專利名稱：經(jīng)由體細(xì)胞胚胎發(fā)生的質(zhì)體遺傳工程的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域涉及植物質(zhì)體遺傳工程。更具體的是，本發(fā)明涉及通過質(zhì)體轉(zhuǎn)化來轉(zhuǎn)化非綠色植物細(xì)胞，以及隨后通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生來再生非綠色植物細(xì)胞。
背景技術(shù)：
因?yàn)榫哂腥舾捎形Φ挠欣麠l件，包括高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)(Daniell等人，2002)、單一轉(zhuǎn)化事件中的多基因改造(DeCosa等人，2001；Ruiz等人，2003；Daniell & Dhingra，2002)、經(jīng)由母系遺傳的轉(zhuǎn)基因限制(Daniell2002)、基因沉默的缺乏(Lee等人，2003；DeCosa等人，2001)、位點(diǎn)特異的轉(zhuǎn)基因整合導(dǎo)致的位置效應(yīng)(Daniell等人，2002)和多重效應(yīng)(Daniell等人，2001；Lee等人，2003)，因此質(zhì)體對于遺傳工程而言是理想的。葉綠體遺傳工程最適合高表達(dá)疫苗抗原和生產(chǎn)有價(jià)值的治療蛋白質(zhì)。自從我們展示了用于各種生物醫(yī)學(xué)用途的人彈性蛋白衍生聚合物的表達(dá)(Guda等人，2000)，我們已將這一方法拓展到表達(dá)霍亂、炭疽的疫苗抗原(Daniell等人，2001，Daniell 2003)、單克隆抗體(Daniell等，2001)和人的治療蛋白質(zhì)，包括人血清白蛋白(Fernandez等，2003)、爪蟾抗菌肽(DeGray等，2001)、干擾素(Daniell，2003)和胰島素樣生長因子(Daniell，2003)。一些別的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因葉綠體中表達(dá)了人生長激素干擾素-GUS(Human Somatotropin Interferon-GUS)融合蛋白質(zhì)來提高穩(wěn)定性(Reddy等人，2003)并在轉(zhuǎn)基因葉綠體中表達(dá)了破傷風(fēng)疫苗抗原(Tregoning等人，2003)。毫無例外，所有這些治療蛋白質(zhì)都被表達(dá)于轉(zhuǎn)基因煙草葉綠體中，符合各種環(huán)境團(tuán)體針對用于植物來源藥物的食品作物倡儀的零容許度(zero-tolerance)。
然而，迫切需要治療性蛋白質(zhì)和疫苗抗原的口服遞送來大大降低它們的生產(chǎn)、純化、儲存和運(yùn)輸成本，并最小化與靜脈給藥相關(guān)的并發(fā)癥。因?yàn)轱嬍持泻}卜是優(yōu)異的糖、維生素A、C和纖維的來源，胡蘿卜(Daucuscarota L.)成為全球范圍內(nèi)人和動(dòng)物食用的最重要的蔬菜之一。胡蘿卜是兩年生植物，在兩年內(nèi)完成其生命周期。在第一年植物產(chǎn)生可食的肉質(zhì)主根。如果將其留在地里，在經(jīng)過一個(gè)寒冷的季節(jié)后，植物于第二年開花(Yan，W.& Hunt，L.A Reanalysis of Vernalization Data of Wheat and Carrot，Annals of Botany 84，615-619(1999))。另外，種植的胡蘿卜作物的葉綠體基因組嚴(yán)格通過母系遺傳傳遞(Vivek等人1999)。因此，胡蘿卜在環(huán)境上是安全的，并且通過雙重保護(hù)阻止了轉(zhuǎn)基因經(jīng)由花粉和種子的流動(dòng)，從而符合對食品作物中的轉(zhuǎn)基因流動(dòng)提出的零容許度倡儀。胡蘿卜體細(xì)胞胚是單細(xì)胞來源的，通過循環(huán)的胚胎發(fā)生擴(kuò)增；這提供了一致的細(xì)胞培養(yǎng)物來源，這一點(diǎn)是生產(chǎn)治療蛋白質(zhì)的必要條件之一(均一單一來源)。使用生物反應(yīng)器，胡蘿卜細(xì)胞迅速分裂并產(chǎn)生大量的生物量。培養(yǎng)的胡蘿卜細(xì)胞是可食的，并可以被直接用于遞送精確劑量的疫苗抗原或生物藥物。當(dāng)經(jīng)由可食胡蘿卜進(jìn)行給藥時(shí)不需要烹飪，這將保持治療蛋白質(zhì)在食用過程中的結(jié)構(gòu)完整性。在培養(yǎng)基中能長期生存的、包裹的胚可以作為人工種子用于低溫儲藏和有控制的萌發(fā)(Tessereau，H.，B.Florin，M.C.Meschine，C.Thierry和V.Petiard，1994)。因此，具有增加的醫(yī)學(xué)或營養(yǎng)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因胡蘿卜能夠在改善人或動(dòng)物的健康方面扮演至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。
然而，要改造胡蘿卜基因組必須克服幾個(gè)主要的障礙。迄今為止，僅使用過含有大葉綠體的綠葉作為外植體來轉(zhuǎn)化葉綠體基因組。第一個(gè)挑戰(zhàn)是向小的前質(zhì)體引入外源DNA并鑒定在非綠色質(zhì)體中具有功能的適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列和選擇標(biāo)記。第二個(gè)挑戰(zhàn)是經(jīng)由體細(xì)胞胚胎發(fā)生再生葉綠體轉(zhuǎn)基因植物并實(shí)現(xiàn)同質(zhì)性(homoplasmy)，這一點(diǎn)不具有當(dāng)使用葉作為外植體時(shí)由器官發(fā)生提供的可以進(jìn)行隨后循環(huán)選擇的好處。由于這些原因，葉綠體遺傳工程僅在除煙草之外的一些茄科作物中被完成，如番茄(Ruf等人，2001)和馬鈴薯(Sidorov等人，1999)，但是后一作物保持不育。即使再生可能從綠葉經(jīng)由器官發(fā)生實(shí)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化非茄科作物仍然是一挑戰(zhàn)。例如，擬南芥屬(Arabidopsis)轉(zhuǎn)基因植物是不育的(Sidkar等人，1998)，而在油菜作物中甚至穩(wěn)定的整合和同質(zhì)性都不能實(shí)現(xiàn)(Bing Kai Hou等人，2003)。
表1顯示在葉綠體中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的發(fā)展例表。
表1葉綠體中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)



發(fā)明概述本發(fā)明一方面描述運(yùn)用高效率的轉(zhuǎn)化胡蘿卜質(zhì)體的方法，通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生來轉(zhuǎn)化質(zhì)體的方法。本發(fā)明的其它方面還提供能夠通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生來轉(zhuǎn)化質(zhì)體的載體。另一方面還提供轉(zhuǎn)化的質(zhì)體、植物和植物部分，它們已經(jīng)通過這里描述的方法和載體，經(jīng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生被轉(zhuǎn)化。
本申請結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)為改造若干主要作物的質(zhì)體基因組(其中，通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生介導(dǎo)再生)，提供了必要的指導(dǎo)和教導(dǎo)。谷類作物(小麥、稻、玉米、甘蔗)、豆類(大豆、苜蓿)、油料作物(向日葵、橄欖)、經(jīng)濟(jì)作物(棉花、咖啡、茶、橡膠、亞麻、栓皮櫟、松樹)、蔬菜(茄子、黃瓜、木薯、辣椒、蘆筍等)、水果(蘋果、櫻桃、香蕉、大蕉、瓜類、葡萄、番石榴)、堅(jiān)果(腰果、胡桃、花生)和樹(海棗等)可以通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)行再生。本發(fā)明的另一方面展示使用同樣的引物(通用質(zhì)體引物)構(gòu)建用于多種不同物種的葉綠體載體。
附圖簡述

圖1(A-B)顯示胡蘿卜葉綠體轉(zhuǎn)化載體的物理圖譜。
圖1(A)顯示胡蘿卜葉綠體轉(zhuǎn)化載體pDD-Dc-gfp/BADH，該載體攜帶分別處于T7的基因10 5’非翻譯區(qū)(UTR)/rps 16 3’UTR和PpsbA 5’及3’UTR調(diào)節(jié)之下表達(dá)的gfp和BADH基因。具有PEP和NEP識別位點(diǎn)的16S r-RNA基因的Prrn啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)該盒子的表達(dá)。
圖1(B)顯示攜帶aadA和BADH基因的胡蘿卜葉綠體轉(zhuǎn)化載體pDD-Dc-aadA/BADH。aadA基因的表達(dá)處于Shine-Dalgarno序列和psbA3’UTR的調(diào)節(jié)之下，而BADH的表達(dá)受基因10 5’和rps 16 3’UTR調(diào)節(jié)。顯示了用作轉(zhuǎn)基因植物Southern分析探針的AflIII/PvuII消化的約4.9kbDNA片段和用來確證轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)胡蘿卜質(zhì)體的3P/3M和16SF/1M引物的著陸點(diǎn)(landing site)。
圖2(A-C)顯示用葉綠體載體pDD-Dc-gfp/BADH轉(zhuǎn)化的胡蘿卜培養(yǎng)物中GFP的表達(dá)；在488納米藍(lán)色氬氣(激光)的激發(fā)下，于共聚焦熒光顯微鏡下可見發(fā)出綠色熒光。
圖2(A)顯示未轉(zhuǎn)化的對照胡蘿卜培養(yǎng)物，圖2(B)顯示轉(zhuǎn)化的胚性愈傷組織(embryogenic calli)，圖2(C)顯示轉(zhuǎn)化的胡蘿卜胚性愈傷組織分化成球形體細(xì)胞胚和圖2(D)顯示分化進(jìn)入子葉階段的體細(xì)胞胚。
圖3(A-D)表示相對于黃色非轉(zhuǎn)基因胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)物可以目視挑選綠色轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
圖3(A-B)表示由于表達(dá)BADH而變成綠色的轉(zhuǎn)基因胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)物(A盤)，而野生型培養(yǎng)物保持黃色(B盤)。當(dāng)異質(zhì)性(heteroplasmic)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系被置于沒有任何選擇試劑的培養(yǎng)基中時(shí)，可以根據(jù)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)物相對于黃色非轉(zhuǎn)基因胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)物為綠色的，而區(qū)分轉(zhuǎn)基因胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)物(C盤和D盤)。
圖4(A-C)表示通過PCR和Southern印跡分析確證轉(zhuǎn)基因(aadA和badh)整合進(jìn)胡蘿卜質(zhì)體基因組。
圖4(A)表示使用內(nèi)部引物3P(在側(cè)翼序列上著陸)和3M(在aadA基因上著陸)，在64℃的退火溫度下擴(kuò)增出約1.65kb大小的PCR產(chǎn)物，確證轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)植物細(xì)胞系。
圖4(B)表示使用16SF引物(在天然葉綠體基因組上著陸)和1M引物(在aadA基因上著陸)，在64℃的退火溫度下擴(kuò)增出約2.5kb大小的PCR產(chǎn)物，確證轉(zhuǎn)基因的質(zhì)體特異整合。泳道2代表來自非轉(zhuǎn)基因胡蘿卜細(xì)胞的DNA，泳道2-9代表來自幾個(gè)轉(zhuǎn)基因胡蘿卜細(xì)胞系的DNA。引物對(3P/3M和16SF/1M)的引物著陸位點(diǎn)示于圖1B。
圖4(C)表示未被轉(zhuǎn)化和被載體pDD-Dc-aadA/BADH轉(zhuǎn)化的胡蘿卜質(zhì)體基因組的southern印跡分析。用AflIII和PvuII消化胡蘿卜基因組DNA(每泳道5μg)并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，與放射性標(biāo)記的4.9kb P32DNA探針(含有2.4kb側(cè)翼序列和2.5kb轉(zhuǎn)基因序列，見圖1B)雜交。泳道1，來自未被轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物的對照DNA顯現(xiàn)出2.4kb大小的條帶，而泳道2中來自細(xì)胞系1的異質(zhì)性轉(zhuǎn)基因植物顯現(xiàn)出兩個(gè)條帶。通過在液體培養(yǎng)基中反復(fù)的傳代培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞從不同細(xì)胞系獲得同質(zhì)性的轉(zhuǎn)基因植物(泳道3-8)。
圖5(A-B)表示在未被轉(zhuǎn)化和被質(zhì)體載體pDD-Dc-aadA/BADH轉(zhuǎn)化的胡蘿卜的蛋白質(zhì)提取物中分析BADH酶活力(nmol/min/mg/蛋白質(zhì))和BADH表達(dá)。
圖5(A)表示在甜菜醛存在的情況下，根據(jù)NADH的形成，在340nm分析依賴于NAD+的BADH酶的還原作用。在未被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞懸浮液(U)、胡蘿卜根(U)和葉(U)中檢測到了非常低的BADH活力。另一方面，在轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細(xì)胞懸浮液(T)和根(T)中記錄到相對于葉(T)組織分別約54％和72％的高BADH活力。
圖5(B)表示通過western印跡分析BADH表達(dá)。從轉(zhuǎn)化和未被轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)物、根和葉組織制備全細(xì)胞提取物，從每一樣品取50μg的總可溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行10％SDS-PAGE，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到Imnuno-blotTMPVDF膜并與多克隆抗-BADH血清(制備于兔子中的抗天然BADH抗血清)雜交。使用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二級抗體檢測抗原肽。泳道1、2、3含有來自未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)物、根和葉的全胡蘿卜提取物，泳道4、5、6含有來自轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)物、根和葉的全胡蘿卜提取物。與葉(泳道6)相比，轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞(泳道4)和根(泳道5)表達(dá)的BADH蛋白質(zhì)分別約少50％和25％。
圖6(A-C)表示不同的鹽濃度對未被轉(zhuǎn)化和被葉綠體載體pDD-Dc-aadA/BADH轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物生長的影響。
圖6(A)表示未轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)物干物質(zhì)。
圖6(B)表示產(chǎn)生于含有100mM NaCl的液體培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)物。
圖6(C)表示鹽存在情況下對BADH活力的刺激。以懸浮培養(yǎng)物形式將未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細(xì)胞在含有0、100、200和300mM NaCl的液體培養(yǎng)基中以速度130rpm于搖床上振蕩兩周。當(dāng)液體培養(yǎng)基中含有100和200mM NaCl時(shí)，在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察到了提高的BADH活力水平。
圖7表示鹽(100-500mM NaCl)對未轉(zhuǎn)化(U)和轉(zhuǎn)化的(T)胡蘿卜植物的影響。轉(zhuǎn)基因植物在不同濃度的NaCl下被測試一個(gè)月。持續(xù)四周隔天使用含有不同濃度NaCl的水灌溉植物。
圖8表示質(zhì)粒pDD-Ta-aphA-6/nptII。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescript II KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc以及來自小麥(Triticum aestivum)的側(cè)翼區(qū)域(Ta)的pDA-76(aphA-6/nptII表達(dá)盒)。
圖9表示質(zhì)粒pDD-So-aphA-6/nptII。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescript II KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc以及來自甘蔗(Saccharum officinarum)的側(cè)翼區(qū)域(So)的pDA-76(aphA-6/nptII表達(dá)盒)。
圖10表示質(zhì)粒pDD-Dc-aphA-6/nptII。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescript II KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc和來自胡蘿卜(Daucus carota)的側(cè)翼區(qū)域(Dc)的pDA-76(aphA-6/nptII表達(dá)盒)。
圖11表示質(zhì)粒pDD-Dc-aadA/BADH。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescript II KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/壯觀霉素/XL-1 Blue MRF′Tc和來自胡蘿卜(Daucus carota)的側(cè)翼區(qū)域(Dc)的pDA-29(aadA/BADH表達(dá)盒)。
圖12表示質(zhì)粒pDD-Dc-gfp/BADH。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescript II KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/Kan/XL-1Blue MRF′Tc和來自胡蘿卜(Daucus carota)的側(cè)翼區(qū)域(Dc)的pDA-30(gfp/BADH表達(dá)盒)。
圖13表示質(zhì)粒pDD-Gh-aphA-6/nptII。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescript II KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc和來自陸地棉(Gossypium hirsutum)的側(cè)翼區(qū)域(Gh)的pDA-76(aphA-6/nptII表達(dá)盒)。
圖14表示質(zhì)粒pDD-Gh-aadA/BADH。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescript II KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/壯觀霉素/XL-1 Blue MRF′Tc和來自陸地棉(Gossypium hirsutum)的側(cè)翼區(qū)域(Gh)的pDA-29(aadA/BADH表達(dá)盒)。
圖15表示質(zhì)粒pDD-Gh-gfp/BADH。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescript II KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/XL-1 BlueMRF′Tc和來自陸地棉(Gossypium hirsutum)的側(cè)翼區(qū)域(Gh)的pDA-30(gfp/BADH表達(dá)盒)。
圖16表示質(zhì)粒pDD-Zm-aadA/BADH。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescript II KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/壯觀霉素XL-1 Blue MRF′Tc和來自玉米(Zea mays)的側(cè)翼區(qū)域(Zm)的pDA-29(aadA/BADH表達(dá)盒)。
圖17表示質(zhì)粒pDD-Zm-gfp/BADH。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescript II KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/XL-1 BlueMRF′Tc和來自玉米(Zea mays)的側(cè)翼區(qū)域(Zm)的pDA-30(gfp/BADH表達(dá)盒)。
圖18表示質(zhì)粒pDD-Zm-aphA-6/nptII。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescript II KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc和來自玉米(Zea mays)的側(cè)翼區(qū)域(Zm)的pDA-76(aphA-6/nptII表達(dá)盒)。
圖19表示質(zhì)粒pDD-Pv-aphA-6/nptII(柳枝稷)。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescript II KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc和來自柳枝稷(Panicum virgatum)的側(cè)翼區(qū)域(Pv)的pDA-76(aphA-6/nptII表達(dá)盒)。
圖20表示質(zhì)粒pDD-Pv-aadA/BADH(柳枝稷)。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescript II KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/壯觀霉素XL-1 Blue MRF′Tc和來自柳枝稷(Panicum virgatum)的側(cè)翼區(qū)域(Pv)的pDA-29(aadA/BADH表達(dá)盒)。
圖21表示質(zhì)粒pDD-Cd-aphA-6/nptII(狗牙根)。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescriptII KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc和來自狗牙根(Cynodon dactylon)的側(cè)翼區(qū)域(Cd)的pDA-76(aphA-6/nptII表達(dá)盒)。
圖22表示質(zhì)粒pDD-Nt-aphA-6/nptII。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescript II KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc和來自煙草(Nicotiana tabacum)的側(cè)翼區(qū)域(Nt)的pDA-76(aphA-6/nptII表達(dá)盒)。
圖23表示質(zhì)粒pDD-Os-aphA-6/nptII。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescript II KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′ Tc和來自稻(Oryza sativa)的側(cè)翼區(qū)域(Os)的pDA-76(aphA-6/nptII表達(dá)盒)。
圖24表示質(zhì)粒pDA-66。更具體地，此質(zhì)粒描述了psbA 5’UTRBACKBONE VECTOR pUC 19，它是pLD-CtV基本載體(修飾的MCS)的衍生物，具有選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc和來自煙草的側(cè)翼區(qū)域。
圖25表示質(zhì)粒pDD-Ta-aadA/BADH。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescript II KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/壯觀霉素XL-1 Blue MRF′Tc和來自普通小麥(Triticum aestivum)的側(cè)翼區(qū)域(Ta)的pDA-29(aadA/BADH表達(dá)盒)。
圖26表示質(zhì)粒pDD-Ta-gfp/BADH。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescript II KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/XL-1 BlueMRF′Tc和來自小麥(Triticum aestivum)的側(cè)翼區(qū)域(Ta)的pDA-30(gfp/BADH表達(dá)盒)。
圖27表示質(zhì)粒pDD-Hv-aphA-6/nptII。更具體地，此質(zhì)粒描述了具有載體pBluescript II KS的骨架、選擇性標(biāo)記/宿主細(xì)胞氨芐青霉素/Kan/XL-1 Blue MRF′Tc和來自大麥(Hordeum vulgare)的側(cè)翼區(qū)域(Hv)的pDA-76(aphA-6/nptII表達(dá)盒)。
圖28是本文所述具有aphA-6和aphA-2基因的雙管質(zhì)體載體(DoubleBarreled Plastid Vector)的圖解示意圖，其中，所述兩個(gè)基因賦予抗氨基糖苷抗性。
圖29A和30A說明玉米葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建，其中使用PCR擴(kuò)增側(cè)翼區(qū)域?？寺CR產(chǎn)物并將表達(dá)盒插入trnI/trnA基因之間的轉(zhuǎn)錄活性間隔區(qū)域。圖30A的表達(dá)盒具有驅(qū)動(dòng)GFP和BADH表達(dá)的Prrn啟動(dòng)子，GFP和BADH的表達(dá)分別被(5’)基因10/rpsl6 3’和psbA 5’/3’UTRs調(diào)節(jié)。31A的表達(dá)盒具有驅(qū)動(dòng)aadA和BADH表達(dá)的Prrn啟動(dòng)子，BADH基因被(5’)基因10/rpsl6 3’UTR調(diào)節(jié)。
圖29B和30B表示在大腸桿菌中測試玉米葉綠體轉(zhuǎn)化載體中的基因的功能。為了觀察GFP的表達(dá)，細(xì)胞被鋪于LB瓊脂(Amp)平板上，并在37℃孵育過夜。如在圖30B中所見，當(dāng)暴露于紫外光時(shí)，具有pDD34-ZM-GFP-BADH的細(xì)胞顯示熒光。為了測試aadA基因表達(dá)，具有pDD33-ZM-aadA-BADH質(zhì)粒的細(xì)胞被鋪于含有壯觀霉素(100mg/ml)的LB瓊脂平板上，并在37℃孵育過夜。如在圖31B中所見，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能在壯觀霉素中生長。
圖31表示在共聚焦顯微鏡下研究的玉米胚發(fā)生培養(yǎng)物中GFP的表達(dá)。圖32A是非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，而圖32B-C是轉(zhuǎn)化的玉米胚性愈傷組織。通過將轟擊后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有BA或壯觀霉素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于轟擊后2天開始圖30-31中的選擇。八周后在熒光立體顯微鏡和共聚焦顯微鏡下檢測來自不同轟擊實(shí)驗(yàn)的若干健康生長的愈傷組織的GFP表達(dá)。在含有BA或壯觀霉素的玉米再生培養(yǎng)基中自體細(xì)胞胚進(jìn)行再生。
圖32(A-B)表示在含有壯觀霉素或甜菜醛的再生培養(yǎng)基上的玉米植株。圖32A展示了能夠在指示轉(zhuǎn)基因玉米的構(gòu)建的選擇性試劑中生長的玉米葉綠體轉(zhuǎn)基因植物，而未被轉(zhuǎn)化的玉米植物不能在選擇性培養(yǎng)基中生長。
圖32B表示使用適當(dāng)引物通過PCR確證葉綠體轉(zhuǎn)基因植物。泳道1-3為pDD34-ZM-gfp-BADH轉(zhuǎn)化的植物，泳道4-5為pDD33-ZM-aadA-BADH轉(zhuǎn)化的植物。泳道-和+分別表示陰性或陽性對照。從葉組織分離基因組DNA，使用適當(dāng)?shù)囊飳D(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的組織進(jìn)行PCR。
圖33(A-C)表示用葉綠體載體pDD-C-aphA6/aphA2轉(zhuǎn)化的棉花培養(yǎng)物(陸地棉栽培品種Coker310FR)；在補(bǔ)充有50mg/l卡那霉素的培養(yǎng)基MST1(0.1mg/l 2，4-D和0.5mg/l激動(dòng)素)上進(jìn)行篩選。
圖33(A)表示未被轉(zhuǎn)化的對照棉花愈傷組織。
圖33(B)表示轉(zhuǎn)化的原代棉花愈傷組織。
圖33(C)表示從轉(zhuǎn)基因原代棉花愈傷組織傳代培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化的棉花愈傷組織(B盤)。
圖34(A-B)表示通過PCR確證轉(zhuǎn)基因(aphA6和aphA2)整合進(jìn)了棉花質(zhì)體基因組。
圖34(A)表示使用內(nèi)部引物3P(在側(cè)翼序列上著陸)和aphA6-rev(在aphA6基因上著陸)，以64℃為退火溫度，擴(kuò)增出約1.7kb大小的PCR產(chǎn)物，證明轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)棉花愈傷組織。
圖34(B)表示使用引物16SF(在天然葉綠體基因組上著陸)和aphA6-rev(在aphA6基因上著陸)，以64℃為退火溫度，產(chǎn)生約2.5kb大小的PCR產(chǎn)物，證明轉(zhuǎn)基因的質(zhì)體特異性整合。泳道1表示1kb Plus分子標(biāo)記(梯度)。泳道2代表來自非轉(zhuǎn)基因棉花愈傷組織的DNA，泳道3代表在50mg/l卡那霉素上選擇的轉(zhuǎn)基因棉花愈傷組織的DNA。
圖35表示aadA/BADH表達(dá)盒的序列(SEQ ID No.1)。
圖36表示gfp/BADH表達(dá)盒的序列(SEQ ID No.2)。
圖37表示aphA-6/nptII表達(dá)盒的序列(SEQ ID No.3)。
圖38為一般性質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體的圖解示意圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明的一方面提供從植物細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)由體細(xì)胞胚胎發(fā)生再生的同質(zhì)性植物。本發(fā)明的另一方面是能夠用于非綠色外植體的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體，其中，所述外植體能導(dǎo)致植物細(xì)胞的體細(xì)胞胚胎發(fā)生。而本發(fā)明的另一方面為在植物的非綠色可食部分中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)。本發(fā)明的另一些方面描述了單子葉植物、豆類、蔬菜、水果作物的轉(zhuǎn)化和在這些植物的非綠色部分中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。本發(fā)明的另一方面在于使用適于轉(zhuǎn)化植物非綠色部分的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體來表達(dá)異源蛋白質(zhì)。在其它方面，提供轉(zhuǎn)化質(zhì)體基因組以便通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生來表達(dá)異源蛋白質(zhì)的方法，以及表達(dá)目的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化植物和它們的后代。本發(fā)明的再一方面是將外源DNA引入植物小的前質(zhì)體中，以及鑒定在非綠色質(zhì)體中行使功能的選擇性標(biāo)記。本發(fā)明的再其它方面為經(jīng)由體細(xì)胞胚胎發(fā)生再生葉綠體轉(zhuǎn)基因植物以實(shí)現(xiàn)同質(zhì)性。
本申請的優(yōu)選方面適用于高等植物的所有質(zhì)體。這些質(zhì)體包括存在于水果、蔬菜和花中的色質(zhì)體；存在于塊莖(如馬鈴薯)中的造粉體；高等植物根中的前質(zhì)體；存在于植物非綠色部分的白色體和黃化質(zhì)體(在黑暗中表達(dá))。本申請的各方面也適用于葉綠體的各發(fā)育階段，其中葉綠體不是完全綠色的。
定義為了更好的理解本公開的內(nèi)容，提供以下的定義，除非另有說明，否則貫穿整個(gè)申請它們都具有相同的含義。
“異源”通常指來自不同的遺傳來源。當(dāng)然本發(fā)明設(shè)想使用異源和同源的DNA，和適用于在植物質(zhì)體中表達(dá)的操縱子。
“表達(dá)盒”在本領(lǐng)域通常被理解為含有必需的調(diào)節(jié)序列以允許一個(gè)或一個(gè)以上的克隆基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的克隆載體。
“正確折疊的”應(yīng)該被理解為意指折疊成正常構(gòu)象的蛋白質(zhì)，這種構(gòu)象與蛋白質(zhì)作為天然蛋白質(zhì)表達(dá)于其天然宿主細(xì)胞中時(shí)的折疊方式相一致。
貫穿本申請，當(dāng)涉及植物時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解這里涉及的各方面延及轉(zhuǎn)化含有質(zhì)體的所有生物和植物的質(zhì)體。為了明確，短語“高等植物”通常包括茄科和非茄科植物，例如農(nóng)作物、水果、花、蔬菜、豆類、醫(yī)用植物和所有其它本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到的高等植物。
用于整個(gè)后續(xù)的說明書和權(quán)利要求的“基本上同源”意指與天然人血清白蛋白序列有超過50％，最優(yōu)選超過80％、甚至更優(yōu)選超過90％、95％或99％的同源性程度。這里使用的“序列基本一致或基本同源”用于指一個(gè)核苷酸序列或氨基酸序列表現(xiàn)出與另一核苷酸或氨基酸序列具有基本相同的結(jié)構(gòu)或功能。在序列基本一致或基本同源的兩序列之間任何的結(jié)構(gòu)和功能差異都是微小的；即這些差異不會(huì)影響序列在期望的應(yīng)用中發(fā)揮所需的功能。差異可能是由于例如不同物種在密碼子使用上的固有差異造成的。如果兩個(gè)或多個(gè)序列之間具有顯著的序列重疊或相似性，或者即使序列在長度或結(jié)構(gòu)上不同，但這些不同序列表現(xiàn)出相似的物理特征，則結(jié)構(gòu)差異將被認(rèn)為是微小的。所述特征包括，如能夠仍然表達(dá)和正確折疊成蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象狀態(tài)以及在規(guī)定的條件下雜交，或表現(xiàn)出明確定義的免疫交叉反應(yīng)性、相似的生物藥物活性等。這些特征中的每一種都可以被本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用已知方法容易地確定。
“非綠色質(zhì)體”通常指任何非綠色的質(zhì)體，實(shí)例包括存在于水果、蔬菜和花中的色質(zhì)體；存在于塊莖(如馬鈴薯)中的造粉體；存在于高等植物根中的前質(zhì)體；白色體和黃化質(zhì)體(在暗中表達(dá))和不同發(fā)育階段的葉綠體(其中葉綠體不為綠色)。此外，植物和植物細(xì)胞的非綠色部分在本領(lǐng)域中已得以充分表征，也是清楚的。
“間隔區(qū)域”在本領(lǐng)域被理解為兩個(gè)基因之間的區(qū)域。植物葉綠體基因組含有核苷酸序列高度保守的間隔區(qū)域。這些葉綠體基因組間隔區(qū)域在核苷酸序列上的高度保守性使間隔區(qū)域能夠被理想的用于構(gòu)建可以轉(zhuǎn)化廣泛植物物種的葉綠體的載體，而無需針對不同植物或各作物物種構(gòu)建單獨(dú)載體。正如本領(lǐng)域清楚的，功能基因的側(cè)翼序列被眾所周知的稱為“間隔區(qū)域”。間隔區(qū)域的具體性質(zhì)被清楚的描述于申請人1998年5月15日提交的、題為“UNIVERSAL CHLOROPLAST INTEGRATION OFEXPRESSION VECTORS，TRANSFORMED PLANTS ANDPRODUCTS THEREOF”的申請09/079,640中。因此，上述申請09/079,640被引入為參考。已熟知在高等植物葉綠體基因組中至少存在60個(gè)具有轉(zhuǎn)錄活性的間隔區(qū)域(Sugita，M.，Sugiura.M.，Regulation of Gene Expressionin Chloroplasts of Higher Plants，Plant Mol.Biol.，32315-326，1996)。具體的，Sugita等人報(bào)道了60個(gè)被稱為轉(zhuǎn)錄單元的轉(zhuǎn)錄活性間隔區(qū)域，參見該文獻(xiàn)表II。因?yàn)檫@些轉(zhuǎn)錄活性間隔區(qū)域是已知的，故可以在這些鑒定的間隔區(qū)(其包含在各種的高等植物葉綠體基因組中)中使用通用載體(如描述于本申請人的美國專利申請No.09/079,640的載體)。運(yùn)用Sugita等人的教導(dǎo)，可以容易地在質(zhì)體基因組中定位基因間間隔區(qū)。這就使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠使用本申請人的美國專利申請No.09/079,640中教導(dǎo)的方法，向Sugita等人鑒定的間隔區(qū)(存在于各種高等植物中)插入含有psbA、psbA的5’非翻譯區(qū)(UTR)和編碼目的蛋白質(zhì)的基因的通用載體。上述申請和文章被引入作為參考。
選擇性標(biāo)記提供了挑選期望的植物細(xì)胞的手段，用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的載體通常含有能表達(dá)選擇性標(biāo)記基因的構(gòu)建體。標(biāo)記基因是植物可表達(dá)的DNA序列，該序列表達(dá)的多肽能抵抗，即削弱或失活選擇性物質(zhì)的天然抑制作用，選擇性物質(zhì)即抗生素、除草劑或醛脫氫酶，如甜菜醛脫氫酶(描述于2001年4月18日提交的本申請人申請No.09/807,722，并在此將該文獻(xiàn)整個(gè)引入作為參考)?？商娲氖?，選擇性標(biāo)記基因可以提供另一些可見的反應(yīng)性應(yīng)答，即可以在一些物質(zhì)的存在下使表型或生長模式不同于不表達(dá)選擇性標(biāo)記基因的植物或植物細(xì)胞，其中所述物質(zhì)既可以直接應(yīng)用于植物或植物細(xì)胞，也可以存在于植物或植物細(xì)胞的生長培養(yǎng)基中。
無論怎樣，含有選擇性標(biāo)記基因的植物或植物細(xì)胞都將具有可用于鑒定目的的差別表型，即它們可以區(qū)別于非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。此特征性表型允許鑒定含有構(gòu)建體的細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)、組織、器官、植物部分或整個(gè)植物。標(biāo)記物表型的檢測使得可以選擇具有與標(biāo)記基因連接的第二基因的細(xì)胞。
對這種用于鑒定含有質(zhì)體構(gòu)建體的植物細(xì)胞的標(biāo)記，文獻(xiàn)中已有使用描述。在以下提供的例子中，細(xì)菌aadA基因被作為標(biāo)記表達(dá)。aadA基因的表達(dá)賦于壯觀霉素和鏈霉素抗性，因此允許鑒定表達(dá)這一標(biāo)記的植物細(xì)胞。aadA基因產(chǎn)物允許葉綠體中含有此選擇性標(biāo)記基因產(chǎn)物的細(xì)胞持續(xù)生長和變綠。多種其它的啟動(dòng)子區(qū)域也可以被用來驅(qū)動(dòng)選擇性標(biāo)記基因表達(dá)，包括各種質(zhì)體啟動(dòng)子和已經(jīng)被證實(shí)可以在植物質(zhì)體中表現(xiàn)出功能的細(xì)菌啟動(dòng)子。
“反向重復(fù)區(qū)域(Inverted Repeat Regions)”意味著當(dāng)同源區(qū)域存在于質(zhì)體基因組的反向重復(fù)區(qū)(稱作IRA和IRB)中時(shí)，預(yù)計(jì)每個(gè)轉(zhuǎn)化質(zhì)體具有兩個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)基因。當(dāng)同源區(qū)域存在于質(zhì)體基因組反向重復(fù)區(qū)域之外時(shí)，預(yù)計(jì)每個(gè)轉(zhuǎn)化質(zhì)體具有1個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)基因。
“結(jié)構(gòu)等價(jià)”一般應(yīng)該理解為意指蛋白質(zhì)保持在天然細(xì)胞中表達(dá)的天然蛋白質(zhì)的構(gòu)象結(jié)構(gòu)。
載體本申請涉及使用能夠轉(zhuǎn)化質(zhì)體的載體，特別是用于轉(zhuǎn)化質(zhì)體。這類載體包括質(zhì)體表達(dá)載體(如pUC、pBR322、pBLUESCRIPT、pGEM)和Daniel在美國專利No.5,693,507和美國專利No.5,932,479中鑒定的所有其它載體。也包括側(cè)翼序列定位于葉綠體基因組鑲邊重復(fù)區(qū)(embroideredrepent)之外的載體。這些出版物和專利在此被引入作為參考，其引入程度如同具體單獨(dú)指明每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠灰霝閰⒖家粯印?br> 通用載體被描述于1999年3月4日出版的WO99/10513和1998年5月15日提交的申請No.09/079,640，兩篇所述參考文獻(xiàn)被全文引入。
使用了本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)用于葉綠體轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)pLD載體(Daniell等人，1998；Daniell等人，2001b；De Cosa等人，2001；Guda等人，2000；Kota等人，1999)。對于不同蛋白質(zhì)，使用此SD5’序列已經(jīng)表現(xiàn)出在葉綠體中可以獲得高水平的外源蛋白質(zhì)表達(dá)(3-21％的tsp)(Daniell等人，2001b；DeGray等人，2001；Kota等人，1999)。
值得注意的是，這里描述的載體是說明性的例子，可以使用如描述于美國專利申請No.09/079,640中的不同啟動(dòng)子、如描述于美國專利申請No.09/807,722中的不同選擇性標(biāo)記和適用于整合進(jìn)各種植物質(zhì)體基因組的不同側(cè)翼序列來構(gòu)建載體。
轉(zhuǎn)化質(zhì)體基因組的一般方法此說明性例子一般性地展示了實(shí)踐本申請發(fā)明所必需的所有步驟。當(dāng)然，本領(lǐng)域已知的其它合適的方法可以被用來替代或補(bǔ)充這里描述的示例性方法。
植物基因組DNA的分離研缽和杵、液氮、新鮮的暗綠色葉子。DNeasy Plant Mini試劑盒(QIAGEN Inc.)葉綠體側(cè)翼序列的PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)的材料基因組DNA(50-100ng/μl)、dNTPs、10xpfu緩沖液、正向引物、反向引物、高壓滅菌的蒸餾水和Turbo pfu DNA聚合酶。
載體構(gòu)建1.pUC19或pBlueScriptSK(+/-)質(zhì)粒。
2.PCR擴(kuò)增的物種特異性葉綠體DNA側(cè)翼序列。
3.在質(zhì)體中具有功能的啟動(dòng)子、葉綠體基因的5’UTR、選擇性標(biāo)記基因、目的基因和葉綠體3’UTR。
4.限制性酶和緩沖液。
5.T4 DNA聚合酶(除去3’突出端以形成平端和補(bǔ)平5’突出端以形成平端)，或Klenow大片段(補(bǔ)平5’突出端以形成平端)，堿性磷酸酶(對粘性末端去磷酸化)，DNA連接酶(形成磷酸二酯鍵)，和適當(dāng)緩沖液。
6.設(shè)在不同溫度下的水浴或孵育裝置。
生物轟擊(Biolistics)準(zhǔn)備1.將高壓滅菌的Whatman濾紙#1(直徑55毫米)置于烤箱中干燥。
2.100％的乙醇。
3.盒裝高壓滅菌的吸頭、包于鋁箔中的高壓滅菌的Kim Wipes紙巾。
4.儲存于-20℃于50％甘油中的無菌金顆粒(見注釋1和2)。
5.通過浸入100％乙醇而滅菌的無菌破裂膜(rupture disc)(1100psi)和宏載體(macrocarrier)。
6.高壓滅菌的鋼的宏載體固定器(macrocarrier holder)和停止屏(stopping screen)。
7.新制2.5mM CaCl2稱取1.84g溶于5mL水并用0.2μm的過濾器過濾除菌。
8.0.1M亞精胺(具有高度吸濕性)將1M亞精胺儲備液稀釋10倍并等分成100μl裝入1.5mL Eppendrop管，儲存于-20℃。每管使用一次后即拋棄。
用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基制備2.5.1.煙草1000mL培養(yǎng)基4.3g MS鹽(INVITROGEN Inc.)、H2O(分子生物學(xué)級)、100mg/L肌醇、1mg/L硫胺素-HCl、用于芽誘導(dǎo)的3％的蔗糖和用于根誘導(dǎo)的2％的蔗糖、1mg/L 6-芐基氨基嘌呤(BAP；從1mg/mL儲備液中取1ml)、0.1mg/L吲哚-3-乙酸(從1mg/mL儲備液中取0.1ml)、用于根誘導(dǎo)的1mg/L吲哚-3-丁酸(從1mg/mL IBA儲備液中取1ml)。當(dāng)高壓滅菌的培養(yǎng)基冷到45℃-50℃時(shí)，向其加入500mg/L的壯觀霉素(從100mg/mL的儲備液中取5mL過濾除菌的壯觀霉素)。
可食作物馬鈴薯1000mL培養(yǎng)基4.3g MS鹽、維生素B5(在100mL水中溶解1g肌醇、10mg煙酸、10mg吡哆醇-HCl、100mg硫胺素-HCl以制備100x溶液；使用10mL，剩余溶液于4℃儲存)、5mg/l玉米素核苷(使用0.5mL 1mg/mL的ZR儲備液)、0.1mg/lα-萘乙酸(使用0.1mL 1mg/mL的NAA儲備液)、40到500mg/l的壯觀霉素。
番茄1000mL培養(yǎng)基4.3g MS鹽、維生素B5(使用10ml 10x儲備液)、0.2mg/L吲哚-3-乙酸(從1mg/mL IAA儲備液中取0.2ml)、3mg/L 6-芐基氨基嘌呤(從1mg/mL BAP儲備液中取3ml)。300或500mg/l的壯觀霉素。
使用1N KOH或1N NaOH將所有植物生長培養(yǎng)基調(diào)到pH5.8并在121℃持續(xù)20分鐘的高壓滅菌前加入6g/L的Phytagel(Sigma)。對于1mg/mL的BAP、IAA、IBA、NAA、ZR儲備液的制備，分別地稱取10mg粉末，先溶解于1或2滴1N NaOH中，補(bǔ)足到最終體積10mL(所有植物生長調(diào)節(jié)劑被儲存于4℃1-2月)。
轉(zhuǎn)基因植物的分子分析整合進(jìn)煙草葉綠體的基因的PCR分析50μl的PCR反應(yīng)1.0μl基因組DNA(50-100ng/μl)、1.5μldNTPs(10mM儲存液)、5.0μl(10x PCR緩沖液)、1.5μl正向引物(在天然葉綠體基因組上著陸；10μM儲存液)、1.5μl反向引物(在轉(zhuǎn)基因上著陸；10μM儲存液)、39.0μl高壓滅菌的蒸餾水和0.5μl Taq DNA聚合酶。
同質(zhì)性的Southern印跡分析1.脫嘌呤溶液0.25 N HCl(使用0.4mL 12.1 N的HCl；FisherScientific USA，用蒸餾水補(bǔ)至最終體積500mL)。
2.轉(zhuǎn)移緩沖液0.4 N NaOH、1M NaCl(稱取16g NaOH和58.4gNaCl并溶解于蒸餾水，將體積補(bǔ)到最終1000mL)。
3.20XSSC3M NaCl、0.3M檸檬酸三鈉(稱取175.3g NaCl、88.2gNa3C6H5O7·2H2O溶于900mL H2O，用1N HCl調(diào)節(jié)到pH7.0并用蒸餾水將體積補(bǔ)足到最終1000mL并高壓滅菌)。
4.2XSSC向180mL蒸餾水中加入20mL 20XSSC。
通過Western印跡進(jìn)行蛋白質(zhì)分析1.丙烯酰胺/Bis來自Fischer(USA)的現(xiàn)成品，儲存于4℃。
2.10％SDS將10g SDS溶解于90mL去離子水，補(bǔ)足體積到100mL，室溫儲存。
3.分離膠緩沖液1.5M Tris-HCl(向80mL水中加入27.23g Tris堿，用6 N HCl將pH調(diào)至8.8，將體積補(bǔ)到最終150mL。高壓滅菌后儲存于4℃)。
4.積層膠緩沖液0.5M Tris-HCl(向60mL水中加入6.0g Tris堿，用6N HCl將pH調(diào)至6.8，將體積補(bǔ)到最終100mL。高壓滅菌后儲存于4℃)。
5.樣品緩沖液(SDS還原緩沖液)在3.55mL水中加入1.25mL 0.5M Tris-HCl(pH6.8)、2.5mL甘油、2.0mL(10％SDS)、0.2mL(0.5％溴酚藍(lán))。室溫儲存。使用前向950μl樣品緩沖液中加入50μlβ-巰基乙醇(βME)。
6.10X電泳緩沖液(pH8.3)于約700mL水中溶解30.3g Tris堿、144.0g甘氨酸和10.0g SDS(如果不溶加入更多的水)。將體積加到1L并儲存于4℃。
7.10xPBS稱取80g NaCl、2g KCl、26.8g Na2HPO4·7 H2O(或14.4g Na2HPO4)、2.4g KH2PO4溶解于800mL水中。用HCL將pH調(diào)節(jié)到7.4并將體積補(bǔ)足到1L。高壓滅菌后于室溫儲存。
8.20％APS在1mL水中溶解200mg過硫酸銨(每兩周新制)。
9.1500mL轉(zhuǎn)移緩沖液900mL水中加入300mL 10x電泳緩沖液，300mL甲醇、0.15g SDS并將體積調(diào)至1L。
植物抽提緩沖液使用的濃度終濃度60μl 5M NaCl 100mM60μl 0.5M EDTA 10mM600μl 1M Tris-HCl 200mM2μl Tween-20 .05％30μl 10％SDS 0.1％3μl BME 14mM1.2mL 1M蔗糖400mM1mL水60μl 100mM PMSF2mM臨用前加入PMSF(振蕩溶解PMSF晶體)。
PMSF(苯甲基磺酰氟)于1mL甲醇中振蕩溶解17.4mg PMSF粉末，于-20℃儲存不超過1個(gè)月。
方法植物基因組DNA的分離按照vender的指導(dǎo)，使用DNeasy Plant試劑盒(QIAGEN Inc.)從新鮮綠葉中提取植物基因組DNA。
葉綠體側(cè)翼序列的擴(kuò)增依靠PCR的幫助，從特定植物物種的葉綠體DNA或基因組DNA擴(kuò)增物種特異的側(cè)翼序列，PCR使用一套根據(jù)已知高度保守的煙草葉綠體基因組序列設(shè)計(jì)的引物。
進(jìn)行PCR反應(yīng)的條件PCR具有3個(gè)被重復(fù)30到40個(gè)循環(huán)的主要步驟(1)在94℃變性分離雙鏈葉綠體DNA。(2)在54-64℃退火利用氫鍵的形成使引物與單鏈DNA結(jié)合并且DNA聚合酶開始復(fù)制模板。(3)在72℃延伸DNA聚合酶在72℃延伸與引物形成強(qiáng)烈氫鍵的模板。錯(cuò)誤匹配的引物不會(huì)形成強(qiáng)烈的氫鍵，因此所有這些溫度可以根據(jù)DNA序列同源性而變化。與模板互補(bǔ)的堿基在引物的3’端與引物偶聯(lián)。聚合酶從5’到3’添加dNTPs，以3’到5’的方向閱讀模板，加入的堿基與模板互補(bǔ)。
葉綠體轉(zhuǎn)化載體左和右側(cè)翼是葉綠體基因組中充當(dāng)穩(wěn)定整合轉(zhuǎn)基因的同源重組位點(diǎn)的區(qū)域。在葉綠體中有效的轉(zhuǎn)錄和翻譯轉(zhuǎn)基因需要強(qiáng)有力的啟動(dòng)子以及5’UTR和3’UTR。為進(jìn)行多基因表達(dá)，單一啟動(dòng)子可以調(diào)節(jié)操縱子的轉(zhuǎn)錄，并且必須在每個(gè)編碼序列的上游放置單獨(dú)的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(2)(圖10)。以下步驟被用于載體構(gòu)建1.用基于煙草葉綠體基因組的已知序列設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增質(zhì)體的側(cè)翼序列(葉綠體的16S-23S區(qū)之間)。
2.將含有葉綠體基因組側(cè)翼序列的PCR產(chǎn)物插入pUC 19質(zhì)粒，pUC質(zhì)粒事先被限制酶PvuII消化(以消除該多克隆位點(diǎn))，用堿性磷酸酶(CIP)于50℃處理5分鐘進(jìn)行去磷酸化(以阻止克隆載體的重新環(huán)化)。于68℃處理10分鐘以失活CIP酶。
將葉綠體轉(zhuǎn)化盒子(在T4 DNA聚合酶或Klenow填補(bǔ)的幫助下成為平端)克隆進(jìn)在間隔區(qū)中唯一的PvuII位點(diǎn)處消化的克隆載體中，此間隔區(qū)在迄今檢測的所有高等植物中都是保守的。
經(jīng)由粒子槍將外源基因遞送入葉綠體這是向質(zhì)體遞送轉(zhuǎn)基因的最成功和簡單的技術(shù)，其被稱為生物轟擊PDS-1000/He粒子遞送系統(tǒng)(Biolistic PDS-1000/He Particle DeliverySystem(18，19))。這一技術(shù)已被證明可以成功地在廣泛的植物物種中向目的組織遞送外源DNA，并且已在煙草(2)、擬南芥(20)、馬鈴薯(21)、番茄(25)的葉綠體基因組中實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因的整合，在小麥(22)、胡蘿卜、萬壽菊和辣椒(23)中實(shí)現(xiàn)了瞬時(shí)表達(dá)(見注釋5)。
金顆粒懸浮液的制備。
1.在1mL 100％的乙醇中懸浮50-60mg金顆粒并渦旋兩分鐘。
2.以最大速度約10,000xg離心3分鐘(使用臺式微量離心機(jī))。
3.棄上清。
4.加入1mL新制70％的乙醇并渦旋1分鐘。
5.室溫孵育15分鐘并間隙振蕩。
6.10,000xg離心兩分鐘。
7.棄上清，加入1ml無菌蒸餾水，渦旋1分鐘，室溫放置1分鐘，并10,000xg離心兩分鐘。
8.用水重復(fù)3次上述洗滌過程(步驟7)。
9.將金沉淀重懸浮于1ml 50％的甘油中，于-20℃冰箱中儲存儲備液。在用于5個(gè)樣品的金顆粒上沉淀葉綠體載體。
1.渦旋1分鐘后，取50μl金顆粒放入1.5mL試管中。
2.加入10μl DNA(約1μg/μl質(zhì)粒DNA)，并渦旋混合物30秒。
3.加入50μl 2.5M的CaCl2并渦旋混合物30秒。
4.加入20μl 0.1M的亞精胺并在4℃對混合物渦旋20分鐘。洗滌包被在金顆粒上的葉綠體載體1.加入200μl 100％的乙醇并渦旋30秒。
2.3000xg離心40秒。
3.倒掉乙醇上清。
4.重復(fù)5次乙醇洗滌。
5.在最后一步仔細(xì)倒掉乙醇并加入35-40μl乙醇(100％)。
宏載體的制備1.通過在100％的乙醇中浸泡15分鐘來滅菌宏載體，空氣干燥后在塑料蓋的幫助下插入無菌鋼環(huán)固定器。
2.渦旋金-質(zhì)粒DNA懸浮液，吸取8-10μl放于宏載體的中心并空氣干燥。
用于轟擊樣品的基因槍的設(shè)置1.用100％乙醇以精細(xì)紙巾擦拭槍室和固定器(不要用酒精擦拭門)。
2.打開真空泵。
3.打開氦氣罐的閥門(氦壓力調(diào)節(jié)器)(逆時(shí)針)。
4.使用調(diào)節(jié)柄調(diào)節(jié)壓力表閥(可調(diào)閥)，使高于期望的破裂膜壓力約200到250psi(順時(shí)針)。
5.打開基因槍。
6.將破裂膜(通過在100％的乙醇中浸泡5分鐘而滅菌)置入破裂膜支承蓋(rupture disc-retaining cap)，并緊緊擰在氣體加速管上。
7.在宏載體發(fā)射裝置(macrocarrier launch assembly)中放入停止屏，在停止屏上方放置宏載體，以金顆粒(帶有葉綠體載體)面朝下對著屏。在此裝置上擰上宏載體罩(macrocarrier coverlid)，并插入槍室(gunchamber)。
8.將待轟擊的完整葉子或外植體置于濾紙(Whatman No.1)(浸于不含抗生素的培養(yǎng)基中)上。將樣品板置于靶板架(target plate shelf)上，插入槍室并關(guān)閉轟擊室門。
9.按壓Vac開關(guān)以在真空壓力表顯示器中建立壓力(達(dá)到28英寸汞柱)。在控制點(diǎn)關(guān)掉同一開關(guān)并按下Fire開關(guān)直到聽到破裂膜的爆破聲。
10.按下Vent開關(guān)釋放真空并打開槍室取走樣品。
11.通過關(guān)閉氦氣汽缸上的主閥(氦壓力調(diào)節(jié)器)來關(guān)閉系統(tǒng)?；驑屖抑行纬梢欢ǖ恼婵眨煌５卮蜷_和關(guān)閉Fire開關(guān)，直到兩壓力表顯示零讀數(shù)。釋放真空壓力并關(guān)掉基因槍和真空泵。
12.在培養(yǎng)室于黑暗中(即用鋁箔覆蓋)對被轟擊的樣品板孵育兩天，并在第三天將外植體切成適當(dāng)?shù)男K置于選擇性培養(yǎng)基上。
植物組織培養(yǎng)和葉綠體轉(zhuǎn)化煙草葉綠體轉(zhuǎn)化已建立了一種用于煙草栽培品種Petit Havana的高效率可重復(fù)方案(Daniell，H.(1997)Methods in Mol.Biol.Recombinant gene expressionprotocols.62，463-489)。
1.用葉綠體載體轟擊4周齡暗綠色煙草葉的背軸面(背面)并在無選擇的培養(yǎng)基上對葉子黑暗孵育兩天。
2.在第三天將轟擊的葉子外植體切成小方塊(5mm)并將外植體以背軸面朝向培養(yǎng)基的方式置于含有MS鹽、1mg/l硫胺素HCl、100mg/l肌醇、3％蔗糖、1mg/l BAP和0.1mg/1 IAA連同作為選擇性試劑的500mg/l壯觀霉素的選擇性培養(yǎng)基上。
3.在轉(zhuǎn)化的3到5周后應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因芽。將芽葉再次切成小的方形外植體(2mm)，在新鮮培養(yǎng)基上接受第二輪選擇以實(shí)現(xiàn)同質(zhì)性。
4.轉(zhuǎn)基因芽在含有MS鹽、1mg/l硫胺素HCl、100mg/l肌醇、2％蔗糖和1mg/l IBA連同500mg/l壯觀霉素的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行再生(通過PCR確證轉(zhuǎn)基因的整合)。
5.在高濕度條件下將轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)移到盆中并將它們移入溫室或生長室以進(jìn)一步生長和表征。
可食作物的質(zhì)體轉(zhuǎn)化Daniell的小組提出了使用一種植物物種的葉綠體DNA可以轉(zhuǎn)化另一物種(具有未知序列)的通用載體概念(8)。使用這一概念，番茄和馬鈴薯葉綠體基因組按如下描述被轉(zhuǎn)化。
馬鈴薯葉綠體轉(zhuǎn)化使用煙草葉綠體載體，經(jīng)由生物轟擊技術(shù)轉(zhuǎn)化馬鈴薯栽培品種FL1607的葉組織，使用選擇性aadA基因標(biāo)記和可見的綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)報(bào)告基因(21)回收穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物。
1.轟擊馬鈴薯葉(3-4周齡)并在無選擇性的培養(yǎng)基上于暗處孵育兩天。
2.第三天將葉子切成小方塊(5mm)并置于含有維生素B5、5mg/1 ZR、0.1 NAA和3％蔗糖的MS培養(yǎng)基上。在散射光線下每隔兩周進(jìn)行傳代培養(yǎng)之后，逐漸增加壯觀霉素選擇壓力(從40到400mg/l)。
3.在含有維生素B5、0.01mg/L NAA、0.1mg/L GA3、2％蔗糖和40-400mg/l壯觀霉素的MS培養(yǎng)基上從轉(zhuǎn)基因馬鈴薯愈傷組織再生芽。
4.將轉(zhuǎn)基因芽轉(zhuǎn)移至含有維生素B5、2％蔗糖和40-400mg/l壯觀霉素的基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基上進(jìn)行根誘導(dǎo)。將轉(zhuǎn)基因小植株轉(zhuǎn)移到生長室。
番茄葉綠體轉(zhuǎn)化使用煙草葉綠體載體，利用非常低強(qiáng)度的光照產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)基因質(zhì)體的番茄(Lycopersicon esculentum cv.IAC Santa Clara)植物(25)。
1.轟擊四周齡番茄葉，并在無選擇性的培養(yǎng)基上于暗處孵育兩天。
2.將轟擊的葉子切成小塊并置于含有0.2mg/L IAA、3mg/L BAP、3％蔗糖和300mg/L壯觀霉素的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。
3.在不進(jìn)行芽誘導(dǎo)的情況下持續(xù)3到4月后選擇具壯觀霉素抗性的原代愈傷組織。
4.在將轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有0.2mg/L IAA、2mg/L ZR、2％蔗糖和300mg/L壯觀霉素的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上后約4周再生芽，然后在無激素的培養(yǎng)基上生根。將再生轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)移到溫室中。
轉(zhuǎn)基因植物的分子分析轉(zhuǎn)基因芽的PCR篩選。
此方法已經(jīng)被用于區(qū)分突變體、核和葉綠體轉(zhuǎn)基因植物。通過與臨近整合位點(diǎn)的天然葉綠體基因組退火的一個(gè)引物和與aadA基因退火的另一個(gè)引物(26)，在葉綠體轉(zhuǎn)化體中應(yīng)產(chǎn)生適當(dāng)大小的PCR產(chǎn)物。因?yàn)樵诤宿D(zhuǎn)基因植物和突變植物中不能得到此PCR產(chǎn)物，因此排除了核整合或突變體的可能性。
1)使用DNeasy Plant試劑盒(QIAGEN Inc.)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明從轉(zhuǎn)基因葉組織抽提基因組DNA。在轉(zhuǎn)基因組織量較少時(shí)，可以適當(dāng)減少緩沖液體積。
2)使用Taq DNA聚合酶(QIAGEN Inc.)按照與上文描述的擴(kuò)增側(cè)翼序列時(shí)同樣的條件，通過適當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)行PCR反應(yīng)。
同質(zhì)性的Southern印跡分析在Southern印跡分析中，相比于含有轉(zhuǎn)基因盒和側(cè)翼區(qū)域的轉(zhuǎn)基因葉綠體，適當(dāng)限制酶消化的野生型煙草質(zhì)體基因組應(yīng)當(dāng)產(chǎn)生較小的片段(僅有側(cè)翼區(qū))。此外，當(dāng)只觀察到轉(zhuǎn)基因片段時(shí)才實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因植物的同質(zhì)性。
將DNA轉(zhuǎn)移到膜上1.用適當(dāng)限制酶消化轉(zhuǎn)基因樣品的基因組DNA(約2到10μg)(包括野生型作為對照)并將消化的DNA在每100ml含有5μl EtBr(取自10mg/mL儲備液)的0.8％瓊脂糖凝膠中以40V電泳4小時(shí)。
2.將凝膠在0.25N的HCl(脫嘌呤溶液)中浸泡15分鐘并在蒸餾水中洗兩次，5分鐘。
3.將凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液中漫泡20分鐘以變性DNA。
4.使用轉(zhuǎn)移緩沖液將DNA從凝膠過夜轉(zhuǎn)移至尼龍膜(先在水中預(yù)漫泡，再在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5分鐘)。
5.第二天，使用2xSSC緩沖液洗膜兩次，每次5分鐘并在濾紙上空氣干燥5分鐘。在適當(dāng)(C3)設(shè)置下使用GS GeneLinker UV Chamber(Bio-Rad)使DNA與膜交聯(lián)。
探針的制備1.用適當(dāng)?shù)南拗泼赶魏钨|(zhì)粒(含有葉綠體基因組的側(cè)翼序列)。
2.在95℃對45μl側(cè)翼DNA片段(50-250ng)變性5分鐘，然后在冰上放置2-3分鐘。
3.向Ready-To-Go DNA標(biāo)記小珠(-dCTP)試管(AmershamBiosciences，USA)加入變性的探針并通過輕彈試管進(jìn)行溫和的混合。
4.向探針混合物加入5μl放射性α32P(dCTP；Amersham Biosciences，USA)并在37℃孵育1小時(shí)，使用ProbeQuant G-50 Micro柱(AmershamPharmacia Biotech Inc.USA)過濾探針。
預(yù)雜交和雜交。
將印跡(DNA轉(zhuǎn)移面朝向溶液)放入雜交瓶并加入10mL Quik-Hyb(Stratagene，USA)。
在68℃孵育1小時(shí)。向標(biāo)記探針加入100μl超聲處理的鮭精(10mg/mL貯存液；Stratagene，USA)，在94℃加熱5分鐘并加入含有膜和Quik-Hyb溶液的瓶子。于68℃孵育1小時(shí)。
洗滌和放射自顯影。
1.棄掉含有探針的Quik-Hyb溶液，并在室溫于50mL(2xSSC緩沖液和0.1％的SDS)中洗滌膜兩次，15分鐘。
2.在60℃于50mL(0.1xSSC緩沖液和0.1％的SDS)中洗滌膜兩次，15分鐘。
3.將洗后的膜包裹于Saran Wrap中并在暗處使印跡暴光x感光膠片，置于-70℃直到準(zhǔn)備顯影。
通過Western印跡確定轉(zhuǎn)基因表達(dá)植物蛋白質(zhì)的提取
1.在液氮中碾磨100mg的葉子并在冰上向樣品中加入200μl提取緩沖液。
2.向一等份植物提取物加入適當(dāng)體積的新制2x樣品上樣緩沖液(取自含有50μlβ-巰基乙醇和950μl樣品上樣緩沖液的儲備液)。
3.煮沸樣品及上樣染料4分鐘并在10,000xg離心兩分鐘，然后立即向凝膠中上樣20μl。
電泳凝膠凝膠上樣并在100V電泳半小時(shí)，然后150V電泳1小時(shí)，直到與目的蛋白質(zhì)相應(yīng)的標(biāo)志帶位于中部。
蛋白質(zhì)向膜的轉(zhuǎn)移。
使用Mini Transfer Blot Module以30V過夜或65V兩小時(shí)或100V 1小時(shí)從凝膠向膜轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。如果需要的話，可以將膜包裹在Saran Wrap中在-20℃儲存幾天。
膜封閉1.轉(zhuǎn)移后用水漂洗膜并將膜在PTM(100mL 1xPBS，50μL 0.05％Tween 20和3g干奶(3％))中于室溫孵育1小時(shí)。
2.加入15ml適當(dāng)稀釋的初級抗體并在室溫孵育兩小時(shí)。用1xPBS洗滌膜兩次，每次五分鐘。
3.加入20毫升適當(dāng)稀釋的二級抗體。在搖床中于室溫孵育1.5小時(shí)。
4.用PT(100ml 1xPBS+50μl Tween 20)清洗兩次，15分鐘，最后用1x PBS清洗10分鐘。
印跡對X感光膠片曝光1.在1.5mL試管中混合每種化學(xué)發(fā)光溶液(Luminol Enhancer和穩(wěn)定的過氧化物)各750μl并加到膜上，徹底覆蓋。
2.去掉額外的溶液，并用印跡對X膠片進(jìn)行適當(dāng)持續(xù)時(shí)間的暴光，顯影膠片。
種子滅菌
1.在具有1mL 70％乙醇的微量離心管中將少量的種子渦旋1分鐘。短暫的離心后棄乙醇。
2.向試管中加入1mL消毒液(1.5％Bleach和0.1％Tween 20)并間歇地渦旋15分鐘。短暫的離心后棄溶液。
3.使用無菌蒸餾水洗滌種子3次。
4.在含有補(bǔ)加500μg/mL壯觀霉素的RMOP基礎(chǔ)培養(yǎng)基的平板上(以確定轉(zhuǎn)基因葉綠體植物的母系遺傳)，用無菌蒸溜水噴灑種子。
結(jié)果評估葉綠體轉(zhuǎn)基因植物中的母系遺傳整合進(jìn)葉綠體基因組的轉(zhuǎn)基因是母系遺傳的。當(dāng)轉(zhuǎn)基因的煙草種子在含有500μg/mL壯觀霉素的RMOP基礎(chǔ)培養(yǎng)基上萌發(fā)時(shí)，這一點(diǎn)便顯而易見。選擇性試劑對轉(zhuǎn)基因幼苗不應(yīng)有有害影響，而對未轉(zhuǎn)化幼苗將會(huì)有影響。
CTB-GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合ELISA分析。
1.用單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂-GM1(3.0μg/mL的重碳酸鹽緩沖液(15mMNa2CO3，35mM NaHCO3，pH9.6)溶液)包被微量滴定板(96孔ELISA板)，并用BSA(3.0μg/mL的重碳酸鹽緩沖液溶液)包被一些孔作為對照。
2.在4℃過夜孵育平板。
3.在37℃用0.01M磷酸緩沖鹽水(PBS)中的1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)封閉小孔兩小時(shí)。
4.用PBST緩沖液(含有0.05％Tween 20的PBS)洗滌小孔3次。
5.加入于PBS中的來自轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化植物的可溶性蛋白質(zhì)和細(xì)菌CTB，孵育平板。
6.加入初級抗體(兔抗霍亂血清，以1∶8000稀釋于含有0.5％BSA的0.01 M PBST中)并在37℃孵育平板兩小時(shí)。
7.用PBST緩沖液洗滌小孔3次。
8.加入1∶50000稀釋的二級抗體(溶于含有0.5％BSA的0.01 M PBST中的小鼠抗兔IgG-堿性磷酸酶綴合物)并在37℃對平板孵育兩小時(shí)。
9.用Sigma Fast pNPP底物顯影平板。通過加入3M NaOH終止反應(yīng)并在405nm讀取平板的吸收值。
巨噬細(xì)胞裂解試驗(yàn)如下1.從100mg轉(zhuǎn)基因葉子中粗提取分離蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的抽提使用200μl含有CHAPS去污劑(4％CHAPS、10mM EDTA、100mM NaCl、200mM Tris-HCl、pH8.0、400mM蔗糖、14mMβ-巰基乙醇、2mMPMSF)或不含CHAPS去污劑的提取緩沖液。
2.以10,000xg離心樣品5分鐘，上清和勻漿物都被用于分析。
3.將巨噬細(xì)胞RAW 264.7(生長到50％匯合)鋪于96孔板，在120μlDulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM；來自Invitrogen life technologies)中孵育。
4.從孔中吸走培養(yǎng)基并加入100μl含有250ng/mL葉粗提蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基。
5.在對照平板中只加入不含葉子組分的DMEM來測試植物材料和緩沖液的毒性。
6.在另一平板中，取40μl植物樣品稀釋液加入RAW 264.7細(xì)胞，其中植物樣品連續(xù)兩倍稀釋以致最高行具有1∶14稀釋的植物提取物。
7.5小時(shí)后向含有細(xì)胞的每孔加入20μl的MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴化物；Sigma)以評估細(xì)胞死亡。
8.在37℃孵育平板5小時(shí)。用針和注射器除去培養(yǎng)基。向每孔加入200μl DMSO并用吸管吹吸以溶解晶體。轉(zhuǎn)移到平板讀數(shù)器上并測量550nm吸收。
在上清和勻漿物組分中都發(fā)現(xiàn)了活性PA。然而，當(dāng)使用具有CHAPS去污劑的抽提緩沖液時(shí)，最大巨噬細(xì)胞裂解活力出現(xiàn)在上清。
作為可食疫苗的霍亂毒素(CTB)抗原葉綠體轉(zhuǎn)基因植物是理想的疫苗生產(chǎn)者。大腸桿菌腸毒素的熱不穩(wěn)定毒素B亞基(LTB)，或霍亂弧菌的霍亂毒素(CTB)被認(rèn)為是疫苗抗原的潛在候選者。通過將未修飾的天然CTB基因整合進(jìn)葉綠體基因組，已在轉(zhuǎn)基因葉綠體中表現(xiàn)出高水平的CTB聚積(Daniell，H.，等人(2001).J.Mol.Biol.311，1001-1009.)。本新方法不僅允許天然CTB基因的高水平表達(dá)而且允許此多聚體蛋白質(zhì)在葉綠體中正確裝配，這一點(diǎn)是必需的，因?yàn)閷τ谠S多疫苗抗原的功能而言，四級結(jié)構(gòu)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。CTB在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平為3.5％至4.1％tsp，并且植物提取物中裝配的5聚體聚集物與純化的細(xì)菌抗原以相似方式發(fā)生結(jié)合，由此證明了蛋白質(zhì)的功能性，并且結(jié)合試驗(yàn)證明葉綠體合成的CTB和細(xì)菌的CTB都與腸膜GM1-神經(jīng)節(jié)苷脂受體結(jié)合，從而確證了轉(zhuǎn)基因葉綠體中CTB5聚體的正確折疊和二硫鍵形成(圖11)。
此外，本發(fā)明考慮了經(jīng)由質(zhì)體表達(dá)的可食疫苗的例子，如CTB(如上文描述)、炭疽熱、瘟疫和其它已知并描述于現(xiàn)有技術(shù)中的疫苗，包括描述于12/26/02提交的PCT/US02/41503中的疫苗。前述申請被完全引入作為參考。本發(fā)明的此方面進(jìn)一步考慮表達(dá)其它治療蛋白質(zhì)，如干擾素、IGF-1、胰島素，它們將被表達(dá)于非綠色植物細(xì)胞中以便用于口服給藥。這類治療蛋白質(zhì)的一個(gè)示例性描述可見于要求美國臨時(shí)申請60/393,439、60/393,428、60/393,451、60/393,649和60/393,438(其中描述了治療蛋白質(zhì)在植物質(zhì)體中的表達(dá))的優(yōu)先權(quán)的PCT申請。
疫苗的口服給藥和不使用抗生素篩選標(biāo)記進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因植物選擇。
來自菠菜的甜菜醛脫氫酶(BADH)基因被用作轉(zhuǎn)化煙草葉綠體基因組的篩選標(biāo)記(Daniell，H.等人，(2001)Curr.Genet.39，109-116)。在含有甜菜醛(BA)的培養(yǎng)基上挑選轉(zhuǎn)基因植物。攜帶BADH活性的轉(zhuǎn)基因葉綠體將有毒的BA轉(zhuǎn)變成有益的甜菜堿(GB)。用包含aadA和BADH基因的構(gòu)建體轟擊的煙草葉在芽再生效率方面表現(xiàn)出非常強(qiáng)烈的差異。與壯觀霉素相比，使用BA選擇，轉(zhuǎn)化和再生效率高出25％，并且在BA上植物繁殖更為迅速。葉綠體轉(zhuǎn)基因植物在不同的發(fā)育階段表現(xiàn)出比未轉(zhuǎn)化的對照高出15到18倍的BADH活力。高BADH表達(dá)水平和由此導(dǎo)致的甜菜堿積聚不會(huì)導(dǎo)致任何多效性，轉(zhuǎn)基因植物形態(tài)正常并且與未轉(zhuǎn)化的對照植物一樣結(jié)籽。在轉(zhuǎn)基因葉綠體中生產(chǎn)人治療蛋白質(zhì)。
人血清白蛋白(HSA)蛋白質(zhì)。
人血清白蛋白(HSA)占血液總蛋白質(zhì)的60％并被廣泛用于多種人類治療。已產(chǎn)生了表達(dá)HSA的葉綠體轉(zhuǎn)基因植物(Fernandez-San Millan等人，(2003)Plant Bitechrzol.J.1，71-79)。HSA在葉綠體轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平達(dá)到了11.1％tsp。在轉(zhuǎn)基因葉綠體中HSA包涵體的形成對于蛋白質(zhì)的純化是有利的。通過離心沉淀包涵體，使用一個(gè)離心步驟即能夠容易的將包涵體與存在于可溶組分中的大多數(shù)細(xì)胞蛋白質(zhì)分開。通過離心進(jìn)行包涵體純化可以不需要昂貴的親和柱或?qū)游黾夹g(shù)。
HSA的純化1.使用含有0.2M NaCl、25mM Tris-HCl(pH7.4)、2mM PMSF和0.1％Triton X-100的提取緩沖液溶解來自轉(zhuǎn)化組織的HSA包涵體。
2.以10,000xg離心。用含有6M Gu-HCl、0.1M βME和0.25mMTris-HCl(pH7.4)的緩沖液懸浮沉淀。
3.用含有100mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH8.5)和1mM EDTA的緩沖液將植物提取物稀釋100倍。
4.通過37％的聚乙二醇處理，沉淀濃縮HSA蛋白質(zhì)。
5.按照供應(yīng)商的使用說明(Bio-Rad，USA)，通過SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)組分并用銀試劑染色凝膠。
電子顯微鏡和免疫金標(biāo)記.
1.將轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的葉子切成1-3mm的方塊。
2.在0.1M、pH7.4的二甲胂酸緩沖液(2.5％戊二醛、2％多聚甲醛和5mM CaCl2)中于真空下固定15分鐘，并在4℃下固定12小時(shí)。
3.固定后在0.1M二甲胂酸緩沖液(pH7.4)中漂洗樣品兩次。
4.通過梯度乙醇系列(直到95％)對固定的樣品脫水，然后于60℃在LRW樹酯中包埋24小時(shí)。
5.使用Leica Ultracut T超薄切片機(jī)切出超薄切片，并將切片收集到鎳網(wǎng)上。
6.將切片在用PBS緩沖液制備的0.05M甘氨酸中孵育15分鐘以失活殘余的醛基。
7.將鎳網(wǎng)放在封閉溶液(含有2％脫脂干牛奶的PBS)滴上并孵育30分鐘。
8.在山羊抗人白蛋白多克隆抗體(使用封閉液進(jìn)行1∶1000到1∶10,000的稀釋)中孵育切片1小時(shí)。
9.用封閉液洗滌切片6次，每次5分鐘。
10.在用封閉液1∶40稀釋的、與10nm金綴合的、兔抗山羊IgG二級抗體中孵育切片兩小時(shí)。
11.用封閉液洗滌切片6次(每次5分鐘)并用PBS洗滌3次(每次5分鐘)，在用PBS稀釋的2％戊二醛中固定切片5分鐘。
12.將固定的切片在PBS中洗滌3次(每次5分鐘)，然后在蒸餾水中洗滌5次，每次兩分鐘。
13.然后使用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對切片染色并使用透射電子顯微鏡于60kv下檢測樣品。
注釋1.懸浮在50％甘油中的金顆粒可以在-20℃儲存幾個(gè)月。避免反復(fù)凍融亞精胺儲存液；溶解后使用一次并丟棄剩余的溶液。使用過濾除菌的新制CaCl2溶液。不要高壓滅菌。
2.DNA在金上的沉淀效率以及DNA-金顆粒在宏載體上的鋪開非常重要。為了經(jīng)由生物轟擊技術(shù)獲得高的轉(zhuǎn)化效率，當(dāng)酒精揮發(fā)后應(yīng)在宏載體盤上出現(xiàn)厚的金顆粒膜。稀疏或稀薄的金沉淀將降低轉(zhuǎn)化效率。
3.通常，表達(dá)盒兩側(cè)各1000bp的側(cè)翼區(qū)足以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定整合。
4.為獲得質(zhì)體中高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，必須使用5’非翻譯區(qū)(5’UTR)和3’非翻譯區(qū)(3’UTR)調(diào)節(jié)信號(13)。轉(zhuǎn)基因在植物葉綠體中的表達(dá)依賴于功能啟動(dòng)子、穩(wěn)定的mRNA、有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)；有效的翻譯由5’和3’非翻譯區(qū)(UTR)決定。可以從煙草葉綠體基因組中擴(kuò)增葉綠體轉(zhuǎn)化元件Prrn、psbA5’UTR、3’UTR。
5.在暗處孵育兩天后，應(yīng)當(dāng)將接受轟擊的葉子切成小方塊(5-7mm)進(jìn)行第一輪選擇，再生的轉(zhuǎn)基因芽應(yīng)當(dāng)切成小方塊(2-4mm)進(jìn)行第二輪選擇。
6.植物生長室的溫度應(yīng)該為約26-28℃，以適宜煙草、馬鈴薯以及番茄組織培養(yǎng)物的生長。在馬鈴薯和番茄中最初的轉(zhuǎn)基因芽誘導(dǎo)需要漫射的光線。然而，更高的光強(qiáng)度對于煙草是無害的。
7.與煙草相比，馬鈴薯和番茄栽培品種的轉(zhuǎn)化效率非常低。
8.如果用于其它植物物種，煙草葉綠體載體會(huì)產(chǎn)生低的轉(zhuǎn)化頻率。例如，當(dāng)碧冬茄葉綠體側(cè)翼序列被用于轉(zhuǎn)化煙草葉綠體基因組(DeGray，G.等人，(2001)，Plant Physiol.127，852-862.)時(shí)，導(dǎo)致了非常低的轉(zhuǎn)化效率。
在漫射光線的條件下，高度再生的番茄栽培品種(Microtom)芽出現(xiàn)提早開花，阻止了轉(zhuǎn)基因植物的進(jìn)一步生長。因此，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)芽誘導(dǎo)期后，應(yīng)當(dāng)將芽移到正常的光線條件下。
示例性實(shí)施例1經(jīng)由胡蘿卜轉(zhuǎn)化的體細(xì)胞胚胎發(fā)生經(jīng)由體細(xì)胞胚胎發(fā)生，表現(xiàn)出高水平鹽耐受性(達(dá)到500mM NaCl)的同質(zhì)性轉(zhuǎn)基因胡蘿卜植物從胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)物中迅速再生。胡蘿卜葉綠體基因組是嚴(yán)格母系遺傳的并且植物在第一年不結(jié)籽，從而徹底的阻止轉(zhuǎn)基因外流。使用生物反應(yīng)器，胡蘿卜細(xì)胞可以迅速擴(kuò)增并產(chǎn)生巨大的生物量。體細(xì)胞胚來源于單細(xì)胞；在培養(yǎng)基中能長期生存的、包裹的胚可以用作人工種子用于低溫儲藏和有控制的萌發(fā)；這些特征為從植物制造藥物蛋白質(zhì)和它們的口服給藥提供了理想的生產(chǎn)系統(tǒng)。BADH表達(dá)細(xì)胞通過它們的綠色提供了目視篩選手段，將它們與未轉(zhuǎn)化的黃色細(xì)胞區(qū)別開來。由此，第一次在非煙草作物中經(jīng)由葉綠體基因組改造了有用的性狀。這是利用非綠色外植體和體細(xì)胞胚胎發(fā)生第一次實(shí)現(xiàn)的質(zhì)體轉(zhuǎn)化，從而開啟了轉(zhuǎn)化單子葉植物、豆科植物、蔬菜、水果作物和在非綠色可食部分表達(dá)轉(zhuǎn)基因的大門。
此實(shí)施例提供了使用非綠色組織作為外植體、經(jīng)由體細(xì)胞胚胎發(fā)生、穩(wěn)定高效質(zhì)體轉(zhuǎn)化胡蘿卜的第一個(gè)報(bào)導(dǎo)。有用的植物性狀(鹽耐受性)第一次在非茄科作物中經(jīng)由葉綠體基因組表達(dá)。迄今為止，只有煙草葉綠體基因組經(jīng)改造而被賦予了除草劑抗性(Daniell等人，1998)、昆蟲抗性(McBride等人，1995；Kota等人，1999；DeCosa等人，2001)、疾病抗性(DeGray等人，2001)、抗旱性(Lee等人，2003)和有毒金屬的植物救治手段(Ruiz等人，2003)。另外，BADH酶的表達(dá)有利于從未轉(zhuǎn)基因的黃色細(xì)胞中通過目視挑選轉(zhuǎn)基因的綠色細(xì)胞。作為一種世界范圍內(nèi)消耗的主要作物，此報(bào)導(dǎo)應(yīng)當(dāng)是使用非綠色組織作為外植體，并通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)行再生來遺傳改造高等植物物種的質(zhì)體基因組的模型。
結(jié)果和討論胡蘿卜質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建胡蘿卜葉綠體載體使表達(dá)盒定向于葉綠體基因組的16S/trnI-trnA/23S區(qū)，以便經(jīng)同源重組進(jìn)行整合。整合的位點(diǎn)與我們實(shí)驗(yàn)室早先報(bào)道的通用葉綠體轉(zhuǎn)化載體(pLD)(Daniell等人，1998；Guda等人，2000)相似，但是本表達(dá)盒兩側(cè)的側(cè)翼序列的大小被加倍了，以提高同源重組的效率。結(jié)果，側(cè)翼序列被增加到接近4kb。葉綠體轉(zhuǎn)化載體pDD-Dc-gfp/BADH(圖1A)是胡蘿卜特異載體，其攜帶由基因10 5’UTR/rpsl6 3’UTR調(diào)節(jié)的gfp基因(便于在綠色和非綠色組織中表達(dá)并通過GFP熒光篩選轉(zhuǎn)化體)和處于psbA 5’和3’UTRs的控制之下表達(dá)的badh基因(便于在綠色組織中表達(dá)，由光線調(diào)節(jié))。除了基因10 5’UTR來自T7噬菌體基因10外，所有5’和3’調(diào)節(jié)元件都是通過PCR從煙草基因組DNA中擴(kuò)增的。在此表達(dá)盒中兩個(gè)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄都由全長Prrn 16S rRNA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，該啟動(dòng)子含有用于核編碼的和質(zhì)體編碼的RNA聚合酶的調(diào)節(jié)元件，因此有利于在綠色和非綠色組織中轉(zhuǎn)錄。葉綠體轉(zhuǎn)化載體pDD-Dc-aadA/BADH(圖1B)帶有aadA和badh基因，它們的表達(dá)分別處于RBS(核糖體結(jié)合位點(diǎn))/3’psbA UTR和基因10 5’UTR/rpsl6 3’UTR調(diào)節(jié)元件調(diào)節(jié)之下由全長16S rRNA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。
值得進(jìn)一步注意的是描述于美國專利申請No.09/079,640的通用載體可以被用來按本申請所描述的方式轉(zhuǎn)化質(zhì)體基因組。
胡蘿卜質(zhì)體的轉(zhuǎn)化和植物的再生如所描述的(Daniell，1997；Kumar和Daniell，2003)，用胡蘿卜葉綠體載體pDD-Dc-gfp/BADH和pDD-Dc-aadA/BADH轟擊從胡蘿卜(Daucuscarota L.cv.Half long)莖節(jié)段誘導(dǎo)的細(xì)的黃色細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。用pDD-Dc-gfp/BADH載體轉(zhuǎn)化的胡蘿卜培養(yǎng)物產(chǎn)生表達(dá)GFP的愈傷組織和體細(xì)胞胚，它們在20mM的甜菜醛(BA)的選擇下于共聚焦顯微鏡下被觀察到(圖2A-C)。雖然表達(dá)GFP的體細(xì)胞胚能夠在BA的選擇下迅速再生是顯而易見的，但是對于此載體的使用仍然有兩個(gè)主要的限制因素。BA非常昂貴($2000-$3000/gm)，因此可以進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)數(shù)量受到了限制，同時(shí)badh基因由psbA啟動(dòng)子和UTR元件調(diào)節(jié)，這便處于發(fā)育和光調(diào)節(jié)之下。不幸的是，培養(yǎng)的胡蘿卜細(xì)胞是非綠色細(xì)胞并且處于發(fā)育的早期階段，從而最小化了badh的表達(dá)。因此，更多的努力集中在使用其它葉綠體載體來轉(zhuǎn)化胡蘿卜細(xì)胞。使用葉綠體載體pDD-Dc-aadA/BADH，在含有不同濃度的壯觀霉素(150-450mg/L)的固體培養(yǎng)基上(MSB+3mg/L 2，4-D，1mg/L激動(dòng)素)于2-3個(gè)月內(nèi)從5個(gè)轟擊獲得了7個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。進(jìn)一步將轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)移到350-mg/L的壯觀霉素中孵育1個(gè)月并使用500-mg/L的壯觀霉素進(jìn)行增殖。在100lx光強(qiáng)度、26±2℃的溫度下孵育所有的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)物。用加入3-mg/L 2，4-D和1mg/L激動(dòng)素連同選擇性試劑的MSB培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)和增殖轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)物的生長培養(yǎng)基。為了擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)物，每隔2-3周將它們在固體培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)一次，并以130rpm在液體培養(yǎng)基(MSB+0.1mg/L 2，4-D)中漫射光(50lx)下培養(yǎng)。沒有2，4-D的培養(yǎng)基(MSB+0.2mg/L激動(dòng)素)被用作將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)變?yōu)樾≈仓甑闹参?再生-培養(yǎng)基。保持在基礎(chǔ)MSB培養(yǎng)基(含500mg/L的壯觀霉素)上的轉(zhuǎn)基因植物被轉(zhuǎn)移到盆裝土壤中，以誘導(dǎo)成熟的主根系統(tǒng)并用于進(jìn)一步的特征描述。
轉(zhuǎn)基因胡蘿卜細(xì)胞的可見篩選。在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因的體外細(xì)胞培養(yǎng)研究中，有趣的是注意到可以基于顏色來區(qū)分胡蘿卜細(xì)胞。攜帶badh轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因胡蘿卜細(xì)胞始終是綠色，而非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞則是黃色(見圖3A-B)。為了驗(yàn)證明亮的轉(zhuǎn)基因綠色細(xì)胞的確是轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，將具有異質(zhì)性(heteroplasmy)(部分轉(zhuǎn)化的質(zhì)體)的胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)物置于不具選擇性的生長培養(yǎng)基上并允許分離；在3-4周內(nèi)，目視綠色和黃色細(xì)胞分離(圖3C-D)。轉(zhuǎn)基因綠色細(xì)胞被證實(shí)為陽性的轉(zhuǎn)基因整合，而黃色細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)是未轉(zhuǎn)化的。此外，當(dāng)將細(xì)胞暴露于不同的NaCl濃度時(shí)，未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的分裂可以受到抑制。當(dāng)使用直接重復(fù)(Iamtham和Day，2002)從轉(zhuǎn)化的葉綠體基因組中排除掉選擇性抗生素標(biāo)記基因后，此可見的選擇系統(tǒng)對于從未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中區(qū)別轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是重要的。研究BADH酶在增加轉(zhuǎn)基因葉綠體的葉綠素生物合成或穩(wěn)定性方面的作用將是有意義的。
轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)胡蘿卜質(zhì)體的確證。
胡蘿卜葉綠體載體pDD-Dc-aadA/BADH通過同源重組將aadA和badh基因整合進(jìn)質(zhì)體基因組的16S-23S-間隔區(qū)。使用內(nèi)部引物組3P(在質(zhì)體的trnI區(qū)上著陸)和3M(在aadA基因上著陸)，通過PCR產(chǎn)生1.6kb的PCR產(chǎn)物，確證轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)胡蘿卜細(xì)胞系(圖4A)。這就排除了可能通過壯觀霉素篩選獲得的、由葉綠體16S rRNA基因突變導(dǎo)致的突變體。為了區(qū)別核和葉綠體轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系(圖4B)，使用在整合位點(diǎn)上游200bp的天然葉綠體基因組上著陸的16S-F引物和在aadA基因上著陸的1M引物，產(chǎn)生2.5kb大小的PCR產(chǎn)物。因?yàn)樵诤宿D(zhuǎn)基因植物中不能獲得這一PCR產(chǎn)物，因此排除了核整合的可能性。因此，PCR分析允許迅速的篩選大量假定的轉(zhuǎn)基因系并消除突變體和核轉(zhuǎn)基因系。
轉(zhuǎn)基因胡蘿卜質(zhì)體中同質(zhì)性的確定。
將PCR確定的轉(zhuǎn)基因胡蘿卜細(xì)胞系在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行一周一次的反復(fù)傳代培養(yǎng)，以在選擇性試劑存在的情況下進(jìn)行幾輪篩選。使用未轉(zhuǎn)化的和從不同轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系發(fā)育而成的轉(zhuǎn)化的胡蘿卜植物，分離總基因組DNA，AflII和PvuII消化后進(jìn)行Southern印跡分析(圖4C)。AflIII限制位點(diǎn)在轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的胡蘿卜質(zhì)體中存在于16S-rRNA區(qū)(左側(cè)翼)中，并且在未轉(zhuǎn)化質(zhì)體的trnI和trnA側(cè)翼區(qū)之間以及在badh轉(zhuǎn)基因的中部區(qū)域具有唯一的PvuII位點(diǎn)，由此允許在未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因系中都切出預(yù)知大小的片段。為了確定異質(zhì)性或同質(zhì)性，用AflIII和PvuII消化的胡蘿卜植物基因組DNA與4.9kb放射性DNA探針雜交。此探針片段分離自用AflIII和PvuII消化的葉綠體載體pDD-Dc-aadA/BADH；此片段包括2.4Kb的trnl側(cè)翼序列和2.5kb的葉綠體載體轉(zhuǎn)基因序列(圖1B)。在具有選擇性試劑(350mg/L壯觀霉素)的液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)兩次后形成的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出異質(zhì)性(圖4C，泳道2)，而在加入高濃度的選擇性試劑(500mg/L壯觀霉素)的液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)8-10次后，由細(xì)胞系形成的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出同質(zhì)性(圖4C，泳道3-8)。
胡蘿卜細(xì)胞、根和芽中的BADH酶活力。
如描述(Daniell等人，2001)，在來自未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)物、主根(胡蘿卜)和葉子的粗提物中分析了BADH酶活力。使用50μg經(jīng)G-25柱脫鹽的來自各樣品的蛋白質(zhì)粗提物，通過評估BADH酶活力，在細(xì)胞以及胡蘿卜植物的不同部分觀察到了badh轉(zhuǎn)基因表達(dá)。BADH酶在甜菜醛存在的情況下將NAD+轉(zhuǎn)變成NADH，因此通過NAD+還原導(dǎo)致的340nm吸收增加來測定反應(yīng)速率。與未轉(zhuǎn)化的胡蘿卜組織相比，來自轉(zhuǎn)基因質(zhì)體(細(xì)胞、主根和葉)的粗提物表現(xiàn)出提高的BADH活力水平(圖5A)。在胡蘿卜葉子、主根和懸浮培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中觀察到的更高的BADH活力，證明全長的16S啟動(dòng)子Prrn和基因10UTR非常適合在各種組織中表達(dá)轉(zhuǎn)基因。因?yàn)轭A(yù)計(jì)這些調(diào)節(jié)元件在所有組織中具有一致的功能，我們推測觀察到的BADH活力差異可能是由于質(zhì)體基因組拷貝數(shù)的差異引起。已知在不同組織中質(zhì)體基因組拷貝數(shù)變化顯著，在根中只觀察到了葉子中的5％(Sasaki等人，1990)。而在胡蘿卜主根中觀察到的高BADH酶活力(葉子的75％)可能是由于存在大量的色質(zhì)體；根據(jù)它們的橙色或紫色，而不是通常在植物中觀察到的僅含有5％質(zhì)體拷貝的無色根而言，這是顯而易見的。
在胡蘿卜細(xì)胞、根和芽中表達(dá)的BADH蛋白質(zhì)為了進(jìn)一步確證在細(xì)胞、主根和葉中的BADH活力結(jié)果，使用從轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的胡蘿卜組織中制備的粗提物進(jìn)行Western印跡分析，將來自每一樣品的組分(50μg蛋白質(zhì))進(jìn)行10％的SDS-PAGE。轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜的蛋白質(zhì)與多克隆抗-BADH血清(在兔子中引起的抗天然BADH抗血清，由Dr.Elisa Soto贈(zèng)與；Figueroa-Soto等人，1999)雜交，使用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二級抗體檢測抗原肽。在未轉(zhuǎn)化的胡蘿卜組織(細(xì)胞、主根和葉)中沒有檢測到badh的表達(dá)(泳道1-3)。而在轉(zhuǎn)基因樣品中(圖5B)，葉(泳道6)和主根(泳道7)中觀察到了比胡蘿卜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物(泳道4)更高的表達(dá)。BADH蛋白質(zhì)在胡蘿卜根和葉組織中的積聚與在轉(zhuǎn)基因根和芽中獲得的BADH酶活力結(jié)果平行。
胡蘿卜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物的鹽耐受性和BADH活力為了測試鹽協(xié)迫是否影響B(tài)ADH活力，在不同鹽濃度(0-500mM NaCl)下對胡蘿卜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。在胡蘿卜細(xì)胞上進(jìn)行了兩周的研究，表明轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠比未轉(zhuǎn)化細(xì)胞在具有更高濃度NaCl的液體培養(yǎng)基中維持和增殖(圖6A-B)。在含有100ml培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，胡蘿卜培養(yǎng)物產(chǎn)生約11.82g轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(1475％)，而當(dāng)存在100mMNaCl時(shí)，兩周后獲得了8.75g轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(1096％)和1.29g未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(161％)(使用的原初培養(yǎng)物每燒瓶含0.8g，見圖6A-B)。
此外，當(dāng)轉(zhuǎn)基因胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于100到300mM NaCl時(shí)，刺激了BADH酶活力。在100和200mM NaCl中見到顯著的最大BADH活力(圖6C)，而這種增加在未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中是不顯著的。這表明盡管在非綠色細(xì)胞或根中質(zhì)體基因組拷貝數(shù)低，但全長的Prrn啟動(dòng)子和基因10 5’UTR有利于在所有組織中有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯，而且與發(fā)育階段無關(guān)。
鹽對胡蘿卜植物的影響在不同的鹽濃度(100-500mM NaCl)下測試轉(zhuǎn)移到盆裝土壤中的轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化胡蘿卜植物。攜帶badh轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物在多達(dá)400mM的NaCl中旺盛生長(圖7)。而未轉(zhuǎn)化的植物在超過200mM NaCl的盆中兩周后死亡。
本發(fā)明的一方面描述轉(zhuǎn)化質(zhì)體的方法，該方法通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生，使用高效率的胡蘿卜質(zhì)體轉(zhuǎn)化法進(jìn)行。本發(fā)明在其它方面提供能夠通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生轉(zhuǎn)化質(zhì)體的載體。而在另一方面提供通過這里描述的方法和載體，經(jīng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生轉(zhuǎn)化的質(zhì)體、植物和植物部分。本申請結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)的知識為改造若干主要作物的質(zhì)體基因組(其中，通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生介導(dǎo)再生)提供了必要的指導(dǎo)和說明。谷類作物(小麥、稻、玉米、甘蔗)、豆類(大豆、苜蓿)、油料作物(向日葵、橄欖)、經(jīng)濟(jì)作物(棉花、咖啡、茶、橡膠、亞麻、栓皮櫟、松樹)、蔬菜(茄子、黃瓜、木薯、智利辣椒、蘆筍等)、水果(蘋果、櫻桃、香蕉、大蕉、瓜類、葡萄、番石榴)、堅(jiān)果(腰果、胡桃、花生)和樹(海棗等)可以通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生再生。
之前報(bào)導(dǎo)了通過轟擊大量的葉外植體進(jìn)行的葉綠體轉(zhuǎn)化，但幾乎未獲得轉(zhuǎn)基因。例如，在馬鈴薯中在200個(gè)轟擊中，在長期組織培養(yǎng)之后僅獲得兩個(gè)轉(zhuǎn)基因芽(Sidorov，1999)。作者描述番茄質(zhì)體的轉(zhuǎn)化進(jìn)行了幾乎兩年(Ruf等人，2001)。相比，本發(fā)明在8-10周內(nèi)，從5個(gè)轟擊中確證了7個(gè)轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定整合的轉(zhuǎn)基因胡蘿卜細(xì)胞系，并且通過8-10周在液體培養(yǎng)基中重復(fù)的傳代培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞培養(yǎng)物的同質(zhì)性。在一個(gè)月之內(nèi)從同質(zhì)性細(xì)胞系中產(chǎn)生了胡蘿卜轉(zhuǎn)基因植物(即可盆栽)。對于質(zhì)體基因組中的轉(zhuǎn)基因整合，在胡蘿卜中獲得的如此高頻率的轉(zhuǎn)化可能是由于幾個(gè)原因所致。使用來自相同物種(即胡蘿卜(Daucus carota L.cv.halflong)天然葉綠體基因組)的長側(cè)翼序列用于同源重組。相比，在番茄和馬鈴薯中用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的葉綠體載體含有來自煙草葉綠體基因組的側(cè)翼序列。相似的，當(dāng)碧冬茄葉綠體側(cè)翼序列被用于轉(zhuǎn)化煙草葉綠體基因組時(shí)，也導(dǎo)致了非常低的轉(zhuǎn)化效率(DeGray等人，2001)。因此，為了推進(jìn)這一研究領(lǐng)域，應(yīng)該對有用作物的葉綠體基因組進(jìn)行測序。當(dāng)不能在Genbank中獲得葉綠體DNA序列時(shí)(如胡蘿卜的例子)，獲得用于同源重組的側(cè)翼序列是非常具有挑戰(zhàn)性的。
在本研究中另一個(gè)重要的觀察結(jié)果是在培養(yǎng)的胡蘿卜細(xì)胞前質(zhì)體中高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。Sidorov等人報(bào)道了在馬鈴薯塊莖的造粉體中GFP的積聚相對于葉子少50倍。與之形成強(qiáng)烈對比，我們報(bào)導(dǎo)在細(xì)胞中觀察到相對于葉子而言53％的BADH活力。這是在前質(zhì)體中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的首次報(bào)導(dǎo)，盡管已有報(bào)導(dǎo)色質(zhì)體可以積聚適當(dāng)數(shù)量的外源基因產(chǎn)物(Ruf等人，2001)。調(diào)節(jié)badh基因翻譯的異源基因10 5’UTR事實(shí)上不是啟動(dòng)子。已知葉綠體psbA 3’UTR能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄物并且轉(zhuǎn)錄終止作用弱(具有30％的終止效率)。然而，如果需要在前質(zhì)體中得到更高的表達(dá)水平(如玉米種子或根的線蟲抗性)，可能期望在基因10 5’UTR上游插入啟動(dòng)子以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。
為了在胡蘿卜系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)同質(zhì)性，需要幾個(gè)循環(huán)的選擇(8-10)以及高選擇壓力。在液體培養(yǎng)物中，胡蘿卜細(xì)胞的所有表面直接暴露于生長培養(yǎng)基。這意味著高選擇壓力，這種壓力可以阻斷未轉(zhuǎn)化質(zhì)體的生長。相對于含有2，4-D的固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基中的胡蘿卜細(xì)胞增殖迅速。一旦2，4-D從胡蘿卜細(xì)胞中清除，胡蘿卜細(xì)胞迅速轉(zhuǎn)變成成熟體細(xì)胞胚，并大量形成小植株。為實(shí)現(xiàn)同質(zhì)性，另一需要是可獲得用于整合進(jìn)每個(gè)細(xì)胞數(shù)以千計(jì)的質(zhì)體基因組中的模板。我們在先前已經(jīng)證實(shí)利用含有完全的葉綠體復(fù)制起點(diǎn)的葉綠體側(cè)翼序列可以在葉綠體中提供大量的模板(Daniell等人，1990)并幫助實(shí)現(xiàn)同質(zhì)性，即便是在首輪篩選中(Guda等人，2000)。在胡蘿卜葉綠體載體中包含葉綠體復(fù)制起點(diǎn)(推測此ori在其它植物物種中存在于相同的位點(diǎn))應(yīng)該有助于在少數(shù)細(xì)胞分裂循環(huán)中實(shí)現(xiàn)同質(zhì)性。
胡蘿卜細(xì)胞具有通過體細(xì)胞胚迅速繁殖的巨大潛力，在暴露于用于將其轉(zhuǎn)變成植物的成熟培養(yǎng)基之前其會(huì)產(chǎn)生次生體細(xì)胞胚(循環(huán)胚發(fā)生)，并且此培養(yǎng)物可以在體外培養(yǎng)中維持幾年。在胡蘿卜栽培品種US-Harumakigosun中，在適宜生長培養(yǎng)基中保持5年的胡蘿卜胚性愈傷組織通過液體細(xì)胞培養(yǎng)(使用旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器)持繼245天連續(xù)產(chǎn)生了大量的植物(4×107小植株/L-培養(yǎng)基/天)，而且生產(chǎn)力沒有任何下降(Nagamori等人，1999)。體細(xì)胞胚的另一優(yōu)點(diǎn)是它們可以被用作人工種子。人造或人工種子已經(jīng)被定義為包裹于藻酸鈉小珠或基質(zhì)中用于商業(yè)植物繁殖的體細(xì)胞胚。例如，包裹于藻酸-gellan膠(脫水至15％RH，并在潮濕的空氣中重新水合至90％RH)的胡蘿卜體細(xì)胞胚在土壤中達(dá)到73％的萌發(fā)率(Timbert等，1996)，固定化細(xì)胞比非固定化細(xì)胞獲得了高出1.5倍的再生頻率(Nagamori等人，1999)。利用人工種子技術(shù)可以長時(shí)間低溫保存胡蘿卜和其它植物物種中的期望原種基因型(Tessereau等人，1994)，并且一旦需要，這些繁殖體可以被用于在溫室或田間同步種植植物。而為了最小化治療蛋白質(zhì)的異質(zhì)性，高度需要單一的生產(chǎn)源。
甜菜堿(GB)是所有活的生物體正常產(chǎn)生的化合物，并且研究提示許多高等植物、細(xì)菌、海洋生物和哺乳動(dòng)物物種在缺水或鹽協(xié)迫下會(huì)積聚GB。在植物、細(xì)菌和哺乳動(dòng)物腎組織中，GB作為滲透壓保護(hù)劑起作用。在豬腎中，BADH定位于皮質(zhì)和內(nèi)部的髓質(zhì)，它專門定位于圍繞暴露于尿液和高鹽化合物的小管的細(xì)胞上(Figueroa-Soto等人，1999)。甜菜堿是在大鼠腎臟內(nèi)部的髓質(zhì)中鑒定到的主要相容性有機(jī)滲壓劑之一，它有助于腎臟細(xì)胞在暴露于高滲和致死水平的尿液時(shí)存活并正常運(yùn)作。
這些事實(shí)表明在人或動(dòng)物消耗的食物中BADH酶的存在或GB的聚積是有利的。在植物中，由于灌溉實(shí)踐和不斷增加的對淡水供給的需要，鹽協(xié)迫對于農(nóng)作物植物的生長和產(chǎn)量是持續(xù)并不斷增長的有害因素；因此，耐鹽農(nóng)作物植物工程一直是一個(gè)長期被深入研究的科題(Apse MP和Blumwald E，2002)。降低這一協(xié)迫導(dǎo)致的損害的有效機(jī)制之一是通過基因工程在植物中積聚高細(xì)胞內(nèi)水平的滲透壓保護(hù)劑化合物(如甜菜堿)(Rontein等人，2002)。
實(shí)驗(yàn)方案質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建。
按照廠商方案，使用DNeasy Plant Mini試劑盒(Qiagenen Inc.)從葉子中分離胡蘿卜基因組，并從胡蘿卜基因組中擴(kuò)增作為胡蘿卜側(cè)翼序列的DNA片段。利用從煙草葉綠體基因組序列產(chǎn)生的引物，使用Platinum PfxDNA聚合酶(Invitrogen Inc.)擴(kuò)增此側(cè)翼序列片段。擴(kuò)增的片段為葉綠體基因組的16S/trnI-trnA/23S區(qū)，約4.2kb大小。用T4多核苷酸激酶(Promega)處理PCR擴(kuò)增的DNA片段并克隆進(jìn)PvuII消化的、用蝦堿性磷酸酶(Promega)去磷酸化的pBluescript II KS。激酶和去磷酸化反應(yīng)分別根據(jù)廠商的使用說明來完成?；趶臒煵萑~綠體基因組(登錄號NC 001879)中獲得的信息，使用PCR擴(kuò)增葉綠體啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)序列。通過向胡蘿卜葉綠體DNA側(cè)翼序列的PvuII位點(diǎn)插入代表gfp/BADH表達(dá)盒的平末端ClaI-SacI片段從而構(gòu)建胡蘿卜特異的葉綠體轉(zhuǎn)化載體pDD-Dc-gfp/BADH(圖1A)。sm-gfp基因來自TAIR。相似的，通過向胡蘿卜葉綠體DNA側(cè)翼序列的PvuII位點(diǎn)(去磷酸化后)插入代表aadA/BADH表達(dá)盒的平末端ApaI片段，構(gòu)建胡蘿卜葉綠體轉(zhuǎn)化載體pDD-Dc-aadA/BADH(圖1B)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方案進(jìn)行細(xì)菌和DNA操作。
注意，可以使用的潛在載體是如提交于2002年12月26日的美國專利申請No.PCT/us02/41503中描述的雙管質(zhì)體載體(double barrel plastidvector)。此申請被全文引入作為參考，但是為了簡便的目的，我們包括了描述此葉綠體雙管載體的特殊段落。下文提供的描述將有助于理解本申請圖9-28所表示的質(zhì)粒。
迄今為止只在少數(shù)茄科作物中實(shí)現(xiàn)了葉綠體轉(zhuǎn)化。在向其它作物拓展這一技術(shù)時(shí)存在若干挑戰(zhàn)。迄今只有使用葉作為外植體時(shí)的綠色葉綠體被轉(zhuǎn)化。然而，對于許多作物(包括單子葉作物)而言，用作外植體的是培養(yǎng)的非綠色細(xì)胞或其它非綠色植物部分。這些非綠色組織含有前質(zhì)體而不是葉綠體，這兩者中的基因表達(dá)和基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)十分不同。在轉(zhuǎn)化過程中，轉(zhuǎn)化的前質(zhì)體應(yīng)該發(fā)育成成熟的葉綠體并且轉(zhuǎn)化的細(xì)胞應(yīng)該能在發(fā)育的所有階段歷經(jīng)選擇過程而存活。因此，最主要的挑戰(zhàn)是賦于葉綠體在不同的發(fā)育階段于光暗中經(jīng)歷選擇并存活的能力。這是絕對關(guān)鍵的，因?yàn)樵谝粋€(gè)植物細(xì)胞中只有一個(gè)或兩個(gè)葉綠體被轉(zhuǎn)化，這些質(zhì)體應(yīng)該具有在選擇壓力中生存、增殖并建立自己的能力，而所有其它未轉(zhuǎn)化的質(zhì)體在選擇過程中被消滅。雙管質(zhì)體載體通過使用編碼兩種不同的、但能夠解除相同選擇標(biāo)記(或具有相同譜型的選擇標(biāo)記)毒性的酶的基因，并使這些基因處于在前質(zhì)體和成熟葉綠體中均具有功能的調(diào)節(jié)信號驅(qū)動(dòng)之下，而實(shí)現(xiàn)了這一點(diǎn)。
這里描述的質(zhì)體載體是若干這種非限制性例子中的一個(gè)。葉綠體側(cè)翼序列含有適當(dāng)?shù)木幋a序列和間隔區(qū)(轉(zhuǎn)基因盒插入其中)。質(zhì)體基因組中的任何間隔序列都可以用作轉(zhuǎn)基因整合的靶點(diǎn)，包括轉(zhuǎn)錄的和轉(zhuǎn)錄沉默的間隔區(qū)。aphA-6和aphA-2(nptII)基因都編碼屬于氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶家族的酶，但是它們起源于不同的原核生物。因?yàn)槿~綠體基因組的原核性質(zhì)，這些基因無需密碼子的優(yōu)化就能理想的用于轉(zhuǎn)基因葉綠體。原核起源的基因已在轉(zhuǎn)基因葉綠體中以非常高的水平表達(dá)(達(dá)到總可溶蛋白質(zhì)的47％，DeCosa等人，2001)。兩種酶具有相似的催化活力，但是aphA-6基因產(chǎn)物具有擴(kuò)展的解毒卡那霉素的能力，并且提供了更廣泛的氨基糖苷解毒譜(包括丁胺卡那霉素)。選擇卡那霉素作選擇性標(biāo)記的優(yōu)勢是不存在它的天然抗性，不像在許多單子葉植物中以及在選擇過程中16S rRNA基因的自發(fā)點(diǎn)突變中觀察到的壯觀霉素抗性。此外，卡拉霉素并不在人類臨床中作為抗生素使用，并且含有卡拉霉素抗性核轉(zhuǎn)基因的若干作物已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于人消費(fèi)以及在市場上流通(如風(fēng)味番茄)。
如圖36所示，在此非限制性的例子中，所有的轉(zhuǎn)基因都由質(zhì)體Prrn啟動(dòng)子調(diào)節(jié)；這一16SrRNA啟動(dòng)子在天然葉綠體基因組中驅(qū)動(dòng)整個(gè)rRNA操縱子并含有核編碼的和質(zhì)體編碼的RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)。因此，此啟動(dòng)子能夠在前質(zhì)體和葉綠體(綠色和非綠色，在亮處和暗處)中行使功能。aphA-6基因還被基因10 5’UTR進(jìn)一步調(diào)節(jié)，該5’UTR能夠在非綠色組織的前質(zhì)體中于暗處實(shí)現(xiàn)有效的翻譯(見圖32和2中玉米和胡蘿卜非綠色細(xì)胞前質(zhì)體中由16S rRNA啟動(dòng)子和基因10UTR調(diào)節(jié)的GFP表達(dá))。rps 16 3’UTR被用于穩(wěn)定aphA-6基因轉(zhuǎn)錄物。在另一方面，aphA-2(nptll)基因被psb啟動(dòng)子5’和3’UTR調(diào)節(jié)，該啟動(dòng)子是光調(diào)節(jié)的，當(dāng)處于光照下時(shí)，在葉綠體中高度有效(見A.Fernandez-San Millan，A.Mingeo-Castel，M.Miller和H.Daniell，2003，A chloroplast transgenic approach tohyperexpress和purify Human Serum Albumin，a protein highlysusceptible to proteolytic degradation.Plant Biotechnology Journal，出版中；也見于WO 01/72959)。
因此，受前質(zhì)體和葉綠體中光和暗調(diào)節(jié)信號驅(qū)動(dòng)的aphA-6和aphA-2基因的組合，晝夜不間斷地保護(hù)轉(zhuǎn)化的質(zhì)體/葉綠體免于選擇性試劑的損害。具有適當(dāng)調(diào)節(jié)信號的目的基因(基因X)被插在雙管選擇系統(tǒng)的下游或上游。因?yàn)榭梢栽陂g隔區(qū)域中插入多個(gè)基因(DeCosa等人，2001，Daniell&Dhingra，2002)，插入的轉(zhuǎn)基因數(shù)量并不會(huì)為操縱子的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄加工和翻譯帶來困難(WO 01/64024)。在此實(shí)施例的一種變通方案中，使用適當(dāng)?shù)膫?cè)翼序列并經(jīng)兩載體的共轉(zhuǎn)化，將與不同轉(zhuǎn)基因偶聯(lián)的aphA-6和aphA-2基因插入同一葉綠體基因組的不同間隔區(qū)。
植物材料的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植物的再生在含有MS鹽(Murashige和Skoog，1962)、維生素B5(Gamborg等人，1968)、2％蔗糖和0.8％瓊脂的培養(yǎng)基中于植物組織培養(yǎng)試管中長出無菌胡蘿卜植物(Daucus carota L.cv.Half long)。將下胚軸切成0.5mm的節(jié)段并置于含有3％蔗糖、0.1mg/l 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、pH5.7的50mlMSB液體培養(yǎng)基中。在26±2℃、120rpm下連續(xù)振蕩3周后，在100μM篩子上收集離散的細(xì)胞，離心細(xì)胞(150xg 10分鐘)并在新鮮培養(yǎng)基中重懸浮。對迅速生長的均質(zhì)黃色細(xì)胞進(jìn)行每周傳代培養(yǎng)。將通過100μM篩子過濾的細(xì)的胡蘿卜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物均勻的涂布于補(bǔ)加3mg/L 2，4-D和1mg/L激動(dòng)素的MSB固體培養(yǎng)基上，并用胡蘿卜特異的質(zhì)體載體轟擊(圖1A-B)。轟擊的愈傷組織在暗處孵育兩天后，于含有3mg/L 2，4-D和1mg/L激動(dòng)素和不同濃度甜菜醛(10，15，20和25mM BA)及壯觀霉素150、250、350和450mg/L)的MSB培養(yǎng)基上篩選。在16/8h光/暗周期中、以50-100 1x光強(qiáng)度和溫度26±2℃孵育培養(yǎng)物。使用加入選擇性試劑的固體和液體培養(yǎng)基擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)物。將通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生(在含有0.2mg/L的MSB培養(yǎng)基上)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物移植到盆裝土壤中。盆在第一周被罩以塑料袋以保持高濕度，并以濃度逐漸降低的MS鹽進(jìn)行第一周的灌溉，在第二周則灌溉自來水。
DNA提取、PCR和Southern印跡分析。使用Plant Dneasy試劑盒(Quiagen Inc.USA)分離總基因組DNA以進(jìn)行轉(zhuǎn)基因胡蘿卜的PCR和Southern印跡分析。使用10x PCR緩沖液及Taq DNA聚合酶和引物對3P/3M(分別在側(cè)翼序列/aadA基因上著陸)和16SF/1M(分別在天然葉綠體基因組/aadA基因上著陸)進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)條件是將50ng DNA模板在94℃變性5分鐘，進(jìn)行25個(gè)PCR循環(huán)(94℃1分鐘、64℃1分鐘、72℃3分鐘)，最后72℃延伸10分鐘。
為進(jìn)行Southern印跡分析，用PvuII和AflIII消化植物DNA并將其轉(zhuǎn)移到尼龍膜上與4.9 kb探針雜交，探針是通過用PvuII和AflIII消化pDD-Dc-aadA/badh載體并用ProbeQuant G-50柱(Amersham，USA)標(biāo)記上32P而產(chǎn)生的。使用Stratagene Quick-HYB雜交緩沖液并按照供應(yīng)商的使用說明(Stratagene，USA)將印跡與探針雜交。
BADH酶活力和免疫印跡分析。如描述的(Daniell等，2001)進(jìn)行了BADH(甜菜醛脫氫酶)的提取和活力分析。將1g胡蘿卜組織置于兩毫升含有50mM Hepes-KOH(pH8.0)、1mM EDTA、20mM偏亞硫酸氫鈉、10mM硼酸鈉、5mM抗壞血酸和5mM DTT的緩沖液中研磨。在4℃以10000xg將粗提物離心10分鐘并使用Sephadex G-25柱(AmershamPharmacia biotech，USA)對上清脫鹽。在向1mL試驗(yàn)緩沖液(50mMHepes-KOH，pH8.0；1mM EDTA、5mM DTT、1mM NAD+)中于25℃加入1mM BA起始反應(yīng)后1分鐘和10分鐘，用分光光度法于340nm測量被BADH還原的NAD+。
為進(jìn)行免疫印跡分析，使用2x Laemmli緩沖液從100mg胡蘿卜組織中分離總可溶蛋白質(zhì)。將混合物煮沸5分鐘并在10000xg離心5分鐘。將含有50μg總可溶蛋白質(zhì)的上清(用Bradford試驗(yàn)定量)上樣到10％SDS-PAGE凝膠上并轉(zhuǎn)移到印跡膜上。使在兔子中抗BADH產(chǎn)生的多克隆抗BADH血清(由Dr.Elisa Soto提供)與膜雜交。使用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二級抗體，通過Lumi-PhosTMWB化學(xué)發(fā)光試劑(Pierce，USA)檢測雜交的肽。
轉(zhuǎn)基因植物鹽耐受性的分析。在0、100、200、300、400和500mM NaCl中分別分析轉(zhuǎn)移到盆中土壤的具有相同形態(tài)發(fā)生生長階段和高度的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因胡蘿卜植物，以評價(jià)鹽耐受性。將植物保持在生長室中，并用具有不同鹽濃度水平的鹽水每日灌溉持續(xù)1個(gè)月。
說明性實(shí)施例2棉花轉(zhuǎn)化材料和方法植物材料和轉(zhuǎn)化通過在70％的乙醇中浸泡兩分鐘，再用含有約4％可利用的氯的次氯酸鈉溶液處理8分鐘，然后用0.1％的氯化汞溶液(w/v)處理5分鐘，從而對脫絨的棉花(Gossypium hirsutum L.cv.Coker310FR)種子滅菌。表面滅菌及用無菌水洗滌種子4-5次后，種子保持在無菌水中4-5小時(shí)以軟化種皮。在將種子置于含有一半濃度的MS鹽(Murashige和Skoog，1962)和維生素B5(Gamborg等1968)及1.5％蔗糖的1/2 MSB培養(yǎng)基之上前，完全除去種皮。將5日齡幼苗的下胚軸外植體(4-6mm長)垂直置于MST1培養(yǎng)基(含有MS鹽、維生素B5、0.1mg/l 2，4-D、0.5mg/l激動(dòng)素和3％葡萄糖)上，以誘導(dǎo)愈傷組織。使用基于氦的生物轟擊粒子槍(Bio-Rad)，用包被葉綠體載體的金顆粒轟擊均一分散的胚前愈傷組織。棉花愈傷組織的轉(zhuǎn)化使用如下參數(shù)優(yōu)化0.6μm的金顆粒宏載體、27英寸Hg柱室真空、1550psi氦壓、6mm的破裂膜與宏載體間隙、6mm的宏載體飛行距離、6cm靶距離和10μl包被在金顆粒上的葉綠體載體。轟擊后的培養(yǎng)物在暗處孵育24小時(shí)，之后被轉(zhuǎn)移到補(bǔ)加有50mg/l卡那霉素的MST1選擇培養(yǎng)基上并于16/8 h光/暗周期、750lux光強(qiáng)度和28±2℃的溫度條件下孵育。在補(bǔ)加50mg/l卡那霉素的MSTI培養(yǎng)基上擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因胚發(fā)生培養(yǎng)物(圖34)并通過PCR確證轉(zhuǎn)基因aphA-6基因整合進(jìn)培養(yǎng)物(圖35)。
說明性實(shí)施例3表達(dá)盒的構(gòu)建材料和方法側(cè)翼序列的擴(kuò)增和克隆按照廠商方案，使用Qiagen植物提取試劑盒從葉子中分離植物基因組DNA，并從基因組DNA中擴(kuò)增代表側(cè)翼序列的DNA片段。利用引物ADLF-5’gtgtcagtgtcggcccagcagag 3’和ADLR-5’aacaggggtcaaggtcggccag 3’，使用Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen Inc.)擴(kuò)增側(cè)翼序列片段。擴(kuò)增的片段為葉綠體基因組的16S/trnI-trnA/23S區(qū)，大小約為4.2kb。用T4多核苷酸激酶(Promega)處理PCR擴(kuò)增的DNA片段，并克隆進(jìn)PvuII消化的、用蝦堿性磷酸酶(Promega)去磷酸化的pBluescript II KS。激酶和去磷酸化反應(yīng)分別根據(jù)廠商的使用說明來完成。攜帶胡蘿卜特異的側(cè)翼區(qū)的克隆被命名為pDA-35。
表達(dá)盒的構(gòu)建pDA-29是克隆進(jìn)pBluescript II KS的葉綠體特異的表達(dá)盒，它攜帶提供壯觀霉素和鏈霉素抗性的aadA基因和將有毒的甜菜醛分解代謝成甜菜堿的badh基因。前一個(gè)基因的表達(dá)由16S Prrn啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，處于Shine-Dalgarno序列(在5’端)和psbA 3’UTR(在3’端)的調(diào)節(jié)下。badh基因的表達(dá)由異源的T7基因10 5’UTR和rpsl6 3’UTR調(diào)節(jié)。aadA基因來自pLD-CtV(Daniell等人，1998)，badh基因來自pLD-BADH(Daniell等人，2001)。另一個(gè)葉綠體表達(dá)盒pDA-30攜帶編碼可溶的、修飾的綠色熒光蛋白質(zhì)(來自TAIR)的sm-gfp基因和badh基因。sm-gfp的表達(dá)由16S Prrn啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，并被異源的T7基因10 5’UTR和rpsl63’UTR調(diào)節(jié)。badh基因的表達(dá)被psbA啟動(dòng)子/5’UTR和3’UTR調(diào)節(jié)?；趶臒煵萑~綠體基因組中所獲得的信息(Shinozaki等人，1987)，使用PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)序列。
葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建葉綠體轉(zhuǎn)化載體pDD-XX-aadA/badh是攜帶側(cè)翼序列和pDA-29表達(dá)盒的pDA載體衍生物。來自pDA-29的表達(dá)盒以ApaI片段的形式獲得，使用klenow DNA聚合酶(NEB)按照廠商的使用說明，產(chǎn)生平末端，并克隆進(jìn)PvuII消化并去磷酸化的pDA-35中。另一物種特異的葉綠體轉(zhuǎn)化載體pDD-XX-gfp/badh攜帶胡蘿卜側(cè)翼序列和pDA-30表達(dá)盒。來自pDA-30的表達(dá)盒以ClaI/SacI片段的形式獲得，處理成平末端后克隆進(jìn)PvuII消化并去磷酸化的pDA-35中。
細(xì)菌和DNA操作按照標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)操作方案進(jìn)行。
說明性實(shí)施例4玉米轉(zhuǎn)化為了遺傳改造玉米葉綠體基因組，使用特異的PCR引物擴(kuò)增玉米特異的序列(trnI和trnA)(玉米葉綠體基因組中其位于目的整合位點(diǎn)側(cè)翼)并經(jīng)亞克隆而成為甜菜醛脫氫酶(BADH)選擇性標(biāo)記及綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)報(bào)告基因表達(dá)盒的側(cè)翼。愈傷組織培養(yǎng)由無菌切下的未成熟合子胚(1-2mm長)(產(chǎn)生于Hill(F1)玉米植物自花授粉的穗上)起始。穗在含有2.6％的次氯酸鈉(使用商業(yè)漂白劑制備)、1％Tween 20(聚氧乙烯失水山梨醇醚單月桂酸酯)的溶液中不停振蕩下浸泡20分鐘進(jìn)行表面滅菌，然后在無菌蒸餾水中漂洗4次。然后將胚置于含有N6鹽和維生素(463.0mg/l(NH4)2SO4、2830.0mg/l KNO3、400mg/l KH2PO4、166.0mg/lCaCl2、185mg/l MgSO4.7H2O、37.3mg/l Na2-EDTA、27.85mg/lFeSO4·7H2O、1.6mg/l H3BO3、4.4mg/l MnSO4·H2O、·8，KI、1.5mg/lZnSO4·7H2O)、2％蔗糖和1.0mg/l 2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基CI-1上，使圓的盾側(cè)(scutellar side)暴露于外，扁平的胚芽-胚根軸側(cè)(plumule-radicle axis side)與培養(yǎng)基接觸。愈傷組織培養(yǎng)物在25-28℃保持于暗處并且每隔兩周進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
胚性愈傷組織的微粒轟擊用DNA(pDA34-ZM-gfp-BADH和pDA33-ZM-aadA-BADH)包裹微粒并使用生物轟擊裝置PDS1000/He(Bio-Rad)進(jìn)行轟擊。
在轟擊之前挑選胚性愈傷組織，轉(zhuǎn)移到無菌濾紙(Watman No.l)上，并置于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)皿(100×15mm)中的新鮮培養(yǎng)基表面。然后按如下用質(zhì)粒DNA包被金顆粒(0.6μm)50μl清洗后的金顆粒與10μl DNA(1μg/μl)、50μl 2.5M CaCl2、20μl 0.1M的亞精胺混合并渦旋振蕩。在3000rpm將顆粒離心幾秒，然后倒掉乙醇。用乙醇洗滌5次，然后將沉淀重新懸浮于30μl的100％的乙醇中并置于冰上直到用于轟擊(在兩小時(shí)內(nèi)使用包被的顆粒)。使用PDS1000/He(Bio Rad)生物轟擊裝置，將靶樣品在部分真空(28英寸汞柱)下于樣品室上樣(level 2)，進(jìn)行轟擊。
使用1100psi破裂膜，用玉米葉綠體轉(zhuǎn)化載體轟擊愈傷組織培養(yǎng)物。轟擊之后將外植體轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基，用微孔膠帶(micropore tape)密封平板并在25-28℃于暗處孵育。
選擇轟擊后2天開始選擇。轟擊的愈傷組織被轉(zhuǎn)移到含有5-20mM BA(甜菜醛)或25-100mg/l鏈霉素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。也使用50-150mMNaCl結(jié)合BA進(jìn)行篩選，以保持滲透壓。
再生在轟擊之后6到8周，通過將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有Ms鹽和維生素并補(bǔ)加入1.0mg/l NAA(α-萘乙酸)、2％蔗糖、2g/l肌醇和.3％phytagel的R1培養(yǎng)基(pH5.8)上，開始再生。將再生的植物轉(zhuǎn)移到含有1/2MS鹽和維生素、3％蔗糖和.3％phytagel的R2(pH5.8)上。將再生的植物保持在光照下(16/8hr的光周期)。
芽的擴(kuò)增玉米種子的表面滅菌和萌發(fā)玉米種子在含有2.6％的次氯酸鈉(使用商業(yè)漂白劑制備)、.1％Tween20的溶液中連續(xù)振蕩20分鐘進(jìn)行表面滅菌，然后在無菌蒸餾水中漂洗4次。種子于暗處于MS培養(yǎng)基(pH5.8)上生長、。從3日齡的幼苗上無菌切下節(jié)片(nodal section)，節(jié)片在幼苗上呈現(xiàn)清楚的劃分并代表第7節(jié)。當(dāng)被切下后，橫截的節(jié)片是1.3到1.5mm長。
節(jié)片的粒子轟擊在轟擊前，20-30個(gè)節(jié)片被置于每一培養(yǎng)皿的中心，以向頂端(acropitilaend)朝上。使用1100、1300和1550psi的破裂膜，用玉米葉綠體轉(zhuǎn)化載體進(jìn)行轟擊。
多芽的誘導(dǎo)和選擇將節(jié)片外植體以向頂端向上放置于由MS鹽和維生素、1.0mg/l 6BA(6-苯基氨基嘌呤)、3％蔗糖和5g/l phytagel組成的pH5.8的芽擴(kuò)增培養(yǎng)基SM1上，在25℃持續(xù)光照。培養(yǎng)2到4周后開始從原來的芽尖產(chǎn)生芽尖團(tuán)塊。轟擊后2天，將轉(zhuǎn)化的節(jié)片轉(zhuǎn)移到含有5-20mM BA或50-100mg/l鏈霉素選擇性試劑的芽擴(kuò)增培養(yǎng)基。通過在含有5-20mM BA或25-100mg/l鏈霉素的選擇性芽擴(kuò)增培養(yǎng)基上篩選、分裂和傳代培養(yǎng)綠色團(tuán)塊，由此每隔兩周進(jìn)行相繼的傳代培養(yǎng)。
再生通過將多芽團(tuán)塊轉(zhuǎn)移到含有MS鹽、維生素、5mg/l IBA和3％蔗糖的pH5.8的再生培養(yǎng)基M1上，使之再生。將芽尖團(tuán)塊轉(zhuǎn)移到含有1/2 MS鹽和維生素、3％蔗糖和3g/l phytagel的M2培養(yǎng)基(pH5.8)上使形成的芽再生。值得進(jìn)一步注意的是，所有的再生培養(yǎng)基被補(bǔ)加有5-20mM BA或25-100mg/l鏈霉素作為選擇性試劑。
為了在改造玉米葉綠體基因組時(shí)不使用抗生素抗性基因，用含有綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)和甜菜醛脫氫酶(BADH)基因作為選擇性或篩選性標(biāo)記的葉綠體表達(dá)載體轟擊玉米愈傷組織。為了比較甜菜醛(BA)選擇和鏈霉素，構(gòu)建了含有aadA和BADH基因的另一個(gè)葉綠體表達(dá)載體。在BA選擇中比在鏈霉素選擇中，推定的轉(zhuǎn)基因事件數(shù)量高。使用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測BA上篩選的轉(zhuǎn)基因玉米組織。在整個(gè)的玉米體細(xì)胞胚上觀察到GFP熒光。玉米葉綠體的轉(zhuǎn)化提供了一個(gè)生產(chǎn)可食疫苗和可口服給藥的生物藥物的合適途徑。
玉米葉綠體轉(zhuǎn)化載體玉米葉綠體轉(zhuǎn)化載體有利于轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)玉米葉綠體基因組的反向重復(fù)區(qū)(IR)。載體pLD-Corn-BADH含有由組成型16SrRNA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)并受來自碧冬茄質(zhì)體基因組的psbA基因3’UTR區(qū)調(diào)節(jié)的嵌合aadA基因和BADH基因。在此構(gòu)建體中，aadA和BADH都具有葉綠體優(yōu)選的核糖體結(jié)合位點(diǎn)——GGAGG。另一用于玉米葉綠體轉(zhuǎn)化的載體pLD-corn-UTR-BADH具有驅(qū)動(dòng)此雙順反子(dicistron)表達(dá)的組成型16SrRNA啟動(dòng)子，但是BADH處于此啟動(dòng)子和psbA基因5’UTR和psbA基因3’UTR的調(diào)節(jié)之下，以增強(qiáng)表達(dá)。因?yàn)樾枰谟衩追N子的色質(zhì)體中表達(dá)外源蛋白質(zhì)，所以需要將目的基因置于不受細(xì)胞控制的調(diào)節(jié)序列的控制之下。在本文中，候選調(diào)節(jié)序列的合適例子是T7基因10前導(dǎo)序列和cry2Aa2 UTR。T7基因10前導(dǎo)序列被用于在轉(zhuǎn)基因色質(zhì)體中表達(dá)外源蛋白質(zhì)。cry2Aa2 UTR已經(jīng)被本發(fā)明人證實(shí)能夠與綠色組織中的psbA UTR同樣有效地使外源蛋白質(zhì)在色質(zhì)體中積累。因此，對于其它載體，選擇性標(biāo)記使用處于psbA啟動(dòng)子和5’UTR調(diào)節(jié)下的BADH基因，因?yàn)閜sbA是在綠色組織中被最有效地翻譯的葉綠體基因之一。當(dāng)使用綠色組織或非綠色胚性愈傷組織向玉米葉綠體基因組引入轉(zhuǎn)基因時(shí)，優(yōu)選分別使用光調(diào)節(jié)的psbA啟動(dòng)子/UTR或16SrRNA啟動(dòng)子/基因10UTR。
以下列出的例子(其中本申請人說明了玉米、棉花和胡蘿卜的體細(xì)胞胚胎發(fā)生)清楚地說明基于本申請的描述和這里包含的實(shí)施例，多種植物均可以進(jìn)行轉(zhuǎn)化。以下列出的多個(gè)示范性參考文獻(xiàn)說明了在多種植物中通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)行的植物轉(zhuǎn)化方法學(xué)，其進(jìn)一步支持了可以在多種植物中進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化以在這些植物中實(shí)現(xiàn)胚胎發(fā)生。以下參考文獻(xiàn)示例了經(jīng)由胚發(fā)生的作物再生和/或經(jīng)由核基因組的作物/植物轉(zhuǎn)化。作為結(jié)果，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用以下示范性參考文獻(xiàn)中描述的體細(xì)胞胚胎發(fā)生方案，結(jié)合本說明書中描述的葉綠體載體來實(shí)現(xiàn)經(jīng)由非綠色植物細(xì)胞的質(zhì)體轉(zhuǎn)化。換句話說，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到以下方案可應(yīng)用于本說明書中描述的內(nèi)容。以下列出的參考文獻(xiàn)(被全文引入本申請)描述經(jīng)由體細(xì)胞胚胎發(fā)生的植物轉(zhuǎn)化。
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權(quán)利要求
1.適于轉(zhuǎn)化非綠色植物細(xì)胞的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體，所述質(zhì)體載體包含可操作連接的成分——第一側(cè)翼序列、編碼外源基因的DNA序列和第二側(cè)翼序列。
2.權(quán)利要求1的載體，其還包含在所述質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體中具有功能的調(diào)節(jié)序列。
3.權(quán)利要求2的載體，其中所述調(diào)節(jié)序列包含在所述質(zhì)體基因組中生效的啟動(dòng)子。
4.權(quán)利要求3的載體，其中所述啟動(dòng)子是Prrn 16S rRNA。
5.權(quán)利要求4的載體，其中所述調(diào)節(jié)序列包含psbA 5’和psbA 3’元件。
6.權(quán)利要求2的載體，其中所述調(diào)節(jié)序列還包含能增強(qiáng)編碼外源基因的所述DNA序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的5’UTR。
7.權(quán)利要求2的載體，其中所述調(diào)節(jié)序列還包含能賦予編碼外源基因的所述DNA序列轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性的3’非翻譯區(qū)(UTR)。
8.權(quán)利要求2的載體，其中所述調(diào)節(jié)序列還包含基因10 5’UTR。
9.權(quán)利要求8的載體，其中所述調(diào)節(jié)序列還包含基因10 5’UTR/rps 163’UTR。
10.權(quán)利要求1的載體，其中所述第一側(cè)翼序列是16S/trnI，所述第二側(cè)翼序列是trnA/23S。
11.權(quán)利要求1的載體，其中所述第一側(cè)翼序列約4kb。
12.權(quán)利要求1的載體，其中所述第二側(cè)翼序列約4kb。
13.權(quán)利要求1的載體，其中載體是用于穩(wěn)定整合進(jìn)高等植物物種質(zhì)體基因組的元件，并且其中所述第一和第二側(cè)翼DNA序列與所述質(zhì)體基因組的間隔區(qū)中的序列基本同源，且所述側(cè)翼序列在所述高等植物物種的質(zhì)體基因組中是保守的。
14.權(quán)利要求13的載體，其中所述間隔區(qū)是轉(zhuǎn)錄活性間隔區(qū)。
15.權(quán)利要求6的載體，其中所述5’UTR是psbA的5’UTR。
16.權(quán)利要求7的載體，其中所述3’UTR是psbA的3’UTR。
17.權(quán)利要求1的載體，其還包含編碼選擇性標(biāo)記的DNA序列。
18.權(quán)利要求17的載體，其中所述選擇性標(biāo)記為非抗生素選擇性標(biāo)記。
19.權(quán)利要求18的載體，其中所述非抗生素選擇性標(biāo)記是甜菜醛脫氫酶(BADH)。
20.權(quán)利要求17的載體，其中編碼所述選擇性標(biāo)記的所述DNA序列編碼抗生素抗性選擇性標(biāo)記。
21.權(quán)利要求20的載體，其中所述抗生素抗性選擇性標(biāo)記是aadA。
22.用權(quán)利要求1的載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物。
23.權(quán)利要求22的植物的后代。
24.權(quán)利要求22的植物的種子。
25.權(quán)利要求22的植物的非綠色部分，其包含具有編碼目的多肽的異源DNA序列的質(zhì)體基因組。
26.權(quán)利要求22的植物，其中所述植物還包含至少一個(gè)用權(quán)利要求1的載體轉(zhuǎn)化的前質(zhì)體。
27.用權(quán)利要求1的載體轉(zhuǎn)化的體細(xì)胞胚。
28.包含非綠色質(zhì)體的非綠色植物細(xì)胞，其中非綠色質(zhì)體包含表達(dá)盒，其中所述表達(dá)盒含有可操作連接的成分——在所述非綠色質(zhì)體中具有功能的啟動(dòng)子、編碼目的多肽的異源DNA序列、至少一個(gè)額外的編碼賦予可選擇性狀的多肽的結(jié)構(gòu)基因或其功能部分、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)和位于所述表達(dá)盒側(cè)翼以利于通過同源重組將所述表達(dá)盒穩(wěn)定整合進(jìn)所述質(zhì)體的基因組的質(zhì)體DNA側(cè)翼序列，其中所述異源DNA序列的轉(zhuǎn)錄由所述啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。
29.權(quán)利要求28的非綠色植物細(xì)胞，所述細(xì)胞能夠通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生再生。
30.轉(zhuǎn)基因非綠色植物細(xì)胞，所述細(xì)胞具有用權(quán)利要求1的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組，其中所述轉(zhuǎn)基因非綠色植物細(xì)胞通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生再生。
31.通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生轉(zhuǎn)化質(zhì)體的方法，所述方法包括步驟將權(quán)利要求1的載體整合進(jìn)植物質(zhì)體的質(zhì)體基因組中。
32.使用非綠色外植體實(shí)現(xiàn)質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，其中通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生再生植物，包括步驟。
33.含有質(zhì)體的植物細(xì)胞，所述質(zhì)體包括表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有可操作連接的成分——編碼目的多肽的異源DNA序列、編碼選擇性標(biāo)記的DNA序列、和位于所述表達(dá)盒側(cè)翼以利于通過同源重組將所述表達(dá)盒穩(wěn)定整合進(jìn)葉綠體基因組的質(zhì)體DNA序列，其中所述植物細(xì)胞通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生再生。
34.能夠通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生再生的非綠色植物細(xì)胞，其中所述非綠色植物細(xì)胞包含編碼目的多肽的異源DNA序列，其中編碼所述目的多肽的所述異源DNA序列整合在所述非綠色植物細(xì)胞所含的質(zhì)體中。
35.能夠轉(zhuǎn)化非綠色植物細(xì)胞的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體，所述質(zhì)體載體包含可操作連接的成分——第一側(cè)翼序列、在質(zhì)體中生效的啟動(dòng)子、編碼在質(zhì)體中生效的選擇性標(biāo)記的DNA序列、編碼外源基因的DNA序列和第二側(cè)翼序列。
36.適于轉(zhuǎn)化質(zhì)體的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體，其中所述待轉(zhuǎn)化的質(zhì)體在非綠色植物細(xì)胞中，并且其中所述質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體包含可操作連接的成分——第一側(cè)翼序列、在所述質(zhì)體中具有功能的調(diào)節(jié)序列、編碼目的多肽的異源DNA序列和第二側(cè)翼序列。
37.在非綠色植物細(xì)胞中產(chǎn)生目的多肽的方法，其中所述目的多肽由異源DNA序列編碼，所述方法包括步驟將根據(jù)權(quán)利要求1的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體整合進(jìn)植物細(xì)胞的質(zhì)體基因組；和生長所述植物細(xì)胞以表達(dá)所述目的多肽。
38.目視篩選轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括步驟使用根據(jù)權(quán)利要求的載體轉(zhuǎn)化非綠色植物細(xì)胞以表達(dá)外源甜菜醛脫氫酶(badh)基因。
39.適于轉(zhuǎn)化非綠色植物細(xì)胞的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體，所述質(zhì)體載體包含可操作連接的成分——第一側(cè)翼序列、在質(zhì)體中具有功能的調(diào)節(jié)序列、編碼外源基因的DNA序列和第二側(cè)翼序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了適宜轉(zhuǎn)化非綠色植物細(xì)胞的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體，其中質(zhì)體載體包含可操作連接的元件——第一側(cè)翼序列、編碼外源基因的DNA序列和第二側(cè)翼序列。
文檔編號C07K14/28GK1675366SQ03818695
公開日2005年9月28日 申請日期2003年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月3日
發(fā)明者H·丹尼爾 申請人:中佛羅里達(dá)大學(xué)