專利名稱：：通過包含載體肽和活性劑的雙特異性抗體和半抗原構(gòu)建體的方式進(jìn)行藥物前靶向定位的制作方法本申請是1999年8月23日申請的美國專利No.09/382,186和2001年4月3日申請的美國專利No.09/823,746的后續(xù)申請，所述兩個申請是1999年6月22日申請的美國專利No.09/337,756的后續(xù)申請，所述文獻(xiàn)在此全文引作參考。
背景技術(shù)：
：發(fā)明領(lǐng)域。本發(fā)明涉及治療用途的免疫試劑，例如，放射免疫治療(RAIT)，和診斷用途，例如，放射免疫檢測(RAIT)和磁共振成像(MRI)。更具體地，本發(fā)明涉及雙特異性抗體(bsAb)和雙特異性抗體片段(bsFab)，其中所述抗體或抗體片段有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂。另外，本發(fā)明涉及針對特異免疫原的單克隆抗體、人源化和嵌合的單克隆雙特異性抗體和抗體片段，其中所述抗體或抗體片段有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂，還涉及編碼所述抗體和抗體片段的DNAs、和表達(dá)所述DNAs的載體。先前的臨時申請U.S.S.N.60/090,142和U.S.S.N.60/104,156公開了本發(fā)明的一部分，在此全文引作參考。相關(guān)技術(shù)癌癥治療和診斷方面的進(jìn)展包括將抗體或抗體片段直接用于疾病組織，其中抗體或抗體片段能夠?qū)⒃\斷劑或治療劑靶向定位于疾病位點(diǎn)。正在研究的該方法的一個進(jìn)展，包括bsAbs的應(yīng)用，該bsAbs有至少一個特異性結(jié)合疾病靶組織的臂和至少另外一個特異性結(jié)合低分子量半抗原的臂。在該方法中，給予一種bsAb，使之定位于靶組織，并清除正常組織。一段時間之后，給予放射標(biāo)記的低分子量半抗原，其可以被bsAb的第二個特異性識別，同樣也使其定位于原來的靶組織。雖然低分子量半抗原與bsAbs聯(lián)合使用具有多種特征成像和治療用途，但對于潛在的應(yīng)用的來說，制備單個的bsAbs幾乎是不可能的。而且，應(yīng)用bsAb/低分子量半抗原系統(tǒng)還必須克服另外幾個問題。第一個是，bsAb的臂與低分子量半抗原的結(jié)合必須具有很高的結(jié)合親和力，因?yàn)轭A(yù)先設(shè)計(jì)的低分子量半抗原如果沒有被bsAb結(jié)合的話，會快速從活組織中清除出去。第二個是，非-bsAb結(jié)合的低分子量半抗原事實(shí)上需要快速從活組織中清除出去，以避免被非靶組織吸收并潴留。第三個是，在使用bsAb的方案中，檢測和/或治療劑在bsAb方案應(yīng)用中必須與低分子量半抗原保持相關(guān)。關(guān)于bsAbs的一個令人感興趣的進(jìn)展是，使用具有合適雙特異性的Abs直接將螯合劑和金屬螯合絡(luò)合物介導(dǎo)到腫瘤。所使用的螯合劑和金屬螯合絡(luò)合物一般具有放射性，使用放射性核素，如鈷-57(Goodwin等，美國專利No.4,863,713)，銦-111(Barbet等，美國專利No.5,256,395和No.5,274,076，Goodwin等，J.Nucl.Med.，331366-1372(1992)和Kranenborg等，CancerRes(suppl.)，555864s-5867s(1995)和Cancer(suppl.)802390-2397(1997)))，和鎵-68(Boden等，BioconjugateChem.，6373-379，(1995)和Schuhmacher等，CancerRes.，55115-123(1995))進(jìn)行放射免疫成像。因?yàn)锳bs抗體是針對螯合劑和金屬螯合絡(luò)合物的，因而抗體對其所針對的絡(luò)合物具有非常顯著的特異性。事實(shí)上，Boden等的bsAbs對于螯合劑和金屬-螯合絡(luò)合物對映混合物的單個對映體具有特異性。高特異性經(jīng)證實(shí)在一個方面是不利的，也就是，其中所使用的核素不能輕易替換為其它核素，如用其它可獲得的試劑替換進(jìn)行放射免疫治療(RAIT)的釔-90和鉍-213和進(jìn)行MRI的釓。因此在第二步靶向定位過程中采用了碘-131，一種非金屬，來進(jìn)行RAIT，其中使用了I-131標(biāo)記的銦-金屬-螯合絡(luò)合物。該方法的第二個缺點(diǎn)是，需要為每種用于診斷和治療的試劑生產(chǎn)抗體。在癌成像和治療方面，前靶向定位(Pretargeting)方法受到了相當(dāng)多的注意。不同于直接靶向定位的將一種效應(yīng)分子(如一種放射性核素或一種與小的載體連接的藥物)直接連接到靶向試劑，在前靶向定位系統(tǒng)中，效應(yīng)分子是在靶向試劑之后一段時間才施用。這段時間可以使靶向試劑定位于腫瘤病灶，和更重要的是，易于從身體內(nèi)清除。因?yàn)榇蠖喟邢蛟噭┦强贵w蛋白，因此與較小的效應(yīng)分子(通常幾分鐘)相比，一般從身體中清除的更慢(通常幾天)。在包括治療性核素的直接靶向系統(tǒng)中，身體，特別是極易受損害的紅骨髓，在靶向試劑在腫瘤中慢慢到達(dá)最大水平并從身體清除期間，全部暴露在射線之下。在前靶向定位系統(tǒng)中，放射性核素通常結(jié)合到一種小的“效應(yīng)”分子如螯合劑或肽上，這些小的效應(yīng)分子可以非?？斓貜纳眢w清除出去，因此將正常組織的暴露時間減至最小程度。而且，因?yàn)樾》肿幽軌蚩焖俅┰侥[瘤血管并結(jié)合到初級靶向試劑，因此腫瘤能夠快速到達(dá)核素吸收最大量。此外，較小的尺寸有助于在腫瘤中更加均勻的分布。前靶向定位方法有多種不同的實(shí)施方案，但大多包括親合素/鏈霉抗生物素蛋白-生物素識別系統(tǒng)或可被腫瘤抗原和效應(yīng)分子共同識別的雙特異性抗體。親合素/鏈霉抗生物素蛋白系統(tǒng)是高度可變的，并已經(jīng)以不同方式被應(yīng)用?？贵w能夠與鏈霉抗生物素蛋白或生物素相偶聯(lián)，用作初級靶向試劑。一段時間以后，施用效應(yīng)分子，其分別與生物素或親合素/鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合。另外一種方式有3個步驟，首先靶向定位生物素-結(jié)合抗體，然后橋接鏈霉抗生物素蛋白/親合素，最后給予生物素-結(jié)合效應(yīng)物。根據(jù)所使用的效應(yīng)物，這些系統(tǒng)可以很容易地進(jìn)行改變，只要效應(yīng)物和靶向試劑能夠與所使用的生物素或鏈霉抗生物素蛋白/親合素結(jié)構(gòu)相偶聯(lián)。因?yàn)榫哂锌勺冃赃m用于多種靶向位置，并在親合素/鏈霉抗生物素蛋白和生物素之間具有高度結(jié)合親和力，因此該類前靶向定位系統(tǒng)比其它系統(tǒng)具有更大的優(yōu)點(diǎn)。然而，生物素和鏈霉抗生物素是外源蛋白，因而是免疫原性的，在臨床應(yīng)用中這限制了它們的施用次數(shù)。從這個角度來說，bsAbs具有能夠作為相對非-免疫原性的人源化的蛋白來使用的優(yōu)點(diǎn)。雖然bsAb的結(jié)合親和力(通常為10-9到10-10M)比不上鏈霉抗生物素蛋白/親合素-生物素親和的非常高的親和力(～10-15M)，這兩種前靶向定位系統(tǒng)都依賴于初級靶向試劑的結(jié)合親和力，因此具有較高親和力的鏈霉抗生物素蛋白/親合素-生物素系統(tǒng)并不比bsAb前靶向定位系統(tǒng)更具有實(shí)際上的優(yōu)點(diǎn)。然而，多數(shù)bsAbs僅有一個用于結(jié)合初級靶的臂，而鏈霉抗生物素蛋白/親合素-生物素前靶向定位系統(tǒng)一般使用具有兩個臂的完整IgG，兩個臂均用于結(jié)合靶，這加強(qiáng)了與靶的結(jié)合。通過使用一種二價肽，加強(qiáng)了其親和力，與單價肽相比，能夠大大提高肽結(jié)合到靶位點(diǎn)的能力。因此，這兩種系統(tǒng)均能夠提供較高的具有合適潴留的靶向定位比率。使用bsAb的前靶向定位還需要抗體有一個識別效應(yīng)分子的臂。迄今報道的多數(shù)放射性核素靶向定位依賴抗體對金屬螯合絡(luò)合物的識別，如抗體對裝載了銦的DTPA的識別或抗體對其它螯合劑的識別。因?yàn)榭贵w對特定金屬螯合絡(luò)合物通常是高度選擇性的，因此需要構(gòu)建與特定效應(yīng)抗體相適應(yīng)的新的bsAbs。如果抗體對效應(yīng)物不是特異性的，而是與其它成分反應(yīng)，則不需要所述過程。這樣的話，可以制造多個效應(yīng)物，只要它們包含抗體識別成分。我們發(fā)展了以前Janevik-Ivanovska等公開的前靶向定位系統(tǒng)，在所述文獻(xiàn)中將一種直接識別組胺衍生物、組胺-琥珀酰-甘氨酰(HSG)的抗體作為識別系統(tǒng)，其中可以制備多個效應(yīng)物成分。已經(jīng)報道了使用放射性碘和錸標(biāo)記的包含HSG的二價肽，所獲得的卓越的前靶向定位效果。在本申請中，我們擴(kuò)展了該系統(tǒng)，使之包括適用于放射標(biāo)記90Y、111In、177Lu的肽，和可選擇的99mTc-結(jié)合肽。因此，需要一種這樣的免疫試劑，其能夠被直接用于病灶組織并能夠與隨后施用的靶向診斷或治療結(jié)合物結(jié)合，同時需要一種靈活的系統(tǒng)，不需要對雙特異性或多重特異性抗體進(jìn)行改變，即可容納不同的診斷和治療劑。發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是，提供一種多重特異性的抗體或抗體片段，其有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂，其中靶向構(gòu)建體能夠根據(jù)多種不同的診斷和治療應(yīng)用而被加以修飾。本發(fā)明的另外一個目的是，提供聯(lián)合使用多重特異性抗體和靶向構(gòu)建體的前靶向定位診斷和治療方法，提供制造多重特異性的方法，和該方法中所使用的試劑盒。在完成所述目的過程中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)針對靶向構(gòu)建體的多重特異性Abs是有優(yōu)勢的，其能夠攜帶一個或多個診斷和治療劑。通過使用該項(xiàng)技術(shù)，可以改變螯合劑、金屬螯合絡(luò)合物、治療劑或診斷劑的特性，以適應(yīng)不同的用途，而不必為每個新用途準(zhǔn)備新的多重特異性Abs。而且，在該過程中，兩種或多種不同的螯合劑、金屬螯合絡(luò)合物、診斷或治療劑可以與本發(fā)明多重特異性Ab一起使用。發(fā)明概述本發(fā)明涉及多重特異性或雙特異性抗體或抗體片段，其至少有一個特異性結(jié)合靶組織的臂和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂。提供了一種具有通式X-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH2(SEQIDNO1)的化合物，其中該化合物包括位于X或Y位置上的硬酸陽離子螯合劑，和位于剩下的X或Y位置上的軟酸陽離子螯合劑。硬酸陽離子螯合劑可包括羧基或胺基基團(tuán)，還可包括如NOTA、DOTA、DTPA、和TETA的螯合劑。軟酸陽離子螯合劑可包括硫醇基團(tuán)，還包括如Tscg-Cys和Tsca-Cys的螯合劑。該化合物的一個優(yōu)選實(shí)施方案是DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)，也被稱作IMP245。所述化合物中，將硬酸陽離子螯合劑和軟酸陽離子螯合劑的位置進(jìn)行交換就構(gòu)成了另外一個實(shí)施方案，即(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)?；衔镞€可以包括結(jié)合到不同螯合部分上的陽離子。例如，硬酸陽離子可以包括IIa和IIIa族的金屬陽離子，其通常結(jié)合到硬酸螯合劑中。結(jié)合到軟酸螯合劑上的軟酸陽離子包括過渡金屬、鑭系元素、錒系元素、和/或Bi。這樣的軟酸陽離子非窮盡的例子包括Tc、Re、和Bi。本發(fā)明還提供了一種靶向構(gòu)建體，其包括X-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH-R(SEQIDNO1)。在此，硬酸陽離子螯合劑即可位于X，也可位于Y，同時軟酸陽離子螯合劑位于剩下的X或Y。靶向構(gòu)建體還包括將化合物與治療或診斷劑或酶“R”連接到一起的接頭。該接頭至少有一個氨基酸，用于R基團(tuán)與化合物的連接。治療劑的例子包括藥物、藥物前體(如表柔比星葡糖苷酸，CPT-11，依托泊甙葡糖苷酸，柔紅霉素葡糖苷酸和阿霉素葡糖苷酸)或毒素(如蓖麻毒素，相思豆毒蛋白，核糖核酸酶，DNaseI，葡萄球菌(Staphylococcal)腸毒素-A，美洲商陸抗病毒蛋白，gelonin，白喉毒素，假單胞桿菌屬(Pseudomonas)外毒素，和假單胞菌屬內(nèi)毒素)。另外，治療劑的例子包括阿霉素、SN-38、氨甲碟呤、6-巰基嘌呤和/或依托泊甙磷酸鹽。診斷劑包括核素、一種或多種用于光促治療的試劑(如光敏劑，如苯卟啉一元酸環(huán)A(BPD-MA)、本紅紫素錫(SnET2)、磺化酞菁鋁(AlSPc)和德卟啉(texaphyrin)镥(Lutex)、對照試劑和用于磁共振成像(MRI)和計(jì)算機(jī)化體層攝影(CT)的影像增強(qiáng)試劑。R基團(tuán)可以是酶，其能夠?qū)形稽c(diǎn)上的藥物前體轉(zhuǎn)化為藥物；或能夠?qū)⑷コ拘缘乃幬镏虚g體復(fù)原為毒性形式，提高所述藥物在靶位點(diǎn)的毒性。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療、診斷和/或鑒定患者病灶組織的方法，包含(A)給患者施用雙特異性抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂；(B)可選擇地，給患者施用清除組合物，并使組合物將沒有定位的抗體或抗體片段從循環(huán)中清除出去。(C)給患者施用包含載體部分的第一靶向構(gòu)建體，其中載體部分包含或攜帶至少一個可被雙特異性抗體或抗體片段的至少另外一個臂識別的表位，和一個或多個已綴合的治療或診斷劑、或酶；和(D)當(dāng)靶向構(gòu)建體包含酶時，給患者進(jìn)一步施用1)藥物前體，當(dāng)酶能夠在靶位點(diǎn)將藥物前體轉(zhuǎn)化為藥物的情況下；或2)在患者體內(nèi)能夠被解毒，形成低毒性中間體的藥物，當(dāng)酶能夠?qū)⒔舛镜闹虚g體復(fù)原為毒性形式，并從而提高藥物在靶位點(diǎn)的毒性的情況下，或3)藥物前體，其在患者體內(nèi)經(jīng)過自然過程被活化，并通過轉(zhuǎn)化為一種低毒性中間體的方式被解毒，當(dāng)酶能夠?qū)⒔舛镜闹虚g體重新轉(zhuǎn)換為毒性形式，并從而提高藥物在靶位點(diǎn)的毒性的情況下，或4)包含載體部分的第二靶向構(gòu)建體，其中載體部分包含或攜帶至少一個可被雙特異性抗體或抗體片段的至少另外一個臂識別的表位，當(dāng)酶能夠在靶位點(diǎn)將藥物前體轉(zhuǎn)化為藥物的情況下。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療或鑒定患者病灶組織的試劑盒，其包括(A)雙特異性抗體或抗體片段，其具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂；(B)包含載體部分的第一靶向構(gòu)建體，其中載體部分包含或攜帶至少一個可被雙特異性抗體或抗體片段的至少另外一個臂識別的表位，和一個或多個綴合的治療或診斷劑、或酶；和(C)可選擇地，一種清除組合物，用于清除沒有定位的抗體和抗體片段；和(D)可選擇地，當(dāng)?shù)谝话邢驑?gòu)建體包含一種酶時，1)藥物前體，當(dāng)酶能夠在靶位點(diǎn)將藥物前體轉(zhuǎn)化為藥物的情況下；或2)在患者體內(nèi)能夠被解毒，形成低毒性中間體的藥物，當(dāng)酶能夠?qū)⒔舛镜闹虚g體復(fù)原為毒性形式，并從而提高藥物在靶位點(diǎn)的毒性的情況下，或3)藥物前體，其在患者體內(nèi)經(jīng)過自然過程被活化，并通過轉(zhuǎn)化為一種低毒性中間體的方式被解毒，當(dāng)酶能夠?qū)⒔舛镜闹虚g體重新轉(zhuǎn)換為毒性形式，并從而提高藥物在靶位點(diǎn)的毒性的情況下，或4)包含載體部分的第二靶向構(gòu)建體，其中載體部分包含或攜帶至少一個可被雙特異性抗體或抗體片段的至少另外一個臂識別的表位，當(dāng)酶能夠在靶位點(diǎn)將藥物前體轉(zhuǎn)化為藥物的情況下。本發(fā)明的另一個實(shí)施方案是，提供編碼所述抗體或抗體片段的DNA構(gòu)建體。尤其是能夠產(chǎn)生可變區(qū)域的DNA構(gòu)建體，所述可變區(qū)域能夠提供與靶向構(gòu)建體和病灶組織反應(yīng)的有利特性。同時本發(fā)明在該方面還提供了一種重組DNA構(gòu)建體，其包含能夠在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生雙特異性抗體或抗體片段的表達(dá)組件，所述抗體或抗體片段有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂，其中該重組DNA構(gòu)建體包含，在宿主細(xì)胞中起作用的從5’到3’方向轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)、在宿主細(xì)胞中起作用的翻譯起始調(diào)控區(qū)、編碼雙特異性抗體或抗體片段的DNA序列、和在宿主細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄、翻譯終止調(diào)控區(qū)，其中雙特異性抗體或抗體片段受調(diào)控區(qū)的控制。本發(fā)明另外一個實(shí)施方案提供了通過重組技術(shù)制備抗體或抗體片段的方法。同時本發(fā)明在該方面還提供了制備具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂的雙特異性抗體或抗體片段的方法，其包括(A)將前面所述的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細(xì)胞；(B)培養(yǎng)細(xì)胞并分離抗體或抗體片段。在本發(fā)明的另外一個實(shí)施方案中，提供了制備雙特異性融合蛋白的方法，所述融合蛋白具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂，所述方法包括(1)(A)將重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細(xì)胞，該重組DNA構(gòu)建體包含能夠在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生雙特異性融合蛋白片段的表達(dá)組件，其中構(gòu)建體還包含，在宿主細(xì)胞中起作用的從5’到3’方向轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)、在宿主細(xì)胞中起作用的翻譯起始調(diào)控區(qū)、編碼與免疫球蛋白輕鏈抗體片段連接的scFv的DNA序列、和在宿主細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄、翻譯終止調(diào)控區(qū)，其中雙特異性融合蛋白片段受調(diào)控區(qū)的控制；(B)將重組DNA構(gòu)建體共轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主細(xì)胞，該重組DNA構(gòu)建體包含能夠在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生Fd片段的表達(dá)組件，其中Fd片段與(A)中的免疫球蛋白輕鏈抗體片段互補(bǔ)，并且當(dāng)與輕鏈抗體片段連接時形成Fab片段，該Fab片段上的結(jié)合位點(diǎn)對于靶組織來說是特異性的，其中構(gòu)建體還包含，在宿主細(xì)胞中起作用的從5’到3’方向轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)、在宿主細(xì)胞中起作用的翻譯起始調(diào)控區(qū)、編碼Fd片段的DNA序列、和在宿主細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄、翻譯終止調(diào)控區(qū)，其中Fd片段受調(diào)控區(qū)的控制；(C)培養(yǎng)細(xì)胞并分離雙特異性融合蛋白，或(2)(A)將重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)到第一宿主細(xì)胞，該重組DNA構(gòu)建體包含能夠在第一宿主細(xì)胞中產(chǎn)生雙特異性融合蛋白片段的表達(dá)組件，其中構(gòu)建體還包含，在第一宿主細(xì)胞中起作用的從5’到3’方向轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)、在第一宿主細(xì)胞中起作用的翻譯起始調(diào)控區(qū)、編碼與輕鏈抗體片段連接的scFv的DNA序列、和在第一宿主細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄、翻譯終止調(diào)控區(qū)，其中雙特異性融合蛋白片段受調(diào)控區(qū)的控制；(B)將重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)到第二宿主細(xì)胞，該重組DNA構(gòu)建體包含能夠在第二宿主細(xì)胞中產(chǎn)生Fd片段的表達(dá)組件，其中Fd片段與(2)(A)中的輕鏈抗體片段互補(bǔ)，并且當(dāng)與輕鏈抗體片段連接時形成Fab片段，該Fab片段上的結(jié)合位點(diǎn)對于靶組織來說是特異性的，其中構(gòu)建體還包含，在第二宿主細(xì)胞中起作用的從5’到3’方向轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控區(qū)、在第二宿主細(xì)胞中起作用的翻譯起始調(diào)控區(qū)、編碼Fd片段的DNA序列、和在第二宿主細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄、翻譯終止調(diào)控區(qū)，其中Fd片段受調(diào)控區(qū)的控制；(C)培養(yǎng)第一和第二宿主細(xì)胞；(D)選擇性分離雙特異性融合蛋白片段和Fd片段；和(E)將片段進(jìn)行連接，產(chǎn)生雙特異性融合蛋白，并分離雙特異性融合蛋白?？墒褂枚喾N宿主細(xì)胞來制備雙特異性抗體或抗體片段，包括但不限于哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，使用了哺乳動物受精卵，經(jīng)重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生了能夠生產(chǎn)雙特異性抗體或抗體片段的轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明還嘗試提供的雙特異性抗體或抗體片段，其中所述抗體和抗體片段具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂，所述靶向構(gòu)建體可以根據(jù)不同的診斷和治療用途而加以修飾。本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及將本發(fā)明抗體或抗體片段用于光動力學(xué)治療。本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及將本發(fā)明抗體或抗體片段用于放射免疫成像中的正電子發(fā)射體層攝影(PET)。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案涉及將本發(fā)明抗體或抗體片段用于放射免疫成像中的單光子發(fā)射。本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及將本發(fā)明抗體或抗體片段用于磁共振成像(MRI)。本發(fā)明進(jìn)一步實(shí)施方案涉及將本發(fā)明抗體或抗體片段用于X-射線、計(jì)算機(jī)化體層攝影(CT)或超聲波成像。本發(fā)明進(jìn)一步實(shí)施方案涉及將本發(fā)明抗體或抗體片段用于手術(shù)中的、內(nèi)窺鏡的、或血管內(nèi)檢測和/或治療。本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及將本發(fā)明的抗體或抗體片段用于硼中子捕獲治療(BNC7)。本發(fā)明進(jìn)一步實(shí)施方案涉及將本發(fā)明抗體或抗體片段用于診斷或治療病灶組織(例如癌癥、感染、炎癥、血塊、動脈粥樣硬化、梗死)、正常組織(如脾、甲狀旁腺、胸腺、骨髓)、異位組織(如子宮內(nèi)膜異位癥)、和病原體。此外，本發(fā)明提供了前靶向定位診斷和治療方法，其中聯(lián)合使用雙特異性抗體和以下靶向構(gòu)建體(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)以及制備雙特異性的方法，和用于該方法的試劑盒。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)針對靶向構(gòu)建體的bsAbs是有優(yōu)勢的，其能夠攜帶一個或多個診斷或治療劑。通過使用該技術(shù)，可以改變螯合劑、金屬螯合絡(luò)合物、治療劑或診斷劑的特性，以適應(yīng)不同的用途，而不必為每個用途準(zhǔn)備新的bsAbs。而且，通過該方法兩種或多種不同的螯合劑、金屬螯合絡(luò)合物或治療劑可以與本發(fā)明的bsAb一起使用。本發(fā)明涉及治療或鑒定受試者病灶組織的方法，其包括(A)給所述受試者施用雙特異性抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合包含至少兩個HSG半抗原的靶向構(gòu)建體的臂；(B)可選擇地，給所述受試者施用清除組合物，并使所述組合物將沒有定位的抗體或抗體片段從循環(huán)中清除出去。(C)給所述受試者施用包含載體部分的靶向構(gòu)建體，其中載體部分包含或攜帶至少兩個HSG半抗原，和至少一個螯合劑，并可以包含至少一個診斷和/或治療的陽離子，和/或一個或多個螯合的或化學(xué)結(jié)合的治療或診斷劑，或酶；和(D)當(dāng)所述靶向構(gòu)建體包含酶時，給受試者進(jìn)一步施用1)藥物前體，當(dāng)所述酶能夠在靶位點(diǎn)將藥物前體轉(zhuǎn)化為藥物的情況下；或2)在所述受試者體內(nèi)能夠被解毒，形成低毒性中間體的藥物，當(dāng)所述酶能夠?qū)⒔舛镜闹虚g體復(fù)原為毒性形式，并從而提高藥物在靶位點(diǎn)的毒性的情況下，或3)藥物前體，其在受試者體內(nèi)經(jīng)過自然過程被活化，并通過轉(zhuǎn)化為一種低毒性中間體的方式被解毒，當(dāng)酶能夠?qū)⒔舛镜闹虚g體重新轉(zhuǎn)換為毒性形式，并從而提高藥物在靶位點(diǎn)的毒性的情況下。本發(fā)明還涉及檢測或治療哺乳動物靶細(xì)胞、組織或病原體的方法，其包括施用有效量的雙特異性抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂；其中所述至少一個臂能夠結(jié)合到靶細(xì)胞、組織、或病原體或由其產(chǎn)生的或與其相關(guān)的分子上的互補(bǔ)結(jié)合部分；和施用選自下列的靶向構(gòu)建體(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)本發(fā)明還涉及治療或鑒定受試者病灶組織的方法，包含給所述受試者施用雙特異性抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂；可選擇地，給所述受試者施用清除組合物，并使所述組合物將沒有定位的抗體或抗體片段從循環(huán)中清除出去；和給所述受試者施用選自下列的靶向構(gòu)建體(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)本發(fā)明還涉及用于治療或鑒定受試者病灶組織的試劑盒，包含(A)一種雙特異性抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂，其中所述構(gòu)建體選自(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)(B)包含載體部分的靶向構(gòu)建體，其中載體部分包含或攜帶至少一個能夠被所述雙特異性抗體或抗體片段的所述至少另外一個臂識別的表位，和一個或多個綴合的治療或診斷劑、或酶；和(C)可選擇地，清除組合物，用于清除沒有定位的抗體和抗體片段；和(D)可選擇地，當(dāng)所述第一靶向構(gòu)建體包含一種酶時1)藥物前體，當(dāng)所述酶能夠在靶位點(diǎn)將所述藥物前體轉(zhuǎn)化為藥物的情況下；或2)在所述受試者體內(nèi)能夠被解毒，形成低毒性中間體的藥物，當(dāng)所述酶能夠?qū)⑺鼋舛镜闹虚g體復(fù)原為毒性形式，并從而提高所述藥物在靶位點(diǎn)的毒性的情況下，或3)藥物前體，其在所述受試者體內(nèi)經(jīng)過自然過程被活化，并通過轉(zhuǎn)化為一種低毒性中間體的方式被解毒，在所述酶能夠?qū)⑺鼋舛镜闹虚g體重新轉(zhuǎn)換為毒性形式，并從而提高所述藥物在靶位點(diǎn)的毒性的情況下。本發(fā)明還涉及選自下列的靶向構(gòu)建體(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)本發(fā)明還涉及篩選靶向構(gòu)建體的方法，其包括將所述靶向構(gòu)建體與雙特異性抗體或抗體片段接觸，形成混合物，其中所述抗體或抗體片段具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合所述靶向構(gòu)建體的臂；其中所述至少一個臂能夠結(jié)合到靶細(xì)胞、組織、或病原體或由其產(chǎn)生的或與其相關(guān)的分子上的互補(bǔ)結(jié)合部分；和可選擇地，孵育所述混合物；和分析所述混合物。本發(fā)明還涉及哺乳動物正常組織成像的方法，包含施用有效量的雙特異性抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂；其中所述至少一個臂能夠結(jié)合到靶細(xì)胞、組織或由其產(chǎn)生的或與其相關(guān)的分子上的互補(bǔ)結(jié)合部分；和施用選自下列的靶向構(gòu)建體(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)本發(fā)明還涉及受試者病灶組織的手術(shù)中鑒定或治療的方法，包含施用有效量的雙特異性抗體或抗體片段，其中所述抗體和抗體片段具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂；其中所述至少一個臂能夠結(jié)合到靶細(xì)胞、組織或病原體或由其產(chǎn)生的或與其相關(guān)的分子上的互補(bǔ)結(jié)合部分；和施用選自下列的靶向構(gòu)建體(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)本發(fā)明還涉及受試者病灶組織的內(nèi)鏡鑒定或治療的方法，包含施用有效量的雙特異性抗體或抗體片段，其中所述抗體和抗體片段具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂；其中所述至少一個臂能夠結(jié)合到靶細(xì)胞、組織或病原體或由其產(chǎn)生的或與其相關(guān)的分子上的互補(bǔ)結(jié)合部分；和施用選自下列的靶向構(gòu)建體(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)本發(fā)明還涉及受試者病灶組織的血管內(nèi)鑒定或治療的方法，包含施用有效量的雙特異性抗體或抗體片段，其中所述抗體和抗體片段具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂；其中所述至少一個臂能夠結(jié)合到靶細(xì)胞、組織或病原體或由其產(chǎn)生的或與其相關(guān)的分子上的互補(bǔ)結(jié)合部分；和施用選自下列的靶向構(gòu)建體(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)本發(fā)明的其它方面、特征和優(yōu)點(diǎn)將在下面的說明書中加以描述，在一定程度上來說所述內(nèi)容在說明書中是顯而易見的，或在實(shí)施本發(fā)明過程中可以體會到。本發(fā)明的實(shí)施方式和優(yōu)點(diǎn)可以通過本發(fā)明的手段和組合，尤其是權(quán)利要求書中提到的，來實(shí)現(xiàn)并獲得。附圖簡述附圖1圖解說明不同的Abs和bsAbs。附圖2提供了純化的hMN-14Fab-734scFv的SDS-PAGE分析結(jié)果。聚丙烯酰胺凝膠的濃度為4-20％，在非還原條件(泳道1和2)和還原條件下(泳道3和4)進(jìn)行，bsAb(泳道2和4)和hMN-14IgG(泳道1和3)的用量為3μg。附圖3圖解說明兩種雙特異性融合蛋白。附圖4圖示用于制備hMN-14Fab-734scFv雙特異性融合蛋白的DNA構(gòu)建體。附圖5圖示用于制備hMN-14Fab-734scFv雙特異性融合蛋白的DNA構(gòu)建體。附圖6顯示hMN-14×m679bsMAb與111In-標(biāo)記的IMP-241二價HSG-DOTA肽之間的結(jié)合特性。方格A只有111In-IMP-241的SE-HPLC結(jié)果；方格B111In-IMP-241與hMN-14×m679bsMAb混合后的SE-HPLC結(jié)果；方格C將111In-IMP-241加入含有hMN-14×679bsMAb和過量CEA的混合物后的結(jié)果。色譜結(jié)果表明111In-IMP-241與bsMAb(B)與bsMAb/CEA復(fù)合體(C)相關(guān)。附圖7顯示125I-mMu-9×m679F(ab′)2bsMAb和111In-IMP-241在GW-39腫瘤模型裸小鼠中的清除率。小鼠靜脈注射放射標(biāo)記的bsMAb，48小時之后靜脈給予放射標(biāo)記的肽。數(shù)值表示每克注射劑量的平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差的百分?jǐn)?shù)(每次時間間隔n＝5)。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說明I.概述本發(fā)明提供了一種雙特異性抗體(bsAb)或抗體片段(bsFab)，其具有至少一個可與靶組織反應(yīng)的臂，和至少另外一個可與靶向構(gòu)建體反應(yīng)的臂。靶向構(gòu)建體包括肽，所述肽具有至少兩個可識別半抗原單元?？勺R別半抗原的例子包括但不限于，組胺琥珀酰甘氨酰(HSG)和熒光素異硫氰酸鹽。靶向構(gòu)建體可以與多種用于治療或鑒定病灶組織的試劑綴合。能夠綴合的試劑包括但不限于，螯合劑、金屬螯合絡(luò)合物、藥物、毒素(如蓖麻毒素、相思豆毒蛋白，核糖核酸酶(如RNase)，DNaseI，葡萄球菌(Staphylococcal)腸毒素-A，美洲商陸抗病毒蛋白，gelonin，白喉毒素，假單胞桿菌屬(Pseudomonas)外毒素，和假單胞菌屬內(nèi)毒素)和其它效應(yīng)分子。另外，活化藥物前體或提高藥物靶特異性毒性的酶也可以綴合到靶向構(gòu)建體上。因此，使用可與靶向構(gòu)建體反應(yīng)的bsAb可以進(jìn)行多種治療和診斷應(yīng)用，而不必為每個應(yīng)用準(zhǔn)備新的bsAb。雙特異性抗體(bsAb)前靶向定位系統(tǒng)提供了一種診斷和治療用途的潛在的非免疫原性、高度選擇性的替代方法。另外，在此描述的bsAb前靶向定位系統(tǒng)比其它前靶向定位系統(tǒng)具有一個非常重要的優(yōu)點(diǎn)，就是它可以與多種不同的成像或治療劑一起應(yīng)用。本系統(tǒng)所具有的靈活性歸因于使用了直接抗組胺-琥珀酰-甘氨酰(HSG)的抗體和開發(fā)了含有HSG殘基的肽。含有HSG的肽既可以用DOTA螯合111In、90Y、177Lu進(jìn)行合成，也可以用锝/錸螯合劑進(jìn)行合成。在前靶向定位中，聯(lián)合使用這些肽和雙特異性抗體，使用被抗-癌胚抗原(CEA)或抗-結(jié)腸-特異性抗原-P(CSAp)抗體的Fab’化學(xué)穩(wěn)定的抗-HSGFab’，來提供對表達(dá)這些抗原的腫瘤的靶向能力。但是，其它的抗原靶還可以包括現(xiàn)有技術(shù)中已知的多種與腫瘤相關(guān)的抗原，如CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD30，CD74，CD80，HLA-DR，Ia，MUC1，MUC2，MUC3，MUC4，EGFR，HER2/neu，PAM-4，BrE3，TAG-72(B72.3，CC49)，EGP-1(如RS7)，EGP-2(如17-1A和其它Ep-CAM靶)，Le(y)(如B3)，A3，KS-1，S100，IL-2，T101，壞死抗原，葉酸受體，血管生成標(biāo)記(如VEGF)，肌腱蛋白，PSMA，PSA，腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子，MAGE，和/活其片段。組織特異性抗體(如抗骨髓細(xì)胞的，如CD34，CD74等，甲狀旁腺球蛋白抗體等)和抗非惡性病灶組織的抗體，如血凝纖維蛋白，粥樣斑塊巨噬細(xì)胞抗原(如CD74抗體)，和特異性病原體抗體(如抗細(xì)菌的、抗病毒的、和抗寄生蟲的)，在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。可以在溫和條件下對肽進(jìn)行標(biāo)記以獲得較高特異性活性，這樣可避免純化的需要。腫瘤模型裸鼠的體內(nèi)研究表明，放射標(biāo)記的肽在體內(nèi)被快速清除，在腫瘤組織或正常組織中僅有極少量的潴留。在施用前靶向劑量的bsAbs之后1到2天時，腫瘤所攝取的放射標(biāo)記肽的量升高了28-175倍，在注射肽3小時內(nèi)，腫瘤/非腫瘤比率超過2∶1到8∶1，這表明比同時施用的99mTc-抗-CEAFab’具有顯著的提高。抗-CSAp×抗-HSGF(ab′)2bsAb在腫瘤中具有最高和最持久的潴留，并且當(dāng)與111In標(biāo)記的肽聯(lián)合使用時，以治療放射核素如90Y和177Lu來估計(jì)照射劑量，結(jié)果顯示可以給腫瘤施用相當(dāng)12,000cGy的照射劑量，其中腎臟接受了1500cGy，而其它所有組織接受了500cGy。因此，該靶向定位系統(tǒng)具有高度靈活性，能夠使用多種診斷成像和治療所需的化合物，并因?yàn)楂@得了非常高的腫瘤吸收和靶向比率，而非常適用于所述用途。另外，本發(fā)明還包含一種檢測和/或治療哺乳動物靶細(xì)胞、組織或病原體的方法，其包括施用有效量的雙特異性抗體或抗體片段，其中所述抗體和抗體片段包含至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂。在此所使用的“病原體”包括但不限于，真菌(如小孢子菌屬、發(fā)癬菌屬、表皮癬菌屬、Sporothrixschenckii、新型隱球菌、粗球孢菌、莢膜組織胞漿菌、皮炎牙生菌、白色假絲酵母)、病毒(如人免疫缺陷病毒(HIV)、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病病毒、流行性感冒病毒、B型肝炎病毒、仙臺病毒、貓白血病病毒、Reo病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、人血清細(xì)小樣病毒、猿病毒40、呼吸道合胞病毒、乳腺腫瘤病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、登革熱病毒、風(fēng)疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T-細(xì)胞白血病病毒、愛-巴病毒、鼠白血病病毒、流行性腮腺炎病毒、皰疹性口炎病毒、辛德畢斯病毒、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、疣病毒和藍(lán)舌病病毒)、寄生蟲、細(xì)菌(如炭疽桿菌、無乳鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌、化膿鏈球菌、埃希氏大腸桿菌、淋病奈瑟氏球菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、肺炎球菌、嗜血B-型流感、梅毒螺旋體、萊姆病螺旋體、銅綠假單胞菌、麻風(fēng)分枝桿菌、流產(chǎn)布魯桿菌、結(jié)核分枝桿菌、和破傷風(fēng)毒素)、支原體(關(guān)節(jié)炎支原體、豬鼻支原體、口腔支原體、精氨酸支原體、拉氏無膽甾原體、唾液支原體、和肺炎支原體)和原生動物(如鐮狀瘧原蟲、間日瘧原蟲、鼠弓形蟲、讓氏錐蟲、克氏錐蟲、羅德西亞錐蟲、布氏錐蟲、曼森血吸蟲、日本血吸蟲、牛巴貝蟲、Elmeriatenella、旋盤尾絲蟲、旋毛線蟲、旋盤尾絲蟲、小泰勒爾梨漿蟲、水泡絳蟲、羊絳蟲、牛肉絳蟲、細(xì)粒棘球蚴、和科爾蒂中殖孔絳蟲)。參見美國專利No.5,332,567。本文還提供了抗體和抗體片段?？贵w片段是抗體中的抗原結(jié)合部分，如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab等?？贵w片段所結(jié)合的抗原與完整抗體所識別的抗原相同。例如，抗-CD22單克隆抗體片段結(jié)合到CD22的表位。術(shù)語“抗體片段”還包括任一合成的蛋白或基因工程蛋白，其與抗體相同，均是結(jié)合到特異性抗原形成復(fù)合物。例如，抗體片段包括分離的片段、由免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)組成的“Fv”片段、免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區(qū)通過肽接頭連接在一起而形成的重組單鏈多肽分子(“sFv蛋白”)、和由模擬“高變區(qū)”的氨基酸殘基組成的最小識別單元。在免疫球蛋白輕鏈區(qū)或重鏈區(qū)的每個可變區(qū)中發(fā)現(xiàn)了三個被稱作“高變區(qū)”或“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR)的區(qū)域。每個CDR的兩側(cè)均連接有相對保守構(gòu)架區(qū)(FR)。認(rèn)為是FR維持著可變區(qū)的結(jié)構(gòu)完整性。免疫球蛋白輕鏈的CDRs和相應(yīng)重鏈的CDRs構(gòu)成了抗原結(jié)合位點(diǎn)。CDRs的高度可變性與抗體特異性的變化多端相一致。在此所使用的術(shù)語“受試者”指的是任何動物(如脊椎動物和無脊椎動物)包括但不限于，人類和其它靈長類動物、嚙齒類動物(如小鼠、大鼠、和豚鼠)、lagamorphs(如兔)、?？苿游?如牛)、綿羊科動物(如綿羊)、山羊科動物(如山羊)、豬科動物(如豬)、馬科動物(如馬)、犬科動物(如狗)、貓科動物(如貓)、家禽(如雞、火雞、鴨子、鵝、其它家禽等)，還有未馴化的或野生的動物，包括但不限于，如有蹄動物類(如鹿)、熊類、魚類、lagamorphs、嚙齒類動物、鳥類等。該術(shù)語對年齡和性別沒有限制。因此成年的和新出生的受試者，還有胎兒，不管是雄性還是雌性，都包括在該術(shù)語范圍內(nèi)。II.抗體的靶向構(gòu)建體有多種不同結(jié)構(gòu)的靶向構(gòu)建體，但在bsAb靶向定位方法中要選擇那些不僅能減少誘發(fā)免疫反應(yīng)而且在體內(nèi)能夠快速清除的靶向構(gòu)建體。疏水試劑是誘發(fā)強(qiáng)烈免疫反應(yīng)的最好的試劑，而親水試劑則是在體內(nèi)清除速率最快的試劑，因此需要在親水和疏水之間建立一個平衡。本發(fā)明是通過如下方法實(shí)現(xiàn)所述目的的，一方面依靠使用親水螯合試劑來抵消一些有機(jī)部分所固有的疏水性。還有，通過選擇，使靶向構(gòu)建體的亞基具有相反的溶解特性，例如，當(dāng)亞基是含有氨基酸的肽時，可以一部分選擇疏水性的，一部分選擇親水性的。除肽外，還可使用碳水化合物作為亞基。靶向構(gòu)建體可以包括具有兩個氨基酸殘基的肽骨架，優(yōu)選兩個到10個氨基酸殘基，其可以與其它部分如螯合試劑相偶聯(lián)。靶向構(gòu)建體應(yīng)當(dāng)是一種低分子量構(gòu)建體，優(yōu)選分子量小于50,000道爾頓，并優(yōu)選小于約20,000道爾頓、10,000道爾頓、或5,000道爾頓，包括任一能夠與螯合試劑結(jié)合的金屬離子。例如，肽DTPA-Tyr-Lys(DTPA)-OH(其中DTPA是二亞乙基三胺五乙酸)已經(jīng)被用于產(chǎn)生抗分子中銦-DTPA部分的抗體。不過，通過使用不含銦的分子，并通過合適的篩選，能夠產(chǎn)生抗酪氨酰-賴氨酸二肽的新的Abs。通常情況下，靶向構(gòu)建體的抗原肽具有四個或更多個殘基，如肽DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)，其中DOTA是1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷基四乙酸，HSG是具有如下分子式的組胺琥珀酰甘氨?；鶊F(tuán)可以使用不包含金屬的肽作為免疫原，篩選與Phe-Lys-Tyr-Lys(SEQIDNO2)骨架反應(yīng)的Abs。靶向構(gòu)建體的半抗原也能提供免疫原性識別部分，例如一種化學(xué)半抗原。使用化學(xué)半抗原，優(yōu)選HSG半抗原，能夠使抗體和構(gòu)建體之間具有高度特異性。這是因?yàn)榭笻SG半抗原的抗體是已知的，能夠很容易地組合成合適的bsAb。因此半抗原與肽骨架的結(jié)合能夠產(chǎn)生特異性結(jié)合bsAb或bsFab的靶向構(gòu)建體。本發(fā)明還提出將非天然的氨基酸，如D-氨基酸，摻入肽骨架結(jié)構(gòu)中，這樣當(dāng)與最終的bsAb/構(gòu)建體系統(tǒng)一起使用時，能夠確保bsAb的識別靶向構(gòu)建體的臂對靶向構(gòu)建體是完全特異性的。本發(fā)明還提出其它類型的骨架結(jié)構(gòu)，如由非天然氨基酸和peptoids構(gòu)成的結(jié)構(gòu)。作為免疫原的肽在肽自動合成儀上可以很方便地合成，其中使用了固相支持物和標(biāo)準(zhǔn)的重復(fù)正交脫保護(hù)和偶聯(lián)技術(shù)。使用如乙?；臉?biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)將肽中的游離胺基保護(hù)起來，肽中的游離胺基在后面用于螯合連接。這樣的保護(hù)性基團(tuán)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。參見Greene和Wuts的“ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis，1999(JohnWileyandSons，N.Y.)。當(dāng)制備的肽用于bsAb系統(tǒng)時，將肽從樹脂上切割下來，最好使其產(chǎn)生相應(yīng)的C-末端酰胺基，目的是抑制體內(nèi)羧肽酶的活性。III.螯合部分靶向構(gòu)建體中的親水螯合部位能夠確保靶向構(gòu)建體在體內(nèi)快速清除。除了親水性外，在選擇螯合劑時，應(yīng)當(dāng)選擇具有金屬結(jié)合特性的，并且能夠隨著后面的情況而變化，這至少對于那些bsAb表位是肽的一部分或是一種非螯合化學(xué)半抗原的靶向構(gòu)建體來說應(yīng)當(dāng)是這樣，金屬-螯合絡(luò)合物的識別不再是個問題?？梢允褂玫慕饘?螯合組合包括2-芐基-DTPA和它的單甲基、環(huán)己基類似物，其中使用47Sc、52Fe、55Co、67Ga、68Ga、111In、89Zr、90Y、161Tb、177Lu、212Bi、213Bi、和225Ac用于放射成像和RAIT。在本申請中與bsAbs共同使用的是與非放射性金屬如Mn、Fe、和Gd絡(luò)合并用于MRI的螯合劑相同的螯合劑。大環(huán)的螯合劑如NOTA(1，4，7-三氮-環(huán)壬烷-N，N′，N″-三乙酸)、DOTA、和TETA(p-溴乙酰胺-芐基-四乙胺四乙酸)能夠與多種金屬和放射性金屬，特別是放射性核素Ga、Y、Cu進(jìn)行螯合。DTPA和DOTA類螯合劑，因?yàn)榕潴w包括硬堿螯合功能基團(tuán)如羧化物和胺，因而能夠有效螯合硬酸陽離子，尤其是IIa和IIIa族的金屬陽離子。通過將環(huán)定做為與金屬離子相適應(yīng)的大小，而使所制備的金屬-螯合絡(luò)合物更加穩(wěn)定。也可以選擇其它類型的環(huán)狀螯合劑，如大環(huán)聚醚能夠與用于RAIT的223Ra核素穩(wěn)定結(jié)合。卟啉螯合劑能夠與多種放射性金屬螯合，并且還能夠作為特定的非放射性的金屬絡(luò)合物用于bsAb介導(dǎo)的免疫光療。此外，還可在靶向構(gòu)建體上綴合多種類型的螯合劑，以結(jié)合多種金屬離子，如非放射性的金屬、診斷用放射核素和/或治療用放射性核素。能夠結(jié)合到靶向構(gòu)建體的螯合試劑上的診斷用放射性核素包括，但不限于，110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr、或其它δ-、β-或正電子-發(fā)射物。優(yōu)選地，診斷用放射性核素的衰變能在25-10,000keV之間，更優(yōu)選在25-4,000keV之間，更加優(yōu)選在20-1,000keV之間，更加優(yōu)選在70-700keV之間。激發(fā)正電子發(fā)射放射性核素的總衰變能量優(yōu)選＜2,000keV，更優(yōu)選低于1,000keV，最優(yōu)選＜700keV。使用γ-射線檢測的用作診斷劑的放射性核素包括，但不限于Cr-51、Co-57、Co-58、Fe-59、Cu-67、Ga-67、Se-75、Ru-97、Tc-99m、In-111、In-114m、I-123、I-125、I-131、Yb-169、Hg-197和TI201。γ-射線激發(fā)的放射性核素的衰變能優(yōu)選為20-2000keV，更優(yōu)選為60-600keV，更加優(yōu)選為100-300keV。能夠與靶向結(jié)構(gòu)的螯合試劑結(jié)合的治療用放射性核素包括，但不限于111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au、和211Pb。治療用放射性核素的衰變能優(yōu)選在25-10,000keV之間。β-粒子激發(fā)核素的衰變能優(yōu)選為25-5,000keV之間，更優(yōu)選為100-4,000keV，最優(yōu)選為500-2,500keV。還優(yōu)選以俄歇激發(fā)粒子衰變的放射性核素，如Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m、和Ir-192。β-粒子激發(fā)核素的衰變能優(yōu)選＜1,000keV，更優(yōu)選＜100keV，最優(yōu)選＜70keV。還優(yōu)選衰變時產(chǎn)生α-粒子的放射性核素。這樣的放射性核素包括，但不限于Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213、和Fm-255。α-粒子激發(fā)放射性核素的衰變能優(yōu)選為2,000-9,000keV，更優(yōu)選為3,000-8,000keV，最優(yōu)選為4,000-7,000keV。在美國專利No5,753,206中公開的螯合劑，尤其是縮氨基硫脲乙醛酰半胱氨酸(Tscg-Cys)和氨基硫脲-乙酰半胱氨酸(Tsca-Cys)螯合劑有利于結(jié)合軟酸陽離子，如Tc、Re、Bi和其它過渡金屬、鑭系元素和錒系元素，所述元素能夠緊密結(jié)合于弱堿性配體，尤其是含硫的或含磷的配體。可以在肽上連接一種以上的螯合劑，如結(jié)合In(111)陽離子的類似于DTPA的硬酸螯合劑，和結(jié)合Tc陽離子的軟酸螯合劑(如含硫醇基團(tuán)的螯合劑，如Tscg-Cys)。因?yàn)榭筪i-DTPA半抗原的抗體是已知的(Barbet′395，supra)，而且能夠很容易地偶聯(lián)到一種靶抗體形成bsAb，因此在靶向定位方案中，可以使用帶有非放射性的di-DTPA螯合劑和另外一種螯合劑的肽半抗原來結(jié)合放射性同位素，即用于靶向放射性同位素。這種肽的一個實(shí)例是Ac-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO7)。肽可以預(yù)先加載In(III)，然后用99-m-Tc陽離子標(biāo)記，DTPA優(yōu)先螯合In(III)離子，含硫醇基團(tuán)的Tscg-Cys優(yōu)先螯合Tc陽離子。其它硬酸螯合劑，如NOTA、DOTA、TETA等可以代替DTPA基團(tuán)，可以使用模擬技術(shù)生產(chǎn)對它們特異性的Mabs，從而產(chǎn)生出抗di-DTPAMab。應(yīng)當(dāng)意識到，可以合并兩種不同的硬酸或軟酸螯合劑組成接頭，例如，因?yàn)殛栯x子的尺寸、螯合環(huán)的幾何性狀和陽離子優(yōu)選的復(fù)合離子結(jié)構(gòu)是存在差別的，因此不同尺寸的螯合環(huán)可以在兩種不同的硬酸陽離子或兩種軟酸陽離子中間進(jìn)行選擇性結(jié)合。這樣可以使用兩種不同的金屬合并成為一個可被前靶向定位的bsAb捕獲的接頭，金屬中的一種或兩種可以是放射性的或是用于增強(qiáng)MRI的。優(yōu)選的螯合劑包括NOTA、DOTA和Tscg及其組合。這些螯合劑摻入后形成具有如下結(jié)構(gòu)的螯合劑-肽復(fù)合基序(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HsG)-D-Tyr-Lys(HsG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)已經(jīng)表明所述的螯合劑-肽綴合物(f)和(g)能夠結(jié)合68Ga，因此可以用于正電子發(fā)射體層攝影(PET)。使用常用的化學(xué)方法使螯合劑與靶向構(gòu)建體中的肽相偶聯(lián)，其中的一些將在下面的實(shí)施例中加以詳細(xì)描述。簡要地說，在合成肽Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)過程中，首先將Aloc-Lys(Fmoc)-OH連接到肽合成儀Rink酰胺樹脂上。在此所使用的保護(hù)性基團(tuán)縮寫“Aloc”和“Fmoc”，指的是烯丙氧基羰基和芴基甲氧基羰基。然后使用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc自動合成方案將Fmoc-Cys(Trt)-OH和TscG加到賴氨酸的側(cè)鏈，形成如下的肽Aloc-Lys(Tscg-Cys(Trt))-rink樹脂。然后除去Aloc基團(tuán)。然后在合成儀上合成如下的肽“Lys(Aloc)-D-Tyr-Lys(Aloc)-Lys(Tscg-Cys(Trt))-rink樹脂(SEQIDNO4)。然后進(jìn)行N-末端?；饔?，并除去側(cè)鏈Aloc保護(hù)基團(tuán)。然后用活化的N-三苯甲基-HSG-OH處理所得到的肽，直到用Kaiser在樹脂中檢測不到胺類為止。參見Karacay等BioconjugateChem.11842-845(2000)。Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)和DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)和DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)和DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)的合成將在以下作出詳細(xì)描述。IV.制備金屬螯合物的方法螯合劑-肽綴合物在固態(tài)時能夠保存很長時間?？梢园阉鼈兎殖蓡挝粍┝坑糜谂c金屬的結(jié)合反應(yīng)，也可以以單位劑量的固態(tài)、液態(tài)、或半液態(tài)溶液、冷凍溶液或凍干制品的形式進(jìn)行保存。可以通過公知的方法對它們進(jìn)行標(biāo)記。通常情況下，在進(jìn)行螯合時，所采用的硬酸陽離子是以合適的鹽溶液形式存在，它能夠被硬酸螯合劑螯合，也能被軟螯合劑螯合。但是，隨后添加容易與軟酸螯合劑螯合的軟酸陽離子，其能夠置換與軟酸螯合劑已經(jīng)螯合了的任何硬酸陽離子。例如，即使存在過量的不帶放射性111InCl3，99m-Tc(V)葡庚糖酸鹽或Tc陽離子(由氯化錫和Na99m-TcO4原位產(chǎn)生的)和Na99m-TcO4對軟酸螯合劑的標(biāo)記，仍然是定量進(jìn)行的。其它軟酸陽離子如186Re、188Re、213Bi和二價或三價的陽離子Mn、CO、Ni、Pb、Cu、Cd、Au、Fe、Ag(單價)、Zn、和Hg等，尤其是64Cu、和67Cu，其中的一些陽離子用于放射免疫檢測或放射免疫治療，所述陽離子通過類似的方法被裝載到接頭肽上。Re陽離子也能夠由高價錸的鹽和二價錫離子產(chǎn)生，或使用一種預(yù)還原錸葡庚糖酸鹽或其它過渡螯合劑來生成Re。因?yàn)榕c還原Tc相比，還原高價錸需要更多的二價錫離子(最終濃度一般超過200μg/mL)，因此需要注意確保高濃度的二價錫不要還原二硫鍵環(huán)化肽中的敏感的二硫鍵。在錸放射性標(biāo)記中，使用了與Tc-99m相似的過程進(jìn)行標(biāo)記。制備Tscg-Cys-配體的ReO金屬絡(luò)合物的方法之一是將肽與ReOCl3(P(Ph3)2進(jìn)行反應(yīng)，也可以使用其它還原性成分如ReO(乙二胺)2與肽進(jìn)行反應(yīng)。V.施用方法應(yīng)當(dāng)注意的是，以下討論主要集中在使用本發(fā)明雙特異性抗體和靶向構(gòu)建體治療病灶組織。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了將本發(fā)明雙特異性抗體和靶向構(gòu)建體用于治療和/或正常組織或器官的成像，其中使用了美國專利號6126916、6077499、6010680、5776095、5776094、5776093、5772981、5753206、5746996、5697902、5328679、5128119、5101827和4735210中的方法，在此全文引入所述文獻(xiàn)。在此所使用的術(shù)語“組織”指的是，但不限于卵巢組織、胸腺組織、甲狀旁腺組織、骨髓組織或脾組織。在靶向正常組織時，一個重要的用途是鑒定和治療組織的異位(即其位置發(fā)生了轉(zhuǎn)移)，如子宮內(nèi)膜異位癥。施用bsAb和靶向構(gòu)建體可以通過如下方式，在施用與接頭部分連接的治療劑之前一段時間，施用bsAb。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所使用試劑的特定性質(zhì)，能夠很容易地對試劑施用的劑量和時間間隔進(jìn)行設(shè)計(jì)。如果首先給予的是bsAb-F(ab’)2衍生物，則在施用靶向構(gòu)建體之前，應(yīng)當(dāng)?shù)却?-6天。如果作為初級靶向載體的是IgG-Fab’bsAb綴合物，則在施用接頭部分之前，需要等待較長一段時間，一般在3-15天?？蛇x擇地，bsAb和靶向構(gòu)建體可以以一種雞尾酒的形式同時施用，也可以依次施用。有多種診斷和治療劑均能綴合到靶向構(gòu)建體上。一般來說，診斷和治療劑包括同位素、藥物、毒素、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子綴合物、激素、生長因子、綴合物、放射性核素、對照試劑、金屬、細(xì)胞毒性藥物、和免疫調(diào)節(jié)劑。例如，使用釓進(jìn)行磁共振成像，綴合熒光素后用于光動力學(xué)治療。另外，對照試劑可以是MRI對照試劑，如釓離子、鑭離子、錳離子、鐵離子、鉻離子、銅離子、鈷離子、鎳離子、鏑離子、錸離子、銪離子、鋱離子、鈥離子、釹離子、或其它可對照標(biāo)記，也可以是CT對照試劑，和超聲對照試劑。另外的診斷劑包括熒光標(biāo)記化合物如熒光素異硫氰酸鹽、若丹明、藻紅素、藻青素、別藻藍(lán)蛋白、熒光胺、化學(xué)發(fā)光化合物(包括魯米諾、異魯米諾、芳烴吖啶酯、咪唑、吖啶鹽和草酸酯)、和生物發(fā)光化合物(包括熒光素、熒光素酶和水母素。放射性核素也能被用作治療和/診斷劑，包括如90Y、111In、131I、99mTc、186Re、188Re、177Lu、67Cu、212Bi、213Bi、211At。治療劑還包括，如化學(xué)治療藥物如長春花生物堿、蒽環(huán)類藥、epidophyllotoxinw、紫杉烷、抗代謝藥、烷基化試劑、抗體、Cox-2抑制劑、抗有絲分裂試劑、抗心絞痛試劑和凋亡試劑，尤其是多索魯比辛、甲氨蝶呤、泰素、CPT-11、喜樹堿、及它們的衍生物和其它種類的抗癌試劑。其它可用于制備免疫綴合物和抗體融合蛋白的治療劑包括氮芥、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、三氮烯、葉酸類似物、COX-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、鉑配位絡(luò)合物、激素等。REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCINENCES，19thEd.(MackPublishingCo.1995)和GOODMANANDGILMAN′STHEPHARMACOLOGICALBASISOFTHERAPEUTICS，7thEd.(MacMillanPublishingCo.1985)，還有所述出版物的修訂版記載了可用的治療劑。其它可用的治療劑，如試驗(yàn)藥物，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。治療劑還可以包括，但不限于，其它藥物、藥物前體和/或毒素。術(shù)語“藥物”、“藥物前體”和“毒素”在說明書詳述部分加以區(qū)分。術(shù)語“診斷劑”或“診斷”包括但不限于檢測試劑、檢測、或定位。當(dāng)靶向構(gòu)建體包括診斷劑時，優(yōu)選在施用帶有診斷劑的靶向構(gòu)建體之前施用bsAb。在施用診斷劑之前，要為bsAb留出足夠的時間，使之靶向定位于病灶組織，診斷劑是以靶向構(gòu)建體的方式施用，最后進(jìn)行成像。體腔中腫瘤檢測可以通過如下方式進(jìn)行，對不同的身體結(jié)構(gòu)發(fā)射適當(dāng)波長的光并隨后接收，然后直接或間接進(jìn)行觀察，或者通過特殊的檢測器，如放射性探測器或熒光檢測器等。身體任何部位的傷病都可以觀測到，只要非離子射線能夠遞送，并能夠重新捕獲從身體結(jié)構(gòu)反射回來的射線。例如，PET，一種高分辨率、非侵入性的成像技術(shù)，與本發(fā)明抗體和靶向構(gòu)建體一起用于人病灶的造影。在PET過程中，檢測到由正電子衰變產(chǎn)生的511keV的γ-光子。與診斷劑可以一起使用的還有X-射線、計(jì)算機(jī)化體層攝影(CT)、MRI和γ-成像(如單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)化體層攝影(SPECT))。正如前面所描述的，靶向構(gòu)建體可以包括放射性診斷劑，其放射出25-10,000keV的γ-、β-、α-和俄歇-粒子和/或正電子。這樣的試劑的例子包括但不限于，18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、111In、123I、125I、124I、131I、154-158Gd、和175Lu。本發(fā)明的bsAbs或bsFabs能夠被用于光動力學(xué)治療(PDT)，這在美國專利6096289、4331647、4818709、4348376、4361544、4444744、5851527中有所記載。在PDT過程中，給受試者施用一種感光物，如血卟啉衍生物如二血卟啉醚。使用光，如630nm，來激活抗腫瘤活性。可用作替代感光物的包括那些可以在較長波長下使用的感光物，這樣皮膚可以接受較少的光。感光物的例子包括但不限于，苯卟啉一元酸環(huán)A(BPD-MA)、本紅紫素錫(SnET2)、磺化酞菁鋁(AlSPc)和德卟啉镥(Lutex)。另外，在進(jìn)行PDT過程中，診斷劑可以注射，例如，系統(tǒng)地，內(nèi)窺鏡采用激光誘導(dǎo)熒光來檢測已與光激活試劑連接的癌癥的位點(diǎn)，其中內(nèi)窺鏡包括無線的膠囊大小的內(nèi)窺鏡或攝像頭。例如，該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)被用于早期肺部腫瘤的熒光支氣管鏡檢。Doiron等Chest7632(1979)。在另外一個實(shí)例中，抗體和抗體片段用于單光子發(fā)射。例如，在施用本發(fā)明抗體或抗體片段之后，給受試者施用一種Tc-99m-標(biāo)記的診斷劑。然后用一種能夠產(chǎn)生單光子射線的γ-攝像頭掃描受試者，進(jìn)行計(jì)算機(jī)化體層攝影，分辨病灶或腫瘤位點(diǎn)?？梢詫⒐饣罨噭┗蛉玖暇Y合到抗體復(fù)合物，獲得治療用免疫綴合物。已經(jīng)將熒光素和其它發(fā)色基團(tuán)或染料，如對可見光敏感的卟啉，用于檢測和治療病灶，其中給病灶照射合適波長的光。在治療方面，這被稱作光照射、光治療、或光動力學(xué)治療(Jori等(eds.)，PhotodynamictherapyofTumorsandOtherDiseases(LibreriaProgetto1985)；vandenBergh，Chem.Britain22430(1986))。另外，將單克隆抗體偶聯(lián)到光活化染料用于進(jìn)行光治療。Mew等，J.Immunol.1301473(1983)；idem.，CancerRes.454380(1985)；Oseroff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA838744(1986)；idem.，Photochem.Photobiol.4683(1987)；Hasan等，Prog.Clin.Biol.Res.288471(1989)；Tatsuta等，LasersSurg.Med.9422(1989)；Pelegrin等，Cancer672529(1991)。然而，這些早期的研究沒有包括用于內(nèi)窺鏡治療的用途，尤其是使用抗體片段或亞片段。因此本發(fā)明完善了包含光活性試劑或染料的免疫綴合物在治療上的應(yīng)用。可以使用不透射線的和作為對照的材料來加強(qiáng)X-射線檢測和計(jì)算機(jī)化體層攝影的效果，這樣的材料包括碘化合物、鋇化合物、鎵化合物、鉈化合物等。特定的化合物包括鋇、泛影酸鹽、乙碘油、檸檬酸鎵、碘卡酸、碘西他酸、碘達(dá)胺、膽影酸、碘氧胺酸、iogulamide、碘海醇、碘異酞醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘絲酸、碘砜葡胺、iosemeticacid、碘肽硫、碘替酸、碘酞酸、碘曲西酸、碘克酸、羥泛影酸、胺碘苯丙酸、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影酸鈉、丙碘酮或氯化亞鉈。可以使用的超聲對照材料包括葡聚糖和脂質(zhì)體，尤其是氣體填充的脂質(zhì)體。在一個實(shí)施方式中，一種免疫調(diào)節(jié)劑，如細(xì)胞因子，也可以通過接頭或其它本領(lǐng)域已知的方法綴合到靶向構(gòu)建體上。在此所使用的術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)劑”包括細(xì)胞因子、干細(xì)胞生長因子、淋巴毒素，如腫瘤壞死因子(TNF)、和造血因子，如白介素(如白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、和IL-18)，集落刺激因子(如粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF))，干擾素(如干擾素-α、-β、-γ)，干細(xì)胞生長因子命名為“S1因子”、紅細(xì)胞生成素和血小板生成素。合適的免疫調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、干擾素-γ、TNF-α等。靶向構(gòu)建體也可以與酶綴合，其中的酶能夠在靶位點(diǎn)活化藥物/藥物前體或能夠通過控制身體的解毒途徑來提高治療效果。在施用bsAb之后，施用綴合了酶的含有低分子量半抗原的靶向構(gòu)建體。通過bsAb與靶向構(gòu)建體的結(jié)合，使酶前靶向定位于靶位點(diǎn)，之后注射一種已知能夠在靶位點(diǎn)起作用的細(xì)胞毒性藥物。藥物可以是一種能夠在體內(nèi)被哺乳動物一般的解毒過程解毒的，并形成低毒性中間體的藥物。例如，能夠被肝臟轉(zhuǎn)化為低毒性葡糖苷酸化合物的藥物。解毒中間體能夠隨后在靶位點(diǎn)被前靶向定位的酶重新轉(zhuǎn)換為原來的具有較高毒性的形式，從而提高藥物在靶位點(diǎn)的細(xì)胞毒性?？蛇x擇的，可以施用一種能夠被前靶向定位的酶轉(zhuǎn)化為活性藥物的藥物前體。前靶向定位的酶通過回收再利用解毒的藥物，提高了治療效果。該過程需要使用酶-藥物組合?？蛇x擇的，將含有酶的靶向構(gòu)建體與靶bsAb混合，之后給患者施用。在施用藥物前體之前，需要等待足夠長的時間，以使bsAb靶向構(gòu)建體-綴合物定位于靶位點(diǎn)，并使未結(jié)合的靶向構(gòu)建體從循環(huán)中清除出去。正如前面所討論的，藥物前體在施用后被前靶向定位的酶轉(zhuǎn)化為藥物。用于抗癌治療的某些細(xì)胞毒性藥物在血清中的溶解性相對較低。另外，一些藥物在未綴合時具有相當(dāng)?shù)亩拘裕瑢⑺鼈冝D(zhuǎn)化為藥物前體能夠顯著降低其毒性。將溶解性很低的藥物轉(zhuǎn)化為具有較高溶解性的復(fù)合物，如葡糖苷酸、親水酸的酯或親水胺的酰胺，都能提高它們在血漿水相中的溶解度，并能提高它們通過靜脈、動脈或毛細(xì)血管細(xì)胞壁，到達(dá)腫瘤周圍組織液的能力。藥物前體分解后在靶位點(diǎn)沉積了低溶解性的藥物。在美國專利號5851527中，Hansen描述了多個這樣的藥物前體-到-藥物轉(zhuǎn)化的例子。身體對某些毒性物質(zhì)的解毒方法是，在肝臟中將某些毒性物質(zhì)如芳香族或脂環(huán)族醇、硫醇、酚和胺轉(zhuǎn)化為葡糖苷酸，從而使它們的毒性降低并使它們更容易排泄到尿中。能夠轉(zhuǎn)化為所述底物的一個典型的抗腫瘤藥物是表阿霉素，它是多索魯比辛(阿霉素)的4-差向異構(gòu)體，它是一種蒽環(huán)類糖苷，已經(jīng)證明它是人β-D-葡糖苷酸酶的一個底物，參見ArcamoneCancerRes.455995(1985)。其它類似物具有較少的極性基團(tuán)，預(yù)期它們更具有親脂性，并更能夠進(jìn)行所述過程。其它具有芳香族或脂環(huán)族醇、硫醇、酚和胺基團(tuán)的藥物或毒素也可以形成所述復(fù)合物形式。這些藥物、或其藥物前體均適用于本發(fā)明的提高位點(diǎn)特異性的方法。藥物前體CPT-11(伊立替康)在體內(nèi)被羧酸酯酶轉(zhuǎn)化為活性代謝物SN-38。因此本發(fā)明的一個用途是，施用一種靶向腫瘤的bsAb和一種半抗原(如di-DTPA)，然后注射di-DTPA-羧酸酯酶復(fù)合物。在獲得合適的腫瘤/背景定位比率后，給予CPT-11，定位于腫瘤的羧酸酯酶在腫瘤處將CPT-11轉(zhuǎn)化為SN-38。活性SN-38的溶解度很低，因此它會沉積在腫瘤附近，并隨后對鄰近的表現(xiàn)為靶向抗原陰性的腫瘤細(xì)胞發(fā)揮作用。這是本發(fā)明方法的一個優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明公開了一種修飾形式的羧酸酯酶，其包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。參見如Potter等，CancerRes.582646-2651(1998)和Potter等，CancerRes.583627-3632(1998)。依托泊苷是一種被廣泛應(yīng)用的抗癌藥物，通過形成葡糖苷酸而使它的毒性大大降低，這包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。參見如Hande等，CancerRes.481829-1834(1988)?？梢杂杉?xì)胞毒性藥物制備葡糖苷酸復(fù)合物，并作為腫瘤治療劑注射到已被mAb-葡糖苷酸酶復(fù)合物前靶向定位的腫瘤。參見如Wang等，CancerRes.524484-4491(1992)。當(dāng)然，該復(fù)合物還可以用于在此描述的前靶向定位方法。類似的，現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述了來自于柔紅霉素和多索魯比辛衍生物的藥物前體與羧酸酯酶和葡糖苷酸酶一起使用的實(shí)例。參見如Bakina等，J.MedChem.404013-4018(1997)。本發(fā)明可以使用的其它藥物前體/酶組合的實(shí)例包括，但不限于，酚芥的羥基衍生物的葡糖苷酸藥物前體和β-葡糖苷酸酶；酚芥或CPT-11和羧肽酶；氨甲喋呤取代的α-氨基酸和羧肽酶A；藥物(如6-巰嘌呤、多索魯比辛)的青霉素或頭孢菌素復(fù)合物和β-內(nèi)酰胺酶；依托泊苷磷酸鹽和堿性磷酸酶?？蛇x擇的，在半抗原上可以綴合能夠在靶位點(diǎn)活化藥物前體或能夠通過控制身體的解毒途徑而提高治療效果的酶。在施用前靶向定位的bsAb之后，給受試者施用所述酶-半抗原綴合物，使之直達(dá)靶位點(diǎn)。在酶定位于靶位點(diǎn)以后，注射一種已知能夠在靶位點(diǎn)起作用的細(xì)胞毒性藥物，或其藥物前體，其中藥物前體在原位被已靶向定位的酶轉(zhuǎn)化為所述藥物。正如上面所述的，藥物是一種能夠被哺乳動物正常解毒進(jìn)程解毒的并形成低毒性中間體的藥物，低毒性中間體通常是葡糖苷酸。解毒的中間體，如葡糖苷酸，在靶位點(diǎn)被前靶向定位的酶重新轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的形式，并由此增強(qiáng)了藥物在靶位點(diǎn)的細(xì)胞毒性。這可以使藥物再利用。同樣的，所施用的藥物前體也能夠通過正常的生物過程轉(zhuǎn)化為活性藥物。前靶向定位的酶通過使解毒藥物再利用，而提高了藥物的治療效果。該方法適用于所有的酶-藥物組合。在另外的實(shí)施方案中，酶-半抗原綴合物可以在施用前與bsAb混合。在經(jīng)過足夠的時間以使酶-半抗原-bsAb綴合物定位到靶位點(diǎn)并使未結(jié)合的綴合物從循環(huán)中清除后，再施用藥物前體。如上所述，藥物前體在原位被前靶向酶轉(zhuǎn)化為藥物。本發(fā)明進(jìn)一步計(jì)劃應(yīng)用本發(fā)明的bsAb和診斷劑進(jìn)行硼中子捕獲治療(BNCT)方案。BNCT是一種二元系統(tǒng)，其中定位于腫瘤的10B原子通過中子照射使腫瘤細(xì)胞接受離子照射。BNCT基于核反應(yīng)理論，當(dāng)一種穩(wěn)定的同位素，同位素富集10B(有19.8％的天然豐度)在熱中子的輻照下，發(fā)生了核反應(yīng)，產(chǎn)生出α-粒子和7Li原子。這些粒子的路徑約為一個細(xì)胞的直徑，因此具有很高的線性能量傳遞。核反應(yīng)產(chǎn)生的粒子中，僅有幾個短范圍的1.7MeVα-粒子能夠靶向細(xì)胞核并摧毀它。如用BNCT成功治療癌癥，需要一種能夠?qū)⒏邼舛鹊?0B定位于腫瘤位點(diǎn)，同時使非靶向組織基本上沒有硼的方法。美國專利6228362描述了使用前靶向定位bsAb進(jìn)行BNCT治療受試者腫瘤的組合物和方法，并且在實(shí)施本發(fā)明時可以將所述組合物和方法很容易地進(jìn)行修改。在本發(fā)明的另外一個實(shí)施方式中，靶向構(gòu)建體的肽骨架上綴合了一種藥物前體。給患者施用前靶向定位的bsAb，并使之定位于靶并使之基本上不存在于循環(huán)中。一段時間以后，施用包含藥物前體(如聚-谷氨酸(SN-38-酯)10)的靶向構(gòu)建體，由此將藥物前體定位于特定的靶腫瘤。已知，因?yàn)槟[瘤內(nèi)或腫瘤周圍細(xì)胞的高裂解率，從細(xì)胞內(nèi)釋放了大量的酶，因此腫瘤中酶的含量很高。技術(shù)人員可以選擇合適的能夠被這些酶活化的藥物前體，來充分利用所述條件。例如，羧酸酯酶能夠活化聚-谷氨酸(SN-38-酯)10藥物前體，它切割聚-谷氨酸(SN-38-酯)10的酯鍵，在腫瘤部位釋放出高濃度的游離SN-38?？蛇x擇地，也可選擇其它合適的酶定位于腫瘤位點(diǎn)。藥物從靶向構(gòu)建體上切割下來后，被腫瘤細(xì)胞內(nèi)在化。可選擇的，通過在靶部位的交聯(lián)作用，使藥物作為完整復(fù)合物的一部分被內(nèi)在化。靶向構(gòu)建體能夠誘導(dǎo)腫瘤結(jié)合bsAb的內(nèi)在化，并由此因?yàn)樘岣吡藘?nèi)在化的藥物水平，而提高藥物治療效果。有多種肽載體適合綴合藥物前體，包括聚氨基酸，如聚賴氨酸、聚谷氨酸(E)、聚天冬氨酸(D)，包括其D-氨基酸類似物共聚物，如聚(Lys-Glu)即poly[KE]，兩種氨基酸的比例從1∶10-10∶1。也可以使用含有多種氨基酸的共聚物，如聚(Lys-Ala-Glu-Tyr(SEQIDNO8)(KAEY；5∶6∶2∶1)。較少的多聚載體可以通過固相肽合成技術(shù)來合成，固相肽合成技術(shù)可以很容易合成鏈長為2-50個氨基酸殘基的多肽。除了能得到具有準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)的多肽外，此項(xiàng)技術(shù)的第二個優(yōu)點(diǎn)是可以在鏈上特定的位點(diǎn)連接上一個或任意數(shù)目的化學(xué)接頭。這些接頭在后面可以用于連接預(yù)定數(shù)目的識別和治療半抗原。聚乙二醇[PEG]在體內(nèi)具有合適的特性，能夠用于雙特異性抗體藥物前體方法。在SN-38和PEG羥基之間插入二價酸如琥珀酸，從而在SN-38的羥基和標(biāo)準(zhǔn)的雙羥基PEG的兩個末端之間導(dǎo)入酯接頭，從而生成了SN-38-O-CO(CH2)2CO-O-PEG-O-CO(CH2)2CO-OSN-38。所產(chǎn)生的二-SN-38-PEG是SN-38-聚合物類藥物前體中聚合數(shù)目最少的一個。PEG衍生物具有理想的體內(nèi)特性，但由于其二聚性能而具有有限的負(fù)載能力，所以制備了具有更大的攜帶半抗原能力的PEG共聚物，如Poiani等所描述的。參見如Poiani等，BioconjugateChem.，5621-630，1994。當(dāng)PEG發(fā)生雙(琥珀酰亞胺)碳酸鹽衍生和與多功能二元胺如賴氨酸共聚合時，PEG衍生物的兩端均被活化。所述共聚合的產(chǎn)物中，包含(-Lys(COOH)-PEG-Lys(COOH)-PEG-)n重復(fù)單元，其中賴氨酰羧基不參與共聚過程，所述共聚物可用于連接SN-38殘基。SN-38殘基與游離的羧基反應(yīng)，生成具有(-Lys-(COOH)-PEG-Lys(COOH)-PEG-)n鏈的SN-38酯。其它的合成聚合物也可用于攜帶識別半抗原和藥物前體，包括N-(2-羥丙基)甲丙烯酰胺(HMPA)共聚物、聚(苯乙烯-共順丁烯二酸)酐(SMA)、聚(丁二烯醚順丁烯二酸酐)(DIVEMA)、聚乙烯亞胺、乙氧基化聚乙烯亞胺、starburstdendrimers、和聚(N-乙烯吡咯烷酮)(PVP)。例如，包含多個酐單元的DIVEMA聚合物與限量的SN-38反應(yīng)，在聚合物骨架上生成具有預(yù)期取代比率的藥物。剩余的酐基團(tuán)在有水的條件下打開生成游離羧酸酯。使用標(biāo)準(zhǔn)的水溶性肽偶聯(lián)試劑如1-乙基-3-(3-雙甲基氨基丙基)碳二亞胺氫氯化物(EDC)活化有限的游離羧酸酯，并使之偶聯(lián)到具有游離氨基的識別部分。后者的一個例子是組胺，在過去已有其抗體。多種藥物前體都能綴合到靶向構(gòu)建體上。所述聚合物的實(shí)例涉及SN-38，其是藥物前體CPT-11(伊里諾坎)的活性代謝產(chǎn)物。SN-38具有芳香族羥基，這在上面的描述中其用于生成芳香基酯，芳香酯對酯酶類的酶非常敏感。類似的，一種廣泛用于化療的，喜樹堿類似物拓普替康，也具有可利用的芳香族羥基，能夠以SN-38所描述的類似的方式來生產(chǎn)對酯酶敏感的聚合物藥物前體。阿霉素也含有芳香族羥基，使用與所述喜樹堿類相似的酸催化反應(yīng)，能夠使其偶聯(lián)到含有羧酸酯的聚合載體上。類似的，阿霉素類似物如柔紅霉素、表阿霉素、柔紅霉素也能以類似的方式偶聯(lián)。具有氨基“化學(xué)接頭”活性、足以化學(xué)偶聯(lián)到聚合載體上的阿霉素和其它藥物能夠通過其游離氨基通過多種途徑有效偶聯(lián)到載體分子上。提供游離羧酸酯基團(tuán)的聚合物能夠被活化(如被EDC活化)，活化的聚合物與阿霉素混合，通過酰胺鍵直接將藥物連接到聚合物的側(cè)鏈上。通過混合適合的能夠被切割的交聯(lián)試劑，如乙烯glycobis(琥珀酰亞胺基琥珀酸鹽((EGS，PierceChemicalCo.，Rockford，IL)或雙-[2-(琥珀酰亞胺基氧羰基氧)乙基]砜(BSOCOES，MolecularBioscineces，Huntsville，AL)，在與雙琥珀酰亞胺酯基團(tuán)反應(yīng)后，使兩個胺交聯(lián)為兩個酰胺，通過所述方式，含有氨基的藥物也能夠被偶聯(lián)到帶有氨基鏈的聚合物上。這是非常有利的，因?yàn)檫@些基團(tuán)保持了對酶切割的敏感性。例如，(阿霉素-EGS)n-聚-賴氨酸在EGS交聯(lián)鏈上保留了對酶切割敏感的二酯基團(tuán)，可以通過酶如酯酶進(jìn)行切割。使用已知的過程，還能將阿霉素綴合到多種肽上，例如，HyBnK(DTPA)YK(DTPA)-NH2，(HyBn＝p-H2NNHC6H4CO2H)。參見Kaneko等.，JBiocoyugateChem.，2133-141，1991.。在一個優(yōu)選實(shí)例中，治療復(fù)合物包含偶聯(lián)到載體上的阿霉素，其中載體包含胺殘基，和一種螯合試劑，如DTPA，形成了DTPA-肽-阿霉素復(fù)合物，其中DTPA形成前靶向定位bsAb的識別部分。優(yōu)選的，所述載體包含酪氨酰-賴氨酸二肽，如Tyr-Lys(DTPA)-NH2，更優(yōu)選地，載體包含Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH2。阿霉素苯基腙綴合到含雙DPTA的肽上，這從治療角度來說尤為理想。氨甲碟呤也有可利用的氨基，能夠偶聯(lián)到含有活化的羧酸酯的聚合物上，偶聯(lián)方式與阿霉素類似。另外，它還有兩個谷氨酰羧基(α和β)，其也能夠被活化，并偶聯(lián)到含氨基的聚合物上。氨甲碟呤的游離羧酸酯基團(tuán)也能在原位(EDC)被活化，活化的藥物與含氨基的聚合物混合時，能夠通過酰胺鍵直接將藥物連接到聚合物的側(cè)鏈上。使用體積排阻層析或離子交換層析，可以很容易地將過量的未反應(yīng)的或非交聯(lián)反應(yīng)的藥物從聚合物-藥物復(fù)合物中分離出去。Maytansinoids和calicheamicins(如esperamycin)含有雙-和三硫醚鍵，能夠被切割為具有單個硫醇基團(tuán)的成分，以便能夠用于下面的化學(xué)操作。Thiomaytensinoid或thioespera-mycin首先與交聯(lián)試劑如順丁烯二酰亞胺-肽反應(yīng)，其中的肽對肽酶的切割敏感。隨后肽的C-末端被活化，并偶聯(lián)到含氨基的聚合物上，如聚賴氨酸。在另外的實(shí)施方式中，雙特異性抗體將治療或藥物前體聚合物和放射性核素一起介導(dǎo)到體內(nèi)的靶上，由此將化療和放射性免疫治療結(jié)合在一起。其中所述每種治療劑可以綴合到同一靶向構(gòu)建體上，同時施用，或者將核素綴合到第一靶向構(gòu)建體上，藥物綴合到第二靶向構(gòu)建體上，分別施用。在其中一個簡單的實(shí)例中，構(gòu)建了包含一個藥物前體和一個核素的肽。例如，三肽Ac-Glu-Gly-Lys-NH2可以用作靶向構(gòu)建體的載體部分，SN-38連接到該部分的γ-谷氨酰羧基上形成芳基酯，螯合物DOTA連接到第五個氨基上形成酰胺，從而生成了復(fù)合物Ac-Glu(SN-38)-Gly-Lys(DOTA)-NH2。隨后根據(jù)成像或治療的需要，應(yīng)用不同的金屬對DOTA螯合物進(jìn)行放射性標(biāo)記，放射性金屬包括In-111Y-90、Sm-153、Lu-177、和Zr-89。當(dāng)金屬-DOTA復(fù)合物在靶向構(gòu)建體中作為可識別半抗原時，對于金屬DOTA復(fù)合物來說，需要所使用的次級識別抗體對該金屬DOTA復(fù)合物具有非常高的親和力。一般來說，親和力(logKa)應(yīng)在6-11之間。聚合肽，如聚[Glu(SN-38)10-Lys(Y-90-DOTA)2]，與所述低分子量肽一樣容易制備，本發(fā)明優(yōu)選聚合肽。另外，可以使用三重取代的聚合物，如聚[Glu(Sn-38)10-Lys(Y-90-DOTA)n(組胺-琥珀酸酯)m，其中n和m是整數(shù)，從而使識別試劑獨(dú)立于放射免疫治療劑。存在于腫瘤位點(diǎn)的羧酸酯酶將藥物前體活化，或通過第二靶向構(gòu)建體而靶向定位于腫瘤位點(diǎn)的羧酸酯酶將藥物前體活化?？蛇x擇的，在不同的步驟中，分別施用化療和放射免疫治療劑，進(jìn)行聯(lián)合治療。例如，首先給表達(dá)CEA-腫瘤患者施用一種bsAb，其中的bsAb具有至少一個特異性結(jié)合CEA的臂和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂，其中所述靶向構(gòu)建體的半抗原是一種釓-DOTA綴合物。然后，使用包含釓-DOTA-β-葡糖苷酸酶綴合物的靶向構(gòu)建體對患者進(jìn)行治療。在足夠使bsAb和酶實(shí)現(xiàn)定位并從正常組織中清除的一段時間以后，給予患者第二靶向構(gòu)建體，該第二靶向構(gòu)建體包含Ac-Glu(SN-38)-Gly-Lys(Y-90-DOTA)-NH2。該第二靶向構(gòu)建體依靠在腫瘤部位上還沒有與第一靶向構(gòu)建體結(jié)合的bsAb的介導(dǎo)，定位于腫瘤。定位于靶位點(diǎn)的第一靶向構(gòu)建體作用于Ac-Glu(SN-38)-Gly-Lys(Y-90-DOTA)-NH2，釋放出游離的SN-38藥物。通過使用沒有底物限制的酶，將藥物前體和它們各自的酶一起定位于靶位點(diǎn)，大大提高了活性藥物的產(chǎn)量。該實(shí)例與現(xiàn)有的藥物前體方案相比，具有顯著的進(jìn)步。在隨后的步驟中，也就是在施用了作為所給予的靶向構(gòu)建體一部分的核素之后，再施用藥物前體-聚合物的另外一個優(yōu)點(diǎn)是，使放射治療和藥物治療協(xié)同作用，從而使療效最大化。猜測經(jīng)過RAIT的放射性治療后，由于照射損傷，腫瘤變得更加容易“滲漏”。這可使聚合物-藥物前體更完全并更深入進(jìn)入腫瘤?？蛇x擇的，RAIT治療劑可以連接到bsAb上，而不是連接到靶向構(gòu)建體上。例如，首先給CEA表達(dá)腫瘤患者施用一種抗-CEA×抗-DTPA的bsAb，其中bsAb上綴合了Y-90-DOTA。在該例子中，優(yōu)點(diǎn)是可以選擇特定的抗-螯合物mabs，其中的抗-銦-DTPA抗體不會結(jié)合到釔-DOTA螯合物上。在Y-90-DOTA-抗-CEA×抗-銦-DTPA在腫瘤中達(dá)到最大濃度，并充分地從非靶組織清除之后，注射銦-DTPA-葡糖苷酸酶綴合物，使之特異性定位于CEA腫瘤位點(diǎn)。然后給患者注射聚合物-藥物前體，如聚(Glu)(SN-38)10。后者在腫瘤位點(diǎn)被選擇性切割為活性單體SN-38，從而成功聯(lián)合了化療和先前施用的RAIT療法。還應(yīng)當(dāng)注意到，在本發(fā)明方法中可以使用如下的雙特異性抗體或抗體片段，其具有至少一個特異性結(jié)合靶位點(diǎn)抗原的結(jié)合位點(diǎn)，和至少另外一個特異性結(jié)合抗體-酶復(fù)合物中酶部分的結(jié)合位點(diǎn)?？梢栽谧⑸淝笆顾隹贵w與酶結(jié)合，該過程不需要將酶共價綴合到抗體上，或者首先注射所述抗體，并使之定位于靶位點(diǎn)，并在沒有靶向定位的抗體基本上從哺乳動物的循環(huán)系統(tǒng)中清除出去之后，再注射酶，注射量和注射途徑應(yīng)當(dāng)能夠使足夠量的酶到達(dá)已定位的抗體或抗體片段，并在原位與之結(jié)合形成抗體-酶復(fù)合物。還應(yīng)當(dāng)注意到，本發(fā)明還成功使用了多價靶結(jié)合蛋白，其具有至少三個不同的靶結(jié)合位點(diǎn)，如同專利申請系列號60220782中描述的一樣。通過化學(xué)接頭將幾個Fab樣片段交聯(lián)在一起，即可獲得多價靶結(jié)合蛋白。參見美國專利號5262524、5091542和Landsdorp等，Euro.J.Immunol.16679-83(1986)。多價靶結(jié)合蛋白還可以通過如下方法制備，將幾個單鏈Fv分子(scFv)共價連接，從而形成一條多肽。參見美國專利號5892021。美國專利號6025165和5837242中描述了一種由scFv分子聚合形成的多價靶結(jié)合蛋白。Krott等，ProteinEngineering.10(4)423-433(1997)描述了一種包含三個scFv分子的三價靶結(jié)合蛋白。在使用bsAb和靶向構(gòu)建體之間，可以使用一種清除試劑。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明可以使用一種具有獨(dú)特作用機(jī)制的清除試劑，即糖基化的抗-獨(dú)特型Fab’片段，其靶向抗bsAb的病灶靶向臂。給予抗-CEA(MN-14Ab)×抗-肽bsAb，使之最大程度地定位于病灶靶位。給予一種命名為WI2的MN-14的抗獨(dú)特型Ab，來清除殘留的bsAb，優(yōu)選使用糖基化形式的Fab’片段。清除試劑以單價形式與bsAb結(jié)合，所附加的糖基將整個復(fù)合物介導(dǎo)到肝臟，在這里進(jìn)行快速的新陳代謝。然后給受試者施用與靶向構(gòu)建體連在一起的治療或診斷劑。所述WI2Ab與bsAb的MN-14臂具有非常高的親和力，并且清除機(jī)制與其它已經(jīng)公開的機(jī)制不同(參見Goodwin等，ibid)，該機(jī)制不涉及交聯(lián)，因?yàn)閃I2-Fab’是單價的。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種適用于治療或鑒定患者病灶組織的試劑盒，其包含一種雙特異性抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂，以及一種包含載體部分的第一靶向構(gòu)建體，其中載體部分包含或攜帶至少一個可被雙特異性抗體或抗體片段的至少一個臂識別的表位、和一個或多個綴合的治療或診斷劑、或酶，試劑盒還可選擇地包含一種清除組合物，其用于清除沒有定位的抗體和抗體片段。該試劑盒還可選擇性地包含一種藥物前體，當(dāng)?shù)谝话邢驑?gòu)建體包含能夠在靶位點(diǎn)將藥物前體轉(zhuǎn)化為藥物的酶、或包含能夠?qū)⒔舛镜乃幬镏虚g體重新轉(zhuǎn)化為毒性形式并因此提高藥物在靶位點(diǎn)的毒性的酶、或包含能夠?qū)⒃诨颊唧w內(nèi)由自然過程活化并通過轉(zhuǎn)化為低毒性中間體而解毒的藥物前體從解毒的中間體重新轉(zhuǎn)化為毒性形式，并由此提高藥物在靶位點(diǎn)的毒性的酶。還可使用一種包含載體部分的第二靶向構(gòu)建體，其中載體部分包含或攜帶至少一個可被雙特異性抗體或抗體片段的至少另外一個臂識別的表位，和一種藥物前體，當(dāng)酶能夠在靶位點(diǎn)將藥物前體轉(zhuǎn)化為藥物的情況下。試劑盒還可包括能夠促進(jìn)鑒定或治療病灶組織的儀器。例如可包括，但不限于應(yīng)用裝置，如注射器。試劑盒還可包括使用本發(fā)明進(jìn)行鑒定或治療病灶組織時所需的溶液。靶向構(gòu)建體可以靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、手術(shù)過程中、內(nèi)窺鏡、腹膜內(nèi)、肌肉、皮下、胸膜內(nèi)、鞘內(nèi)施用，經(jīng)過導(dǎo)管灌注、或病灶內(nèi)直接注射，可以連續(xù)灌輸、或通過單或多造影劑團(tuán)施用，或經(jīng)過其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于診斷(檢測)和治療病灶組織的方法。此外，所述靶向構(gòu)建體可以包括在其它檢測和治療病灶組織的方法中所使用的試劑，包括但不限于，將右旋糖苷或脂質(zhì)體綴合到靶向構(gòu)建體上用于超聲，或?qū)⑵渌鼘φ赵噭┚Y合到靶向構(gòu)建體上用于其它的成像形式，如上面已經(jīng)描述過的X-射線、CT、PET、SPECT和超聲。VI.生成抗體的方法可以使用公知的生產(chǎn)抗體的方法來生產(chǎn)肽骨架和/或半抗原的抗體(Abs)。例如，給免疫活性動物注射懸浮在弗氏完全佐劑中的免疫原，如(肽)n-KLH，其中KLH是匙孔血藍(lán)蛋白，n＝1-30，隨后再連續(xù)兩次注射懸浮在不完全弗氏佐劑中的同樣的免疫原靜脈抗原加強(qiáng)后三天收集脾細(xì)胞。然后將收集的脾細(xì)胞與Sp2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞融合，培養(yǎng)所得克隆的上清液，其中克隆已經(jīng)進(jìn)行了直接-結(jié)合ELISA法抗-肽反應(yīng)分析。使用最初的免疫原的肽片段分析所產(chǎn)生的Abs的特異性。這些肽片段可以使用肽自動合成儀來制備。對于制備Ab，分離酶-缺陷型雜交瘤，以便能夠進(jìn)行融合細(xì)胞系的選擇。這項(xiàng)技術(shù)還可被用于制備抗一種或多種螯合物的抗體，如In(III)-DTPA螯合物?？笽n(III)-di-DTPA的單克隆小鼠抗體是已知的(Barbet‘395supra)。本發(fā)明所使用的抗體對多種細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)腫瘤相關(guān)抗原具有特異性，所述抗原可以用作標(biāo)記物。這些標(biāo)記可以是腫瘤產(chǎn)生的物質(zhì)，或可以是在腫瘤位點(diǎn)富集的物質(zhì)，其存在于腫瘤細(xì)胞的表面或存在于腫瘤細(xì)胞內(nèi)，可能存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)、細(xì)胞核內(nèi)、或各種細(xì)胞器或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)。所述腫瘤相關(guān)標(biāo)記公開在下列文獻(xiàn)中，Herberman，“ImmunodiagnosisofCancer”，inFleishered.，“TheClinicalBiochemistryofCancer”347頁(AmericanAssociationofClinicalChemists，1979)和美國專利號4150149、4,361,544、和4,444,744。還可參見如下的美國專利，Thorpe等的5,965,132、Thorpe等的6,004,554、Epstein等的6,071,491、Epstein等的6,017,514、Epstein等的5,882,626、Epstein等的5,019,368、和Thorpe等的6,342,221，所有所述文獻(xiàn)在此引作參考。在以前的文獻(xiàn)中，Herberman將腫瘤相關(guān)標(biāo)記分成幾類，包括癌胚抗原類、胎盤抗原類、致瘤或腫瘤病毒相關(guān)抗原、組織相關(guān)抗原、器官相關(guān)抗原、異常激素和正?？乖蚱渥兎N。偶爾情況下，使用腫瘤相關(guān)標(biāo)記的亞基生產(chǎn)的抗體具有更高的腫瘤特異性，如絨毛膜促性腺激素(HCG)的β-亞基或癌胚抗原(CEA)的γ區(qū)，由其產(chǎn)生的抗體大大降低了與非腫瘤物質(zhì)的交叉反應(yīng)，參見美國專利號4361644和4444744。腫瘤脈管標(biāo)記(如VEGF)、腫瘤壞死(Epstein的專利)標(biāo)記、膜受體標(biāo)記(如二氫葉酸受體，EGFR)、跨膜抗原標(biāo)記(如PSMA)和致癌基因產(chǎn)物標(biāo)記都可用作抗體或抗體片段的腫瘤相關(guān)的合適的靶位。正常細(xì)胞的標(biāo)記，如果其在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)很豐富，如B-細(xì)胞復(fù)合體抗原(如CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、和惡性B-細(xì)胞上的HLA-DR)、還有特定腫瘤細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子(如惡性T-細(xì)胞上的IL-2受體)，也適合作本發(fā)明抗體和抗體片段的靶位。其它公知的可用作本發(fā)明抗體和抗體片段靶位的腫瘤相關(guān)抗原包括，但不限于，CEA、CSAp、TAG-72、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、EGP-1、EGP-2、BrE3、PAM-4、KC-4、A3、KS-1、PSMA、PSA、韌粘素、T101、S100、MAGE、HLA-DR、CD19、CD20、CD22、CD30、和CD74。另外的令人感興趣的標(biāo)記是跨膜激活劑和CAML-相互作用劑(TACI)。參見Yu等，Nat.Immunol.1252-256(2000)。簡單的說，TACI是一種惡性B-細(xì)胞的標(biāo)記(如淋巴瘤)。此外，已知TACI和B-細(xì)胞成熟抗原(BCMA)通過類似于一種增殖-誘導(dǎo)配體(APRIL)。的腫瘤壞死因子而結(jié)合在一起。APRIL在體外能夠刺激初級B細(xì)胞和T細(xì)胞的增殖，并能夠在體內(nèi)導(dǎo)致B-細(xì)胞的積累，從而使脾的重量增加。APRIL還與TALL-I(還稱作BlyS或BAFF)競爭受體結(jié)合位點(diǎn)。尤其是可溶的BCMA和TACI特異防止APRIL的結(jié)合，并能夠阻斷初級B-細(xì)胞的APRIL-刺激的增殖。在小鼠中，BCMA-Fc也能夠抑制抗匙孔血藍(lán)蛋白和抗肺炎泛克的抗體的產(chǎn)生，這表明APRIL和/或TALL-I由經(jīng)BCMA和/或TACI發(fā)出信號對于產(chǎn)生體液免疫是必須的。因此，APRIL-TALL-I和BCMA-TACI共同形成了一種兩配體-兩受體、涉及激發(fā)B、T細(xì)胞功能的途徑。在生成對免疫原的初級抗體后，可以對抗體進(jìn)行測序，并隨后應(yīng)用重組技術(shù)來制備。小鼠抗體和抗體片段的人源化和嵌合化，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。例如，人源化單克隆抗體可以由如下過程來制備，將小鼠免疫球蛋白的輕鏈和重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)轉(zhuǎn)導(dǎo)到人的可變區(qū)域，然后，用人的殘基替換小鼠對應(yīng)物的框架區(qū)。使用來自人源化單克隆抗體的抗體可以避免潛在的問題，該問題涉及鼠恒定區(qū)的免疫原性。現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)記載了克隆小鼠免疫球蛋白可變區(qū)的常用技術(shù)，例如Orlandi等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA863833(1989)，在此全文引作參考?，F(xiàn)有技術(shù)中也記載了生產(chǎn)人源化Mabs的技術(shù)，例如，Jones等Nature321522(1986)，Riechmann等，Nature332321(1988)，Verhoeyen等，Science2391534(1988)，Verhoeyen等Science2391534(1988)，Carter等，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA894285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12437(1992)，和Singer等，J.Immun.1502844(1993)，所述所有文獻(xiàn)在此引作參考。可選擇地，可從轉(zhuǎn)基因非人動物中獲得完整的人抗體。參見如Mendez等，NatureGenetics，15146-156(1997)、美國專利號5633425。例如，從含有人免疫球蛋白轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因小鼠中回收人抗體。通過抑制小鼠內(nèi)源免疫球蛋白基因，并將人免疫球蛋白轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)導(dǎo)到小鼠，從而使小鼠的體液免疫系統(tǒng)人源化。人免疫球蛋白轉(zhuǎn)座子非常復(fù)雜，含有大量的離散片段，其總量幾乎占到人類基因組總量的0.2％。為了確保轉(zhuǎn)基因小鼠能夠生產(chǎn)出完整功能的抗體，必須將人類重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)座子的絕大部分區(qū)域轉(zhuǎn)導(dǎo)到小鼠基因組中。所述目的是通過如下的方法逐步完成的，首先形成酵母人工染色體(YACs)，其在種系構(gòu)造中既包含人類重鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)座子，還包含人類輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)座子。因?yàn)槊總€插入片段大小都在1Mb左右，因此構(gòu)建YAC時需要免疫球蛋白轉(zhuǎn)座子的重疊片段進(jìn)行同源重組。獲得兩個YACs，其中一個包含重鏈轉(zhuǎn)座子，另一個包含輕鏈轉(zhuǎn)座子，通過將包含酵母球芽的YAC與小鼠胚胎干細(xì)胞融合的方法，將兩個YACs分別轉(zhuǎn)導(dǎo)到小鼠。然后將胚胎干細(xì)胞克隆顯微注射到小鼠的胚泡。根據(jù)胚系傳遞YAC的能力，篩選得到嵌合雄性鼠，然后將嵌合雄性小鼠與小鼠抗體缺陷型的鼠進(jìn)行雜交。將兩個轉(zhuǎn)基因胚系進(jìn)行雜交，其中之一包含人類重鏈轉(zhuǎn)座子，另一個包含人類輕鏈轉(zhuǎn)座子，經(jīng)過雜交產(chǎn)生了能夠在免疫誘導(dǎo)下產(chǎn)生人類抗體的后代。通過微細(xì)胞介導(dǎo)染色體傳遞(MMCT)的方法，也能將未重排的人類免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到小鼠胚胎干細(xì)胞。參見如Tomizuka等，NatureGenetics，16133(1997)。在該方法中，將包含人類染色體的微型細(xì)胞與小鼠胚胎干細(xì)胞融合。在后代中穩(wěn)定保留了所傳遞的染色體，并且成年嵌合體表現(xiàn)出了適當(dāng)?shù)慕M織特異性表達(dá)?？蛇x擇的，本發(fā)明的抗體或抗體片段可以衍生自從免疫球蛋白組合文庫中分離的人類抗體片段。參見如Barbas等，METHODSACompaniontoMethodsinEnzymology2119(1991)，和Winter等，Rev.Immunol.12433(1994)，所述文獻(xiàn)在此引作參考。在通過B-細(xì)胞永生化生產(chǎn)單克隆抗體方面，所存在的一些難題可以通過使用噬菌體展示在E.coli中構(gòu)建和表達(dá)抗體片段的方法來加以克服。為了確保能夠回收到親和力高的單克隆抗體，所使用的組合免疫球蛋白文庫必須有較大的庫容量。所使用的一個典型的策略是，從免疫小鼠的淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞獲得mRNA，然后使用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。通過PCR分別擴(kuò)增重鏈基因和輕鏈基因，并連接到噬菌體克隆載體。從而構(gòu)建了兩個不同的基因文庫，其中之一包含重鏈基因，另一個包含輕鏈基因。從每個文庫中分離噬菌體DNA，將重鏈基因和輕鏈基因連接在一起，并經(jīng)包裝形成一個組合基因文庫。其中的每個噬菌體均包含重鏈和輕鏈cDNAs的隨機(jī)組合對，并在轉(zhuǎn)染E.coli后，使轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)抗體鏈。為了鑒定識別預(yù)定抗原的抗體，將噬菌體文庫進(jìn)行涂板處理，從而將空斑中的抗體分子轉(zhuǎn)移到濾膜。將濾膜與放射性標(biāo)記的抗原一起溫育，然后洗去過量的未結(jié)合的配體。經(jīng)放射自顯影，出現(xiàn)放射斑點(diǎn)的空斑即包含了與抗原結(jié)合的抗體。可以獲得用于生產(chǎn)人類免疫球蛋白質(zhì)粒文庫的克隆和表達(dá)載體，例如，可從STRATAGENE克隆系統(tǒng)中獲得所述克隆和表達(dá)載體(LaJolla，CA)。還有一個方法也可以用于獲得高親和力的scFv。參見如Vaughn等，Nat.Biotechnol.，14309-314(1996)。使用對應(yīng)于所有已知VH、VK和Vλ基因家族的PCR引物，從非免疫的人類供體中分離V-基因，從而構(gòu)建具有較大容量的scFv基因文庫。在擴(kuò)增后，將VK和Vλ庫合并在一起組成一個庫。將這些片段連接到噬菌粒載體上。然后將scFv接頭連接到噬菌粒VL片段的上游。將VH和接頭-VL片段擴(kuò)增，并裝配到JH區(qū)域。將得到的VH-接頭-VL片段連接到噬菌粒載體。如同上面所描述的，可以使用濾膜、或免疫管(Nunc；Maxisorp)對噬菌粒文庫進(jìn)行淘選。從而得到類似于上面的結(jié)果，即從免疫兔的淋巴細(xì)胞或脾細(xì)胞構(gòu)建組合免疫球蛋白文庫，并在畢赤酵母中表達(dá)。參見如Ridder等，Biotechnology，13155-260(1995)。另外，在分離得到合適的scFv以后，可以通過親和力成熟過程，如CDR3變異，和鏈改組過程使抗體片段具有更高的結(jié)合親和力和更低的解離速度。參見如Jackson等，Br.J.Cancer，78181-188(1998)；Osboum等，Immunotechnology，2181-196(1996)。另外一種形式的抗體片段是編碼單個CDR的肽。通過構(gòu)建編碼預(yù)期抗體的CDR的基因來獲得CDR肽(“最小識別單元”)。例如，該基因可以通過如下方法制備，即使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從抗體-生產(chǎn)細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)。參見如Larrick等，MethodsACompaniontoMethodsinEnzymology2106(1991)；Courtenay-Luck，″GeneticManipulationofMonoclonalAntibodies，″inMONOCLONALANTIBODIESPRODUCTION，ENGINEERINGANDCLINICALAPPLICATION，Ritter等(eds.)，166-179頁(CambridgeUniversityPress1995)；和Ward等，″GeneticManipulationandExpressionofAntibodies，″inMONOCLONALANTIBODIESPRINCIPLESANDAPPLICATIONS，Birch等，(eds.)，137-185頁(Wiley-Liss，Inc.1995)?？梢酝ㄟ^已知的技術(shù)制備bsAbs，例如，分別用胃蛋白酶消化抗-CEA腫瘤Ab和抗-肽Ab，形成它們各自的F(ab’)2。用半胱氨酸還原抗-CEA-Ab-F(ab’)2，生成Fab’單體單元，進(jìn)一步將其與交聯(lián)劑雙(順丁烯二酰亞胺基)正丁烷反應(yīng)，生成Fab’-順丁烯二酰亞胺部分。用半胱氨酸還原抗肽Ab-F(ab’)2，經(jīng)純化回收的抗肽-Fab’-SH與抗-CEA-Fab’-順丁烯二酰亞胺反應(yīng)，生成Fab’×Fab’雙特異性的Ab?？蛇x擇的，抗肽Fab’-SH片段可以與抗-CEAF(ab’)2偶聯(lián)，生成一種F(ab’)2×Fab’構(gòu)建體、或與抗-CEAIgG偶聯(lián)生成一種IgG×Fab’雙特異性構(gòu)建體。在其中一個實(shí)例中，所述IgG×Fab’構(gòu)建體通過如下的位點(diǎn)-特異性方法來制備，即將抗肽Fab’的硫醇基團(tuán)與抗-CEAIgG重鏈上的碳水化合物相連接，其中的碳水化合物已經(jīng)用高碘酸鹽氧化，之后通過與商業(yè)可獲得的胼-順丁烯二酰亞胺交聯(lián)劑反應(yīng)而使之活化。其中所使用的Ab可以通過公知的技術(shù)進(jìn)行嵌合化或人源化。嵌合抗體是這樣一種重組蛋白，其包含來自嚙齒類動物抗體的可變區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)，同時抗體分子的其它部分來自人類抗體。人源化抗體是這樣一種重組蛋白，其中鼠單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)已經(jīng)進(jìn)行了從鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)到人類可變區(qū)的轉(zhuǎn)變。生產(chǎn)雙特異性抗體和抗體片段可以使用多種重組方法。例如，可以轉(zhuǎn)基因家畜的奶中生產(chǎn)雙特異性抗體和抗體片段。參見如Colman，A.，Biochem.Soc.Symp.，63141-147，1998；和美國專利5827690。構(gòu)建兩種DNA，其中分別含有編碼免疫球蛋白重鏈和輕鏈對的DNA片段。將片段克隆到表達(dá)載體，其中表達(dá)載體包含一種優(yōu)選在乳房上皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子序列。這樣的例子包括，但不限于，兔、牛、和綿羊酪蛋白基因的啟動子，牛α-乳球蛋白基因的啟動子，綿羊β-乳球蛋白基因的啟動子，和鼠乳酸蛋白基因的啟動子。優(yōu)選的，插入片段的3’端連接有乳房特異性基因同源基因組序列。從而提供了聚腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定序列。將所述表達(dá)組件共同注射到受精原核，即哺乳動物的受精卵，然后將其植入雌性受體的子宮，使之發(fā)育。出生之后，用Southern分析方法篩選含有兩種轉(zhuǎn)基因的后代。為了形成本發(fā)明的抗體，在同一細(xì)胞中必須同時表達(dá)重鏈和輕鏈兩種基因。使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)免疫分析方法分析雌性轉(zhuǎn)基因動物的奶，鑒定其是否含有預(yù)期的功能性抗體和抗體片段。可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法純化奶中的抗體。將編碼小鼠輕鏈和重鏈可變區(qū)的cDNA片段與編碼人類抗體C區(qū)的片段相連接，從而構(gòu)建了一種嵌合的Ab。因?yàn)镃區(qū)不能結(jié)合抗原，所以所述嵌合抗體不僅保留了與原來的小鼠Ab相同的抗原特異性，而且在序列上更加接近人類抗體。嵌合Ab仍然含有一部分小鼠的序列，它仍然具有免疫原性。人源化的Ab包含那些抗原識別必需的小鼠氨基酸。通過將來自鼠互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸構(gòu)建到人類抗體框架中，來構(gòu)建所述產(chǎn)物。其它的生產(chǎn)bsAbs的方法中包括工程化重組Abs，其含有附加的半胱氨酸殘基，從而比一般的免疫球蛋白型交聯(lián)得更加牢固。參見如FitzGerald等，ProteinEng.10(10)1221-1225，1997。另外一個進(jìn)展是將兩個或多個不同的具有所需雙特異性的單鏈抗體或抗體片段連在一起形成工程化重組融合蛋白。參見如Coloma等，NatureBiotech.15159-163，1997。使用分子工程技術(shù)可以得到多種雙特異性融合蛋白。其中的一種形式，雙特異性融合蛋白是單價體，其組成例如，由scFv和Fab組成，其中scFv有第一抗原結(jié)合位點(diǎn)，F(xiàn)ab片段有第二抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙特異性融合蛋白的另外一種形式是二價體，其組成如，帶有兩個第一抗原結(jié)合位點(diǎn)的IgG，和帶有兩個第二抗原結(jié)合位點(diǎn)的兩個scFv。應(yīng)用重組技術(shù)也能在哺乳動物細(xì)胞中生產(chǎn)功能性雙特異性單鏈抗體(bscAb)，也被稱作雙抗體(diabodies)。參見如Mack等，Proc.Acad.Sci.，927021-7025，1995。例如，應(yīng)用重組方法將兩條單鏈Fv片段通過甘氨酸-絲氨酸接頭連接到一起。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法分離所需的兩個抗體的V輕鏈(VL)和V重鏈(VH)區(qū)。分別從VL、VH各自的雜交瘤中獲取VL和VH的cDNA，然后將其結(jié)合在一起形成單鏈片段，該過程使用了兩步法融合PCR技術(shù)。第一步的PCR是導(dǎo)入(Gly4-Ser1)3接頭(SEQIDNO9)，第二步PCR是連接VL和VH擴(kuò)增子。然后，將每個單鏈分子克隆到細(xì)菌表達(dá)載體。在擴(kuò)增之后，切除其中一條單鏈分子，將其亞克隆到另外一個載體，該載體包含第二條單鏈分子。所得到的bscAb片段亞克隆到真核表達(dá)載體。將該載體轉(zhuǎn)導(dǎo)到中國倉鼠卵巢細(xì)胞，使其表達(dá)所述功能性蛋白。雙特異性融合蛋白也可以以類似的方法進(jìn)行制備。雙特異性單鏈抗體和雙特異性融合蛋白均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。連接了兩個或多個不同單鏈抗體或抗體片段的雙特異性融合蛋白也可以類似的方法來生產(chǎn)?？梢詰?yīng)用重組技術(shù)來生產(chǎn)多種融合蛋白。例如，利用重組技術(shù)能夠生產(chǎn)包含來自人源化單克隆抗-CEA抗體的Fab片段和來自鼠抗-diDTPA的scFv片段的融合蛋白。一種可變接頭，如GGGS(SEQIDNO10)，將scFv連接到抗-CEA抗體的重鏈恒定區(qū)?？蛇x擇的，scFv也可以連接到hMN-14的輕鏈恒定區(qū)。通過PCR反應(yīng)將適合連接Fd重鏈和scFv的接頭序列導(dǎo)入VL和VH區(qū)。然后，將編碼scFv的DNA片段連接到包含編碼CH1區(qū)DNA序列的階段性(Staging)載體上。切除scFv-CH1構(gòu)建體，并將其連接到包含編碼抗-CEA抗體VH區(qū)DNA序列的載體上。使用所得到的載體轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，使其表達(dá)雙特異性融合蛋白。使用埃希氏大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)能夠大量生產(chǎn)bscAb和融合蛋白。參見如Zhenping等，Biotechnology，14192-196，1996。兩個“交叉-重疊”scFv片段在E.coli中共表達(dá)，可以生成功能性bscAb，所謂交叉重疊是指，兩個片段的VL和VH區(qū)分別位于不同的多肽鏈上。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)可以分離兩個抗體的V輕鏈(VL)區(qū)和V重鏈(VH)區(qū)。然后將其cDNA連接到細(xì)菌表達(dá)載體上，其中第一抗體VL區(qū)的C-末端通過接頭連接到第二抗體VH區(qū)的N-末端。相對應(yīng)的，第二抗體VL區(qū)的C-末端通過接頭連接到第一抗體VH區(qū)的N-末端。使用一種強(qiáng)啟動子對所得到的雙順反子操縱子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，可以使用的強(qiáng)啟動子如埃希氏大腸桿菌堿性磷酸酯酶啟動子，該啟動子可以使用磷酸鹽饑餓法進(jìn)行誘導(dǎo)?？蛇x擇的，使用lac啟動子和一種由2％甘氨酸和1％TritonX-100組成的培養(yǎng)基，也能在E.coli中有效表達(dá)單鏈融合構(gòu)建體。參見如Yang等，Appl.Environ.Microbiol.，642869-2874，1998。使用一種大腸桿菌熱穩(wěn)定性腸毒素II信號序列將所述肽介導(dǎo)到周質(zhì)腔。在完成分泌后，將兩種肽連接形成非共價異源二聚體，其具有兩種抗原結(jié)合特異性。應(yīng)用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法對bscAb進(jìn)行純化，如葡萄球菌蛋白A層析。還可以在轉(zhuǎn)基因家畜的奶中生產(chǎn)功能性bscAb和融合蛋白。參見如Colman，A.，Biochem.Soc.Symp.，63141-147，1998；美國專利號5827690。使用所述方法獲得bscAb片段，將其克隆到表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有優(yōu)選在乳房上皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子序列。這樣的例子包括，但不限于，兔、牛、和綿羊酪蛋白基因的啟動子，牛α-乳球蛋白基因的啟動子，綿羊β-乳球蛋白基因的啟動子，和鼠乳酸蛋白基因的啟動子。優(yōu)選的，所插入的bscAb的3’端側(cè)接有乳房特異性基因同源基因組序列。從而提供了聚腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定序列。將所述表達(dá)組件共同注射到受精原核，即哺乳動物的受精卵，然后將其植入雌性受體的子宮，使之發(fā)育。出生之后，用Southern分析方法篩選含有轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA的后代。使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)免疫分析方法分析雌性轉(zhuǎn)基因動物的奶，鑒定其是否含有預(yù)期的功能性bscAb。可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法純化奶中的bscAb。在奶中生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品bscAb是一種有效的方法，能夠獲得大量的bscAb。還可以在轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)本發(fā)明功能性的bscAb和融合蛋白。參見如Fiedler等，Biotech.，131090-1093，1995；Fiedler等，Immunotechnology，3205-216，1997。所述形式的產(chǎn)品有幾個優(yōu)點(diǎn)，包括低成本、大規(guī)模生產(chǎn)和能夠穩(wěn)定、長期的儲存。使用所述方法獲得bscAb片段，將其克隆到表達(dá)載體，該載體包含啟動子序列和編碼能夠?qū)⒌鞍捉閷?dǎo)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號肽的序列。有多種啟動子可供使用，只要它能使信號肽將表達(dá)產(chǎn)物介導(dǎo)到植物的特定部位。例如，使用花椰菜花葉病毒強(qiáng)啟動子35S，可以使蛋白在煙草植株的各個部位表達(dá)，使用種子特異性豆球蛋白B4啟動子可以使蛋白在特定的組織中表達(dá)。根據(jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化表達(dá)組件。使用Southern分析方法鑒定轉(zhuǎn)化子。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)免疫分析方法分析轉(zhuǎn)基因植株中是否含有具有功能的bscAb?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法從植物組織中純化bscAb。另外，轉(zhuǎn)基因植物能夠長期儲存bscAb和融合蛋白。已經(jīng)從室溫條件下儲存一周的煙草葉子中，提取出了功能活性的scFv蛋白。類似的，室溫儲存一年的轉(zhuǎn)基因煙草種子同樣沒有喪失scFv蛋白或其抗原結(jié)合活性。還可以在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)本發(fā)明功能性bscAb和融合蛋白。參見如Mahiouz等。J.Jmmunol.Methods，212；149-160(1998)?；诶ハx的表達(dá)系統(tǒng)能夠大量生產(chǎn)均質(zhì)和折疊正確的bscAb。桿狀病毒廣泛用作昆蟲細(xì)胞的表達(dá)載體，并且已經(jīng)成功用其重組了抗體分子。參見如Miller，L.K，Ann.Rev.Microbiol.，42177(1998)；Bei等，J.Immunol.Methods，186245(1995)?？蛇x擇的，可以使用一種誘導(dǎo)表達(dá)體系，其中所生成的穩(wěn)定昆蟲細(xì)胞系中包含bscAb構(gòu)建體，該構(gòu)建體受誘導(dǎo)啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。參見如Mahiouz等，J.Immunol.Methods，212；149-160(1998)。根據(jù)所述方法獲得bscAb片段，將其克隆到含有果蠅金屬硫蛋白啟動子和人類HLA-A2前導(dǎo)序列的表達(dá)載體中。然后將構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到D.melanogasterSC-2細(xì)胞。通過提高細(xì)胞周圍的銅、鋅或鎘的含量來誘導(dǎo)表達(dá)。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)免疫方法來檢測是否含有具有功能的bscAb。同樣使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化bscAb。本發(fā)明所優(yōu)選的雙特異性抗體是整合了MabMu-9的Fv與Mab679的Fv的抗體、和整合了MABMN-14的Fv與Mab679的Fv的抗體、以及它們的人類的、嵌合的或人源化的對應(yīng)物。美國專利5874540公開了所述MN-14以及它的嵌合的和人源化的對應(yīng)物。還優(yōu)選整合一個或多個Mu-9或679的CDRs的抗體?？贵w可以是一種整合了III-類抗-CEA抗體和679的Fv的融合蛋白或雙特異性抗體。美國專利4818709詳細(xì)記載了包括III-類抗-CEA抗體在內(nèi)的III-類抗體。VII.其它用途本發(fā)明囊括了bsAb和與所述靶向構(gòu)建體連接在一起的治療或診斷劑在手術(shù)中、血管內(nèi)和內(nèi)窺鏡腫瘤和損傷檢測、活檢和治療方面的用途，所述內(nèi)容在美國專利6096289中也有所記載。本發(fā)明的抗體和抗體片段不僅能夠用于治療或成像目的，而且能夠在體外進(jìn)行輔助研究。例如，可以在體外使用本發(fā)明的bsAbs來探知一種靶向構(gòu)建體是否能夠與一種或多種bsAbs形成穩(wěn)定的復(fù)合物。這樣的分析能夠幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員確定能夠與bsAbs形成穩(wěn)定復(fù)合物的靶向構(gòu)建體。反過來講，這也有助于本領(lǐng)域技術(shù)人員確定有可能用作治療和/或成像劑的靶向構(gòu)建體。所述分析通過如下方法進(jìn)行，將未確知的靶向構(gòu)建體與至少兩摩爾當(dāng)量的bsAb混合。溫育后，使用體積排阻HPLC分析混合物，來檢測靶向構(gòu)建體是否與bsAb發(fā)生了結(jié)合?？蛇x擇的，也可以使用標(biāo)準(zhǔn)組合方法進(jìn)行分析，其中將含有多種bsAbs的溶液點(diǎn)在標(biāo)準(zhǔn)96孔板上。在每個孔中加入靶向構(gòu)建體溶液。溫育后進(jìn)行分析，可以很容易地確定那個構(gòu)建體與所述bsAb(s)結(jié)合得最好。應(yīng)當(dāng)理解在所述分析中，bsAb和靶向構(gòu)建體的加入順序不是至關(guān)緊要的；即，可以將bsAb加入構(gòu)建體中，反之亦然。同樣的，bsAb和靶向構(gòu)建體也不用必須是溶液形式；即，它們在加入時可以是溶液形式，也可以不是溶液形式，無論那種形式只要是最方便的形式即可。最后，用于分析是否結(jié)合的方法也是無關(guān)緊要的，只要該方法能夠確定是否發(fā)生了結(jié)合。因此，人們可以使用如下的標(biāo)準(zhǔn)分析方法，包括但不限于FABMS、高-區(qū)域NMR或其它合適的方法，對是否結(jié)合進(jìn)行分析，所述方法可以與排阻HPLC聯(lián)合使用，也可以替代排阻HPLC方法使用。下面通過如下的實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，本發(fā)明不受如下實(shí)施例任何形式的限制。實(shí)施例實(shí)施例1)合成Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys-)-NH2(IMP243)使用Karacay等BioconjugateChem.11842-854(2000)所描述的方法合成所述肽，與文獻(xiàn)不同之處在于用D-酪氨酸代替了L-酪氨酸，用N-三苯甲基-HSG-OH代替了DTPA。在進(jìn)行N-三苯甲基-HSG-OH的最終偶聯(lián)時，所使用的N-三苯甲基-HSG-OH的量十倍于樹脂上肽的量。使用一個當(dāng)量的(相對于HSG)N-羥基苯并三唑、一個當(dāng)量的苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)膦六氟磷酸鹽(BOP)和兩個當(dāng)量的二異丙基乙胺對N-三苯甲基-HSG-OH(NMP中為0.28M)進(jìn)行活化。將活化底物與樹脂混合，室溫下持續(xù)15小時。實(shí)施例2)包含IMP243的Tc-99m試劑盒制備一種配方緩沖液，其含有22.093g的羥基丙基-β-環(huán)糊精、0.45g的2，4-二羥基苯甲酸、0.257g的醋酸鈉鹽、和10.889g的α-D-葡庚糖酸鈉鹽，所述成分溶解在170mL脫氮水中。用幾滴1M的氫氧化鈉將溶液的pH值調(diào)到5.3，然后稀釋到總量220mL。0.2mLSnCl2(200mg/mL)用3.8mL配方緩沖液進(jìn)行稀釋，制得含二價錫的緩沖溶液。將肽Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)(0.0026g)溶解于78mL的緩沖溶液中，并與0.52mL二價錫緩沖液混合。然后將肽溶液過濾，使用的是0.22μm的MillexGV濾器，取1.5mL等分濾液倒入3mL凍干瓶。然后立即將凍干瓶冷凍、凍干并在真空下卷曲密封。在試劑盒中加入1.5mL鹽水中的高锝酸鹽溶液(27mCi)。在室溫下溫育該試劑盒10分鐘，并在沸水浴中加熱25分鐘。在使用前將試劑盒冷卻到室溫。實(shí)施例3)通過雙特異性抗體腫瘤前靶向定位，將治療/成像放射性同位素?cái)y帶到腫瘤的肽合成了DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)(IMP237)，其通過雙特異性抗體腫瘤前靶向定位，將治療放射性同位素如90Y或177Lu遞送到腫瘤。雙特異性抗體由兩部分組成，其中一部分與腫瘤上的抗原相結(jié)合，另一部分與HSG肽相結(jié)合。與HSG肽相結(jié)合的抗體是679。該系統(tǒng)也可用于遞送成像同位素，如111In-111。IMP237的合成在Sieber酰胺樹脂上(Nova-Biochem)，使用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc固相肽合成技術(shù)將如下受保護(hù)的氨基酸裝配成肽骨架，依次是Fmoc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(But)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，，F(xiàn)moc-Phe-OH(試劑購自AdvancedChemtech)，三-t-丁基DOTA(大環(huán)的)。然后使用Dangles等J.Org.Chem.524984-4993(1987)的方法，用Pd[P(ph)3]4將側(cè)賴氨酸側(cè)鏈進(jìn)行去保護(hù)。然后加入三苯甲基HSG(其合成將在下面加以描述)形式的HSG配體，使用BOP/HBTU雙偶聯(lián)過程使之連接到氨基酸上。用TFA進(jìn)行處理，從而從樹脂上將肽切割下來，并脫去肽上的保護(hù)性基團(tuán)。利用HPLC純化肽，從1.823gFmoc-Lys(Aloc)-Tyr(But)-Lys(Aloc)-NH-Sieber酰胺樹脂中純化了0.6079g的肽。N-三苯甲基-HSG-OH的合成將甘氨酸-t-丁基鹽酸酯(15.263g，9.1×10-2mol)和19.760gNa2CO3混合，然后懸浮在50mLH2O中，并冰浴冷卻。然后在反應(yīng)溶液中加入琥珀酸酐(9.142g，9.14×10-2mol)，并使其溫度慢慢升至室溫，并攪拌18小時。將檸檬酸(39.911g)溶解在50mLH2O中，將其緩緩加入到反應(yīng)溶液中，然后用2×150mLEtOAc進(jìn)行萃取。將有機(jī)萃取物用Na2SO4干燥、過濾并濃縮，得到25.709g白色固體。將粗產(chǎn)物(25.709g)溶解在125mL二氧雜環(huán)乙烷中，在室溫水浴中冷卻，然后與11.244gN-羥基琥珀酰亞胺混合。向反應(yīng)溶液中加入15.0mL二異丙基碳二亞胺，并攪拌一個小時。將二鹽酸組胺(18.402g，1.00×10-1mol)溶解在100mLDMF和35mL二異丙基乙胺中。將組胺混合物加入反應(yīng)溶液中，在室溫下攪拌21小時。用100mL水使反應(yīng)淬滅，然后過濾除去沉淀。在高真空的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中除去溶劑。粗提產(chǎn)物溶解在300mL二氯甲烷中，并用100mL飽和NaHCO3萃取。有機(jī)層用Na2SO4干燥、并濃縮，得到34.19g的黃色油狀粗提產(chǎn)物。將粗提產(chǎn)物(34.19g)溶解在50mL氯仿中，并與31mL二異丙基乙胺混合。將氯化三苯甲基(25.415g)溶解在50mL氯仿中，并遂滴加入攪拌著的并在冰浴中冷卻著的反應(yīng)溶液中。攪拌反應(yīng)45分鐘，然后用100mL水使反應(yīng)淬滅。分離有機(jī)溶液層，并經(jīng)過Na2SO4干燥、和濃縮，得到綠色的膠狀物。用100mLEt2O搗碎膠狀物，形成黃色的沉淀，用3×50mL的Et2O洗滌沉淀物。將固相進(jìn)行真空干燥，得到30.641g(總產(chǎn)量的59.5％)的N-三苯甲基-HSG-t-丁基酯。將N-三苯甲基-HSG-t-丁基酯(20.620g，3.64×10-2mol)溶解在由30mL氯仿和35mL冰醋酸組成的溶液中。在冰浴下進(jìn)行反應(yīng)，并將15mLBF3-Et2O緩緩加入反應(yīng)溶液中。使反應(yīng)液緩慢升至室溫，并混合5小時。用200mL1M的NaOH滅反應(yīng)，并用200mL氯仿萃取所得產(chǎn)物。經(jīng)過Na2SO4使有機(jī)層干燥，并濃縮，得到粗提膠狀物，其中該膠狀物用100mLEt2O研制，形成沉淀。將粗提沉淀倒入400mL0.5MpH7.5的磷酸鹽緩沖液中，并用2×200mLEtOAc進(jìn)行萃取。用1MHCl將水層酸化至pH3.5，并用2×200mL氯仿萃取。形成沉淀，并經(jīng)過過濾收集沉淀(8.58g)。通過與先前樣品HPLC對照顯示，所述沉淀即為所預(yù)期的產(chǎn)品(ESMSMH+511)。放射標(biāo)記制備90Y試劑盒將DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)溶解在0.25MNH4OAc/10％HPCD緩沖液中，濃度分別為9、18、35、70和140μg/mL。將溶液在0.22μmMillexGV過濾器上進(jìn)行無菌過濾，取1mL加到酸沖洗過的凍干瓶中。將凍干瓶迅速冷凍干燥。凍干后將瓶在真空下密封，并從凍干器拿出時要卷曲密閉。將90Y(～400μCi/試劑盒)稀釋到1mL去離子水中，然后加入到凍干試劑盒中。將試劑盒在沸水浴中加熱15分鐘，然后將瓶冷卻到室溫，并使用反相HPLC評價被標(biāo)記的肽(HPLC條件WatersNoca-PakC-18，8×100mmRCM柱，洗脫液流速為3mL/min，洗脫液的線性梯度為從100％(0.1％TFA水溶液)到100％(90％CH3CN，0.1％TFA，10％H2O))。HPLC分析結(jié)果顯示在本試劑盒中，完全標(biāo)記所需要的肽的最小濃度是35μg/mL。反相HPLC示蹤結(jié)果顯示出了明顯的90Y標(biāo)記肽的峰。排阻HPLC結(jié)果顯示，當(dāng)將所述被標(biāo)記的肽與過量679IgG混合時，所述標(biāo)記肽完全結(jié)合到了679IgG上。用111In標(biāo)記將111In(～300μCi/試劑盒)稀釋到0.5mL去離子水中，然后加入到凍干試劑盒中。將試劑盒在沸水浴中加熱15分鐘，然后將瓶冷卻，然后加入0.5mL2.56×10-5M的溶解在0.5M醋酸鹽緩沖液中的In，然后將試劑盒再次在沸水浴中加熱15分鐘。將進(jìn)行肽標(biāo)記的瓶冷卻到室溫，并使用反相HPLC進(jìn)行評價(HPLC條件WatersNoca-PakC-18，8×100mmRCM柱，洗脫液流速為3mL/min，洗脫液的線性梯度為從100％(0.1％TFA水溶液)到100％(90％CH3CN，0.1％TFA，10％H2O))。HPLC分析結(jié)果顯示在進(jìn)行標(biāo)記時需要的肽的最小濃度(4.7％的游離111In)，在本試劑盒中，是35μg/mL。反相HPLC示蹤結(jié)果顯示出了明顯的111In標(biāo)記肽的峰。排阻HPLC結(jié)果顯示，當(dāng)將所述被標(biāo)記的肽與過量679IgG混合時，所述標(biāo)記肽完全結(jié)合到了679IgG上。體內(nèi)研究給帶有GW-39人類結(jié)腸異種移植腫瘤的裸鼠注射雙特異性抗體hMN-14×m679(1.5×10-10mol)。在注射111In標(biāo)記的肽(8.8μCi，1.5×10-11mol)之前，使抗體在體內(nèi)經(jīng)過24小時的清除。在分別注射3、24、48小時后，殺死動物。用hMN-14×m679進(jìn)行了前靶向定位后，肽在小鼠體內(nèi)的生理分布結(jié)果顯示在表1中。表2顯示了在前靶向定位研究中，肽在腫瘤中與非腫瘤中的比率。表1在注射hMN-14×m679后24小時，使用111In標(biāo)記的肽進(jìn)行的前靶向定位結(jié)果％注射量/g組織表2在注射hMN-14×m679后24小時，使用111In標(biāo)記的肽進(jìn)行前靶向定位腫瘤/非腫瘤組織的比率DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)(IMP237)和DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)(IMP241)的血清穩(wěn)定性肽標(biāo)記和HPLC分析根據(jù)Karacay等，BioconjugateChem.11842-854(2000)記載的方法標(biāo)記肽IMP237和IMP241。將IMP241肽(0.0019g)溶解在587μl0.5MpH5.5的NH4Cl溶液中。取1.7μl肽溶液稀釋到165μl0.5MpH5.5的NH4Cl溶液中。將10μl的111In(1.8mCi)加入到肽溶液中，并將混合液在沸水浴中加熱30分鐘。用HPLC法分析標(biāo)記的肽，所使用的柱子是Waters8×100mmradial-pak，nova-pakC-18RCM筒狀柱。柱子的洗脫條件如下，流速3mL/min，線性梯度從100％的0.1％TFA水溶液到100％的0.1％TFA溶解在90％乙氰和10％水中形成的溶液，洗脫時間為10分鐘。在柱子的無效空間中大約有6％的游離111In(1.6分鐘)。在5分鐘和6.6-8分鐘之間還有一些111In標(biāo)記的峰。111In標(biāo)記的肽洗脫時間為8.8分鐘，是一個獨(dú)立的峰。111InIMP237的HPLC輪廓與111InIMP241的輪廓非常接近。血清穩(wěn)定性將30μl的111InImp241置于300μl新鮮的小鼠血清中，并置于37℃溫育箱中。通過所述HPLC法對肽進(jìn)行監(jiān)測。將24μl的111InImp237置于230μl新鮮的小鼠血清中，并置于37℃溫育箱中。通過所述HPLC法對肽進(jìn)行監(jiān)測。分析結(jié)果顯示，與小鼠血清37℃溫育22小時后，檢測到111InIMP241已經(jīng)發(fā)生了緩慢的分解，分解率大約為5％。在37℃溫育22小時后，檢測到大約有70％的111InIMP237轉(zhuǎn)化為保留時間較短的成分。結(jié)論在與IMP237對比之下，IMP241肽中的D型酪氨酸使IMP241肽在小鼠血清中的分解速度變緩。IMP237和IMP241在體內(nèi)的穩(wěn)定性比較通過檢測(HPLC法)30分鐘和60分鐘時小鼠的尿樣品，來進(jìn)行111InIMP237和111InIMP241體內(nèi)穩(wěn)定性比較。其中的IMP237肽和IMP241肽使用所述方法進(jìn)行111In-111標(biāo)記。將標(biāo)記的肽注射到Balb/c小鼠中，分別在注射肽30分鐘和60分鐘后殺死動物，每一個時間點(diǎn)使用一只小鼠。隨后的HPLC示蹤結(jié)果表明，在排泄物中存在完整的111InImp241，而111InImp237幾乎全部代謝為一種新的111In標(biāo)記的肽。結(jié)論用D-Tyr取代肽骨架中的Tyr能使肽在體內(nèi)的代謝速率降至最低。其它的體內(nèi)研究給帶有GW-39人類結(jié)腸異種移植腫瘤的裸鼠注射雙特異性抗體mMU-9×m679(1.5×10-10mol)。在注射111In標(biāo)記的肽(8.8μCi，1.5×10-11mol)之前，使抗體在體內(nèi)經(jīng)過24小時的清除。在分別注射3、24、48小時后，殺死動物。用mMU-14×m679進(jìn)行了前靶向定位后，肽在小鼠體內(nèi)的生理分布結(jié)果顯示在表3中。表4顯示了在前靶向定位研究中，肽在腫瘤中與非腫瘤中的比率。表5顯示在沒有使用雙特異性抗體前靶向定位的情況下，肽在小鼠中的生理分布。表3在注射mMU-9×m679后48小時，使用111In標(biāo)記的肽進(jìn)行的前靶向定位結(jié)果％注射量/g組織表4在注射mMU-9×m679后48小時，使用111In標(biāo)記的肽進(jìn)行前靶向定位腫瘤/非腫瘤組織的比率表5單獨(dú)的111In標(biāo)記肽在體內(nèi)的生理分布實(shí)施例4)合成肽抗原應(yīng)用樹脂固相合成技術(shù)裝配肽Ac-Phe-Lys(Ac)-Tyr-Lys(Ac)-OH(SEQIDNO2)，將第一位的殘基(賴氨酸)以受保護(hù)的衍生物α-Fmoc-Lys(Aloc)-OH的形式連接到樹脂上。選擇性去掉α-Fmoc保護(hù)基團(tuán)，然后在后面的循環(huán)中依次偶聯(lián)上Fmoc-Tyr(OBut)、α-Fmoc-Lys(Aloc)-OH、和Fmoc-Phe-OH，并進(jìn)行α-氨基脫保護(hù)。與TFA反應(yīng)可以去掉Aloc-和OBut-側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，與乙酸酐反應(yīng)可以為游離α-和ε-氨基基團(tuán)帶上Ac，從而形成Ac-Phe-Lys(Ac)-Tyr-Lys(Ac)-OH(SEQIDNO2)。實(shí)施例5)將Ac-Phe-Lys(Ac)-Tyr-Lys(Ac)-OH(SEQIDNO2)偶聯(lián)到KLH將Ac-Phe-Lys(Ac)-Tyr-Lys(Ac)-OH(SEQIDNO2)肽溶解在水中，用1N的HCl將pH值調(diào)至4.0，然后用1摩爾當(dāng)量的1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺進(jìn)行處理，在4℃反應(yīng)1小時。PH為8.5的匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)與過量的100倍摩爾濃度的活化肽進(jìn)行綴合反應(yīng)，在4℃反應(yīng)1小時。使用排阻層析從未反應(yīng)肽中純化肽-KLH綴合物，用于生產(chǎn)抗體。實(shí)施例6)生成抗-肽Ab將肽抗原和完全弗氏佐劑混合物注射到免疫活性小鼠中。在隨后的幾周中，給小鼠施用兩次與不完全弗氏佐劑混合的肽進(jìn)行加強(qiáng)。從免疫動物中收集脾細(xì)胞，并使之與Sp2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞融合。所得克隆的培養(yǎng)物上清液用于ELISA法進(jìn)行抗-肽反應(yīng)分析，反應(yīng)板預(yù)先涂布肽免疫原。分離酶缺陷型雜交瘤，用于選擇融合細(xì)胞系，選擇在培養(yǎng)基上生長的克隆，使之產(chǎn)生抗肽Ab。實(shí)施例7)抗肽Ab的純化使用層析技術(shù)純化抗-肽Ab，首先使用蛋白A柱分離IgG組分，然后使用離子交換柱去掉產(chǎn)物中的雜質(zhì)。最后使用親和柱純化所需的Ab，其中親和柱的固相載體上結(jié)合了抗原肽，它是通過將所述肽化學(xué)偶聯(lián)到活性珠或活性樹脂上形成的。實(shí)施例8)將抗-肽Ab消化為F(ab’)2將抗-肽Ab與200μg/μlpH為4的的胃蛋白酶一起溫育1小時，然后使用串聯(lián)的蛋白A柱進(jìn)行純化，以去除未被消化的IgG，然后使用G-50-Sephadex柱進(jìn)行純化，以去除低分子量雜質(zhì)。實(shí)施例9)將抗肽Ab還原為Fab’-SH將抗肽F(ab’)2與新制備的半胱氨酸溶液一起反應(yīng)，使之還原為Fab’片段，其中半胱氨酸溶解在包含10mMEDTA的0.1MPBS緩沖液中。使用HPLC監(jiān)控反應(yīng)過程，在反應(yīng)完成后(大約1小時的時間)，使用旋轉(zhuǎn)-柱層析純化Fab’-SH，并貯存在pH小于5的含有10mMEDTA的脫氧緩沖液中。實(shí)施例10)將抗-CEA-IgG氧化偶聯(lián)到順丁烯二酰亞胺將抗-CEAAbIgG與10mM過氧化鈉在4℃黑暗中反應(yīng)90分鐘，使之氧化。使用旋轉(zhuǎn)柱層析純化氧化的Ab，并將其與過量的交聯(lián)接頭4-(4-順丁烯二酰亞胺苯基)丁酸肼(MPBH)混合。使反應(yīng)進(jìn)行2小時，然后使用旋轉(zhuǎn)柱層析純化IgG-腙-順丁烯二酰亞胺。與10mM氰氫硼化鈉進(jìn)行反應(yīng)，還原腙鍵，然后再次進(jìn)行純化。實(shí)施例11)制備抗-CEA-IgG×抗-肽-Fab’雙特異性Ab用等摩爾當(dāng)量實(shí)施例6中制備的抗-肽Fab’-SH處理實(shí)施例10中制備的IgG-肼-順丁烯二酰亞胺，pH值為6.0，室溫下反應(yīng)30分鐘。與碘乙酰胺反應(yīng)30分鐘，來阻遏剩余的游離的硫醇基團(tuán)。使用排阻層析純化雙特異性Ab抗-CEA-IgG×抗-肽-Fab’，去除未反應(yīng)的Fab’，然后進(jìn)行親和層析用固相結(jié)合肽從未反應(yīng)的IgG中分離IgG×Fab’。實(shí)施例12)Ac-Phe-Lys(Bz-DTPA)-Tyr-Lys(Bz-DTPA)-NH2(SEQIDNO2)的合成應(yīng)用樹脂固相合成技術(shù)裝配肽Ac-Phe-Lys(Bz-DTPA)-Tyr-Lys(Bz-DTPA)-NH2(SEQIDNO2)，將第一位的殘基(賴氨酸)以受保護(hù)的衍生物α-Fmoc-Lys(Aloc)-OH的形式連接到樹脂上。選擇性去掉α-Fmoc保護(hù)基團(tuán)，然后在后面的循環(huán)中依次偶聯(lián)上Fmoc-Tyr(OBut)、α-Fmoc-Lys(Aloc)-OH、和Fmoc-Phe-OH，并進(jìn)行α-氨基脫保護(hù)。與鈀(O)催化劑反應(yīng)除去Aloc側(cè)鏈。可選擇地，也可以使用Boc-基團(tuán)作為保護(hù)基團(tuán)，與TFA反應(yīng)可以去掉Boc-保護(hù)基團(tuán)，并使游離氨基與過量的ITC-Bz-DTPA反應(yīng)。在去除過量Bz-DTPA后，與乙酸酐反應(yīng)可以為游離α-氨基基團(tuán)帶上Ac，用TFA將完整的肽從樹脂上切割下來(期間伴隨著酪氨酰殘基的脫保護(hù))，從而形成Ac-Phe-Lys(Bz-DTPA)-Tyr-Lys(Bz-DTPA)-NH2。實(shí)施例13)用Y-90放射性標(biāo)記Ac-Phe-Lys(Bz-DTPA)-Tyr-Lys(Bz-DTPA)-NH2(SEQIDNO2)將標(biāo)題肽以100倍摩爾過量與釔-90放射性核素混合在pH5.5的醋酸鹽緩沖液中。在30分鐘后定量放射性標(biāo)記。實(shí)施例14)羧酸酯酶與di-DTPA-肽的連接將羧酸酯酶(5mg)溶解在pH8.0的0.2M的磷酸鹽緩沖液中，然后用5倍摩爾過量的交聯(lián)試劑硫代-琥珀酰亞胺基-[4-順丁烯二酰亞胺甲基]-環(huán)己烷-1-羧酸鹽(sulfo-SMCC)進(jìn)行處理。室溫?cái)嚢鑳蓚€小時后，使用G-25Sephadex旋轉(zhuǎn)柱從低分子量成分中分離活化的酶，并在含有1mMEDTApH為7的0.1M磷酸鹽緩沖液中平衡。將四肽N-乙?；?Cys-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH2(SEQIDNO11)(10倍摩爾過量)加入到活化的酶中，并溶解在與所述旋轉(zhuǎn)柱所使用的相同的緩沖液中。室溫?cái)嚢?小時后，使用G-25Sephadex離心柱層析從未反應(yīng)的肽中純化Cys-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH2(SEQIDNO11)肽羧酸酯酶綴合物，其中使用了pH6.0的0.25M醋酸鹽緩沖液。用銦-111對綴合物進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果證明所述過程成功地實(shí)現(xiàn)了綴合，然后使用排阻HPLC對綴合物進(jìn)行分析。實(shí)施例15)抗-CEA-IgG×抗肽-Fab’雙特異性抗體用于RAIT給予CEA表達(dá)腫瘤患者抗-CEA-IgG×抗肽-Fab’雙特異性Ab。7天后，給予患者Y-90-di-Bz-DTPA-肽(來自實(shí)施例13)。Y-90標(biāo)記的肽快速從非靶組織清除，而定位于用抗-CEA-IgG×抗-肽-Fab’雙特異性Ab前靶向的位點(diǎn)，導(dǎo)致腫瘤的破壞。實(shí)施例16)制備半乳糖-WI2-Fab’清除試劑使用實(shí)施例8中的方法，用胃蛋白酶將抗MN-14獨(dú)特型Ab消化為F(ab’)2片段，其中抗MN-14獨(dú)特型Ab又被稱作WI2。使用實(shí)施例9中的方法，用低分子量硫醇基團(tuán)將F(ab’)2還原為Fab’片段。在還原完成以后，用離心柱層析純化Fab’-SH，并使之與過量碘乙酰胺反應(yīng)來阻遏鉸鏈區(qū)硫醇，避免其再次連接。從過量碘乙酰胺再次純化Fab’，并使之與400倍摩爾過量的半乳糖苷化試劑，即氰甲基-2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-巰基-β-D-吡喃半乳糖苷的巰基-imidate，進(jìn)行反應(yīng)(參見Karacay等)。使用兩個旋轉(zhuǎn)柱純化半乳糖苷化蛋白，并使用MALDI-MS檢測半乳糖和Fab’的比率。實(shí)施例17)使用抗-CEA-IgG×抗-肽Fab’雙特異性Ab進(jìn)行RAIT，其中進(jìn)行了bsAb清除步驟。給CEA表達(dá)腫瘤患者施用抗-CEA-IgG(MN-14)×抗-肽Fab’雙特異性Ab。三天以后，給患者施用清除劑量的半乳糖-WI2-Fab’。在施用清除劑量的半乳糖-WI2-Fab’24小時后，給患者施用Y-90-di-Bz-DTPA-肽。Y-90標(biāo)記的肽在非靶組織中快速地被清除，但卻很好地定位于使用了抗-CEA-IgG×抗-肽-Fab’雙特異性Ab前靶向定位的位點(diǎn)上，從而有效地消滅腫瘤。實(shí)施例18)Ac-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO7)(IMP192)的合成將第一個氨基酸Aloc-Lys(Fmoc)-OH連接到肽合成器上的0.21mmol的Rink酰胺樹脂上，然后使用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc自動合成方案，將與殘基Fmoc-Cys(Trt)-OH和TscG結(jié)合的Tc-99m配體加入到賴氨酸側(cè)鏈上，從而形成如下的肽Aloc-Lys(TscG-Cys(Trt)-rink樹脂。然后使用8mLPd[P(Ph)3]4溶液進(jìn)行處理，去除Aloc基團(tuán)，其中所述Pd[P(Ph)3]4溶液的配比如下，將100mgPd[P(Ph)3]4溶解在由10mLCH2Cl2、0.75mL冰醋酸和2.5mL二異丙基乙胺組成的混合溶劑中。然后用0.8ml三丁基氫化物處理樹脂混合物，旋轉(zhuǎn)混合60分鐘。然后繼續(xù)在合成儀上進(jìn)行肽合成，形成如下的肽Lys(Aloc)-Tyr-Lys(Aloc)-Lys(Tscg-Cys)-rink樹脂(SEQIDNO7)。將8mL含有10mLDMF、3mL乙酸酐和6mL二異丙基乙胺的溶液加入到樹脂中，并旋轉(zhuǎn)混合，使N-末端進(jìn)行乙酰化。使用前面所述的方法去除側(cè)鏈Aloc保護(hù)基團(tuán)，然后使用哌啶處理樹脂，使用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc去保護(hù)方案去除所有的可能存在于樹脂上的醋酸。活化DTPA和DTPA的添加將5gDTPA溶解在40mL1.0M的四丁基銨氫氧化物甲醇溶液中。在高真空下去除甲醇，得到一種粘性油。將油溶解在50mLDMF中，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器高真空下去除揮發(fā)性溶劑。用DMF處理兩次以上。然后將粘性油溶解在50mLDMF中，并與5gHBTU混合。然后將8mL活化的DTPA溶液加入樹脂中，旋轉(zhuǎn)混合14小時。用DTPA重復(fù)處理，直至用Kaiser檢測法檢測時，樹脂呈現(xiàn)胺檢測陽性?？蛇x擇的，可以聯(lián)合使用DTPA四-t-丁基酯和常用的偶聯(lián)試劑，如DIC和HBTU。(參見AranoY，UezonoT，AkizawaH，OnoM，WakisakaK，NakayamM，SakaharaH，KonishiJ，YokoyamaA.，“Reassessmentofdiethylenetreaminepentaaceticacid(DTPA)asachelatingagentforindium-111labelingofpolypeptidesusinganewlysynthesizedmonoreactiveDTPAderivative.”，JMedChem.1996Aug30；39(18)3451-60)。切割和純化然后使用8mL由30mLTFA、1mL三異丙基硅烷、和1mL乙二硫酚組成的溶液處理樹脂60秒，從而將肽從樹脂上切割下來。將粗切割產(chǎn)物傾倒到30mL醚中，并通過離心收集沉淀。然后使用反相HPLC用4×30cmWaterspreparativeC-18Delta-Pak柱子(15μm，100埃)純化肽。收集HPLC組分，將其凍干獲得包含所需產(chǎn)物的組分，其中產(chǎn)物鑒定使用ESMS(MH±1590)法。試劑盒配制將肽裝配到凍干試劑盒中，該試劑盒包含78μg肽、0.92mg非放射性InCl3、100μg二價氯化錫、3mg龍膽酸和HPCD(再生10％)。實(shí)施例19)Tc-99m標(biāo)記及其穩(wěn)定性將1.5mL含有25mCiNa99mTcO4的鹽水加入到IMP192試劑盒中，來標(biāo)記IMP192。將試劑盒室溫溫育10mm，然后在沸水浴中加熱15mm。然后將標(biāo)記肽溶液冷卻到室溫。取其中一部分用于穩(wěn)定性研究。取其中一部分以1∶10的比例稀釋到鹽水、1mM半胱氨酸0.05MpH7.5的磷酸鹽溶液、和新鮮的人血清中。將最初的試劑盒溶液、鹽水稀釋液和半胱氨酸對比溶液在室溫下溫育，將血漿樣品在37℃下溫育。使用HPLC和ITLC對樣品進(jìn)行監(jiān)測。結(jié)果表明標(biāo)記肽在體外試驗(yàn)中是穩(wěn)定的。在血漿樣品中的標(biāo)記肽保留時間從6.3mm變?yōu)?.3min。保留時間的變化可能是因?yàn)檠獫{中的一些成分與肽發(fā)生了離子成對現(xiàn)象。表6實(shí)施例20)制備hMN-14×734(Fab×Fab)使hMN-14Fab’SH(一種人源化的單克隆抗-CEA抗體)和734Fab’mal(一種鼠抗-diDTPA)片段進(jìn)行交聯(lián)，從而制備所述bsAb，所使用的方法類似于實(shí)施例8的方法。使用10mM2-巰基乙胺在存在10mMpH7.3EDTA的條件下還原F(ab’)2片段，從而形成hMN-14和734的Fab’SH片段，反應(yīng)時間為60分鐘，反應(yīng)溫度為37℃。經(jīng)過旋轉(zhuǎn)柱(Penefsky)純化(SephadexG-50-80，50mMNaOAc，0.5mMEDTA，pH5.3)收集Fab’SH片段。使用4mMN，N’-o-亞苯基雙馬來酰亞胺將734Fab’SH片段導(dǎo)入順丁烯二酰亞胺，其中在RT下反應(yīng)60分鐘。使用旋轉(zhuǎn)柱純化技術(shù)分離Fab’mal。734Fab’mal和hMN-14Fab’SH的交聯(lián)反應(yīng)在4℃進(jìn)行16小時，兩者的摩爾比例是1∶1。為了打開在所述過程中可能形成的二硫鍵，將所述反應(yīng)混合物用10mM2-巰基乙胺處理1小時，pH為5.3，溫度為23℃。使用pH6.4的乙基順丁烯二酰亞胺將SH基團(tuán)阻遏。使用旋轉(zhuǎn)柱去除反應(yīng)混合物中的過量小分子量化合物。然后使用分析排阻HPLC柱Bio-SilSEC-250分離純化bsAb。純化的bsAb的HPLC保留時間為10.23分鐘。實(shí)施例21)HPLC結(jié)合研究使用氯胺T(Greenwood和Hunter)進(jìn)行bsAb的放射碘標(biāo)記。將標(biāo)記了放射碘的bsAbs結(jié)合到CEA、WI2(大鼠抗-MN-14獨(dú)特型抗體)和放射性標(biāo)記的肽基DTPA螯合物上，然后用分析排阻HPLC對所述結(jié)合物進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，在用10-20倍摩爾過量的CEA處理時，有大約90％的放射碘標(biāo)記的bsAb結(jié)合到了CEA上。bsAb與放射性銦標(biāo)記的DTPA螯合物(IMP-156或IMP-192)形成了復(fù)合物。IMP156Ac-Phe-Lys(DTPA)-TYR-Lys(DTPA)-NH2(SEQIDNO2)實(shí)施例22)血清穩(wěn)定性在溫度為37℃，潮濕、并含有5％二氧化碳的條件下，對放射性碘標(biāo)記的bsAb在新鮮人血清中的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測。取一部分在SE-HPLC上檢測。為了檢測與血清蛋白結(jié)合的放射性碘，取一部分與WI2混合，結(jié)果使bsAb峰的保留時間減少。在血清中溫育48小時后，bsAbs對WI2的結(jié)合能力損失了3-5％。在血清中溫育72小時后，bsAbs在血清中形成了少量的聚合物(4-7％)。實(shí)施例23)99m-Tc-IMP-192肽基螯合物Tc-99m復(fù)合物在體外的穩(wěn)定性試驗(yàn)通過如下方法進(jìn)行，將Tc-99m復(fù)合物分別在鹽水、新鮮人血清和10mM半胱氨酸溶液中溫育達(dá)20小時。從在前靶向定位研究中注射了99m-Tc-IMP-192的小鼠中，收集尿液，用于分析所述復(fù)合物在體內(nèi)的穩(wěn)定性。在尿液中檢測到放射活性表明尿液中存在完整的肽，因?yàn)镾E-HPLC結(jié)果顯示放射活性是與抗體結(jié)合的。99m-Tc-IMP-192在正常BALB/c小鼠中的生理分布研究表明其在血液中被快速清除，記載在表7中。體內(nèi)和體外研究結(jié)果均表明99mTTc-IMP-192具有穩(wěn)定性。表799m-Tc-IMP-192在BALB/c小鼠中的清除組織％ID/g1小時2小時4小時24小時肝臟0.27±0.180.22±0.160.09±0.020.04±0.0脾0.08±0.010.09±0.30.05±0.020.03±0.01腎4.16±0.754.05±0.603.21±0.991.21±0.08肺0.50±0.230.29±0.080.19±0.040.05±0.00血液0.30±0.090.21±0.030.14±0.040.05±0.01胃0.39±0.180.42±0.180.27±0.330.02±0.01小腸1.37±0.750.60±0.060.21±0.090.03±0.01大腸0.41±0.541.53±0.451.58±0.700.15±0.14肌肉0.10±0.060.05±0.000.03±0.010.00±0.0尿169±9557±156.30±4.530.20±0.02實(shí)施例24)構(gòu)建和表達(dá)hMN-14Fab-734scFv使用重組的方法來生產(chǎn)單價雙特異性融合蛋白，其中融合蛋白包含來自人源化單克隆抗-CEA抗體的Fab片段和來自小鼠抗-diDTPA的scFv片段。參見附圖3。單鏈734(734scFv)的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為GGGS(SEQIDNO10)-VL-(GGGGS)3(SEQIDNO9)-VH，其中近端的GGGS(SEQIDNO10)提供了一個彈性鍵，可以將scFv連接到hMn-14重鏈的恒定區(qū)上(附圖1)?？蛇x擇的，scFv也可以連接到hMN-14輕鏈的恒定區(qū)上。使用特異性引物組通過PCR反應(yīng)，將適合框架內(nèi)連接hMN-14重鏈Fd和734scFv的接頭序列導(dǎo)入734的VL和VH區(qū)。PCR擴(kuò)增734VL所使用的引物組是734VLscFv5′(Cys)和734VLscFv3′(所述引物的多肽和多核苷酸序列記載在美國專利申請系列號09337756中，申請日為1999年6月22日，所述專利全文引入本申請)。引物734VLscFv5′(Cys)是編碼人類IgG1鉸鏈區(qū)前四個殘基(PKSC)(SEQIDNO12)的有義鏈序列，其中所述四個氨基酸殘基通過一個短的彈性接頭GGGS(SEQIDNO10)，與734VL的前六個氨基酸殘基(QLVVTQ)(SEQIDNO13)框架內(nèi)連接。人類鉸鏈區(qū)必須包括一個半胱氨酸，因?yàn)榘腚装彼釋τ趆MN-14重鏈Fd-734scFv融合和hMN-14輕鏈之間形成鏈間二硫鍵是必需的。在CH1區(qū)和鉸鏈區(qū)結(jié)合處的內(nèi)含子序列中插入Pst1位點(diǎn)，以便于后續(xù)過程中的連接。引物734VLscFv3′是編碼734VL區(qū)末端六個氨基酸殘基(TKLKIL)(SEQIDNO14)和部分彈性接頭序列(GGGGSGGGG)(SEQIDNO15)的反義序列，其框架內(nèi)融合在VL區(qū)的下游。PCR擴(kuò)增后，首先用T4DNA聚合酶處理擴(kuò)增產(chǎn)物(～400bp)，除去末端額外“A”殘基，“A”殘基是在PCR擴(kuò)增中添加到末端的，然后使用Pst1進(jìn)行消化。所得到的產(chǎn)物是一種雙鏈DNA片段，其具有Pst1突出端和鈍端。734VHPCR擴(kuò)增所使用的引物組是734VHscFv5′和734VHcFv3′(Sac1)。引物734VHscFv5′(參見專利系列號09337756)是編碼連接VL和VH序列的彈性接頭(SGGGGS)(SEQIDNO16)的剩余部分和734VH區(qū)的前六個氨基酸殘基(EVKLQE)(SEQIDNO17)的正義鏈序列。引物734VHscFv3′(Sac1)(參見專利系列號09337756)是編碼734VH區(qū)末端六個氨基酸殘基(TVTVSS)(SEQIDNO18)的反義序列。另外還包括一個翻譯終止密碼子。在終止密碼子的下游插入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Eag1和Sac1，以便于進(jìn)行亞克隆。類似的，首先用T4DNA聚合酶處理PCR擴(kuò)增VH產(chǎn)物(～400bp)，以除去PCR產(chǎn)物末端額外的“A”殘基，然后用Sac1進(jìn)行消化，得到具有鈍端一粘性末端的VHDNA片段。構(gòu)建含有人類IgG1基因組序列SacII酶切片段的pBlueScript(Stratagene，LaJolla)階段性載體(HClkbpSK)。該基因組SacII酶切片段包含一部分5’內(nèi)含子、人類IgG1CH1區(qū)、將CH1區(qū)與鉸鏈區(qū)連接的內(nèi)含子序列、鉸鏈序列、將鉸鏈區(qū)連接到CH2區(qū)的內(nèi)含子序列、和部分CH2區(qū)。通過Pst1/Sac1消化，去掉HClkbpSK中包含鉸鏈區(qū)和部分CH2區(qū)的片段，然后將所產(chǎn)生的克隆位點(diǎn)用于與所述過程中所制備的VL(Pst1/鈍端)和VH(鈍端/Sac1)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的共連接。通過內(nèi)含子將所得構(gòu)建體(CH1-734pSK)中的CH1區(qū)與734scFv基因序列相連接(附圖4)。因?yàn)镮gG1的基因組SacII片段僅包括位于CH1區(qū)旁側(cè)的5’內(nèi)含子序列的一部分，因此需要將剩余的內(nèi)含子序列(其作為BamH1/SacII酶切片段)插入到CH1-734pSK的相應(yīng)部位，從而重建完整的內(nèi)含子序列。然后分離BamH1/Eag1酶切片段，其包含完整5’內(nèi)含子、CH1區(qū)、用于連接的內(nèi)含子、5個鉸鏈殘基、短的GGGS接頭(SEQIDNO10)、和734scFv序列，并將其用于取代hMN-14pdHL2載體內(nèi)的包含人類基因組IgG1恒定序列的HindIII/Eag1酶切片段。使用一端帶有BamH1突出端，另一端帶有HindIII突出端的HNB接頭，來將BamH1/Eag1酶切片段更容易的連接到hMN-14pdHL2載體的HindIII/Eag1位點(diǎn)。所得到的載體命名為hMN-14-734pdHL2，可用其轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，來表達(dá)雙特異性蛋白。所使用的hMN-14pdHL2載體來自載體pdHL2，該載體在以前的文獻(xiàn)中有所記載。參見Losman等，CancerSupplement，802660，1997。hMN-14pdHL2載體是使用如下方法構(gòu)建的，使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)用hMN-14的VH和Vκ區(qū)取代hLL2pdHL2的VH和Vκ區(qū)(附圖5)。通過電穿孔技術(shù)將hMN-14-734pdHL2載體轉(zhuǎn)染到SP2/0細(xì)胞，經(jīng)過鑒定，所述細(xì)胞克隆分泌了bsAb。利用蛋白L柱(Pierce，Rockford，IL)從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化得到的bsAb是75kD的蛋白(根據(jù)氨基酸序列進(jìn)行估計(jì))，在非還原SDS-PAGE電泳中，它與66kD的標(biāo)記物遷移率相同，這可能是由于它的二級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的(附圖2，泳道2)。在還原條件下，觀察到對應(yīng)于重鏈(50kD)和輕鏈(25kD)的條帶(附圖2，泳道4)。轉(zhuǎn)染瘤分泌的κ鏈單體(25kD)和二聚體(50kD)也得到了共純化(附圖2，泳道2)，因?yàn)榈鞍譒與人、小鼠和大鼠的κ輕鏈相結(jié)合。使用離子交換層析進(jìn)一步從κ單體和二聚體中分離bsAb。純化的hMN-14Fab-734scFv表現(xiàn)出了劑量依賴方式特異性結(jié)合CEA和In-DTPA-BSA的特性。實(shí)施例25)在奶中轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)bscAb將bscAb片段克隆到表達(dá)載體，該載體包含5’酪蛋白啟動組序列和位于插入位點(diǎn)旁側(cè)面3’不翻譯基因組序列。然后使用現(xiàn)有技術(shù)中的標(biāo)準(zhǔn)過程，將表達(dá)組件注射到小鼠受精卵細(xì)胞原核中。然后將卵細(xì)胞植入雌性受體的子宮中，使之孕育。在出生后，通過Southern分析篩選存在轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA的后代。然后使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的標(biāo)準(zhǔn)免疫方法，來分析轉(zhuǎn)基因雌性鼠的奶中是否存在bscAb，并分析所存在的bscAb是否具有功能?？梢岳每贵w對免疫抗原的互補(bǔ)結(jié)合特性，或利用柱層析、或其它的現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法，從奶中純化bscAb。實(shí)施例26)在植物中轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)bscAb將bscAb片段克隆到表達(dá)載體，該載體包含截短的豆球蛋白B4啟動子，加上Vicisfaba的LeB4不翻譯RNA前導(dǎo)序列的54個堿基對和編碼LeB4信號肽、將蛋白介導(dǎo)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的序列。根據(jù)Zambryski等描述的方法，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將表達(dá)組件轉(zhuǎn)化到煙草葉片中。通過Southern分析鑒定轉(zhuǎn)化子。使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的標(biāo)準(zhǔn)免疫方法分析轉(zhuǎn)基因植物中是否存在bscAb，并分析所存在的bscAb是否具有功能?？梢允褂矛F(xiàn)有技術(shù)中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法從植物組織中純化bscAb。實(shí)施例27)前靶向定位試驗(yàn)使用帶有GW39異種移植腫瘤的雌性裸鼠(TaconicNCRNU，3-4周齡)用于前靶向定位試驗(yàn)。腫瘤重量為0.3-0.8g。表8125-I-hMN-14×734bsAb和111-In-銦-IMP-156肽在GW-39異種移植腫瘤裸鼠中的生理分布在注射111-In-銦-IMP-156前，給hMN-14×734留出48小時進(jìn)行定位的時間。在注射111-In-銦-IMP-1563小時后進(jìn)行生理分布檢測。bsAb與肽的施用比例為1∶0.03。對于每個時間點(diǎn)取5只動物進(jìn)行檢測。125-I-hMN-14×734111-In-銦-IMP-156組織％ID/gT/NT％ID/gT/NT腫瘤2.9±1.115.2±1.91肝臟0.1±0.0619±60.5±0.0910.6±3.5脾0.5±0.036.3±1.20.5±0.112±6腎0.3±0.089.3±1.81.9±0.52.6±0.5肺0.3±0.112±30.4±0.112±2血液0.3±0.111±20.7±0.27.6±1.5表9在注射后3個小時，對照組對111-In-銦-IMP-156的清除。％ID/gT/NT腫瘤0.14±0.021肝臟0.42±0.10.3±0.1脾0.28±0.090.5±0.1腎0.93±0.130.2±0.03肺0.04±0.013.5±0.7血液0.05±0.013.1±0.7表10給GW39異種移植腫瘤裸鼠施用125-I-標(biāo)記的bsAb(5μCi，15μg，1.5×10-10mol)。在注射99m-Tc-IMP-192(10μCi，1.6×10-11mol的肽)之前，為hMN-14×734留出24小時的定位和清除時間。分別在注射99m-Tc-IMP-192后30分鐘、1小時、3小時、和24小時進(jìn)行生理分布研究，每個時間點(diǎn)取5只動物。BsAb與肽的比例是1∶0.1。125-I-hMN-14×734％ID/g組織30分鐘1小時3小時24小時腫瘤4.9±1.16.0±2.35.5±1.13.3±0.7肝臟0.6±0.10.5±0.20.5±0.10.1±0.02脾0.8±0.30.7±0.30.7±0.20.2±0.03腎0.5±0.10.5±0.10.5±0.10.1±0.02肺0.9±0.30.8±0.20.8±0.30.3±0.1血液0.9±0.31.2±0.41.1±0.30.2±0.0799m-Tc-IMP-192％ID/g組織30分鐘1小時3小時24小時腫瘤11.4±4.814.3±3.612.6±5.28.7±3.3肝臟1.4±0.30.9±0.20.6±0.10.4±0.08脾1.2±0.40.8±0.20.5±0.10.4±0.2腎9.9±6.14.6±0.72.4±0.51.2±0.3肺4.2±3.43.6±1.91.0±0.30.3±0.1血液4.3±1.23.5±0.91.7±0.40.6±0.2表11給GW39異種移植腫瘤裸鼠施用125-I-標(biāo)記的bsAb(5μCi，15μg，1.5×10-10mol)。在注射99m-Tc-IMP-192(10μCi，1.6×10-11mol的肽)之前，為hMN-14×734留出24小時的定位和清除時間。分別在注射99m-Tc-IMP-192后30分鐘、1小時、3小時、和24小時時進(jìn)行生理分布研究，每個時間點(diǎn)取5只動物。BsAb與肽的比例是1∶0.1。125-I-hMN-14×腫瘤/非腫瘤的比率組織30分鐘1小時3小時24小時肝臟8.8±1.512.1±5.510.3±2.523.8±3.5脾6.4±1.69.3±4.07.9±1.718.2±4.0腎10.0±2.612.5±4.511.1±3.027.3±4.6肺6.2±2.38.4±4.67.2±2.312.4±6.6血液5.7±2.14.9±1.25.1±1.314.5±3.699m-Tc-IMP-192腫瘤/非腫瘤的比率組織30分鐘1小時3小時24小時肝臟7.9±1.715.7±5.420.7±7.622.3±7.4脾9.4±1.019.5±8.622.9±7.523.8±3.5腎1.2±0.23.1±0.65.2±1.57.3±1.9肺3.7±1.75.5±3.613.3±7.130.8±14.4血液2.7±0.74.2±1.37.3±2.316.1±6.4表12GW-39腫瘤裸鼠的對照組施用99m-Tc-IMP-192(10μCi，1.6×10-11mol的肽)，3小時后處死99m-Tc-IMP-192組織％ID/g腫瘤0.2±0.05肝臟0.3±0.07脾0.1±0.05腎2.6±0.9肺0.2±0.07血液0.2±0.09在假定一分子肽與一分子bsAb結(jié)合的情況下，從所述數(shù)據(jù)中計(jì)算出了99m-Tc-IMP-192占據(jù)腫瘤上的DTPA結(jié)合位點(diǎn)的百分率，其中的腫瘤已經(jīng)結(jié)合了bsAb。然而，一分子的肽也有可能與兩分子的bsAb交聯(lián)。表1399m-Tc-IMP-192占據(jù)腫瘤上的DTPA結(jié)合位點(diǎn)的百分率，其中腫瘤已經(jīng)結(jié)合了bsAb。時間hMN-14×73430分鐘25.41小時25.83小時2524小時28所述試驗(yàn)結(jié)果表明人源化×鼠bsAb保留了與CEA和銦-DTPA結(jié)合的能力；hMN-14×734(Fab×Fab)能夠有效靶向腫瘤組織；雙重功能的肽基Tc-99m螯合劑是穩(wěn)定的；99m-Tc-IMP-192復(fù)合到腫瘤定位的hMN-14×734上，并至少維持24小時；在注射99m-Tc-IMP-192后的較早時間點(diǎn)(在注射后1-3小時)可以進(jìn)行腫瘤成像。實(shí)施例28)使用抗-CEAFab×抗-肽scFv融合蛋白進(jìn)行RAIT，其中加入了bsAb清除步驟一位69歲的患有結(jié)腸癌的男性患者，在進(jìn)行完切除手術(shù)后一年，發(fā)現(xiàn)CEA在血漿中的濃度為50ng/mL。給患者進(jìn)行了CT掃描，發(fā)現(xiàn)在其肝臟的左半部有5個腫瘤，大小在1cm-3cm之間。給患者施用100mg的hMN-14-Fab/734-scFv融合蛋白。三天后，給患者施用清除劑量的半乳糖-WI2-Fab′。在施用清除劑量的半乳糖-WI2-Fab′24小時后，血液中融合蛋白的濃度比注射清除試劑前降低了20倍。然后給患者注射IMP245Y-90-di-Bz-DTPA-肽，其中包含50mCi的Y-90。三個月后進(jìn)行CT掃描，結(jié)果表明5個腫瘤中消失了3個，剩余的兩個腫瘤體積沒有增大。同時，CEA在血漿中的濃度降低為10ng/mL。在隨后的6個月中，CEA在血漿中的水平?jīng)]有增加，并且CT掃描結(jié)果表明所剩下的兩個腫瘤沒有增長。在第一次治療后1年，在觀測到患者CEA水平有所增高時，再次對患者進(jìn)行了所述過程的治療，在第二次治療后3個月和6個月時，觀測到兩個腫瘤的體積發(fā)生了縮小。在6個月后，CEA在血漿中的水平不超過5ng/mL。實(shí)施例29)羧酸酯酶-DTPA綴合物的制備將兩瓶兔肝臟羧酸酯酶(SIGMA；蛋白含量～17mg)溶解在2.2mL的0.1MpH7.7的磷酸鈉緩沖液中，并與25倍摩爾過量的CA-DTPA混合，其中CA-DTPA是新制備的DMSO中的儲存溶液(～25mg/mL)。在綴合反應(yīng)混合物中，DMSO的最終濃度為3％(v/v)。溫育1小時后，使用兩個5mL的旋轉(zhuǎn)柱(SephadexG50/80，流動相為pH7.30.1M的磷酸鈉緩沖液)對混合物進(jìn)行預(yù)純化，除去過量的試劑和DMSO。使用TSK3000GSupelco柱對所述洗脫液進(jìn)行進(jìn)一步的純化，流動相為0.2MpH6.8的磷酸鈉緩沖液，流速為4ml/分鐘。使用Centricon-10TM濃縮器將包含綴合物的組分濃縮，期間將緩沖液變?yōu)?.1MpH6.5的醋酸鈉緩沖液?；厥章?.9ml，4.11mg/ml(3.7mg)。聯(lián)合使用分析型HPLC和線內(nèi)UV檢測對所述產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果表明有一個保留時間為9.3分鐘的主峰和一個保留時間為10.8分鐘的小峰，兩者的比率為95∶5。酶分析結(jié)果表明115酶單位/mg蛋白，相當(dāng)于沒有經(jīng)過修飾的羧酸酯酶。對沒有經(jīng)過修飾的羧酸酯酶和DTPA-修飾的羧酸酯酶進(jìn)行質(zhì)譜分析(MALDI模式)，結(jié)果表明DTPA的平均取代率接近1.5。使用已知的過量放射性銦示蹤進(jìn)行金屬結(jié)合分析，在兩次完全相同的試驗(yàn)中，得到的結(jié)果分別為DTPA酶為1.24和DTPA酶為1.41。使用活性為12.0mCi/mg的In-111醋酸鹽標(biāo)記羧酸酯酶-DTPA，然后使用過量的非放射性銦醋酸鹽進(jìn)行處理，最后使用10mMEDTA進(jìn)行處理，清除其中過量的非放射性銦。HPLC和ITLC分析結(jié)果顯示放射性銦的摻入率為97.7％。用20倍摩爾量的過量雙特異性抗體hMN-14Fab′×734Fab′與經(jīng)過HPLC分析的樣品反應(yīng)，使樣品與抗體完全絡(luò)合，然后將所得到的產(chǎn)物進(jìn)一步與WI2(hMN-14的抗-ID)進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)，其中WI2是雙特異性抗體的80倍。實(shí)施例30)IMP224的合成將0.0596g包含肽IMP221(H2N-NH-C6H4-CO-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH2MH+1322，通過FmocSPPS制備的)的苯肼與0.0245g溶解在3mLDMF中的鹽酸多索魯比辛混合。將反應(yīng)溶液在室溫下黑暗條件下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)4個小時后，加入0.0263g的IMP221，然后繼續(xù)反應(yīng)過夜。然后使用HPLC純化所有的反應(yīng)混合物，HPLC條件為WatersNova-Pak(3-40×100mmsegment，6μm，60埃)制備柱，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液的梯度為緩沖液A∶B＝80∶20到A∶B＝60∶40，洗脫40分鐘(緩沖液A＝0.3％NH4OAc，B＝0.3％NH4Oac在90％CH3CN中)。合并包含產(chǎn)物的組分，并使之凍干，得到0.0453g的預(yù)定產(chǎn)物，然后使用ESMAMH+1847進(jìn)行進(jìn)一步的確定。實(shí)施例1)IMP224試劑盒的配制將實(shí)施例31的肽裝入到試劑盒中，在后續(xù)過程中用In-111對其進(jìn)行標(biāo)記。制備85mL包含5.014g2-羥丙基-β-環(huán)糊精、和0.598g檸檬酸的溶液。用1M的NaOH將溶液的pH調(diào)至4.20，并用水稀釋到100mL。將0.0010g的IMP224肽溶解在100mL緩沖液中，取其中1mL經(jīng)過0.22μmMillexGV濾膜進(jìn)行無菌過濾，過濾到2mL的凍干瓶中，然后將其立即冷凍干燥。實(shí)施例32)In-111對IMP224試劑盒進(jìn)行標(biāo)記將In-111溶解在0.5mL水中，并注射到凍干試劑盒中。將試劑盒溶液室溫下溫育10分鐘，然后加入0.5mLpH7.2的緩沖液，其中所用的緩沖液包含0.5M的NaOAc和2.56×1-5M的非放射性的銦。實(shí)施例33)IMP224試劑盒的體外穩(wěn)定性用2.52mCi的In-111使用所述方法對其中一個IMP224試劑盒進(jìn)行標(biāo)記。取其中一部分體積(0.15mL，370μCi)與0.9mL0.5MpH4.0的檸檬酸鹽緩沖液、0.9mL0.5MpH5.0的檸檬酸鹽緩沖液和0.9mL0.5MpH7.5的磷酸鹽緩沖液混合。然后使用反相HPLC對標(biāo)記的肽進(jìn)行穩(wěn)定性研究。HPLC的條件是WatersRadial-PakC-18Nova-Pak8×100mm，流速為3mL/分鐘，梯度為100％A到100％B，其中A為0.3％NH4Oac，B為90％CH3CN、0.3％NH4Oac，洗脫時間為10分鐘。表14In/In-111IMP224的體外穩(wěn)定性結(jié)果*表示已經(jīng)分解沒有計(jì)算在峰面積中的肽實(shí)施例34)IMP221在BALB/c小鼠中的體內(nèi)生理分布將0.5mL含400μCiIn-111的水加入到試劑盒中。將該In-111試劑盒溶液室溫下溫育10分鐘，然后用含1.5mL非放射性的銦的pH7.20.5M的醋酸鹽緩沖液將其稀釋。然后使用ITLC在飽和NaCl條件下分析標(biāo)記的肽。游離In-111位于ITLC長條上部20％。給每只小鼠注射100μL(20μCi)的In-111標(biāo)記肽。分別在注射后30分鐘、1小時、2小時、4小時和24小時時將動物麻痹并殺死，每個時間點(diǎn)取三只小鼠。分別取鼠的血液、肌肉、肝臟、肺、腎、脾、大腸、小腸、胃、尿和尾巴，計(jì)算其分布量。所述生理分布研究結(jié)果列于下表中。表15IMP224(Dox＝N-NH-C6H4-CO-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH2MH+1847，已經(jīng)用In-111進(jìn)行了標(biāo)記，并用非放射性的In進(jìn)行了飽和)在BALB/c小鼠中的生理分布結(jié)果，％ID/g。實(shí)施例35)IMP224的體內(nèi)穩(wěn)定性和清除將0.5mL含400mCiIn-111的水加入到試劑盒中。將該In-111試劑盒室溫下溫育10分鐘，然后用含0.5mL非放射性的銦的pH7.20.5M的醋酸鹽緩沖液將其稀釋。然后使用ITLC在飽和NaCl條件下分析標(biāo)記的肽。游離In-111位于ITLC長條上部20％。給每只小鼠注射100μL(400μCi)的In-111標(biāo)記肽。分別在注射后30分鐘和1小時時將動物麻痹并殺死，每個時間點(diǎn)取兩只動物。收集血清和尿樣品，并將其儲存在冰上，并盡量快速地將其在冰上運(yùn)送到HPLC處，進(jìn)行HPLC分析。尿樣品的HPLC(排阻層析)分析結(jié)果顯示，In-111標(biāo)記的肽仍能與抗體結(jié)合。反相HPLC分析結(jié)果顯示，在尿中的放射性標(biāo)記肽是完整的。在血清中殘留的活性量太低，不能使用靈敏度較低的反相HPLC進(jìn)行分析。多索魯比辛在肝膽管中的清除率～95％。因此，通過將可水解形式的雙DTPA肽連接到藥物上，從而使藥物在體內(nèi)的生理分布轉(zhuǎn)變?yōu)?00％從腎中排泄。這可以使藥物在體內(nèi)的毒性大大降低，因?yàn)樗械奈窗邢蚨ㄎ坏乃幬锒伎梢砸酝暾问奖豢焖倥判?。?6在尿和血清中回收到的活性實(shí)施例36)用IMP224和IMP225進(jìn)行前靶向定位試驗(yàn)使用一種包含10μg肽的IMP224凍干試劑盒。向2ml的凍干試劑瓶中加入1mL無菌水。取其中0.5mL與1.0mCiIn-111混合。將所述In-111試劑盒溶液在室溫下溫育10分鐘，然后取其中0.1mL用1.9mL非放射性的銦醋酸鹽緩沖液BM8-12稀釋在無菌瓶中。然后使用ITLC在飽和NaCl條件下分析標(biāo)記的肽。游離In-111位于ITLC長條上部20％。使用帶有GW-39異種移植腫瘤的雌性裸小鼠(TaconicNCRNU，3-4周齡)進(jìn)行前靶向定位試驗(yàn)。腫瘤在0.3-0.8g之間。給每只動物注射100微升(5μCi，15μg，1.5×10-10mol)的I-125標(biāo)記的抗體F6×734-(Fab′)2。72小時后，給每只小鼠注射100微升(10μCi)In-111標(biāo)記的肽。然后分別在注射后1小時、4小時和24小時時將動物麻醉并殺死，每個時間點(diǎn)取5只鼠。然后取小鼠的腫瘤、血液、肌肉、肝臟、肺、腎、脾、大腸、小腸、胃、尿和尾巴，并進(jìn)行計(jì)算。用包含11μg肽的IMP225(Ac-Cys(Dox-COCH2)-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH2(SEQIDNO11)MNa+1938)凍干試劑盒重復(fù)所述的試驗(yàn)。表17In-111-IMP-224在GW-39腫瘤異種移植裸鼠中的生理分布，在72小時前曾施用了F6×734-F(ab′)2。單位為％ID/g組織。n＝5。表18In-111-IMP-224在GW-39腫瘤異種移植裸鼠中的生理分布，在72小時前曾施用了F6×734-F(ab′)2。數(shù)據(jù)是腫瘤與正常器官的比率。n＝5。表19In-111-IMP-225在GW-39腫瘤異種移植裸鼠中的生理分布，在72小時前曾施用了F6×734-F(ab′)2。單位為％ID/g組織。n＝5本發(fā)明所述的雙特異性構(gòu)建體或其它具有類似特性的物質(zhì)均適合用于前靶向定位RAIT，其中IMP-192和它的類似物用治療放射性同位素如188-Re、213-Bi、67-Cu等進(jìn)行了標(biāo)記。應(yīng)當(dāng)認(rèn)為治療螯合物能夠綴合到肽上，其中肽除了具有螯合物表位外，還有可被bsAbs識別的表位，這正如前面所描述的。還應(yīng)當(dāng)意識到，可以使用本發(fā)明的前靶向定位方法，將可檢測的放射性標(biāo)記連接上不同的接頭，直接被介導(dǎo)到預(yù)定位點(diǎn)，如腫瘤，其中所述預(yù)定位點(diǎn)是將要在手術(shù)中、內(nèi)窺鏡、血管內(nèi)或其它類似過程中被切除的或是被檢測的和/或是被治療的。使用非放射性的bsAbs也可以實(shí)現(xiàn)前靶向定位，而且在所述過程中，最后所施用的低分子量放射性標(biāo)記接頭，在體內(nèi)定位的速度和未結(jié)合接頭在體內(nèi)的清除速度都比較快，這與手術(shù)過程中應(yīng)當(dāng)避免不必要的拖延相一致，并且所述過程中還可以使用半衰期較短的放射性同位素。另外，所公開的治療劑也可以用于手術(shù)后的放射性免疫治療方案，以確保徹底根除殘余的腫瘤細(xì)胞。實(shí)施例37)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)(IMP245)的合成使用在合成IMP192時所描述的雙偶聯(lián)過程來合成所述肽。使用5eq受保護(hù)的DOTA將三-t-丁基DOTA加到帶有單個苯并三唑-1-基-氧代-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟磷酸鹽(BOP)的肽的C-末端，偶聯(lián)時間為16小時。然后用醋酸酐處理樹脂。然后使用鈀催化劑去掉側(cè)鏈上的Aloc基團(tuán)，并根據(jù)合成IMP243時所描述的方法，加上N-三苯甲基-HSG基團(tuán)。將產(chǎn)物從樹脂上切割下來，并用HPLC純化，收集其中的四種組分，凍干后，得到0.2385g的產(chǎn)物。ESMSMH+1832實(shí)施例38)Tc-99m試劑盒組成制備一種配方緩沖液，其包含22.093g的羥丙基-β-環(huán)糊精、0.45g的2，4-二羥苯甲酸、0.257g的醋酸鈉、和10.889g的α-D-葡庚糖酸鈉，將所述成分溶解在170mL的脫氮水中。用幾滴1M的NaOH將所述溶液的pH調(diào)至5.3，然后稀釋到總量220mL。取0.2mLSnCl2(200mg/mL)溶液，用3.8mL的配方緩沖液將其稀釋，制得二價錫緩沖液。將肽IMP245(0.0029g)溶解在1mL濃度為1.6×10-3M的InCl3鹽酸溶液中，其中鹽酸的濃度為0.1M。將肽溶液與2mL0.5M的NH4OAc溶液混合，并室溫下溫育15分鐘。然后將75mL的配方緩沖液和0.52mL的二價錫緩沖液加入到肽溶液中。然后將1.5mL的肽溶液通過0.22μmMillexGV過濾器過濾到3mL的凍干瓶中。然后將瓶立即冷凍、并凍干，并在真空下密封。實(shí)施例39)用Tc-99m對IMP245進(jìn)行標(biāo)記高溫(沸水浴)將溶解在1.5mL鹽水中的高锝酸鹽溶液(29mCi)加入到試劑盒中。然后將試劑盒在室溫下溫育10分鐘，并在沸水浴中加熱15分鐘。在使用前將試劑盒冷卻到室溫。低溫(37℃)將溶解在1.5mL鹽水中的高锝酸鹽溶液(25mCi)加入到試劑盒中。然后將試劑盒在室溫孵育14分鐘，然后在37℃水浴中加熱18分鐘，試劑盒在使用前冷卻至室溫。因?yàn)槭褂昧瞬煌淖⑸淦鳎舜螛?biāo)記的HPLC保留時間略有不同。實(shí)施例40)IMP245的肽分析(HPLC)使用反相HPLC和排阻HPLC分析所述肽(結(jié)果在下面列出)。排阻HPLC示蹤結(jié)果表明肽結(jié)合了兩個mMU-9×m679和兩個hMN-14×m679雙特異性抗體(參見“AUniversalPre-TargetingSystemforCancerDetectionandTherapyUsingBi-specificAntibody”，Sharkey，R.M.，McBride，W.J.，Karacay，H.，Chang，K.，Griffiths，G.L.，Hansen，H.J.，和Goldenberg，D.M.，在此將該文獻(xiàn)全文引入本發(fā)明)。反相HPLC結(jié)果表明在主峰之前有幾個小峰出現(xiàn)，而且加熱好像不能顯著改變小峰與大峰的比率。SEC回收率單獨(dú)的Tc-99mImp245為54％，Tc-99mIMP245+hMN-14×m679為66％，Tc-99mIMP245+mMU-9×m679為66％。實(shí)施例41)IMP245在血清中的穩(wěn)定性取50μL的Tc-99mIMP245，用470μL新鮮小鼠血清稀釋，并在37℃下溫育。分別在溫育2.5小時和19小時時，取其中一部分體積使用反相HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果表明所述肽表現(xiàn)的相當(dāng)穩(wěn)定。實(shí)施例42)非放射性的錸IMP245酮基復(fù)合物的合成將0.0504g的IMP245與0.0045g的ReOBr4N(bu)4(根據(jù)Cotton等的方法合成)和50μL溶在1mLDMF中的DIEA混合，室溫下混合5天，來制備錸酮基復(fù)合物。使用HPLC來純化所有的反應(yīng)混合物，最終得到0.0118g的預(yù)期產(chǎn)物。ESMSMH+2031實(shí)施例43)Tc-99m試劑盒的組成(龍膽酸配方)將(0.0029g，1.58×10-6mol)IMP245肽溶解于2.0mL0.5MpH5.5的NH4OAc緩沖液中，其中緩沖液中包含0.0020g的InCl3。將肽溶液在50℃下加熱17分鐘。將22.093g的羥丙基-β-環(huán)糊精(HPCD)、0.450g的2，4-二羥苯甲酸(龍膽酸)、0.257g的醋酸鈉、10.889g的α-D-葡庚糖酸溶解在170mL的脫氮DI水中。用幾滴1M的NaOH將所述溶液的pH調(diào)至5.30，然后用DI水稀釋到總量220mL。然后將配方緩沖液經(jīng)過0.22μm的過濾器進(jìn)行無菌過濾。取0.2mL(200mg/mLSnCl2溶解在6M的HCl中)溶液，用3.8mL的配方緩沖液將其稀釋到無氬的無菌瓶中，制得二價錫緩沖液。然后將肽溶液與76mL的配方緩沖液和0.56mL的二價錫緩沖液混合。然后將1.5mL的所述溶液通過MillexGV0.22mm過濾器過濾到3mL的凍干瓶中。然后將凍干瓶立即在干冰中冷凍直至凍干。在凍干完成后，將試劑盒在真空下密封。每個試劑盒包含55μg的肽和1.5mL的99mTcO4-鹽水溶液。實(shí)施例44)Tc-99m試劑盒組成(抗壞血酸配方)用抗壞血酸配制的Tc-99m試劑盒的制備方法與龍膽酸試劑盒的制備方法相同，只是用0.222g的L-抗壞血酸取代龍膽酸。實(shí)施例45)對Tc-99m試劑盒進(jìn)行標(biāo)記用1.5mL的99mTcO4-鹽水溶液(0.5-70mCi)溶解試劑盒中的肽，然后在室溫下溫育10分鐘。然后將試劑盒在沸水浴中加熱15分鐘，并在使用前將其冷卻到室溫。實(shí)施例46)Tc-99m/InIMP245的標(biāo)記和穩(wěn)定性前面的標(biāo)記表明用非放射性的銦對DOTA進(jìn)行飽和能夠使Tc-99m/InIMP245的產(chǎn)量提高。龍膽酸配方的試劑盒在用1.5mL30mCiTc-99mIn對肽進(jìn)行標(biāo)記時，表現(xiàn)出更加清晰的初始標(biāo)記，而抗壞血酸配方的試劑盒在標(biāo)記后，標(biāo)記肽在室溫儲存過夜時表現(xiàn)得更加穩(wěn)定。前面所進(jìn)行的Tc-99m標(biāo)記的肽在37℃新鮮血清中的穩(wěn)定性研究表明，Tc-99m標(biāo)記的肽在血清中與在試劑盒中一樣穩(wěn)定。對所述標(biāo)記肽進(jìn)行擴(kuò)展梯度HPLC分析，結(jié)果顯示標(biāo)記肽有兩個峰。導(dǎo)致兩個峰的原因可能是由于順反Tc氧代物的形成。兩個峰的比率隨肽的序列、組成和標(biāo)記條件的變化而變化。實(shí)施例47)Y-90和In-111對IMP245進(jìn)行標(biāo)記將肽溶解在0.5MpH3.08的NH4OAc溶液中，肽的濃度為2.2×10-3M。取其中3.5μL的肽溶液，將其與165μL0.5MpH3.93的NH4OAc溶液和6μL的Y-90溶液混合。然后將混合物加熱到85-95℃，持續(xù)20分鐘。對所述混合物所進(jìn)行的反相HPLC分析結(jié)果顯示肽被很好地標(biāo)記了。在幾個不同的條件下使用In-111進(jìn)行了與所述過程類似的標(biāo)記過程，但都沒有得到清晰標(biāo)記的產(chǎn)物。隨后對沒有標(biāo)記的肽進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果顯示生成了幾個新的峰。該肽在貯存過程中可能生成了二硫化物。在隨后的過程中加入了Tc/Re配體，與非放射性的錸一起進(jìn)行預(yù)飽和，以使肽更加穩(wěn)定，更加有利于進(jìn)行Y-90、Lu-177和In-111標(biāo)記。實(shí)施例48)用In-111對ReOIMP245進(jìn)行標(biāo)記將0.0025g的ReOIMP245肽(MH+2031)溶解在560μL0.5MpH3.98的NH4OAc緩沖液中(肽的濃度為2.2×10-3M)。取2.7μL的ReOIMP245溶液，使之與2μL的In-111(573μCi)和150μL的0.5MpH3.98的NH4OAc緩沖液混合。然后將溶液在沸水浴中加熱20分鐘。HPLC分析結(jié)果顯示出現(xiàn)了一個清晰的標(biāo)記肽的峰，其保留時間類似于Tc-99m/InIMP245。實(shí)施例49)生成適于用90Y、111In、和177Lu進(jìn)行標(biāo)記的肽bsMAbs的制備雙特異性抗體F(ab′)2是由人源化MN-14抗-CEA或鼠Mu-9抗-CSAp的Fab′片段和鼠679組成的，在制備所述雙特異性抗體時使用了PDM作為交聯(lián)接頭。首先制備親代抗體的F(ab′)2。對于hMN-14或Mu-9來說，用1mM的DTT將F(ab′)2還原為Fab′-SH，并使之滲濾到含有0.5mMEDTA的pH5.3的醋酸鹽緩沖液中(醋酸鹽/EDTA緩沖液)，以除去DTT，并濃縮至5-10mg/mL，在使用前一直將其儲存在2-8℃條件下。對于679，使用1mM的DTT將F(ab′)2還原為Fab′-SH，然后用5倍體積的醋酸鹽/EDTA緩沖液將其稀釋，然后快速加入20mM的PDM(用90％DMF來制備)，使之最終濃度為4mM。室溫?cái)嚢?0分鐘，之后將所得到的溶液(包含679Fab′-PDM)滲濾到醋酸鹽/EDTA緩沖液中直至使游離PDM的量到達(dá)最低限度，并使所述溶液的濃度濃縮至5-10mg/mL。然后將hMN-14Fab′-SH或Mu-9Fab′-SH與679Fab′-PDM以1∶1的比例混合，所述比例是根據(jù)Fab′的量來計(jì)算的。加入半胱氨酸至終濃度2mM，來淬滅綴合反應(yīng)，然后在Superdex200-填充柱(Amersham，PharmaciaBio，Piscataway，NJ)上進(jìn)行純化，得到預(yù)期的雙特異性綴合物(～100kDa)。然后使用SE-HPLC，SDS-PAGE和IEF對所述雙特異性綴合物進(jìn)行分析。對于hMN-14×m679F(ab′)2，其雙特異性通過BIAcore和SE-HPLC來加以證明。另外，使用CM-5芯片按照制造商(Biacore，Inc.，Piscataway，NJ08854)推薦的方法進(jìn)行BIAcore分析來檢測hMN-14×679對HSG的親和性，其中CM-5芯片來自一種包含單個HSG取代分子和硫醇的肽。為了進(jìn)行生理分布研究，首先用125INa(PerkinElmerLifeScience，Inc.Boston，MA)使用氯胺-T方法(20)對hMN-14×m679F(ab′)2進(jìn)行放射性碘標(biāo)記，然后使用離心排阻柱進(jìn)行純化。在質(zhì)量檢測試驗(yàn)中，使用ITLC分析發(fā)現(xiàn)未結(jié)合的放射性碘小于5％，SE-HPLC(Bio-SilSE250，BioRad，Hercules，CA)分析顯示有大于90％的產(chǎn)物以相同的速率進(jìn)行遷移，形成了一個單峰，在加入過量CEA(ScrippsLaboratories，SanDiego，CA)的情況下，有大于90％的放射性標(biāo)記產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂懈叻肿恿康牧硪环N成分。以類似的方法對125I-mMu-9×m679bsMAb進(jìn)行測試，使用GW-39人類結(jié)腸異種移植腫瘤的部分純化提取物作為CSAp的來源，它能使mMu-9×679bsMAb的洗脫部分變?yōu)镾E-HPLC柱的無效組分。以所述類似的方法制備人源化MN-14(hMN-14)Fab′-SH。將99mTc-高锝酸鹽(30mCi)直接加入到凍干的hMN-14-Fab′-SH(1.0mg)中，并在30分鐘內(nèi)注射到動物體內(nèi)。通過ITLC分析顯示，所述產(chǎn)品有3.0％未結(jié)合的99mTc，并有92％的免疫反應(yīng)組分。肽的放射性標(biāo)記用于進(jìn)行90Y、111In、和177Lu標(biāo)記的二價HSG-肽，即IMP241，其包含DOTA配體，以使所述放射性金屬更容易進(jìn)行結(jié)合。將IMP241溶解在0.5M醋酸銨(pH4.0)中，濃度為2.2×10-3M。90YCl3來自于PerkinElmerLifeSciences，Inc.(Boston，MA)，111InCl3來自于IsoTexDiagnostics(Friendswood，TX)，177Lu來自于ResearchReactorFacillity，UniversityofMissouri-Columbia，(Columbia，MO)。在塑料錐形瓶中將3mCi的111InCl3與0.5MpH4.0的醋酸銨(3倍于111InCl3的體積)和2.3μLIMP241(溶解在0.5MpH4.0的醋酸銨溶液中，濃度為2.2×10-3M)混合，來制備111In-IMP241。在離心之后，將混合物在沸水浴中加熱30分鐘，并隨后冷卻。將混合物離心，并加入DTPA，使之最終濃度為3mM。在室溫下15分鐘后，用0.1MpH6.5的醋酸鈉將其最終體積升至1.0mL。使用在飽和氯化鈉溶液中平衡的反相HPLC和ITLC來檢測未結(jié)合的同位素的量。反相HPLC分析所使用的柱子是Waters8×100mmradialPakcartridge，填充物是C-18N-va-Pak4μm(固相)。柱子的洗脫速度為1.5mL/分鐘，線性梯度為100％A到55％A和45％B，其中A為0.075％的TFA水溶液，B為0.075％TFA溶解在75％乙氰和25％的水組成的溶液中，洗脫時間為15分鐘。在洗脫到15分鐘時，溶劑已經(jīng)轉(zhuǎn)換為100％B，在再平衡到起始條件之前，使柱子在該溶劑條件下保持5分鐘。反相HPLC結(jié)果顯示有一個保留時間為11.8分鐘的單峰。將111In-IMP241與過量m679IgG混合，并在Bio-SilSE250HPLC凝膠過濾柱上進(jìn)行分析，結(jié)果顯示出現(xiàn)了一個與抗體保留時間相同的峰，這表明兩者已經(jīng)發(fā)生了結(jié)合。用90Y放射性標(biāo)記IMP-241時，將15mCi的90YCl3、3倍體積的0.5MpH4.0的醋酸銨、和83.2μL的IMP-241(溶解在0.5MpH4.0的醋酸銨中，濃度為1.1×10-4M)混合，并加入抗壞血酸，使抗壞血酸的最終濃度為6.75mg/mL。然后將混合物在沸水浴中加熱30分鐘，并冷卻至室溫，之后加入DTPA，使之最終濃度為5mM。15分鐘之后，用0.1MpH6.5的醋酸鈉將最終體積升至1.0mL。用已經(jīng)在飽和氯化鈉溶液中平衡的ITLC條進(jìn)行分析，結(jié)果顯示有小于0.2％的未結(jié)合的同位素。將90Y-IMP241與過量m679IgG混合，然后進(jìn)行SE-HPLC分析，結(jié)果顯示出現(xiàn)了一個與抗體保留時間相同的峰，這表明兩者已經(jīng)發(fā)生了結(jié)合。用小鼠血清來測試放射性標(biāo)記肽的穩(wěn)定性，將放射性標(biāo)記肽稀釋在10倍體積的小鼠血清中，并在37℃下溫育混合溶液。分別在1小時、3小時、和24小時時抽取樣品，并用反相HPLC進(jìn)行分析。在體內(nèi)的前靶向定位研究GW-39，一種產(chǎn)自人類結(jié)腸腫瘤的CEA細(xì)胞系(參見Goldenberg，D.M和Hansen，H.J，Carcinoembryonicantigenpresentinhumancolonicneoplasmsseriallypropagatedinhamsters，Science，1751117-18(1972))在裸鼠中進(jìn)行連續(xù)的傳代繁殖，方法是在無菌鹽水中將1-2克的腫瘤切碎，將切碎的混合物通過金屬絲網(wǎng)篩，并將鹽水體積調(diào)至每10mL鹽水中含有1克的腫瘤。給6周齡左右的雌性NCr裸鼠(CharlesRiverLaboratories，Inc.，F(xiàn)redrickMD或Taconic，Germantown，NY)連續(xù)灌輸0.2ml的所述懸浮液。在腫瘤移植兩到三周后，給動物注射單獨(dú)的放射性標(biāo)記肽，或?yàn)榱诉M(jìn)行前靶向定位，在注射放射性標(biāo)記肽之前1到2天給動物施用bsMAb。在前靶向定位過程中，首先給動物靜脈注射1.5×10-10摩爾(15μg；6μCi125I)的bsMAb(0.1到0.2mL)，然后給動物靜脈注射(0.1-0.2mL)111In-IMP-241(1.5×10-11摩爾，8-10μCi)、177Lu-IMP-241(1.5×10-11摩爾，5μCi)、或99mTc-IMP-243(1.5×10-11摩爾，25-30μCi)。在注射肽指定時間之后，將動物麻醉，心臟穿刺放血，在尸體解剖之前將動物無痛致死。取動物組織、稱重并使用合適的窗口通過γ-閃爍計(jì)算每種組織的放射性核素的量和注射材料的標(biāo)準(zhǔn)放射量。GI組織(胃、小腸和大腸帶著內(nèi)容物一起稱重和計(jì)算)。每克組織的注射劑量(％ID/g)和肽在腫瘤組織與正常組織中的百分比率(T/NT)列于下表中。表中和附圖中所有的數(shù)值均是每次研究中所使用的動物的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表20a表示放射性濃度在檢測限以下。表21a表示放射性濃度在檢測限以下。表22表23表24表25在注射后3小時，在GW-39腫瘤裸鼠中99mTc-hMN-14Fab′的腫瘤/非腫瘤的比率。(n＝5)組織99mTc-hMN-14Fab’肝臟0.2±0.02脾0.9±0.4腎0.02±0.001肺0.7±0.1血液1.0±0.01表26表27表28表29a表示射線吸收劑量以腎的1500cGy劑量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化肽的放射性標(biāo)記和BsMabs的檢測IMP-241DOTA的螯合基團(tuán)可以使用111In、90Y和其它放射性金屬，如177Lu。用所述放射性核素所標(biāo)記的肽的特異活性分別為600、1650、和300Ci/mmol。用177Lu標(biāo)記的肽特異活性較低一方面是因?yàn)榉派浣饘俜胖玫臅r間比較長，另一方面是同位素產(chǎn)品發(fā)生了融化，不能使177Lu的活性得到最大值。99mTc-肽的特異活性在1500與1600Ci/mmol之間。在每一次標(biāo)記過程中，調(diào)整標(biāo)記的條件保證肽的放射活性摻入率大于98％，這樣就不需要進(jìn)行純化了。反相HPLC表明所述標(biāo)記的肽與新鮮小鼠血清在37℃混合時，所有的肽在24小時內(nèi)是穩(wěn)定的，其洗脫峰的形狀與剛開始制備出來時相同，沒有發(fā)生變化。擴(kuò)展梯度HPLC對IMP-243和245的分析結(jié)果表明所述標(biāo)記肽有兩個峰，這可能是因?yàn)閟yn的形成和抗锝酮基種類不同。附圖6顯示的是hMN-14×m679bsMAb與111In-IMP-241結(jié)合的SE-HPLC結(jié)果?；旧纤龅姆派湫詷?biāo)記的肽的洗脫時間都轉(zhuǎn)變?yōu)閎sMAb的洗脫時間，并且當(dāng)在加入放射性標(biāo)記肽之前先將CEA加入到bsMAb時，所有的放射性活性均出現(xiàn)在無效組分中。當(dāng)用CSAp制備mMu-9×m679bsMAb也出現(xiàn)類似的結(jié)果(未示出)。利用BIAcore計(jì)算mMu-9×m679F(ab′)2bsMAb和所述有一個HSG的肽在芯片上的結(jié)合動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明動力學(xué)參數(shù)為KD＝1.5×10-9M。肽的生理分布為了進(jìn)行生理分布研究，IMP-241用發(fā)射γ射線的放射性核素111In或177Lu對IMP-241進(jìn)行了放射性標(biāo)記，以便于在組織中進(jìn)行肽的檢測，另外IMP-243和IMP-245用99mTc進(jìn)行了標(biāo)記。在帶有腫瘤的裸鼠中，177Lu-和111In-IMP-241在裸鼠中具有相似的分布狀況和清除特性(表20和21)。在所述兩種情況下，肽在注射3小時后就被快速地從血液中清除出去，其在血液中的放射活性非常低，不能進(jìn)行精確的定量測定，但所述肽在主要器官中具有足夠的放射活性，能夠進(jìn)行定量測定。放射活性經(jīng)過腎臟的排泄作用而消除，在監(jiān)測期間只有少量的放射活性停留在腎臟中。在平均重量為0.15g的腎臟中，在注射后0.5-1.0小時后，腎臟中檢測到的放射活性只占到總注射活性的大約0.6％。給另外一組動物施用177Lu-IMP-241，在48小時時進(jìn)行解剖，但因?yàn)樵谀I臟中的放射活性剛剛能夠進(jìn)行精確測定，因此在表中沒有列出所述數(shù)據(jù)。但是在注射后48小時時，177Lu-IMP-241在腎臟中的量降到0.94±0.2％ID/g，與在注射后24小時時所觀測到的數(shù)值相比，大約降低了45％。放射活性物質(zhì)絕大部分排泄到尿中，但也有一小部分通過GI管進(jìn)行清除。在注射后1.0-3.0小時之內(nèi)，在所有GI組織(即胃、小腸和大腸)中的放射活性占到注射活性總量的大約0.6-0.7％。到24小時時，在所有GI組織中的放射活性僅占總量的0.07％。99mTc-IMP-243與IMP-241在組織中的分布情況顯著不同(表22)。99mTc-IMP-243在血液中的清除速度較慢，在肝臟中的攝取量較大，并且相當(dāng)多的部分在GI管道。例如，在注射后1小時，小腸包含24.3±4.75％ID/g量的99mTc-IMP-243，到3小時時，放射活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移到大腸中。在注射24小時后，放射活性物質(zhì)完全從身體中清除。因此，放射活性物質(zhì)不與GI組織發(fā)生實(shí)質(zhì)上的結(jié)合，其僅存在于GI內(nèi)容物中，這與放射活性在小腸和大腸中前進(jìn)的觀測結(jié)果相一致。另一個肽IMP-245，在GI組織中放射活性的比例要小得多。在肝臟和腎臟中潴留的量也比99mTc-IMP-243要低。前靶向定位研究使用hMN-14×m679F(ab′)2bsMAb進(jìn)行前靶向定位99mTc-IMP-243和99mTc-IMP-245能力的試驗(yàn)。其中的bsMAb使用125I進(jìn)行了放射性標(biāo)記，這樣能夠與99mTc-IMP-243或IMP-245同時進(jìn)行記錄。給動物靜脈施用bsMAb，在24小時后，給動物施用放射性標(biāo)記肽，并在施用后3小時和24小時時解剖動物。在前靶向定位過程中，在注射后3小時和24小時時，腫瘤吸收99mTc-IMP-243的量比單獨(dú)注射肽分別高出將近28和70倍(表23)。在3小時時腫瘤攝取量為12.25±3.32％ID/g，經(jīng)過24小時降為7.36±3.19。99mTc-IMP-243的量在腫瘤中下降的速度沒有bsMAb在腫瘤中下降的快，在相同時間內(nèi)，bsMAb在腫瘤中的量由4.78±1.11％ID/g下降到2.24±0.53％ID/g。在施用3小時內(nèi)，99mTc-IMP-243在腫瘤與非腫瘤中的量的比例除了大腸外在其它組織中均高于2.0∶1，這是因?yàn)樵谑┯?小時時肽在大腸中還沒有被清除，在施用24小時后，腫瘤/大腸的比例增加了近20倍。在肽注射后3小時時，腫瘤/血液比例為2.4±0.6。腫瘤對99mTc-IMP-245的攝取情況與99mTc-IMP-243類似(表6)，只是99mTc-IMP-245腫瘤/非腫瘤的比例要高于99mTc-IMP-243，這主要是因?yàn)樵谑┯?9mTc-IMP-245的動物中，bsMAb經(jīng)過清除后，其含量要低于施用99mTc-IMP-243的動物。不過，99mTc-IMP-245前靶向定位系統(tǒng)也具有較低的GI吸收率，甚至是在施用后1小時時，因此該肽比起99mTc-IMP-243來有明顯的優(yōu)點(diǎn)。99mTc-IMP-245腫瘤/腎的比例比99mTc-IMP-243要高。所述生理分布狀況數(shù)據(jù)表明，在施用早期時，比起使用直接進(jìn)行放射性標(biāo)記的Fab′片段，99mTc-IMP-245前靶向定位系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)能夠提供更好的成像對比度。還應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是，在注射3小時后，使用99mTc-標(biāo)記肽的腫瘤/腎比例要明顯高于直接被99mTc-hMN-14Fab′放射性標(biāo)記的抗體片段(表25)。在評價IMP-241肽前靶向定位時使用了兩種不同的靶向系統(tǒng)，一個系統(tǒng)使用了人源化抗-CEA抗體(hMN-14)，另一個系統(tǒng)使用了鼠抗-CSAp的抗體(mMu-9)。其中所使用的bsMAb均是將它們的Fab′與鼠679MAb的Fab′進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)來制備。在生理分布研究中，bsMAb均使用125I進(jìn)行了放射性標(biāo)記，這樣bsMAb的分布可以同IMP-241一起進(jìn)行評估，IMP-241使用了111In進(jìn)行了放射性標(biāo)記。在所述兩種前靶向定位系統(tǒng)中，給帶有腫瘤的裸鼠注射的bsMAb和肽的量均是相同的，但因?yàn)镸u-9bsMAb在血液中清除的時間要比hMN-14bsMAb長，因此在施用Mu-9bsMAb48小時后，施用放射性標(biāo)記肽，而施用hMN-14bsMAb時只需經(jīng)過24小時就可施用放射性標(biāo)記的肽。hMN-14×679構(gòu)建體在施用后24小時，在血液中的含量與mMu-9×m679構(gòu)建體施用48小時后的含量很接近，分別為0.79±0.24％ID/g和0.55±0.10％ID/g。發(fā)現(xiàn)Mu-9bsMAb在腫瘤中的含量(13.1±4.36％ID/g)高于MN-14bsMAb(2.92±0.41)，因?yàn)樵谝郧皩Π琈u-9和抗-CEA抗體的靶向研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Mu-9在GW-39異種移植腫瘤模型中比抗-CEA抗體具有更高的吸收率和更長的潴留時間。因?yàn)镸u-9bsMAb在腫瘤中的含量較高，因此肽的濃度相應(yīng)也較高，在注射肽僅3小時后，濃度即達(dá)到17.8±1.4％ID/g，而在使用hMN-14bsMAb進(jìn)行前靶向定位的動物中，肽的濃度僅為11.3±2.2％ID/g。有趣的是，hMN-14bsMAb與肽結(jié)合的效率要高，因?yàn)樵谀[瘤中，在使用hMN-14bsMAb時，施用肽3小時后，肽％ID/g與bsMAb的比例是3.9，而在使用Mu-9bsMAb時，在相同時間后，肽％ID/g與bsMAb的比例是1.4。然而，在Mu-9前靶向定位系統(tǒng)中，腫瘤潴留111In-IMP-241的時間較長，這與bsMAb結(jié)合到腫瘤上所需的時間較長相對應(yīng)。在每一系統(tǒng)中，在3小時時肽bsMAb的比例能夠持續(xù)到48小時時，這表明肽與bsMAb發(fā)生了特異性結(jié)合。使用111In-IMP-241前靶向定位系統(tǒng)比起單獨(dú)使用肽，能夠使腫瘤愈合的速度提供100倍(參考表20)。在使用111In-IMP-241進(jìn)行前靶向定位時，不管是使用那種bsMab前靶向定位系統(tǒng)，其在所有組織的腫瘤/非腫瘤比例也顯著高于單獨(dú)使用111In241肽?？傊?，在Mu-9bsMAb系統(tǒng)中，111In-IMP-241具有顯著較高的腫瘤/非腫瘤比例，尤其是在經(jīng)過一段時間以后。不管IMP-241是用177Lu放射性標(biāo)記還是用111In進(jìn)行放射性標(biāo)記，所得到的前靶向定位結(jié)果是相同的。正如表27所列出的，使用hMn-14bsMAb前靶向定位系統(tǒng)時，177Lu-IMP-241的％ID/g與111In-IMP-241的基本相同。因?yàn)?11In-IMP-241的生理分布與177Lu-IMP-241的相似，還因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)將111In作為代用物用于預(yù)測90Y-的生理分布，因此使用111In-IMP-241和mMu-9×m679F(ab′)2bsMAb能夠進(jìn)行擴(kuò)展了的生理分布研究。正如附圖7中所顯示的，因?yàn)镸u-9抗體在腫瘤中潴留的時間較長，因此放射性標(biāo)記肽在腫瘤中潴留的時間也較長。使用這些數(shù)據(jù)，建立了90Y、和177Lu的放射劑量模型。90Y，因?yàn)樗摩?射線的能量較高(2.27MeVmax)，因此每mCi對腫瘤所釋放的射線劑量比177Lu(495keVmax)要高。但是，為了更好地進(jìn)行比較，將射線劑量用同種射線對同種劑量限制性組織進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。在該情況下，選擇了對腎1500cGy作為標(biāo)準(zhǔn)劑量，在該劑量下組織是可以耐受的，而且產(chǎn)生的毒性也是相近的。在組織吸收劑量被標(biāo)準(zhǔn)化的情況下，數(shù)據(jù)顯示177Lu-IMP-241與90Y-IMP-241對腫瘤釋放的射線劑量是相同的。在腎耐受1500cGy劑量的情況下，腫瘤接受了將近12,000cGy的劑量，該射線劑量對大部分的實(shí)體腫瘤來說都是致命的。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，對本發(fā)明所公開的組合物和過程作出任何修飾和改變都是顯而易見的。因此所述任何修飾和改變均包括在本發(fā)明的權(quán)利要求書之內(nèi)。在本發(fā)明說明書中所記載的所有出版物全文或部分引入本發(fā)明。另外的參考文獻(xiàn)如下AranoY，UezonoT，AkizawaH，OnoM，WakisakaK，NakayamaM，SakaharaH，KonishiJ，YokoyamaA.，“Reassessmentofdiethylenetriaminepentaaceticacid(DTPA)asachelatingagentforindium-111labelingofpolypeptidesusinganewlysynthesizedmonoreactiveDTPAderivative，”JMedChem.1996Aug30；39(18)3451-60.Bamias，A.，andEpenetos，A.A.Two-stepstrategiesforthediagnosisandtreatmentofcancerwithbioconjugates.Antibody，Immunoconjugates，Radiopharm.1992；5385-395.Darbet，J.，Peltier，P.，Bardet，S.，Vuillez，JP.，Bachelot，I.，Denet，S.，Olivier，P.，Lecia，F(xiàn).，Corcuff，B.，Huglo，D.，Proye，C.，Rouvier，E.，Meyer，P.，Chatal，J.F.Radioimmunodetectionofmedullarythyroidcarcinomausingindium-111bivalenthaptenandanti-CEAxanti-DTPA-indiumbispecifcantibody.J.Nucl.Med.1998；391172-1178.Bos，ES.，Kuijpcrs，WHA.，Meesl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或多種用于磁共振成像(MRI)的影像增強(qiáng)劑。27.權(quán)利要求26的靶向構(gòu)建體，其中所述增強(qiáng)劑包括Mn、Fe、La和Gd。28.權(quán)利要求13的靶向構(gòu)建體，其中所述診斷劑包含一種或多種用于X-射線或計(jì)算機(jī)體層攝影的不透射線的試劑或?qū)φ赵噭?9.權(quán)利要求28的靶向構(gòu)建體，其中所述不透射線的試劑或?qū)φ赵噭┌ㄤ^、泛影酸鹽、乙碘油、檸檬酸鎵、碘卡酸、碘西他酸、碘達(dá)胺、膽影酸、碘氧胺酸、iogulamide、碘海醇、碘異酞醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘絲酸、碘砜葡胺、iosemeticacid、碘肽硫、碘替酸、碘酞酸、碘曲西酸、碘克酸、羥泛影酸、胺碘苯丙酸、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影酸鈉、丙碘酮或氯化亞鉈。30.權(quán)利要求13的靶向構(gòu)建體，其中所述診斷劑包含一種或多種超聲對照試劑。31.權(quán)利要求30的靶向構(gòu)建體，其中所述超聲對照試劑包括脂質(zhì)體或葡聚糖。32.權(quán)利要求31的靶向構(gòu)建體，其中脂質(zhì)體是氣體填充的。33.權(quán)利要求13的靶向構(gòu)建體，其中所述的酶包括能夠在靶位點(diǎn)將藥物中間體轉(zhuǎn)化為毒性形式，以提高所述藥物的毒性的酶。34.治療或診斷、或治療和診斷疾病或?qū)е录膊〉牟“Y的方法，其包括(A)給所述受試者施用雙特異性抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂；(B)可選擇地，給所述受試者施用清除組合物，并使所述組合物將沒有定位的抗體或抗體片段從循環(huán)中清除出去；和(C)給所述受試者施用包含權(quán)利要求1化合物的靶向構(gòu)建體，其進(jìn)一步包含至少一種診斷或治療陽離子，和/或一種或多種螯合的或化學(xué)結(jié)合的治療劑、診斷劑或酶。35.權(quán)利要求34的方法，其中雙特異性抗體或抗體片段和靶向構(gòu)建體基本上是在同一時間施用，其中抗體或抗體片段具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂。36.權(quán)利要求34的方法，其中治療陽離子發(fā)射20-10,000keV的粒子和/或正電子。37.權(quán)利要求34的方法，其中所述治療陽離子選自111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au和211Pb。38.權(quán)利要求34的方法，其中診斷陽離子發(fā)射25-10,000keV的粒子和/或正電子。39.權(quán)利要求34的方法，其中所述診斷陽離子選自110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr。40.權(quán)利要求34的方法，其中所述診斷劑用于進(jìn)行正電子發(fā)射體層攝影(PET)。41.權(quán)利要求34的方法，其中所述診斷劑用于進(jìn)行SPECT成像。42.權(quán)利要求34的方法，其中所述診斷陽離子或試劑包括一種或多種用于磁共振成像的影像增強(qiáng)劑。43.權(quán)利要求42的方法，其中所述增強(qiáng)劑選自Mn、Fe、La和Gd。44.權(quán)利要求34的方法，其中所述診斷劑包含一種或多種用于X-射線或計(jì)算機(jī)體層攝影的不透射線的試劑或?qū)φ赵噭?5.權(quán)利要求44的方法，其中所述不透射線的試劑或?qū)φ赵噭┌ㄤ^、泛影酸鹽、乙碘油、檸檬酸鎵、碘卡酸、碘西他酸、碘達(dá)胺、膽影酸、碘氧胺酸、iogulamide、碘海醇、碘異酞醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘絲酸、碘砜葡胺、iosemeticacid、碘肽硫、碘替酸、碘酞酸、碘曲西酸、碘克酸、羥泛影酸、胺碘苯丙酸、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影酸鈉、丙碘酮或氯化亞鉈。46.權(quán)利要求34的方法，其中所述診斷劑包含一種或多種超聲對照試劑。47.權(quán)利要求46的方法，其中所述超聲對照試劑包括脂質(zhì)體或葡聚糖。48.權(quán)利要求47的方法，其中所述脂質(zhì)體是氣體填充的。49.權(quán)利要求34的方法，其中所述診斷劑選自熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光化合物。50.權(quán)利要求49的方法，其中所述熒光化合物選自熒光素異硫氰酸鹽、若丹明、藻紅蛋白、藻青蛋白、別藻青蛋白、o-phthaldehyde和熒光胺。51.權(quán)利要求49的方法，其中所述化學(xué)發(fā)光化合物選自魯米諾、異魯米諾、芳烴吖啶酯、咪唑、吖啶鹽和草酸酯。52.權(quán)利要求49的方法，其中所述生物發(fā)光化合物選自熒光素、熒光素酶和水母發(fā)光蛋白。53.權(quán)利要求34的方法，其中所述靶組織是腫瘤。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述腫瘤產(chǎn)生或與選自以下的抗原相關(guān)結(jié)腸-特異性抗原-P(CSAp)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD30、CD74、CD80、HLA-DR、Ia、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、EGFR、HER2/neu、PAM-4、TAG-72、EGP-1、EGP-2、A3、KS-1、Le(y)、S100、PSMA、PSA、韌粘素、葉酸受體、VEGFR、壞死抗原、IL-2、T101、MAGE。55.權(quán)利要求34的方法，其中所述至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂是單克隆抗體或單克隆抗體的片段。56.權(quán)利要求34的方法，其中所述至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂是單克隆抗體或單克隆抗體的片段。57.權(quán)利要求34的方法，其中所述至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂是人的、嵌合的或人源化的抗體或人的、嵌合的或人源化抗體的片段。58.權(quán)利要求34的方法，其中所述至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂是人的、嵌合的或人源化的抗體或人的、嵌合的或人源化的抗體的片段。59.權(quán)利要求34的方法，其中所述雙特異性抗體或抗體片段進(jìn)一步包含治療核素。60.權(quán)利要求59的方法，其中所述治療核素選自111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au和211Pb。61.權(quán)利要求34的方法，其中雙特異性抗體包含MAbMu-9的Fv和MAb679的Fv。62.權(quán)利要求61的方法，其中Mu-9和/或679是嵌合的或人源化的。63.權(quán)利要求61的方法，其中Mu-9和/或679是人Mu-9和679。64.權(quán)利要求61的方法，其中雙特異性抗體包含Mu-9的一個或多個CDRs。65.權(quán)利要求61的方法，其中雙特異性抗體包含679的一個或多個CDRs。66.權(quán)利要求61的方法，其中雙特異性抗體是融合蛋白。67.權(quán)利要求34的方法，其中雙特異性抗體包含MAbMN-14的Fv和MAb679的Fv。68.權(quán)利要求67的方法，其中MN-14和/或679是嵌合的或人源化的。69.權(quán)利要求67的方法，其中MN-14和/或679是人MN-14和679。70.權(quán)利要求67的方法，其中雙特異性抗體包含MN-14的一個或多個CDRs。71.權(quán)利要求67的方法，其中雙特異性抗體包含679的一個或多個CDRs。72.權(quán)利要求67的方法，其中雙特異性抗體是融合蛋白。73.權(quán)利要求34的方法，其中融合蛋白是三價體，并且整合了能與CSAp反應(yīng)的抗體的Fv。74.權(quán)利要求34的方法，其中雙特異性抗體整合了III類抗-CEA抗體和679的Fv。75.權(quán)利要求34的方法，其中所述靶向構(gòu)建體包含一種或多種用于消除病灶組織的放射性同位素。76.權(quán)利要求34的方法，其中所述靶向構(gòu)建體包含10B原子，并且所述方法進(jìn)一步包含照射定位于所述病灶組織的所述硼原子的步驟，從而影響所述病灶組織的BNCT。77.權(quán)利要求34的方法，當(dāng)所述靶向構(gòu)建體包含酶時，給所述受試者進(jìn)一步施用藥物，該藥物能夠被所述的酶轉(zhuǎn)化為毒性形式，并由此提高所述藥物在靶位點(diǎn)的毒性。78.檢測或治療哺乳動物靶細(xì)胞、組織或病原體的方法，其包括施用有效量的雙特異性抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段包含至少一個特異性結(jié)合靶的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂；和施用包含權(quán)利要求1化合物的靶向構(gòu)建體；其中所述靶包括靶細(xì)胞、組織、病原體或由其產(chǎn)生的或與其相關(guān)的分子，并且特異性結(jié)合所述靶的至少一個臂能夠結(jié)合到靶的互補(bǔ)結(jié)合部分。79.權(quán)利要求78的方法，其中所述病原體是真菌、病毒、寄生蟲、細(xì)菌、原生動物或支原體。80.權(quán)利要求79的方法，其中所述真菌選自小孢子菌屬、發(fā)癬菌屬、表皮癬菌屬、Ssporothrixschenckii、新型隱球菌、粗球孢菌、莢膜組織胞漿菌、皮炎牙生菌、白色假絲酵母。81.權(quán)利要求79的方法，其中所述病毒選自人免疫缺陷病毒(HIV)、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、狂犬病病毒、流行性感冒病毒、B型肝炎病毒、仙臺病毒、貓白血病病毒、Reo病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、人血清細(xì)小樣病毒、猿病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺腫瘤病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、登革熱病毒、風(fēng)疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T-細(xì)胞白血病病毒、EB病毒、鼠白血病病毒、流行性腮腺炎病毒、皰疹性口炎病毒、辛德畢斯病毒、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、疣病毒和藍(lán)舌病毒。82.權(quán)利要求79的方法，其中所述細(xì)菌選自炭疽桿菌、無乳鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌、化膿鏈球菌、埃希氏大腸桿菌、淋病奈瑟氏球菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、肺炎球菌、嗜血B-型流感、梅毒螺旋體、萊姆病螺旋體、銅綠假單胞菌、麻風(fēng)分枝桿菌、流產(chǎn)布魯菌、結(jié)核分枝桿菌、和破傷風(fēng)毒素。83.權(quán)利要求79的方法，其中所述寄生蟲是蠕蟲或瘧原蟲。84.權(quán)利要求79的方法，其中所述原生動物選自鐮狀瘧原蟲、間日瘧原蟲、鼠弓形蟲、讓氏錐蟲、克氏錐蟲、羅德西亞錐蟲、布氏錐蟲、曼森血吸蟲、日本血吸蟲、牛巴貝蟲、Elmeriatenella、旋盤尾絲蟲、旋毛線蟲、旋盤尾絲蟲、小泰勒爾梨漿蟲、水泡絳蟲、羊絳蟲、牛肉絳蟲、細(xì)粒棘球蚴、和科爾蒂中殖孔絳蟲。85.權(quán)利要求79的方法，其中所述支原體選自關(guān)節(jié)炎支原體、豬鼻支原體、口腔支原體、精氨酸支原體、拉氏無膽甾原體、唾液支原體、和肺炎支原體。86.權(quán)利要求78的方法，其中所述靶向構(gòu)建體進(jìn)一步包含至少一種放射性核素、治療劑、診斷劑或酶。87.權(quán)利要求86的方法，其中放射性核素選自225Ac、111Ag、72As、77As、211At、198Au、199Au、212Bi、213Bi、75Br、76Br、11C、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、166Dy、169Er、18F、52Fe、59Fe、67Ga、68Ga、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、166Ho、120I、123I、124I、125I、131I、110In、111In、194Ir、177Lu、51Mn、52mMn、99Mo、13N、15O、32P、33P、211Pb、212Pb、109Pd、149Pm、142Pr、143Pr、223Ra、82mRb、186Re、188Re、189Re、105Rh、47Sc、153Sm、75Se、83Sr、89Sr、161Tb、94mTc、94Tc、99mTc、86Y、90Y和89Zr；并且當(dāng)靶向構(gòu)建體包含一種以上核素時，放射性核素可以是不同的放射性核素。88.權(quán)利要求86的方法，其中診斷劑包括成像劑。89.一種治療或鑒定受試者病灶組織的方法，其包括給所述受試者施用雙特異性抗體或抗體片段，其中抗體或抗體片段具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂；可選擇地，給所述受試者施用清除組合物，并使所述組合物將沒有定位的抗體或抗體片段從循環(huán)中清除出去；和給所述受試者施用包含權(quán)利要求1化合物的靶向構(gòu)建體。90.權(quán)利要求89的方法，其中所述受試者是哺乳動物。91.權(quán)利要求90的方法，其中所述哺乳動物受試者選自人類、靈長目、馬科動物、犬科動物和貓科動物。92.權(quán)利要求89的方法，其中所述靶向構(gòu)建體進(jìn)一步包含至少一種放射性核素、治療劑、診斷劑或酶。93.權(quán)利要求92的方法，其中放射性核素選自225Ac、111Ag、72As、77As、211At、197Au、199Au、212Bi、213Bi、75Br、76Br、11C、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、166Dy、169Er、18F、52Fe、59Fe、67Ga、68Ga、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、166Ho、120I、123I、124I、125I、131I、110In、111In、194Ir、177Lu、51Mn、52mMn、99Mo、13N、15O、32P、33P、211Pb、212Pb、109Pd、149Pm、142Pr、143Pr、223Ra、82mRb、186Re、188Re、189Re、105Rh、47Sc、153Sm、75Se、83Sr、89Sr、161Tb、94mTc、94Tc、99mTc、86Y、90Y和89Zr；并且當(dāng)靶向構(gòu)建體包含一種以上放射性核素時，放射性核素可以是不同的放射性核素。94.權(quán)利要求92的方法，其中診斷劑包括成像劑。95.權(quán)利要求92的方法，其中治療劑包括藥物、毒素、細(xì)胞因子、激素或生長因子。96.一種用于治療或鑒定受試者病灶組織的試劑盒，其包括(A)包含權(quán)利要求1化合物的靶向構(gòu)建體；(B)雙特異性抗體或抗體片段，其中抗體或抗體片段具有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂；其中靶向構(gòu)建體包括載體部分和一種或多種綴合的治療劑或診斷劑或酶，其中所述載體部分包含或攜帶至少一個可被所述雙特異性抗體或抗體片段的所述至少另外一個臂識別的表位；和(C)可選擇地，一種清除組合物，用于清除沒有定位的抗體或抗體片段。97.權(quán)利要求96的試劑盒，其中所述診斷劑選自110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr。98.權(quán)利要求96的試劑盒，其中所述治療劑選自111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、14Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au和211Pb。99.權(quán)利要求96的方法，當(dāng)所述靶向構(gòu)建體包含酶時，可選擇地，該試劑盒進(jìn)一步包含藥物，其中所述藥物能夠被酶轉(zhuǎn)化為毒性形式，以提高所述藥物在靶位點(diǎn)的毒性。100.包含權(quán)利要求1化合物的靶向構(gòu)建體。101.一種哺乳動物正常組織成像的方法，其包括施用有效量的雙特異性抗體或抗體片段；和施用包含權(quán)利要求1化合物的靶向構(gòu)建體；其中所述雙特異性抗體或抗體片段包含至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂；并且其中所述至少一個臂能夠與正常組織或靶細(xì)胞上或由其產(chǎn)生或與之相關(guān)的互補(bǔ)結(jié)合部分結(jié)合。102.權(quán)利要求101的方法，其中所述正常組織是卵巢組織、胸腺組織、甲狀旁腺組織、子宮內(nèi)膜組織、骨髓組織或脾組織。103.權(quán)利要求101的方法，其中所述靶向構(gòu)建體進(jìn)一步包含至少一種放射性核素、治療劑、診斷劑或酶。104.權(quán)利要求103的方法，其中放射性核素選自225Ac、111Ag、72As、77As、211At、198Au、199Au、212Bi、213Bi、75Br、76Br、11C、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、166Dy、169Er、18F、52Fe、59Fe、67Ga、68Ga、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、166Ho、120I、123I、124I、125I、131I、110In、111In、194Ir、177Lu、51Mn、52mMn、99Mo、13N、15O、32P、33P、211Pb、212Pb、109Pd、149Pm、142Pr、143Pr、223Ra、82mRb、186Re、188Re、189Re、105Rh、47Sc、153Sm、75Se、83Sr、89Sr、161Tb、94mTc、94Tc、99mTc、86Y、90Y和89Zr；并且當(dāng)靶向構(gòu)建體包含一種以上放射性核素時，放射性核素可以是不同的放射性核素。105.權(quán)利要求103的方法，其中診斷劑包括對照試劑。106.權(quán)利要求103的方法，其中診斷劑包括成像劑。107.權(quán)利要求106的方法，其中所述成像劑是用于PET的試劑。108.權(quán)利要求106的方法，其中成像劑是用于SPECT的試劑。109.權(quán)利要求103的方法，其中治療劑包括藥物、毒素、細(xì)胞因子、激素或生長因子。110.一種手術(shù)中鑒定受試者病灶組織的方法，其包括施用有效量的雙特異性抗體或抗體片段；和施用包含權(quán)利要求1化合物的靶向構(gòu)建體；其中雙特異性抗體或抗體片段包含至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂；并且其中所述至少一個臂能夠結(jié)合到靶細(xì)胞、組織或病原體或由其產(chǎn)生的或與其相關(guān)的分子上的互補(bǔ)結(jié)合部分。111.權(quán)利要求110的方法，其中所述靶向構(gòu)建體進(jìn)一步包含至少一種放射性核素、治療劑、診斷劑或酶。112.權(quán)利要求111的方法，其中放射性核素選自225Ac、111Ag、72As、77As、211At、198Au、199Au、212Bi、213Bi、75Br、76Br、11C、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、166Dv、169Er、18F、52Fe、59Fe、67Ga、68Ga、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、166Ho、120I、123I、124I、125I、131I、110In、111In、194Ir、177Lu、51Mn、52mMn、99Mo、13N、15O、32P、33P、211Pb、212Pb、109Pd、149Pm、142Pr、143Pr、223Ra、82mRb、186Re、188Re、189Re、105Rh、47Sc、153Sm、75Se、83Sr、89Sr、161Tb、94mTc、94Tc、99mTc、86Y、90Y和89Zr；并且，當(dāng)靶向構(gòu)建體包含一種以上放射性核素時，放射性核素可以是不同的放射性核素。113.權(quán)利要求111的方法，其中診斷劑包括對照試劑。114.權(quán)利要求111的方法，其中診斷劑包括成像劑。115.權(quán)利要求111的方法，其中治療劑包括藥物、毒素、細(xì)胞因子、激素或生長因子。116.一種內(nèi)窺鏡鑒定受試者病灶組織的方法，其包括施用有效量的雙特異性抗體或抗體片段；和施用包含權(quán)利要求1化合物的靶向構(gòu)建體；其中雙特異性抗體或抗體片段包含至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂；并且其中所述至少一個臂能夠結(jié)合到靶細(xì)胞、組織或病原體或由其產(chǎn)生的或與其相關(guān)的分子上的互補(bǔ)結(jié)合部分。117.權(quán)利要求116的方法，其中所述靶向構(gòu)建體進(jìn)一步包含至少一種放射性核素、治療劑、診斷劑或酶。118.權(quán)利要求117的方法，其中放射性核素選自225Ac、111Ag、72As、77As、211At、198Au、199Au、212Bi、213Bi、75Br、76Br、11C、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、166Dy、169Er、18F、52Fe、59Fe、67Ga、68Ga、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、166Ho、120I、123I、124I、125I、131I、110In、111In、194Ir、177Lu、51Mn、52mMn、99Mo、13N、15O、32P、33P、211Pb、212Pb、109Pd、149Pm、142Pr、143Pr、223Ra、82mRb、196Re、188Re、189Re、105Rh、47Sc、153Sm、75Se、73Sr、89Sr、161Tb、94mTc、94Tc、99mTc、86Y、90Y和89Zr；并且，當(dāng)靶向構(gòu)建體包含一種以上放射性核素時，放射性核素可以是不同的放射性核素。119.權(quán)利要求117的方法，其中診斷劑包括對照試劑。120.權(quán)利要求117的方法，其中診斷劑包括成像劑。121.權(quán)利要求117的方法，其中治療劑包括藥物、毒素、細(xì)胞因子、激素或生長因子。122.一種血管內(nèi)鑒定受試者病灶組織的方法，其包括施用有效量的雙特異性抗體或抗體片段，其中雙特異性抗體或抗體片段包含至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂；其中所述至少一個臂能夠結(jié)合到靶細(xì)胞、組織或病原體或由其產(chǎn)生的或與其相關(guān)的分子上的互補(bǔ)結(jié)合部分；和施用包含權(quán)利要求1化合物的靶向構(gòu)建體。123.權(quán)利要求122的方法，其中所述靶向構(gòu)建體進(jìn)一步包含至少一種放射性核素、治療劑、診斷劑或酶。124.權(quán)利要求123的方法，其中放射性核素選自225Ac、111Ag、72As、77As、211At、198Au、199Au、212Bi、213Bi、75Br、76Br、11C、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、166Dy、169Er、18F、52Fe、59Fe、67Ga、68Ga、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、166Ho、120I、123I、124I、125I、131I、110In、111In、194Ir、177Lu、51Mn、52mMn、99Mo、13N、15O、32P、33P、211Pb、212Pb、109Pd、149Pm、142Pr、143Pr、223Ra、82mRb、186Re、188Re、189Re、105Rh、47Sc、153Sm、75Se、83Sr、89Sr、161Tb、94mTc、94Tc、99mTc、86Y、90Y和89Zr；并且，當(dāng)靶向構(gòu)建體包含一種以上放射性核素時，放射性核素可以是不同的放射性核素。125.權(quán)利要求123的方法，其中診斷劑包括對照試劑。126.權(quán)利要求123的方法，其中診斷劑包括成像劑。127.權(quán)利要求123的方法，其中治療劑包括藥物、毒素、細(xì)胞因子、激素或生長因子。全文摘要本發(fā)明涉及可以被雙特異性抗體或抗體片段結(jié)合的靶向構(gòu)建體，所述抗體或抗體片段有至少一個特異性結(jié)合靶組織的臂，和至少另外一個特異性結(jié)合靶向構(gòu)建體的臂。靶向構(gòu)建體含有載體部分，所述載體部分包含或攜帶至少一個可被所述雙特異性抗體或抗體片段的至少一個臂識別的表位。該靶向構(gòu)建體進(jìn)一步包含一個或多個治療或診斷劑或酶。本發(fā)明提供了構(gòu)建體和制備靶向構(gòu)建體、雙特異性抗體或抗體片段的方法，以及使用它們的方法。文檔編號C07K16/46GK1668335SQ03816898公開日2005年9月14日申請日期2003年5月16日優(yōu)先權(quán)日2002年5月17日發(fā)明者D·M·戈登伯格,H·漢森,S·-O·梁,W·J·麥克布里德,Z·屈申請人:免疫醫(yī)療公司