專利名稱：抗髓鞘相關(guān)糖蛋白(mag)抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)結(jié)合并中和其功能的修飾抗體、編碼該抗體的多核苷酸、含有所述抗體的藥物制劑以及所述抗體在神經(jīng)疾病的治療和/或預(yù)防中的用途。本發(fā)明的其它方面、目的及優(yōu)勢(shì)將在以下描述中闡明。
背景技術(shù)：
在西方世界，中風(fēng)是導(dǎo)致死亡和殘疾的一個(gè)主要原因。除組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)外，還沒有獲得批準(zhǔn)的中風(fēng)治療的療法，t-PA必須在發(fā)病的3小時(shí)內(nèi)經(jīng)CT掃描后給藥以防止大出血。目前針對(duì)急性中風(fēng)治療(即神經(jīng)保護(hù))的大多數(shù)治療藥物主要作用于谷氨酸受體及其下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑，已知這些途徑參與急性細(xì)胞死亡過程。然而迄今為止，這些治療策略在臨床試驗(yàn)中證明并不成功，而且常常伴隨著劑量限制性副作用(Hill&Hachinski，The Lancet，352(suppl III)10-14(1998))。因此需要血流中斷后緩解細(xì)胞死亡的新方法。
中風(fēng)發(fā)作后，在許多病人中觀察到某種程度自發(fā)的功能恢復(fù)，這表明腦在損傷后具有修復(fù)和/或重建的能力(雖然有限)。因此，具有增強(qiáng)此種修復(fù)的潛力的藥物可使在大腦局部缺血發(fā)作后介入治療的時(shí)間大為推遲(可能幾天)。能同時(shí)提供急性神經(jīng)保護(hù)以及促進(jìn)功能恢復(fù)作用的藥物與現(xiàn)行有潛力的神經(jīng)保護(hù)策略相比，具有顯著的優(yōu)勢(shì)。
迄今，人們對(duì)功能恢復(fù)的機(jī)制依然不甚了解。已經(jīng)提出的一種可能的機(jī)制是損傷或非損傷軸突的發(fā)芽。然而，雖然體內(nèi)試驗(yàn)顯示使用神經(jīng)營養(yǎng)性因子來治療脊髓損傷或中風(fēng)可導(dǎo)致功能恢復(fù)的加快以及一定程度的軸突發(fā)芽，但是這不能證明軸突發(fā)芽的程度與功能恢復(fù)的程度之間存在直接的關(guān)系(Jakeman，et al.1998，Exp.Neurol.154170-184；Kawamata et al.1997，Proc Natl Acad.Sci.USA.，948179-8184；Ribotta，et al.2000，J Neurosci.205144-5152)。此外，軸突發(fā)芽需要活的神經(jīng)元。因此，在諸如中風(fēng)等與大面積細(xì)胞死亡相關(guān)的疾病中，中風(fēng)后給予的藥物所產(chǎn)生的功能恢復(fù)的加快可能是通過軸突發(fā)芽之外的機(jī)制，如內(nèi)源性干細(xì)胞的分化、備用途徑的激活、受體分布或神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)的興奮性的改變(Fawcett&Asher，1999，Brain Res.Bulletin，49377-391；Horner&Gage，2000，Nature407 963-970)。
人們認(rèn)為損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的修復(fù)能力有限的部分原因是CNS環(huán)境中的分子對(duì)軸突發(fā)芽(軸突生長)具有抑制作用。一般認(rèn)為CNS髓鞘質(zhì)中含有抑制性分子(Schwab ME and Caroni P(1988)J.Neurosci.8，2381-2193)。兩種髓鞘蛋白質(zhì)——髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)和Nogo已被克隆并鑒定為公認(rèn)的神經(jīng)突派生抑制劑(Sato S.etal(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.163，1473-1480；MckerracherL et al(1994)Neuron 13，805-811；Mukhopadhyay G et al(1994)Neuron 13，757-767；Torigoe K and Lundborg G(1997)Exp.Neurology 150，254-262；Schafer et al(1996)Neuron 16，1107-1113；WO 9522344；W0 9701352；Prinjha R et al(2000)Nature403，383-384；Chen MS et al(2000)Nature 403，434-439；GrandPreT et al(2000)Nature 403，439-444；US005250414A；WO200005364A1；WO0031235)。
髓鞘相關(guān)糖蛋白是一種表達(dá)于髓鞘表面的細(xì)胞表面跨膜分子，它由五個(gè)胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、一個(gè)單一的跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。MAG的表達(dá)僅局限于CNS和外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中處于髓鞘形成過程的神經(jīng)膠質(zhì)中。通常認(rèn)為MAG作用于神經(jīng)元受體，該受體介導(dǎo)針對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞骨架的作用，包括神經(jīng)絲的磷酸化作用和體外神經(jīng)突派生抑制作用。雖然MAG的拮抗物被推定對(duì)損傷后軸突發(fā)芽有促進(jìn)作用(WO9522344，WO9701352和WO9707810)，但是這些權(quán)利要求并未得到體內(nèi)數(shù)據(jù)的支持。此外，MAG對(duì)體內(nèi)CNS神經(jīng)元軸突發(fā)芽的抑制作用也未得到證實(shí)(Li CM et al(1994)Nature 369，747-750；Montag，D et al(1994)Neuron 13，229-246；Lassmann H et al(1997)GLIA 19，104-110；Li C et al(1998)J.Neuro.Res.51，210-217；Yin X et al(1998)J.Neurosci.18，1953-1962；Bartsch U et al(1995)Neuron 15 1375-1381；Li M et al(1996)46，404-414)。
抗體一般由兩條輕鏈和以二硫鍵連接在一起的兩條重鏈組成。每條輕鏈以二硫鍵與相應(yīng)的重鏈相連。每條重鏈的一端為一個(gè)可變區(qū)，緊隨其后的是若干恒定區(qū)。每條輕鏈在一端有一個(gè)可變區(qū)，而在另一端有一個(gè)恒定區(qū)。輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)排列在一起。輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個(gè)恒定區(qū)排列在一起。輕鏈和重鏈的恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合。
每對(duì)輕鏈和重鏈的可變區(qū)形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。輕鏈和重鏈上的可變區(qū)大體結(jié)構(gòu)相同，每個(gè)區(qū)域含有由四個(gè)序列相對(duì)保守的區(qū)域組成的骨架，這四個(gè)區(qū)域由三個(gè)通常被稱作高變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)將他們連接。這四個(gè)骨架區(qū)大部分采取β-片層構(gòu)象，而CDR形成環(huán)狀連接β-片層結(jié)構(gòu)，在某些情況下構(gòu)成β-片層結(jié)構(gòu)組成部分。骨架區(qū)CDR緊密相鄰，CDR一起構(gòu)成抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w的CDR和骨架區(qū)可根按照Kabat等的文獻(xiàn)(“Sequences of proteins of immunologicalinterest”US Dept.of Health and Human Services，US GovernmentPrinting Office，1987)來鑒定。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一種抗MAG單克隆抗體，參見文獻(xiàn)(Poltorak etal(1987)Journal of Cell Biology 105，1893-1899；DeBellard et al(1996)Mol.Cell.Neurosci.7，89-101；Tang et al(1997)Mol.Cell.Neurosci.9，333-346；Torigoe K and Lundborg G(1997)Exp.Neurology 150，254-262)并可獲得商品(MAB1567(Chemicon))，當(dāng)對(duì)局灶性大腦局部缺血后小鼠(一個(gè)中風(fēng)模型)直接腦部給藥或者靜脈給藥時(shí)，可提供神經(jīng)保護(hù)以及促進(jìn)功能恢復(fù)。因此，抗MAG抗體可提供用于中風(fēng)后急性神經(jīng)保護(hù)以及促進(jìn)功能恢復(fù)的潛在治療藥物。該抗體為小鼠源抗體。雖然小鼠源抗體常常用作診斷試劑，它們的治療效用僅在極少實(shí)例中得到證實(shí)。其應(yīng)用受限的部分原因是重復(fù)對(duì)人給予鼠源單克隆抗體通常會(huì)激發(fā)人類對(duì)這些分子的免疫反應(yīng)。為克服鼠源單克隆抗體本質(zhì)的缺陷，已經(jīng)開發(fā)出了目標(biāo)為引入人類抗體結(jié)構(gòu)功能域的“修飾的”抗體，這一技術(shù)在本技術(shù)領(lǐng)域已很成熟。例如，人源化抗體含非人類來源的互補(bǔ)決定區(qū)(“CDR”)，而其余的大部分結(jié)構(gòu)來源于人類抗體。
神經(jīng)退變過程是引起許多神經(jīng)疾病/紊亂包括如中風(fēng)、外傷性腦損傷和脊髓損傷的急性疾病以及包括阿耳茨海默氏病、額顳性癡呆(tauopathies)、周圍神經(jīng)病、帕金森氏病、杭廷頓氏舞蹈病和多發(fā)性硬化的慢性疾病的原因。因此，抗MAG單抗可通過緩解這些疾病/紊亂相關(guān)的細(xì)胞死亡以及促進(jìn)功能恢復(fù)，用于這些疾病/紊亂的治療。
本發(fā)明說明書中公開的所有出版物包括期刊和專利，通過引用整體結(jié)合到本文中。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供一種結(jié)合并中和MAG的修飾抗體或其功能片段，該抗體含有一個(gè)或多個(gè)下述CDR。CDR可根按照Kabat描述的方法進(jìn)行鑒定(Kabat et al.(1991)Sequences of proteins of immunologicalinterest；Fifth Edition；US Department of Health and Human Services；NIH publication No 91-3242)。CDR優(yōu)選為Kabat所闡述的CDR，但應(yīng)遵循Chothia和Lesk所述蛋白結(jié)構(gòu)和折疊的原則(Chothia et al.，(1989)Conformations of immunoglobulin hypervariable regions；Nature342，p877-883)。應(yīng)該知道，其它殘基也可被看作為抗原結(jié)合區(qū)的組成部分，因而也包含在本發(fā)明中。
輕鏈CDR
重鏈CDR
本發(fā)明還涉及一種與具有上述CDR的抗體結(jié)合相同表位的抗體?？捎酶偁幰种品▉韺?duì)抗原上的表位進(jìn)行定位。因此，本發(fā)明也提供一種競爭性抑制具有上述CDR的修飾抗體與MAG(優(yōu)選為人MAG)結(jié)合的抗體(修飾型或非修飾型)。
再一方面，本發(fā)明提供一種修飾抗體或其功能片段，該修飾抗體或其功能片段含有含有一個(gè)或多個(gè)選自CDRH1、CDRH2和CDRH3的CDR的重鏈可變區(qū)和/或含有一個(gè)或多個(gè)選自CDRL1、CDRL2和CDRL3的CDR的輕鏈可變區(qū)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種修飾的抗MAG抗體或其功能片段，它含有a)其序列中含有CDRH1、CDRH2和CDRH3的重鏈可變區(qū)(VH)，
和/或b)序列中含有CDRL1、CDRL2和CDRL3的輕鏈可變區(qū)(VL)進(jìn)一方面，本發(fā)明提供一種藥用組合物，該藥用組合物含有本發(fā)明修飾抗MAG抗體或其功能片段以及藥學(xué)上可接受的釋釋劑或載體。
另一方面，本發(fā)明提供一種人類中風(fēng)和其它神經(jīng)疾病的治療或預(yù)防方法，該方法包括給予所述需要病人有效劑量的本發(fā)明抗MAG抗體或其功能片段。
又一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明抗MAG抗體或其功能片段在制備中風(fēng)和其它神經(jīng)疾病的治療或預(yù)防藥物中的應(yīng)用。
再一方面，本發(fā)明提供一種在罹患中風(fēng)或其它神經(jīng)疾病或有發(fā)生這些疾病風(fēng)險(xiǎn)的病人中抑制神經(jīng)退變和/或促進(jìn)功能恢復(fù)的方法，該方法包括給予所述需要病人有效劑量的本發(fā)明抗MAG抗體或其功能片段。
進(jìn)一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的抗MAG抗體或其功能片段在制備用于對(duì)罹患中風(fēng)或其它神經(jīng)疾病或有發(fā)生該疾病風(fēng)險(xiǎn)的病人抑制神經(jīng)退變和/或促進(jìn)功能恢復(fù)的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明其它方面及優(yōu)勢(shì)將在詳細(xì)說明及其優(yōu)選實(shí)施方案中作進(jìn)一步的描述。
附圖簡述

圖1一種小鼠/人嵌合抗MAG抗體的重鏈序列(Seq ID No.27)。
圖2一種小鼠/人嵌合抗MAG抗體的輕鏈序列(Seq ID No.28)。
圖3一種小鼠/人嵌合抗MAG抗體的重鏈序列(Seq ID No.29)。
圖4嵌合抗MAG抗體與大鼠MAG結(jié)合圖5人源化抗MAG抗體序列圖6與大鼠MAG結(jié)合的人源化抗MAG抗體圖7與大鼠MAG結(jié)合的人源化抗MAG抗體圖8與人MAG結(jié)合的人源化抗MAG抗體圖9小鼠和人源化抗MAG抗體的競爭ELISA。
發(fā)明詳述抗MAG抗體本發(fā)明的修飾抗體優(yōu)選為單克隆抗體(mAb)，并優(yōu)選為嵌合的、人源化的或改造的抗體，其中特別優(yōu)選為人源化抗體。
修飾抗體優(yōu)選具有天然抗體或其片段的結(jié)構(gòu)。因此該抗體可包括完整的抗體、(Fab1)2片段、Fab片段、輕鏈二聚體或重鏈二聚體。抗體可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或IgM；或IgA、IgE或IgD或其修飾的變體?？贵w重鏈的恒定區(qū)可以根據(jù)需要進(jìn)行選擇。輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ恒定區(qū)。此外，抗體可包括所有類型如IgG二聚體的改良型、不再與Fc受體結(jié)合或介導(dǎo)Clq結(jié)合的Fc突變體(封閉抗體)?？贵w也可以是WO 86/01533所述類型的嵌合抗體，該抗體含有抗原結(jié)合區(qū)和非免疫球蛋白區(qū)。該抗原結(jié)合區(qū)是抗體輕鏈可變區(qū)或重鏈可變區(qū)。典型的抗原結(jié)合區(qū)同時(shí)含有輕鏈和重鏈可變區(qū)。所述非免疫球蛋白區(qū)在C端與抗原結(jié)合區(qū)融合。典型的非免疫球蛋白區(qū)為非免疫球蛋白，并可為酶、毒素或是已知具有結(jié)合特異性的蛋白質(zhì)。該種類型嵌合抗體的兩個(gè)區(qū)域也可以通過一個(gè)可切割接頭序列連接起來。具有上文所述CDRS的免疫粘附素也在本發(fā)明的考慮之列。
恒定區(qū)可以根據(jù)所需要的功能進(jìn)行選擇。通常IgG1通過與補(bǔ)體結(jié)合表現(xiàn)出裂解能力和/或介導(dǎo)ADCC(抗體依賴的細(xì)胞毒性)。如果需要無細(xì)胞毒性的封閉抗體，那么優(yōu)選IgG4。然而，IgG4抗體在生產(chǎn)中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，所以對(duì)通常更為穩(wěn)定的IgG1進(jìn)行改造也許更優(yōu)選。建議的改造在EPO307434中有描述，其中優(yōu)選改造包括在235和237位的改造。因此本發(fā)明提供本發(fā)明抗體的裂解或非裂解型形式。
在一優(yōu)選方面，該修飾抗體為IgG型，更優(yōu)選為IgG1。
因此，在優(yōu)選方案中，本發(fā)明的抗體為具有上述CDR的全長非裂解性IgG1。在最優(yōu)選方案中，我們提供具有序列SEQ ID No 13和16的CDR的全長非裂解性IgG1以及具有序列SEQ ID No 15和18的CDR的全長非裂解性IgG1。
再一方面，本發(fā)明提供編碼CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的多核苷酸。優(yōu)選多核苷酸序列為輕鏈CDR
重鏈CDR
再一方面，本發(fā)明提供編碼修飾抗MGA抗體的輕鏈可變區(qū)的多核苷酸，所述抗體序列包含至少一個(gè)選自CDRL1、CDRL2和CDRL3的CDR(優(yōu)選含全部3個(gè)CDR)。
又一方面，本發(fā)明提供編碼修飾抗MGA抗體的重鏈可變區(qū)的多核苷酸，所述抗體序列包含至少一個(gè)選自CDRH1、CDRH2和CDRH3的CDR(優(yōu)選包含全部3個(gè)CDR)。
在一個(gè)特別優(yōu)選方面，本發(fā)明的抗MAG抗體為人源化抗體。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種結(jié)合并中和MAG的人源化抗體或其功能片段，它含有含一種下列氨基酸序列的重鏈可變區(qū)QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID No 13)。
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSS(Sequence ID No 14)QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYFCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSS(sequence ID No 15)另一方面，本發(fā)明提供一種結(jié)合MAG的人源化抗體或其功能片段，它含有序列Sequence ID No 13、14或15的重鏈可變區(qū)以及含有氨基酸序列Sequence ID No 16、17、18或19的輕鏈可變區(qū)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV(SEQ ID No 16)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIINLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV(SEQ ID No 17)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLHTEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV(SEQ ID No 18)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTHESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIINLHTEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV(SEQ ID No 19)進(jìn)一方面，本發(fā)明提供人源化抗體，它含有包含序列SEQ ID No 13、14或15的重鏈可變區(qū)片段以及人類重鏈恒定區(qū)部分或其片段和包含序列SEQ ID No 16、17、18或19的輕鏈可變區(qū)片段以及人類輕鏈恒定區(qū)部分或其片段。
在一個(gè)優(yōu)選方面，人源化抗體為IgG型，更優(yōu)選為IgG1。
本發(fā)明的優(yōu)選抗體含有含有序列SEQ ID No 13的重鏈可變區(qū)以及含有序列SEQ ID No16的輕鏈可變區(qū)；含有序列SEQ ID No 13的重鏈可變區(qū)以及含有序列SEQ ID No17的輕鏈可變區(qū)；含有序列SEQ ID No 13的重鏈可變區(qū)以及含有序列SEQ ID No18的輕鏈可變區(qū)；含有序列SEQ ID No 13的重鏈可變區(qū)以及含有序列SEQ ID No19的輕鏈可變區(qū)；含有序列SEQ ID No 14的重鏈可變區(qū)以及含有序列SEQ ID No16的輕鏈可變區(qū)；含有序列SEQ ID No 14的重鏈可變區(qū)以及含有序列SEQ ID No17的輕鏈可變區(qū)；含有序列SEQ ID No 14的重鏈可變區(qū)以及含有序列SEQ ID No18的輕鏈可變區(qū)；含有序列SEQ ID No 14的重鏈可變區(qū)以及含有序列SEQ ID No19的輕鏈可變區(qū)；含有序列SEQ ID No 15的重鏈可變區(qū)以及含有序列SEQ ID No16的輕鏈可變區(qū)；含有序列SEQ ID No 15的重鏈可變區(qū)以及含有序列SEQ ID No17的輕鏈可變區(qū)；含有序列SEQ ID No 15的重鏈可變區(qū)以及含有序列SEQ ID No18的輕鏈可變區(qū)；含有序列SEQ ID No 15的重鏈可變區(qū)以及含有序列SEQ ID No19的輕鏈可變區(qū)。
另一個(gè)方面，本發(fā)明提供編碼含有序列Sequence IDs No 13、14和15的重鏈可變區(qū)以及含有序列Sequence ID No.16、17、18和19的輕鏈可變區(qū)的多核苷酸。
編碼氨基酸序列SEQ ID No 13的優(yōu)選多核苷酸序列為CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID No 20)
編碼氨基酸序列Sequence ID No 14的優(yōu)選多核苷酸序列為CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTTCTGTGCGAGAAACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID No 21)編碼氨基酸序列Sequence ID No 15的優(yōu)選多核苷酸序列為CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCACCTATTTCTGTGCGAGAAACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID No 22)編碼氨基酸序列Sequence ID No 16的優(yōu)選多核苷酸序列為GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG(SEQ ID No23)編碼序列SEQ ID No 17的優(yōu)選多核苷酸序列為GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCATCAACCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG(SEQ ID No24)
編碼序列SEQ ID No 18的優(yōu)選多核苷酸序列為GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCACACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG(SEQ ID No25)編碼序列SEQ ID No 19的優(yōu)選多核苷酸序列為GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCATCAACCTGCACACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG(SEQ ID No26)“中和”指全部或部分抑制MAG功能，包括其與神經(jīng)元的結(jié)合，以及抑制軸突生長。
“修飾抗體”指由修飾的免疫球蛋白編碼區(qū)編碼的蛋白質(zhì)，它可通過在所選宿主細(xì)胞中表達(dá)而獲得。這些修飾抗體包括基因工程抗體(如嵌合抗體、重構(gòu)抗體、人源化抗體或載體抗體)或缺失全部或部分免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體片段如Fv、Fab或F(ab)2等。
“修飾的免疫球蛋白編碼區(qū)”指編碼修飾抗體的核酸序列。當(dāng)修飾抗體為CDR移植抗體或人源化抗體時(shí)，編碼非人類免疫球蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的序列被插入到含有人類可變區(qū)骨架序列的第一免疫球蛋白配偶體中。第一免疫球蛋白配偶體可選擇性地與第二免疫球蛋白配偶體有效地連接在一起。
“第一免疫球蛋白配偶體”指編碼人類抗體骨架區(qū)或人類免疫球蛋白可變區(qū)的核酸序列，其中天然CDR編碼區(qū)被供體抗體CDR編碼區(qū)所取代。人類可變區(qū)可以是免疫球蛋白重鏈、輕鏈(或兩種鏈)、類似物或其功能片段。這些位于抗體(免疫球蛋白)可變區(qū)內(nèi)的CDR區(qū)域可通過本技術(shù)領(lǐng)域的已知方法進(jìn)行鑒定。例如，Kabat等(Sequences of Proteins of Immunological Interest，4th Ed.，U.S.Department of Health and Human Services，National Institutes of Health(1987))公開了CDR定位原則。此外，已知計(jì)算機(jī)程序?qū)﹁b別CDR區(qū)域/結(jié)構(gòu)也很有幫助。
“第二免疫球蛋白配偶體”指編碼另一種蛋白質(zhì)或多肽的核苷酸序列，它與第一免疫球蛋白配偶體按閱讀框融合或通過任選通用接頭序列連接在一起(即有效連接)。優(yōu)選為免疫球蛋白基因。第二免疫球蛋白配偶體可包含編碼相同(即同源，第一和第二修飾抗體均來源相同)或其它(即異源)的目的抗體整個(gè)恒定區(qū)的核酸序列。它可以是免疫球蛋白的重鏈或輕鏈(或兩條鏈，同為一條多肽的組成部分)。第二免疫球蛋白配偶體不限于某一特定的免疫球蛋白類型或同種型。此外，第二免疫球蛋白配偶體可含有免疫球蛋白恒定區(qū)部分，如在Fab或F(ab)2中發(fā)現(xiàn)的那些(即適當(dāng)?shù)娜祟惡愣▍^(qū)或骨架區(qū)的不連續(xù)部分)。第二免疫球蛋白配偶體還可含有編碼暴露在宿主細(xì)胞外表面的整合膜蛋白的序列，如噬菌體展示文庫組成部分或編碼用于分析或診斷檢測的蛋白質(zhì)如辣根過氧物酶、β-半乳糖苷酶等的序列。
術(shù)語Fv、Fc、Fd、Fab或F(ab)2使用其標(biāo)準(zhǔn)含義(參見如Harlow等，Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，(1988))。
本說明書中所用的“基因工程抗體”描述一種修飾抗體，即全長合成的抗體(如嵌合抗體、重構(gòu)抗體或人源化抗體，與抗體片段含義相反)，其中所選受體抗體的部分輕鏈和/或重鏈可變區(qū)被對(duì)所選表位具有特異性的一個(gè)或多個(gè)供體抗體的類似部分所取代。例如，這種分子包括特征為與非修飾輕鏈(或嵌合輕鏈)連接在一起的人源化重鏈的抗體，反之亦然?；蚬こ炭贵w特征也可為改變編碼受體抗體的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)的骨架區(qū)的核苷酸序列以保持供體抗體的結(jié)合特異性。這些抗體可含有以本發(fā)明所述供體抗體的CDR替換受體抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR(優(yōu)選全部)。
“嵌合抗體”指一種基因工程抗體，它含有來源于供體抗體、與來源于受體抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)連接在一起的天然可變區(qū)(輕鏈和重鏈)。
“人源化抗體”指一種基因工程抗體，它具有來源于非人類供體免疫球蛋白的CDR，而分子中其余免疫球蛋白部分來源于一種(或多種)人類免疫球蛋白。此外，也可對(duì)骨架支持殘基進(jìn)行改造以使其保持結(jié)合親合力(參見如，Queen et al.，Proc.Natl Acad Sci USA，8610029-10032(1989)；Hodgson et al.，Bio/Technology，9421(1991))。適當(dāng)?shù)娜祟愂荏w抗體可根據(jù)與供體抗體的核苷酸和氨基酸序列的同源性，從常用數(shù)據(jù)庫如KABAT_數(shù)據(jù)庫、Los Alamos數(shù)據(jù)庫和瑞士蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中選擇。特征為與供體抗體骨架區(qū)同源(在氨基酸基礎(chǔ)上)的人類抗體，也許適于提供用于供體CDR插入的重鏈恒定區(qū)和/或重鏈可變骨架區(qū)。合適的能貢獻(xiàn)輕鏈恒定區(qū)或可變骨架區(qū)的受體抗體也可用類似的方法進(jìn)行選擇。必須注意的是受體抗體的重鏈和輕鏈不需要來源于相同的受體抗體。先有技術(shù)描述了生產(chǎn)這些人源化抗體的幾種方法——參見如EP-A-0239400和EP-A-054951等。
“重構(gòu)人源抗體”指一種修飾抗體，其中來自于第一人源單克隆供體抗體的至少一個(gè)CDR被用來替換第二人類受體抗體中的CDR。優(yōu)選所有六個(gè)CDR都被替代。更優(yōu)選來自于第一人源單克隆供體抗體的整個(gè)抗原結(jié)合區(qū)(如Fv、Fab或F(ab’)2)被用來替換第二人源單克隆受體抗體的相應(yīng)區(qū)域。最優(yōu)選來自于第一人類供體的Fab區(qū)與適當(dāng)?shù)牡诙祟愂荏w抗體的恒定區(qū)有效地連接在一起以形成一個(gè)全長單克隆抗體。
“載體抗體”指連接藥物以增強(qiáng)透過血腦屏障(BBB)運(yùn)輸?shù)目贵w。(綜述參見Pardridge；Advanced Drug Delivery Review 36，299-321，1999)。該連接可以是化學(xué)連接或者將該半分子人為地設(shè)計(jì)到抗體中。一個(gè)實(shí)例是用大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受體抗體如抗胰島素抗體或抗運(yùn)鐵蛋白受體抗體來制造嵌合體(Saito et al(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92 10227-31；Pardridge et al(1995)Pharm.Res.12 807-816；Broadwell et al(1996)Exp.Neurol.142 47-65；Bickel et al(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90，2618-2622；Friden et al(1996)J.Pharm.Exp.Ther.278 1491-1498，US5182107，US5154924，US5833988，US5527527)。一旦與受體結(jié)合，雙特異性抗體的兩個(gè)組分就可通過轉(zhuǎn)胞過程穿過BBB?；蛘咴撍幬锟梢允且粋€(gè)配基，該配基可與所述細(xì)胞表面受體如胰島素、運(yùn)鐵蛋白或低密度脂蛋白結(jié)合(Descamps etal(1996)Am.J.Physiol.270 H1149-H1158；Duffy et al(1987)BrainRes.420 32-38；Dehouck et al(1997)J.Cell Biol.1997 877-889)。也可采用已知的促進(jìn)跨BBB運(yùn)輸?shù)奶烊欢嚯娜鐫B透素和SynB1和SynB3(Rouselle et al(2000)Mol.Pharm.57，679-686 and Rouselle et al(2001)Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 296，124-131)。
術(shù)語“供體抗體”指一種抗體(單克隆抗體或重組抗體)，它將其可變區(qū)、CDR、或其它功能片段或其類似物的氨基酸序列貢獻(xiàn)給第一免疫球蛋白配偶體，其目的是提供供體抗體的修飾的免疫球蛋白編碼區(qū)及其表達(dá)所得的抗原特異性和中和活性。
術(shù)語“受體抗體”指一種與供體抗體異源的抗體(單克隆抗體或重組抗體)，它為第一免疫球蛋白配偶體貢獻(xiàn)編碼其重鏈和/或輕鏈骨架區(qū)和/或其重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)的全部(或任何部分，優(yōu)選為全部)氨基酸序列。優(yōu)選受體抗體為人類抗體。
“CDR”定義為抗體的互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸序列，它是免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高變區(qū)。參見如，Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，4th Ed.，U.S.Department of Health and HumanServices，National Institutes of Health(1987)。免疫球蛋白的可變部分中有三個(gè)重鏈和三個(gè)輕鏈CDR(或CDR區(qū))。因此，本說明書中所用的“CDR”指所有三個(gè)重鏈CDR或所有三個(gè)輕鏈CDR(或所有重鏈和輕鏈CDR，如適當(dāng))。抗體的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)折疊方式意味著其它殘基也應(yīng)被認(rèn)作是抗原結(jié)合區(qū)的一部分并且可被技術(shù)人員如此理解。參見如，Chothia et al，(1989)Conformations of immunoglobulinhypervariable regions；Nature 342，p877-883。為方便起見，Kabat所闡明的CDR在序列表SEQ ID Nos 13-26中以下劃線標(biāo)出。
CDR提供了抗體與抗原或表位結(jié)合接觸的殘基的大部分。本發(fā)明的目的CDR來源于供體抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列，并且包括天然的CDR的類似物，該類似物也分亨或保留了與其來源供體抗體相同的抗原結(jié)合特異性和/或中和能力。
“功能片段”是部分重鏈或輕鏈可變區(qū)序列(如對(duì)免疫球蛋白N末端或C末端的細(xì)微的缺失)，它保留了與片段來源抗體相同的抗原結(jié)合特異性和/或中和能力。
“類似物”是至少對(duì)一個(gè)氨基酸進(jìn)行了修飾的氨基酸序列，其中所述的修飾可以是化學(xué)修飾，或是少量氨基酸(即不超過10個(gè))的替代或重排，該修飾允許氨基酸序列保留未修飾序列的生物學(xué)特性如抗原特異性和高親和力。例如，當(dāng)在CDR編碼區(qū)內(nèi)或附近創(chuàng)建某些限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)時(shí)，可通過置換來構(gòu)建(沉默)突變。本發(fā)明考慮了本發(fā)明抗體的類似物的用途。大家已熟知，氨基酸或核苷酸序列的微小改變會(huì)導(dǎo)致諸如保留原始蛋白質(zhì)基本相同特性的原始蛋白質(zhì)等位型等。因此本發(fā)明抗體類似物所包括那些類似物，其中重鏈和輕鏈高變區(qū)中的CDR與上述CDR如CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3至少有80％的同源性，優(yōu)選為至少90％同源性，更優(yōu)選為至少95％同源性，并保留MAG中和活性。當(dāng)氨基酸序列最優(yōu)化排列時(shí)，如果在相同位置上有80％相同的氨基酸殘基，缺失和插入計(jì)作非相同的殘基，那么氨基酸序列至少有80％同源性。本發(fā)明還關(guān)注本發(fā)明抗體的類似物，其中骨架區(qū)與Seq ID 1-5所列骨架區(qū)至少有80％同源性，優(yōu)選為至少90％同源性，更優(yōu)選為至少95％同源性。當(dāng)氨基酸序列最優(yōu)化排列時(shí)，如果在相同位置上有80％相同的氨基酸殘基，缺失和插入計(jì)作非相同的殘基，那么氨基酸序列至少為80％同源。
類似物也可產(chǎn)生等位變異體。“等位變異體或修飾型”是核苷酸序列中的改變。該變異體或修飾型可能是由于基因編碼的簡并性或經(jīng)特意地人為設(shè)計(jì)以提供滿意的特性。這些變異體或修飾體可導(dǎo)致或不導(dǎo)致氨基酸序列的改變。
術(shù)語“效應(yīng)物”指非蛋白質(zhì)載體分子，其上通過常規(guī)方法連接有修飾抗體、和/或天然或合成的供體抗體的輕鏈或重鏈或供體抗體的其它片段。所述非蛋白質(zhì)載體包括診斷領(lǐng)域常規(guī)使用的載體如聚苯乙烯或其它塑料珠、如用于BIAcore[Pharmacia]系統(tǒng)的多糖、或其它用于醫(yī)學(xué)界并可安全給予人類和動(dòng)物的非蛋白質(zhì)物質(zhì)。其它效應(yīng)物包括用于螯合金屬原子或放射性同位素的大環(huán)。此效應(yīng)物也可用于提高修飾抗體的半衰期如聚乙二醇。
對(duì)MAG特異的中和抗體已有描述(Poltorak et al(1987)Journal ofCell Biology 105，1893-1899；DeBellard et al(1996)Mol.Cell.Neurosci.7，89-101；Tang et al(1997)Mol.Cell.Neurosci.9，333-346；TorigoeK and Lundborg(1997)Exp.Neurology 150，254-262)并有商品可獲得(MAB1567(Chemicon))。
換句話說，人們可構(gòu)建抗體、修飾抗體和片段，方法是給非人類物種(如牛、綿羊、猴子、雞、嚙齒動(dòng)物(如小鼠和大鼠)等)免疫接種任何物種的天然MAG，如人或雞的MAG而產(chǎn)生需要的免疫球蛋白，產(chǎn)物的抗MAG抗體與人MAG有交叉抗體反應(yīng)性?？刹捎贸Ｒ?guī)的雜交瘤技術(shù)來提供分泌抗MAG的非人源單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。然后對(duì)該雜交瘤的結(jié)合能力進(jìn)行篩選，篩選可用包被MAG的384或96孔板、結(jié)合于鏈霉親合素包被板的生物素化MAG或采用生物素化MAG的同源性銪-APC偶聯(lián)免疫法(homogenous europium-APC linked immunoassay)。
天然人類抗體可在人類抗體小鼠如“Xenomouse”(Abgenix)中生產(chǎn)，在該人類抗體小鼠中，小鼠免疫球蛋白基因被移除，而編碼人免疫球蛋白的基因被插入到小鼠染色體中。小鼠按常規(guī)方法免疫，并產(chǎn)生源于人類基因的抗體應(yīng)答。因此，該小鼠產(chǎn)生的人類抗體避免了對(duì)篩選出的陽性雜交瘤的后續(xù)人源化處理(參見Green L.L.，JImmunol Methods 1999 Dec 10；231(1-2)11-23)。
本發(fā)明還包括來源于抗MAG單克隆抗體的Fab片段或F(ab’)2片段的應(yīng)用。這些片段可用作活體內(nèi)保護(hù)性藥物。Fab片段含有完整的輕鏈和重鏈的氨基末端部分；而F(ab’)2片段為兩個(gè)Fab片段通過二硫鍵連接而形成的片段。Fab片段和F(ab’)2片段可以通過常規(guī)的方法獲得，如用適當(dāng)?shù)牡鞍姿饷浮竟系鞍酌负?或胃蛋白酶切割mAb或用重組技術(shù)。Fab和F(ab’)2片段本身可以用作治療或預(yù)防藥物，也可用作包括可變區(qū)和CDR序列的序列供體，用于本說明書所述重組或人源化抗體的生產(chǎn)。
Fab和F(ab’)2片段也可通過組合噬菌體文庫(參見如，Winter etal.，Ann.Rev.Immunol.，12433-455(1994))或通過免疫球蛋白鏈改組(參見如，Marks et al.，Bio/Technology，10779-783(1992))來構(gòu)建，上述兩篇文獻(xiàn)被整體引用而結(jié)合到本文中。
因此，MAG特異的人類抗體片段(Fv、scFv、Fab)可采用人類抗體片段噬菌體展示文庫進(jìn)行分離。展示人類抗體片段蛋白質(zhì)的噬菌體顆粒文庫通過檢測對(duì)MAG蛋白的結(jié)合能力篩選。結(jié)合MAG的那些噬菌體展示抗體片段得以從文庫中保留，其克隆也得以擴(kuò)增。然后將人類抗體基因從特定的噬菌體中切割下來并插入到含有人IgG恒定區(qū)的人類IgG表達(dá)結(jié)構(gòu)中，表達(dá)結(jié)構(gòu)與來自于分離到的抗MAG特異性噬菌體的可變區(qū)一起形成完整的人類IgG分子。
供體抗體可貢獻(xiàn)出諸如重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)多肽序列、骨架序列、CDR序列、功能片段及其類似物等序列以及編碼它們的核苷酸序列，所述序列可用于設(shè)計(jì)和獲得各種修飾抗體，該修飾抗體特征為具有供體抗體的抗原結(jié)合特異性。
考慮到基因編碼的簡并性，可構(gòu)建各種編碼具有供體抗體抗原特異性的重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列、CDR序列以及功能片段和類似物的編碼序列。當(dāng)分離所得的編碼可變鏈多肽序列或CDR的核苷酸序列與第二免疫球蛋白配偶體有效地結(jié)合時(shí)，可用于生產(chǎn)修飾抗體如嵌合抗體或人源化抗體或其它基因工程抗體。
修飾的免疫球蛋白分子可編碼包括基因工程抗體如嵌合抗體和人源化抗體的修飾抗體。所需的修飾免疫球蛋白編碼區(qū)含有插入到第一免疫球蛋白配偶體(人類骨架區(qū)或人類免疫球蛋白可變區(qū))中的CDR編碼區(qū)，該CDR編碼區(qū)編碼的多肽具有抗MAG抗體(優(yōu)選為高親和力抗體)的抗原特異性。
優(yōu)選第一免疫球蛋白配偶體有效地與第二免疫球蛋白配偶體連接在一起。第二免疫球蛋白配偶體的定義如上，并可含編碼目的第二抗體區(qū)的序列，例如Fc。第二免疫球蛋白配偶體還可含編碼另一個(gè)免疫球蛋白的序列，它與配偶體的輕鏈或重鏈恒定區(qū)按閱讀框融合或通過一個(gè)接頭序列連接。可對(duì)針對(duì)MAG功能片段或類似物設(shè)計(jì)基因工程抗體以增強(qiáng)其抗原結(jié)合能力。
第二免疫球蛋白配偶體也可連接上述效應(yīng)物，包括非蛋白質(zhì)載體分子，第二免疫球蛋白配偶體可通過常規(guī)的方法與效應(yīng)物有效地連接。
第二免疫球蛋白配偶體如抗體序列與效應(yīng)物的融合或連接可以采用任何適當(dāng)?shù)姆绞?，如常?guī)的化學(xué)鍵合或離子鍵合、蛋白質(zhì)融合或異雙功能交叉連接物如碳化二亞胺、戊二醛等。這些方法在本技術(shù)領(lǐng)域中為公知技術(shù)，并在常規(guī)的化學(xué)和生物化學(xué)教材中已有描述。
此外，僅用來為第二免疫球蛋白配偶體與效應(yīng)物之間提供所需空間的常規(guī)接頭序列，也可構(gòu)建到修飾的免疫球蛋白編碼區(qū)中。該接頭的設(shè)計(jì)為本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明涉及的更深入的方面提供具有一個(gè)或多個(gè)上述可結(jié)合并中和MAG功能的CDR的雙抗體(二價(jià)抗體或雙特異性抗體)、三抗體、四抗體和其它多價(jià)scFV蛋白種類。
在一個(gè)更深入的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可連接上其它的物質(zhì)。例如，可采用重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)本發(fā)明的基因工程抗體，其中完整抗體分子的Fc片段或者CH2-CH3區(qū)被一種酶或其它可探測分子(即，多肽效應(yīng)物或報(bào)道分子)替代。
第二免疫球蛋白配偶體也可有效地連接上一個(gè)與具有抗MAG抗體抗原特異性的與含CDR的序列異源的非免疫球蛋白多肽、蛋白或其片段。所得蛋白在表達(dá)后，可同時(shí)表現(xiàn)抗MAG抗原特異性和非免疫球蛋白特征。融合配偶體的特征可以是，例如，功能特征如其它的結(jié)合或受體結(jié)構(gòu)功能域，或治療特征(當(dāng)融合配偶體本身是一個(gè)治療蛋白時(shí))，或其它的抗原特征。
本發(fā)明的另一個(gè)所需蛋白質(zhì)可為含有具有全長重鏈和輕鏈的完整的抗體分子、或其不連續(xù)的片段如Fab或F(ab’)2片段、重鏈二聚體，或其最小重組片段如Fv或單鏈抗體(SCA)或任何與所選供體mAb具有相同特異性的其它分子。該蛋白可以以修飾抗體的形式來使用，或以非融合的形式來使用。
當(dāng)?shù)诙庖咔虻鞍着渑俭w來源于與供體抗體不同的抗體，如為免疫球蛋白骨架區(qū)或恒定區(qū)的任一同種型或同類時(shí)，會(huì)得到基因工程抗體?；蚬こ炭贵w可含有同一種來源如受體抗體的免疫球蛋白(Ig)恒定區(qū)和可變骨架區(qū)，以及來源于供體抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR。此外，可在核苷酸或氨基酸水平上對(duì)受體mAb輕鏈和/或重鏈可變骨架區(qū)或供體CDR區(qū)域進(jìn)行修飾如缺失、替換或插入，以保留供體抗體的抗原結(jié)合特異性。
該基因工程抗體設(shè)計(jì)為含有抗MAG mAb的一個(gè)(或兩個(gè))重鏈和/或輕鏈可變區(qū)或一個(gè)或多個(gè)重鏈或輕鏈CDR。如上所述，基因工程抗體也可中和抗原。
該基因工程抗體包括含所選人類免疫球蛋白或亞型骨架區(qū)的人源化抗體，或含與抗MAG抗體功能片段融合在一起的人類重鏈和輕鏈恒定區(qū)的嵌合抗體。合適的人源(或其它動(dòng)物)受體抗體可通過與供體抗體的核苷酸和氨基酸序列的同源性從常用數(shù)據(jù)庫如KABAT_數(shù)據(jù)庫、Los Alamos數(shù)據(jù)庫和瑞士蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中選擇。特征為與供體抗體骨架區(qū)的同源性(蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上)的人類抗體可適于提供重鏈恒定區(qū)和/或用于供體CDR插入的重鏈可變骨架區(qū)。能提供輕鏈恒定區(qū)或可變骨架區(qū)的適宜的受體抗體可通過類似的方法進(jìn)行選擇。必須指出的是受體抗體的重鏈和輕鏈不必來源于相同的受體抗體。
優(yōu)選異源骨架區(qū)和恒定區(qū)選自人類免疫球蛋白類和亞型如IgG(亞型1-4)、IgM、IgA和IgE。然而，受體抗體不必僅含人類免疫球蛋白序列。例如，基因可構(gòu)建為其中的編碼部分人類免疫球蛋白鏈的DNA序列與編碼非人類免疫球蛋白序列如多肽效應(yīng)物或報(bào)道分子的DNA序列融合在一起。
在人源化抗體中，人類重鏈和輕鏈的可變區(qū)優(yōu)選通過進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)CDR替換而改造?？墒褂盟辛鶄€(gè)CDR，或少于六個(gè)CDR的各種組合方式。優(yōu)選所有六個(gè)CDR被替換。可使用如同輕鏈的人受體抗體來源的未修飾輕鏈，僅替換人重鏈中的CDR?；蛘?，兼容性輕鏈可借助于常用的抗體數(shù)據(jù)庫，選自其它人類抗體。基因工程抗體的其余部分可來源于任何適當(dāng)?shù)氖荏w人類免疫球蛋白。
因此，基因工程人源化抗體優(yōu)選具有天然人類抗體或其片段的結(jié)構(gòu)，并具有有效治療所需的各種特性。
本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)能理解到還可通過改變可變區(qū)的氨基酸對(duì)基因工程抗體進(jìn)行進(jìn)一步修飾(即類似物)，該改變不必影響供體抗體的特異性和強(qiáng)結(jié)合力?？梢灶A(yù)見的是，重鏈和輕鏈的氨基酸可被可變骨架區(qū)或CDR之一或兩者中其它的氨基酸所替代。
此外，也可對(duì)恒定區(qū)進(jìn)行修飾以提高或降低本發(fā)明分子的選擇性。例如，二聚體化、與Fc受體的結(jié)合或結(jié)合和激活補(bǔ)體的能力(參見如，Angal et al.，Mol.Immunol，30105-108(1993)；Xu et al.，J.Biol.Chem，2693469-3474(1994)；Winter et al.，EP 307，434-B)。
作為嵌合抗體的修飾抗體與上述人源化抗體所不同的是，它提供與來源于其它物種(優(yōu)選為人類)免疫球蛋白兩條鏈的恒定區(qū)連接在一起的整個(gè)非人類供體抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)包括骨架區(qū)。
在通過下列方法構(gòu)建本發(fā)明的修飾抗體(優(yōu)選人源化抗體)的方法中，優(yōu)選采用合適的供體mAbs的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)序列和CDR及其核苷酸編碼序列?？刹捎孟嗤蝾愃频姆椒▉砩a(chǎn)本發(fā)明的其它實(shí)施例。
生產(chǎn)所選供體抗體mAb的雜交瘤為常規(guī)方法所克隆的雜交瘤，其重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA可通過本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來獲得，如Sambrook等所描述的方法(Molecular Cloning(ALaboratory Manual)，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory(1989))。可用多核苷酸引物和逆轉(zhuǎn)錄酶來獲得重鏈和輕鏈可變區(qū)以及抗體鏈中其余的來源于人類免疫球蛋白的免疫球蛋白部分，該重鏈和輕鏈可變區(qū)至少含CDR編碼區(qū)和那些保留供體mAb結(jié)合特異性所需的受體mAb輕鏈和/或重鏈可變骨架區(qū)部分?？捎靡阎臄?shù)據(jù)庫，通過與其它抗體進(jìn)行比較來鑒別CDR編碼區(qū)。
于是，可制備鼠/人嵌合抗體并對(duì)其結(jié)合能力進(jìn)行分析。該嵌合抗體含有在兩條鏈上與人Ig恒定區(qū)結(jié)合在一起的完整非人類供體抗體VH和VL區(qū)。
來自人類抗體重鏈可變區(qū)的同源骨架區(qū)可用計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫如KABAT_數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒別，具有與供體抗體同源的人類抗體可選作受體抗體?？梢灶愃频姆绞皆O(shè)計(jì)合適的輕鏈可變骨架區(qū)。
人源化抗體可來源于嵌合抗體，或者優(yōu)選通過將來自于重鏈和輕鏈的供體mAb CDR編碼區(qū)適當(dāng)?shù)夭迦氲剿x重鏈和輕鏈骨架區(qū)內(nèi)而合成制得?；蛘撸嗽椿贵w可用標(biāo)準(zhǔn)的誘變技術(shù)來制得。因此，所得人源化抗體含有人類骨架區(qū)和供體mAb CDR編碼區(qū)。還可對(duì)骨架區(qū)的殘基進(jìn)行后續(xù)操作。所得人源化抗體可在重組宿主細(xì)胞如COS、CHO或骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)。
常規(guī)的表達(dá)載體或重組質(zhì)?？赏ㄟ^將抗體編碼序列與常用的調(diào)控序列有效地連接而生產(chǎn)，該調(diào)控序列可調(diào)控復(fù)制和在宿主細(xì)胞中的表達(dá)和/或從宿主細(xì)胞的分泌。調(diào)控序列包括啟動(dòng)子序列如CMV啟動(dòng)子和信號(hào)序列，該序列可來源于其它已知抗體?？捎妙愃频姆椒ㄉa(chǎn)具有編碼互補(bǔ)抗體輕鏈或重鏈DNA序列的第二表達(dá)載體。除所關(guān)注的編碼序列和選擇性標(biāo)記外，優(yōu)選該第二表達(dá)載體與第一表達(dá)載體相同，這樣可以盡可能地保證每條多肽鏈能被有功能地表達(dá)?；蛘?，修飾抗體的重鏈和輕鏈編碼序列可位于同一載體上。
可通過常規(guī)方法用第一和第二載體同時(shí)對(duì)所選宿主細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染(或用單一載體進(jìn)行簡單地轉(zhuǎn)染)以創(chuàng)建同時(shí)含有重組或合成的輕鏈和重鏈的轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。然后用常規(guī)方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞來生產(chǎn)本發(fā)明的基因工程抗體。含有重組重鏈和/或輕鏈的聯(lián)合物的人源化抗體可通過適當(dāng)?shù)姆治龇椒ㄈ鏓LISA或RIA從培養(yǎng)物中篩選出來。也可采用類似的常用的方法來構(gòu)建其它的修飾抗體和分子。
在本發(fā)明的方法和組合物構(gòu)建中克隆和亞克隆的合適載體可由本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員選擇。例如，可用常規(guī)的pUC系列克隆載體。pUC19載體有商品可從供應(yīng)商如Amersham(Buckinghamshire，United Kingdom)或Pharmacia(Uppsala，Sweden)處獲得。此外，用于克隆的載體應(yīng)能容易復(fù)制、具有豐富的克隆位點(diǎn)和選擇性基因(如抗生素抗性)并易于操作。因此，克隆載體的選擇在本發(fā)明中不是一個(gè)限制因素。
同樣，用于抗體表達(dá)的載體也可由本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員從常規(guī)載體中選擇。該載體也含有所選調(diào)制序列(如CMV啟動(dòng)子)，它指導(dǎo)外源DNA序列在所選宿主細(xì)胞中的復(fù)制和表達(dá)。這些載體含有上述編碼抗體的DNA序列或修飾的免疫球蛋白編碼區(qū)。此外，該載體可含有所選免疫球蛋白序列，該序列可通過插入需要的限制性酶切位點(diǎn)來進(jìn)行修飾以便于操作。
表達(dá)載體的特征也可為適于擴(kuò)大外源DNA序列表達(dá)的基因如哺乳動(dòng)物二氫葉酸還原酶基因(DHFR)。其它優(yōu)選載體序列含有一個(gè)諸如來自牛生長激素(BGH)的多聚腺苷酸信號(hào)序列和β球蛋白啟動(dòng)子序列(betaglopro)。本說明書所用的表達(dá)載體可用本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來合成。
該載體的組成成分如復(fù)制子、選擇基因、增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、信號(hào)序列等可通過商業(yè)途徑或天然來源或用已知的方法合成來獲得，以用于指導(dǎo)重組DNA產(chǎn)物在所選宿主細(xì)胞中的表達(dá)和/或分泌。也可選用其它合適的載體用于此目的，這些載體中有許多是本技術(shù)領(lǐng)域中已知的哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、昆蟲、酵母和真菌表達(dá)的載體。
本發(fā)明還包括用含有抗體或其修飾免疫球蛋白分子編碼序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染而來的細(xì)胞系。用于這些克隆載體的克隆和其它操作的宿主細(xì)胞也是常用的細(xì)胞。然而，最優(yōu)選多種大腸桿菌(E.coli)菌株的細(xì)胞用于構(gòu)建本發(fā)明修飾抗體中克隆載體的復(fù)制和其它步驟。
適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)本發(fā)明抗體的宿主細(xì)胞或細(xì)胞系優(yōu)選為哺乳動(dòng)物細(xì)胞如NS0、Sp2/0、CHO、COS、成纖維細(xì)胞(如3T3)和骨髓瘤細(xì)胞，更優(yōu)選為CHO或骨髓瘤細(xì)胞。也可用人類細(xì)胞，這樣能使分子按人類糖基化方式進(jìn)行修飾?；蛘咭部刹捎闷渌婧思?xì)胞系。合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇以及轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、擴(kuò)增、篩選和產(chǎn)品生產(chǎn)和純化的方法為本技術(shù)領(lǐng)域所公知。參見如，在上面已引用的Sambrook等。
細(xì)菌細(xì)胞被證實(shí)適于作為宿主細(xì)胞用來表達(dá)本發(fā)明的重組Fabs(參見如，Plückthun，A.，Immunol.Rev.，130151-188(1992))。然而，由于細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)傾向于為非折疊或不正確折疊形式或非糖基化形式，因此必須對(duì)細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)的任何重組Fab的抗原結(jié)合能力的保留情況進(jìn)行篩選。如果細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)的分子以適當(dāng)?shù)恼郫B形式產(chǎn)生，那么該細(xì)菌細(xì)胞為所需的宿主。例如，許多用于表達(dá)的大腸桿菌(E.coli)菌株作為宿主細(xì)胞在生物技術(shù)領(lǐng)域廣為人知。本方法中也可采用枯草桿菌(B.subtillis)、鏈霉菌(Strptomyces)、其它桿菌等的許多菌株。
如需要，本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的酵母細(xì)胞株也可用作宿主細(xì)胞，同樣昆蟲細(xì)胞如果蠅和鱗翅目昆蟲(Lepidoptera)以及病毒表達(dá)系統(tǒng)也可用作宿主。參見如，Miller et al.，Genetic Engineering，8277-298，Plenum Press(1986)及其中引用的文獻(xiàn)。
載體構(gòu)建的一般方法、生產(chǎn)本發(fā)明宿主細(xì)胞所需的轉(zhuǎn)染方法以及從該宿主細(xì)胞中生產(chǎn)本發(fā)明的修飾抗體必需的培養(yǎng)方法都是常規(guī)方法。同樣地，本發(fā)明的抗體一旦生產(chǎn)后，可按照本技術(shù)領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法從細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行純化，這些方法包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析、凝膠電泳等。這些方法為本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的專門技術(shù)，并不限制本發(fā)明。例如，在WO 99/58679和WO 96/16990中描述了修飾抗體的制備。
還有另一個(gè)抗體表達(dá)方法為在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)，如美國專利美國專利號(hào)4,873,316中所述。它所涉及采用動(dòng)物酪蛋白啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)，當(dāng)轉(zhuǎn)基因到哺乳動(dòng)物時(shí)，可使雌性在其乳汁中產(chǎn)生所需的重組蛋白質(zhì)。
抗體一旦通過理想的方法表達(dá)后，可通過采用適當(dāng)?shù)姆治龇椒▽?duì)其體外活性進(jìn)行檢測。目前，常采用常規(guī)的ELISA分析方法來定性和定量地評(píng)價(jià)抗體與MAG的結(jié)合。此外，其它的體外分析方法也可用來在隨后的臨床試驗(yàn)前檢驗(yàn)抗體的中和效力，進(jìn)行臨床試驗(yàn)的目的是評(píng)價(jià)抗體在體內(nèi)常規(guī)清除機(jī)制下的持續(xù)性。
本發(fā)明的治療藥物可在預(yù)防時(shí)給藥，或在損傷后或其它需要的情況下給藥。治療的劑量和療程與本發(fā)明的分子在人體循環(huán)中的相對(duì)持續(xù)時(shí)間有關(guān)，并可由本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員依據(jù)所治療的情況和病人的一般健康狀況來進(jìn)行調(diào)整。
本發(fā)明治療藥物的給藥方式可以是將藥物輸送到受體的任何適當(dāng)途徑。本發(fā)明的拮抗劑和抗體以及藥用組合物特別適于非胃腸道給藥，即皮下注射、肌內(nèi)注射、靜脈注射或鼻內(nèi)給藥。
本發(fā)明的治療藥物可配制成藥用組合物，所述藥用組合物含有效劑量的本發(fā)明的拮抗劑或抗體作為活性成分以及藥學(xué)可接受的載體。本發(fā)明的預(yù)防藥物優(yōu)選為直接注射應(yīng)用的含有基因工程抗體的水性懸浮液或溶液，優(yōu)選緩沖于生理pH。用于非胃腸道給藥的組合物通常為溶于藥學(xué)上可接受的載體(優(yōu)選水性載體)的本發(fā)明抗體或拮抗物溶液或其混合物?？梢圆捎迷S多水性載體，如0.9％NaCl、0.3％甘油等。這些溶液為無菌，并一般不含有顆粒性物質(zhì)。這些溶液可用常規(guī)的熟知的滅菌方法(如過濾)進(jìn)行滅菌。根據(jù)需要，組合物可含藥學(xué)上可接受的助劑如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑等，使其接近生理狀態(tài)。本發(fā)明的拮抗劑或抗體在所述藥物制劑中的濃度可在很大的范圍內(nèi)變化，即從小于約0.5％(重量)，通常為1％(重量)或不小于1％(重量)，最高達(dá)15％(重量)或20％(重量)，按照所選給藥具體方式主要根據(jù)液體體積、粘度等進(jìn)行選擇。
因此，用于肌內(nèi)注射的藥用組合物可制成含無菌緩沖水溶液1mL和本發(fā)明的拮抗物或抗體約1ng-100mg，如約50ng-約30mg，更優(yōu)選約5mg-25mg。同樣地，用于靜脈輸液的本發(fā)明的藥用組合物可制成含無菌林格溶液約250ml和本發(fā)明的基因工程抗體約1-30mg，優(yōu)選為約5mg-25mg。制備非胃腸道給藥的組合物的實(shí)際方法為本技術(shù)領(lǐng)域廣為人知的方法或技術(shù)人員顯而易見的方法，這些方法在如Remington’s Pharmaceutical Science，15th ed.，MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania中有更詳細(xì)地描述。
本發(fā)明的治療藥物，當(dāng)制成藥用制劑時(shí)，優(yōu)選制成單劑劑型。合適的有效治療劑量易于由本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員確定。為有效治療人類中風(fēng)和其它神經(jīng)疾病，應(yīng)經(jīng)非胃腸道給予(優(yōu)選i.v.或i.m.(肌內(nèi)注射))每70kg體重最多700mg劑量的本發(fā)明的拮抗物或抗體。如需要，該藥劑可每隔適宜的時(shí)間重復(fù)給藥，該間隔是否合適由醫(yī)師選擇。
本說明書中描述的抗體可以凍干貯存并可在使用前重配于一適當(dāng)?shù)妮d體中。該方法對(duì)于常規(guī)免疫球蛋白被證明是有效的，可以采用本技術(shù)領(lǐng)域公知的凍干和重配方法。
另一方面，本發(fā)明提供一種用于治療或預(yù)防中風(fēng)和其它神經(jīng)疾病的藥用組合物，該藥用組合物含有本發(fā)明的抗MAG抗體或其功能片段以及藥學(xué)上可接受的載體。
進(jìn)一方面，本發(fā)明提供一種用于在罹患或有危險(xiǎn)罹患中風(fēng)或其它神經(jīng)疾病的病人中抑制神經(jīng)退變和/或促進(jìn)功能恢復(fù)的藥用組合物，該藥用組合物含有本發(fā)明的抗MAG抗體或其功能片段以及藥學(xué)上可接受的載體。
以下實(shí)施例用于闡明本發(fā)明。
實(shí)施例1——中風(fēng)模型中的抗MAG抗體材料和方法抗MAG單克隆抗體抗MAG單克隆抗體為從Chemicon公司獲得的小鼠抗雞MAG單克隆抗體MAB 1567。該抗體具有如下特征抗原髓鞘相關(guān)糖蛋白(人、小鼠、大鼠、牛、雞、青蛙)同種型IgG1中和能力參見DeBellard et al(1996)Mol.Cell.Neurosci.7，89-101；Tang et al(1997)Mol.Cell.Neurosci.9，333-346；Torigoe K andLundborg G(1997)Exp.Neurology 150，254-262。
對(duì)照IgG1單抗從R+D Systems公司購得。
經(jīng)腦室套管插入術(shù)(僅用于試驗(yàn)1)在氟烷麻醉的情況下，經(jīng)腦室(i.c.v.)將插管放置于左側(cè)腦室內(nèi)(坐標(biāo)距中線1.6mm、距前囟點(diǎn)近尾部0.8mm、距顱骨表面4.1mm、門齒條下方3.2mm，據(jù)Paxinos and Watson，1996)。對(duì)所有大鼠單籠飼養(yǎng)以避免損壞導(dǎo)管或模型插管。手術(shù)后7天，通過對(duì)血管緊縮素II(100ng，Simpson，et al. 1978)強(qiáng)烈的飲用反應(yīng)來校正插管的正確的定位。9天后，動(dòng)物遭受大腦局部缺血。
短暫局灶性大腦局部缺血在每只體重為300-350g的雄性Sprague Dawley大鼠中誘導(dǎo)短暫(90min)局灶性大腦局部缺血。對(duì)動(dòng)物的麻醉開始用置于面罩上的5％氟烷、60％氧化亞氮和30％氧氣的混合物，后續(xù)麻醉用1.5％氟烷來維持。用文獻(xiàn)(Zea Longa，et al.，1989)所述的腔內(nèi)扎線術(shù)來造成中腦動(dòng)脈梗塞。在整個(gè)手術(shù)過程中，使動(dòng)物維持正常體溫，并在單獨(dú)圈養(yǎng)前，在一個(gè)培養(yǎng)箱中，使動(dòng)物蘇醒1h。本試驗(yàn)僅包括梗塞1小時(shí)后神經(jīng)學(xué)分?jǐn)?shù)為3的那些動(dòng)物(用5分制評(píng)價(jià)0，無缺陷；1，對(duì)側(cè)反射；2，握力減弱；3，繞行；4，不動(dòng)；5，死亡)。動(dòng)物飼養(yǎng)至1星期，此時(shí)用透心灌注0.9％NaCl后灌注4％多聚甲醛的100mM磷酸緩沖液來處死動(dòng)物。將大腦置于4℃下4％多聚甲醛中48h進(jìn)行后期固定，此時(shí)將其從顱骨除下并用大鼠大腦基片切成2mm大小的塊。然后用Shandon Citadel 1000組織處理機(jī)對(duì)2mm切片進(jìn)行石蠟包埋，用薄樣切片機(jī)切成6μm大小的切片并封藏于包被多聚L-賴氨酸的載片上。然后對(duì)切片進(jìn)行處理以進(jìn)行甲苯基堅(jiān)牢紫(Cresyl FastViolet，CFV)染色。
給藥方案抗MAG單克隆抗體和小鼠IgG1同種型對(duì)照抗體對(duì)無菌0.9％NaCl溶液透析過夜，進(jìn)行適當(dāng)?shù)臐饪s。
試驗(yàn)1在MCAO后1、24和72h時(shí)經(jīng)i.c.v.給予動(dòng)物2.5μg抗MAG mab或2.5μg小鼠IgG(5μl/劑)。
試驗(yàn)2在MCAO后1和24h時(shí)經(jīng)i.v.給予動(dòng)物200μg抗MAGmab或200μg小鼠IgG。
不要讓研究者看到每種劑量溶液的標(biāo)識(shí)。
神經(jīng)學(xué)評(píng)價(jià)在誘導(dǎo)大腦局部缺血前，用于試驗(yàn)1的大鼠接受橫木行走和不干膠標(biāo)簽實(shí)驗(yàn)的訓(xùn)練。未同時(shí)達(dá)到兩個(gè)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物被排除在進(jìn)一步試驗(yàn)之外。在訓(xùn)練后，剩余的動(dòng)物按表現(xiàn)分成兩個(gè)相等的組。在神經(jīng)學(xué)評(píng)價(jià)過程中，不讓研究者知道治療動(dòng)物組。
雙側(cè)不干膠標(biāo)鑒試驗(yàn)用雙側(cè)不干膠標(biāo)鑒試驗(yàn)(Schallert et al.，PharmacologyBiochemistry and Behaviour 16455-462，(1983))來評(píng)價(jià)對(duì)側(cè)忽視和同側(cè)斜倚。該模型的觸覺消失在人類中風(fēng)病人中也能觀察到(Rose，etal.1994)。該試驗(yàn)此前有詳細(xì)地描述(Hunter，et al.，Neuropharmacology 39806-816(2000)；Virley et alJournal of CerebralBlood Flow&Metabolism，20563-582(2000))。簡單地說，圓形不干膠紙標(biāo)鑒隨機(jī)地用相同的壓力牢固地粘在前爪的無毛區(qū)附近(左、右)。在MCAO前進(jìn)行為期6天的訓(xùn)練，第六天的數(shù)據(jù)用作手術(shù)前的基線(0天)。在MCAO后24小時(shí)和7天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，數(shù)據(jù)表示的是兩次試驗(yàn)的平均值。接觸和除下標(biāo)鑒的反應(yīng)時(shí)間被記錄下來并用Logrank test(Cox，J.Royal Statistical Society B 34187-220(1972))進(jìn)行分析。
橫木行走橫木行走是通過在空中100cm橫木(直徑2.3cm，距地板48cm)上的行走距離來測量前肢和后肢的協(xié)調(diào)性，如文獻(xiàn)(Virley et alJournal of Cerebral Blood Flow&Metabolism，20563-582(2000))的詳細(xì)描述。訓(xùn)練大鼠從頭到尾走過橫桿。對(duì)于測試，在MCAO后24h和7d對(duì)每只大鼠進(jìn)行試驗(yàn)，數(shù)據(jù)表示兩次試驗(yàn)的平均值。按Student’s t-test的ANOVA進(jìn)行，先進(jìn)行NAOVA，然后進(jìn)行Student’s t檢驗(yàn)。
27分制神經(jīng)學(xué)分?jǐn)?shù)(試驗(yàn)1)該試驗(yàn)由一組評(píng)價(jià)神經(jīng)學(xué)狀態(tài)的試驗(yàn)組成，包括爪定位、可視前爪接觸試驗(yàn)、橫木、對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)、斜面、正位反射、對(duì)側(cè)反射、活動(dòng)和一般狀況，如文獻(xiàn)(Hunter，et al.Neuropharmacology 39806-816(2000))所述，加上握力測量(右前肢握力良好2分，弱1分)。對(duì)于正常動(dòng)物總分＝27。
對(duì)于試驗(yàn)2，該試驗(yàn)進(jìn)一步作如下改變握力——正常分?jǐn)?shù)3，良好-2，弱-1，極弱-0；活動(dòng)——正常分?jǐn)?shù)4，優(yōu)秀-3，優(yōu)良-2，良好-1，一般-0；一般狀況——正常分?jǐn)?shù)4，優(yōu)秀-3，優(yōu)良-2，良好-1，一般-0；繞行——沒有為分?jǐn)?shù)5，一側(cè)偏好為4分，大圈為3分，中圈為2分，小圈為1分，原地打轉(zhuǎn)為0分。對(duì)于正常動(dòng)物總分＝32。
在兩次試驗(yàn)中，在MACO后1、24、48h和7d對(duì)動(dòng)物進(jìn)行測試，健康正常動(dòng)物的分?jǐn)?shù)分別為27或32。數(shù)據(jù)表示的是均值，進(jìn)行Kruskil Wallis ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
損傷評(píng)價(jià)試驗(yàn)1——對(duì)于每只動(dòng)物，用來自大腦中三個(gè)預(yù)先設(shè)定位置(分別距前囟點(diǎn)0、-2.0、-6.0mm)的切片進(jìn)行病變區(qū)評(píng)價(jià)。用甲苯基堅(jiān)牢紫染色來對(duì)神經(jīng)元損傷進(jìn)行評(píng)價(jià)，損傷面積用Optimas 6.1imagingpackage軟件包來進(jìn)行測量。數(shù)據(jù)表示為平均面積(mm2)±sem。
試驗(yàn)2——對(duì)于每只動(dòng)物，用來自大腦中七個(gè)預(yù)先設(shè)定水平(+3mm至-8mm w.r.t.前囟點(diǎn))的切片進(jìn)行病變區(qū)評(píng)價(jià)。用甲苯基堅(jiān)牢紫染色來對(duì)神經(jīng)元損傷進(jìn)行評(píng)價(jià)，損傷面積用Optimas 6.1imagingpackage軟件包來進(jìn)行測量。數(shù)據(jù)表示為平均面積(mm2)±sem。
結(jié)果試驗(yàn)1——抗MAG單抗的經(jīng)腦室(i.c.v)給藥MCAO后一小時(shí)時(shí)，兩治療組動(dòng)物都表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)學(xué)分?jǐn)?shù)減少(每組的平均分?jǐn)?shù)為12)。此時(shí)兩組之間沒有顯著差異。然而，在MCAO后24小時(shí)(p＝0.02)、48小時(shí)(p＝0.005)和7天(p＝0.006)時(shí)用抗MAG單抗(2.5μg，MCAO后1、24和72h)治療的動(dòng)物與那些用對(duì)照IgG治療的動(dòng)物相比，神經(jīng)學(xué)總分表現(xiàn)出顯著的改善。IgG1治療組中MCAO后24小時(shí)、48小時(shí)和7天的神經(jīng)學(xué)分?jǐn)?shù)分別為15、14和18，而在抗MAG單抗治療的動(dòng)物中則分別為19.5、21.5和22。通行為的進(jìn)一步分析，包括部分，顯著改善主要?dú)w因于下列試驗(yàn)方面機(jī)能改善爪定位(24h，p＝0.045；48h，p＝0.016；7d，p＝0.008)、握力(24h，p＝0.049；48h，p＝0.0495；7d，p＝0.243)、活動(dòng)(24h，p＝0.199；48h，p＝0.012；7d，p＝0.067)、橫木(24h，p＝0.065；48h，p＝0.005；7d，p＝0.016)、斜面(24h，p＝0.006；48h，p＝0.006；7d，p＝0.169)、前爪接觸視力試驗(yàn)(48h，p＝0.049；7d，p＝0.049)和繞行的程度(24h，p＝0.417；48h，p＝0.034；7d，p＝0.183)。
橫木行走在手術(shù)前，訓(xùn)練所有動(dòng)物跨過橫木(100cm)。與手術(shù)前的值相比，在手術(shù)后24小時(shí)時(shí)，無論是抗MAG治療動(dòng)物還是IgG1治療動(dòng)物，其穿越橫木的距離都有明顯的減少(分別為50±18cm和22±14cm)。在tMACO后24h，雖然無顯著性差異，抗MAG治療的動(dòng)物比IgG1治療動(dòng)物表現(xiàn)出明顯的改善，它穿越的距離是抗MAG治療的動(dòng)物的二倍。雖然手術(shù)后七天，兩組隨時(shí)間都表現(xiàn)出明顯的改善，但是與基線相比，IgG1治療動(dòng)物的機(jī)能仍然存在顯著性機(jī)能障礙(55±15cm；p＝0.005)。然而，抗MAG單抗治療的動(dòng)物(2.5μg，1、24和72h，MCAO后i.c.v)則相反，其機(jī)能與基線沒有顯著差異(75±15cm；p＝0.07)。該數(shù)據(jù)顯示，與IgG1治療動(dòng)物對(duì)照相比，抗MAG單抗治療能增強(qiáng)橫木行走任務(wù)的恢復(fù)。
不干膠標(biāo)鑒在手術(shù)前，每一治療組中的動(dòng)物都能快速地接觸并除下每只前爪上的標(biāo)鑒，在治療前各組之間無顯著性差異(表1)。在MCAO后24小時(shí)和7天，每一治療組中左前爪接觸時(shí)間相對(duì)保持不變，而右前爪的則明顯增加。但是抗MAG治療動(dòng)物和IgG1治療動(dòng)物的除下時(shí)間之間無顯著性差異。此外，MCAO后24h，與基線相比，兩治療組中從兩前爪除下的時(shí)間都有顯著性地增加，但是抗MAG治療動(dòng)物的從左前爪除下的時(shí)間比IgG1治療動(dòng)物有顯著性地減少(p＝0.03)。與IgG1治療動(dòng)物相比，抗MAG治療動(dòng)物的從右前爪除下的等待時(shí)間也有減少的趨勢(shì)(p＝0.08)(表1)。在第7d，IgG1治療動(dòng)物有某種程度的恢復(fù)，與24h時(shí)相比，其每只前爪的除下標(biāo)鑒的等待時(shí)間都有所減少(表1)。數(shù)據(jù)表明用抗MAG單抗來治療大鼠可促進(jìn)其在tMCAO后不干膠標(biāo)鑒試驗(yàn)中的恢復(fù)。
表1-不干膠標(biāo)簽數(shù)據(jù)

(*p＝0.03Anti-MAG對(duì)IgG1，Logrank檢驗(yàn))病變區(qū)測量當(dāng)在tMCAO后7天時(shí)進(jìn)行檢測時(shí)，與用等量小鼠IgG1治療的那些動(dòng)物相比，用抗MAG單抗經(jīng)i.c.v給藥的動(dòng)物所檢測的三個(gè)大腦位置中的兩個(gè)的病變區(qū)面積有顯著性地減少(表2)。
表2

(*p＝0.02、$p＝0.03、#p＝0.06，抗MAG對(duì)IgG1，單向非配對(duì)Studentst檢驗(yàn))試驗(yàn)2——靜脈(i.v.)給藥神經(jīng)學(xué)分?jǐn)?shù)MCAO后一小時(shí)和24小時(shí)，兩組動(dòng)物都表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)學(xué)分?jǐn)?shù)的減少。此時(shí)兩組之間沒有顯著差異，在抗MAG單抗和IgG1治療后的平均分?jǐn)?shù)分別為20和18(p＝0.5)。MCAO后48h，用抗MAG單抗(200μg，MCAO后1、24h時(shí)i.v.)治療的動(dòng)物在爪定位(p＝0.048)和握力(p＝0.033)方面表現(xiàn)出顯著的改善。在大腦局部缺血發(fā)作后幾天，抗MAG單抗治療的動(dòng)物會(huì)持續(xù)改善(爪定位p＝0.041；握力p＝0.048；活動(dòng)p＝0.05)，與IgG1治療的那些小鼠(平均分?jǐn)?shù)23)相比，在神經(jīng)學(xué)分?jǐn)?shù)方面表現(xiàn)出顯著性的提高(平均分?jǐn)?shù)25，p＝0.047)。
病變區(qū)測量當(dāng)在tMCAO后7天時(shí)進(jìn)行檢測時(shí)，與同種型對(duì)照相比，當(dāng)MACO后經(jīng)i.v.給藥時(shí)，抗MAG抗體顯著性地減少七個(gè)預(yù)定大腦位置(+3至-8mm w.r.t.前囪點(diǎn))中的五個(gè)的病變區(qū)面積

*p＜0.05——非配對(duì)單向Students t檢驗(yàn)結(jié)論在對(duì)短暫中腦動(dòng)脈梗塞后的大鼠，無論是直接向CSF給藥還是靜脈給予抗MAG單克隆抗體，與對(duì)照治療的動(dòng)物相比，都能減少細(xì)胞死亡面積和促進(jìn)功能恢復(fù)。在這些試驗(yàn)中所觀察到的神經(jīng)保護(hù)水平表明，此效應(yīng)不能歸因于軸突發(fā)芽，因?yàn)樗荒軐?dǎo)致神經(jīng)元的不足。與對(duì)照治療動(dòng)物相比，在MCAO后24h和48h時(shí)觀察到的功能恢復(fù)的改善可能反映了抗體所提供的神經(jīng)保護(hù)的程度。然而，動(dòng)物會(huì)隨時(shí)間表現(xiàn)出進(jìn)一步的改善，表明MAG活性的阻斷也能隨時(shí)間增強(qiáng)功能修復(fù)。
本實(shí)施例中的試驗(yàn)表明，MAG反應(yīng)性的阻斷可對(duì)大鼠中風(fēng)模型提供神經(jīng)保護(hù)，促進(jìn)功能恢復(fù)，因而抗MAG抗體可提供用于中風(fēng)后急性神經(jīng)保護(hù)和/或促進(jìn)功能恢復(fù)的潛在治療藥物。經(jīng)i.v途徑給藥的抗體的低含量以及所得到的抗體的低血清水平依次表明，由于血腦屏障對(duì)抗體滲透的制約，腦中的抗體濃度會(huì)極低。奇怪的是，雖然如此，它仍然導(dǎo)致可觀察到的神經(jīng)保護(hù)以及功能恢復(fù)的增強(qiáng)?？筂AG抗體還有可能用于其它細(xì)胞和/或神經(jīng)纖維退化的神經(jīng)紊亂如脊髓損傷、外傷性腦損傷、周圍神經(jīng)病、阿耳茨海默氏病、額中顳性癡呆、帕金森氏病、杭廷頓氏舞蹈病和多發(fā)性硬化癥。在隨后的實(shí)施例中，本說明書所公開的嵌合抗體和人源化抗體的CDR為實(shí)施例1抗體的CDR。
實(shí)施例2——嵌合抗體修飾抗體包括嵌合抗體，其中來源于一種物種的可變區(qū)與來源于另一種物種的恒定區(qū)相連。本發(fā)明的小鼠-人嵌合抗MAG免疫球蛋白鏈的實(shí)施例如圖1、2和3所示。可生產(chǎn)采用人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、IgD恒定區(qū)的小鼠-人嵌合抗體，同樣也可生產(chǎn)將小鼠可變區(qū)與來自于非人類物種的重鏈或輕鏈恒定區(qū)連接在一起的異源嵌合體。
圖1(Seq ID No.27)提供一個(gè)嵌合免疫球蛋白重鏈的氨基酸序列，其中鼠源抗MAG重鏈可變區(qū)與一個(gè)功能性免疫球蛋白分泌信號(hào)序列及人類IgG1恒定區(qū)的一種修飾型連接在一起，該修飾型中Kabat 248和250殘基被突變?yōu)榫彼?，其目的是消除與FcγRI和補(bǔ)體蛋白Clq結(jié)合的效應(yīng)物功能(Duncan，A.R.and Winter，G.Localization of theClq binding site on antibodies by surface scanning.Nature 332，738-740，1988.Duncan，A.R.，Woolf，J.M.，Partridge，L.J.，Burton，D.R.and Winter，G.Localization of the binding site for human FcRl onIgG.Nature 332，563-564，1988)。任選制造該種突變以定制修飾抗體的性能來獲取特定的治療效果——例如，不激活裂解效應(yīng)物機(jī)制而與抗原結(jié)合并阻斷其功能。
圖2(Seq ID No.28)提供一個(gè)嵌合免疫球蛋白輕鏈的氨基酸序列，其中鼠源抗MAG輕鏈可變區(qū)與一個(gè)功能性免疫球蛋白分泌信號(hào)序列及人類κ恒定區(qū)連接在一起。
同樣地，抗MAG可變區(qū)也可與缺少滅活效應(yīng)物功能的突變的免疫球蛋白恒定區(qū)連接在一起。圖3(Seq ID No.29)提供一個(gè)嵌合免疫球蛋白重鏈的氨基酸序列，其中鼠源抗MAG重鏈可變區(qū)與一個(gè)功能性免疫球蛋白分泌信號(hào)序列及人類IgG1恒定區(qū)的野生型連接在一起。
從圖1-3提供的信息來看，編碼這些嵌合鏈的cDNA插入序列可通過本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法來制備。簡單地說，用遺傳密碼來確定編碼所需氨基酸的核苷密碼子并創(chuàng)建一個(gè)編碼嵌合蛋白的有效cDNA序列。如果需要在某一特定生物中表達(dá)cDNA插入序列，那么可以根據(jù)已知的密碼子使用偏好來選擇特定的偏好密碼子。然后可通過PCR擴(kuò)增來合成所需要的核苷序列，PCR擴(kuò)增模板含有代表所需序列用作疊連群的重疊的合成寡聚核苷酸。所得產(chǎn)物還可用PCR或誘變來進(jìn)行修飾使其連接上限制性酶切位點(diǎn)，從而使其易于克隆進(jìn)入合適的質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)或進(jìn)一步操作。
實(shí)施例3——ELISA中嵌合抗體與大鼠MAG的結(jié)合含本發(fā)明的輕鏈和重鏈CDR的嵌合抗MAG抗體可通過CHO細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來生產(chǎn)。為此，采用Transfast轉(zhuǎn)染試劑(Promega；E2431)并按制造商說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。簡單地說，在6孔培養(yǎng)板上，每孔加入～106CHO細(xì)胞。第二天，向培養(yǎng)基(Optimeml withGlutamax；Gibco #51985-026)中按1∶1的比例(5μg總DNA)加入編碼適當(dāng)?shù)闹劓溁蜉p鏈的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體DNA并混合。加入Transfast轉(zhuǎn)染試劑并將該溶液轉(zhuǎn)移到長滿細(xì)胞層的板孔中。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)1h后，在DNA/Transfast混合物上鋪上2mlOptimem培養(yǎng)基并置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48-72h。收獲上清，通過離心和經(jīng)過0.2μm濾器過濾來使其澄清。CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清中的抗體濃度用ELISA進(jìn)行測定，估計(jì)約為0.5μg/ml。對(duì)MAG的結(jié)合，可采用商品大鼠MAG-Fc。由于與人類Fc融合，結(jié)合的嵌合抗體不能用抗人IgG第二抗體來檢測。而用抗人類κ輕鏈特異性抗體來代替。圖4顯示的是該嵌合抗體即使在1/64稀釋度時(shí)也能結(jié)合MAG。在本測試中，無關(guān)的人源化抗體和模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)上清不產(chǎn)生任何信號(hào)。
程序ELISA微量滴定板(Nunc Maxisorp)用1μg/ml大鼠MAG-Fc融合蛋白(R&D systems；538-MG)的PBS溶液在4℃包被過夜。用PBS洗板兩次，然后用PBS/BSA(1％w/v)于室溫(室溫)下封閉1h。將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的培養(yǎng)上清用0.2μm濾器過濾，并從上清原液開始用PBS/BSA作連續(xù)稀釋至1/64稀釋度。樣品的各稀釋度于室溫放置1h。然后用PBS/Tween 20(0.1％v/v)洗板三次。檢測抗體為用PBS/BSA稀釋至1/2000的山羊抗人κ輕鏈特異性抗體-過氧化物酶結(jié)合物(Sigma A-7164)。檢測抗體在室溫下保溫1h，并按上述方法洗板。加入底物溶液(Sigma Fast OPD P-9187)，保溫至檢測到適宜的顏色顯示為止，然后用3M H2SO4中止。在490nm處讀取顏色顯示。
實(shí)施例4——人源化抗體修飾抗體包括含有與人類恒定區(qū)連接在一起的人源化可變區(qū)的人源化抗體。本發(fā)明的人源化抗MAG免疫球蛋白鏈的實(shí)例如圖5所示?？缮a(chǎn)采用人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、IgD恒定區(qū)的人源化抗體。
圖5(Seq ID No30)提供一個(gè)人源化免疫球蛋白重鏈的氨基酸序列的實(shí)例，其中人源化抗MAG重鏈可變區(qū)與一個(gè)功能性免疫球蛋白分泌信號(hào)序列及人類IgG1恒定區(qū)的修飾型連接在一起，該修飾型中的Kabat 248和250殘基被突變?yōu)榫彼嵋韵渑cFcγRI和補(bǔ)體蛋白Clq結(jié)合的效應(yīng)物功能(Duncan，A.R.and Winter，G.Localization ofthe Clq binding site on antibodies by surface scanning.Nature 332，738-740，1988.Duncan，A.R.，Woolf，J.M.，Partridge，L.J.，Burton，D.R.and Winter，G.Localization of the binding site for humanFcRl on IgG.Nature 332，563-564，1988)。任選制造該突變以定制修飾抗體的性能來獲取特殊的治療效果——如不激活裂解效應(yīng)物機(jī)制而與抗原的結(jié)合并阻斷的功能。
圖5(Seq ID No.31)還提供一個(gè)人源化免疫球蛋白輕鏈的氨基酸序列的實(shí)施例，其中人源化抗MAG輕鏈可變區(qū)與一個(gè)功能性免疫球蛋白分泌信號(hào)序列及人類κ恒定區(qū)連接在一起。
同樣地，抗MAG可變區(qū)也可與缺少滅活效應(yīng)物功能突變的免疫球蛋白連接在一起。圖5(Seq ID No.32)提供一個(gè)人源化免疫球蛋白重鏈的氨基酸序列，其中人源化抗MAG重鏈可變區(qū)與一個(gè)功能性免疫球蛋白分泌信號(hào)序列及人類IgG1恒定區(qū)的野生型連接在一起。
從圖5提供的信息來看，編碼這些人源化鏈的cDNA插入物可通過本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法來制備。簡單地說，用遺傳密碼來確定編碼所需氨基酸的核苷密碼子和創(chuàng)建編碼該蛋白的有效eDNA序列。如果需要在某一特定生物中表達(dá)cDNA插入物，那么可根據(jù)已知的密碼子使用偏好來選擇特定的偏好密碼子。然后可通過PCR擴(kuò)增來合成所需要的核苷序列，PCR擴(kuò)增模板含代表所需序列用作疊連群的重疊的合成寡聚核苷酸。所得產(chǎn)物還可用PCR或誘變來進(jìn)行修飾以連接上限制性酶切位點(diǎn)，從而使其易于克隆進(jìn)入一合適的表達(dá)或進(jìn)一步操作的質(zhì)粒中。
實(shí)施例5——ELISA中人源化抗體與大鼠和人MAG的結(jié)合1)9種人源化重鏈和輕鏈復(fù)合物與培養(yǎng)上清中標(biāo)準(zhǔn)化量的大鼠MAG-Fc融合蛋白的直接結(jié)合ELISA含本發(fā)明的輕鏈和重鏈CDR的人源化抗MAG抗體可通過CHO細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來生產(chǎn)。為此，使用Transfast轉(zhuǎn)染試劑(Promega；E2431)并按制造商指南進(jìn)行轉(zhuǎn)染。簡單地說，在6孔培養(yǎng)板上每孔加入～106CHO細(xì)胞。第二天向培養(yǎng)基(Optimeml with Glutamax；Gibco#51985-026)中按1∶1的比例(5μg總DNA)加入編碼適當(dāng)重鏈或輕鏈的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體DNA并混合。加入Transfast轉(zhuǎn)染試劑并將該溶液轉(zhuǎn)移到長滿細(xì)胞層的板孔中。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)1h后，在DNA/Transfast混合物上鋪上2ml Optimem培養(yǎng)基并置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48-72h。收獲上清，通過離心和經(jīng)過0.2μm濾器過濾來使其澄清。9種重鏈和輕鏈可變鏈復(fù)合物由下表所示序列生產(chǎn)，而IgG1重鏈恒定區(qū)是Seq.ID.的功能區(qū)。

抗體濃度可用ELISA進(jìn)行測定，用于試驗(yàn)的上清量可標(biāo)準(zhǔn)化至起始濃度為250或500ng/ml(根據(jù)培養(yǎng)上清的濃度而決定)?？乖刹捎蒙唐坊笫驧AG-Fc(R&D Systems；538-MG)。由于與人類Fc融合，結(jié)合的人源化抗體不能用一般的抗人IgG第二抗體來檢測。用抗人類κ輕鏈特異性抗體來代替。圖6顯示的是本實(shí)施例中檢測的所有9種人源化抗體以類似的結(jié)合曲線與大鼠MAG結(jié)合，結(jié)合曲線低至～4ng/ml。雖然不是絕對(duì)，這表明本實(shí)施例中檢測的人源化抗體的親和度與本實(shí)施例中用作對(duì)照的非人源化嵌合抗體的親和度的范圍非常接近。
程序96孔Nunc Maxisorp板用大鼠MAG-Fc融合蛋白(1μg/ml；R&Dsystems；Cat.No.538-MG)的PBS溶液在4℃包被過夜。用含有Tween 20的PBS(0.1％v/v；PBST)洗板兩次，并用含BSA的PBS(1％w/v)于室溫(室溫)下封閉1h。不同含量的培養(yǎng)上清用封閉緩沖液進(jìn)行連續(xù)稀釋，并以約500或250ng/ml的起始濃度加入到封閉的板孔中。上清的抗體濃度基于對(duì)存在于每一培養(yǎng)上清中人源化抗體量的獨(dú)立分析。試驗(yàn)中還包括作為對(duì)照的嵌合小鼠-人(非人源化)抗體?？贵w樣品于室溫下保溫1h，然后用PBST洗板三次。加入用封閉緩沖液稀釋至1/5000的第二抗體(山羊抗人輕鏈特異性抗體-過氧化物酶結(jié)合物；Sigma A-7164)并在室溫下保溫1h。按上述方法洗板三次，加入底物(根據(jù)說明書溶解的OPD片；Sigma P-9187)檢測結(jié)合。觀察顯色反應(yīng)，用3M H2SO4中止反應(yīng)。在490nm處讀取顏色顯示。
2)2種純化的人源化抗MAG抗體重鏈-輕鏈復(fù)合物與大鼠MAG-Fc融合蛋白的直接結(jié)合ELISA由重鏈和輕鏈可變區(qū)復(fù)合物BVh1/CVl1和BVh3/CVl3(表圖5)和序列表SEQ.I.D.NO30所示的IgG1突變恒定區(qū)(它是BVh1/CVl1突變IgG1，本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員能輕易地導(dǎo)出BVh3/CVl3同等物的序列)組成的兩種人源化抗體，可通過實(shí)施例3所述的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的放大形式來生產(chǎn)并用蛋白A親和層析進(jìn)行純化。純化的抗體材料可對(duì)PBS透析，并在OD280讀數(shù)進(jìn)行測定濃度。將抗體濃度調(diào)至5000ng/ml，并在大鼠MAG-Fc結(jié)合ELISA中用于其連續(xù)稀釋。圖7顯示的是純化抗體材料與大鼠MAG-Fc的結(jié)合，并且本實(shí)施例中所檢測的兩種重鏈和輕鏈可變區(qū)復(fù)合物極其相似。
方法96孔Nunc Maxisorp板用大鼠MAG-Fc融合蛋白(2.5μg/ml；R&D systems；Cat.No.538-MG)的PBS溶液在4℃包被過夜。用含有Tween 20的PBS(0.1％v/v；PBST)洗板兩次，并用含BSA的PBS(1％w/v)于室溫(室溫)下封閉1h。純化人源化抗體用封閉緩沖液調(diào)節(jié)至起始濃度為5μg/ml，并進(jìn)行連續(xù)稀釋?？贵w樣品于室溫下保溫1h，然后用PBST洗板三次。加入用封閉緩沖液稀釋至1/5000的第二抗體(山羊抗人輕鏈特異性抗體-過氧化物酶結(jié)合物；Sigma A-7164)并在室溫下保溫1h。按上述方法洗板三次，并加入底物(根據(jù)說明書溶解的OPD片；Sigma P-9187)檢測結(jié)合。觀察顯色反應(yīng)，用3MH2SO4中止反應(yīng)。在490nm處讀取顏色顯示。
結(jié)果不帶有或帶有幾個(gè)骨架區(qū)突變的兩種純化的人源化抗體表現(xiàn)出極為相似地與大鼠MAG的結(jié)合。結(jié)果如圖7所示。
3)兩種人源化重鏈-輕鏈復(fù)合物標(biāo)準(zhǔn)化量的培養(yǎng)上清與CHO細(xì)胞表達(dá)的人MAG的結(jié)合對(duì)與實(shí)施例5 2)所述相同的人源化重鏈和輕鏈復(fù)合物，測試其澄清培養(yǎng)上清與CHO細(xì)胞表面上表達(dá)的人MAG的結(jié)合?；谟蒃LISA測定的抗體濃度對(duì)每種抗體所用的培養(yǎng)上清的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。為此，用山羊抗人IgG(γ)鏈(Sigma I-3382；碳酸氫鹽緩沖液pH9.6；2μg/ml)于4℃包被96孔板(Nunc Maxisorp)過夜。第二天用洗滌緩沖液(PBST)洗板兩次，并加入至少75μl封閉緩沖液(含BSA的PBS，1％w/v)于室溫(室溫)下封閉1h。對(duì)抗體樣品液用封閉緩沖液進(jìn)行等分連續(xù)稀釋(起始稀釋度為原液或1/2)?？贵w標(biāo)準(zhǔn)品為一種非相關(guān)特異性已知濃度的純化人源化IgG1。也對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液在板上作連續(xù)稀釋，起始濃度為500ng/ml。所有抗體溶液于室溫下保溫1h。按上述方法洗板三次，然后與用封閉緩沖液稀釋成1/5000的山羊抗人輕鏈(κ)特異性抗體(游離或結(jié)合的)-過氧化物酶結(jié)合物(SigmaA-7164)共同在室溫下保溫1h。再次按上述方法洗板三次，并與底物(OPD片；Sigma P-9187)一起保溫至顯很深的顏色。加入3M H2SO425μl中止顯色反應(yīng)，在490nm下讀板。
圖8顯示本實(shí)施例中測試的兩種抗體都能識(shí)別人MAG并且其結(jié)合特性非常相似。CHO/-為無MAG表達(dá)的陰性對(duì)照CHO細(xì)胞。
基于細(xì)胞的Eu ELISA方法在96孔板(Costar 3595)上每孔加入100μl細(xì)胞懸液(推薦在第1、2、3或4天進(jìn)行測試的細(xì)胞數(shù)目參見下表)。

移去培養(yǎng)基，用含F(xiàn)CS(10％)、BSA(1％)、NaN3(1％)的DMEM/F12(Sigma D6421；封閉緩沖液)于室溫對(duì)板封閉1h。然后去除封閉溶液，加入樣品(溶于封閉緩沖液，50μl/孔)。樣品于4℃保溫1h。然后在Skatron洗板機(jī)上用PBS洗板三次。洗滌后，用0.5％多聚甲醛(用PBS稀釋)于4℃對(duì)細(xì)胞固定20分鐘，再次按上述方法洗滌。每孔加入50μl用銪緩沖液(50mM Tris堿、150mM NaCl、0.5％BSA、0.1g/l Tween 20、7.86mg/l DTPA，pH7.3)稀釋的銪結(jié)合第二抗體并于4℃保溫1h。
按上述方法洗板并每孔加入200μl Delphia增強(qiáng)溶液。于室溫下保溫5-10分鐘。于24小時(shí)內(nèi)在Victor酶標(biāo)儀上讀板。
4)兩種純化的人源化抗體和非人源化大鼠單克隆抗體與大鼠MAG-Fc融合蛋白的競爭ELISA方法96孔Nunc Maxisorp板用大鼠MAG-Fc融合蛋白(2.5μg/ml；R&D systems；Cat.No.538-MG)的PBS溶液在4℃包被過夜。用含有Tween 20的PBS(0.1％v/v；PBST)洗板兩次，并用含BSA的PBS(1％w/v)于室溫(室溫)下封閉1h。將純化的人源化抗體調(diào)節(jié)至濃度為200ng/ml，并與等體積的用封閉緩沖液稀釋至范圍為6000-0ng/ml制成的競爭性分子混合。競爭物為相同濃度(僅為BVh1/CVh1)的親本單克隆抗體(抗MAG)或非相關(guān)大鼠單克隆抗體(INN1)。抗體/競爭物溶液于室溫下保溫1h，然后用PBST洗板三次。加入用封閉緩沖液稀釋至1/5000的第二抗體(山羊抗人輕鏈特異性抗體-過氧化物酶結(jié)合物；Sigma A-7164)并在室溫下保溫1h。按上述方法洗板三次，并加入底物(根據(jù)說明書溶解的OPD片；Sigma P-9187)檢測結(jié)合。在490nm處讀取顏色顯示。
結(jié)果兩種純化抗體制品都同等地被原始大鼠單克隆抗體所競爭，而不被具有非相關(guān)特異性的大鼠單克隆抗體所競爭——參見圖9。這表明原始大鼠單克隆抗體與本實(shí)施例測試的人源化抗體可能識(shí)別相同的表位并可能具有類似的對(duì)大鼠MAG的親和力。
權(quán)利要求
1.一種修飾抗體或其功能片段，所述修飾抗體或其功能片段結(jié)合并中和MAG，而且含有一個(gè)或多個(gè)下列CDR輕鏈CDR
重鏈CDR
。
2.一種修飾抗體或其功能片段，所述修飾抗體或其功能片段含有重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)含有一個(gè)或多個(gè)選自CDRH1、CDRH2和CDRH3的CDR，所述輕鏈可變區(qū)含有一個(gè)或多個(gè)選自CDRL1、CDRL2和CDRL3的CDR。
3.一種修飾抗-Mag抗體或其功能片段，所述修飾抗體或其功能片段含有重鏈可變區(qū)(VH)，其序列中含有高變區(qū)CDRH1、CDRH2和CDRH3；和/或輕鏈可變區(qū)(VL)，其序列中含有高變區(qū)CDRL1、CDRL2和CDRL3。
4.權(quán)利要求3的抗體，所述抗體為單克隆抗體。
5.權(quán)利要求4的抗體，所述抗體為人源化抗體。
6.權(quán)利要求5的抗體或其功能片段，所述抗體或其功能片段含有包含一種下列氨基酸序列的重鏈可變區(qū)QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAPNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID No 13).QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSS (Sequence ID No 14)QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFINYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTATYFCARNPINYYGINYEGYVMDYWGQGTLVTVSS (sequence ID No 15)。
7.權(quán)利要求6的抗體或其功能片段，所述抗體或其功能片段還含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)含有氨基酸序列Sequence ID No 16、17、18或19DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV(SEQ ID No 16)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIINLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV (SEQ ID No 12)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLHTEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV (SEQ ID No 18)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSHSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIINLHTEDVAVYYCHQYLSSLTFGQGTKLEIKRTV (SEQ ID No 19)。
8.權(quán)利要求6-7任一項(xiàng)的抗體，所述抗體含有包含序列SEQ ID No 13、14或15的重鏈可變區(qū)片段以及人類重鏈恒定區(qū)部分或其片段；和包含序列SEQ ID No 16、17、18或19的輕鏈可變區(qū)片段以及人類輕鏈恒定區(qū)部分或其片段。
9.任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的人源化抗體，所述抗體選自含有下述區(qū)段的抗體含有SEQ ID No 13的重鏈可變區(qū)以及含有SEQ ID No 16的輕鏈可變區(qū)；含有SEQ ID No 13的重鏈可變區(qū)以及含有SEQ ID No 17的輕鏈可變區(qū)；含有SEQ ID No 13的重鏈可變區(qū)以及含有SEQ ID No 18的輕鏈可變區(qū)；含有SEQ ID No 13的重鏈可變區(qū)以及含有SEQ ID No 19的輕鏈可變區(qū)；含有SEQ ID No 14的重鏈可變區(qū)以及含有SEQ ID No 16的輕鏈可變區(qū)；含有SEQ ID No 14的重鏈可變區(qū)以及含有SEQ ID No 17的輕鏈可變區(qū)；含有SEQ ID No 14的重鏈可變區(qū)以及含有SEQ ID No 18的輕鏈可變區(qū)；含有SEQ ID No 14的重鏈可變區(qū)以及含有SEQ ID No 19的輕鏈可變區(qū)；含有SEQ ID No 15的重鏈可變區(qū)以及含有SEQ ID No 16的輕鏈可變區(qū)；含有SEQ ID No 15的重鏈可變區(qū)以及含有SEQ ID No 17的輕鏈可變區(qū)；含有SEQ ID No 15的重鏈可變區(qū)以及含有SEQ ID No 18的輕鏈可變區(qū)；含有SEQ ID No 15的重鏈可變區(qū)以及含有SEQ ID No 19的輕鏈可變區(qū)。
10.一種編碼含Sequence ID No 15的重鏈可變區(qū)的多核苷酸，其為CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA。
11.一種編碼氨基酸序列Sequence ID No 14的多核苷酸序列，其為CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTTCTGTGCGAGAAACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA。
12.一種編碼氨基酸序列Sequence ID No 15的多核苷酸序列，其為CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTACGGCATGAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCCACCTACGCCGACGACTTCACCGGCCGGTTTGTCTTCTCCTTGGACACCTCTGTCAGCACGGCATATCTGCAGATCAGCAGCCTAAAGGCTGAGGACACTGCCACCTATTTCTGTGCGAGAAACCCCATCAACTACTACGGCATCAACTACGAGGGCTACGTGATGGACTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCA。
13.一種編碼氨基酸序列Sequence ID No 16的多核苷酸，其為GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG。
14.一種編碼氨基酸序列SEQ ID No 17的多核苷酸序列，其為GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCATCAACCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG。
15.一種編碼氨基酸序列SEQ ID No 18的多核苷酸，其為GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCACAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCACACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG。
16.一種編碼氨基酸序列SEQ ID No 15的多核苷酸，其為GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCGTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCATCAACCTGCACACCGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTG。
17.一種藥用組合物，其包含權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的修飾抗MAG抗體或其功能片段以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體。
18.一種治療或預(yù)防人類中風(fēng)及其它神經(jīng)疾病/紊亂的方法，所述方法包括給予所述有需要病人有效劑量的權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的抗MAG抗體，所述抗體包括修飾抗體或其功能片段。
19.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)抗MAG抗體，包括修飾抗體或其功能片段，在制備治療或預(yù)防中風(fēng)和其它神經(jīng)疾病/紊亂的藥物中的應(yīng)用。
20.一種在罹患或有危險(xiǎn)罹患中風(fēng)或其它神經(jīng)疾病/紊亂的病人中抑制神經(jīng)退變和/或促進(jìn)功能恢復(fù)的方法，所述方法包括給予所述有需要病人有效劑量的權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的抗MAG抗體，所述抗體包括修飾抗體或其功能片段。
21.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的抗MAG抗體，包括修飾抗體或其功能片段，在制備罹患或有危險(xiǎn)罹患中風(fēng)或其它神經(jīng)疾病/紊亂的病人中抑制神經(jīng)退變和/或促進(jìn)功能恢復(fù)的藥物中的應(yīng)用。
22.一種治療或預(yù)防人類中風(fēng)或其它神經(jīng)疾病/紊亂的方法，所述方法包括胃腸道外給予所述病人治療有效劑量的抗MAG抗體的步驟。
23.權(quán)利要求22的方法，其中抗MAG抗體經(jīng)靜脈給藥。
24.權(quán)利要求18、20或24任一項(xiàng)的方法，其中其它神經(jīng)疾病/紊亂選自外傷性腦損傷、脊髓損傷、阿耳茨海默氏病、額顳性癡呆、周圍神經(jīng)病、帕金森氏病、杭廷頓氏舞蹈病和多發(fā)性硬化癥。
25.一種促進(jìn)軸突發(fā)芽的方法，所述方法包括使人軸突接觸權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的抗MAG抗體的步驟。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述方法為體外方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)的修飾抗體、含有所述抗體的藥物制劑以及所述抗體在神經(jīng)疾病/紊亂的治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K16/28GK1671417SQ03818477
公開日2005年9月21日 申請(qǐng)日期2003年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月6日
發(fā)明者J·H·艾利斯, V·格爾馬謝夫斯基 申請(qǐng)人:葛蘭素集團(tuán)有限公司