專利名稱：通過固相技術(shù)經(jīng)金屬輔助的從固體載體上裂解制備m(co)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及放射性藥物領(lǐng)域。本發(fā)明特別涉及通過金屬輔助的從固體載體上裂解制備金屬配位劑的方法。
在另一個(gè)方面中本發(fā)明涉及配位體與生物分子的新的固相結(jié)合的綴合物。
在另一個(gè)方面中本發(fā)明涉及新金屬配位的配位體-生物分子綴合物、包括這些新配合物的組合物及其應(yīng)用。
在另一個(gè)方面中本發(fā)明涉及用于制備診斷或治療藥物組合物的試劑盒。
為了在臨床常規(guī)診斷或療法中使用放射性標(biāo)記的生物活性分子，即諸如，肽類，非常需要僅注射標(biāo)記的化合物以避免相應(yīng)受體的飽和來自″冷″未標(biāo)記的化合物的體內(nèi)毒性副作用。此外，大量標(biāo)記的生物分子與受體結(jié)合破壞可能獲得的清晰圖像(閃爍圖)，且由此通常不能獲得清楚診斷。
根據(jù)本領(lǐng)域的狀況，僅可以通過使用仍然產(chǎn)生定量標(biāo)記的最低可能量(濃度)的衍生的生物分子(或與該生物分子偶聯(lián)的99mTc的配位體)在正常均勻標(biāo)記方法中獲得高特異性活性。隨配位體和配合物前體的不同，這些量通常必須相對(duì)較高，因?yàn)樵诘蜐舛认拢湮宦适艿蕉?jí)動(dòng)力學(xué)控制且由此標(biāo)記過于緩慢并伴有配位體或99mTc前體的分解。最低濃度限通常不易于常規(guī)應(yīng)用，因?yàn)樵谶@類濃度下條件稍加改變(溫度、時(shí)間)不會(huì)產(chǎn)生定量標(biāo)記的產(chǎn)物。相應(yīng)地，副產(chǎn)物和分解產(chǎn)物以及原料仍然存在于最終溶液中。
從′熱′化合物中以物理方式分離′冷′化合物的便利方法是通過使配位體-生物分子綴合物與固相材料結(jié)合并將其從伴隨形成的配合物上裂解來進(jìn)行。這類金屬輔助的從固相上裂解的實(shí)例是罕見的。
美國專利US-5,789,555(Pollak等)描述了用锝-99m、錸-186或錸-188標(biāo)記肽類的方法。該方法包括使所述肽類與固體載體通過與馬來酰亞胺連接基形成的硫醚鍵共價(jià)偶聯(lián)的步驟。通過將高锝酸鹽引入載體，形成99mTcV(＝O)-肽配合物。在配合物形成時(shí)，99mTcV(＝O)通過打斷C-S鍵催化從載體上裂解肽，由此從載體上釋放99mTcV(＝O)-肽配合物。
從文獻(xiàn)中得知被保護(hù)的硫醇類通過與Tc＝O中心配位釋放保護(hù)基。基于這些發(fā)現(xiàn)，Pollak等(J.Am.Chem.Soc.121，11593-11594(1999)通過與金表面形成的硫醚鍵結(jié)合了四配位基螯合物。Tc(V)與這種配位體配位時(shí)，通過將S-Au-鍵打斷為與Tc配位的硫使99mTc-配合物選擇性釋放入溶液中。
近來Dunn-Dufault等(Nucl.Med.Biol.27，803-807(2000)描述了這種方法的變化形式，通過使螯合物與有機(jī)聚合載體共價(jià)結(jié)合來進(jìn)行。
上述用于生產(chǎn)Tc和Re標(biāo)記的有機(jī)配合物的方法均取決于C-S或Au-S鍵的裂解。這種使配位體與固體載體共價(jià)結(jié)合的C-S和Au-S鍵對(duì)氧化敏感。因此，必須在還原條件下保存包括通過C-S鍵共價(jià)結(jié)合的配位體的固體載體。這對(duì)長期儲(chǔ)存而言尤其重要。在還原條件下儲(chǔ)存的必要性要求為儲(chǔ)存采取的另外措施。此外，如果載體用于生產(chǎn)適合于藥物施用的化合物，那么從藥物安全性的觀點(diǎn)來看，存在還原劑非常不理想。因此，對(duì)已知的固體結(jié)合配位體用于這類應(yīng)用而言存在一定局限。
另外，這些金屬氧化物種類的應(yīng)用伴有對(duì)利用共同使用的配位體即四配位基的限制?，F(xiàn)有技術(shù)中僅公開了用于99mTcV(＝O)中心的肽基配位體。
因此，存在對(duì)制備金屬標(biāo)記的配合物的新方法的需求，該方法通過固相技術(shù)經(jīng)金屬輔助的從固體載體裂解來進(jìn)行，所述的固體載體使用固相結(jié)合的生物分子-配位體綴合物，它們?cè)谒幬锷峡山邮艿臈l件下比現(xiàn)有技術(shù)的綴合物更為穩(wěn)定。
另外，可以用于通過固相技術(shù)經(jīng)金屬輔助的裂解形成金屬配位的配位體-生物分子綴合物的多種配位體的可用性是有利的，因?yàn)檫@種情況可以為這項(xiàng)技術(shù)提供更為靈活的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供用于制備標(biāo)記的診斷和治療化合物的改進(jìn)方法。
在得到本發(fā)明的研究中，發(fā)現(xiàn)在有[Tc(H2O)3(CO)3]+存在的情況下，某些能夠與金屬配位并通過叔胺基團(tuán)與固體載體結(jié)合的有機(jī)分子(配位體)在形成[Tc(CO)3-配位體]-配合物時(shí)從固體載體上裂解。選擇性水解C-N鍵裂解顯然由配合物形成過程中形成的低價(jià)羰基[Tc(H2O)3(CO)3]+中心介導(dǎo)且在沒有[99mTc(H2O)3(CO)3]+存在的相同反應(yīng)條件下不會(huì)發(fā)生。在從固體載體上釋放后，前者叔胺以配位的仲胺存在。
提出這種[Tc(CO)3-配位體]-配合物的機(jī)理如下。當(dāng)固體結(jié)合的螯合劑(所謂的配位體)的叔胺基團(tuán)與[M(H2O)3(CO)3]n+的金屬陽離子中心配位時(shí)，它帶部分正電且相鄰碳原子由此被活化用于親核攻擊。剩余的羥基攻擊螯合劑的亞甲基并誘導(dǎo)C-N鍵裂解(附圖2)。螯合劑第三供體部位與金屬中心配位且產(chǎn)物配合物釋放入溶液中。未配合的螯合劑和未裂解的配合物保持與固相結(jié)合。
發(fā)現(xiàn)通過如上所述從帶有[99mTc(H2O)3(CO)3]+的固體載體水解裂解配位體獲得的標(biāo)記化合物具有極高的特異性活性，即在溶液中幾乎沒有未配位的配位體。溶液中未配位的配位體的量約為10-7M數(shù)量級(jí)。因此，可以有吸引力地研發(fā)這種特異性裂解反應(yīng)以制備所謂的″無載體添加的″(n.c.a.)锝和其它具有相似化學(xué)反應(yīng)性的金屬的配合物。
因此，本發(fā)明涉及生產(chǎn)金屬配位劑的新方法，包括在適宜條件下使通式(I)表示的固相結(jié)合的有機(jī)綴合物與(II)[M(H2O)3(CO)3]n+接觸 其中球狀體為固相；C為可以被一個(gè)或兩個(gè)基團(tuán)R4和R5取代的亞甲基，R4和R5特別可以為脂族或芳族取代基；或RO、RS或R2N，其中R為脂族基或芳族基；L為可以存在或可以不存在的連接基，它與固體載體偶聯(lián)并具有激活對(duì)C基團(tuán)的親核攻擊的特性且優(yōu)選苯基、烷基、烯丙基或芳基；且R1和R2相同或不同且為金屬配位基團(tuán)或非配位的有機(jī)基團(tuán)；所述的固相結(jié)合的有機(jī)綴合物用生物活性分子任選在R1和R2之一或兩者上衍生；在(II)[M(H2O)3(CO)3]n+中，M選自锝(Tc)、錸(Re)、銠(Rh)、鉑(Pt)、銥(Ir)和銅(Cu)組成的組且n為1、2或3，這取決于所述金屬；所述的適宜條件為使[M(H2O)3(CO)3]n+與固相結(jié)合的有機(jī)綴合物的叔胺氮原子之間形成配價(jià)鍵，從而使如此形成的金屬配位劑從載體上釋放。
連接基可以存在或可以不存在。它可以已經(jīng)存在于可用的固體載體上或可以以后引入。當(dāng)它存在時(shí)，優(yōu)選為C上親核攻擊的良好活化基團(tuán)且選自苯基、乙烯基、芳基和其它非脂族或脂族基團(tuán)。所述的苯基、乙烯基、芳基、其它非脂族或脂族基團(tuán)可以被取代且如果它們被取代，那么它們優(yōu)選被選自O(shè)R、R、NR2的吸電子基團(tuán)取代，其中R為脂族基或芳族基。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，連接基如通式II中所示 其中X1為C或O且X2為吸電子取代基且優(yōu)選-OCH3。
當(dāng)R1和R2或R1和R2之一為非配位有機(jī)基團(tuán)時(shí)，它們選自烷基、苯基、芐基或其衍生物。
R1和/或R2優(yōu)選選自下列基團(tuán)組成的組 R3-NH2其中R3正是叔胺或?yàn)楹?-3個(gè)碳的脂族鏈。
金屬M(fèi)可以為任意金屬且優(yōu)選選自Tc、Re、Ru、Rh、Ir、Cu和Pt組成的組。最優(yōu)選的金屬為99mTc、186Re或188Re。
優(yōu)選金屬適合于例如通過傳送高能粒子或順磁特性用作顯象劑或用作放射性核素。
可以通過本領(lǐng)域中公知的任意合適的方法制備[M(H2O)3(CO)3]n+。用于制備[M(H2O)3(CO)3]n+的適宜方法例如來自Alberto等(J.Am.Chem.Soc.123，3135-3136(2001))或WO98/48848(Alberto等)公開的permetallate形式。
不含固體載體的通式I分子在本文中稱作配位體。該配位體特別可以為三齒配位體，條件是R1和R2選自下列基團(tuán)組成的組
R3-NH2所述配位體還可以為二齒螯合物，條件是R1和R2或兩者之一為脂族或芳族非配位基團(tuán)。
本發(fā)明與[M(H2O)3(CO)3]n+聯(lián)用的配位體可以多種三齒配位體，主要需要存在叔胺基作為配位體的中心部分，它形成與固體載體偶聯(lián)的C-N鍵并在配合物形成時(shí)被裂解。優(yōu)選所用的配位體基于脂族或芳族胺或羧酸酯類及其組合作為供體。配位體還可以為二齒螯合物，條件是R1和R2均不為非配位脂族或芳族基團(tuán)。如實(shí)施例10中所示。
特別可以將二亞乙基三胺、甲基吡啶胺-N-乙酸、N-(2-氨乙基)-甘氨酸或亞氨基-二乙酸用作本發(fā)明中的配位體。
可以通過首先形成鹵化樹脂，例如通過Ngu和Patel所述的方法使配位體與固體載體共價(jià)連接(Tet.Lett.38，973-976(1997)。這種鹵化樹脂隨后可以與被保護(hù)的配位體發(fā)生反應(yīng)。在脫保護(hù)后，得到配位體結(jié)合樹脂。如果配位體通過這種方法與固相結(jié)合，那么它與固體載體結(jié)合的共價(jià)鍵為C-N鍵。例如，還可以如實(shí)施例5、6、8和9中所述，通過還原氨化和/或用烷基鹵烷基化由氨基樹脂作為原料在固體載體上合成配位體。實(shí)施例1-9中更詳細(xì)地討論了吸附了的樹脂的制備。
在本說明書中，術(shù)語配位體指的是含有能夠與金屬形成配位鍵而形成穩(wěn)定的金屬-配位體配合物的至少一個(gè)金屬配位原子的化合物。含有一個(gè)以上金屬配位原子的配位體可以稱作螯合物或多齒配位體。二齒配位體為含有兩個(gè)金屬-配位原子的配位體，三齒配位體為含有三個(gè)金屬-配位原子的配位體，且四齒配位體為含有四個(gè)配位原子的配位體。
可以與配位體偶聯(lián)的生物活性分子(本文也稱作″生物分子″)可以為在診斷或療法中具有活性的任意分子。該分子可以偶聯(lián)在除與固體載體連接的氮以外的任意位置上。它可以為使放射性產(chǎn)物定向于需要診斷或治療位置的靶向分子或它可以具有不同于放射性標(biāo)記的治療活性。所述的生物活性分子可以選自下列分子組成的組氨基酸；甾類化合物；肽類；蛋白質(zhì)，特別是結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、酶或抗體；碳水化合物；多糖類和寡糖類；核苷、核苷酸、寡核苷酸和多核苷酸；脂類、肽類；和藥物活性小分子，諸如中樞神經(jīng)系統(tǒng)受體結(jié)合化合物。
所述的生物分子可以通過本領(lǐng)域中公知的任意合適的方法與所述的配位體連接，例如通過使醛還原氨化成配位體的伯胺基或通過在芳基體系上引入結(jié)合部位。生物分子可以在配位體與固體載體結(jié)合前或之后與配位體連接。
發(fā)現(xiàn)對(duì)固體載體的選擇可以進(jìn)一步改善本發(fā)明方法的效率。所述的固體載體可以在水中溶脹，它必須在反應(yīng)條件下保持穩(wěn)定且不必含有金屬配位單位。特別在這種情況中，固體載體為聚乙二醇樹脂或聚乙二醇與聚苯乙烯的雜化物，例如帶有聚乙二醇間隔基與芐醇結(jié)合基的聚苯乙烯樹脂。
本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包括收集金屬配位劑(即放射性藥物)用于進(jìn)一步應(yīng)用的步驟。
在制備n.c.a.99mTc放射性藥物后，可以收集、洗滌并重新使用固相聚合物。
優(yōu)選該方法在約6.0-11.0范圍、優(yōu)選在約7.5-9.5范圍的pH下進(jìn)行。
進(jìn)行該反應(yīng)的適宜溫度在約40-100℃范圍。優(yōu)選反應(yīng)在約70-82℃范圍的溫度下進(jìn)行。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及通式I的固相結(jié)合的配位體-生物分子綴合物和包括這類化合物的組合物。優(yōu)選這些組合物為可以在藥物上可接受的條件下長期儲(chǔ)存的形式。
使用本發(fā)明的方法可以通過過濾、但不需要進(jìn)一步在標(biāo)記后純化而獲得具有高特異性活性的金屬配位的配位體-生物分子綴合物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及可使用本發(fā)明方法獲得的金屬配位的配位體-生物分子綴合物。通常這些綴合物包含在組合物中，該組合物是通過本發(fā)明方法獲得的且特征在于它基本上不含未配位的配位體-生物分子綴合物，例如在含有這些綴合物的組合物中未配位的配位體-生物分子綴合物含量為10-7M。具有這類特征的組合物是本發(fā)明的另一個(gè)方面。
由于放射性藥物中所用某些同位素、例如99mTc的半衰期短，所以將配位體-生物分子綴合物在使用前進(jìn)行標(biāo)記對(duì)配位的綴合物的特異性活性而言可能是重要的。在新標(biāo)記的組合物中衰變的配合物的量低于在使用前長時(shí)間配位綴合物時(shí)的情況。
因此，本發(fā)明在另一個(gè)方面中涉及用于制備診斷或治療藥物組合物的試劑盒，包括含有通式(I)分子的容器，其中該分子與[M(H2O)3(CO)3]n+溶液發(fā)生反應(yīng)。該容器可以為罐或柱。將[M(H2O)3(CO)3]n+溶液導(dǎo)入罐或柱以啟動(dòng)反應(yīng)。該溶液可以為試劑盒的組成部分或可以通過其它方式提供。在可選的實(shí)施方案中，試劑盒中包括用于制備羰基金屬[M(H2O)3(CO)3]n+的試劑。此外，該試劑盒可以包括過濾用具。
試劑盒的應(yīng)用為可以形成的金屬配合物提供了靈活性，因?yàn)榭梢郧≡谂湮环磻?yīng)前選擇合適的金屬。


圖1中解釋了本發(fā)明的不添加載體(n.c.a.)的金屬配位化合物的制備原理。三齒配位體，例如二亞乙基三胺通過連接基，本文為芐基衍生物通過叔胺與固體載體結(jié)合。使生物分子與螯合物(配位體)結(jié)合，由此形成配位體-生物分子綴合物。在引入[Tc(H2O)3(CO)3]+時(shí)，配合物形成且三齒配位體替代了兩個(gè)水合配位體。[Tc(H2O)2(OH)(CO)3]+上剩余的羥基配位體可以攻擊活化的亞甲基而誘導(dǎo)C-N-鍵裂解。通過使叔氨基與锝中心配位活化亞甲基，這一過程吸引來自螯合物的電子密度并使其對(duì)親核攻擊敏感。
具有對(duì)固相結(jié)合的生物分子-配位體綴合物的叔胺原子反應(yīng)性的主要種類為[M(OH)(H2O)2(CO)3]。在溶液中，[M(OH)(H2O)2(CO)3]以[M(H2O)3(CO)3]n+形式和其它離解形式與綴合物保持平衡，這取決于溶液的pH?？梢岳斫怆SpH的不同，因存在平衡而使[M(OH)(H2O)2(CO)3]至少部分可以與這些種類互變。
通過下面的非限制性實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明。在實(shí)施例中參照下列附圖圖1本發(fā)明不添加載體(n.c.a.)的金屬配位化合物的制備原理。
圖2配合物形成的機(jī)理。
圖3裂解反應(yīng)的pH依賴性。
圖4裂解收率的溫度依賴性。
圖5實(shí)施例1、2、3、4和10的反應(yīng)圖解。
圖6實(shí)施例5、6，、7、8和9的反應(yīng)圖解。
圖7實(shí)施例11、12和13的反應(yīng)圖解。
圖8實(shí)施例14和表1化合物的結(jié)構(gòu)式。
圖9含有生物活性分子的化合物的結(jié)構(gòu)式。
實(shí)施例實(shí)施例1使模型配位體與適宜的固相樹脂共價(jià)結(jié)合。該固相樹脂必須在水中溶脹以使Tc-物質(zhì)擴(kuò)散且偶聯(lián)配位體的結(jié)合基必須為用于親核攻擊的活化基團(tuán)。聚苯乙烯/聚乙二醇樹脂TentaGel S AC(Rapp Polymere GmbH，Tbingen，Germany)滿足了這些要求。其活性部位芐醇衍生物被轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的溴化物1(Ngu和Patel，Tet.Lett.38，973-976(1997))。
將N，N″-雙(1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亞環(huán)己基)乙基)二亞乙基三胺(2)(101.8mg，235.9pmol)溶于DMF(5ml)，加入樹脂1(196.6mg，47.2mol)并將該混合物在室溫下緩慢攪拌22小時(shí)。過濾該反應(yīng)混合物并用DMF(3次)、DMF和甲醇(3次，交替)和DMF(5次)洗滌樹脂。通過用肼水合物在DMF(1ml)中的2％溶液將樹脂洗滌10次5分鐘除去保護(hù)基。過濾該反應(yīng)混合物并用DMF(3次)、DMF和甲醇(5次，交替)、DMF(3次)和乙醚(3次)洗滌樹脂。將樹脂在高度真空中干燥而得到產(chǎn)物3，產(chǎn)量為192.3mg(97.8％；容量0.236mmol/g，偶聯(lián)效率100％)。
通過顯色試驗(yàn)觀察固相樹脂的游離氨基對(duì)堿性樹脂使用溴酚藍(lán)水溶液，而對(duì)伯胺類僅使用在DMF/二異丙基乙胺10∶1中的三硝基甲苯磺酸(TNBS)。樹脂3在兩種試驗(yàn)中顯陽性，而被保護(hù)的中間體對(duì)TNBS染色顯陰性。由通過元素分析測(cè)定的樹脂的N-含量計(jì)算樹脂的容量(以mmol結(jié)合的螯合劑/克計(jì))和螯合劑與固體載體的偶聯(lián)效率。
通過在室溫下將樹脂3在1mM[99Tc(H2O)3(CO)3]+溶液(7當(dāng)量)中攪拌驗(yàn)證樹脂3的螯合容量。通過β-液體閃爍計(jì)數(shù)分析過濾的溶液顯示活性降低了14％，這一結(jié)果與在樹脂上定量形成配合物一致。HPLC分析僅顯示了原料峰，表明在這些適度條件下沒有發(fā)生從固相的裂解。預(yù)先形成的99Tc-配合物在用于標(biāo)記的條件下變穩(wěn)定。甚至在80℃下的pH7.5的磷酸鹽緩沖液中延長加熱5小時(shí)在該溶液中也僅產(chǎn)生3％β-活性，至少低于預(yù)測(cè)值一個(gè)數(shù)量級(jí)。
實(shí)施例2使產(chǎn)生不帶電荷的配合物的另一種三齒配位體與實(shí)施例1中所述相同的樹脂結(jié)合。將N-甲基吡啶胺乙酸乙酯(54mg，280μmol)溶于DMF(3ml)并加入樹脂1(280mg，67μmol)。將該混合物在室溫下緩慢攪拌15小時(shí)，過濾該反應(yīng)混合物并用DMF(3次)、DMF和甲醇(3次，交替)和乙醚(3次)洗滌樹脂。被保護(hù)的中間體對(duì)溴酚藍(lán)顯陽性，而對(duì)TNBs染色顯陰性。通過將樹脂在水(5ml)和1M氫氧化鈉(0.30ml)的混合物中緩慢攪拌28小時(shí)除去保護(hù)基。過濾樹脂、用DMF(3次)、DMF和甲醇(3次，交替)、DMF(3次)和乙醚(3次)洗滌并在高度真空中干燥而得到產(chǎn)物4，產(chǎn)量為268mg(96％；容量0.209mmol/g，偶聯(lián)效率87.1％)。樹脂4在所有染色反應(yīng)時(shí)均顯陰性。
實(shí)施例3使產(chǎn)生帶負(fù)電荷的配合物的另一種三齒配位體與實(shí)施例1中所述相同的樹脂結(jié)合。將亞氨基二乙酸二甲基酯鹽酸鹽(6.4mg，33Fmol)和二異丙基乙胺(11.2μl，66μmol)溶于DMF(0.5ml)并加入樹脂1(280mg，67μmol)。將該混合物在室溫下緩慢攪拌24小時(shí)，過濾該反應(yīng)混合物并用DMF(3次)、DMF和甲醇(3次，交替)和水(3次，交替)洗滌樹脂。被保護(hù)的中間體對(duì)溴酚藍(lán)顯陽性，而對(duì)TNBs染色顯陰性。用NaOH水溶液沖洗樹脂除去保護(hù)基(0.1M，3小時(shí)，然后0.01M，12小時(shí))。過濾樹脂、0.1M NaOH(2次)、水(5次)、水和甲醇(3次，交替)，用甲醇(3次)和乙醚(3次)洗滌并在高度真空中干燥而得到產(chǎn)物5，產(chǎn)量為35mg(100％；容量4mmol/g，偶聯(lián)效率18％)。樹脂5對(duì)所有染色反應(yīng)均顯陰性。
實(shí)施例4使產(chǎn)生帶負(fù)電荷的配合物的另一種三齒配位體與實(shí)施例1中所述相同的樹脂結(jié)合。將N5-叔丁氧羰基-5-氨基-3-氮雜戊酸乙酯(74mg，280μmol)溶于DMF(3ml)并加入樹脂1(300mg，72μmol)。將該混合物在室溫下緩慢攪拌15小時(shí)，過濾該反應(yīng)混合物并用DMF(3次)、DMF和甲醇(3次，交替)和乙醚(3次)洗滌樹脂。被保護(hù)的中間體對(duì)溴酚藍(lán)顯陽性，而對(duì)TNBs染色顯陰性。通過將樹脂在水(5ml)和1M氫氧化鈉(1.40ml)的混合物中緩慢攪拌28小時(shí)除去乙酯基。過濾樹脂，用DMF(3次)、DMF和甲醇(3次，交替)、DMF(3次)和乙醚(3次)洗滌并在高度真空中干燥而得到Boc保護(hù)的酸。通過將樹脂在TFA和DCM(1∶1)的混合物中攪拌5分鐘、過濾并通過將樹脂再在TFA和DCM(1∶1)的混合物中攪拌10分鐘除去Boc基。如上所述洗滌得到產(chǎn)物6，產(chǎn)量為72mg(96％；容量22mmol/g，偶聯(lián)效率94％)。樹脂對(duì)6 TNBs染色顯陰性。
實(shí)施例5NovaSyn TG樹脂含有脂族氨基結(jié)合基。在本實(shí)施例中描述了在固體載體上合成螯合物甲基吡啶胺乙酸。
在室溫下將NovaSyn TG樹脂(100mg，30umol)和吡啶2-醛(14.3μl，150μmol)在甲醇(3ml)中攪拌20小時(shí)。過濾該反應(yīng)混合物并用DMF(3次)和DMF和甲醇(3次，交替)洗滌樹脂。向樹脂中加入在DMF(2ml)中的三乙酰氧基硼氫化鈉(31.8mg，150μmol)。在室溫下攪拌5小時(shí)后，過濾該反應(yīng)混合物并用DMF(4次)和甲醇(3次)洗滌樹脂。向樹脂中加入NaHCO3(10％水溶液)。3小時(shí)后，用DMF(3次)、水(3次)、乙醇(3次)和乙醚(3次)洗滌樹脂并干燥至得到氨基吡啶中間體，它對(duì)溴酚藍(lán)染色顯陽性，而對(duì)TNBS染色顯弱陽性。
向樹脂中加入溴乙酸乙酯(16.6μl，150μmol)和二異丙基乙胺(5.1μl，30μmol)在乙醇(2.5ml)中的混合物。在室溫下攪拌24小時(shí)后，過濾該反應(yīng)混合物并用乙醇(5次)洗滌樹脂且干燥。向樹脂中加入NaOH(1M)以除去乙酯保護(hù)基。在室溫下攪拌1天后，過濾該反應(yīng)混合物并用水(5次)、乙醇(3次)和乙醚(2次)洗滌樹脂且干燥至得到8，產(chǎn)量為86.4mg(83.7％；容量0.10mmol/g，偶聯(lián)效率43％)。
實(shí)施例6使NovaSyn TG樹脂(100mg，30mol)、溴乙酸乙酯(33.21，300mol)和二異丙基乙胺(12.9J.1，75Fmol)如實(shí)施例5第二部分中所述反應(yīng)而得到9，產(chǎn)量為96.2mg(93％)。
實(shí)施例7NovaSyn TGT樹脂含有羥基三苯甲基結(jié)合基。如所述將羥基轉(zhuǎn)化成氯化物(J.M.J Frechert等，Tetrahedron Lett.1975，3055)。
將亞氨基乙酸二甲基酯鹽酸鹽(16.2mg，82umol)和二異丙基乙胺(21ul，123umol)溶于DMF(2ml)。加入氯化Novasyn TGT樹脂(41umol)。如實(shí)施例3中所述進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)和酯水解，但不包括在3小時(shí)反應(yīng)時(shí)間后加入二異丙基乙胺(14ul，82umol)。得到產(chǎn)物10，產(chǎn)量為132mg(81％；容量0.015mmol/g，偶聯(lián)效率6％)。
實(shí)施例8NovaSyn TGR樹脂含有氨甲基結(jié)合基與在亞甲基上的兩個(gè)芳基取代基。按照與實(shí)施例5中所述合成8類似的方法制備樹脂11。
使NovaSyn TG R樹脂(166mg，30umol)與實(shí)施例5中所述相同量的試劑反應(yīng)而得到11，產(chǎn)量為153mg(90％；容量0.08mmol/g，偶聯(lián)效率44％)。
實(shí)施例9按照與實(shí)施例6中所述合成9類似的方法制備樹脂12。
使NovaSyn TGR樹脂(166mg，30umol)與實(shí)施例6中所述相同量的試劑反應(yīng)而得到12，產(chǎn)量為142.2mg(84％)。
實(shí)施例10在本實(shí)施例中，使二齒螯合物與Tentagel S AC溴化物1結(jié)合。
將N，N′-二甲基乙二胺(110ul，1040umol)溶于DMF(1ml)，加入樹脂1(108.6mg，26mol)并將該混合物在室溫下緩慢攪拌24小時(shí)。過濾該反應(yīng)混合物并用DMF(3次)、DMF和甲醇(3次，交替)、水(3次)、DMF和異丙醇(3次，交替)、水(3次，異丙醇(3次)和乙醚(3次)洗滌樹脂。將樹脂在高度真空中干燥而得到13，產(chǎn)量為101.6mg(98.1％；容量0.24mmol/g，偶聯(lián)效率100％)。對(duì)溴酚藍(lán)樹脂13顯陽性，而對(duì)TNBs染色顯陰性。
實(shí)施例11在本實(shí)施例中描述了產(chǎn)生嵌入雙鏈DNA的生物活性配合物的綴合物的合成。使生物活性單位芘衍生物結(jié)合在固體載體上的螯合單位上。
如制備3中所述使N-Boc-N″-Dde被保護(hù)的二亞乙基三胺與1偶聯(lián)。雙保護(hù)的中間體對(duì)溴酚藍(lán)顯陽性，而對(duì)TNBs染色顯陰性。通過將樹脂在肼水合物(1.5ml，在DMF中2％)中攪拌5次10分鐘，隨后過濾除去De保護(hù)基。用TNBS染色顯陽性證實(shí)除去了Dde保護(hù)基。通過還原氨化引入芘基。向單保護(hù)的樹脂(103mg，24μmol)中加入1-芘醛(28.5mg，120μmol)和甲醇(4ml)并將該混合物在室溫下攪拌20小時(shí)。過濾并用DMF洗滌后，加入在DMF(5ml)中的三乙酰氧基硼氫化鈉(25mg，120μmol)并將該混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。用DMF和甲醇(如上所述)洗滌得到Boc-保護(hù)的樹脂結(jié)合的芘二亞乙基三胺衍生物，它對(duì)溴酚藍(lán)顯陽性，而對(duì)TNBs染色顯陰性。最終通過將樹脂在三氟乙酸(在CH2Cl2中50％)中攪拌5分鐘，隨后過濾并用三氟乙酸(在CH2Cl2中50％)處理10分鐘除去Boc保護(hù)基。洗滌(如上所述)得到產(chǎn)物7(容量0.18mmol/g，偶聯(lián)效率82％)。樹脂7對(duì)溴酚藍(lán)顯陽性，而對(duì)TNBs染色顯陰性。
實(shí)施例12在本實(shí)施例中，使生物素(維生素H)與螯合單位結(jié)合。與實(shí)施例11相反，在與固體載體結(jié)合前合成螯合物/生物分子-綴合物。將三亞乙基四胺(0.150ml，1.00mmol)溶于THF(30ml)并將該溶液冷卻至-78℃。在-78℃下30分鐘內(nèi)加入三氟乙酸乙酯(0.109ml，1.00mmol)在THF(5ml)中的溶液并將該溶液在相同溫度下攪拌4小時(shí)。然后將其加熱至0℃。
同時(shí)將在DMF(8ml)中的(+)-生物素(244mg，1.00mmol)加熱至80℃而得到無色溶液。向該熱溶液中加入N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺(216mg，1.05mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(121mg，1.05mmol)。將該混合物緩慢冷卻至室溫。白色粉末沉淀。持續(xù)攪拌4小時(shí)。
將這兩種混合物在0℃下混合并攪拌30分鐘而得到白色凝膠。蒸發(fā)THF至得到白色混懸液。在室溫下攪拌18小時(shí)后。在真空中蒸發(fā)溶劑并向殘余物中加入水。將pH調(diào)節(jié)至3-4。過濾該混合物，中和洗脫液并在真空中除去水。通過柱色譜法(二氧化硅，二氯甲烷/甲醇/三乙胺5∶1∶0.1)提純而得到N-生物素基-N-三氟乙酰基-三亞乙基四胺，產(chǎn)量為60.5mg(0.129mmol，12.9％)。通過質(zhì)譜法和NMR驗(yàn)證結(jié)構(gòu)。
如實(shí)施例1中所述使N-生物素基-N-三氟乙?；?三亞乙基四胺(40.3mg，86umol)、三乙胺(1.8ul，17umol)和樹脂1(71.7mg，17umol)反應(yīng)。將TFA-樹脂在高度真空中干燥至得到產(chǎn)物14，產(chǎn)量為67mg(85％，容量3mmol/g，偶聯(lián)效率13％)。樹脂14對(duì)溴酚藍(lán)顯陽性，而對(duì)TNBs染色顯陰性。根據(jù)TNBS染色時(shí)的陰性結(jié)果，用碳酸鈉(10％水溶液)除去TFA的保護(hù)基的嘗試失敗。
實(shí)施例13在本實(shí)施例中描述了制備標(biāo)記的肽衍生物的方法。使含有游離羧基端基的被保護(hù)的二肽與部分保護(hù)的多胺偶聯(lián)。除去所有的保護(hù)基并引入Dde保護(hù)以便選擇性打斷肽和螯合物上的伯氨基。這可以使綴合物通過由螯合物的未被保護(hù)的仲氨基之一形成叔氨基而選擇性結(jié)合固體載體。
將N，N′，N″-三(叔丁氧羰基)三亞乙基四胺(103.3mg，234.5umol)、Boc-Phe-Gly-OH(75.6mg，234.5umol)、PyBOP(183mg，352mol)和二異丙基乙胺(20ul，117umol)溶于二氯甲烷(2.5ml)。將該溶液在室溫下攪拌4小時(shí)。定期加入二異丙基乙胺(20ul，117umol)以保持pH＞7。在真空中除去溶劑，將殘余物溶于乙酸乙酯并用鹽水(3次)、0.5M冷HCl(3次)、10％NaHCO3(2次)和鹽水(3次)洗滌。用MgSO4干燥有機(jī)相并在真空中除去溶劑而得到N-(叔丁氧羰基-苯丙氨?；?甘氨?；?-N′，N″，N-三(叔丁氧羰基)-三亞乙基四胺，產(chǎn)量為175.2mg(231.6umol，98.8％)。通過質(zhì)譜法和NMR驗(yàn)證結(jié)構(gòu)。
通過將產(chǎn)物(162.2mg，0.169mmol)在HCl的乙酸乙酯溶液(約1M，3ml)中攪拌除去Boc保護(hù)基。在室溫下攪拌9小時(shí)后，在真空中除去溶劑。將殘余物溶于水并攪拌1小時(shí)(pH為2-3)，然后加入NaOH(1M，313mmol)以中和該溶液并在真空中蒸發(fā)溶劑而得到定量產(chǎn)量的H-Phe-Gly-NH-C2H4-NH-C2H4-NH-C2H4-NH2。通過質(zhì)譜法和NMR驗(yàn)證結(jié)構(gòu)。
將H-Phe-Gly-NH-C2H4-NH-C2H4-NH-C2H4-NH2(113mg，0.152mmol)和2-乙酰基雙甲酮(Dde-OH)(70.0mg，0.335mmol)溶于乙醇(4ml)。在室溫下攪拌20小時(shí)后，通過TLC分析顯示所述胺完全轉(zhuǎn)化成單一產(chǎn)物。除去溶劑而得到Dde-Phe-Gly-NH-C2H4-NH-C2H4-NH-C2H4-NH-Dde。通過質(zhì)譜法驗(yàn)證結(jié)構(gòu)。不經(jīng)分離剩余2-乙酰基雙甲酮而使用粗產(chǎn)物。
如實(shí)施例1中所述使Dde-Phe-Gly-NH-C2H4-NH-C2H4-NH-C2H4-NH-Dde(76mol)和樹脂1(79.2mg，19umol)反應(yīng)。被保護(hù)的中間體對(duì)溴酚藍(lán)顯陽性，而對(duì)TNBs染色顯陰性。也如實(shí)施例1中所述除去Dde保護(hù)基而得到產(chǎn)物15。樹脂15對(duì)溴酚藍(lán)顯陽性，而對(duì)TNBs染色顯陰性。
實(shí)施例14標(biāo)記條件使用碳酸硼試劑盒由[99mTcO4]-制備[99mTC(H2O)3(CO)3]+(Alberto等，J.Am.Chem.Soc.123，3135-3136(2001))。向[99mTC(H2O)3(CO)3]+-溶液(1ml)中加入1mg固相結(jié)合的螯合物(0.2mmol)，將該混合物短暫超聲處理且然后加熱至82℃ 30分鐘。通過過濾從固相樹脂中分離該溶液并通過帶有γ-檢測(cè)的HPLC分析。
由于使用了所有的固相結(jié)合的螯合物，所以觀察到形成可溶性配合物。產(chǎn)率隨螯合物類型和反應(yīng)條件的不同在5-50％之間改變(標(biāo)1)。
實(shí)施例15按照單罐法標(biāo)記樹脂3和4，將[99mTC(H2O)3(CO)3]+形成與裂解反應(yīng)合并。向碳酸硼試劑盒中加入1mg固相結(jié)合的螯合物(0.2mmol)(MallinckrodtMedical，Petten，the Netherlands；Alberto等，J.Am.Chem.Soc.123，3135-3136(2001))。將從發(fā)生器中洗脫的NaTcO4加入到小瓶中并將該混合物保持在78℃-82℃下20-60分鐘。PH為11。裂解收率為8-32％，高锝酸鹽的轉(zhuǎn)化率為40-54％。
實(shí)施例16就在樹脂4上的標(biāo)記反應(yīng)而言，改變諸如pH值和反應(yīng)溫度的反應(yīng)條件以找到最佳反應(yīng)條件。為了用作放射指示劑，要求原料[99mTC(H2O)3(CO)3]+的完全轉(zhuǎn)化和形成一種單產(chǎn)物。因樣品的放射性及其快速衰變(t1/2＝6.2小時(shí))而必須避免在標(biāo)記步驟后的純化步驟。需要高裂解收率以得到高放射性溶液。
裂解反應(yīng)的pH依賴性如附圖3中所示。裂解收率從pH6開始在pH8.5時(shí)增加到最大值。這一結(jié)果與[99mTC(H2O)3(CO)3]+脫質(zhì)子化成[99mTC(OH)(H2O)2(CO)3]的結(jié)果一致(錸類似物的pKs7.5；Egli等，Organometallics 16，1833-1840(1997))且由此使用Tc-配位的羥基離子是攻擊CH2-基團(tuán)的親核體以裂解C-N鍵的理論。將pH增加至11再次降低了裂解收率。這可能是由于形成帶負(fù)電荷的物質(zhì)[99mTC(OH)2(H2O)(CO)3]-所致，它降低配位氨基的親電性。
通過分析[99mTC(H2O)3(CO)3]+完全轉(zhuǎn)化后的反應(yīng)產(chǎn)物研究樹脂4與[99mTC(H2O)3(CO)3]+反應(yīng)的溫度依賴性。在室溫下，僅在樹脂上形成配合物，從固相過濾后的溶液沒有顯示出放射性。在43℃時(shí)，觀察到裂解收率，但較低。然后隨溫度的增加而增加(圖4)。這一結(jié)果清楚地表明樹脂上配合物形成與裂解反應(yīng)之間有競(jìng)爭(zhēng)性，其中裂解反應(yīng)具有較高的反應(yīng)能壘。然而，鑒于固相樹脂和結(jié)合的生物分子的穩(wěn)定性，極高的溫度可能是缺點(diǎn)。對(duì)樹脂4而言優(yōu)選70℃-82℃的反應(yīng)溫度。
表1固相結(jié)合的螯 裂解的99mTC- 裂解收率 條件合劑(樹脂)配合物3(TentaGel) 27％ 1小時(shí)82℃4(TentaGel) 52％ 1小時(shí)82℃28％ 2小時(shí)56℃5(TentaGel) 20％ 1小時(shí)82℃6(TentaGel) 22％ 1小時(shí)82℃7(TentaGel) 5％ 1小時(shí)82℃8(NovaSyn TG)8％ 1小時(shí)82℃9(NovaSyn TG) 11％ 1小時(shí)82℃4％ 3小時(shí)56℃
10(NovaSyn TGT) 93％ 1小時(shí)82℃79％ 3小時(shí)56℃11(NovaSyn TGR) 53％ 1小時(shí)82℃15％ 3小時(shí)56℃12(NovaSyn TGR) 83％ 1小時(shí)82℃78％ 3小時(shí)56℃13(TentaGel)10％ 1小時(shí)82℃14(TentaGel) 14％ 1小時(shí)82℃14(TentaGel)13％ 2小時(shí)82℃
權(quán)利要求
1.生產(chǎn)金屬配位劑的方法，包括在適宜條件下使通式I表示的固相結(jié)合的有機(jī)綴合物與(II)[M(H2O)3(CO)3]n+接觸 其中球狀體為固相；C為可以被一個(gè)或兩個(gè)基團(tuán)R4和R5取代的亞甲基，R4和R5特別可以為脂族或芳族取代基；或RO、RS或R2N，其中R為脂族基或芳族基；L為可以存在或可以不存在的連接基，它與固體載體偶聯(lián)并具有激活對(duì)C基團(tuán)的親核攻擊的特性且優(yōu)選苯基、烷基、烯丙基或芳基；且R1和R2相同或不同且為金屬配位基團(tuán)或非配位的有機(jī)基團(tuán)；所述的固相結(jié)合的有機(jī)綴合物用生物活性分子任選在R1和R2之一或兩者上衍生；在(II)[M(H2O)3(CO)3]n+中，M選自锝(Tc)、錸(Re)、銠(Rh)、鉑(Pt)、銥(Ir)和銅(Cu)組成的組且n為1、2或3，這取決于所述金屬；所述的適宜條件為使[M(H2O)3(CO)3]n+與固相結(jié)合的有機(jī)綴合物的叔胺氮原子之間形成配價(jià)鍵，從而使如此形成的金屬配位劑從載體上釋放。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的連接基選自苯基、乙烯基、芳基和其它非脂族基和脂族基組成的組。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的苯基、乙烯基、芳基或其它非脂族基和脂族基被選自O(shè)R、R、NR2的吸電子基團(tuán)取代，其中R為脂族基或芳族基。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述的連接基如通式II所示 其中X1為C或O且X2為吸電子取代基且優(yōu)選-OCH3。
5.權(quán)利要求1的方法，其中R1和/或R2選自下列基團(tuán)組成的組 R3-NH2
6.權(quán)利要求1的方法，其中R1和R2為脂族或芳族取代基，諸如-CH3、CxH5或CH2C6H5。
7.權(quán)利要求1的方法，其中M選自Tc、Re、Ru、Rh、Ir、Cu和Pt組成的組。
8.如權(quán)利要求7中所述的方法，其中所述的金屬選自99mTc、186Re和188Re組成的組。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述的生物分子選自下列分子組成的組氨基酸；甾類化合物；肽類；蛋白質(zhì)，特別是結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、酶或抗體；碳水化合物；多糖類和寡糖類；核苷、核苷酸、寡核苷酸和多核苷酸；脂類、肽類；和藥物活性小分子，諸如中樞神經(jīng)系統(tǒng)受體結(jié)合化合物。
10.權(quán)利要求1的方法，其中固體載體為聚乙二醇樹脂或聚乙二醇與聚苯乙烯的雜化物，例如帶有聚乙二醇間隔基與芐醇結(jié)合基的聚苯乙烯樹脂。
11.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括收集金屬配位劑以便進(jìn)一步應(yīng)用的步驟。
12.權(quán)利要求1的方法，其中該方法在約6.0-11.0范圍、優(yōu)選在約7.5-9.5范圍的pH下進(jìn)行。
13.權(quán)利要求1的方法，其中該方法在約40-100℃范圍、優(yōu)選在約70-82℃范圍的溫度下進(jìn)行。
14.權(quán)利要求11的方法，進(jìn)一步包括將收集的金屬標(biāo)記的綴合物制成藥物上可接受的形式。
15.通式I表示的固相結(jié)合的有機(jī)綴合物 其中L、C、R1、R2、R4和R5如權(quán)利要求1中所定義。
16.權(quán)利要求15的固相結(jié)合有機(jī)分子，其特征在于所述的生物活性分子選自下列分子組成的組氨基酸；甾類化合物；肽類；蛋白質(zhì)，特別是結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、酶或抗體；碳水化合物；多糖類和寡糖類；核苷、核苷酸、寡核苷酸和多核苷酸；脂類、肽類；和藥物活性小分子，諸如中樞神經(jīng)系統(tǒng)受體結(jié)合化合物。
17.權(quán)利要求15的固相結(jié)合有機(jī)分子，其中固體載體為聚乙二醇樹脂或聚乙二醇與聚苯乙烯的雜化物，例如帶有聚乙二醇間隔基與芐醇結(jié)合基的聚苯乙烯樹脂。
18.如表1中所示的權(quán)利要求15的固相結(jié)合有機(jī)分子。
19.通過權(quán)利要求1所述方法獲得的金屬配位有機(jī)分子。
20.用于制備診斷或治療藥物組合物的試劑盒，包括含有通式(I)分子的容器，其中可以發(fā)生所述分子與[M(H2O)3(CO)3]n+溶液的反應(yīng)。
21.如權(quán)利要求20中所述的試劑盒，其中所述的容器為罐或柱。
22.如權(quán)利要求20中所述的試劑盒，進(jìn)一步包括[M(H2O)3(CO)3]n+溶液。
23.如權(quán)利要求20中所述的試劑盒，進(jìn)一步包括用于制備羰基金屬[M(H2O)3(CO)3]n+的試劑。
24.如權(quán)利要求20中所述的試劑盒，進(jìn)一步包括過濾用具。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)水溶性金屬配位劑的方法，包括在適宜條件下使通式I表示的固相結(jié)合的有機(jī)綴合物與[M(H
文檔編號(hào)C07F1/08GK1703249SQ03820789
公開日2005年11月30日 申請(qǐng)日期2003年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月3日
發(fā)明者羅杰·艾伯托, 斯蒂芬·芒德威勒 申請(qǐng)人:蘇黎世大學(xué)