含在抗原多肽中的抗原決定基(以下也稱為“表位”)的抗體(以下也將其稱為“抗CochlinN末端片段抗體”)，其中所述抗原多肽在含有上述N末端片段的蛋白質(zhì)中具有特異性的氨基酸序列。在抗Cochlin N末端片段抗體中，特別優(yōu)選識(shí)別抗原多肽中含有的抗原決定基的抗體，其中該抗原多肽對(duì)含有具有約16kDa分子量的N末端片段的蛋白質(zhì)具有特異性。更具體地說，這樣的抗體例如是識(shí)別包含在序列表SEQ ID NO.1中氨基酸編號(hào)36-127所表示的氨基酸序列中的抗原決定基的抗體。
本發(fā)明的如上所述的抗體優(yōu)選不與存在于人中耳中除外淋巴以外的體液中所包含的其他蛋白質(zhì)等反應(yīng)，但如果與Cochlin的反應(yīng)性足夠高、可以將外淋巴與其它體液區(qū)別開，則也可以可使用。具體來說，例如使用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，只要由該抗體檢測(cè)出的譜帶位置等能夠?qū)碜訡ochlin的譜帶和來自其它蛋白質(zhì)的譜帶明確區(qū)別開來即可。
抗原多肽可以根據(jù)其本身為公知的方法選擇抗原性高、適合作為抗原決定基的序列使用。例如可以使用“Epitope Adviser”(富士通九州System engineering社制造)等市售的表位分析軟件對(duì)Cochlin的氨基酸序列進(jìn)行分析，綜合預(yù)測(cè)立體結(jié)構(gòu)上暴露部位、疏水性和親水性、結(jié)構(gòu)的柔軟性、極性等，選擇出推定具有容易變?yōu)楸砦坏男螤畹男蛄?。另外，例如可在制備在多種動(dòng)物種類中反應(yīng)的抗體時(shí)，用適當(dāng)?shù)男蛄蟹治鲕浖缺葘?duì)作為目標(biāo)的多個(gè)動(dòng)物種類所具有的Cochlin的氨基酸序列，從各動(dòng)物種類中共通的氨基酸序列中選擇容易成為表位的部分序列。另外，在制備與某一特定動(dòng)物種類所具有的Cochlin特異性結(jié)合的抗體時(shí)，可以選擇與其它動(dòng)物種類所具有的Cochlin的氨基酸序列的同源性低的部分。
關(guān)于抗原多肽的長(zhǎng)度，只要是根據(jù)后述的方法使用該多肽進(jìn)行免疫時(shí)，可在被免疫的動(dòng)物中具有作為抗原可被識(shí)別的長(zhǎng)度即可，可以是任意長(zhǎng)度。具體來說，例如可以使用5-30個(gè)殘基的氨基酸，優(yōu)選10-25個(gè)殘基的長(zhǎng)度。這樣的抗原多肽可以是按照公知的方法化學(xué)合成的合成多肽，也可以是由天然物提取、純化的多肽。
作為上述所選擇的抗原多肽，只要含有存在于外淋巴的Cochlin所具有的氨基酸序列，則可從具有序列表SEQ ID NO.1的氨基酸序列或其部分序列的多肽中任意選擇使用。例如作為用于制備抗Cochlin N末端片段抗體的抗原多肽，只要具有包含至少一個(gè)上述N末端片段中所具有的抗原決定基的氨基酸序列，則可以任意使用。具體來說，例如優(yōu)選使用序列表SEQ ID NO.1中氨基酸編號(hào)36-127所表示的氨基酸序列中，具有包含至少一個(gè)抗原決定基的氨基酸序列的多肽。更具體地說，優(yōu)選使用序列表SEQ ID NO.1中氨基酸編號(hào)36-50(SEQ ID NO.2)、63-83(SEQ ID NO.5)、95-111(SEQ IDNO.6)、114-127(SEQ ID NO.7)所表示的多肽。其中特別優(yōu)選氨基酸編號(hào)36-50(SEQ ID NO.2)或114-127(SEQ ID NO.7)所表示的多肽。
另外，例如作為制備可全部識(shí)別異構(gòu)體p63、p44、p40三個(gè)異構(gòu)體的抗體時(shí)所使用的抗原多肽，例如優(yōu)選使用序列表SEQ ID NO.1中氨基酸編號(hào)163-181(SEQ ID NO.4)所表示的多肽等。作為制備可識(shí)別異構(gòu)體p63、p44兩個(gè)異構(gòu)體的抗體時(shí)所使用的抗原多肽，例如優(yōu)選使用序列表SEQ ID NO.1中氨基酸編號(hào)137-151(SEQ IDNO.3)所表示的多肽等。
這些抗原多肽在SEQ ID NO.1的氨基酸序列上的位置關(guān)系如圖10所述。
抗體的制備可以采用其本身為公知的常用的方法進(jìn)行。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體，優(yōu)選使用多克隆抗體。具體來說，例如制備多克隆抗體時(shí)，使用碳化二亞胺、馬來酰亞胺等適當(dāng)?shù)目s合劑，使上述抗原多肽與KLH(匙孔血藍(lán)蛋白)、BSA(牛血清白蛋白)、豬甲狀腺球蛋白等載體蛋白結(jié)合，制備用于免疫的抗原(免疫原)。這里，抗原多肽與載體蛋白的結(jié)合可通過其本身為公知的常用方法進(jìn)行，例如當(dāng)采用以KLH作為載體蛋白，通過馬來酰亞胺化使抗原多肽結(jié)合的方法時(shí)，可優(yōu)選使硫代-SMMC(4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-甲酸硫化琥珀酰亞氨基酯)等雙官能性縮合劑與KLH反應(yīng)，進(jìn)行馬來酰亞胺化，再使抗原多肽與其反應(yīng)，其中所述抗原多肽是在N末端或C末端中成鍵一側(cè)的末端上加成了半胱氨酸的抗原多肽，這樣就可經(jīng)由巰基容易地結(jié)合，制備免疫原。所選擇的抗原多肽的氨基酸序列中含有半胱氨酸時(shí)，也可以利用它結(jié)合。另外，使用碳化二亞胺化的KLH時(shí)，可以通過與抗原多肽的脫水縮合形成肽鍵來結(jié)合。
根據(jù)需要，將含有這樣制備的免疫原的溶液與佐劑混合，每隔2-3周對(duì)兔、小鼠、大鼠、豚鼠、綿羊、山羊、雞等通常制備抗體所使用的動(dòng)物的皮下或腹腔反復(fù)免疫。免疫后，優(yōu)選進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)性采血，通過ELISA法、蛋白質(zhì)印跡法等免疫學(xué)方法確認(rèn)滴度(抗體滴度)充分增加。經(jīng)確認(rèn)滴度有足夠增加后，由動(dòng)物采血，分離血清，得到抗血清。當(dāng)為雞時(shí)，由雞卵中采集卵黃，由卵黃中分離水溶性組分，制備卵黃提取液，這也同樣可以用作抗血清。
本發(fā)明中，無需對(duì)所得抗血清進(jìn)行純化，可以直接使用，但優(yōu)選通過以下的方法純化使用。例如有使用A蛋白的純化方法、用硫酸銨鹽析的方法、通過離子交換層析等純化免疫球蛋白組分的方法、或者通過使用固定有特定多肽的柱進(jìn)行親和柱層析純化的方法等，其中優(yōu)選使用A蛋白的純化方法和使用親合柱層析的方法其中之一或?qū)⑺鼈兘M合進(jìn)行。這里，固定于柱上、用于純化的多肽可以根據(jù)所使用的抗原多肽的氨基酸序列，選擇與其相同的序列或包含其一部分序列的多肽使用。
制備單克隆抗體時(shí)，與上述同樣，從受免疫的動(dòng)物的脾中采集抗體生成細(xì)胞，按照常規(guī)方法與來自同類動(dòng)物等的骨髓瘤細(xì)胞等培養(yǎng)細(xì)胞融合，制備雜交瘤(Milstein等.，Nature，256，495(1975))。進(jìn)行培養(yǎng)，適當(dāng)?shù)赝ㄟ^ELISA法、蛋白質(zhì)印跡法等確認(rèn)抗體滴度，生成識(shí)別目標(biāo)表位的單克隆抗體，且選擇抗體生成能力高的雜交瘤。由上述經(jīng)選擇的雜交瘤的培養(yǎng)上清中，可獲得目標(biāo)單克隆抗體。
上述所得抗體均是特異性識(shí)別Cochlin的抗體。這可如下確認(rèn)從適當(dāng)?shù)膭?dòng)物種類采集內(nèi)耳組織等已知存在Cochlin的組織，將其制備成提取液，使用該提取液作為陽性對(duì)照；或者化學(xué)合成具有作為抗原多肽使用的氨基酸序列的多肽，分析上述所得抗體與它們的反應(yīng)性。另外，也優(yōu)選以外淋巴作為試樣，確認(rèn)上述所得抗體與存在于外淋巴中的Cochlin的反應(yīng)性。
本說明書中所述抗體不僅指全長(zhǎng)度的抗體，也包括抗體的片段。抗體的片段優(yōu)選功能性片段，例如有F(ab’)2、Fab’等。F(ab’)2、Fab’是通過將免疫球蛋白用蛋白分解酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等)處理來制備的，是在存在于鉸鏈區(qū)的兩條H鏈之間的二硫鍵的前后被消化而生成的抗體片段?？贵w片段也包括包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)，其中所述抗原結(jié)合位點(diǎn)來自編碼該抗體的基因。
例如，將IgG1用木瓜蛋白酶處理，可制備相同的2個(gè)抗體片段，所述相同的2個(gè)抗體片段是在存在于鉸鏈區(qū)的2條H鏈之間的二硫鍵的上游被切斷，由包含VL(L鏈可變區(qū))和CL(L鏈恒定區(qū))的L鏈，以及包含VH(H鏈可變區(qū))和CHγ1(H鏈恒定區(qū)中的γ1區(qū))的H鏈片段在C末端區(qū)通過二硫鍵結(jié)合而成。將該2個(gè)相同的抗體片段分別稱為Fab’。另外，將IgG用胃蛋白酶處理，在存在于鉸鏈區(qū)的2條H鏈之間的二硫鍵的下游被切斷，可制備比上述2個(gè)Fab’在鉸鏈區(qū)連接的片段稍大的抗體片段。將該抗體片段稱為F(ab’)2。
本發(fā)明的抗體可以作為擔(dān)載于固相載體等不溶性載體上的固定抗體使用，或作為用標(biāo)記物標(biāo)記的標(biāo)記抗體使用。這樣的固定抗體、標(biāo)記抗體全部在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
固定抗體是指通過物理吸附或化學(xué)結(jié)合等處于擔(dān)載于不溶性載體上的狀態(tài)的抗體。這些固定抗體可用于檢測(cè)或定量存在于中耳的體液中所含有的Cochlin。可用于擔(dān)載抗體的不溶性載體例如有(1)含有聚苯乙烯樹脂、聚碳酸酯樹脂、硅樹脂或尼龍樹脂等的塑料，或含有玻璃等所代表的水不溶性物質(zhì)的板，試管或管等具有容積的物質(zhì)，珠，球，濾器或膜等；以及(2)纖維素系載體、瓊脂糖系載體、聚丙烯酰胺系載體、葡聚糖系載體、聚苯乙烯系載體、聚乙烯醇系載體、聚氨基酸系載體或多孔性二氧化硅系載體等親和層析中使用的不溶性載體。
標(biāo)記抗體是指用標(biāo)記物標(biāo)記的抗體，這些標(biāo)記抗體可用于檢測(cè)或定量存在于中耳的體液中所含有的Cochlin?？稍诒景l(fā)明中使用的標(biāo)記物只要是通過物理結(jié)合或化學(xué)結(jié)合等與抗體結(jié)合，由此可檢測(cè)它們的存在的物質(zhì)即可，并沒有特別限定。標(biāo)記物的具體例子有酶、熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、生物素、抗生物素蛋白或放射性同位素等，更具體地說，有過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、葡糖-6-磷酸脫氫酶、醇脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、青霉素酶、過氧化氫酶、脫輔基葡糖氧化酶(apoglucose oxidase)、尿素酶、螢光素酶或乙酰膽堿酯酶等酶，異硫氰酸熒光素、藻膽蛋白、稀土類金屬螯合劑、丹磺酰氯或異硫氰酸四甲基羅丹明等熒光物質(zhì)，3H、14C、125I或13I等放射性同位素，生物素，抗生物素蛋白或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。標(biāo)記物與抗體的結(jié)合方法可以采用戊二醛法、馬來酰亞胺法、吡啶基二硫化物(pyridyl disulfide)法或過碘酸法等公知的方法。
其中放射性同位素和熒光物質(zhì)單獨(dú)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，但酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、生物素和抗生物素蛋白不可單獨(dú)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，因此再與1種或以上其它物質(zhì)反應(yīng)，由此產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。例如，當(dāng)使用酶時(shí)，至少需要底物，根據(jù)測(cè)定酶活性的方法(比色法、熒光法、生物發(fā)光法或化學(xué)發(fā)光法等)而使用各種底物。另外，當(dāng)采用生物素時(shí)，通常至少要與抗生物素蛋白或酶修飾的抗生物素蛋白反應(yīng)。還根據(jù)需要根據(jù)該底物的不同而采用各種顯色物質(zhì)。
上述抗Cochlin抗體(包括其片段、標(biāo)記抗體、固相抗體等)可作為外淋巴瘺檢測(cè)試劑使用。該試劑的形式并沒有特別限定，可以是固體也可以是液體(溶液、懸濁液等)。當(dāng)為液體時(shí)，可以通過將上述抗體溶解或懸浮于適當(dāng)?shù)娜軇?可穩(wěn)定保存抗體的緩沖液等)來制備試劑。
3.用于外淋巴瘺的檢測(cè)的試劑盒本發(fā)明的試劑盒至少含有用于檢測(cè)試樣中是否存在來自外淋巴瘺的Cochlin的抗體，以用于檢測(cè)上述的外淋巴瘺。使用該試劑盒，可以在需要時(shí)簡(jiǎn)便、迅速地進(jìn)行本發(fā)明的外淋巴瘺的檢測(cè)，其結(jié)果可對(duì)與其它疾病的鑒別、治療方案的確定等起到作用。
本發(fā)明的試劑盒只要可以進(jìn)行本發(fā)明的檢測(cè)方法，可以是任意的構(gòu)成。例如，如果是用ELISA法進(jìn)行Cochlin檢測(cè)的試劑盒，則至少含有用于檢測(cè)Cochlin是否存在的抗體、酶標(biāo)記的二次抗體，其它還可以含有使試樣中的Cochlin吸附的固相、酶底物、稀釋液或洗滌液等緩沖液、陽性對(duì)照等。這樣，本發(fā)明的試劑盒至少含有用于檢測(cè)試樣中是否存在Cochlin的抗體，并可將本身為公知的常用試劑等組合制備。
實(shí)施例以下通過實(shí)施例說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的任何限定。
下述實(shí)施例中，“SDS”代表十二烷基硫酸鈉，“PBS”代表磷酸緩沖鹽，“DAB”代表3，3’-二氨基聯(lián)苯胺，“HRP”代表辣根過氧化物酶。
實(shí)施例11.抗體的制備制備只識(shí)別異構(gòu)體p63的抗體(以下也稱為“抗LCCL抗體”)、識(shí)別異構(gòu)體p63和p44的抗體(以下也稱為“抗p63/44抗體”)和識(shí)別全部異構(gòu)體的抗體(以下也稱為“抗p63/44/40抗體”)3種抗體作為Cochlin的3種異構(gòu)體的多克隆抗體?？贵w的制備委托寶酒造株式會(huì)社。
(1)抗原多肽的氨基酸序列的選擇比對(duì)在3種抗體的制備中使用的抗原多肽，如人、牛、小鼠的Cochlin的氨基酸序列(N.G.Robertson，Nature Genet.，20，299-303(1998)；Ikezono等.，Biochcm.Biophys.Acta，1535，3，258-265(2001))，選擇這些種的作為共同序列的、且抗原性優(yōu)異的部分。選擇時(shí)參考了用“Epitope Adviser”(富士通九州system engineering社制造)進(jìn)行分析的結(jié)果。通過該結(jié)果，選擇了含有存在于異構(gòu)體p63的N末端的15個(gè)氨基酸的多肽(SEQ ID NO.2)作為制備抗LCCL抗體用的抗原多肽。這相當(dāng)于序列表SEQ ID NO.1的氨基酸編號(hào)36-50。選擇了含有存在于異構(gòu)體p44的N末端、在異構(gòu)體p63和p44中共通的15個(gè)氨基酸的多肽(SEQ ID NO.3、相當(dāng)于序列表SEQ IDNO.1的氨基酸編號(hào)137-151)作為制備抗p63/44抗體用的抗原多肽。還分別選擇了含有存在于異構(gòu)體p40的N末端、全部異構(gòu)體中共通的19個(gè)氨基酸序列的多肽(SEQ ID NO.4、相當(dāng)于序列表SEQ IDNO.1的氨基酸編號(hào)163-181)作為制備抗p63/44/40抗體用的抗原多肽。
(2)抗體的制備使用具有上述(1)中所選擇的氨基酸序列的各抗原多肽制備多克隆抗體，將該工作委托給了寶酒造株式會(huì)社。寶酒造株式會(huì)社制備抗體的步驟如下。
首先通過化學(xué)合成分別制備10mg(80％)上述抗原多肽，通過經(jīng)由Cys(半胱氨酸)的馬來酰亞胺法，使所述抗原多肽與2mg KLH匙孔血藍(lán)蛋白結(jié)合，制成免疫原。這里，由于制備抗p63/44抗體和抗p63/44/40抗體用的抗原多肽的氨基酸序列中不含有半胱氨酸，因此在用于制備抗p63/44抗體的抗原多肽的C末端、在用于制備抗p63/44/40抗體的抗原多肽的N末端加成半胱氨酸，合成多肽，并使用該多肽。每間隔2周將該免疫原對(duì)1只兔進(jìn)行致敏，共致敏4次，第3次致敏后，通過ELISA法(酶聯(lián)免疫測(cè)定法)進(jìn)行滴度測(cè)定，確認(rèn)滴度上升。致敏后，按照公知的方法采集1ml抗血清，通過A蛋白純化所得抗血清總量。預(yù)先使5mg上述抗原多肽與5g用CNBr活化的瓊脂糖結(jié)合，制備肽親和柱，接著將用A蛋白純化的抗血清中80％的量過該柱，進(jìn)一步純化。各操作按照其本身為公知的常用方法進(jìn)行。
(3)抗體的特異性的確認(rèn)由牛內(nèi)耳組織制備內(nèi)耳蛋白質(zhì)溶液(陽性對(duì)照)，以此作為抗原，通過蛋白質(zhì)印跡法對(duì)上述(2)中制備的抗體的特異性進(jìn)行確認(rèn)。
首先，由牛顳骨(購(gòu)自東京芝浦臟器(株))采集180mg內(nèi)耳膜迷走神經(jīng)，向其中加入在冰中將1 tab的1ml蛋白質(zhì)提取液(Complete mini Ca(-)(Boehringer Mannheim社制)溶解于10mlPBS、0.5％SDS而得到的溶液(pH 7.4))，用試管混合器和デイスポ攪拌磨碎器(GHI社制)進(jìn)行勻漿，直至肉眼看不到殘余組織，然后用1000g離心15分鐘，以所得上清作為內(nèi)耳蛋白質(zhì)溶液。使用0.5μl該溶液作為陽性對(duì)照。蛋白質(zhì)印跡法按照后面2中詳述的方法進(jìn)行。
結(jié)果，在使用抗LCCL抗體的分析中，在約63kDa的位置可見譜帶，表明識(shí)別異構(gòu)體p63。在使用抗p63/44抗體的分析中，在約63kDa和44kDa的位置檢測(cè)出譜帶，表明該抗體識(shí)別異構(gòu)體p63和p44。另外在使用抗p63/44/40抗體的分析中，檢測(cè)出異構(gòu)體p63、p44和p40三條譜帶，表明該抗體識(shí)別全部異構(gòu)體。這樣顯示出使用制備的三種抗體，可區(qū)別存在于內(nèi)耳組織的3種Cochlin的異構(gòu)體。
2.使用1的抗體對(duì)外淋巴及內(nèi)耳組織進(jìn)行的分析使用上述1中制備的3種抗體，通過蛋白質(zhì)印跡法對(duì)外淋巴及內(nèi)耳組織進(jìn)行分析。
(1)用于電泳和蛋白質(zhì)印跡法的試劑的制備(i)樣品緩沖液的制備在18.75ml 1 M Tris-HCL(pH 6.8)、15ml 2-巰基乙醇、30ml甘油、6.9ml 10％SDS、3ml 0.1％溴酚藍(lán)中加入蒸餾水，使總量為100ml。終濃度為0.188 M Tris緩沖液、2.39mM SDS。
(ii)大小標(biāo)記的制備將1瓶市售的大小標(biāo)記(prestained protein marker weightstandards，高范圍已染色蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品(高分子量用)；Cat.No.#36041-020(Gibco社制造))溶解于500μl的1mM DTT、10％甘油，煮沸5分鐘，然后冷卻，按照20μl/管分注，在-80℃保存。用時(shí)熔融使用。
(iii)電泳緩沖液(running buffer)的制備將15g/l Tris堿、72g/l甘氨酸、5g/l SDS溶解于MilliQ(MILLIPORE社制造)水，制備貯存用的5倍濃縮液。使用時(shí)將其稀釋，以終濃度25mM Tris、192mM甘氨酸、1g/l SDS(pH 8.3)使用。
(iv)轉(zhuǎn)印緩沖液(transfer buffer)的制備將3.03g Tris、14.4g甘氨酸、200ml甲醇溶解于蒸餾水，使終濃度為25mM Tris、192 mM甘氨酸、20％v/v甲醇(pH 8.3)。
(v)使用0.1％吐溫PBS(pH 7.4)作為洗滌緩沖液。
(vi)封閉緩沖液(blocking buffer)的制備將dry milk(雪印社制造的脫脂乳)溶解于0.2％吐溫的PBS(pH7.4)溶液中，使終濃度為5％。
(vii)抗體稀釋緩沖液的制備將dry milk(雪印社制造的脫脂乳)溶解于0.1％吐溫的PBS(pH7.4)溶液中，使終濃度為1％。
(viii)猩紅染色液的制備將30g三氯乙酸、30g磺基水楊酸、2g猩紅S溶解于100ml的MilliQ水中，制成貯存用的10×濃縮液。使用時(shí)用MilliQ水稀釋10倍使用。
(ix)DAB液的制備DAB溶液用時(shí)制備。將10mg DAB(10mg片劑；Cat.No.049-22831(Wako社制造))溶解于20ml的50mM Tris緩沖液(pH 7.6)，然后加入20μl 30％H2O2。將其用0.45μm的濾器(MILLIPORE社制造)過濾之后使用。
(2)試樣的制備使用人、牛、豚鼠的內(nèi)耳組織和外淋巴作為試樣。
關(guān)于人的試樣，將采集和研究的目的對(duì)患者進(jìn)行了充分的說明，得到同意后使用。內(nèi)耳組織的提取液的制備如下在聽神經(jīng)腫瘤手術(shù)時(shí)采集人內(nèi)耳膜迷走神經(jīng)并稱量，向180mg組織量中加入1 tab的1ml蛋白提取液(Complete mini Ca(-)(Boehringer Mannheim社制)溶解于10ml PBS、0.5％SDS而得到的溶液(pH 7.4))，用試管混合器和デイスポ攪拌磨碎器(GHI社制)進(jìn)行勻漿，直至肉眼看不到殘余組織，然后用1000g離心15分鐘，以所得上清作為內(nèi)耳蛋白質(zhì)溶液。使用2μl和0.5μl進(jìn)行電泳。外淋巴是在人工內(nèi)耳安裝手術(shù)時(shí)，用鉆在耳蝸的基底膜向蝸孔外淋巴腔開孔，插入電極，此時(shí)回收漏出的外淋巴，將其中2μl進(jìn)行電泳。
作為牛的試樣，在內(nèi)耳組織的提取液中，與1同樣地使用0.5μl由上述1的(3)制備的溶液。另外，用手術(shù)鉆將牛顳骨(購(gòu)自東京芝浦臟器(株))的外耳道切開，切除鼓膜，到達(dá)中耳，摘除鐙骨，由卵圓窗采集外淋巴。此時(shí)要注意采集外淋巴時(shí)不要混入內(nèi)耳組織。使用采集的外淋巴中的2μl作為試樣。豚鼠內(nèi)耳組織的提取液如下制備由Hartley系豚鼠顳骨(購(gòu)自三共ラボ-サビス(株))采集內(nèi)耳膜迷走神經(jīng)，向該180mg內(nèi)耳膜迷走神經(jīng)中加入在冰中將1 tab的1ml蛋白質(zhì)提取液(Complete mini Ca(-)(BoehringerMannheim社制)溶解于10ml PBS、0.5％SDS而得到的溶液(pH7.4))，用試管混合器和デイスポ攪拌磨碎器(GHI社制)進(jìn)行勻漿，直至肉眼看不到殘余組織，然后用1000g離心15分鐘，以所得上清作為內(nèi)耳蛋白質(zhì)溶液。使用0.5μl。外淋巴的采集是切除鼓膜，到達(dá)中耳，摘除鐙骨，由卵圓窗采集外淋巴。使用其中的2μl。
相對(duì)于200份容量的各試樣，按照上述(1)制備的樣品緩沖液85份、2-巰基乙醇15份的比例混合并溶解。將制備的各試樣溶液在95℃15分鐘，然后冷卻至室溫，以3000rpm離心10秒，各取15μl進(jìn)行電泳。
(3)聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)于各抗體的檢測(cè)，將上述(2)中制備的各試樣溶液點(diǎn)樣于15％丙烯酰胺凝膠(レデイゲルJ；長(zhǎng)73mm×寬80mmcm×厚1mm(Bio-Rad社制造))共3片上，置于電泳裝置(Bio-Rad社制造)上，使用上述(1)中制備的電泳緩沖液進(jìn)行電泳。電泳以60分鐘、27mA[每片凝膠]進(jìn)行。
(4)通過蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行的分析使用上述(1)中制備的轉(zhuǎn)印緩沖液，在100V下用90分鐘將上述(3)中進(jìn)行了電泳的3片凝膠分別轉(zhuǎn)印到硝基纖維素膜(0.45μm；Cat.no.#162-0145(Bio-Rad社制造))上。轉(zhuǎn)印裝置采用濕式印跡儀(Bio-Rad社制造)。
轉(zhuǎn)印后，將硝基纖維素膜在猩紅染色液中浸漬5分鐘，然后用MilliQ水脫色，確認(rèn)各試樣溶液中的蛋白質(zhì)被染色的情況。確認(rèn)后，在蒸餾水中振蕩5分鐘進(jìn)行脫色。
接著通過DAB染色法(酶顯色法)進(jìn)行檢測(cè)和分析。首先將3片上述硝基纖維素膜在用于封閉非特異性反應(yīng)的封閉緩沖液中、在4℃浸泡1晝夜。將其用洗滌緩沖液洗滌5分鐘，洗滌3次，使其與上述1中制備的一次抗體反應(yīng)。一次抗體如下處理抗LCCL抗體用抗體稀釋緩沖液稀釋1000倍，抗p63/44抗體和抗p63/44/40抗體用同一緩沖液稀釋500倍，分別添加到各1片硝基纖維素膜上。一邊振蕩一邊反應(yīng)2小時(shí)。
將所得反應(yīng)后的膜用上述洗滌緩沖液洗滌15分鐘，洗滌3次，然后與二次抗體反應(yīng)。將來自山羊的抗兔IgG抗體(HRP標(biāo)記；Cat.No.p-0448(Dako社制造))用上述抗體稀釋緩沖液稀釋1000倍，使用該溶液作為二次抗體，一邊振蕩一邊反應(yīng)1小時(shí)。將其用洗滌緩沖液洗滌5分鐘，洗滌3次，然后與上述(1)中制備的DAB液反應(yīng)，使其顯色。反應(yīng)通過浸漬于蒸餾水中來終止。
各分析結(jié)果如圖1所示。
使用抗LCCL抗體分析的結(jié)果顯示，在人、牛、豚鼠的全部動(dòng)物種類的內(nèi)耳組織提取液中檢出63kDa的譜帶(圖中用箭頭表示的譜帶)。在全部動(dòng)物種類的外淋巴中檢出16kDa的清晰的細(xì)譜帶(圖中用星號(hào)(*)表示的譜帶)。在使用抗p63/44抗體的分析中，在全部動(dòng)物種類的內(nèi)耳組織提取液中檢出63kDa和44kDa的譜帶，在外淋巴中未見主要的譜帶。在使用抗p63/44/40抗體的分析中，在全部動(dòng)物種類的內(nèi)耳組織提取液中檢出63kDa、44kDa和440kDa三條譜帶，但在外淋巴中未見主要的譜帶。
由這些結(jié)果表明三種抗體的每一種都顯示同樣的反應(yīng)，可以區(qū)別3種異構(gòu)體。另外可知外淋巴中存在約16kDa的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)只由抗LCCL抗體識(shí)別，不被抗p63/44抗體和抗p63/44/40抗體識(shí)別，因此暗示是含有具有異構(gòu)體p63的N末端部分的氨基酸序列(p44和p40所不具有的序列)的片段的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明人著眼于只存在于該外淋巴中的16kDa的蛋白質(zhì)，使用抗LCCL抗體進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
3.使用抗LCCL抗體檢測(cè)外淋巴瘺上述2中的分析結(jié)果顯示，通過本發(fā)明的抗體檢測(cè)出只存在于外淋巴的16kDa的蛋白質(zhì)，由此對(duì)以該蛋白質(zhì)為指標(biāo)的外淋巴瘺的檢測(cè)方法進(jìn)行了研究。使用抗LCCL抗體進(jìn)行研究。
(1)用于電泳和蛋白質(zhì)印跡法的試劑的制備均與上述2的(1)同樣進(jìn)行。
(2)試樣的制備采用包含CSF、血清、唾液、滲出性中耳炎的滲出液的中耳洗滌液，包含慢性中耳炎的耳漏的中耳洗滌液作為可存在于人中耳中的除外淋巴以外的體液。采用由患有急性感音性耳聾并疑為有外淋巴瘺的患者采集的中耳洗滌液作為外淋巴瘺檢測(cè)試驗(yàn)樣本。采用從梅尼埃爾氏病患者得到的中耳洗滌液作為要與外淋巴瘺區(qū)分的疾病。另外采用人工內(nèi)耳手術(shù)、鐙骨手術(shù)、外半規(guī)管瘺管、外傷的各個(gè)患者的內(nèi)耳漏出的外淋巴作為試樣。各試樣是將采集和研究的目的對(duì)患者進(jìn)行了充分的說明，在得到同意后使用的。
CSF采用因疑為患有髓膜炎和腦炎而進(jìn)行檢查，結(jié)果為正常的患者的CSF的一部分。血清采用健康人的靜脈血。唾液是由健康人采集到的樣本。包含滲出性中耳炎的滲出液的中耳洗滌液、包含慢性中耳炎耳漏的中耳洗滌液、以及來自梅尼埃爾氏病的患者的中耳洗滌液是將各自患者的鼓膜切開微小口子，用針筒注入微量生理鹽水，然后再通過針筒將其回收而采集。疑為患有外淋巴瘺的患者的中耳洗滌液在進(jìn)行鼓室開放術(shù)時(shí)采集。對(duì)于外淋巴瘺確診操作前的中耳洗滌液，不開放鼓室，與由梅尼埃爾氏病患者采集中耳洗滌液同樣，用針筒從鼓膜回收。
從各種傷病患者的內(nèi)耳漏出的外淋巴的采集如下進(jìn)行。首先，人工內(nèi)耳手術(shù)患者的外淋巴是在人工內(nèi)耳安裝手術(shù)時(shí)，用鉆在耳蝸的基底膜向蝸孔外淋巴腔開孔，插入電極，此時(shí)回收漏出的外淋巴。因耳硬化癥而施行鐙鼓手術(shù)的患者的外淋巴是在鐙骨的底板(卵圓窗)打孔，插入人工聽小骨，此時(shí)回收漏出的外淋巴。鐙骨手術(shù)操作前的中耳洗滌液是在在鐙骨上打孔之前用生理鹽水洗滌中耳，回收該洗滌液。具有外半規(guī)管瘺管的患者的外淋巴，是在因外聽道癌切除而進(jìn)行的外聽道全摘除手術(shù)時(shí)，用生理鹽水洗滌中耳的外半規(guī)管凸的部分上的孔及其周邊部分，回收洗滌液。作為外傷患者的外淋巴，采集了外傷導(dǎo)致內(nèi)耳骨折而漏出的外淋巴(外傷性顳骨骨折血性中耳滲出液)。對(duì)于人工內(nèi)耳手術(shù)患者的外淋巴，將其分別稀釋5倍、50倍、500倍后再制備，同樣地使用。
對(duì)于這些試樣、以及上述例2中使用的牛外淋巴和牛內(nèi)耳蛋白質(zhì)溶液(陽性對(duì)照)，分別按照下表1所示取樣，相對(duì)于200份容量，按照上述(1)制備的樣品緩沖液85份、2-巰基乙醇15份的比例混合并溶解。將制備的各試樣溶液在95℃孵育3分鐘，然后冷卻至室溫，以3000rpm離心10秒，各取15μl進(jìn)行電泳。
(3)聚丙烯酰胺凝膠電泳將上述(2)中制備的各試樣溶液加到15％丙烯酰胺凝膠上(レデイゲルJ；縱73mm×寬80mmcm×厚1mm(Bio-Rad社制造))上，置于電泳裝置(Bio-Rad社制造)上，使用上述(1)中制備的電泳緩沖液進(jìn)行電泳。電泳以60分鐘、27mA[每片凝膠]進(jìn)行。
(4)通過蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行的分析使用上述(1)中制備的轉(zhuǎn)印緩沖液，在100V下用90分鐘將上述(3)中進(jìn)行了電泳的凝膠分別轉(zhuǎn)印到硝基纖維素膜(0.45μm；Cat.no.#162-0145(Bio-Rad社制造))。轉(zhuǎn)印裝置采用濕式印跡儀(Bio-Rad社制造)。
轉(zhuǎn)印后，將硝基纖維素膜在猩紅染色液中浸漬5分鐘，然后用MilliQ水脫色，確認(rèn)各試樣溶液中的蛋白質(zhì)被染色的情況。確認(rèn)后，在蒸餾水中振蕩5分鐘進(jìn)行脫色。
接著通過化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)和分析。將轉(zhuǎn)印后的硝基纖維素膜在用于封閉非特異性反應(yīng)的封閉緩沖液中、在4℃浸泡1晝夜。將其用洗滌緩沖液洗滌5分鐘，洗滌3次，使其與一次抗體反應(yīng)。一次抗體如下處理抗LCCL抗體用抗體稀釋緩沖液稀釋1000倍，添加到硝基纖維素膜上。一邊振蕩一邊反應(yīng)2小時(shí)。
將來自山羊的抗兔IgG抗體(HRP標(biāo)記)(Dako社制造；Cat.No.#p-0448)用上述抗體稀釋緩沖液稀釋1000倍，使用該稀釋的溶液作為二次抗體，一邊振蕩一邊反應(yīng)1小時(shí)。將其用洗滌緩沖液洗滌15分鐘，洗滌3次，然后用化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL plus；Amersham Pharmacia Biotech社制造)使其化學(xué)放光，用產(chǎn)生的信號(hào)感光膠片(Kodak Scientific Imaging Film；Cat.No.#165-1454(Kodak公司制造))。關(guān)于膠片的曝光時(shí)間，印跡有表1的孔No.1-12試樣的第1片硝基纖維素膜約為1分鐘，印跡有孔No.13-24試樣的第2片硝基纖維素膜約為1小時(shí)。印跡有孔No.25-36試樣的第3片硝基纖維素膜約曝光10秒和約曝光1小時(shí)，通過兩個(gè)試驗(yàn)比較曝光時(shí)間帶來的不同。印跡有孔No.37-48試樣的第4片硝基纖維素膜、印跡有孔No.49-60試樣的第5片硝基纖維素膜和印跡有孔No.61-72試樣的第6片硝基纖維素膜分別曝光5分鐘。
結(jié)果如圖2-7所示。圖中，照片上的數(shù)字表示表1的孔No.，下面的內(nèi)容表示供給該孔的試樣。圖2-圖7是通過化學(xué)發(fā)光法對(duì)以下的膜進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果照片圖2印跡有表1的孔No.1-12試樣的第1片硝基纖維素膜，圖3為印跡有孔No.13-24試樣的第2片硝基纖維素膜，圖4為印跡有孔No.25-36試樣的第3片硝基纖維素膜，圖5為印跡有孔No.37-48試樣的第4片硝基纖維素膜，圖6為印跡有孔No.49-60試樣的第5片硝基纖維素膜，圖7為印跡有孔No.61-72試樣的第6片硝基纖維素膜。各試樣用于電泳的樣品量、孔No.以及結(jié)果一覽表示在表1中。
表1

孔No.33，44，53，56，64，67，70未加試樣。
人外淋巴中(由人工內(nèi)耳手術(shù)(圖2之3、圖3之14-17、圖4之26、圖5之40、47)、外半規(guī)管瘺管(圖3之18)、鐙骨手術(shù)(圖3之19、20、圖4之27、28和32、圖6之50、52和59、圖7之63、71)、外傷(圖4之34)各患者得到的外淋巴)，所有例子中均在約16kDa處檢出清晰的細(xì)譜帶。將來自人工內(nèi)耳手術(shù)患者的外淋巴進(jìn)行系列稀釋，由孔的結(jié)果(圖3之14-17)可知采集自人的外淋巴稀釋50倍左右仍可檢出。由疑為外淋巴瘺的患者得到的中耳洗滌液中，5例為陽性，3例為陰性(圖4之29、圖7之65、66、68和69為陽性，圖4之30、圖5之41、42為陰性)。鐙骨手術(shù)操作前(圖6之51、58、圖7之62)、梅尼埃爾氏病(圖3之21、圖4之35、36、圖5之38、39、圖6之54、55和57)、滲出性中耳炎(圖3之22-24)、慢性中耳炎(圖4之31)的各患者的中耳洗滌液為陰性。人CSF(圖2之4-7)、人血清(圖2之8-10)、人唾液(圖2之12)中未見用該抗體檢出的譜帶。
牛外淋巴中檢出了稍寬的16kDa譜帶(圖2之2)。作為陽性對(duì)照的牛內(nèi)耳蛋白質(zhì)溶液中檢出了可能是異構(gòu)體p63的63kDa的譜帶，但蛋白量多，因此曝光過度，可見該部分泛白(圖2之11)。
如圖4所示，進(jìn)行1小時(shí)的曝光時(shí)(圖4上面的照片)，也檢出約為16kDa的N末端片段以外的譜帶，但它們可明顯與目標(biāo)譜帶區(qū)別。例如，特別是在外傷患者的外淋巴(圖4之34)等中，采集外淋巴時(shí)產(chǎn)生溶血，因此在約60kDa處檢出可能是白蛋白的譜帶，但可以與被檢測(cè)為16kDa的目標(biāo)譜帶區(qū)別。另外還證實(shí)即使曝光10秒鐘，也可以檢測(cè)出試樣中的Cochlin(圖4下面的照片)。
由這些結(jié)果可知該16kDa的蛋白質(zhì)在可能存在于人的中耳的體液中，即CFS、血清、唾液、鐙骨手術(shù)操作前的中耳洗滌液、滲出性中耳炎的中耳滲出液、慢性中耳炎的耳漏等中均未檢出，另外在梅尼埃耳氏病患者的中耳洗滌液中也未檢出，只在人外淋巴中檢出，因此對(duì)于外淋巴瘺的檢測(cè)是非常有用的。
另外，疑為外淋巴瘺的患者中，使用操作前用針筒從鼓膜回收的中耳洗滌液時(shí)、和使用實(shí)施骨膜開放術(shù)時(shí)回收的中耳洗滌液都產(chǎn)生相同的結(jié)果，由此可知通過本發(fā)明的檢測(cè)方法，無需鼓膜開放術(shù)，僅通過微小切開和使用針筒的方法即可檢測(cè)出外淋巴瘺。
實(shí)施例21.抗體的制備與實(shí)施例1同樣地制備3種與抗LCCL抗體不同的只識(shí)別異構(gòu)體p63的抗體?？贵w的制備委托寶酒造株式會(huì)社。
(1)抗原多肽的氨基酸序列的選擇在3種只識(shí)別異構(gòu)體p63的抗體的制備中使用的抗原多肽分別如下選擇含有相當(dāng)于序列表SEQ ID NO.1中氨基酸編號(hào)63-83的21個(gè)氨基酸的多肽(SEQ ID NO.5)(以其作為抗原多肽制備的抗體在以下也稱為“抗LCCL1抗體”)、含有相當(dāng)于同序列氨基酸編號(hào)95-111的17個(gè)氨基酸的多肽(SEQ ID NO.6)(以其作為抗原多肽制備的抗體在以下也稱為“抗LCCL2抗體”)、含有相當(dāng)于序列表SEQ IDNO.1中氨基酸編號(hào)114-127的14個(gè)氨基酸的多肽(SEQ ID NO.7)(以其作為抗原多肽制備的抗體在以下也稱為“抗LCCL3抗體”)。
(2)抗體的制備用具有上述(1)中所選擇的氨基酸序列的各抗原多肽制備多克隆抗體，將該工作委托給了寶酒造株式會(huì)社。寶酒造株式會(huì)社制備抗體的步驟與實(shí)施例1的1(2)相同。
由于所述氨基酸序列中不含有半胱氨酸，因此在分別用于制備抗體的抗原多肽的C末端加成半胱氨酸，合成由此形成的多肽，使用該多肽制備抗LCCL2抗體、抗LCCL3抗體。
(3)抗體的特異性的確認(rèn)上述(2)中制備的抗體的特異性按照與實(shí)施例1的1(3)同樣的方法確認(rèn)。結(jié)果在對(duì)抗LCCL1抗體、抗LCCL2抗體、抗LCCL3抗體各個(gè)抗體的分析中，在約63kDa的位置見到譜帶，表明識(shí)別異構(gòu)體p63。
2.使用由上述1制備的抗體對(duì)外淋巴及內(nèi)耳組織進(jìn)行的分析使用上述1中制備的3種抗體，通過蛋白質(zhì)印跡法對(duì)外淋巴及內(nèi)耳組織進(jìn)行分析。
(1)用于電泳和蛋白質(zhì)印跡法的試劑的制備全部與實(shí)施例1的2(1)同樣進(jìn)行。
(2)試樣的制備使用牛的內(nèi)耳組織和外淋巴作為試樣。內(nèi)耳組織的提取液按照與上述實(shí)施例1的1(3)同樣的方法制備，使用0.3μl。用手術(shù)鉆將牛顳骨(購(gòu)自東京芝浦臟器(株))的外耳道切開，切除鼓膜，到達(dá)中耳，摘除鐙骨，由卵圓窗采集外淋巴。此時(shí)要注意采集外淋巴時(shí)不要混入內(nèi)耳組織。使用采集的外淋巴中的1μl作為試樣。
相對(duì)于200份各試樣的容量，按照上述(1)制備的樣品緩沖液85份、2-巰基乙醇15份的比例混合并溶解。將制備的各試樣溶液在95℃孵育3分鐘，然后冷卻至室溫，以3000rpm離心10秒，各取15μl進(jìn)行電泳。
(3)聚丙烯酰胺凝膠電泳制作2片15％丙烯酰胺凝膠(レデイゲルJ；長(zhǎng)73mm×寬80mmcm×厚1mm(Bio-Rad社制造))，用于各抗體的檢測(cè)，只將上述(2)中制備的牛內(nèi)耳試樣溶液點(diǎn)樣、和只將外淋巴溶液點(diǎn)樣，置于電泳裝置(Bio-Rad社制造)上，使用上述(1)中制備的電泳緩沖液進(jìn)行電泳。電泳以60分鐘、27mA[每片凝膠]進(jìn)行。
(4)通過蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行的分析使用上述(1)中制備的轉(zhuǎn)印緩沖液，在100V下用90分鐘將上述(3)中進(jìn)行了電泳的2片凝膠分別轉(zhuǎn)印到硝基纖維素膜(0.45μm；Cat.no.#162-0145(Bio-Rad社制造))。轉(zhuǎn)印裝置采用濕式印跡儀(Bio-Rad社制造)。
轉(zhuǎn)印后，將硝基纖維素膜在猩紅染色液中浸漬5分鐘，然后用MilliQ水脫色，確認(rèn)各試樣溶液中的蛋白質(zhì)被染色的情況。
接著通過DAB染色法(酶顯色法)進(jìn)行檢測(cè)和分析。首先將上述硝基纖維素膜在用于封閉非特異性反應(yīng)的封閉緩沖液中、在4℃浸泡1晝夜。將其用洗滌緩沖液洗滌5分鐘，洗滌3次?？筁CCL抗體、抗LCCL1抗體、抗LCCL2抗體和抗LCCL3抗體均用抗體稀釋緩沖液稀釋1000倍，作為一次抗體，添加到硝基纖維素膜上。一邊振蕩一邊反應(yīng)2小時(shí)。
將所得反應(yīng)后的膜用上述洗滌緩沖液洗滌15分鐘，洗滌3次，然后與二次抗體反應(yīng)。將來自山羊的抗兔IgG抗體(HRP標(biāo)記；Cat.No.p-0448(Dako社制造))用上述抗體稀釋緩沖液稀釋1000倍，使用該溶液作為二次抗體，一邊振蕩一邊反應(yīng)1小時(shí)。將其用上述洗滌緩沖液洗滌5分鐘，洗滌3次，然后與上述(1)中制備的DAB液反應(yīng)，使其顯色。反應(yīng)通過浸漬于蒸餾水中來終止。
將切成短棒狀的各泳道按照牛外淋巴和牛內(nèi)耳的抗體順序進(jìn)行分析，結(jié)果如圖8所示。
使用抗LCCL抗體、抗LCCL1抗體、抗LCCL2抗體和抗LCCL3抗體進(jìn)行的分析中，結(jié)果在內(nèi)耳組織提取液中檢出63kDa的譜帶(圖中用箭頭表示的譜帶)。外淋巴中，用抗LCCL抗體和抗LCCL3抗體在16kDa檢出明確的譜帶。另外，抗LCCL1抗體和抗LCCL2抗體也檢出譜帶。由這些結(jié)果表明上述四種抗體識(shí)別異構(gòu)體p63，且證實(shí)使用抗LCCL抗體、抗LCCL1抗體、抗LCCL2抗體和抗LCCL3抗體各抗體，都可識(shí)別只存在于外淋巴的16kDa蛋白質(zhì)。
3.使用抗LCCL3抗體檢測(cè)外淋巴瘺上述2中的分析結(jié)果顯示，通過抗LCCL1抗體、抗LCCL2抗體和抗LCCL3抗體檢測(cè)出只存在于外淋巴的16kDa的蛋白質(zhì)，由此對(duì)以該蛋白質(zhì)為指標(biāo)的外淋巴瘺的檢測(cè)方法進(jìn)行了研究。使用抗LCCL3抗體進(jìn)行研究。
(1)用于蛋白質(zhì)印跡法的試劑的制備均與上述實(shí)施例1的2(1)同樣進(jìn)行。
(2)試樣的制備采用從梅尼埃爾氏病患者得到的中耳洗滌液、由人工內(nèi)耳手術(shù)、鐙骨手術(shù)患者的內(nèi)耳漏出的外淋巴試樣和由疑為外淋巴瘺的患者采集的中耳洗滌液作為試樣。各試樣是將采集和研究的目的對(duì)患者進(jìn)行了充分的說明，在得到同意后使用的。
試樣與實(shí)施例1的3(2)同樣地采集，或使用由實(shí)施例1的3(2)采集的試樣。其制備方法完全與實(shí)施例1的3(2)同樣地進(jìn)行。
(3)聚丙烯酰胺凝膠電泳完全與實(shí)施例1的3(3)同樣地進(jìn)行。
(4)通過蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行的分析完全與實(shí)施例1的3(4)同樣地進(jìn)行。只是膠片曝光的時(shí)間為5分鐘。
結(jié)果如圖9所示。圖中，照片上的數(shù)字表示表2的孔No.，下面的內(nèi)容表示供給該孔的試樣。圖9是通過化學(xué)發(fā)光法對(duì)印跡有表2的孔No.73-83試樣的硝基纖維素膜進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果照片。各試樣用于電泳的樣品量、孔No.以及結(jié)果一覽表示在表2中。為了比較，對(duì)于使用抗LCCL抗體的試樣與由相同患者采集的試樣，也記錄了抗LCCL抗體下的試驗(yàn)結(jié)果。
表2 *孔No.81未點(diǎn)樣。
在人外淋巴(人工內(nèi)耳手術(shù)(圖9之74)、鐙骨手術(shù)(圖9之82、83))中，在16kDa處檢出譜帶，可確認(rèn)為陽性。梅尼埃爾氏病(圖9之75)患者的中耳洗滌液為陰性。由疑為外淋巴瘺的患者得到的中耳洗滌液中，4例為陽性，1例為陰性(圖9之76、77、78和79為陽性，80為陰性)。該結(jié)果與由抗LCCL抗體得到的結(jié)果一致，抗LCCL3抗體和抗LCCL抗體都檢出只存在于外淋巴中的16kDa的蛋白質(zhì)，由此可知抗LCCL3抗體也與抗LCCL抗體同樣，對(duì)于檢測(cè)外淋巴瘺有效。
實(shí)施例3如上述實(shí)施例1和2所詳述，通過抗LCCL抗體和抗LCCL3抗體在人、牛、豚鼠等外淋巴中檢出了約16kD的蛋白質(zhì)。這里，使用牛外淋巴，通過雙向凝膠電泳(2D-GE)進(jìn)行分析。
雙向凝膠電泳(2D-GE)中，通過在第一向進(jìn)行等電聚焦凝膠電泳，在第二向進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，可以更詳細(xì)地分析蛋白質(zhì)。例如因分子量接近而使單向的SDS-PAGE中無法分離的多個(gè)蛋白質(zhì)，在雙向凝膠電泳(2D-GE)中可以分離，可以對(duì)因磷酸化、糖鏈的加成、氨基酸置換等各種因素使蛋白質(zhì)受到的微妙的變化進(jìn)行分析。2D-GE、印跡法、通過抗LCCL抗體和抗LCCL3抗體的染色法在以下詳述。
1.第一向的等電聚焦電泳第一向的等電聚焦電泳采用Amersham Bioscience公司(Buckinghamshire，英國(guó))制造的IPG凝膠(pH 6-9，18cm)進(jìn)行。作為試樣的牛外淋巴使用與上述實(shí)施例1相同的試樣。
首先向1容(約16μl)試樣(牛外淋巴)中加入7容(112μl)試樣添加液(每片添加7M尿素、2M硫脲、2％TritonX-100、2％Pharmalyte、40mM DTT、蛋白質(zhì)分解酶抑制劑(Complete mini EDA(-)，Boehringer Mannheim公司，Mannheim德國(guó)))，以此作為試樣溶液。將IPG凝膠(購(gòu)入的干燥狀態(tài)的商品)用約10ml的溶脹液(7M尿素、2M硫脲、2％TritonX-100、2％Pharmalyte、40mM DTT)溶脹，用于第一向電泳。
電泳通過Amersham Bioscience公司(Buckinghamshire，英國(guó))制造的電泳裝置(MultiphorII)進(jìn)行，將120μl上述試樣裝入設(shè)置于陽極一側(cè)的樣品杯中，進(jìn)行電泳。電泳在300V下進(jìn)行60分鐘，然后用90分鐘將電壓由300V緩慢升至3500V，再在3500V下進(jìn)行18小時(shí)。電泳過程中將裝置冷卻至15℃。
2.第二向的SDS-PAGE電泳第一向的電泳結(jié)束后，將IPG凝膠用平衡液(7M尿素、25％甘油、50mM Tris-HCl緩沖液(pH 6.8)、2％SDS、33mM DTT、1.6％溴酚藍(lán)平衡30分鐘，將其用于第二向的SDS-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)。SDS-PAGE凝膠使用24×24×0.1cm大小。用于濃縮的該凝膠中聚丙烯酰胺的濃度為3％，用于分離的凝膠中聚丙烯酰胺的濃度為15％，其它凝膠組成與通常的SDS-PAGE的條件相同。另外，電泳緩沖液使用25mM Tris、192mM甘氨酸、0.1％SDS組成。在濃縮凝膠中以50mA進(jìn)行電泳，在分離凝膠中以70mA進(jìn)行電泳。
3.印跡第二向電泳結(jié)束后，立即將凝膠用印跡緩沖液(25mM Tris、192mM甘氨酸、0.05％SDS、10％甲醇)平衡30分鐘，用印跡儀裝置(日本Eido公司制造NA-1515B)將其轉(zhuǎn)印至PVDF膜(AppliedBiosystems公司制造Pro-Blot)。
4.通過抗LCCL抗體染色將上述3中的印跡膜在封閉溶液(5％脫脂乳、0.2％吐溫20、PBS)中、在4℃的冰箱中靜置一晝夜，進(jìn)行封閉，然后用洗滌液(吐溫20、PBS)振蕩5分鐘，振蕩3次進(jìn)行洗滌。
將上述實(shí)施例1中制備的抗LCCL抗體(6μl)用稀釋液(1％脫脂乳、吐溫20、PBS、6ml)稀釋1000倍，以此作為一次抗體溶液。在預(yù)先洗凈的膜上添加一次抗體溶液，在室溫下振蕩2小時(shí)，使其反應(yīng)，然后用洗滌液振蕩15分鐘，振蕩3次進(jìn)行洗滌。
將抗兔IgG-HRP共軛物(Chappel公司制造、2.4μl)用上述稀釋液稀釋2500倍，以此作為2次抗體溶液。在洗凈的膜上添加該2次抗體溶液，在室溫下振蕩1小時(shí)，使其反應(yīng)，然后用洗滌液振蕩15分鐘，洗滌3次。用Amersham Bioscience公司制造的ECL試劑盒對(duì)洗滌后的膜進(jìn)行抗體識(shí)別斑點(diǎn)的檢測(cè)。
結(jié)果，在等電點(diǎn)7.7-7.9附近、分子量17.7-23.1kD附近檢出一組蛋白質(zhì)。其中主要的蛋白質(zhì)是分子量17.7-18.8kD的蛋白質(zhì)。這一組蛋白質(zhì)不是多種蛋白質(zhì)的混合，而可能是一種蛋白質(zhì)因例如磷酸化、糖鏈的加成、氨基酸置換等各種因素而產(chǎn)生了微妙的變化。
5.通過抗LCCL3抗體染色將上述4中通過ECL試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的膜浸泡于剝離溶液(100mM 2-巰基乙醇、2％SDS、62.5mM Tris-HCl緩沖液(pH 6.8))，在50℃孵育箱中振蕩30分鐘，剝離(除去)抗LCCL抗體。
接著，用該相同的膜通過上述實(shí)施例2中制備的抗LCCL3抗體進(jìn)行染色。染色的步驟與上述4中通過LCCL抗體進(jìn)行的染色完全相同。一次抗體(抗LCCL3抗體)的稀釋率為1000倍。
染色的結(jié)果，以與上述4中所得相同的譜圖檢測(cè)出蛋白質(zhì)。
由上述4和5進(jìn)行的2種抗體進(jìn)行免疫染色的結(jié)果中，檢測(cè)出的蛋白質(zhì)的斑點(diǎn)譜圖相同，由此表明上述實(shí)施例1中制備的抗LCCL抗體和上述實(shí)施例2中制備的抗LCCL3抗體檢測(cè)出相同的蛋白質(zhì)。即由此可知抗LCCL抗體和抗LCCL3抗體是在本發(fā)明的外淋巴瘺檢測(cè)方法中可同等使用的抗體。
并且，制備抗LCCL抗體所用的抗原多肽是序列表SEQ ID NO.1中氨基酸編號(hào)36-50所表示的肽，制備抗LCCL3抗體所用的抗原多肽是氨基酸編號(hào)114-127所表示的肽，由此證實(shí)上述實(shí)施例1-2中，在外淋巴中檢出的約16kD的蛋白質(zhì)是大致包括SEQ ID NO.1中氨基酸編號(hào)36-127所表示的氨基酸序列的、含有Cochlin的N末端片段的蛋白質(zhì)。因此可知，本發(fā)明的外淋巴瘺的檢測(cè)方法中，不只限于本實(shí)施例中制備的抗LCCL抗體、抗LCCL1抗體、抗LCCL2抗體和抗LCCL3抗體，只要是識(shí)別包含在SEQ ID NO.1中氨基酸編號(hào)36-127所表示的氨基酸序列中的抗原決定基的抗體，可以任意制備，選擇使用抗體滴度優(yōu)異的抗體。
實(shí)施例4在上述實(shí)施例1和2中，對(duì)通過本發(fā)明的方法進(jìn)行了外淋巴瘺檢測(cè)的8名疑為外淋巴瘺患者，除采用該方法外，也通過以往采用的外淋巴瘺鑒別方法——鼓室開放術(shù)(以下將其稱為“以往方法”)確認(rèn)了鼓室內(nèi)是否有外淋巴的漏出。另外基于有瘺管的推定，同樣對(duì)所有病例用紗布?jí)浩炔杉曰颊弑救说慕钅ぃ苽涿撍钅ば∑?，將該脫水筋膜小片與內(nèi)耳窗(圓窗、卵圓窗)和前窗小裂疊合，將其用生理組織粘合劑(Beriplast P、Aventis Pharma(株)固定，使瘺管封閉(以下也稱為“瘺管封閉術(shù)”)。外淋巴瘺是急性感音性耳聾中唯一有望通過手術(shù)恢復(fù)聽力的疾病，及早治療可提高治愈率。因此，對(duì)這8名患者的用本發(fā)明的方法的結(jié)果、以往方法的結(jié)果、以及施行瘺管封閉術(shù)是否恢復(fù)聽力進(jìn)行了比較研究。如前所述，疑為外淋巴瘺的患者均是對(duì)試樣采集和研究目的的應(yīng)用進(jìn)行了充分的說明并得到同意的患者。
在瘺管封閉術(shù)前和術(shù)后，按照日本聽覺醫(yī)學(xué)會(huì)制定的聽力檢查方法，用測(cè)聽計(jì)(Rion公司制AA-75或AA-75N)進(jìn)行聽力檢查，使用250Hz、500Hz、1000Hz、2000Hz、4000Hz 5個(gè)頻率的聽力水平的平均值進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)厚生勞動(dòng)省急性高度難聽調(diào)查研究班的聽力恢復(fù)判定基準(zhǔn)，將手術(shù)前和手術(shù)后的檢查值恢復(fù)至與正常耳朵或發(fā)病前相同水平的判定為“治愈”，將5個(gè)頻率的平均值恢復(fù)30分貝(dB)或以上的判定為“明顯恢復(fù)”，恢復(fù)10dB或以上至30dB或以下的判定為“恢復(fù)”，10dB以內(nèi)的判定為“不變”。實(shí)施例1和2中的外淋巴瘺的檢測(cè)結(jié)果已記于表1和2，為與本實(shí)施例對(duì)比，再次記于表3。
表3

該結(jié)果中，在疑為外淋巴瘺的8例中，以往方法的診斷結(jié)果與本發(fā)明方法的結(jié)果一致的有5例，不一致的有3例。
該診斷結(jié)果不同的3例中，沒有外淋巴漏出但本發(fā)明的方法卻為陽性的疑為外淋巴瘺1是高度耳聾、難以通過手術(shù)改善的病例，未見聽力的改善，被診斷為外淋巴瘺。
另外，確認(rèn)有外淋巴漏出，但本發(fā)明的方法卻是陰性的2例中，疑為外淋巴瘺3在鼓室開放術(shù)后1年，聽力進(jìn)一步惡化，由此研究了其它疾病的可能性，結(jié)果通過MRI(核磁共振成像)確診為聽神經(jīng)腫瘤。根據(jù)目前厚生勞動(dòng)省診斷基準(zhǔn)，由生理學(xué)診察和癥狀疑為外淋巴瘺，在鼓室開放術(shù)時(shí)，在手術(shù)過程中通過顯微鏡目視確認(rèn)外淋巴由卵圓窗、圓窗漏出，由此診斷為外淋巴瘺的病例中，也有可能是其它疾病，以及對(duì)該患者用本發(fā)明的方法檢查則為陰性，由此顯示了本發(fā)明的可靠性。
疑為外淋巴瘺4中，已明確外淋巴的漏出，但由于與通常的外淋巴漏出有明顯不同的大量的液體，因此不是外淋巴漏出，可能是為采集本發(fā)明的試樣而注入的生理鹽水未充分除去造成。
疑為外淋巴瘺7中，也有外淋巴瘺的漏出，并且本方法也為陽性，但進(jìn)行瘺管封閉術(shù)也未見改善。這可能是由于由發(fā)病到手術(shù)之間間隔了17天的時(shí)間。即使是外淋巴瘺，在由發(fā)病到手術(shù)之間時(shí)間太長(zhǎng)組織侵襲進(jìn)一步發(fā)展、癥狀嚴(yán)重、高齡、有并發(fā)癥等的情況下，即使進(jìn)行手術(shù)聽力也由可能不會(huì)改善。
8例疑為外淋巴瘺中，本發(fā)明的方法判定為陽性的5例，全部確認(rèn)為外淋巴瘺，本發(fā)明判定為陰性的3例中1例確診為其它疾病，因此可以說本發(fā)明的方法判定為陽性的即是外淋巴瘺。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供簡(jiǎn)便、可靠、且對(duì)患者的侵襲度低的外淋巴瘺的檢測(cè)方法。通過該方法，無需診斷者主觀判斷，可以客觀地進(jìn)行以往不可能的外淋巴瘺的確診，可在臨床現(xiàn)場(chǎng)實(shí)質(zhì)性地鑒別出梅尼埃爾氏病、突發(fā)性耳聾等其它急性感音性耳聾與外淋巴瘺。由此可施行迅速且適當(dāng)?shù)闹委煼桨?，可大幅改善治愈率?br> 本申請(qǐng)要求基于2002年6月27日日本特許申請(qǐng)(特愿2002-187479)的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容作為參考被引入本說明書中。另外，本說明書援引的文獻(xiàn)的內(nèi)容也作為參考引入本說明書中。
序列表<110>日本醫(yī)科大學(xué)<120>外淋巴瘺的檢測(cè)方法<130>A31253A<160>7<210>1<211>550<212>PRT<213>人類<220>
<221>信號(hào)<222>(1)..(24)<400>1Met Ser Ala Ala Trp Ile Pro Ala Leu Gly Leu Gly Val Cys Leu Leu15 10 15Leu Leu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Glu Gly Ala Ala Pro Ile Ala Ile20 25 30Thr Cys Phe Thr Arg Gly Leu Asp Ile Arg Lys Glu Lys Ala Asp Val35 40 45Leu Cys Pro Gly Gly Cys Pro Leu Glu Glu Phe Ser Val Tyr Gly Asn50 55 60Ile Val Tyr Ala Ser Val Ser Ser Ile Cys Gly Ala Ala Val His Arg65 70 75 80Gly Val Ile Ser Asn Ser Gly Gly Pro Val Arg Val Tyr Ser Leu Pro85 90 95Gly Arg Glu Asn Tyr Ser Ser Val Asp Ala Asn Gly Ile Gln Ser Gln
100 105 110Met Leu Ser Arg Trp Ser Ala Ser Phe Thr Val Thr Lys Gly Lys Ser115 120 125Ser Thr Gln Glu Ala Thr Gly Gln Ala Val Ser Thr Ala His Pro Pro130 135 140Thr Gly Lys Arg Leu Lys Lys Thr Pro Glu Lys Lys Thr Gly Asn Lys145 150 155 160Asp Cys Lys Ala Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser Phe Asn Ile165 170 175Gly Gln Arg Arg Phe Asn Leu Gln Lys Asn Phe Val Gly Lys Val Ala180 185 190Leu Met Leu Gly Ile Gly Thr Glu Gly Pro His Val Gly Leu Val Gln195 200 205Ala Ser Glu His Pro Lys Ile Glu Phe Tyr Leu Lys Asn Phe Thr Ser210 215 220Ala Lys Asp Val Leu Phe Ala Ile Lys Glu Val Gly Phe Arg Gly Gly225 230 235 240Asn Ser Asn Thr Gly Lys Ala Leu Lys His Thr Ala Gln Lys Phe Phe245 250 255Thr Val Asp Ala Gly Val Arg Lys Gly Ile Pro Lys Val Val Val Val260 265 270Phe Ile Asp Gly Trp Pro Ser Asp Asp Ile Glu Glu Ala Gly Ile Val275 280 285Ala Arg Glu Phe Gly Val Asn Val Phe Ile Val Ser Val Ala Lys Pro290 295 300Ile Pro Glu Glu Leu Gly Met Val Gln Asp Val Thr Phe Val Asp Lys305 310 315 320
Ala Val Cys Arg Asn Asn Gly Phe Phe Ser Tyr His Met Pro Asn Trp325 330 335Phe Gly Thr Thr Lys Tyr Val Lys Pro Leu Val Gln Lys Leu Cys Thr340 345 350His Glu Gln Met Met Cys Ser Lys Thr Cys Tyr Asn Ser Val Asn Ile355 360 365Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser Ser Ser Val Gly Asp Ser Asn Phe Arg370 375 380Leu Met Leu Glu Phe Val Ser Asn Ile Ala Lys Thr Phe Glu Ile Ser385 390 395 400Asp Ile Gly Ala Lys Ile Ala Ala Val Gln Phe Thr Tyr Asp Gln Arg405 410 415Thr Glu Phe Ser Phe Thr Asp Tyr Ser Thr Lys Glu Asn Val Leu Ala420 425 430Val Ile Arg Asn Ile Arg Tyr Met Ser Gly Gly Thr Ala Thr Gly Asp435 440 445Ala Ile Ser Phe Thr Val Arg Asn Val Phe Gly Pro Ile Arg Glu Ser450 455 460Pro Asn Lys Asn Phe Leu Val Ile Val Thr Asp Gly Gln Ser Tyr Asp465 470 475 480Asp Val Gln Gly Pro Ala Ala Ala Ala His Asp Ala Gly Ile Thr Ile485 490 495Phe Ser Val Gly Val Ala Trp Ala Pro Leu Asp Asp Leu Lys Asp Met500 505 510Ala Ser Lys Pro Lys Glu Ser His Ala Phe Phe Thr Arg Glu Phe Thr515 520 525Gly Leu Glu Pro Ile Val Ser Asp Val Ile Arg Gly Ile Cys Arg Asp
530 535 540Phe Leu Glu Ser Gln Gln545 550<210>2<211>15<212>PRT<213>人類<400>2Thr Arg Gly Leu Asp Ile Arg Lys Glu Lys Ala Asp Val Leu Cys1 5 10 15<210>3<211>15<212>PRT<213>人類<400>3Ala Val Ser Thr Ala His Pro Ala Thr Gly Lys Arg Leu Lys Lys1 5 10 15<210>4<211>19<212>PRT<213>人類<400>4Lys Ala Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser Phe Asn Ile Gly Gln1 5 10 15
Arg Arg Phe<210>5<211>21<212>PRT<213>人類<400>5Gly Asn Ile Val Tyr Ala Ser Val Ser Ser Ile Cys Gly Ala Ala Val1 5 10 15His Arg Gly Val Ile20<210>6<211>17<212>PRT<213>人類<400>6Leu Pro Gly Arg Glu Asn Tyr Ser Ser Val Asp Ala Asn Gly Ile Gln1 5 10 15Ser<210>7<211>14<212>PRT<213>人類<400>7Leu Ser Arg Trp Ser Ala Ser Phe Thr Val Thr Lys Gly Lys1 5 10
權(quán)利要求
1.外淋巴瘺的檢測(cè)方法，該方法包括檢測(cè)存在于中耳的體液中是否存在Cochlin。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法是檢測(cè)存在于被疑為罹患外淋巴瘺患者的中耳的體液中是否存在Cochlin，以檢測(cè)出的Cochlin的存在作為外淋巴瘺可能性的指標(biāo)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中檢測(cè)Cochlin是否存在是通過檢測(cè)是否存在含有Cochlin的N末端片段的蛋白質(zhì)而進(jìn)行的。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中檢測(cè)Cochlin是否存是通過免疫學(xué)方法進(jìn)行的。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中免疫學(xué)方法使用抗Cochlin N末端片段抗體進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其中免疫學(xué)方法使用識(shí)別序列表SEQ ID NO.1的氨基酸編號(hào)36-127所表示的氨基酸序列中所含有的抗原決定基的抗體進(jìn)行。
7.如權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中免疫學(xué)方法使用抗Cochlin N末端片段抗體進(jìn)行，所述抗Cochlin N末端片段抗體的特征在于識(shí)別包含在序列表SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.7中記載的氨基酸序列所表示的多肽中的抗原決定基。
8.抗Cochlin N末端片段抗體，其特征在于識(shí)別序列表SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7中記載的氨基酸序列所表示的多肽中所含有的抗原決定基。
9.外淋巴瘺檢測(cè)試劑，該試劑含有抗Cochlin抗體。
10.如權(quán)利要求9所述的外淋巴瘺檢測(cè)試劑，其中所述抗Cochlin抗體是抗Cochlin N末端片段抗體。
11.如權(quán)利要求9或10所述的外淋巴瘺檢測(cè)試劑，其中所述抗Cochlin抗體是識(shí)別序列表SEQ ID NO.1的氨基酸編號(hào)36-127所表示的氨基酸序列中所含有的抗原決定基的抗體。
12.如權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)所述的外淋巴瘺檢測(cè)試劑，其中所述抗Cochlin抗體是抗Cochlin N末端片段抗體，該抗Cochlin N末端片段抗體的特征在于識(shí)別序列表的SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7中記載的氨基酸序列所表示的多肽中所含有的抗原決定基。
13.外淋巴瘺檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有如權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的外淋巴瘺檢測(cè)試劑。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供簡(jiǎn)便、可靠、且對(duì)患者的侵襲度低的外淋巴瘺的檢測(cè)方法。本發(fā)明提供外淋巴瘺的檢測(cè)方法，該方法包括檢測(cè)存在于中耳的體液中是否存在Cochlin。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1665841SQ0381517
公開日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2003年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月27日
發(fā)明者池園哲郎, 八木聰明, 大森彬 申請(qǐng)人:學(xué)校法人日本醫(yī)科大學(xué)