專利名稱：寡核苷酸分離和去保護(hù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寡核苷酸的分離和去保護(hù)，并且更特別地，涉及利用可棄型分離柱獲得去保護(hù)寡核苷酸的方法。
背景基于DNA的分析技術(shù)，尤其是基于陣列的分析方法學(xué)，已對(duì)寡核苷酸生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了巨大的影響，其已發(fā)展了平行合成技術(shù)以滿足生物技術(shù)市場(chǎng)之需。平行合成允許在單個(gè)工作日內(nèi)在單臺(tái)儀器上合成大量寡核苷酸。該過(guò)程已被優(yōu)化至這樣的水平，即多數(shù)物質(zhì)尤其是設(shè)計(jì)作為PCR引物的較短寡核苷酸，可無(wú)需任何純化而使用。事實(shí)上，盡管存在著使用純化物質(zhì)可能獲得的優(yōu)勢(shì)，許多寡核苷酸是以非純化形式直接使用的。
對(duì)于許多分析技術(shù)而言，期望使用較長(zhǎng)寡核苷酸(如長(zhǎng)度為70到100個(gè)核苷酸的鎖式探針)，因?yàn)樗鼈儏^(qū)分不同靶標(biāo)的特異性優(yōu)于較短寡核苷酸。該長(zhǎng)度的粗合成寡核苷酸嚴(yán)重污染有較短片段，因而需要純化以避免與非特異性結(jié)合相關(guān)的問(wèn)題(Jobs等Ana1.Chem.74(1)199-202(2002))。在合成期間可發(fā)生失敗的偶聯(lián)和/或副反應(yīng)，其可產(chǎn)生非全長(zhǎng)或不完整的寡核苷酸。另外，可發(fā)生酸催化的脫嘌呤，導(dǎo)致寡核苷酸去保護(hù)期間寡核苷酸主鏈的切割。所以化學(xué)合成產(chǎn)生寡核苷酸群，其必須加以純化以獲得期望的寡核苷酸。因而，典型的合成寡核苷酸反應(yīng)混合物含三種主要成分全長(zhǎng)產(chǎn)物、截短片段以及由先前脫嘌呤的寡核苷酸片段的堿基切割產(chǎn)生的寡核苷酸。全長(zhǎng)產(chǎn)物可能包括缺失片段(如具有單個(gè)(n-1)或兩個(gè)(n-2)核苷酸缺失的片段)。另外，寡核苷酸反應(yīng)混合物可能污染有具有不想要的雙摻入核苷酸的產(chǎn)物(n+產(chǎn)物)，還有不完全或不正確去保護(hù)的片段。不純的寡核苷酸無(wú)論多長(zhǎng)，可能導(dǎo)致不清楚的結(jié)果，正如見(jiàn)于以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的分析或在某些情況下(Villadas等Anal.Biochem.300(1)101-103(2002))，不純的寡核苷酸可阻止獲得任何有意義的結(jié)果。
因而，需要有效的純化操作來(lái)處理可合成的大量寡核苷酸。合成期間，在偶聯(lián)最后一個(gè)寡核苷酸之后，三苯甲基部分典型地留在寡核苷酸的5’端，以促進(jìn)全長(zhǎng)寡核苷酸的純化。所述三苯甲基部分通常為二甲氧基三苯甲基(DMTr)或單甲氧基三苯甲基(MMTr)，是需要最終除去的酸不穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán)。這種去保護(hù)或去三苯甲基化通常在溶液中利用80％乙酸水溶液或者在柱(cartridge)上利用2％三氟乙酸(TFA)水溶液進(jìn)行。在使用柱的寡核苷酸去三苯甲基化期間，釋放的具有游離5’OH的寡核苷酸和新形成的三苯甲基陽(yáng)離子在整個(gè)過(guò)程中都必須緊密結(jié)合在柱上。隨后，洗出酸，并用乙腈和水洗脫去三苯甲基化的寡核苷酸。盡管該過(guò)程看似非常簡(jiǎn)單，可是去三苯甲基化反應(yīng) 是可逆的，且平衡常數(shù)取決于酸以及兩個(gè)去保護(hù)產(chǎn)物的濃度。寡核苷酸和三苯甲基陽(yáng)離子在柱上有限的遷移性導(dǎo)致這兩種分子極高的有效濃度。因此，柱上的寡核苷酸去三苯甲基化可導(dǎo)致去三苯甲基化寡核苷酸產(chǎn)率低(50％或更低)，并且可伴隨三苯甲基部分的再結(jié)合。盡管在酸中延長(zhǎng)的去保護(hù)可在寡核苷酸中造成額外的無(wú)嘌呤位點(diǎn)，未去三苯甲基化的物質(zhì)可重新去三苯甲基化。因此，需要在柱上對(duì)寡核苷酸去三苯甲基化的有效方法。
概述本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即寡核苷酸能夠以使得所述寡核苷酸不溶的方式非共價(jià)固定到固相支持物上。因此，盡管連接在寡核苷酸一端或兩端的疏水分離功能元件(function)可被選擇性除去，所述寡核苷酸能夠依然緊密結(jié)合在所述支持物上。本發(fā)明的方法允許寡核苷酸在溫和條件下快速去保護(hù)(如去三苯甲基化)，同時(shí)使得去保護(hù)寡核苷酸的產(chǎn)率最大化。另外，非共價(jià)固定的寡核苷酸可在非水條件下在柱上衍生化(如通過(guò)摻入熒光團(tuán))。本發(fā)明的方法可用于同時(shí)純化和衍生化多數(shù)個(gè)寡核苷酸。
在一方面，本發(fā)明以用于寡核苷酸去保護(hù)的方法為特征。該方法包括提供多數(shù)個(gè)包括受保護(hù)寡核苷酸在內(nèi)的寡核苷酸，其中(i)每個(gè)受保護(hù)寡核苷酸的5′端與疏水分離功能元件相連或者(ii)每個(gè)受保護(hù)寡核苷酸都與一對(duì)疏水分離功能元件相連，其中所述疏水分離功能元件對(duì)中一員較之于該對(duì)中的另一員疏水性較??；利用有機(jī)溶劑將所述多數(shù)個(gè)寡核苷酸沉淀到疏水固相支持物上，以產(chǎn)生非共價(jià)固定的寡核苷酸；并利用溶于有機(jī)溶劑(如二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氫呋喃、乙酸乙酯、丙酮或異丙醇)的試劑通過(guò)(i)從所述固定寡核苷酸中選擇性除去所述5′分離功能元件或者(ii)從所述固定寡核苷酸中順序除去所述疏水分離功能元件對(duì)來(lái)對(duì)所述固定寡核苷酸進(jìn)行去保護(hù)。沉淀可包括在所述疏水固相支持物上預(yù)干燥所述多數(shù)個(gè)寡核苷酸，然后用所述有機(jī)溶劑洗滌所述疏水固相支持物。所述疏水固相支持物可以柱(cartridge)或含多數(shù)個(gè)柱的歧管的形式提供。所述疏水固相支持物可以是基于聚苯乙烯、炭、石墨或硅石的。
該方法可進(jìn)一步包括，在沉淀前，將所述多數(shù)個(gè)寡核苷酸吸附到疏水支持物上，并洗脫(i)缺乏所述5′疏水分離功能元件的寡核苷酸或者(ii)缺乏任何保護(hù)基團(tuán)的寡核苷酸以及僅含所述疏水分離功能元件對(duì)中疏水性較小的分離功能元件的寡核苷酸。該方法可進(jìn)一步包括洗脫所述去保護(hù)的寡核苷酸。
所述5′疏水分離功能元件可以是三苯甲基部分、疏水縮醛或硫縮醛基團(tuán)。所述三苯甲基部分可以是二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、甲呱啶(pixyl)或單甲氧基三苯甲基部分。例如，所述三苯甲基部分可以從由4-己氧基甲氧基三苯甲基、4-癸氧基甲氧基三苯甲基、4-十六烷氧基甲氧基三苯甲基、4-十八烷氧基苯呫噸基、4-4′-二-己氧基甲氧基三苯甲基、4-4′-二-癸氧基甲氧基三苯甲基、4-4′-二-十六烷氧基甲氧基三苯甲基、4-十八烷氧基三苯甲基、4-十六烷氧基三苯甲基、4-癸氧基三苯甲基和4-己氧基三苯甲基部分組成的組中選擇。所述三苯甲基部分可利用酸的非水溶液(如溶于二氯甲的2％三氯乙酸)選擇性除去。
所述疏水分離功能元件對(duì)的一員可以是直鏈烷基、支鏈烷基、芳基烷基或芳基，其通過(guò)接頭與寡核苷酸相連，所述接頭可在不除去所述疏水分離功能元件對(duì)另一員的條件下去除。所述接頭可以是甲硅烷氧基或二甲硅烷氧基功能元件。
所述多數(shù)個(gè)寡核苷酸之內(nèi)可包括脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，并且可包括非標(biāo)準(zhǔn)主鏈(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或磷酰胺(phosphoramido))。寡核苷酸可以是鎖核酸(LNA)。寡核苷酸可以含有與官能團(tuán)(如氨基、硫醇、磷酸、醛、嵌入劑、猝滅劑或熒光團(tuán))相連的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。所述官能團(tuán)可位于所述寡核苷酸的任一端或寡核苷酸的兩端。所述官能團(tuán)在各端可以不同。所述5′分離功能元件或者所述疏水分離功能元件對(duì)的一員可連接在所述官能團(tuán)上。所述疏水分離功能元件對(duì)的一員可連接在接頭上，并且所述接頭可連接在所述官能團(tuán)上。
該方法可進(jìn)一步包括使用非水條件衍生化所述固定寡核苷酸。例如，衍生化可包括將熒光團(tuán)摻入到所述純化的寡核苷酸中和洗脫所述衍生化寡核苷酸。
除非另行定義，本文所用所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)人員一般理解的相同的含義。下文描述了合適的方法和材料，盡管可利用與文中所述的那些類似或等同的方法和材料實(shí)施本發(fā)明。特此將文中提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利及其它參考文獻(xiàn)全文并入作為參考。如有沖突，將以本說(shuō)明書(shū)包括定義為準(zhǔn)。另外，材料、方法及實(shí)施例僅用于舉例說(shuō)明而并不旨在限制。
本發(fā)明的其它特征和有利之處將會(huì)由以下詳細(xì)描述以及由權(quán)利要求而變得顯而易見(jiàn)。


圖1為于聚苯乙烯支持物上制備的二甲硅烷氧基連接的寡核苷酸基于柱的分離圖。
圖2為MMTr-NH標(biāo)記的寡核苷酸基于柱的分離和去保護(hù)圖示。
圖3顯示了柱純化的寡核苷酸選擇的毛細(xì)管電泳操作。
圖4為雙標(biāo)記寡核苷酸(分子信標(biāo))的合成策略。
詳細(xì)描述一般而言，本發(fā)明的方法允許多數(shù)個(gè)化學(xué)合成的寡核苷酸如在固相支持物上合成的寡核苷酸基于連接在所述寡核苷酸一端或兩端的疏水分離功能元件而被分離。本發(fā)明的方法允許從全長(zhǎng)寡核苷酸中分離由于寡核苷酸物質(zhì)脫嘌呤和隨后的切割而產(chǎn)生的較短片段。這將色譜可有效并實(shí)際分離的物質(zhì)的長(zhǎng)度延長(zhǎng)到目前DNA合成的極限。在有些實(shí)施方案中，可將寡核苷酸非共價(jià)固定到固相支持物上，從而使得所述寡核苷酸不溶，并且可除去5′疏水分離功能元件(如5′保護(hù)基)并且所述寡核苷酸可以衍生化。在其它實(shí)施方案中，所述寡核苷酸連接于一對(duì)疏水分離功能元件，其中該疏水分離功能元件對(duì)中的一員較之于該對(duì)中的另一員疏水性較小。本發(fā)明的方法可在可棄型柱(反相柱)上用于寡核苷酸的高通量多重分離。
寡核苷酸如本文所用，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”包括具有3′-5′磷酸二酯主鏈的核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸寡聚體，以及具有不同于標(biāo)準(zhǔn)3′-5′磷酸二酯鍵的主鏈結(jié)構(gòu)(如肽核酸(PNA)、甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或磷酰胺鍵)的核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸寡聚體。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”也包括含非標(biāo)準(zhǔn)堿基成分如肌苷或nubularine、修飾堿基成分、修飾糖成分以及此類成分之組合的寡聚體。例如，可修飾含氮堿基或糖成分以包括反應(yīng)官能團(tuán)(如C5丙炔、鹵素或生物素)和標(biāo)記(如放射性、化學(xué)發(fā)光、場(chǎng)致發(fā)光、可見(jiàn)、近紅外及熒光)。糖成分的另外修飾包括添加將呋喃糖環(huán)2′-O位連接到4′-C位的亞甲基接頭。這種修飾被稱之為鎖核酸(locked nucleic acid)(LNA)；含一個(gè)或多個(gè)LNA修飾的核酸稱之為L(zhǎng)NA。
用于合成寡核苷酸(包括含非標(biāo)準(zhǔn)堿基的寡核苷酸)的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，寡核苷酸可通過(guò)β-氰基乙基亞磷酰胺法組裝。例如有關(guān)寡核苷酸合成方法，參見(jiàn)″Oligonucleotide SynthesisAPractical Approach，″編輯M.J.Gait，IRL Press，1984、WO92/09615以及WO98/08857?？衫米詣?dòng)化寡核苷酸合成儀機(jī)器生產(chǎn)寡核苷酸。此類合成儀是公知的，并且可由包括Applied Biosystems和AmershamPharmacia Biotech在內(nèi)的許多公司獲得。
寡核苷酸合成典型地使用固相支持物，其上經(jīng)由連至核苷酸3′-O的接頭連接了一個(gè)或多個(gè)受保護(hù)核苷酸。接頭是指含有原子鏈如碳、氮、氧等的任何分子，其在水解方面穩(wěn)定，并起著將待于支持物上合成的分子與所述支持物相連接的作用。在支持物上的合成起始之前，接頭通常經(jīng)由共價(jià)鍵連接在支持物上，并提供一個(gè)或多個(gè)供待合成分子前體連接的位點(diǎn)。應(yīng)當(dāng)理解，有時(shí)，接頭包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸如polyT，它們并非最終完成的全長(zhǎng)寡核苷酸的一部分。為接頭的一部分，但并非最終完成的全長(zhǎng)寡核苷酸的一部分的核苷酸并不視為寡核苷酸的3′-端。含二甲硅烷氧基的接頭(如直接連接于寡核苷酸3′羥基的四異丙基二甲硅烷氧基功能元件)尤為有用，并且可利用在Kwiatkowski等，Nucleic Acids Res.，244632-4638(1996)、Kwiatkowski等，Nucleic Acids Res.，27(24)4710-14(1999)或WO 98/08857中提供的方法產(chǎn)生。需要指出的是官能團(tuán)(如氨基、硫醇、磷酸、醛、嵌入劑、猝滅劑或熒光團(tuán))可連接在接頭上。
隨著另外核苷酸單體的相繼加入，所得寡核苷酸以3′到5′端的方向延伸。一旦寡核苷酸達(dá)到了期望的長(zhǎng)度，可利用上述出版物中描述的技術(shù)對(duì)所述寡核苷酸進(jìn)行部分去保護(hù)、切割無(wú)嘌呤位點(diǎn)、并除去由所述切割得到的任何較短片段。然后可以從支持物上取下依然與合成支持物相結(jié)合的寡核苷酸。在二甲硅烷氧基接頭的情況下，可利用破壞所述硅-氧鍵的試劑從支持物上切下所述寡核苷酸。
分離功能元件典型地，本發(fā)明的方法中使用包含受保護(hù)寡核苷酸的多數(shù)個(gè)寡核苷酸。如本文所用，受保護(hù)核苷酸是指這樣的寡核苷酸，即其5′端連接有疏水分離功能元件，或者該寡核苷酸連接有一對(duì)疏水分離功能元件，其中該對(duì)中一員連接在5′端，而另一員連接在所述寡核苷酸的3′端。如果有一對(duì)疏水分離功能元件連接在寡核苷酸上，則該疏水分離功能元件對(duì)中的一員較之于另一員疏水性較小。在一個(gè)實(shí)施方案中，3′分離功能元件可比5′分離功能元件具有實(shí)質(zhì)上更高的疏水性。在其它實(shí)施方案中，5′分離功能元件可具有實(shí)質(zhì)上更高的疏水性。
連接在寡核苷酸3′端的分離功能元件可以是固相支持物與第一核苷酸即寡核苷酸3′端之間的接頭的組成成分。寡核苷酸3′端的分離功能元件典型地在氨水處理下是穩(wěn)定的，從而當(dāng)寡核苷酸從固體支持物上釋放的時(shí)候，所述分離功能元件將不會(huì)從寡核苷酸上切割。例如，合適的3′分離功能元件包括直鏈烷基、支鏈烷基、芳基烷基或芳基。直鏈或支鏈二醇如1，10-癸二醇或其它疏水二醇是尤為有用的疏水分離功能元件。
5′分離功能元件可與5′末端核苷酸構(gòu)件一起引入，在合成期間向該寡聚體添加末端的適當(dāng)衍生化的亞磷酰胺。術(shù)語(yǔ)“構(gòu)件”既包括末端核苷酸，也包括用以引入末端官能團(tuán)象磷酸、胺、硫醇、亞肼基、醛基或氨基氧基的化學(xué)部分。用于寡核苷酸5′端的合適的分離功能元件不限于標(biāo)準(zhǔn)的二甲氧基三苯甲基(DMTr)、甲呱啶(Px)或單甲氧基三苯甲基(MMTr)基團(tuán)，而包括所有類型的酸不穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán)。尤為重要的有三苯甲基(Tr)、三甲氧基三苯甲基(TMTr)、甲氧基甲呱啶(MPx)以及向寡核苷酸引入附加疏水性的其它基團(tuán)。后者可選自4-己氧基甲氧基三苯甲基(C6MTr)、4-癸氧基甲氧基三苯甲基(C10MTr)、4-十六烷氧基甲氧基三苯甲基(C16MTr)、4-十八烷氧基苯呫噸基(C18Px)、4-4′-二-己氧基甲氧基三苯甲基(bisC6Tr)、4-4′-二-癸氧基甲氧基三苯甲基(bisC10MTr)和4-4′-二-十六烷氧基甲氧基三苯甲基(bisC16MT)、4-十八烷氧基三苯甲基(C18Tr)、4-十六烷氧基三苯甲基(C16Tr)、4-癸氧基三苯甲基(C10Tr)和4-己氧基三苯甲基(C6Tr)。有關(guān)其它高度疏水的三苯甲基基團(tuán)的實(shí)例，也見(jiàn)美國(guó)專利No.5,892,007。這些極為疏水的功能元件對(duì)于分離相對(duì)長(zhǎng)的寡核苷酸具有價(jià)值，此處常見(jiàn)二甲氧基三苯甲基基團(tuán)的作用可以不足以定量并無(wú)損失地將三苯甲基化的分子錨定到支持物上。如美國(guó)專利No.5,319,079所述，在三苯甲基交換過(guò)程中，也可以在合成寡核苷酸的5′位引入不同類型的取代的三苯甲基基團(tuán)。疏水的縮醛或硫縮醛基團(tuán)也是有用的5′功能元件。
具有強(qiáng)疏水性的分離功能元件可用于合成和純化雙標(biāo)記的寡核苷酸(如taqman探針和分子信標(biāo))，其在所述寡核苷酸的每一端由不同的染料標(biāo)記。此類探針必需極純，以有效猝滅染料熒光。為獲得滿意的純度，這類探針通常以多步操作制備，每一步都緊跟著進(jìn)行廣泛的層析純化。對(duì)此種冗長(zhǎng)操作的需要反映在商業(yè)上雙標(biāo)記探針的高價(jià)上。制備雙標(biāo)記探針?biāo)玫牡湫腿玖暇哂邢喈?dāng)?shù)氖杷阅?；因而，使用?biāo)準(zhǔn)DMTr基團(tuán)作為5′分離功能元件將會(huì)產(chǎn)生極難在HPLC中分離并且不可能在柱上分辨開(kāi)來(lái)的混合物。不過(guò)，用比DMTr更為疏水的C18Px或C18Tr功能元件替換DMTr基團(tuán)，則使得來(lái)自兩種染料的疏水作用無(wú)效，并允許根據(jù)本發(fā)明的方法分離雙標(biāo)記探針。
吸附到疏水支持物上在寡核苷酸已從它在其上合成的支持物上釋放之后，可將所述寡核苷酸吸附到疏水支持物上。典型地，所述疏水支持物由與支持材料如基于硅石、炭、石墨或聚苯乙烯的顆?；瘜W(xué)鍵合的、長(zhǎng)度在從4到24碳(如8到18碳)范圍內(nèi)變化的烴鏈組成。烴鏈可以是分枝的，并且可具有一個(gè)或多個(gè)芳族取代。例如，C18鏈可鍵合到基于硅石的顆粒上，以形成可用的疏水支持物。苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物是相對(duì)便宜且對(duì)許多試劑和溶劑而言為惰性的通用支持材料。對(duì)堿性氨溶液和對(duì)TBAF的抗性使得該材料尤為有用。盡管基于硅石的材料對(duì)試劑和溶劑的抗性不如基于苯乙烯的支持物，任何有害試劑和基于硅石的支持物之間短的接觸時(shí)間以及有些試劑因水稀釋而致的可能的失活，使得該支持物可用。事實(shí)上，與未處理的柱相比，填充RP18硅石并由10％氨水或0.1M TBAF水溶液預(yù)處理的小HPLC柱，在模型寡核苷酸反應(yīng)混合物的分離中并不表現(xiàn)出任何實(shí)質(zhì)性差異。
另外可用的支持物包括基于氧化鋯的材料，其對(duì)堿降解具有低敏感性，或者以活性炭為基礎(chǔ)的支持物，其完全抗堿降解。
典型地，疏水支持物以柱或含多數(shù)個(gè)柱的歧管(如柱板)的形式提供?？蓷壭椭煽壳也毁F，并允許按比例增加同時(shí)進(jìn)行的分離的數(shù)目或者分離物質(zhì)的數(shù)量。可配制含多種元件(如閥、泵、注射單元和分段收集器)和柱的系統(tǒng)，以自動(dòng)化寡核苷酸的分離。柱可以相繼或并行的方式運(yùn)行，取決于特定寡核苷酸優(yōu)選的分離順序。分離寡核苷酸的操作可自動(dòng)化(如利用機(jī)器人系統(tǒng)處理所有樣品和溶劑)。為避免與柱性能差異相關(guān)的問(wèn)題并降低處理時(shí)間，歧管或其它平臺(tái)可與真空系統(tǒng)偶聯(lián)并由其驅(qū)動(dòng)，這允許在添加每種試劑或洗脫劑之后干燥所有柱。
當(dāng)將寡核苷酸吸附到疏水支持物上時(shí)，為避免產(chǎn)物的大量損失，可預(yù)處理寡核苷酸，以達(dá)到與固相相互作用的最佳形式。這可通過(guò)使用含有使得寡核苷酸更為疏水的疏水反離子的緩沖液實(shí)現(xiàn)。引入到寡核苷酸的疏水性程度可通過(guò)從三-或四-甲基、乙基、丙基、丁基和戊基銨鹽的組中選擇物質(zhì)加以控制。叔銨鹽和季銨鹽尤為有用。實(shí)踐中，使用易于揮發(fā)的鹽如碳酸鹽或乙酸鹽是有利的。另一種考慮是擁有強(qiáng)疏水分離功能元件的寡核苷酸聚集成不滲透到支持物細(xì)孔中、而是直接流過(guò)柱的結(jié)構(gòu)的傾向。為破壞這些聚集物，可將鹽濃度升至相對(duì)高的水平，并且可使用有機(jī)溶劑象乙醇、乙腈或二甲基甲酰胺(DMF)使該疏水結(jié)構(gòu)溶劑化。
一旦寡核苷酸吸附到疏水支持物上，就可洗脫缺乏5′疏水分離功能元件的寡核苷酸。在寡核苷酸連接于一對(duì)疏水分離功能元件的情況下，則洗脫缺乏任何保護(hù)基的寡核苷酸或者僅含較小疏水性分離功能元件的寡核苷酸。例如，當(dāng)3′分離功能元件具有較高疏水性時(shí)，可洗脫缺乏任何分離功能元件的寡核苷酸以及僅具有5′分離功能元件的寡核苷酸。如果5′分離功能元件具有更高疏水性，則可洗脫缺乏任何分離功能元件的寡核苷酸以及僅具有3′分離功能元件的寡核苷酸。
為消除缺乏5′疏水分離功能元件(如三苯甲基功能元件)的寡核苷酸，可利用由三乙基醋酸銨和10-20％乙腈組成的洗脫溶劑有效洗出較小疏水性的寡核苷酸。盡管作為脫嘌呤和隨后切割脫嘌呤鏈的結(jié)果出現(xiàn)的寡核苷酸片段比全長(zhǎng)物質(zhì)更為疏水，且難于分級(jí)分離，本發(fā)明使得這些片段在實(shí)際的柱分離之前被有效洗掉，或者在柱上利用由兩種分離功能元件操縱的系統(tǒng)選擇性排除。
將寡核苷酸沉淀到疏水固相支持物上在消除全部較短片段后，余下的產(chǎn)物可從柱上簡(jiǎn)單地洗脫，然后在揮發(fā)性物質(zhì)蒸發(fā)后去三苯甲基化。然而，該操作需要額外的酸蒸發(fā)，并且通常需要脫鹽階段。在本發(fā)明中，可除去寡核苷酸5′端的分離功能元件或者寡核苷酸上的疏水分離功能元件對(duì)，而同時(shí)寡核苷酸仍連接在柱上。
如本文所述，可在有機(jī)溶劑中將寡核苷酸沉淀到柱上，并且隨后可除去分離功能元件。寡核苷酸可依然緊密結(jié)合在支持物上，而可選擇性除去5′分離功能元件(如三苯甲基部分)，或者相繼除去5′和3′分離功能元件。因而，寡核苷酸可在溫和條件下快速去保護(hù)(如去三苯甲基化)，同時(shí)最大化去保護(hù)寡核苷酸的產(chǎn)率。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“沉淀”是指支持物表面上不溶脫水物質(zhì)的形成。例如，寡核苷酸可通過(guò)風(fēng)干然后用乙腈沖洗而沉淀在柱上。以這種方式處理的寡核苷酸依然緊密結(jié)合在柱上，并且未觀察到寡核苷酸損失，即使是在乙腈前級(jí)分中。見(jiàn)實(shí)施例1。寡核苷酸可由有機(jī)溶劑如乙腈或其它有機(jī)溶劑如二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、乙酸乙酯、丙酮或異丙醇沉淀。需要指出所述有機(jī)溶劑可包含小百分比的水而仍然適用于本發(fā)明。
一旦寡核苷酸非共價(jià)固定在固相支持物上，則可利用酸的非水溶液(如溶于二氯甲烷的2％三氯乙酸(TCA))除去5′分離標(biāo)簽。例如，當(dāng)將2％TCA的二氯甲烷溶液施加到含有以DMTr成分保護(hù)的寡核苷酸的柱上時(shí)，迅速形成肉眼可見(jiàn)的DMTr陽(yáng)離子橙色條帶，并且易于從柱上洗出。如本文所述，可在C18-硅柱板上在少于30分鐘內(nèi)分離96條寡核苷酸，這比其它商業(yè)上可得到的可需要多達(dá)4小時(shí)分離所述寡核苷酸的系統(tǒng)更快。因而，在本發(fā)明的方法中，三苯甲基部分從柱中消除，這推進(jìn)了去三苯甲基化反應(yīng)完成。過(guò)量的酸可通過(guò)用有機(jī)溶劑(如乙腈)洗滌除去，而終產(chǎn)物可通過(guò)包含乙腈或其它有機(jī)溶劑的洗脫劑從柱中洗脫。含40％乙腈的組合物能夠洗脫所有含寡核苷酸的物質(zhì)。如果期望，可在另外單獨(dú)的分析HPLC操作中檢測(cè)任何殘余的未去保護(hù)的寡核苷酸。如本文所述，僅觀察到痕量三苯甲基化的起始材料(通常比5％少得多)，表明本發(fā)明的去三苯甲基化操作基本上是定量的。
當(dāng)受MMTr基團(tuán)保護(hù)的5′-氨基烷基寡核苷酸如上文所述吸附、沉淀并去三苯甲基化時(shí)，立即形成MMTr陽(yáng)離子黃色條帶，并且很容易從柱上洗出。整個(gè)去三苯甲基化操作在少于195秒內(nèi)以定量產(chǎn)率完成。在該同一期限內(nèi)，2％TFA僅導(dǎo)致8.4％轉(zhuǎn)化為去三苯甲基化物質(zhì)。通過(guò)應(yīng)用一級(jí)動(dòng)力學(xué)，估計(jì)對(duì)于99％的去三苯甲基化，2％TFA將需要140分鐘。2％v/v TFA的實(shí)際酸濃度相當(dāng)于0.26M而2％w/v TCA僅為0.12M。因而，令人驚訝的是，盡管存在TFA溶液比TCA酸性高大約20倍的事實(shí)，2％TCA在反應(yīng)性上具有120倍的差異。
在寡核苷酸連接于一對(duì)分離功能元件、其中3′分離功能元件比5′分離功能元件具有更高的疏水性的情況下，可切割接頭，并洗脫缺乏任何疏水功能元件的寡核苷酸。余下的物質(zhì)可利用有機(jī)溶劑再沉淀到柱上，并且可除去5′分離功能元件，而純的去保護(hù)產(chǎn)物可如上文所討論的那樣洗脫。當(dāng)5′分離功能元件比3′分離功能元件具有更高的疏水性時(shí)，可如上文所討論的那樣除去5′分離功能元件，并洗脫缺乏任何疏水功能元件的片段。余下的物質(zhì)可用有機(jī)溶劑再沉淀到柱上，接頭可被切割，而純的去保護(hù)產(chǎn)物可得以洗脫。
衍生化寡核苷酸一旦擁有反應(yīng)性官能團(tuán)的寡核苷酸被非共價(jià)固定到固相支持物上，則所述寡核苷酸可在選擇的有機(jī)溶劑中并與否則與水反應(yīng)的試劑進(jìn)行衍生化?？捎玫姆撬軇┑姆窍拗菩詫?shí)例包括吡啶、二甲基甲酰胺、二甲亞砜、三乙胺、丙酮、乙腈和二氯甲烷。與水反應(yīng)的試劑的非限制性實(shí)例包括酰氯、酸酐、混合酸酐、以及與不同激活劑一起使用的酸。另外，許多官能團(tuán)作為活性酯遞送，其中許多昂貴，因而需要以最大的效率使用。因而，在本發(fā)明的方法中，活性酯可用于衍生化寡核苷酸而無(wú)需經(jīng)受水解。寡核苷酸的一個(gè)或多個(gè)核苷酸可通過(guò)摻入官能團(tuán)如氨基、硫醇、磷酸、醛、嵌入劑、猝滅劑、熒光團(tuán)或允許寡核苷酸穿透細(xì)胞膜的成分而衍生化。在有些實(shí)施方案中，官能團(tuán)置于寡核苷酸的任一端。在其它實(shí)施方案中，官能團(tuán)置于寡核苷酸的兩端。官能團(tuán)在寡核苷酸的各端可以不同。
本發(fā)明將在下列實(shí)施例中進(jìn)一步描述，這并不限制權(quán)利要求書(shū)描述的本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例中所用試劑和分析及制備方法除非另行指出，在本方法部分之后的實(shí)施例中使用如下試劑和方法。
根據(jù)WO98/08857制備5′-O-(4，4′-二甲氧基)三苯甲基胸苷基3′-O-(1，1，3，3-四異丙基-二甲硅烷氧基-3)-(1-O-3，6，9-三氧雜)十一-11-醇及其亞磷酰胺衍生物。商業(yè)上可獲得的CPG(1000；CPGInc.，F(xiàn)airfield；或Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)用類似于Pon，RT，″Chapter19 Solid-phase Supports forOligonucleotide Synthesis，″Methods in Molecular Biology Vol.20 Protocols for Oligonucleotides and Analogs，465-497，編輯S.Agrawal，Humana Press Inc.，Towata，NJ(1993)描述的方法胺化。羥基CPG通過(guò)氨基衍生化的CPG與γ-丁內(nèi)脂在吡啶中反應(yīng)獲得。所有商業(yè)化學(xué)制品為合成級(jí)質(zhì)量，并無(wú)需進(jìn)一步純化而使用。
寡核苷酸合成在ABI 394 DNA合成儀上或者在由臺(tái)灣臺(tái)北中華科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所開(kāi)發(fā)的1536通道寡核苷酸合成儀MultiSyn(Cheng等Nucleic Acids Res.待出版(2002))上實(shí)施。所有偶聯(lián)利用由苯甲酰(dA、dC)和/或異丁酰(dG)基團(tuán)在環(huán)外胺功能元件上保護(hù)的amidite、在推薦用于0.2μmol或更小規(guī)模合成的條件下進(jìn)行。如果需要，最后一個(gè)核苷亞磷酰胺替換為由另一個(gè)5′保護(hù)基衍生化的核苷亞磷酰胺，或者最終的二甲氧基三苯甲基(DMTr)基團(tuán)根據(jù)三苯甲基交換法交換為其它三苯甲基衍生物(見(jiàn)美國(guó)專利No.5,319,079)。
氨去保護(hù)的寡核苷酸的分析性液體層析在配備有LiChrosorb RP18(5μm)柱、二極管陣列檢波器的Hitachi-Merck La Chrom HPLC系統(tǒng)中進(jìn)行，使用40分鐘線性梯度的溶劑A溶于0.1M醋酸三乙銨(″TEAA″)的5％v/v乙腈(″MeCN″)，pH7.0和溶劑B溶于0.1M TEAA的80％v/v乙腈，pH7.0。毛細(xì)管電泳(CE)分析在Beckman系統(tǒng)中使用ssDNA100-R毛細(xì)管單元(毛細(xì)管長(zhǎng)度30cm)進(jìn)行。
實(shí)施例1-在聚苯乙烯支持物上制備的二甲硅烷氧基連接的寡核苷酸基于柱的分離根據(jù)如下操作在氨基甲基聚苯乙烯支持物(ABI)上合成寡核苷酸(26mer)(也見(jiàn)圖1)將含0.2mmol氨基甲基聚苯乙烯(19mmol/g)的盒子置于ABI 394 DNA合成儀上，并進(jìn)行3次連續(xù)的T amidite偶聯(lián)。繼這些偶聯(lián)之后單次添加二甲硅烷氧基dG amidite以獲得接頭和寡核苷酸合成的起點(diǎn)。序列的其余部分根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作合成。在固相支持物上合成的產(chǎn)物由濃氨水用三苯甲基-存在(trityl-on)的方法處理，但在這種情況下，將固相進(jìn)行進(jìn)一步操作而不是氨水洗滌。
將支持物轉(zhuǎn)移到Soersted管中，并由濃氨水于55℃處理12小時(shí)。離心之后，將氨水上清與以前的氨水洗滌物合并，并在反相HPLC上分析，以顯示所有由無(wú)嘌呤位點(diǎn)的堿基切割產(chǎn)生的較短含三苯甲基片段的存在。殘留支持物通過(guò)用乙腈洗滌干燥，并由氟化四丁銨(0.2ml，1M溶于THF中)于室溫下處理2小時(shí)。揮發(fā)性物質(zhì)在真空中蒸發(fā)，并向殘留懸液中添加結(jié)合緩沖液(1M NaCl+溶于水的5％DMF)(1.0ml)。將清亮上清施加到由130mg疏水聚苯乙烯基支持物制備的柱上，并用由20％乙腈和0.1M醋酸三乙銨(TEAA)組成的緩沖液洗脫缺乏三苯甲基功能元件的殘留片段，以產(chǎn)生保留在柱上的單一全長(zhǎng)產(chǎn)物，如通過(guò)HPLC分析所指示的那樣。向柱中通入空氣，以除去痕量的水，之后繼之以純乙腈(2×1.0ml)以沉淀柱上存在的物質(zhì)。過(guò)量乙腈通過(guò)氣流除去，并添加由溶于二氯甲烷的2％三氯乙酸(TCA)組成的去三苯甲基化混合物，導(dǎo)致柱上立即形成橙色條帶。這種切割的DMTr陽(yáng)離子條帶從柱上迅速洗脫出，從而全部的切割和去除操作在少于2分鐘之內(nèi)結(jié)束。含殘留酸的柱用純乙腈洗滌，干燥，并利用含0.1M TEAA的40％乙腈洗脫出最終的純產(chǎn)物?；蛘?，干柱可由純水洗滌，然后用溶于水的50％乙腈洗脫。后一種方法產(chǎn)生不含過(guò)量鹽的寡核苷酸。
實(shí)施例2-MMTr基團(tuán)自5′-氨基衍生化的寡核苷酸的去除根據(jù)合成寡核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)操作制備含MMTr-NH-C5功能元件的寡核苷酸?；旧先鐚?shí)施例1中所述對(duì)去保護(hù)的物質(zhì)進(jìn)行柱純化和在柱(on-cartridge)三苯甲基去除，但使用稍微更長(zhǎng)的時(shí)間進(jìn)行三苯甲基去除(也見(jiàn)圖2)。黃色MMTr陽(yáng)離子在4分鐘內(nèi)從柱上除去，這對(duì)于產(chǎn)物的定量去三苯甲基化是足夠的時(shí)間，就如從另外單獨(dú)的HPLC分析中所看到的那樣。
在類似實(shí)驗(yàn)中，但使用的是2％三氟乙酸水溶液(TFA)，發(fā)現(xiàn)在相同時(shí)間下少于10％的產(chǎn)物能夠被去三苯甲基化。
實(shí)施例3-用于純化具有兩個(gè)分離功能元件的分子的雙在柱寡核苷酸去保護(hù)在含有經(jīng)由簡(jiǎn)單的酯鍵而連接于支持物的胸苷殘基的標(biāo)準(zhǔn)CPG支持物上構(gòu)建寡核苷酸。對(duì)該起始?xì)埢M(jìn)行3次連續(xù)的疏水構(gòu)件偶聯(lián)以及二甲硅烷氧基dG amidite的單次偶聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)中所用的疏水構(gòu)件為1，12-十二烷二醇的亞磷酰胺衍生物(商業(yè)上可由Glen Research獲得)。寡核苷酸的其余部分含標(biāo)準(zhǔn)核苷酸，獲得30-mer(AG)15、71-mer(AG)35T、91-mer(AG)45T或111-mer(AG)55T。所述三苯甲基-存在合成的物質(zhì)用氨處理，并且部分去保護(hù)的寡核苷酸在其自支持物上切割后收集在氨中。于55℃加熱12小時(shí)，這除去所有堿不穩(wěn)定保護(hù)基，產(chǎn)生含四大組化合物的混合物1)含5′DMTr和3′-疏水功能元件兩者的全長(zhǎng)寡核苷酸，2)截短片段和具有3′-疏水成分的脫嘌呤寡核苷酸的3′-部分，3)脫嘌呤和切割的寡核苷酸的去三苯甲基化片段，和4)作為合成物質(zhì)雙脫嘌呤/切割的結(jié)果形成的缺乏任何疏水功能元件的片段。將上述混合物施加到聚苯乙烯柱上，并用35％乙腈+0.1M TEAA洗出屬于組3和組4的物質(zhì)，然后用水洗滌柱，風(fēng)干，并用乙腈沉淀吸附的寡核苷酸，繼之以純四氫呋喃(THF)的單次洗滌。然后使用溶于THF(0.4ml)的1M TBAF，通過(guò)于室溫下進(jìn)行2小時(shí)的二甲硅烷氧基功能元件的在柱切割，釋放疏水性3′分離功能元件。柱隨后用如下步驟處理a)THF、b)乙腈、c)風(fēng)干、d)水、e)20％乙腈+0.1M TEAA、f)水、g)風(fēng)干和h)純乙腈。在此階段，柱上僅含沉淀的三苯甲基化的全長(zhǎng)組分，其由2％TAC去三苯甲基化，并最終如實(shí)施例1所述洗脫。分離和蒸發(fā)的物質(zhì)通過(guò)反相HPLC和CE分析。圖3提供了柱純化的寡核苷酸的代表性CE分析。
實(shí)施例4-雙標(biāo)記分子探針的合成和分離1)由DABCYL-NHS酯(琥珀酰亞胺酯)(Molecular Probes)和2-氨基-1，3-丙二醇(Aldrich)起始制備含DABCYL(猝滅劑)成分、DMTr-O可延伸部件和亞磷酰胺功能元件的三功能構(gòu)件(圖4)。分離的酰氨基1，3-二醇根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)操作三苯甲基化和亞磷酸化(phosphitylated)。功能上相同的構(gòu)件可購(gòu)自例如Chem Genes公司。
2a)十八烷氧基苯基溴由十八烷基溴和4-溴苯酚根據(jù)公開(kāi)的操作獲得。該化合物通過(guò)在高真空下蒸餾純化。
2b)十八烷氧基三苯基甲烷(C18 Tr-OH)在Grignard操作中由十八烷氧基苯基溴和在無(wú)水THF中的鎂起始制備。向該金屬有機(jī)化合物中添加二苯甲酮，并且產(chǎn)物用2M HCl水解。對(duì)經(jīng)過(guò)處理的反應(yīng)混合物干燥、蒸發(fā)，并從甲苯中結(jié)晶純產(chǎn)物。通過(guò)用過(guò)量乙酰氯處理將三苯甲基醇轉(zhuǎn)化為三苯甲基氯化物。
2c)1-氨基-戊醇-5用三甲基氯硅烷在吡啶中硅烷化，并用獲得的C18 Tr氯化物三苯甲基化以形成C18 Tr-NH-C5-OH。分離物隨后亞磷酸化以形成構(gòu)件(圖4)，用于引入具有增強(qiáng)的疏水性的分離功能元件。上述操作類似于商業(yè)上可獲得的MMTr-NH-衍生物的合成進(jìn)行。
3)氨基甲基聚苯乙烯支持物與三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)胸苷殘基、接著與一個(gè)二甲硅烷氧基修飾的胸苷構(gòu)件反應(yīng)。分子信標(biāo)的合成通過(guò)猝滅劑amidite的單次偶聯(lián)起始，接著是在每端具有彼此互補(bǔ)的6個(gè)堿基的38-mer DNA探針的合成。合成通過(guò)添加熒光團(tuán)單元(CY3，AmershamBiosciences)和作為分離功能元件的C18 Tr衍生物完成。合成的物質(zhì)通過(guò)氨水去保護(hù)，并且固相支持物用1∶1的乙腈/水洗滌若干次，以除去所有脫嘌呤和切割的分子。殘留的物質(zhì)如上文所述從支持物上切割，并施加到分離柱上。利用40％乙腈+0.1M TEAA的徹底洗滌除去所有痕量的截短序列和脫嘌呤序列的3′-端部分。殘留的物質(zhì)如實(shí)施例1所述在柱上沉淀并去三苯甲基化。最終洗脫的物質(zhì)的純度在HPLC和CE兩者上測(cè)試，其僅僅顯示雙標(biāo)記全長(zhǎng)分子信標(biāo)的存在。
實(shí)施例5-在柱寡核苷酸衍生化在5′-端由MMTr-NH-C5-基團(tuán)標(biāo)記的26-mer寡核苷酸如實(shí)施例2所述在柱上合成、純化并去三苯甲基化。不過(guò)，并不洗脫產(chǎn)物，取而代之，所述乙腈洗滌過(guò)的、沉淀有5′氨基寡核苷酸的柱用過(guò)量溶于由乙腈∶DMF∶吡啶7∶2∶1組成的混合物中的異硫氰酸熒光素于室溫下處理6小時(shí)。未反應(yīng)的試劑利用相同組成的溶劑洗掉，之后用乙腈洗滌并風(fēng)干。最終洗脫的產(chǎn)物通過(guò)HPLC分析，以證明起始物質(zhì)向5′熒光素標(biāo)記產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。
其它實(shí)施方案應(yīng)當(dāng)理解盡管本發(fā)明已結(jié)合其詳細(xì)內(nèi)容進(jìn)行了說(shuō)明，前述說(shuō)明旨在舉例說(shuō)明，而并非限制本發(fā)明的范圍，它是由所附權(quán)利要求的范圍限定的。其它方面、有利之處以及修飾落在如下權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
固相上的寡核苷酸↓在機(jī)器上氨水處理→↓溶于THF的TBAF處理60分鐘↓氨水55攝氏度12小時(shí)↓將全部稀釋混合物施加到RP 18柱上→↓洗出截短的寡核苷酸片段→↓殘留物的固相去三苯甲基化↓純?nèi)L(zhǎng)寡核苷酸的洗脫→ 1)將粗反應(yīng)混合物施加到RP C18柱上2)用20％乙腈洗滌3)用水洗滌4)用空氣沖洗5)用100％丙酮洗滌6)溶于二氯甲烷的TCA(2％)→洗脫MMTr陽(yáng)離于7)用100％乙腈洗滌8)用空氣沖洗9)用40％乙腈洗脫全長(zhǎng)寡核苷酸
權(quán)利要求
1.用于寡核苷酸去保護(hù)的方法，所述方法包括a)提供多數(shù)個(gè)寡核苷酸，所述多數(shù)個(gè)寡核苷酸包含受保護(hù)寡核苷酸，其中(i)所述受保護(hù)寡核苷酸的5′端與疏水分離功能元件相連或者(ii)每個(gè)所述受保護(hù)寡核苷酸都與一對(duì)疏水分離功能元件相連，其中所述疏水分離功能元件對(duì)中一員較之于該對(duì)中的另一員疏水性較小；b)利用有機(jī)溶劑將所述多數(shù)個(gè)寡核苷酸沉淀到疏水固相支持物上，以產(chǎn)生非共價(jià)固定的寡核苷酸；和c)利用溶于有機(jī)溶劑的試劑，通過(guò)(i)從所述固定寡核苷酸中選擇性除去所述5′分離功能元件或者(ii)從所述固定寡核苷酸中順序除去所述疏水分離功能元件對(duì)，來(lái)對(duì)所述固定寡核苷酸進(jìn)行去保護(hù)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括，在步驟b)之前，將所述多數(shù)個(gè)寡核苷酸吸附到疏水支持物上；并洗脫(i)缺乏所述5′疏水分離功能元件的寡核苷酸或者(ii)缺乏任何保護(hù)基團(tuán)的寡核苷酸以及僅含所述疏水分離功能元件對(duì)中疏水性較小的分離功能元件的寡核苷酸。
3.權(quán)利要求1的方法，所述方法進(jìn)一步包括洗脫所述去保護(hù)的寡核苷酸。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷、氯仿、乙腈、四氫呋喃、乙酸乙酯、丙酮或異丙醇。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述沉淀步驟包括預(yù)干燥位于所述疏水固相支持物上的所述多數(shù)個(gè)寡核苷酸，然后用所述有機(jī)溶劑洗滌所述疏水固相支持物。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述5′疏水分離功能元件為三苯甲基部分、疏水縮醛或硫縮醛基團(tuán)。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述三苯甲基部分利用酸的非水溶液選擇性除去。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述酸的非水溶液為溶于二氯甲烷的2％三氯乙酸。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述疏水固相支持物以柱或歧管的形式提供，所述歧管含多數(shù)個(gè)柱。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述疏水固相支持物是基于聚苯乙烯、炭、石墨或硅石的。
11.權(quán)利要求6的方法，其中所述三苯甲基部分為二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、甲呱啶或單甲氧基三苯甲基部分。
12.權(quán)利要求6的方法，其中所述三苯甲基部分從由4-己氧基甲氧基三苯甲基、4-癸氧基甲氧基三苯甲基、4-十六烷氧基甲氧基三苯甲基、4-十八烷氧基苯呫噸基、4-4′-二-己氧基甲氧基三苯甲基、4-4′-二-癸氧基甲氧基三苯甲基、4-4′-二-十六烷氧基甲氧基三苯甲基、4-十八烷氧基三苯甲基、4-十六烷氧基三苯甲基、4-癸氧基三苯甲基和4-己氧基三苯甲基部分組成的組中選擇。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述疏水分離功能元件對(duì)的一員為直鏈烷基、支鏈烷基、芳基烷基或芳基，其通過(guò)接頭與寡核苷酸相連，所述接頭可在不除去所述疏水分離功能元件對(duì)中另一員的條件下去除。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述接頭為甲硅烷氧基或二甲硅烷氧基功能元件。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述多數(shù)個(gè)寡核苷酸之內(nèi)包含脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
16.權(quán)利要求15的方法，其中寡核苷酸包含非標(biāo)準(zhǔn)主鏈。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述非標(biāo)準(zhǔn)主鏈為硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或磷酰胺。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述寡核苷酸為鎖核酸(LNA)。
19.權(quán)利要求15的方法，其中寡核苷酸含有與官能團(tuán)相連的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述官能團(tuán)為氨基、硫醇、磷酸、醛、嵌入劑、猝滅劑或熒光團(tuán)。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述官能團(tuán)位于所述寡核苷酸的任一端。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述官能團(tuán)位于所述寡核苷酸的兩端。
23.權(quán)利要求19的方法，其中所述官能團(tuán)在各端是不同的。
24.權(quán)利要求19的方法，其中所述5′分離功能元件或者所述疏水分離功能元件對(duì)的一員連接在所述官能團(tuán)上。
25.權(quán)利要求19的方法，其中所述疏水分離功能元件對(duì)的一員連接在接頭上，而所述接頭連接在所述官能團(tuán)上。
26.權(quán)利要求1的方法，所述方法進(jìn)一步包括使用非水條件衍生化所述固定寡核苷酸。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述衍生化步驟包括將熒光團(tuán)摻入到所述純化的寡核苷酸中。
28.權(quán)利要求26的方法，所述方法進(jìn)一步包括洗脫所述衍生化寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于寡核苷酸去保護(hù)的方法，包括(a)提供受保護(hù)寡核苷酸，其中(i)5′端與疏水分離功能元件(如二甲氧基三苯甲基)相連或者(ii)兩端與一對(duì)疏水分離功能元件相連，該對(duì)中一員較之于另一個(gè)疏水性較小(如為烷基、芳基烷基或芳基甲硅烷氧基)；(b)利用有機(jī)溶劑將寡核苷酸沉淀(如通過(guò)干燥)到疏水支持物(如疏水聚苯乙烯基支持物)上，從而非共價(jià)固定所述寡核苷酸并使其不溶；和(c)利用溶于有機(jī)溶劑的試劑(如溶于二氯甲烷的2％三氯乙酸)對(duì)寡核苷酸進(jìn)行去保護(hù)(即除去疏水分離功能元件)。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1678618SQ03820591
公開(kāi)日2005年10月5日 申請(qǐng)日期2003年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月28日
發(fā)明者M·科維亞特科斯基 申請(qǐng)人:Quia技術(shù)股份有限公司