專利名稱：包含革蘭氏陰性菌來源的運鐵蛋白結合蛋白和hsf疫苗組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及革蘭氏陰性菌的免疫原性組合物和疫苗、它們的生產和這些組合物的藥用用途。更具體的說，本發(fā)明涉及包含運鐵蛋白結合蛋白和Hsf的疫苗組合物。這兩種抗原的存在導致更高水平殺菌抗體的產生。
背景革蘭氏陰性菌是許多人類疾病的病原體，需要發(fā)展有效的疫苗對抗這些細菌。具體的說，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、馬耳他布魯氏菌(Brucellamelitensis)、羊布魯氏菌(Brucella ovis)、鸚鵡熱衣原體(Chlamydiapsittaci)、砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、埃希氏大腸桿菌(Esherichia coli)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)均為可通過免疫接種治療的致病革蘭氏陰性菌。
淋病奈瑟氏球菌為淋病的病原體，淋病是世界上最常報道的一種性傳播疾病，估計其年發(fā)病率為6200萬例(Gerbase et al 1998 Lancet351；(Suppl 3)2-4)。淋病的臨床癥狀包括泌尿生殖道、咽喉或直腸的粘膜炎癥和新生兒眼部感染。女性上行性淋球菌感染可導致不孕、宮外孕、慢性盆腔炎病以及形成輸卵管膿腫。復雜型淋病伴有敗血癥、關節(jié)炎、心內膜炎和腦膜炎。
耐抗生素淋球菌的巨大數(shù)目導致淋病發(fā)病率及其并發(fā)癥的增加。對淋病的抗生素療法，一種有吸引力的替代方法是免疫接種預防?，F(xiàn)在還沒有針對淋病奈瑟氏球菌的疫苗。
腦膜炎奈瑟氏球菌是一種重要病原體，特別是在兒童和青年成人中。敗血癥和腦膜炎是侵襲性腦膜炎球菌疾病(IMD)最危及生命的形式。由于其高發(fā)病率和高致死率，這種疾病已成為世界性健康問題。
基于其莢膜多糖抗原性差異，現(xiàn)已鑒定了十三種腦膜炎奈瑟氏球菌血清群，最常見的是血清群A、B和C，它們引起了世界上90％的這類疾病。血清群B是歐洲、美國和一些拉丁美洲國家腦膜炎球菌疾病最常見的病因。
現(xiàn)已發(fā)展出基于血清群A、C、W和Y莢膜多糖的疫苗，這些疫苗控制了腦膜炎球菌疾病的爆發(fā)(Peltola et al 1985 Pediatrics 76；91-96)。但是血清群B的免疫原性很弱，只能引起主要為同型IgM的短暫抗體應答(Ala′Aldeen D and Cartwright K 1996，J.Infect.33；153-157)。現(xiàn)在還沒有廣泛有效抗血清群B腦膜炎球菌的疫苗，而此血清群正是在大多數(shù)溫帶國家中引起這類疾病的主要原因。這是一個特別棘手的問題，因為血清型B引起的疾病在歐洲、澳大利亞和美國的發(fā)生率正在上升，大多數(shù)是在5歲以下的兒童中。發(fā)展抗血清群B腦膜炎球菌的疫苗特別困難，因為其多糖莢膜免疫原性很弱，這是由于其莢膜與人神經細胞黏附分子的免疫性相似。因此生產疫苗的策略集中在腦膜炎球菌外膜的表面暴露結構上，但由于這些抗原在各菌株之間顯著變化而受到阻礙。
進一步研究導致由外膜囊泡構成的疫苗的產生，外膜囊泡含有一些組成正常細菌膜成分的蛋白質。其中一個疫苗是VA-MENGOC-BC抗腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B和C的Cuban疫苗(Rodriguez et al1999 Mem Inst.Oswaldo Cruz，Rio de Janeiro 94；433-440)。此疫苗被設計用于對抗古巴爆發(fā)的侵襲性腦膜炎球菌疾病，該疾病不能被使用莢膜多糖AC疫苗的接種計劃清除。該疾病的主導血清群為B和C，VA-MENGOC-BC疫苗成功控制了疾病爆發(fā)，估計其抗腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B株的疫苗有效率為83％(Sierra et al 1990 In Neisseria，Walter Gruyter，Berlin，m.Atchman et al(eds)p 129-134，Sierra et al 1991，NIPH Ann 14；195-210)。此疫苗對特定的爆發(fā)有效，但引起的免疫應答不能防范腦膜炎奈瑟氏球菌的其它菌株。
隨后在拉丁美洲相同和不同腦膜炎球菌血清群B菌株引起的流行病流行期間進行的效力研究表明，此疫苗在較大兒童和成人中有一定效力，但在最具感染危險的較小兒童中其效力明顯較低(Milagreset al 1994，Infect.Immun.62；4419-4424)。問題是這類疫苗在有多菌株地方性流行病的國家如聯(lián)合王國有多大的效果。抗異株免疫原性的研究只表現(xiàn)出有限的交叉反應性血清殺菌活性，特別是在嬰兒中(Tappero et al 1999，JAMA 281；1520-1527)。
挪威發(fā)展出第二個外膜囊泡疫苗，它使用的是斯堪的納維亞普遍流行的血清型B中分離的菌株(Fredriksen et al 1991，NIPH Ann，14；67-80)。臨床試驗此疫苗，發(fā)現(xiàn)其29個月后保護率為57％(Bjune et al1991，Lancet，338；1093-1096)。
但是，在疫苗的使用中外膜囊泡涉及一些問題。例如，OMV含有有毒的脂多糖，而且它們含有的免疫顯性抗原可為菌株特異性或其表達常常變異。已有一些方法可用來克服一些外膜囊泡制劑疫苗的問題。WO01/09350描述了解決某些這種問題的方法，例如降低毒性和修飾外膜囊泡上存在的抗原。
現(xiàn)有的抗腦膜炎球菌疫苗具有不同的問題。基于蛋白的外膜疫苗為特異性的，并只對少數(shù)菌株有效。多糖疫苗是次優(yōu)的，因為它們引起較弱的短時免疫反應，特別是對于血清群B(Lepow et al 1986；Peltola 1998，Pediatrics 76；91-96)。
奈瑟氏球菌感染表明了一個重要的健康問題，對于這個問題，淋病奈瑟氏球菌沒有疫苗可用，腦膜炎奈瑟氏球菌疫苗的效力和防范異株的能力有限。顯然現(xiàn)在需要發(fā)展更好的抗奈瑟氏球菌感染疫苗，它們能提高現(xiàn)有疫苗的效力，并防范更廣范圍的菌株。
附圖簡述

圖1.考馬斯染色的凝膠顯示來源于不同腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的外膜囊泡制劑中Hsf、TbpA和NspA的表達水平。1道-分子量標記；2道-從H44/76菌株制備的外膜囊泡，其中莢膜多糖被下調；3道-從H44/76菌株制備的外膜囊泡，其中莢膜多糖和PorA被下調；4道-從H44/76菌株制備的外膜囊泡，其中莢膜多糖和PorA被下調，NspA被上調；5道-從H44/76菌株制備的外膜囊泡，其中莢膜多糖和PorA被下調，Hsf被上調；6道-從H44/76菌株制備的外膜囊泡，其中莢膜多糖和PorA被下調，TbpA被上調；7道-從H44/76菌株制備的外膜囊泡，其中莢膜多糖和PorA被下調，TbpA和Hsf被上調；8道-從H44/76菌株制備的外膜囊泡，其中莢膜多糖和PorA被下調，TbpA和NspA被上調。
發(fā)明詳述本發(fā)明公開了一種抗原的組合物，當抗原結合于免疫原性組合物或疫苗中時，可比單獨給予抗原時誘導更高的殺菌抗體滴度。優(yōu)選抗原組合物導致殺菌抗體的滴度協(xié)同效應性升高。由于殺菌抗體近似反映了候選疫苗的效力，疫苗中Tbp和Hsf的結合產生非常高效的疫苗。本發(fā)明另一個優(yōu)點是Tbp和Hsf兩個抗原的結合將能防范更廣范圍的菌株。
本發(fā)明涉及包含運鐵蛋白結合蛋白和Hsf樣蛋白或其抗原片段的免疫原性組合物。在與其它抗原形成的混合物中，這些蛋白質被分離或優(yōu)選純化到純度或富集度至少為30％、40％，更優(yōu)選為50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。運鐵蛋白結合蛋白和Hsf樣蛋白可分離自或來源于相同或不同的革蘭氏陰性菌株。
分離是指蛋白質被人工從其自然環(huán)境中分離出來。純化是指在抗原與本發(fā)明免疫原性組合物的其它成分結合之前，被純化到純度至少為30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。
來源于是指編碼蛋白質的基因來源自某個菌株或蛋白質純化自某個菌株。因此，來源于包括獨立表達系統(tǒng)中產生的重組蛋白，如果編碼此蛋白的基因來源于所述細菌。
相互結合時，Tbp和Hsf表現(xiàn)出有利的相互作用，優(yōu)選協(xié)同性引起殺菌活力(例如用血清殺菌檢測法或SBA測量)更高的免疫應答，優(yōu)選超過各抗原分別引起應答的累積，更優(yōu)選其協(xié)同因子至少為1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9，最優(yōu)選其協(xié)同因子至少為10。疫苗中加入Tbp和Hsf引起強烈的殺菌免疫應答，并防范多個菌株，較現(xiàn)有疫苗有顯著的優(yōu)勢。
本發(fā)明的一個實施方案是包含運鐵蛋白結合蛋白和Hsf樣蛋白的免疫原性組合物。免疫原性組合物是包含至少一種給予宿主時可產生免疫應答的抗原的組合物。Tbp和Hsf樣蛋白可來源于任何革蘭氏陰性菌，包括粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、流感嗜血桿菌、博德特氏菌、奈瑟氏球菌(包括腦膜炎奈瑟氏球菌，它可以是血清群A、B、C、W135或Y，以及淋病奈瑟氏球菌)或上述革蘭氏陰性菌菌株。本發(fā)明包括免疫原性組合物，其中Tbp和Hsf樣蛋白來源于相同或不同的革蘭氏陰性菌菌株。
運鐵蛋白結合蛋白運鐵蛋白結合蛋白(Tbp)為革蘭氏陰性菌外膜上的蛋白或蛋白復合物，它結合運鐵蛋白。該家族中的某些蛋白可形成錨定于外膜的β桶。結構上，運鐵蛋白結合蛋白可包含帶TonB盒和活塞結構域的胞內N端結構域，以及與短胞內環(huán)和較長胞外環(huán)相連的多次穿膜β鏈。其它實例包括與整合膜蛋白相互作用形成復合物的脂蛋白。該家族蛋白的實例為TbpA和TbpB。術語Tbp包括單獨存在或處于結合狀態(tài)的這些蛋白，以及TbpA和TbpB形成的復合物。優(yōu)選本發(fā)明免疫原性組合物中至少存在TbpA。
現(xiàn)已區(qū)分了TbpB的兩個家族，它們分別具有高分子量和低分子量。TbpB的高分子量和低分子量形式(WO93/06861；EP586266)與不同家族TbpA相連(WO93/06861；EP586266；WO92/03467；US5912336)，這些TbpA根據其同源性區(qū)分。雖然具有相同分子量，TbpA因其與高分子量形式或低分子量形式TbpB相連而被分為高分子量家族和低分子量家族(Rokbi et al FEMS Microbiol.Lett.100；51，1993)。已知TbpA和TbpB在各種細菌中表達，包括腦膜炎奈瑟氏球菌(WO93/06861；EP586266；WO92/03467；US5912336)、淋病奈瑟氏球菌(WO92/03467；US5912336)、流感嗜血桿菌(Gray-Owen et alInfect.Immun.1995；631201-1210，Schryvers J.Med.Microbiol.1989；29121-130；WO95/13370；WO96/40929)、大葉性肺炎放線桿菌、粘膜炎莫拉氏菌(Mathers et al FEMS Immunol.Med.Microbiol.1997；19231；Chen et al Vaccine 1999；18109；WO97/13785；WO99/52947)和溶血巴斯德氏菌(Cornelissen et al Infection andImmunity68；4725，2000)。TbpA和TbpB也被分別稱為Tbp1(NMB 0461)和Tbp2(NMB 0460)(Cornelissen et al Infection and Immunity65；822，1997)。
本文使用的Tbp表示來源于革蘭氏陰性菌的運鐵蛋白結合蛋白，其來源包括粘膜炎莫拉氏菌和流感嗜血桿菌，優(yōu)選奈瑟氏球菌，更優(yōu)選腦膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌，最優(yōu)選腦膜炎奈瑟氏球菌血清型B。Tbp包含TbpA和TbpB以及高分子量和低分子量形式的TbpA及TbpB。Tbp包含上述單獨存在的蛋白、該蛋白與其它任何蛋白的復合物及其可與運鐵蛋白結合的復合物。
雖然Tbp可指任何高或低分子量形式的TbpA或TbpB，優(yōu)選高分子量和低分子量形式的TbpA和/或TbpB存在于本發(fā)明的免疫原性組合物中。最優(yōu)選存在高分子量和低分子量TbpA。
本發(fā)明的免疫原性組合物中還可考慮包含其它攝鐵蛋白替代或補充Tbp。粘膜炎莫拉氏菌的攝鐵蛋白包括TbpA、TbpB、Ton-B依賴受體、CopB(Sethi et al Infect.Immun.1997；653666-3671)、HasR、OmpB1和LbpB(Du et al Infect.Immun.1998；663656-3665；Mathers etal FEMS Immunol.Med.Microbiol.1997；19231-236；Chen et alVaccine 1999；18109-118)。流感嗜血桿菌的攝鐵蛋白包括TbpB、HasR、TonB依賴受體、血紅蛋白結合蛋白、HhuA、HgpA、HgbA、HgbB和HgbC(Cope et al Infect.Immun.2000；684092-4101；Maciveret al Infect.Immun.1996；643703-3712；Jin et al Infect.Immun.1996；643134-3141；Morton et al J.Gen.Microbiol.1990；136927-933；Schryvers J.Med.Microbiol.1989；29121-130)。腦膜炎奈瑟氏球菌來源的攝鐵蛋白包括Tbp1(NMB 0461)、Tbp2(NMB 0460)、FbpA(NMB0634)、FbpB、BfrA(NMB 1207)、BfrB(NMB 1206)、LbpA(NMB 1540)、LbpB(NMB 1541)、也稱為GNA2132的Lipo28(NMB 2132)、Sibp(NMB1882)、Ton B依賴受體(NMB 0964和NMB 0293)和HmbR(Tettelin et alScience 287；1809-1815 2000)。
本發(fā)明免疫原性組合物中包含的Tbp蛋白與WO93/06861和EP586266中所述來源于腦膜炎奈瑟氏球菌的TbpA和TbpB具有同源性；優(yōu)選與WO93/06861和EP586266中所述TbpA和TbpB氨基酸序列的一致性超過40％、45％、50％、60％、70％，更優(yōu)選超過80％或90％，最優(yōu)選超過95％、96％、97％、98％、99％。
Tbp包含一些特殊區(qū)域。例如，在來源于腦膜炎奈瑟氏球菌H44/76的TbpA中，氨基端186個氨基酸形成內部球形區(qū)域，22個跨膜β鏈，形成β桶結構。這些區(qū)域由短的胞內環(huán)和較大的胞外環(huán)連接。胞外環(huán)2、3和5具有最高程度的序列多樣性，環(huán)5暴露于表面。環(huán)5和4涉及配體結合，優(yōu)選本發(fā)明免疫原性組合物中包含TbpA片段。
除了本文所述的基因上調技術外，革蘭氏陰性菌中的運鐵蛋白結合蛋白還可通過在下述限鐵條件下生長而被上調。在本發(fā)明免疫原性組合物中，外膜囊泡中的運鐵蛋白結合蛋白被上調，上調優(yōu)選通過使宿主菌株在限鐵條件下生長達到。該方法還會導致各種鐵調控蛋白的上調，特別是奈瑟氏球菌菌株中的FrpB和血紅素/血紅素結合蛋白利用蛋白C、流感嗜血桿菌中的HgpA和HgpB，它們可成為免疫顯性的。因此用下述方法下調這些蛋白的表達(優(yōu)選缺失編碼它們的基因)是有利的，以確保本發(fā)明免疫原性組合物引起的免疫應答可抵抗多種菌株中存在的抗原。
Hsf樣蛋白Hsf樣蛋白是自體轉運(autotransporter)蛋白，與WO99/31132中發(fā)現(xiàn)的腦膜炎奈瑟氏球菌Hsf序列具有同源性；優(yōu)選與WO99/31132中發(fā)現(xiàn)的Hsf氨基酸序列(優(yōu)選SEQ ID NO 2、4、6或8)的同源性超過40％、50％、60％、70％，更優(yōu)選超過80％，最優(yōu)選超過90％，最優(yōu)選超過95％、96％、97％、98％、99％。Hsf樣蛋白為表面暴露蛋白，被認為有粘附素功能。這些蛋白形成多聚復合體，在感染和建群時表達。
許多革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)有Hsf樣蛋白，包括腦膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、流感嗜血桿菌、粘膜炎莫拉氏菌和埃希氏大腸桿菌。腦膜炎奈瑟氏球菌中發(fā)現(xiàn)的Hsf樣蛋白的實例包括Hsf(也稱為NhhA-NMB 0992)(WO99/31132)、Aida-1樣蛋白(Peak et al 2000，F(xiàn)EMS Imm.Med.Microbiol.28；329)、IgA蛋白酶、Ssh-2、Hap(WO99/55873)、NadA(J.Exp Med.2002 195；1445)、UspA2和Tsh。粘膜炎莫拉氏菌中Hsf樣蛋白的實例包括Hsf、UspA1(WO93/03761)、UspA2(WO93/03761)、外膜酯酶和YtfN。流感嗜血桿菌中Hsf樣蛋白的實例包括Hia/Hsf(St Geme et al J.Bacteriol.2000 1826005-6013)、Hap、IgA1蛋白酶、HMW1、HMW2(Barenkamp et al Infect.Immun.1992 60；1302-1313)、YadA、YadAc和YtfN(Hendrixson et alMol Cell 1998；2941-850；St Geme et al Mol Microbiol.1994；14217-233；Grass and St Geme Infect.Immunol.2001；69；307-314；St Gemeand Cutter J.Bacteriology 2000；182；6005-6013)。埃希氏大腸桿菌中Hsf樣蛋白的實例包括Hsf、Hia和Hap。
Hsf具有自體轉運蛋白常見的結構。例如，腦膜炎奈瑟氏球菌H44/76株的Hsf由以下部分組成暴露于表面包含可變區(qū)(52-106，121-124，191-210和230-234位氨基酸)的蛋白氨基端的頭區(qū)(52-479位氨基酸)、頸區(qū)(480-509位氨基酸)、疏水α螺旋區(qū)(518-529位氨基酸)和跨外膜的四個穿膜鏈所在的錨定區(qū)(539-591位氨基酸)。
Hsf可指包含1-51位氨基酸組成的信號序列的全長多肽。本發(fā)明也包含除去信號序列的Hsf，這樣該多肽組成Hsf的成熟形式。其它Hsf優(yōu)選形式可被截短以缺失WO01/55182中公開蛋白的可變區(qū)。優(yōu)選變體包括缺失了1、2、3、4或5個WO01/55182中定義的可變區(qū)。優(yōu)選變體缺失了52-237位間氨基酸殘基或缺失了54-237位間氨基酸殘基，更優(yōu)選缺失了52-133位間氨基酸殘基或55-133位間氨基酸殘基。需要理解的是截短的變體可包含或不包含Hsf的1-51位氨基酸信號序列。上述序列和下述序列可在N端和C端的任一端或兩端被截短或延長1、2、3、4、5、7、10或15個氨基酸。
當Hsf用于亞單位疫苗時，優(yōu)選使用可溶性乘客域(passengerdomain)部分；例如52-479位氨基酸的完整結構域，最優(yōu)選其保守部分例如134-479位氨基酸。
雖然優(yōu)選使用全長Tbp和/或Hsf樣蛋白(特別是TbpA和Hsf)、或其天然變體、或N端和/或C端缺少不超過60個氨基酸的全序列，Tbp和/或Hsf樣蛋白的抗原片段也包含在本發(fā)明免疫原性組合物中。這些片段是從Tbp和Hsf樣蛋白，優(yōu)選TbpA和Hsf的氨基酸序列中取出的連續(xù)片段，包含至少10個氨基酸，優(yōu)選20個氨基酸，更優(yōu)選30個氨基酸，更優(yōu)選40個氨基酸，或最優(yōu)選50個氨基酸。此外，抗原片段表示與抗體產生免疫學反應的片段，該抗體為抗腦膜炎奈瑟氏球菌Tbp或Hsf樣蛋白抗體，優(yōu)選抗TbpA或Hsf抗體，或為哺乳動物宿主被腦膜炎奈瑟氏球菌感染時產生的抗體?？乖芜€包括產生免疫應答的片段，該免疫應答特異性拮抗來源于革蘭氏陰性菌的Tbp或Hsf樣蛋白，優(yōu)選TbpA或Hsf。這些片段優(yōu)選防范其來源細菌的感染，優(yōu)選防范奈瑟氏球菌感染，更優(yōu)選防范腦膜炎奈瑟氏球菌感染，最優(yōu)選防范腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B感染。
優(yōu)選TbpA片段包含TbpA胞外環(huán)。使用腦膜炎奈瑟氏球菌H44/76株的TbpA序列時，這些環(huán)對應于環(huán)1的200-202位氨基酸、環(huán)2的226-303位氨基酸、環(huán)3的348-395位氨基酸、環(huán)4的438-471位氨基酸、環(huán)5的512-576位氨基酸、環(huán)6的609-625位氨基酸、環(huán)7的661-671位氨基酸、環(huán)8的707-723位氨基酸、環(huán)9的769-790位氨基酸、環(huán)10的814-844位氨基酸和環(huán)11的872-903位氨基酸。在序列對比后，對應的序列在其它Tbp蛋白中也組成優(yōu)選片段。最優(yōu)選片段包含組成Tbp環(huán)2、環(huán)3、環(huán)4或環(huán)5的氨基酸序列。
雖然上述Tbp或TbpA蛋白的優(yōu)選片段涉及腦膜炎奈瑟氏球菌，本領域的技術人員能基于序列同源性，從所有上述革蘭氏陰性菌株的Tbp或TbpA蛋白中輕易找出同等多肽，這些多肽也是本發(fā)明的片段。
優(yōu)選Hsf片段包含Hsf整個頭區(qū)，優(yōu)選包含Hsf 52-473位氨基酸。其它Hsf優(yōu)選片段包含頭區(qū)的表面暴露區(qū)，包含52-62、76-93、116-134、147-157、157-175、199-211、230-252、252-270、284-306、328-338、362-391、408-418、430-440和469-479位氨基酸。最優(yōu)選片段為用在本發(fā)明OMV制劑中的134-591和用在本發(fā)明亞單位組合物中的134-479。
雖然上述Hsf樣蛋白或Hsf蛋白優(yōu)選片段涉及腦膜炎奈瑟氏球菌，本領域的技術人員能基于序列同源性，從所有上述革蘭氏陰性菌株的Hsf樣蛋白或Hsf蛋白中輕易找出同等多肽，這些多肽也是本發(fā)明的片段。
本發(fā)明還包含Tbp和Hsf樣蛋白，優(yōu)選TbpA和Hsf的融合蛋白。這些融合蛋白可為Tbp和Hsf樣蛋白的結合物，優(yōu)選TbpA和Hsf，或其片段結合到同一多肽中?；蛘?，本發(fā)明還包含Tbp和Hsf樣蛋白各自的融合蛋白，優(yōu)選TbpA和/或Hsf，或其片段的融合蛋白，使Tbp和Hsf樣蛋白兩者，優(yōu)選TbpA和Hsf，或其片段均存在于本發(fā)明組合物中。例如TbpA或Hsf可與下述蛋白形成融合蛋白β半乳糖苷酶、谷胱甘肽S轉移酶、綠色熒光蛋白(GFP)、附加表位如FLAG、myc標記、聚組氨酸、或病毒/細菌表面蛋白如流感病毒血細胞粘附素、破傷風類毒素、白喉類毒素或CRM197。
可引入免疫原性組合物的分離運鐵蛋白結合蛋白是本領域熟知的(WO0025811)。它們可由細菌宿主表達，用去污劑提取(例如2％Elugent)，用親和層析或本領域熟知的標準柱層析技術(Oakhill et alBiochem J.2002 364；613-6)純化。類似的，Hsf的分離可使用本領域熟知的技術完成。重組Hsf可在E.Coli或其它細菌菌株中表達。該蛋白可使用親和層析純化。如果在Hsf序列中引入了標記，這可成為常規(guī)程序。
發(fā)明人指出本文使用的術語“包含”、“包括”在所有場合可任選替換為術語“由……組成”、“組成為”。
疫苗組合本發(fā)明涉及包括Tbp和Hsf樣蛋白的抗原組合，所述組合有效引起高效抗革蘭氏陰性菌的殺菌活性。本發(fā)明抗原性組合物可包含Tbp和Hsf外的抗原。它們可包含其它來源于革蘭氏陰性菌蛋白抗原，優(yōu)選來源于奈瑟氏球菌，更優(yōu)選來源于腦膜炎奈瑟氏球菌。
腦膜炎奈瑟氏球菌對于腦膜炎奈瑟氏球菌，本發(fā)明免疫原性組合物優(yōu)選包含Hsf和TbpA。在OMV制劑中，優(yōu)選Hsf和TbpA在OMV來源的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株中上調。TbpA可以高或低分子量形式存在，優(yōu)選高和低分子量形式都存在。Hsf優(yōu)選作為膜整合蛋白截短物存在于OMV中，優(yōu)選134-591位氨基酸。Hsf還可作為亞單位疫苗存在，優(yōu)選為乘客域(氨基酸52-479)，最優(yōu)選為乘客域134-479氨基酸位截短物。
可進一步向上述組合物中加入抗原(若存在于OMV中則上調)，例如，NspA(WO96/29412)、Hap(PCT/EP99/02766)、PorA、PorB、OMP85(也稱為D15)(WO00/23595)、PilQ(PCT/EP99/03603)、PldA(PCT/EP99/06718)、FrpB(WO96/31618見SEQ ID NO38)、FrpA(NMB 0585)或FrpC或至少30、50、100、500、750個氨基酸的兩者相同保守部分(WO92/01460)、LbpA和/或LbpB(PCT/EP98/05117；Schryvers et al Med.Microbiol.1999 321117)、FhaB(WO98/02547 SEQ ID NO38[3083-9025位核苷酸])、HasR(PCT/EP99/05989)、lipo02(PCT/EP99/08315)、MltA(WO99/57280)(NMB0033)和ctrA(PCT/EP00/00135)。
優(yōu)選本發(fā)明免疫原性組合物中抗原組合包含Tbp和Hsf樣蛋白和FhaB的組合；Tbp和Hsf樣蛋白和PilQ的組合；Tbp和Hsf樣蛋白和NspA的組合；Tbp和Hsf樣蛋白和FrpC的組合；更優(yōu)選包含Tbp和Hsf樣蛋白和Hap的組合；Tbp和Hsf樣蛋白和FrpA/C的組合；Tbp和Hsf樣蛋白和LbpB的組合；Tbp和Hsf樣蛋白和D15的組合。最優(yōu)選包含D15為外膜囊泡制劑的部分。
粘膜炎莫拉氏菌抗原本發(fā)明免疫原性組合物中優(yōu)選包含一個或多個下述粘膜炎莫拉氏菌來源的蛋白(優(yōu)選TbpA和Hsf樣蛋白來源于粘膜炎莫拉氏菌)OMP106(WO97/41731 & WO96/34960)、HasR(PCT/EP99/03824)、PilQ(PCT/EP99/03823)、OMP85(PCT/EP00/01468)、lipo06(GB9917977.2)、Lipo10(GB 9918208.1)、Lipo11(GB 9918302.2)、lipo18(GB9918038.2)、P6(PCT/EP99/03038)、ompCD、CopB(Helminen ME，etal(1993)Infect.Immun.612003-2010)、D15(PCT/EP99/03822)、OmplA1(PCT/EP99/06781)、Hly3(PCT/EP99/03257)、LbpA和LbpB(WO98/55606)、TbpA和TbpB(WO97/13785 & WO97/32980)、OmpE、UspA1和UspA2(WO93/03761)，以及Omp21。
流感嗜血桿菌抗原本發(fā)明免疫原性組合物中優(yōu)選包含一個或多個下述流感嗜血桿菌來源的蛋白(優(yōu)選TbpA和Hsf樣蛋白來源于流感嗜血桿菌)D15(WO 94/12641)、P6(EP 281673)、TbpA、TbpB、P2、P5(WO94/26304)、OMP26(WO 97/01638)、HMW1、HMW2、HMW3、HMW4、Hia、Hsf、Hap、Hin47和Hif。
本發(fā)明另一個方面為包含本發(fā)明抗原性組合物和其它抗原的疫苗組合，該組合用于某些疾病狀況時有優(yōu)勢，包括與病毒和革蘭氏陽性菌有關的疾病。
在一個優(yōu)選組合中，包含本發(fā)明Tbp和Hsf樣蛋白的抗原性組合物用1、2、3或優(yōu)選所有4個下述腦膜炎球菌莢膜多糖或寡糖配制A、C、Y或W-135，它們可為單純型或與蛋白載體結合的結合型。這種包含腦膜炎奈瑟氏球菌來源TbpA和Hsf的疫苗在用作全球腦膜炎球菌疫苗時有優(yōu)勢。優(yōu)選包含結合型腦膜炎球菌莢膜多糖C、C和Y或A和C。
在一個更優(yōu)選實施方案中，如上述優(yōu)選用1、2、3或所有4個單純型或結合型腦膜炎球菌莢膜多糖(或寡糖)A、C、Y或W-135配制的包含本發(fā)明TbpA和Hsf的抗原性組合物用結合的流感嗜血桿菌b莢膜多糖或寡糖配制，和/或一個或多個單純型或結合型肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)莢膜多糖或寡糖。該疫苗還可任選包含一個或多個保護宿主抵抗肺炎鏈球菌感染的蛋白抗原。這種疫苗用作腦膜炎/鏈球菌肺炎疫苗時有優(yōu)勢。
在一個更優(yōu)選的實施方案中，包含本發(fā)明Tbp和Hsf樣蛋白的免疫原性組合物用莢膜多糖配制，該莢膜多糖來源于一個或多個下述細菌腦膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血桿菌b、肺炎鏈球菌、A群鏈球菌、B群鏈球菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。在一個優(yōu)選實施方案中，免疫原性組合物包含來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、W-135和Y其中一個或多個的莢膜多糖。一個更優(yōu)選的實施方案包含來源于肺炎鏈球菌的莢膜多糖。肺炎球菌莢膜多糖抗原優(yōu)選選自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F(最優(yōu)選為選自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。一個更優(yōu)選的實施方案包含流感嗜血桿菌PRP莢膜多糖。一個更優(yōu)選的實施方案包含5型、8型或336金黃色葡萄球菌的莢膜多糖。一個更優(yōu)選的實施方案包含I型、II型或III型表皮葡萄球菌的莢膜多糖。一個更優(yōu)選的實施方案包含Ia型、Ic型、II型或III型B群鏈球菌莢膜多糖。一個更優(yōu)選的實施方案包含A群鏈球菌莢膜多糖，更優(yōu)選包含至少一種M蛋白，更優(yōu)選包含多種M。
優(yōu)選肺炎球菌蛋白抗原為暴露于肺炎球菌外表面的肺炎球菌蛋白(至少在肺炎球菌部分生命周期中可被宿主免疫系統(tǒng)識別)，或肺炎球菌分泌或釋放的蛋白。最優(yōu)選該蛋白為肺炎鏈球菌毒素、粘附素、2-成分信號轉導蛋白(2-component signal tranducr)或脂蛋白，或其片段。特別優(yōu)選的蛋白包含但不限于肺炎球菌溶血素(優(yōu)選經化學處理或突變解毒)[Mitchell et al.Nucleic Acids Res.1990 Jul 11；18(13)4010″Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcuspneumoniae types 1 and 2.″，Mitchell et al.Biochim Biophys Acta 1989Jan 23；1007(1)67-72″Expression of the pneumolysin gene inEscherichia colirapid purification and biological properties.″，WO96/05859(A.Cyanamid)，WO 90/06951(Paton et al)，WO99/03884(NAVA)]；PspA及其穿膜缺失突變體(US 5804193-Briles etAL.)；PspC及其穿膜缺失突變體(WO 97/09994-Briles et al)；PsaA及其穿膜缺失突變體(Berry & Paton，Infect Immun 1996 Dec；64(12)5255-62″Sequence heterogeneity of PsaA，a 37-kilodalton putativeadhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae″)；肺炎球菌膽堿結合蛋白及其穿膜缺失突變體；CbpA及其穿膜缺失突變體(WO97/41151；WO 99/51266)；甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(Infect.Immun.1996643544)；HSP70(WO 96/40928)；PcpA(Sanchez-Beato et al.FEMSMICROBIOL LETT 1998，164207-14)；M樣蛋白(EP 0837130)和粘附素18627(EP 0834568)。更優(yōu)選的肺炎球菌蛋白抗原為WO 98/18931中公開的抗原，特別是選自WO 98/18930和PCT/US99/30390中的抗原。
本發(fā)明疫苗還可任選包含防范白喉(Diphtheria)、破傷風(tetanuss)和百日咳博德特氏菌中的一種或多種感染的抗原。百日咳成分可為滅活的完整百日咳博德特氏菌(Pw)或包含至少一個(優(yōu)選所有3個)來源于PT、FHA和69kDa pertactin抗原的無細胞百日咳(Pa)。提供對白喉和破傷風防范的典型抗原為白喉類毒素和破傷風類毒素。所述類毒素可為化學失活的毒素或引入點突變的無活性毒素。
本發(fā)明疫苗還可任選包含一種或多種使宿主防范無定型(non-typeable)流感嗜血桿菌、RSV的抗原和/或一種或多種保護宿主防范流感病毒的抗原。這種疫苗用作全球中耳炎疫苗是有優(yōu)勢的。
優(yōu)選無定型流感嗜血桿菌蛋白抗原包括絲束蛋白(US 5766608)和包含其多肽的融合蛋白(如LB1融合蛋白)(US 5843464-Ohio StateResearch Foundation)、OMP26、P6、蛋白D、TbpA、TbpB、Hia、Hmw1、Hmw2、Hap和D15。
優(yōu)選流感病毒抗原包括生長于雞蛋、MDCK細胞或Vero細胞中的完整存活或失活病毒、分裂流感病毒(split influenza virus)或完整流感病毒體(如R.Gluck，Vaccine，1992，10，915-920所述)，或其純化蛋白或重組蛋白，如HA、NP、NA或M蛋白，或其組合。
優(yōu)選RSV(呼吸道合胞病毒)抗原包括F糖蛋白、G糖蛋白、HN蛋白、M蛋白或其衍生物。
應領會的是本發(fā)明抗原性組合物可包含一種或多種來源于單一種類細菌的莢膜多糖?？乖越M合物還可包含來源于一種或多種細菌的莢膜多糖。
該莢膜多糖可為非結合形式或與載體蛋白結合，如破傷風類毒素、破傷風類毒素片段C、白喉類毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素、蛋白D(US6342224)、TbpA或Hsf。本發(fā)明一個實施方案包含與TbpA和Hsf結合的非結合莢膜多糖。
多糖結合物可通過任何已知結合技術制備。例如多糖可通過硫醚鍵結合。該結合方法用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸鹽(CDAP)活化多糖，形成氰酸酯?；罨亩嗵强芍苯咏Y合或通過間隔基團連接到載體蛋白的氨基上。優(yōu)選氰酸酯與己二胺偶合，氨基衍化多糖用涉及硫醚鍵形成的異種連接化學(heteroligation chemistry)方法結合到載體蛋白上。該結合物在Uniformed Services University的PCT公開申請WO93/15760中有所介紹。
結合物還可通過直接還原氨基化方法制備，如US4365170(Jennings)和US4673574(Anderson)中所述。其它方法如EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中所述。
另一個方法涉及通過碳二亞胺縮合，用己二酸酰肼(ADH)衍化的溴化氰活化多糖偶合到載體蛋白上(Chu C.et al Infect.Immunity，1983 245 256)。
包含外膜囊泡的抗原性組合物本發(fā)明一個優(yōu)選方面是在OMV中上調或過度表達Tbp和Hsf。革蘭氏陰性菌通過連續(xù)兩層膜結構即質膜和外膜與外界基質隔離。革蘭氏陰性菌的外膜是動態(tài)的，根據環(huán)境條件可產生劇烈的形態(tài)變化。在這些表現(xiàn)中，對許多革蘭氏陰性菌中的外膜囊泡的形成進行了記載和研究(Zhou et al 1998)。其中，一份不完全的產囊泡細菌病原體名單包括百日咳博德特氏菌、布氏疏螺旋體、馬耳他布魯氏菌、羊布魯氏菌、鸚鵡熱衣原體、砂眼衣原體、埃希氏大腸桿菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、淋病奈瑟氏球菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、銅綠假單胞菌和小腸結腸炎耶爾森氏菌。雖然對其產生OMV/囊泡的生化機制還未完全了解，對這些外膜囊泡進行了詳細的研究，因為它們代表分離天然構型外膜蛋白制劑的一種有力的方法學。在這種情況下，外膜制劑的使用對發(fā)展抗奈瑟氏球菌、粘膜炎莫拉氏菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌和衣原體的疫苗具有特別吸引力。而且，外膜囊泡聯(lián)合多個合適蛋白或非蛋白抗原可帶來擴展防范種內變體的效果。
本發(fā)明外膜囊泡具有上調的Tbp和Hsf樣蛋白(優(yōu)選TbpA和Hsf)。這可任選通過使Hsf樣蛋白和Tbp在來源于一種革蘭氏陰性菌的外膜囊泡中上調達到，優(yōu)選奈瑟氏球菌菌株。Hsf樣蛋白和Tbp還可各自在來源于不同革蘭氏陰性菌菌株的外膜囊泡中上調，優(yōu)選奈瑟氏球菌菌株。在一個優(yōu)選實施方案中，Tbp和Hsf樣蛋白，更優(yōu)選TbpA和Hsf上調的不同奈瑟氏球菌菌株分別為L2和L3免疫型腦膜炎奈瑟氏球菌或L3和L2免疫型腦膜炎奈瑟氏球菌。
奈瑟氏球菌菌株來源囊泡制劑的制備可通過任何技術人員已知的方法進行。優(yōu)選使用EP 301992、US 5,597,572、EP 11243或US 4,271,147、Frederikson et al.(NIPH Annals ，1467-80)、Zollinger et al.(J.Clin.Invest. ，63836-848)、Saunders et al.(Infect.Immun. ，67113-119)、Drabick et al.(疫苗 ，18160-172)或WO 01/09350(實施例8)中公開的方法。一般OMV用去污劑提取，優(yōu)選脫氧膽酸，核酸任選用酶法清除。任選用超速離心后排阻層析的方法純化。若包含2個或更多不同本發(fā)明的囊泡，它們可混和裝在一個容器中形成本發(fā)明的多價制劑(如果本發(fā)明的不同囊泡為在單獨容器中的獨立成分，將其同時給予[就醫(yī)一次]宿主也認為是多價制劑)。OMV制劑通常經0.2μm濾器過濾除菌，優(yōu)選儲存在已知可穩(wěn)定囊泡制劑的蔗糖溶液(如3％)中。
外膜囊泡制劑中Tbp和Hsf樣蛋白的上調可通過在OMV制劑來源的革蘭氏陰性菌中插入額外的基因拷貝實現(xiàn)。若非如此，OMV制劑來源的細菌菌株中基因啟動子可被換為更強的啟動子。這些技術在WO01/09350中有論述。與來源于未改造腦膜炎奈瑟氏球菌(如H44/76菌株)的OMV相比，蛋白的上調會導致OMV中存在更高水平的蛋白。優(yōu)選水平高出至少1.2、1.5、2、3、4、5、7、10或20倍。
當LPS為OMV中額外抗原時，可優(yōu)選在OMV制備方法中使用低濃度去污劑(如脫氧膽酸或DOC)提取的方案，以保留高水平的結合LPS而除去特別有毒的弱結合LPS。所用DOC濃度優(yōu)選為0-0.5％DOC，更優(yōu)選0.02％-0.4％，0.03％-0.3％，0.04％-0.2％，0.05％-0.15％，0.05％-0.2％DOC，最優(yōu)選接近或恰好0.1％DOC。
“強啟動序列”指增加編碼所需抗原的基因轉錄的調控元件。
“上調表達”指相對于未改造(即天然產生)囊泡，任何增強所需抗原表達的方法。應該理解的是“上調”的量因所需特定抗原不同而變化，但是不超過破壞囊泡膜完整性的量?？乖纳险{指表達比未改造囊泡中高至少10％。優(yōu)選高至少50％。更優(yōu)選高至少100％(2倍)。最優(yōu)選高至少3、4、5、7、10、20倍。優(yōu)選在囊泡來源于限鐵條件下生長的細菌時評估表達水平(例如在鐵螯合劑存在下)。
或者，上調表達可指在代謝或營養(yǎng)改變時使表達不受條件限制的進行，特別對于TbpA、TbpB、LbpA和LbpB。
再次說明，術語“工程改造細菌菌株以產生更少所述抗原”或下調是指相對于未改造囊泡(即天然囊泡)，任何降低所需抗原表達(或功能基因產物的表達)的方法，優(yōu)選為缺失，從而使表達比未改造囊泡至少低10％。優(yōu)選低至少50％，最優(yōu)選完全消除。如果下調蛋白為酶或功能蛋白，下調可通過引入一個或多個突變完成，該突變導致酶活力或功能活性下降10％、20％、50％、80％或優(yōu)選下降100％。
改變奈瑟氏球菌蛋白表達要求的工程步驟可通過技術人員已知的多種方法進行。例如，可插入序列(如啟動子或可讀框)、通過轉座子插入技術打斷啟動子/基因。例如，為了上調基因表達，可通過轉座子在基因起始密碼子上游最多2kb(更優(yōu)選上游200-600bp，最優(yōu)選上游約400bp)處插入強啟動子。可使用點突變或缺失(特別對于下調基因的表達)。
但是這些方法可能極不穩(wěn)定或不確定，因此優(yōu)選工程步驟通過同源重組進行。優(yōu)選此方法發(fā)生在兩個序列之間一個為細菌染色體至少30個核苷酸的序列(重組區(qū))，另一個為轉入此株細菌的載體至少30個核苷酸的序列(第二個重組區(qū))。優(yōu)選這些區(qū)域為40-1000個核苷酸，更優(yōu)選為100-800個核苷酸，最優(yōu)選為500個核苷酸)。這些重組區(qū)應有足夠的相似性，這樣它們可在嚴格條件下相互雜交。
本文中所述進行遺傳改造的方法(如通過重組和引入其它基因序列到奈瑟氏球菌基因組中上調或下調基因表達)見WO01/09350中所述。典型可整合入奈瑟氏球菌的強啟動子為porA、porB、lgtF、Opa、p110、lst和hpuAB。優(yōu)選組成性強啟動子PorA和PorB。已被確定的是PorB啟動子活性包含在對應于porB起始密碼子上游-1到-250核苷酸的片段中。
通過在限鐵條件下生長上調攝鐵蛋白的表達本發(fā)明外膜囊泡制劑中運鐵蛋白結合蛋白的上調優(yōu)選通過從限鐵條件下生長的革蘭氏陰性菌親株中分離外膜囊泡實現(xiàn)。培養(yǎng)基中低濃度的鐵導致涉及攝鐵蛋白表達增加，包括TbpA和TbpB。這些蛋白的表達因此被上調而無需重組改造有關基因，如通過插入強啟動子或插入額外的基因拷貝。本發(fā)明還包括通過使基因已被重組改造的菌株在限鐵培養(yǎng)基中生長而上調運鐵蛋白結合蛋白的方法。
限鐵可通過向培養(yǎng)基中加入鐵螯合劑實現(xiàn)。合適的鐵螯合劑包括2，2-二吡啶、EDDHA(乙二胺-二(鄰羥基苯乙酸))和Desferal(甲磺酸去鐵胺，Sigma)。優(yōu)選Desferal螯合劑，以10-100μM的濃度加入培養(yǎng)基中，優(yōu)選25-75μM，更優(yōu)選50-70μM，最優(yōu)選60μM。培養(yǎng)基中鐵主要來自酵母浸出物和大豆蛋白胨，各批中含量可有差異。因此對于不同批次培養(yǎng)基，不同濃度的Desferal可實現(xiàn)上調攝鐵蛋白的最佳效果。熟練技術人員可輕易確定最佳濃度。一般來說，應向培養(yǎng)基中加入足夠的鐵螯合劑以上調所需鐵調控蛋白的表達，但不應多至對細菌生長產生有害的效果。
優(yōu)選將通過在限鐵條件下生長使運鐵蛋白結合蛋白上調的方法與重組上調Hsf樣蛋白相結合，以獲得本發(fā)明的外膜囊泡。
下調/除去可變的非保護性免疫顯性抗原許多表面抗原在細菌菌株間是可變的，其結果是保護只針對有限密切相關的菌株。本發(fā)明的一個方面包括含有Tbp和Hsf樣蛋白的外膜囊泡，優(yōu)選TbpA和Hsf，該外膜囊泡中其它蛋白的表達降低，或優(yōu)選編碼可變表面蛋白的基因被缺失。當在疫苗中給予缺失獲得的產囊泡細菌菌株時，有更大潛力產生抗各種菌株的交叉反應，這是因為保守蛋白(保留在外膜上)對免疫者的免疫系統(tǒng)產生了較大影響。可變抗原的實例包括對于奈瑟氏球菌經歷了抗原性變異的pili(PilC)、PorA、Opa、OpC、PilC、PorB、TbpB、FrpB；對于流感嗜血桿菌P2、P5、pilin、IgA1蛋白酶；對于莫拉氏菌屬OMP106。
其它可被下調或關閉的基因是細菌體內容易打開(表達)或關閉的基因。這樣基因編碼的外膜蛋白不經常存在于細菌表面，襄泡制劑中這些蛋白的存在由于上述原因對疫苗的有效性也是有害的。一個下調或缺失的優(yōu)選實例是奈瑟氏球菌Opc蛋白。含Opc囊泡疫苗引起的抗Opc免疫只有有限的保護作用，因為感染生物容易變?yōu)镺pc-。這類蛋白另外的實例是流感嗜血桿菌HgpA和HgpB。
例如，這些可變或非保護性基因表達可被下調，甚至關閉。其優(yōu)勢是免疫系統(tǒng)集中作用在少量存在于囊泡外膜表面上的更好抗原上。
下調表達的方法在WO01/09350中公開。
下調免疫顯性的外膜蛋白是指蛋白表達水平降低，優(yōu)選關閉，或者突變和/或缺失暴露于表面的免疫顯性環(huán)，使外膜蛋白免疫顯性更低。下調蛋白酶功能是指蛋白表達水平降低或優(yōu)選關閉，或者指酶功能的表現(xiàn)降低或優(yōu)選消失。
優(yōu)選用于制作本發(fā)明免疫原性組合物的腦膜炎球菌菌株具有下調、優(yōu)選缺失PorA、OpA和Opc中的1、2或3個。優(yōu)選PorA和Opa；PorA和OpC；OpA和OpC；PorA和Opa以及OpC被下調。
已知四個不同Opa基因存在于腦膜炎球菌的基因組中(Aho et al.1991 Mol.Microbiol.51429-37)，因此所述的Opa表達被下調是指優(yōu)選1、2、3或(優(yōu)選)所有4個存在于腦膜炎球菌中的基因被下調。下調可通過WO01/09350中所述遺傳性實現(xiàn)，或通過從腦膜炎球菌Opa系中尋找容易找到的自然穩(wěn)定不表達或低表達的菌株來實現(xiàn)。這些菌株可使用Poolman et al(1985 J.Med.Micro.19203-209)中所述技術找到，其中Opa-細胞和表達Opa的細胞具有不同表型，該區(qū)別可通過在平板上或顯微鏡下觀察細胞形態(tài)看到。一旦發(fā)現(xiàn)。穩(wěn)定表現(xiàn)出Opa-的菌株可通過發(fā)酵后對細胞內容物進行Western blot確認其Opa的缺失。
當本發(fā)明外膜囊泡中運鐵蛋白結合蛋白的上調是通過在限鐵條件下生長實現(xiàn)時，可變鐵調控蛋白也可上調。這些蛋白包括腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌中的FrpB(Microbiology 142；3269-3274，(1996)；J.Bacteriol.181；2895-2901(1999))，以及流感嗜血桿菌中的血紅素/血紅素結合蛋白利用蛋白C(J.Bacteriol.177；2644-2653(1995))和HgpA、HgpB和HgpC(Infect.Immun.66；4733-4741(1998)，Infect.Immun.67；2729-2739(1999)，Microbiology 145；905-914(1999))。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，當使用限鐵條件上調運鐵蛋白結合蛋白的表達時，至少下調這些蛋白中的可變蛋白是有利的。這可通過使用WO01/09350中所述方法實現(xiàn)，或通過缺失蛋白中可變部分實現(xiàn)。這會保證免疫原性組合物引起的免疫應答被引向較大范圍的菌株中存在的抗原。FrpB的下調優(yōu)選與本發(fā)明囊泡性免疫原性組合物中下述抗原下調結合PorA和OpA；PorA和OpC；OpA和OpC；PorA和OpA和OpC，所述抗原來源于革蘭氏陰性菌，優(yōu)選粘膜炎莫拉氏菌、流感嗜血桿菌或奈瑟氏球菌(更優(yōu)選腦膜炎奈瑟氏球菌)。在一個本發(fā)明的替代實施方案中，外膜囊泡中的FrpB被下調，該外膜囊泡來源于革蘭氏陰性菌，優(yōu)選粘膜炎莫拉氏菌、流感嗜血桿菌或奈瑟氏球菌(更優(yōu)選腦膜炎奈瑟氏球菌)，任選在限鐵條件下生長。
LPS的解毒本發(fā)明免疫原性組合物中的OMV可通過WO01/09350中公開的LPS解毒方法解毒。具體的說，LPS的解毒方法涉及下調，優(yōu)選缺失WO01/09350中所述的酶htrB和/或msbB。這些基因缺失突變株的表型特征為msbB-突變株的LPS與野生型相比失去了一條仲?；?，htrB-突變株LPS失去了2(兩者)仲?；湣＿@些方法優(yōu)選與涉及低濃度DOC提取OMV的方法結合，優(yōu)選0-0.3％DOC，更優(yōu)選0.05-0.2％DOC，最優(yōu)選約0.1％DOC。
其它LPS解毒方法包括向囊泡制劑中加入功能等同于多粘菌素B[與脂質A高度親和的分子]的無毒多肽(優(yōu)選SAEP2)(功能等同于多粘菌素B的無毒多肽——特別是多肽SAEP2(序列KTKCKFLKKC中2個半胱氨酸形成二硫鍵)用途詳見WO93/14115、WO95/03327、Velucchi et al(1997)J Endotoxin Res 41-12，和EP976402)。
多糖交叉反應從莢膜革蘭氏陰性菌中分離細菌外膜囊泡常導致莢膜多糖也被純化。在某些情況下，此“污染物”是有用的，因為它可增強其它囊泡成分引起的免疫應答。但在其它情況下，細菌囊泡制劑中污染多糖物質的存在對疫苗中囊泡的使用是有害的。例如，已顯示至少對于腦膜炎奈瑟氏球菌其血清群B莢膜多糖不引起保護性免疫，而且它容易引起有害的人體自身免疫應答。所以，本發(fā)明外膜囊泡可從產囊泡細菌菌株中分離，該菌株經工程改造沒有莢膜多糖。此囊泡因而適合用于人體。一個特別優(yōu)選的囊泡制劑實例是來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B的缺乏莢膜多糖的菌株。一般外膜囊泡應從不能合成莢膜多糖的革蘭氏陰性菌中分離，特別是上述msbB-的突變株。
這可通過使用改造的產囊泡菌株實現(xiàn)，該菌株中莢膜生物合成和/或輸出所必需的基因受損。編碼莢膜多糖生物合成或輸出基因的失活可通過突變(點突變、缺失或插入)調控區(qū)、編碼區(qū)或兩者(優(yōu)選使用上述同源重組技術)實現(xiàn)，或通過任何其它降低這些基因酶功能的方法。此外，莢膜生物合成基因的失活可通過反義過度表達或轉座子誘變實現(xiàn)。優(yōu)選方法為缺失某些或全部多糖生物合成和輸出必需的腦膜炎奈瑟氏球菌莢膜多糖(cps)基因。為達此目的，可使用置換質粒pMF121(Frosh et AL.1990，Mol.Microbiol.41215-1218中所述)以運載缺失突變cpsCAD(+galE)基因簇。
當上述本發(fā)明免疫原性組合物來源于腦膜炎球菌B菌株時，更優(yōu)選也除去莢膜多糖(其包含人類相似多糖結構)。雖然許多基因可通過關閉實現(xiàn)此效果，本發(fā)明人已表明，優(yōu)選產囊泡菌株通過遺傳工程改造永久性下調siaD基因功能基因產物的表達(即下調α-2-8聚唾液酸轉移酶活力)，優(yōu)選通過關閉基因，最優(yōu)選通過缺失全部或部分基因啟動子和/或可讀框。該失活作用如WO01/09350中所述。siaD(也稱為synD)突變是許多可導致莢膜多糖中人類相似表位缺失的突變中最有優(yōu)勢的突變，因為它是僅有的對LOS保護性表位沒有影響的突變中的一個，因此它在將LOS作為最終保護性抗原目標的方法中具有優(yōu)勢，而且它對細菌的生長影響最小。因此本發(fā)明一個優(yōu)選方面是上述的免疫原性囊泡制劑，該制劑來源于lgtE-siaD-、lgtA-siaD-或優(yōu)選lgtB-siaD-腦膜炎球菌B突變株。該菌株本身為本發(fā)明的另一個方面。
雖然由于上述原因優(yōu)選siaD-突變株，可使用其它關閉奈瑟氏球菌(優(yōu)選腦膜炎球菌B)莢膜多糖合成的突變株。因此產囊泡菌株可被遺傳改造永久性下調下列一個或多個功能基因產物的表達ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA(同synX和siaA)、synB(同siaB)或synC(同siaC)基因，優(yōu)選通過關閉基因，最優(yōu)選通過缺失所有或部分基因啟動子和/或可讀框。lgtE-突變可與一個或多個這些突變結合。優(yōu)選lgtB-突變與一個或多個這些突變結合。因此本發(fā)明的另一個方面是上述免疫原性囊泡制劑，該制劑來源于有上述結合突變的腦膜炎球菌B菌株。該菌株本身是本發(fā)明的另一個方面。
LPS寡糖部分中的不均一性在不同奈瑟氏球菌中產生了結構多樣性和抗原多樣性(Griffiss et al.Inf.Immun.1987；551792-1800)。這被用于將腦膜炎球菌細分為12個免疫型(Scholtan et al.J MedMicrobiol 1994，41236-243)。免疫型L3、L7和L9在免疫學上相同，其結構相似(甚至相同)，因此被稱為L3，7，9(通稱為“L3”)。腦膜炎球菌LPS L3，7，9(L3)、L2和L5可通過唾液酸化或加入胞嘧啶5′-單磷酸-N-乙酰神經氨酸修飾。雖然L2、L4和L6型LPS有免疫學差異，但是它們結構相似，并且本文中提及L2之處，在本發(fā)明范圍內可任選用L4或L6取代。LPS結構和不均一性的說明詳見M.P.Jennings etAL，Microbiology 1999，145，3013-3021和Mol Microbiol 2002，43931-43。
由于L3或L2型LPS與人鞘糖脂中的乳-N-新四糖寡糖基團(lacto-N-neotetraose oligosaccharide group)(Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-)存在結構相似性，L3或L2型LPS抗體的安全性已受到質疑。即使大量人群已用脫氧膽酸提取的含殘量L3型LPS的囊疫苗安全免疫(G.Bjune et AL，Lancet(1991)，338，1093-1096；GVG.Sierra et AL，NIPH ann(1991)，14，195-210)，缺失LOS糖的末端部分對于防止任何與人組織表面結構發(fā)生的交叉反應是有利的。在一個優(yōu)選實施方案中，lgtB基因的失活導致形成末端半乳糖殘基和唾液酸缺失的LPS結構中間體(突變保留L2和L3型LOS中的4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-結構)。該中間體可在L3和L2型LPS菌株中獲得。一個替代性次優(yōu)選(短)的LPS可通過關閉lgtE基因獲得。一個更加替代性次優(yōu)選的LPS可通過關閉lgtA基因獲得。如果選擇該lgtA-突變株，優(yōu)選還關閉lgtC的表達以防止形成非免疫原性的L1免疫型。
最優(yōu)選LgtB-突變，因為本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)這是最佳截短方式，可解決安全性問題而仍保留可引起殺菌抗體應答的LPS保護性寡糖表位。
因此，還包含L2或L3制劑(無論純化型或分離型囊泡)或腦膜炎球菌囊泡制劑的本發(fā)明免疫原性組合物一般最好來源于遺傳工程改造以永久性下調lgtB、lgtA或lgtE功能基因產物表達的奈瑟氏球菌(優(yōu)選腦膜炎球菌)，優(yōu)選通過關閉基因，最優(yōu)選通過缺失全部或部分基因啟動子和/或可讀框。
包含各種lgt基因(包括lgtB和lgtE)的奈瑟氏球菌基因座及其序列是本領域已知的(見M.P.Jennings et AL，Microbiology 1999，145，3013-3021和本文列舉的參考文獻，以及J.Exp.Med.1802181-2190 )。
在囊泡制劑中，特別在用低濃度DOC提取的制劑中，LPS可用作本發(fā)明免疫原性組合物中的抗原。下調/缺失/失活lgtE、lgtA(特別是與lgtC結合)或者優(yōu)選lgtB基因/基因產物的酶功能是有利的，以除去人類相似的乳-N-新四糖結構。包含用于生物合成LPS寡糖結構的lgt基因的奈瑟氏球菌基因座(及其序列)是本領域已知的(Jennings etal Microbiology 1999 145；3013-3021和本文列舉的參考文獻，以及J.Exp.Med.1802181-2190 )。優(yōu)選下調/缺失lgtB(或功能基因產物)，因為它保留了完整的LPS保護性表位。
在本發(fā)明腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B囊泡制劑中，優(yōu)選下調/缺失siaD和lgtB(雖然在腦膜炎球菌B產囊泡菌株中也可使用lgtB-與下述任何ctrA-、ctrB-、ctrC-、ctrD-、synA-(同synX-和siaA-)、synB-(同siaB-)或synC-(同siaC-)結合)，獲得具有最佳安全性和保留LPS保護性表位的囊泡制劑。
本發(fā)明免疫原性組合物可包含至少1、2、3、4或5種不同外膜囊泡制劑。其中包含2種或更多OMV制劑時，每種OMV中至少一種本發(fā)明抗原被上調。這些OMV制劑可來源于相同種和血清群的奈瑟氏球菌，或優(yōu)選來源于不同類、血清群、血清型、亞血清型或免疫型的奈瑟氏球菌。例如，免疫原性組合物可包含一種或多種包含L2免疫型LPS的外膜囊泡制劑，以及一種或多種包含L3免疫型LPS的外膜囊泡制劑。優(yōu)選L2或L3型OMV制劑來源于LPS寡糖合成基因座相轉變最小的穩(wěn)定菌株。
優(yōu)選的奈瑟氏球菌囊泡制劑除了Hsf和Tbp外，在奈瑟氏球菌包括淋病球菌和腦膜炎球菌(特別是腦膜炎奈瑟氏球菌B)中進行上調時，優(yōu)選一個或多個下述基因(編碼保護性抗原)NspA(WO96/29412)、Hap(PCT/EP99/02766)、PorA、PorB(NMB2039)、OMP85(WO00/23595)、PilQ(PCT/EP99/03603)、PIdA(PCT/EP99/06718)、FrpB(WO96/31618)、FrpA/FrpC(WO92/01460)、LbpA/LbpB(PCT/EP98/05117)、FhaB(WO98/02547)、HasR(PCT/EP99/05989)、lipo02(PCT/EP99/08315)、MltA(WO99/57280)、MafA(NMB0652)、MafB(NMB0643)、Omp26(NMB0181)、粘附素NMB0315、粘附素NMB0995、粘附素NMB1119、P2086(NMB0399)、Lip028(NMB2132)、NM-ADPRT(NMB1343)、VapD(NMB1753)和CtrA(PCT/EP00/00135)。它們也優(yōu)選作為異源基因導入其它革蘭氏陰性菌中。
優(yōu)選下調一個或多個下述基因PorA、PorB、PilC、LbpA、LbpB、Opa、Opc、HtrB、msbB和lpxK。
優(yōu)選上調一個或多個下述基因pmrA、pmrB、pmrE和pmrF。
優(yōu)選改造以下抑制調控序列fur操縱基因區(qū)(特別對于TbpB基因或LbpB基因或兩者)；DtxR操縱基因區(qū)。
優(yōu)選下調一個或多個下述基因galE、siaA、siaB、siaC、siaD、ctrA、ctrB、ctrC和ctrD。
本發(fā)明免疫原性組合物還可包含來源于革蘭氏陰性菌的OMV/囊泡制劑，此革蘭氏陰性菌包括銅綠假單胞菌、粘膜炎莫拉氏菌和流感嗜血菌b。
優(yōu)選的銅綠假單胞菌囊泡制劑除了Hsf和Tbp，優(yōu)選上調一個或多個下述基因(編碼保護性抗原)PcrV、OprF、OprI。它們也優(yōu)選作為異源基因導入其它革蘭氏陰性菌株中。
優(yōu)選的粘膜炎莫拉氏菌囊泡制劑除了Hsf和Tbp，優(yōu)選上調一個或多個下述基因(編碼保護性抗原)OMP106(WO97/41731和WO96/34960)、HasR(PCT/EP99/03824)、PilQ(PCT/EP99/03823)、OMP85(PCT/EP00/01468)、lipo06(GB9917977.2)、lipo10(GB9918208.1)、lipo11(GB9918302.2)、lipo18(GB9918038.2)、P6(PCT/EP99/03038)、ompCD、CopB(HelminenME，et al(1993) Infect.Immun.612003-2010)、D15(PCT/EP99/03822)、Omp1A1(PCT/EP99/06781)、Hly3(PCT/EP99/03257)、LbpA和LbpB(WO98/55606)、TbpA和TbpB(WO97/13785，WO95/13370和WO97/32980)、OmpE、UspA1和UspA2(WO93/03761)，以及Omp21。它們也優(yōu)選作為異源基因導入其它革蘭氏陰性菌株中。
優(yōu)選下調一個或多個下述基因CopB、OMP106、OmpB1、LbpA、和LbpB。
優(yōu)選下調一個或多個下述基因htrB、msbB和lpxK。
優(yōu)選上調一個或多個下述基因pmrA、pmrB、pmrE和pmrF。
優(yōu)選的流感嗜血桿菌囊泡制劑除了Hsf和Tbp，優(yōu)選上調一個或多個下述基因(編碼保護性抗原)D15(WO94/12641、WO95/12641)、P6(EP281673)、P2、P5(WO94/26304)、OMP26(WO97/01638)、HMW1、HMW2、HMW3、HMW4、Hia、Hap、Hin47和Hif(應上調所有此操縱子中的基因以上調菌毛蛋白)。它們也優(yōu)選作為異源基因導入其它革蘭氏陰性菌株中。
優(yōu)選下調一個或多個下述基因P2、P5、Hif、IgA1蛋白酶、HgpA、HgpB、HMW1、HMW2、Hxu、htrB、msbB和lpxK。
優(yōu)選上調一個或多個下述基因pmrA、pmrB、pmrE和pmrF。
優(yōu)選本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗不包含和/或由其組成WO00/71725第3頁18行到第52頁2行的表中列出的SEQ ID具體組合和/或WO00/71725中實施例1-11所述任何個別組合。
優(yōu)選額外的或替代的WO01/52885中公開的任何個體化組合在本發(fā)明中未要求保護。
疫苗制劑一個本發(fā)明優(yōu)選實施方案是疫苗中本發(fā)明的免疫原性組合物制劑，該制劑還可包含藥學可接受的賦形劑或載體。
用任何前述改造過的菌株生產外膜囊泡制劑可通過任何本領域技術人員熟知的方法實現(xiàn)。優(yōu)選使用EP301992、US5,597,572、EP11243或US4,271,147中公開的方法。最優(yōu)選使用WO01/09350中公開的方法。
Vaccine Design(“The subunit and adjuvant approach”(eds Powell M.F.& Newman M.J.)(1995)Plenum Press New York)中描述了疫苗制備的一般方法。
本發(fā)明的抗原性組合物在本發(fā)明疫苗制劑中可佐劑化。合適的佐劑包含鋁鹽如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁，但還可為鈣鹽(特別是碳酸鈣)、鐵鹽或鋅鹽，或者可為任何?；野彼?、?；?、陽離子或陰離子衍生多糖或聚磷腈的不溶性懸浮液。
可使用的合適Th1佐劑系統(tǒng)包括，單磷酰脂質A，特別是3-脫-O-?；瘑瘟柞Ｖ|A，和單磷酰脂質A、優(yōu)選3-脫-O-酰化單磷酰脂質A(3D-MPL)與鋁鹽的組合。一個增強系統(tǒng)涉及WO94/00153中所述單磷酰脂質A與皂苷衍生物組合，特別是QS21和3D-MPL的組合，或者WO96/33739中所述反應原性更弱的組合物，其中QS21用膽固醇猝滅。一個特別有潛力的涉及水包油乳液中的QS21、3D-MPL和生育酚的佐劑配方見WO95/17210中所述，并且這是優(yōu)選配方。
本發(fā)明疫苗可包含皂苷，更優(yōu)選QS21。它還可包含水包油乳液和生育酚。包含寡核苷酸的未甲基化CpG(WO 96/02555)也是優(yōu)選的TH1應答誘導物，并適合用于本發(fā)明中。
本發(fā)明的疫苗制劑可用于保護或治療易感染的哺乳動物，通過全身途徑或粘膜途徑給予所述疫苗。這些給藥途徑可包括肌肉內、腹膜內、真皮內或皮下注射途徑；或口腔/消化、呼吸、泌尿生殖道粘膜給藥的途徑。因此本發(fā)明的一個方面為免疫人類宿主，使其抵抗革蘭氏陰性菌感染導致的疾病，該方法包括給予宿主免疫保護劑量的本發(fā)明囊泡制劑。
選擇每劑疫苗中抗原劑量，此劑量在典型的免疫者中引起免疫保護應答而無顯著的有害副反應。該劑量根據使用的特異性免疫原及其使用方式不同而變化。一般每劑包含1-100μg蛋白抗原，優(yōu)選5-50μg，最典型在5-25μg范圍內。
具體疫苗的最佳劑量可通過涉及觀察受免疫者中適當免疫應答的標準研究確定。在首次接種后，受免疫者可以恰當?shù)拈g隔接受一次或多次加強免疫。
本發(fā)明的多核苷酸“多核苷酸”一般指任何多核糖核酸或多脫氧核糖核酸，它可為未修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA?！岸嗪塑账帷卑ǖ幌抻趩捂満碗p鏈DNA、單鏈和雙鏈區(qū)混和的DNA、單鏈和雙鏈RNA、單鏈和雙鏈區(qū)混和的RNA、包含單鏈或更典型雙鏈或單鏈和雙鏈區(qū)混和的DNA和RNA的雜合分子。此外，“多核苷酸”指包含RNA或DNA或RNA和DNA兩者的三鏈區(qū)。術語多核苷酸還包括含有一個或多個修飾堿基的DNA或RNA，為了穩(wěn)定或其它原因具有修飾骨架的DNA或RNA?！靶揎棥眽A基包括如三苯甲基化堿基和稀有堿基如次黃嘌呤核苷?？蓪NA和RNA進行各種修飾；因此，“多核苷酸”包含自然界一般存在的多核苷酸的化學、酶或代謝性修飾形式，以及病毒和細胞中特征性的DNA和RNA化學形式?！岸嗪塑账帷边€包含相對短的多核苷酸，常被稱為寡核苷酸。
本發(fā)明的另一個方面涉及免疫學的/疫苗制劑，此制劑包含一種或多種編碼Tbp和Hsf樣蛋白的多核苷酸，特別是對應于本發(fā)明蛋白組合的多核苷酸。這些技術是本領域已知的，例如見Wolff et al.，Science，(1990)2471465-8。
這些多核苷酸中Tbp和Hsf樣蛋白，優(yōu)選TbpA和Hsf，其表達受真核啟動子調控，可在哺乳動物細胞中表達。多核苷酸還可包含編碼其它抗原的序列。這些真核啟動子的實例包含使用哺乳動物細胞作為宿主的病毒來源的啟動子，包括腺病毒啟動子、逆轉錄病毒啟動子。此外，哺乳動物啟動子也可用于驅動TbpA和Hsf樣蛋白的表達。
抗體和被動免疫本發(fā)明的另一個方面是使用包含TbpA和Hsf樣蛋白的免疫原性組合物產生免疫球蛋白，該免疫球蛋白可用于治療或預防革蘭氏陰性菌感染，優(yōu)選奈瑟氏球菌，更優(yōu)選腦膜炎奈瑟氏球菌，最優(yōu)選腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B。
用于產生多克隆抗體的接種物通過將抗原性組合物分散在生理學可接受的稀釋劑中制備，該稀釋劑如為生理鹽水或其它適合用于人體的輔料，以形成水性組合物。給予哺乳動物免疫刺激量的接種物，保持接種哺乳動物一段足以使抗原性組合物誘導產生保護性抗體的時間。
抗體可通過熟知的技術如親和層析分離到所需的純度。
抗體可包括來源于各種常用動物的抗血清制劑，這些動物如山羊、靈長動物、驢、豬、馬、豚鼠、小鼠或人。從這些動物取血并回收血清。
依照本發(fā)明生產的免疫球蛋白可包含完整抗體，抗體片段或亞片段。抗體可為任何種類的完整免疫球蛋白，如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE、對Tbp和Hsf有雙重特異性的嵌合抗體或雜合抗體。它們也可為片段，如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv和包括雜合片段在內的類似物。免疫球蛋白還包含天然的、合成的或遺傳工程改造的蛋白，該蛋白如抗體般作用，與特異性抗原結合形成復合物。
本方面的疫苗可給予作為在特異性攻擊下產生免疫球蛋白來源的接受者。接受者捐獻血漿，用傳統(tǒng)血漿分離方法從中獲得超免疫球蛋白。給予其它接受者以超免疫球蛋白，以傳遞抗奈瑟氏球菌感染抗性或治療奈瑟氏球菌感染。本發(fā)明超免疫球蛋白對于治療或預防奈瑟氏球菌疾病特別有用，在嬰兒、免疫低下個體或治療需要但沒有時間使個體應答疫苗產生抗體時。
本發(fā)明另一個方面是包含單克隆抗體的藥用組合物，該抗體與TbpA和Hsf反應的，可用于治療或預防革蘭氏陰性菌感染，優(yōu)選奈瑟氏球菌，更優(yōu)選腦膜炎奈瑟氏球菌，最優(yōu)選腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B。
這類藥用組合物包含的單克隆抗體可為任何種類的完整免疫球蛋白，如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE、對Tbp和Hsf樣蛋白有雙重特異性的嵌合抗體或雜合抗體。它們也可為片段，如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv和包括雜合片段在內的類似物。
制造單克隆抗體的方法是本領域熟知的，可包括將脾細胞與骨髓瘤細胞融合(Kohler and Milstein 1975 Nature 256；495；Antibodies-alaboratory manual Harlow and Lane 1988)。另外，單克隆Fv片段可通過篩選合適噬菌體展示文庫(Vaughan TJ et al 1998 NatureBiotechnology 16；535)獲得。單克隆抗體還可用本領域熟知的技術人源化或部分人源化。
血清殺菌測定血清殺菌測定是檢測免疫原性組合物中組合的抗原間協(xié)同關系的優(yōu)選方法。這種協(xié)同應答的特征可為抗原組合引起的SBA相對于每個抗原單獨引起的SBA，高出至少50％、2倍、3倍，優(yōu)選4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍，最優(yōu)選10倍。優(yōu)選測量對抗原來源的同源菌株的SBA，優(yōu)選還測量對一組異源菌株的SBA。(代表性的抗原組見下，如屬于A-4簇的BZ10(B:2b:P1.2)；屬于ET-37復合物的B16B6(B:2a:P1.2)；以及H44/76(B:15:P1.7，16))。SBA是獲得最廣泛承認的評估腦膜炎球菌疫苗效力的免疫標記(Perkins et al.J InfectDis.1998，177683-691)。令人滿意的SBA可通過任何已知的方法確認。SBA可用從動物模型(見實施例6-9)或從人類受試者獲得的血清進行。
用人血清進行SBA的更優(yōu)選方法如下述。在第一次接種前、第二次接種后2月和第三次接種后1月取血樣，(1年內接種三次為典型的人初種計劃，給予時間例如為0、2和4月，或0、1和6月)。該人初種計劃可在1歲以下嬰兒中(例如在進行Hib免疫的同時)進行或在2-4歲兒童中進行，青少年也可按該初種計劃進行接種以進行SBA測定。如果可行，初種后6-12個月和增強劑量后1月再取血樣。
對于有同源殺菌活力的抗原或囊泡制劑，如果(在2-4歲兒童或青少年中，但優(yōu)選在1歲以下嬰兒中)(初種計劃)第三次疫苗劑量后1月，抗本發(fā)明抗原來源的腦膜炎球菌的活力在SBA(抗體稀釋)滴度(與接種前滴度相比)方面上升了四倍的受試者，其占全部受試者的百分比大于30％，優(yōu)選大于40％，更優(yōu)選大于50％，最優(yōu)選大于60％，則SBA是令人滿意的。
當然，有異源殺活力的抗原或囊泡制劑也可為有同源殺菌活力的囊泡制劑，如果它可也可引起令人滿意的抗其來源腦膜炎球菌的SBA。
對于有異源殺菌活力的抗原或囊泡制劑，如果(在2-4歲兒童或青少年中，但優(yōu)選在1歲以下嬰兒中)(初種計劃)第三次疫苗劑量后1月，抗三種異源腦膜炎球菌的活力在SBA(抗體稀釋)滴度(與接種前滴度相比)方面上升了四倍的受試者，其占全部受試者的百分比大于20％，優(yōu)選大于30％，更優(yōu)選大于35％，最優(yōu)選大于40％，則SBA是令人滿意的。該試驗是對具有異源殺菌活力的抗原或囊泡制劑能否誘導產生抗各種腦膜炎球菌菌株的交叉殺菌抗體的良好指示。三種異源菌株之間優(yōu)選具有不同電泳型(ET)復合物或多座序列型(multilocus sequence typing)(MLST)圖譜(見Maiden et al.PNAS USA1998，953140-5)，而且優(yōu)選與有異源殺菌的抗原或囊泡制劑的來源菌株也不同。技術人員可輕易決定三種具有不同電泳型復合物的菌株，這些菌株反映了腦膜炎球菌中，特別腦膜炎球菌B型中的遺傳多樣性，它們被認作重大疾病的起因和/或代表公認的MenB高毒力系(見Maiden et al.同上)。例如可使用以下三種菌株屬于A-4簇的BZ10(B:2b:P1.2)；屬于ET-37復合物的B16B6(B:2a:P1.2)；屬于ET-5復合物的H44/76(B:15:P1.7，16)，或任何其它屬于相同ET/簇的菌株。這些菌株可用于測試有異源殺菌活力的抗原或囊泡制劑，該制劑來源于或制自例如屬于ET-5復合物的腦膜炎球菌CU385株(B:4:P1.15)。另一個可使用的實例菌株來源于3系流行病克隆(如NZ124[B:4:P1.7，4])。另一個ET-37株為NGP165(B:2a:P1.2)。
測定SBA活力的方法是本領域已知的。例如可使用的方法在WO99/09176的實施例10C中有介紹。一般來說，培養(yǎng)受試菌株培養(yǎng)物(優(yōu)選在鐵耗竭的情況下-通過向培養(yǎng)基中加入鐵螯合劑如EDDA)于對數(shù)期。細胞可以懸浮于含BSA的培養(yǎng)基(如含0.3％BSA的Hanks培養(yǎng)基)中，調整到約20000CFU/ml，獲得工作細胞懸液?；旌?倍稀釋受試血清(優(yōu)選在56℃下加熱30min失活)[例如50μl/孔的體積]和20000CFU/ml的受試腦膜炎球菌懸液[例如25μl/孔的體積]，制成系列反應混合物。振搖(如在210rpm下)并溫育(如在37℃下15分鐘)反應小瓶。最終反應混合物[如體積為100μl]還包含補體來源[如25％最終體積的預先測定的幼兔血清]，溫育如上述[如37℃下60分鐘]。無菌聚苯乙烯U形底96孔微量滴定板可用于此測定?？捎枚喙芤埔浩鲝拿靠兹〕鲆坏确輀如10μl]，滴于Mueller-Hinton瓊脂平板上(優(yōu)選包含1％的Isovitalex和1％熱失活馬血清)上，溫育(例如5％CO2中37℃下18小時)。優(yōu)選每個平板上最多可數(shù)出80CFU的單個菌落。下述三個試樣可用作對照緩沖液+細菌+補體；緩沖液+細菌+失活補體；血清+細菌+失活補體。SBA滴度可使用程序直接計算，該程序用回歸算法處理數(shù)據，給出對應于殺死50％細胞的稀釋度。
本專利說明書引用的所有文獻或專利申請通過整體引用結合到本文中。
本發(fā)明的工業(yè)應用方法除非詳細另有說明，下面的實施例使用本領域技術人員熟知和常規(guī)的標準技術進行。實施例用于說明而不是限制本發(fā)明。
實施例1構建外膜囊泡制劑中使用的腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B菌株的方法。
WO01/09350提供了制備外膜囊泡和處理外膜囊泡來源細菌菌株的詳細方法。當外膜囊泡需保留脂蛋白如TbpB和/或脂多糖時，優(yōu)選用低濃度脫氧膽酸或不用脫氧膽酸的分離方法。
實施例2缺少cps功能基因但表達PorA的重組腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B菌株中Hsf蛋白抗原的上調。
如WO01/09350實施例中所述，在某些國家，外膜囊泡中PorA的存在是有利的，可增強重組改良囊泡的疫苗效力。在下面實例中，我們采用改造的pCMK(+)載體在缺少cps功能基因但表達PorA的菌株中上調Hsf蛋白抗原的表達。原始pCMK(+)載體包含嵌合porA/lacO啟動子，它在表達laclq的大腸桿菌宿主中被抑制，但在腦膜炎奈瑟氏球菌中有轉錄活性。改造的pCMK(+)中原porA啟動子用于推動hsf基因轉錄。編碼Hsf的基因用下表中的HSF01-NdeI和HSF02-NheI寡核苷酸引物進行PCR擴增。由于HSF01-NdeI引物序列，表達的Hsf蛋白在5′末端含有2個甲硫氨酸。采用供應商所述的PCR擴增條件(HiFi DNA聚合酶，Boehringer Mannheim，GmbH)。熱循環(huán)如下25次(94℃1分鐘，48℃1分鐘，72℃3分鐘)和1次(72℃10分鐘，4℃直到回收)。對應的擴增子隨后克隆到pCMK(+)傳遞載體相應的限制酶切位點中。在該稱為pCMK(+)-Hsf的重組質粒中，我們通過重組擴增方法PCR缺失了嵌合porA/lacO啟動子中的lacO。pCMK(+)-Hsf質粒用作PCR擴增2個單獨DNA片段的模板-片段1包含porA 5′重組區(qū)、卡那霉素抗性基因和porA啟動子。使用的寡核苷酸引物RP1(sacII)和RP2見下表。RP1引物與lac操縱子上游序列同源。
-片段2包含來源于porA基因的Shine-Dalgarno序列、hsf基因和porA 3′重組區(qū)。使用的寡核苷酸引物RP3和RP4(ApaI)見下表。RP3引物與lac操縱子下游序列同源。片段1的3′末端和片段2的5′末端有48個堿基重疊。500ng的各PCR(1和2)用于最終使用RP1和RP4的PCR反應。最終獲得的擴增子亞克隆至SacII和ApaI內切的pSL1180載體中。用QIAGEN maxiprep試劑盒大規(guī)模純化改造的質粒pCMK(+)-Hsf，用2μg該材料轉化缺少cps功能基因的腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B菌株。為了保持porA的表達，通過PCR和蛋白質印跡篩選方法結合選擇一次交換導致的整合。porA特異性PCR和蛋白質印跡確定的卡那霉素抗性試驗陽性克隆儲存于-70℃甘油保藏，用于進一步研究。細菌(對應于約5.108個菌體)重懸于50μlPAGE-SDS緩沖液，冷凍(-20℃)/煮沸(100℃)三次，用12.5％凝膠的PAGE-SDS電泳分離。檢測來源于NmB[Cps-，PorA+]或NmB[Cps-，PorA+，Hsf+]的完整細胞細菌裂解產物(WCBL)中Hsf的表達?？捡R斯染色檢測到Hsf的表達顯著增加(相對于內源Hsf水平)。此結果證實改造的pCMK(+)-Hsf載體是有功能的，可成功用于上調外膜蛋白的表達，而不消除主要PorA外膜蛋白抗原的產生。
本方面工作中使用的寡核苷酸

實施例3通過啟動子置換上調腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B的tbpA基因。
本實驗的目的是用強porA啟動子置換tbpA基因的內源啟動子區(qū)，以上調TbpA抗原的產生。為了該目的，用大腸桿菌克隆方法學構建啟動子置換質粒。在腦膜炎奈瑟氏球菌ATCC 13090的私有IncytePathoSeq數(shù)據庫中發(fā)現(xiàn)了tbpA編碼序列上游DNA區(qū)(731bp)。此DNA包含編碼TbpB抗原的序列。此基因位于一操作子中。缺失tbpB基因并用CmR/porA啟動子盒取代。為了該目的，從腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B的基因組DNA中，PCR擴增對應于tbpB基因5′端509bp側翼區(qū)、2139bp的tbpB編碼序列、87bp的基因間序列和tbpA編碼序列前483個核苷酸的3218bp的DNA片段，使用的寡核苷酸為包含攝取序列以及NheI和HindIII限制酶切位點(下劃線)的BAD16(5′-GGC CTAGCTAGCCGT CTG AAG CGA TTA GAG TTT CAA AATTTA TTC-3′)和BAD17(5′-GGC CAA GCTTCA GAC GGC GTT CGACCG AGT TTG AGC CTT TGC-3′)。用High Pure試劑盒(BoerhingerMannheim，Germany)純化該PCR片段，直接克隆于pGemT載體(Promega，USA)中。該質粒經循環(huán)PCR誘變(Jones &Winistofer(1992))，其作用是(i)插入合適的限制酶切位點以克隆CmR/PorA啟動子盒，以及(ii)缺失tbpB基因5′端209bp的側翼序列和tbpB編碼序列。循環(huán)PCR使用的寡核苷酸為包含合適限制酶切位點XmaI、BglII和XhoI(下劃線)的BAD18(5′-TCCCCCGGGAAGATCTGG ACG AAA AAT CTC AAG AAA CCG-3′)和BAD19(5′-GGAAGATCTCCGCTCGAGCAA ATT TAC AAA AGG AAG CCG ATATGC AAC AGC AAC ATT TGT TCC G-3′)。從前述pUC D15/Omp85質粒擴增CmR/porA啟動子盒，使用包含合適限制酶切位點XmaI、SpeI、BglII和XhoI(下劃線)的引物BAD21(5′-GGAAGATCTCCGCTCGAGACA TCG GGC AAA CAC CCG-3′)和BAD20(5′-TCCCCCGGGAGATCTCACTAGTAT TAC CCT GTT ATC CC-3′)。該PCR片段克隆至循環(huán)PCR質粒中。該質粒用于轉化腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B(cps-)和(cps-porA-)菌株。TbpA上游區(qū)中兩次交換導致的整合引導porA啟動子直接插入tbpA ATG的上游。
實施例4構建TbpA和Hsf兩種抗原表達上調的腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B菌株。
本實驗的目的是在同一腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B菌株中同時上調TbpA和Hsf的表達。TbpA產生是通過將其內源性啟動子區(qū)置換為強porA啟動子(啟動子置換)上調的。在這種情況下，位于tbpA上游的tbpB基因缺失，TbpB蛋白不再存在于外膜中。Hsf的表達通過在porA基因座插入(同源重組)相應基因第二份拷貝(基因送遞)上調。兩個菌株已描述于另一專利WO01/09350中。兩個方法中使用的選擇標記(CMr或Kanr)允許二者整合組合到同一染色體中。
用Qiagen Genomic tip 500-G方案從重組腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B cps-/TbpA+/PorA+菌株中提取完整基因組DNA。10μg的DNA用DraIII限制性內切酶內切，用經典轉化方案轉化腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B。用于轉化的細胞為重組NmB cps-/Hsf+/PorA+(通過1次交換同源重組到porA基因座中)或重組NmB cps-/Hsf+/PorA-(通過2次交換等位交換/同源重組到porA基因座中)。在含有200μg/ml卡那霉素的GC瓊脂平板培養(yǎng)過夜，在含10mM MgCl2的GC液體培養(yǎng)基中稀釋到DO650＝0.1，與10μg經DraIII內切的基因組DNA在37℃下激烈攪拌下共同溫育6小時。在含200μg/ml卡那霉素和5μg/ml氯霉素的GC培養(yǎng)基上篩選兩次交換得到的重組腦膜炎奈瑟氏球菌(PCR篩選)，分析其OMV制劑中TbpA和Hsf的表達。如圖1所示，與制備自對照cps-菌株的OMV相比，制備自TbpA/Hsf重組NmB菌株的OMV中TbpA和Hsf兩者產量顯著增加。在雙重重組株中每種蛋白的過度表達水平可與相應一次重組株中獲得的表達水平相近。TbpA和Hsf的過度表達水平可與PorA+和PorA-菌株中相近(數(shù)據未顯示)。綜上所述，這些數(shù)據表明(i)腦膜炎奈瑟氏球菌中TbpA和Hsf的表達可一起同時上調；以及(ii)可獲得重組富含TbpA和Hsf的囊泡并用于免疫。
外膜囊泡Hsf和TbpA的含量分析考馬斯蘭染色SDS-PAGE15μg具有Hsf或TbpA或Hsf和TbpA兩者均上調外膜囊泡制劑中的蛋白在含有β巰基乙醇的樣品緩沖液稀釋，95℃加熱10分鐘。樣品在聚丙烯酰胺凝膠上進行SDS-PAGE(Novex 4-20％ Tris-甘氨酸1.5mm 2Dwell SDS Page)，在考馬斯蘭中染色1小時，脫色洗滌數(shù)次。結果如圖1所示，它表明來源于Hsf和TbpA蛋白表達水平已增強的外膜囊泡制劑中Hsf和TbpA水平明顯較高。
實施例5Hsf和/或TbpA上調的OMV的免疫原性。
每組20只小鼠用OMV經肌肉內途徑免疫三次，分別在0、21和28天。每次接種5μg(蛋白含量)用AlPO4和MPL配制的OMV。OMV來源于腦膜炎奈瑟氏球菌H44/76株，其經工程改造后莢膜多糖和PorA下調。比較Hsf、TbpA、Hsf和TbpA兩者上調都或兩者都不上調時的OMV。在第41天，取血樣用ELISA或血清殺菌測定分析。
ELISA測定抗Hsf抗體96孔微量滴定板(Nunc，Maxisorb)4℃下用100μl 1μl/mg特異性抗原PBS溶液包被。用150mM NaCl的0.05％Tween 20沖洗后，滴定板用100μl 1％PBS-BSA在室溫下振搖飽和30分鐘。在每個步驟之間(0.2％PBS-BSA作稀釋緩沖液，在室溫下振搖30分鐘)，用NaCl-Tween20沖洗除去過量試劑。每孔中加入100ml血清稀釋樣品。結合抗體被生物素化抗小鼠Ig(Prosan)(1/2000)識別?？乖?抗體復合物用鏈霉抗生物素蛋白-生物素化過氧化物酶結合物(Amersham)(1/4000)顯示。鄰苯二胺/過氧化氫(4mg/10ml 0.1M檸檬酸緩沖液+5μl過氧化氫，pH4.5)用于顯色檢測。滴定板在黑暗中室溫下溫育15分鐘，加入50μl 1N鹽酸停止反應。讀出490nm的吸光度。

上表所示結果表明，用有HSF或Hsf和TbpA兩者均上調的OMV免疫，抗Hsf抗體滴度升高或相等。事實上用佐劑或Hsf和TbpA均未上調的OMV或只有TbpA上調的OMV接種，血清中不能檢測到抗Hsf抗體。
實施例6Hsf和/或TbpA上調OMV的抗血清的血清殺菌活力用Hsf上調、TbpA上調、Hsf和TbpA均上調或均未上調的OMV接種小鼠，用同源H44/76菌株或異源Cu385菌株測定比較小鼠抗血清的血清殺菌活力。血清殺菌測定顯示與保護作用良好的相關性，因此是候選組合物引起的保護性免疫應答效力的良好指示。
腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B野生型(H44/76株＝B:15 P1.7，16L3，7，9，CU385株＝B:4 P1.19，15 L3，7，9)在MR+1％Polyvitex+1％馬血清Petri培養(yǎng)皿上37℃+5％CO2下培養(yǎng)過夜。它們在加入了50μMDesferal(鐵螯合劑)的TSB液體培養(yǎng)基中37℃下振搖傳代培養(yǎng)3小時，470nm下光密度達到約0.5。
56℃加熱40分鐘失活混和血清或單獨的血清。血清樣品在0.3％HBSS-BSA中1/100稀釋，然后在圓底微量滴度板中連續(xù)稀釋兩倍(8個稀釋度)(體積50μl)。
合適OD的細菌用0.3％HBSS-BSA稀釋至每毫升1.3 10e4 CFU。37.5μl的此稀釋物加入至血清稀釋物中，微量滴定板37℃下振搖溫育15分鐘。然后每孔中加入12.5μl兔補體。37℃下振搖溫育1小時后，微量滴定板置于冰上以停止殺菌。
采用傾斜法(tilt method)，每孔取20μl置于MH+1％Polyvitex+1％馬血清Petri培養(yǎng)皿上，37℃+CO2下溫育過夜。計數(shù)CFU，計算殺菌百分比。血清殺菌滴度為產生≥50％殺菌的最終稀釋度。
H44/76 CU385OMV GMT％效應者數(shù)GMT ％效應者數(shù)

在另兩個類似實驗中獲得了與上表所示相似的結果。
用Hsf和TbpA兩者均上調的OMV接種后，可發(fā)現(xiàn)抗同源和異源菌株殺菌滴度(GMT)顯著增加。通過比較，用Hsf或TbpA上調OMV接種的小鼠其殺菌GMT與用對照OMV接種的小鼠其殺菌GMT相似。
雙重上調的益處也在產生顯著水平殺菌抗體(滴度大于1/100)小鼠的百分比中清楚的觀察到，特別在使用異源菌株的實驗中。
實施例7混和抗HSf和抗TbpA血清對殺菌活力的效果每組20只小鼠用OMV經肌肉內途徑免疫三次，分別在0、21和28天。每次接種5μg(蛋白含量)用AlPO4和MPL配制的OMV。OMV來源于腦膜炎奈瑟氏球菌H44/76株，其工程改造后莢膜多糖和PorA下調。一組小鼠用沒有蛋白上調的對照OMV免疫。第二組中Hsf表達上調，第三組中TbpA表達上調，第四組中Hsf和TbpA的表達均上調。
混和同組小鼠的血清或混和來自只有Hsf或TbpA上調組的血清。測定每個混和血清的血清殺菌活力，結果如下表所示。

上表所示的結果表明，混和抗Hsf和抗TbpA抗血清得到的血清殺菌活力比單獨用任何一個抗血清得到的活力高得多。抗Hsf抗體和抗TbpA抗體兩者共同存在可產生協(xié)同效應。
實施例8截短的Hsf蛋白可與TbpA協(xié)同結合采用標準分子生物學方法得到一系列截短的Hsf構成物。它們包括編碼含有Hsf信號序列的1-54位氨基酸的構成物和Hsf(Tr1Hsf)的134-592位氨基酸構成物。第二個截短的Hsf包含Hsf信號序列1-53位氨基酸，其后是Hsf 238-592位氨基酸(Tr2Hsf)。這兩個截短的Hsf構成物和全長Hsf引入腦膜炎奈瑟氏球菌B株MC58 siaD-、Opc-、PorA-中，上調它們的表達并采用上述方法生產外膜囊泡。
外膜囊泡制劑吸附于Al(OH)3上，在0、21和28天注射到小鼠體內。在第42天從小鼠取血并制備血清。將此血清與接種TbpA上調OMV的小鼠的血清混和，按上述方法進行血清殺菌測定。
結果血清殺菌滴度組別 H44/76 CU385

上表結果表明，第一個截短物(Tr1Hsf)引起免疫應答，此應答可與抗TbpA的抗血清結合產生比使用全長Hsf與抗TbpA的抗血清結合更大的血清殺菌活力。但是，截短的程度非常重要，與全長Hsf相比Tr2中的截短作用有不利的影響。Tr1Hsf增強的殺菌活力可抵抗使用的兩種菌株。
實施例9抗TbpA、Hsf和第三種腦膜炎球菌蛋白抗體的血清殺菌活力。
如上述腦膜炎奈瑟氏球菌H66/76株中PorA和莢膜多糖下調，該菌株作為背景菌株，用上述方法上調TbpA和Hsf、LbpB、D15、PilQ或NspA。如上述從每株菌中制備外膜囊泡。用本領域熟知的方法制備重組FhaB、FrpC、FrpA/C和Hap，如PCT/EP99/02766、WO92/01460和WO98/02547中所述。
外膜囊泡制劑和重組蛋白吸附于Al(OH)3上，在0、21和28天注射到小鼠體內。在第42天從小鼠取血并制備血清。抗TbpA和Hsf上調OMV的血清與接種LbpB、D15、PilQ或NspA上調OMV或接種重組FhaB、FrpC、FrpA/C或Hap的小鼠的血清混和，血清殺菌測定按上述方法進行。
結果結果如下表所示。在使用同源H44/76菌株的測定中，加入抗第三種腦膜炎球菌抗原的抗體，除FrpC外，不能產生比單獨使用抗TbpA和Hsf抗體更高的血清殺菌滴度。
但是，在使用異源菌株的血清殺菌測定中，加入抗第三種抗原的抗體是有利的。抗D15(OMP85)、Hap、FrpA/C和LbpB的抗體對增加抗CU385菌株的血清殺菌滴度特別有效。
血清殺菌滴度抗血清混合物 H44/76 CU385

實施例10外膜囊泡中的FrpB敲除對它們在同源和異源菌株引起殺菌免疫應答能力的影響。
兩株H44/76腦膜炎奈瑟氏球菌按WO01/09350中所述用于制備外膜囊泡制劑，用0.1％DOC提取，使LOS含量為約20％。B1733菌株為siaD(-)、PorA(-)，具有上調的Tr1Hsf(實施例8)，lgtB被敲除。B1820 B1733菌株為siaD(-)、PopA(-)，具有上調的Tr1Hsf，lgtB被敲除，F(xiàn)rpB也被敲除。兩株菌在加入了60μM Desferal的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這樣鐵調控蛋白如LbpA/B和TbpA/B被上調。
囊泡制劑吸附于Al(OH)3上，在0和21天肌內注射5μg到每組30只小鼠體內。在第28天取血樣。
對三種L3菌株(同源野生型H44/76株和兩株異源L3；NZ124和M97250687)進行血清殺菌測定，如實施例6中所述。
結果

GMT表示SBA中血清滴度的幾何平均數(shù)。
SC表示血清轉變小鼠(SBA滴度＞1/100)的數(shù)目。
結果清楚的顯示，F(xiàn)rpB敲除(B1820)囊泡比FrpB(+)囊泡(B1733)引起更好的異源交叉殺菌應答。在M97250687和NZ124菌株中，SBA滴度更高，血清轉變小鼠的比例也更高。同源菌株中缺失FrpB的結果不佳。
這些數(shù)據表明FrpB促進免疫應答，但由于此外膜蛋白高度易變，抗此蛋白的抗體只能殺死同源菌株。
權利要求
1.一種免疫原性組合物，所述組合物包含來源于相同或不同革蘭氏陰性菌的分離的運鐵蛋白結合蛋白(Tbp)或其抗原片段和分離的Hsf樣蛋白或其抗原片段。
2.權利要求1的免疫原性組合物，其中運鐵蛋白結合蛋白或其片段和Hsf樣蛋白或其片段來源于奈瑟氏球菌(Neisseria)。
3.權利要求1-2任一項的免疫原性組合物，其中運鐵蛋白結合蛋白或其片段來源于腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)。
4.權利要求1-3任一項的免疫原性組合物，其中Hsf樣蛋白或其片段來源于腦膜炎奈瑟氏球菌。
5.權利要求1-4任一項的免疫原性組合物，其中運鐵蛋白結合蛋白或其片段來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B。
6.權利要求1-5任一項的免疫原性組合物，其中Hsf樣蛋白或其片段來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B。
7.權利要求1-6任一項的免疫原性組合物，其中運鐵蛋白結合蛋白或其片段來源于淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)。
8.權利要求1-7任一項的免疫原性組合物，其中Hsf樣蛋白或其抗原片段來源于淋病奈瑟氏球菌。
9.權利要求1-8任一項的免疫原性組合物，其中運鐵蛋白結合蛋白或其抗原片段來源于粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)。
10.權利要求1-9任一項的免疫原性組合物，其中Hsf樣蛋白或其抗原片段來源于粘膜炎莫拉氏菌。
11.權利要求1-10任一項的免疫原性組合物，其中運鐵蛋白結合蛋白或其抗原片段來源于流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)。
12.權利要求1-11任一項的免疫原性組合物，其中Hsf樣蛋白或其抗原片段來源于流感嗜血桿菌。
13.權利要求1-12任一項的免疫原性組合物，其中運鐵蛋白結合蛋白為TbpA或其抗原片段。
14.權利要求13的免疫原性組合物，所述組合物含有高分子量型TbpA或低分子量型TbpA、或者高分子量型TbpA和低分子量型TbpA兩者都含有。
15.權利要求1-14任一項的免疫原性組合物，其中Hsf樣蛋白為Hsf或其抗原片段。
16.權利要求1-15任一項的免疫原性組合物，所述組合物含有Tbp和/或Hsf樣蛋白的抗原片段，所述抗原片段能產生抗奈瑟氏球菌、粘膜炎莫拉氏菌或流感嗜血桿菌感染的保護性反應。
17.權利要求16的免疫原性組合物，所述組合物含有TbpA和/或Hsf的抗原片段。
18.權利要求1-17任一項的免疫原性組合物，所述組合物含有Tbp與Hsf樣蛋白或它們的抗原片段的融合蛋白。
19.權利要求18的免疫原性組合物，所述組合物含有TbpA與Hsf樣蛋白或它們的抗原片段的融合蛋白，所述抗原片段能產生抗奈瑟氏球菌屬感染的保護性反應。
20.一種分離的免疫原性組合物，所述組合物包含來源于革蘭氏陰性菌的外膜囊泡制劑，其中運鐵蛋白結合蛋白和Hsf樣蛋白兩者的表達至少比未改造革蘭氏陰性菌天然表達高1.5倍。
21.權利要求20的免疫原性組合物，其中運鐵蛋白結合蛋白的表達由于在限鐵條件下生長而上調。
22.權利要求20-21任一項的免疫原性組合物，其中至少一部分外膜囊泡制劑來源于奈瑟氏球菌。
23.權利要求20-22任一項的免疫原性組合物，其中至少一部分外膜囊泡制劑來源于腦膜炎奈瑟氏球菌。
24.權利要求20-23任一項的免疫原性組合物，其中至少一部分外膜囊泡制劑來源于腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B。
25.權利要求20-22任一項的免疫原性組合物，其中至少一部分外膜囊泡制劑來源于淋病奈瑟氏球菌。
26.權利要求20-25任一項的免疫原性組合物，其中外膜囊泡制劑來源的宿主細胞被工程改造，從而下調LgtB和LgtE中一個或多個基因的表達，優(yōu)選為前者。
27.權利要求20-26任一項的免疫原性組合物，其中外膜囊泡制劑來源的宿主細胞不能合成莢膜多糖，并且優(yōu)選被工程改造，從而下調表達而且優(yōu)選缺失一個或多個以下基因siaD、ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA(同synX和siaA)，synB(同siaB)和synC(同siaC)，最優(yōu)選為siaD。
28.權利要求20-27任一項的免疫原性組合物，其中外膜囊泡制劑來源的宿主細胞已經被工程改造，從而下調表達而且優(yōu)選缺失OpC、OpA和PorA中一個或多個基因，優(yōu)選為PorA。
29.權利要求20-28任一項的免疫原性組合物，其中外膜囊泡制劑來源的宿主細胞已經被工程改造，從而下調FrpB的表達，優(yōu)選缺失此基因。
30.權利要求20-29任一項的免疫原性組合物，其中外膜囊泡制劑來源的宿主細胞已經被工程改造，從而下調表達并且優(yōu)選缺失msbB和/或HtrB，優(yōu)選為msbB。
31.權利要求20-30任一項的免疫原性組合物，其中外膜囊泡制劑含有與外膜蛋白(OMP)結合的LPS。
32.權利要求31的免疫原性組合物，其中LPS在外膜囊泡制劑中與OMP原位結合(優(yōu)選囊泡內)。
33.權利要求20-32任一項的免疫原性組合物，其中至少一部分外膜囊泡制劑來源于粘膜炎莫拉氏菌。
34.權利要求20-33任一項的免疫原性組合物，其中至少一部分外膜囊泡制劑來源于流感嗜血桿菌。
35.權利要求20-34任一項的免疫原性組合物，所述組合物包含從兩株或更多株革蘭氏陰性菌分離出的外膜囊泡制劑。
36.權利要求35的免疫原性組合物，其中運鐵蛋白結合蛋白和Hsf樣蛋白在來源于不同菌株的不同囊泡或來源于同一菌株的相同囊泡中被上調。
37.權利要求20-36任一項的免疫原性制劑，所述制劑包含的外膜囊泡制劑中增強的運鐵蛋白結合蛋白表達來源于引入革蘭氏陰性菌的多核苷酸。
38.權利要求20-37任一項的免疫原性組合物，所述制劑包含的外膜囊泡制劑中增強的Hsf樣蛋白表達來源于引入革蘭氏陰性菌的多核苷酸。
39.權利要求20-38任一項的免疫原性組合物，所述制劑包含的外膜囊泡制劑中增強的運鐵蛋白結合蛋白和Hsf樣蛋白表達來源于引入革蘭氏陰性菌的編碼兩種蛋白的多核苷酸。
40.權利要求20-39任一項的免疫原性組合物，其中菌株已經遺傳工程改造，在編碼運鐵蛋白結合蛋白的基因上游導入了更強的啟動子序列。
41.權利要求20-40任一項的免疫原性組合物，其中菌株已經遺傳工程改造，在編碼Hsf樣蛋白的基因上游導入了更強的啟動子序列。
42.權利要求20-41任一項的免疫原性組合物，其中菌株已經遺傳工程改造，在編碼運鐵蛋白結合蛋白和Hsf樣蛋白的基因上游導入了更強的啟動子序列。
43.權利要求20-42任一項的免疫原性組合物，其中運鐵蛋白結合蛋白為TbpA，優(yōu)選為高分子量TbpA、低分子量TbpA或高分子量TbpA和低分子量TbpA兩者，而且最優(yōu)選來自腦膜炎奈瑟氏球菌。
44.權利要求20-43任一項的免疫原性組合物，其中Hsf樣蛋白為來自腦膜炎奈瑟氏球菌的Hsf。
45.權利要求1-44任一項的免疫原性組合物，所述組合物還含有單純型或結合型細菌莢膜多糖或寡糖。
46.權利要求1-45任一項的免疫原性組合物，所述組合物含有兩種或更多種細菌莢膜多糖或寡糖，所述多糖或寡糖與運鐵蛋白結合蛋白或Hsf樣蛋白結合或與兩者同時結合。
47.權利要求45-46任一項的免疫原性組合物，其中莢膜多糖或寡糖來源于以下一種或多種細菌腦膜炎奈瑟氏球菌血清群A、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群C、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群Y、腦膜炎奈瑟氏球菌血清群W-135、流感嗜血桿菌b、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、A群鏈球菌、B群鏈球菌、金色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
48.一種免疫原性組合物，所述組合物包含一種或多種編碼運鐵蛋白結合蛋白或其抗原片段和Hsf樣蛋白或其抗原片段的多核苷酸，所述蛋白或其片段的表達由真核啟動子推動。
49.權利要求48的免疫原性組合物，其中編碼了奈瑟氏球菌的TbpA和Hsf。
50.權利要求48-49任一項的免疫原性組合物，其中編碼了腦膜炎奈瑟氏球菌的TbpA和Hsf。
51.權利要求1-50任一項的免疫原性組合物，所述組合物含有佐劑。
52.權利要求51的免疫原性組合物，所述組合物含有鋁鹽。
53.權利要求51-52任一項的免疫原性組合物，所述組合物含有3D-MPL。
54.權利要求51的免疫原性組合物，所述組合物包含含CpG的佐劑。
55.一種包含權利要求1-54任一項的免疫原性組合物和藥學可接受的賦形劑的疫苗。
56.一種用于治療或預防革蘭氏陰性菌疾病的方法，所述方法包括給予保護劑量或有效劑量的權利要求55的疫苗。
57.權利要求56的方法，其中預防或治療奈瑟氏球菌感染。
58.權利要求55的疫苗在制備治療或預防革蘭氏陰性菌感染的藥物中的用途。
59.權利要求58的用途，其為在制備治療或預防奈瑟氏球菌感染的藥物中的用途。
60.一種經遺傳工程改造的革蘭氏陰性菌株，所述菌株是權利要求20-44任一項的免疫原性組合物中外膜囊泡的來源。
61.一種制備權利要求1-17任一項的免疫原性組合物的方法，所述方法包括將分離的運鐵蛋白結合蛋白與分離的Hsf樣蛋白或它們的抗原片段混合的步驟。
62.一種制備權利要求20-44任一項的免疫原性組合物的方法，所述方法包括從革蘭氏陰性菌培養(yǎng)物中分離外膜囊泡的步驟。
63.權利要求62的方法，其中分離外膜囊泡的步驟包括用0-0.5％、0.02-0.4％、0.04-0.3％、0.06-0.2％、0.08-0.15％或優(yōu)選0.1％濃度的去污劑提取，去污劑優(yōu)選為DOC。
64.一種制備權利要求47免疫原性組合物的方法，所述方法包括將細菌莢膜多糖或寡糖與運鐵蛋白結合蛋白和/或Hsf樣蛋白結合的步驟。
65.一種制備權利要求55疫苗的方法，所述方法包括將權利要求1-54的免疫原性組合物與藥學可接受的賦形劑結合的步驟。
66.一種制備用于預防或治療奈瑟氏球菌感染的免疫球蛋白的方法，所述方法包括用權利要求55的疫苗免疫接受者，并從接受者分離免疫球蛋白的步驟。
67.一種用權利要求66的方法獲得的免疫球蛋白制劑。
68.一種藥用制劑，其包含權利要求67的免疫球蛋白制劑和藥學可接受的賦形劑。
69.一種藥用制劑，其包含抗腦膜炎奈瑟氏球菌TbpA和Hsf的單克隆抗體以及藥學可接受的賦形劑。
70.一種治療或預防革蘭氏陰性菌感染的方法，所述方法包括給予患者有效劑量的權利要求68-69任一項的藥用制劑的步驟。
71.權利要求68-69任一項的藥用制劑在制造治療或預防革蘭氏陰性菌疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預防和治療革蘭氏陰性菌感染的免疫原性組合物和疫苗。本發(fā)明免疫原性組合物包含運鐵蛋白結合蛋白和Hsf，這兩種抗原的組合顯示為協(xié)同性作用，產生高血清殺菌測定活性的抗體。這種抗原組合可用于抗腦膜炎奈瑟氏球菌(Neissaria meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)和流感嗜血菌(Haemophilus infulenzae)的疫苗。
文檔編號C07K14/195GK1671413SQ03818454
公開日2005年9月21日 申請日期2003年7月31日 優(yōu)先權日2002年8月2日
發(fā)明者F·－X·J·貝爾特特, R·比曼斯, P·德諾埃爾, C·費倫, C·戈拉, J·普爾曼, V·魏南茨 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司