專(zhuān)利名稱(chēng)：診斷心力衰竭的特異性抗體proBNP(1－108)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及室性心力衰竭的體外診斷領(lǐng)域。
充血性心力衰竭是一種常見(jiàn)的臨床綜合征，特別是在老年個(gè)體中。它通常表現(xiàn)為非特異性癥狀的潛伏觸發(fā)，如運(yùn)動(dòng)引起的咳嗽、疲勞和周?chē)[的出現(xiàn)。診斷通常是根據(jù)不同參數(shù)的研究，如臨床指征(分類(lèi)為4個(gè)階段NYHA(即紐約心臟協(xié)會(huì))的I-IV階段)、超聲心動(dòng)圖顯象、閃爍顯像、運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)等。
由于心臟病的嚴(yán)重性，以及高昂的治療費(fèi)用，顯然該綜合征的早期診斷是非常希望的這將有助于防止該綜合征快速發(fā)展為重度心力衰竭。因此，確定具有心力衰竭危險(xiǎn)的個(gè)體是必需的。這也能夠適應(yīng)更快速、更容易、更便宜的治療監(jiān)測(cè)。遺憾的是，還沒(méi)有完全滿意的并且能夠提供全部信息的診斷心力衰竭的方法。
預(yù)測(cè)心力衰竭的癥狀發(fā)生前標(biāo)志物已經(jīng)尋找了很長(zhǎng)時(shí)間。在這方面，心肌細(xì)胞產(chǎn)生并分泌具有促尿鈉排泄活性的肽的事實(shí)已經(jīng)得到證實(shí)一種心房來(lái)源的肽，ANP(心鈉素)，由Bold等人.Life Science 1981，vol.28(1)89-94在大鼠中發(fā)現(xiàn)，以及一種房室來(lái)源的促尿鈉排泄肽，被稱(chēng)為BNP(腦鈉素)，由Sudoh等人，Nature 1988，vol.33278-81在豬中發(fā)現(xiàn)，然后在人類(lèi)中發(fā)現(xiàn)。
BNP的前體是preproBNP(1-134)，它是該分子在心肌細(xì)胞中的一種貯存形式。該前體被切割后釋放信號(hào)肽和proBNP(1-108)。proBNP(1-108)由108個(gè)氨基酸的多肽組成，其序列為H1PLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPR76S77PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH108(SEQ ID No.1) 在分泌之前和/或分泌過(guò)程中，它在氨基酸Arg76與Ser77之間被切割，首先產(chǎn)生BNP，也被稱(chēng)為BNP(77-108)或BNP-32，或者BNP(1-32)，以及該激素原的N端部分，BNP(1-76)，也被稱(chēng)為proBNP的N端片段或NT-proBNP。
BNP或BNP(77-108)是該分子的一種血管反應(yīng)性形式，由32個(gè)氨基酸的肽組成，其序列為S77PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH108(SEQ ID No.2).
NT-proBNP或BNP(1-76)由proBNP(1-108)的76個(gè)N端氨基酸組成，構(gòu)成下列序列H1PLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPR76(SEQ ID No.3).
在顯示心室營(yíng)養(yǎng)不良的患者中，血液中激素BNP、BNP(77-108)的水平較高。而且也已經(jīng)描述了血漿中BNP(77-108)的測(cè)定，用它作為預(yù)測(cè)室性心力衰竭的一種標(biāo)志物。然而，眾所周知，激素BNP(77-108)相對(duì)不穩(wěn)定。因此，它的測(cè)定需要特別注意(Davidson，N.C.等人.Circulation 1995；911276)(Gobinet-Georges等人.Clin.Chem.Lab.Med.2000；38519-23)。另外，BNP的半衰期極短，其血漿濃度不是很高。因此，在具有心力衰竭危險(xiǎn)的個(gè)體中得到一定數(shù)量的假陰性結(jié)果。因此，對(duì)BNP(77-108)的測(cè)定不能準(zhǔn)確地區(qū)別處于NYHA分類(lèi)階段I的患者與正常個(gè)體(Clerico A.等人.J.Endocrinol.Invest.1998；21170-9)(Del Ry S.等人.Scand.J.Clin.Lab.Invest.2000；6081-90)。
為了避免這一困難，專(zhuān)利申請(qǐng)WO 93/24531描述了一種體外診斷心力衰竭的方法，該方法以BNP(1-76)(proBNP的N端片段)的檢測(cè)為基礎(chǔ)，BNP(1-76)是一種富含的化合物，其半衰期比BNP(77-108)激素更長(zhǎng)。然而，申請(qǐng)WO 93/24531描述的方法似乎不能簡(jiǎn)單地對(duì)血樣中的BNP(1-76)進(jìn)行。實(shí)際上，所述的實(shí)施例不能對(duì)真正的血清進(jìn)行，而是對(duì)利用合成肽BNP(47-64)——BNP(1-76)的子序列——獲得的標(biāo)準(zhǔn)范圍進(jìn)行。為了克服這一缺點(diǎn)，證明非常復(fù)雜的自動(dòng)化系統(tǒng)是必要的。
文章Hunt等人.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，vol.214(3)，1995，1175-1183描述了一種測(cè)定BNP的競(jìng)爭(zhēng)性RIA測(cè)定，該方法對(duì)心力衰竭患者的血漿進(jìn)行，涉及一種抗proBNP(1-13)N端片段的抗血清。該文章準(zhǔn)確地證實(shí)，在心力衰竭患者中，與BNP(77-108)水平有極佳相關(guān)性的BNP(1-76)水平大大高于對(duì)照個(gè)體中觀察到的水平。然而，描述的僅僅特異提取血漿BNP(1-76)的方案很復(fù)雜，因?yàn)樗枰肧ep-pak C18TM柱(Millipore-Waters)隨后通過(guò)HPLC層析提取血漿。而且，該文章強(qiáng)調(diào)，在這樣使用的RIA測(cè)定中，proBNP(1-108)似乎不被識(shí)別。這提示proBNP(1-108)能夠從心臟組織分泌到循環(huán)中，但是然后可能通過(guò)N端酸的切割被快速降解為較小的肽。此外，根據(jù)該文章所述，proBNP(1-108)也可能以抗proBNP(1-108)抗血清不能與之結(jié)合的方式存在。最后，他們也提出，BNP(1-76)(proBNP的N端片段)甚至可能是比BNP(77-108)或者比proANP的N端片段更特異的一種心臟功能障礙標(biāo)志物。
文章Karl等人.(Scand.J.Clin.Lab.Invest.1999；59(suppl230)177-181)描述了一種檢測(cè)BNP(1-76)的方法，該方法類(lèi)似于專(zhuān)利申請(qǐng)WO 93/24531，但是未提供對(duì)患者標(biāo)本獲得的任何結(jié)果。
文章Schulz等人.Scand.J.Clin.Lab.Invest.，2001，vol.61，pp.33-42也描述了一種BNP(1-76)(proBNP的N端片段)特異的放射免疫測(cè)定，該方法不需要提取，使用抗該片段的氨基酸1-21的抗血清。作者證實(shí)了BNP(1-76)測(cè)定在診斷室性心力衰竭中的優(yōu)點(diǎn)，以及它與BNP(77-108)測(cè)定的良好相關(guān)性。在proBNP(1-108)的多種循環(huán)形式的研究中，他們提出了如下假說(shuō)proBNP(1-108)將以完整激素原的形式和切割產(chǎn)物BNP(1-76)(proBNP的N端片段)和BNP(77-108)的形式在血液中循環(huán)。然而，該文章未提及或者建議proBNP(1-108)的任何可能的生理活性，或者proBNP(1-108)作為室性心力衰竭的預(yù)測(cè)或診斷標(biāo)志物的任何診斷價(jià)值。
文章Shimizu等人.Clinica Chimica Acta，2002，vol.316，pp.129-135描述了對(duì)血液中人BNP的降解和心力衰竭患者血漿中免疫反應(yīng)性BNP的循環(huán)分子形式的一項(xiàng)研究。在后者的血漿中發(fā)現(xiàn)存在兩種免疫反應(yīng)性BNP形式一種高分子量BNP(36KD，可能對(duì)應(yīng)于proBNP(1-108)的三聚體)，和一種低分子量BNP。后者對(duì)應(yīng)于同時(shí)存在BNP-32的一種形式的降解產(chǎn)物，其丟失了BNP-32的激素形式的N端絲氨酸和脯氨酸(即脫-SerPro-BNP(BNP3-32))(在此被稱(chēng)為BNP(1-32))。因此心臟分泌proBNP(1-108)和激素BNP(BNP-32、BNP(1-32)或BNP(77-108))到血液中。然而，作者似乎提出，寡聚形式(三聚體)的proBNP(1-108)以類(lèi)似于循環(huán)BNP(77-108)的濃度存在，但是他們沒(méi)有進(jìn)行測(cè)定。因此沒(méi)有研究proBNP(1-108)濃度與患者的臨床狀況之間的關(guān)系。同時(shí)其中也沒(méi)有證明血清proBNP(1-108)的診斷或預(yù)后價(jià)值；也沒(méi)有提出能夠常規(guī)測(cè)定后者。
而且，已經(jīng)知道proBNP(1-108)上存在一定數(shù)量的表位。因此，在BNP(77-108)的檢測(cè)中，對(duì)應(yīng)于BNP(77-108)的10個(gè)N端氨基酸(AA1-10)的序列S77PKMVQGSGC86(SEQ ID No.105)的表位在申請(qǐng)WO97/32900中描述。類(lèi)似地，在BNP(1-76)(proBNP的N端片段)的檢測(cè)中，對(duì)應(yīng)于BNP(1-76)(proBNP的N端片段)的12個(gè)C端氨基酸的序列R65KMVLYTLRAPR76(SEQ ID No.106)的表位在申請(qǐng)WO 00/35951中描述，一個(gè)類(lèi)似的序列H64RKMVLYTLRAPR76(SEQ ID No.107)在申請(qǐng)WO 00/45176中描述。然而，這些專(zhuān)利申請(qǐng)均未描述或者提出存在一種表位，它是這些序列的一種中間物或雜合物。
因此，在心力衰竭的早期診斷方面仍然需要一種能夠避免現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)的方法。具體而言，需要一種簡(jiǎn)單的方法，它能夠常規(guī)使用并且可靠，能夠避免檢測(cè)BNP(77-108)的缺點(diǎn)，因?yàn)锽NP(77-108)是一種不是非常富含并且相對(duì)不穩(wěn)定的分子，而同時(shí)可避免復(fù)雜的提取，復(fù)雜的提取是測(cè)定BNP的其它分子形式所致的，可能需要復(fù)雜的自動(dòng)化才能進(jìn)行。
因此，本發(fā)明的作者努力發(fā)展了一種備選方法來(lái)解決提出的問(wèn)題。本發(fā)明的中心是發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，在proBNP(1-108)的鉸鏈序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85(SEQ ID No.4)或序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84(SEQ ID No.108)的結(jié)構(gòu)域中存在一種具有獨(dú)特性質(zhì)的表位，并且至少含有序列RAPR76S77P(SEQ ID No.5)。
實(shí)際上，當(dāng)用序列為CY70TLRAPR76S77PKMVQGSG85(SEQ ID No.16)的proBNP(1-108)鉸鏈區(qū)的肽免疫兔子，或者用序列為CY70TLRAPR76S77PKMVQGS84(SEQ ID No.109)的肽免疫兔子時(shí)，他們驚訝地發(fā)現(xiàn)，獲得的抗血清不僅含有特異地識(shí)別該鉸鏈區(qū)的肽而基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)形式的抗體，而且還具有識(shí)別循環(huán)proBNP(1-108)的能力。
本申請(qǐng)的作者也第一次證實(shí)，循環(huán)proBNP(1-108)是預(yù)測(cè)心力衰竭的一種有效的標(biāo)志物，它在心力衰竭患者中的濃度顯著高于正常對(duì)照個(gè)體。
作者也發(fā)現(xiàn)，獲得這類(lèi)抗體的另外一種方法是用完整的proBNP(1-108)分子免疫動(dòng)物。實(shí)際上，作者發(fā)現(xiàn)，用完整的proBNP(1-108)分子免疫能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生可特異地識(shí)別鉸鏈區(qū)的序列的抗體。
另外，本發(fā)明的作者也證明，可被根據(jù)本發(fā)明的抗體識(shí)別的最小表位含有下列序列RAPR76S77P。他們也證明，獲得作為本發(fā)明的主題的抗體的一種成功方法是用下列通式的一種肽免疫動(dòng)物a1-X1-RAPRSP-X2-a2(I)其中，a1可以是H，或者可以代表如下官能團(tuán)或化學(xué)基團(tuán)，其選自硫醇、醇、氨氧基、伯胺或仲胺官能團(tuán)、氨基羧基、生物素基和乙?；?，X1代表一種0-3個(gè)氨基酸的肽序列，它可能來(lái)源于或者可能不來(lái)源于proBNP(1-108)的天然序列，X2代表一種0-8個(gè)氨基酸的肽序列，優(yōu)選地7個(gè)氨基酸的肽序列，它可能來(lái)源于或者可能不來(lái)源于proBNP(1-108)的天然序列，a2可以代表OH基、NH2基或烷氧基。
類(lèi)似地，本發(fā)明的作者證明，用含有序列RAPR76S77P的肽或者用下列通式的肽免疫動(dòng)物能夠獲得相同的特異性抗體X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)其中X可以是H，或者可以代表乙酰基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸。
另外，本發(fā)明的作者也證明，用下列通式的肽免疫動(dòng)物能夠獲得相同的特異性抗體X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III)其中X可以是H，或者可以代表乙?；?，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的作者也發(fā)展了一種簡(jiǎn)單、可靠的早期診斷心力衰竭的方法，該方法以血液中循環(huán)proBNP(1-108)的檢測(cè)為基礎(chǔ)，并且研制了一種進(jìn)行這種循環(huán)proBNP(1-108)檢測(cè)的試劑盒。
因此本發(fā)明的一個(gè)主題是一種抗proBNP(1-108)抗體，其特征在于首先，它特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85，并且基本上不識(shí)別BNP(1-76)或BNP(77-108)，其次，它能夠特異地識(shí)別人血清或血漿標(biāo)本中的循環(huán)proBNP(1-108)。
本發(fā)明的一個(gè)主題也是一種抗-proBNP(1-108)抗體，其特征在于首先，它特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84，并且基本上不識(shí)別BNP(1-76)或BNP(77-108)，其次，它能夠特異地識(shí)別人血清或血漿標(biāo)本中的循環(huán)proBNP(1-108)。
具體而言，本發(fā)明的一個(gè)主題是一種抗-proBNP(1-108)抗體，其特征在于首先，它特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列RAPR76S77P，并且基本上不識(shí)別BNP(1-76)或BNP(77-108)，其次，它能夠特異地識(shí)別人血清或血漿標(biāo)本中的循環(huán)proBNP(1-108)。
本發(fā)明的一個(gè)主題也是一種獲得抗-proBNP(1-108)抗體的方法，這些抗體特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能夠特異地識(shí)別人血清或血漿標(biāo)本中的循環(huán)proBNP(1-108)，該方法的特征在于用完整的proBNP(1-108)分子免疫動(dòng)物，然后用BNP(77-108)肽和/或BNP(1-76)肽消耗所獲得的抗血清。
表述獲得的針對(duì)特定抗原(免疫抗原)的“抗血清的消耗”是指除去該抗血清中可能存在的非特異性抗體，方法包括使該抗血清與“非特異性抗原”，即與免疫抗原不同的抗原接觸并溫育，然后免疫學(xué)分離并除去可與該“非特異性抗原”反應(yīng)的抗體，回收這樣消耗的(即消耗非特異性抗體的)抗血清。消耗通常用來(lái)使針對(duì)指定抗原的抗血清具有特異性。
在這種情況下，識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85和/或序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84或序列RAPR76S77P的抗血清能夠被消耗，即通過(guò)將其與上述BNP(77-108)和/或BNP(1-76)接觸使之具有特異性，例如，對(duì)于后者能夠固定在一個(gè)固相中，并且按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)通過(guò)免疫吸附作為層析的支持體。在此，消耗的抗血清中最后存在的抗體是一種單特異性多克隆抗體。
本發(fā)明的一個(gè)主題也是下列通式的一種肽a1-X1-RAPRSP-X2-a2(I)其中a1可以是H，或者可以代表如下官能團(tuán)或化學(xué)基團(tuán)，其選自硫醇、醇、氨氧基、伯胺或仲胺官能團(tuán)、氨基羧基、生物素基和乙?；?，X1代表一種0-3個(gè)氨基酸的肽序列，其可能來(lái)源于或者可能不來(lái)源于proBNP(1-108)的天然序列，X2代表一種0-8個(gè)氨基酸的肽序列，優(yōu)選地7個(gè)氨基酸的肽序列，其可能來(lái)源于或者可能不來(lái)源于proBNP(1-108)的天然序列，a2可以代表OH基、NH2基或烷氧基。
本發(fā)明的一個(gè)主題也是下列通式的一種肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)其中X可以是H，或者可以代表乙酰基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的一個(gè)主題也是下列通式的一種肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III)其中X可以是H，或者可以代表乙?；?，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸。
應(yīng)當(dāng)指出，在上述通式(II)和(III)中，氨基酸編號(hào)(Y70、R76、S77、S84或G85)只是用來(lái)幫助理解本發(fā)明，以及確定該序列相對(duì)于proBNP(1-108)序列的位置。對(duì)于本申請(qǐng)中給出編號(hào)的其它序列同樣如此。
本發(fā)明也涉及含有下列序列的任何肽序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)，或者序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)，或者分別在氨基酸位點(diǎn)70-85或84之一處保守或非保守置換的上述序列(II)或(III)之一，只要使RAPR76S77P部分保持完整(特別是未置換)。
因此是指一種肽，其含有通過(guò)氨基酸Y70、T71、L72、K79、M80、V81、Q82、G83、S84和G85中的一個(gè)或多個(gè)的置換，衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)或者衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)的一種序列，X可以缺失或者代表NH2基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸，Z可以缺失，或者代表OH基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸。
最后，本發(fā)明涉及序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85的肽，以及序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84的肽。
本發(fā)明的一個(gè)主題也是一種獲得抗-proBNP(1-108)抗體的方法，該抗體特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)的序列，并且能夠特異地識(shí)別人血清或血漿標(biāo)本中的循環(huán)proBNP(1-108)，該方法的特征在于用下列通式的肽免疫動(dòng)物a1-X1-RAPRSP-X2-a2(I)其中，a1、X1、X2和a2的含義與上述相同，任選地，用BNP(77-108)肽和/或BNP(1-76)肽消耗所獲得的抗血清。這樣獲得的抗體是一種單特異性抗體。
本發(fā)明的主題也是一種獲得抗-proBNP(1-108)抗體的方法，該抗體特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能夠特異地識(shí)別人血清或血漿標(biāo)本中的循環(huán)proBNP(1-108)，該方法的特征在于用通式X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)的肽或者用通式X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)的肽免疫動(dòng)物，其中X和Z如上所述定義，任選地，用BNP(77-108)肽和/或BNP(1-76)肽消耗所獲得的抗血清。
本發(fā)明的一個(gè)主題也是獲得一種雜交瘤的一種方法，該雜交瘤分泌抗-proBNP(1-108)抗體，該抗體特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能夠特異地識(shí)別人血清或血漿標(biāo)本中的循環(huán)proBNP(1-108)，該方法的特征在于用通式X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)的肽或者用通式X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)的肽免疫動(dòng)物，所述肽是保守或非保守置換的形式，只要使得RAPR76S77P部分保持完整(特別是未置換)，其中X和Z如上所述定義，任選地，用BNP(77-108)肽和/或BNP(1-76)肽消耗所獲得的抗血清。
本發(fā)明的主題也是一種獲得抗-proBNP(1-108)抗體的方法，該抗體特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能夠特異地識(shí)別人血清或血漿標(biāo)本中的循環(huán)proBNP(1-108)，該方法的特征在于用序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85的肽或者用序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84的肽免疫一種動(dòng)物，任選地，用BNP(77-108)肽和/或BNP(1-76)肽消耗所獲得的抗血清。
本發(fā)明的一個(gè)主題也是獲得一種雜交瘤的方法，該雜交瘤分泌抗-proBNP(1-108)抗體，該抗體特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能夠特異地識(shí)別人血清或血漿標(biāo)本中的循環(huán)proBNP(1-108)，該方法的特征在于-用如下肽免疫動(dòng)物，所述肽選自下列通式的肽a1-X1-RAPRSP-X2-a2(I)其中，a1、X1、X2和a2的含義與上述相同，X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II)其中X和Z的含義與上述相同，X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III)其中X和Z的含義與上述相同，X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II)其為保守或非保守置換的形式，只要使RAPR76S77P部分保持完整(特別是未置換)，其中X和Z的含義與上述相同，X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III)其為保守或非保守置換的形式，只要使RAPR76S77P部分保持完整(特別是未置換)，其中X和Z的含義與上述相同，Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85和Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84；-從該動(dòng)物中提取分泌免疫球蛋白的淋巴細(xì)胞，并且-使該淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得至少一種分泌免疫球蛋白的雜交瘤。
這相當(dāng)于獲得雜交瘤的常規(guī)技術(shù)，其原理在Khler和Milstein，(1975)Nature(London)，256495-497中描述。
本發(fā)明的一個(gè)主題也是這樣一種雜交瘤和該雜交瘤分泌的抗-proBNP(1-108)單克隆抗體。
本發(fā)明的一個(gè)主題也是人類(lèi)心力衰竭的一種體外診斷方法，包括使生物標(biāo)本，優(yōu)選地血液、血漿或血清，與一種抗-proBNP(1-108)抗體接觸，該抗體特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能夠特異地識(shí)別人血清或血漿標(biāo)本中的循環(huán)proBNP(1-108)，以及檢測(cè)標(biāo)本中的proBNP(1-108)。
本發(fā)明通常提供人類(lèi)心力衰竭的一種體外診斷方法，包括a)使生物標(biāo)本，優(yōu)選地血液、血漿或血清，與一種抗-proBNP(1-108)抗體接觸，該抗體特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能夠特異地識(shí)別人血清或血漿標(biāo)本中的循環(huán)proBNP(1-108)，b)在允許形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下溫育該混合物，和c)任選地使用能夠與初級(jí)(primary)復(fù)合物中存在的proBNP(1-108)特異結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的檢測(cè)抗體，或者使用能夠與針對(duì)初級(jí)復(fù)合物中存在的proBNP(1-108)的抗體結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的檢測(cè)抗原，顯示形成的抗原-抗體復(fù)合物。
具體而言，本發(fā)明提供一種診斷心力衰竭的方法，除了上述步驟a、b、c之外，還包括步驟d)將顯示的抗原-抗體復(fù)合物的量與個(gè)體的臨床狀況相關(guān)聯(lián)。
本發(fā)明的一個(gè)主題也是一種試劑盒，其用于檢測(cè)生物標(biāo)本，特別是血液、血漿或血清標(biāo)本中的proBNP(1-108)，該試劑盒含有至少一種抗-proBNP(1-108)抗體，該抗體特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能夠特異地識(shí)別人血清或血漿標(biāo)本中的循環(huán)proBNP(1-108)。
最后，本發(fā)明涉及一種試劑盒，其用于檢測(cè)生物標(biāo)本，特別是血液、血漿或血清標(biāo)本中的proBNP(1-108)，該試劑盒含有一種化合物作為標(biāo)準(zhǔn)和/或?qū)φ?，該化合物含有至少一種肽，該肽選自下列通式的肽a1-X1-RAPRSP-X2-a2(I)其中，a1、X1、X2和a2的含義與上述相同，X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II)其中X和Z的含義與上述相同，X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II)其為保守或非保守置換的形式，只要使RAPR76S77P部分保持完整(特別是未置換)，其中X和Z的含義與上述相同，X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III)其中X和Z的含義與上述相同，X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III)其為保守或非保守置換的形式，只要使RAPR76S77P部分保持完整(特別是未置換)，其中X和Z的含義與上述相同，Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85，Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84。
定義在本發(fā)明上下文中，“生物標(biāo)本”或者“生物液體標(biāo)本”優(yōu)選地包括生物液體，如血液、血漿、血清、尿、腦脊液、唾液等。
術(shù)語(yǔ)“心力衰竭”是指病理狀態(tài)，其中心臟功能異常致使心臟不能充分地泵送血液，以滿足生物的代謝需要，和/或心臟滿足這種需要，但是充盈壓特別高。具體而言，這可能是右心室和/或左心室衰竭。
術(shù)語(yǔ)“抗體”是指任何完整的抗體或一種抗體的功能片段(可能通過(guò)或者可能不通過(guò)遺傳工程獲得)，其含有或者由至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)組成，使得該抗體能夠與抗原化合物的至少一個(gè)抗原決定簇結(jié)合。作為抗體片段的例子，可能提到Fab、Fab′和F(ab′)2片段以及單鏈可變片段(scFv鏈)。
根據(jù)本發(fā)明的抗-proBNP(1-108)抗體可以是多克隆或單克隆類(lèi)型。根據(jù)本發(fā)明的一種多克隆抗-proBNP(1-108)抗體尤其可以如下獲得用完整的proBNP(1-108)免疫一種動(dòng)物，如兔、小鼠等，分離獲得的抗血清，然后利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，例如用含有BNP(77-108)和/或BNP(1-76)的免疫吸附劑對(duì)其進(jìn)行消耗。根據(jù)本發(fā)明的一種單克隆抗-proBNP(1-108)抗體尤其可以用Khler和Milstein(Nature(London)，256495-497(1975))的常規(guī)方法獲得。
在本發(fā)明中有用的單克隆抗體或單特異性多克隆血清，或者通過(guò)篩查基因組文庫(kù)獲得的抗體，利用下文詳細(xì)描述的常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生。
術(shù)語(yǔ)“捕獲抗體”是指一種抗體或一種抗體的一部分，其優(yōu)選地附著于固相上，通過(guò)親和結(jié)合能夠保留生物標(biāo)本中的proBNP(1-108)抗原。
生物標(biāo)本中抗原的存在通過(guò)“檢測(cè)工具(單元)”顯示。關(guān)于抗原的檢測(cè)，本發(fā)明具體涉及使用至少一種“檢測(cè)抗體”的檢測(cè)。通過(guò)識(shí)別與捕獲抗體所識(shí)別的位點(diǎn)不同的表位位點(diǎn)，標(biāo)記的這種檢測(cè)抗體能夠通過(guò)親和結(jié)合與捕獲的抗原結(jié)合。
術(shù)語(yǔ)“經(jīng)標(biāo)記的”是指直接標(biāo)記(利用酶、放射性同位素、熒光染料、發(fā)光化合物等)和間接標(biāo)記(例如利用直接標(biāo)記的抗體或者使用標(biāo)記的“親和對(duì)”的試劑，例如，但是不排除標(biāo)記的抗生物素蛋白-生物素對(duì)，等等)。
術(shù)語(yǔ)“抗原片段”是指proBNP(1-108)的任一部分，其能夠在免疫的動(dòng)物中誘導(dǎo)合成僅對(duì)proBNP(1-108)特異的抗體。
根據(jù)本發(fā)明，一個(gè)“抗原片段”至少含有“表位位點(diǎn)”或表位RAPR76S77P?！氨砦晃稽c(diǎn)”或“表位”是一種氨基酸序列，它能夠被至少一種抗體識(shí)別，并且允許其特異結(jié)合。
術(shù)語(yǔ)“單特異性多克隆抗體”是指具有單表位特異性的任何多克隆抗體。是指一種抗體，它能夠結(jié)合序列proBNP(1-108)的含有含表位的氨基酸的氨基酸序列，但是不能結(jié)合序列proBNP(1-108)的不合含表位的氨基酸的氨基酸序列。
當(dāng)指抗體對(duì)抗原的識(shí)別或特異性結(jié)合時(shí)，術(shù)語(yǔ)“特異地”是指該抗體與該抗原相互作用，而基本上不與其它抗原相互作用，或者如果指與一種表位的“特異性”識(shí)別，實(shí)際上只識(shí)別該表位。締合常數(shù)大于108L·mol-1是優(yōu)選的。
術(shù)語(yǔ)“保守置換”具體地是指一類(lèi)氨基酸被同一類(lèi)氨基酸置換，相對(duì)于來(lái)源肽，這種置換不會(huì)顯著改變獲得的肽的免疫反應(yīng)性。在多個(gè)氨基酸類(lèi)別中，含有一個(gè)極性側(cè)鏈的氨基酸(如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸)，含有一個(gè)非極性側(cè)鏈的氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸)，含有一個(gè)堿性側(cè)鏈的氨基酸(如賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸)，和含有一個(gè)酸性側(cè)鏈的氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)通?？梢詤^(qū)別。
術(shù)語(yǔ)“非保守置換”是指其它任何類(lèi)型的置換，相對(duì)于來(lái)源肽，它不會(huì)顯著改變獲得的肽的免疫反應(yīng)性。
表述“基本上不識(shí)別BNP(1-76)或BNP(77-108)”是指本發(fā)明所述的抗體顯示與BNP(1-76)或BNP(77-108)有不到20％，特別是不到10％，優(yōu)選地不到5％的交叉反應(yīng)。百分交叉反應(yīng)按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法測(cè)定，如實(shí)施例5所述。
“基本上”不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)肽優(yōu)選地對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的抗體與這些肽的反應(yīng)的缺乏，或者實(shí)際上的缺乏。
表述“基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)”是指抗體“基本上不識(shí)別BNP(1-76)或BNP(77-108)”，含義如上。
特異性抗體的產(chǎn)生本發(fā)明使用的抗體是抗原特異性抗體，因此，是單克隆抗體或單特異性多克隆抗體，即它們只特異地識(shí)別一種表位。
單克隆抗體能夠利用Khler和Milstein，Nature，1975，256495-497所述的常規(guī)淋巴細(xì)胞融合和雜交瘤培養(yǎng)方法獲得。制備單克隆抗體的其它方法也已知(Harlow等人編著，1988《抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》)。單克隆抗體能夠如下制備免疫一種哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、兔或人等)，利用淋巴細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生雜交瘤(Khler和Milstein，1975)。
這種常用技術(shù)具有備選技術(shù)。例如，通過(guò)表達(dá)從一種雜交瘤中克隆的核酸，能夠產(chǎn)生單克隆抗體。通過(guò)噬菌體展示技術(shù)，通過(guò)將抗體cDNA導(dǎo)入載體中，也能夠產(chǎn)生抗體，這種載體一般是絲狀噬菌體，它在噬菌體表面呈現(xiàn)V基因文庫(kù)(例如，對(duì)于大腸桿菌為fUSE5，J.K.Scott和G.P.Smith，Science，1990，249386-390)。Marks等人，1991，J.Mol.Biol，222581-597描述了構(gòu)建這些抗體文庫(kù)的方案。
按照常用的程序，用一種性質(zhì)為肽的抗原免疫動(dòng)物，能夠從該動(dòng)物的血清中獲得多克隆抗體。如果需要，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)，例如柱免疫吸附，通過(guò)用BNP(77-108)和BNP(1-76)消耗，使這樣獲得的多克隆抗體對(duì)序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、對(duì)序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或?qū)行蛄蠷APR76S77P的肽具有單特異性，從而確保對(duì)于proBNP(1-108)的特異性，基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)。
捕獲和/或檢測(cè)抗體在夾心技術(shù)中，選擇捕獲抗體，使其特異地識(shí)別患者自然抗原上的一種表位，而且選擇檢測(cè)抗體，優(yōu)選地但不是必要地，使其特異地識(shí)別患者自然抗原上的另外一種表位。
生物標(biāo)本能夠任選地在前一個(gè)步驟中處理，或者在促使待檢測(cè)表位暴露的條件下，直接將其與至少一種捕獲抗體置于一起。
根據(jù)本發(fā)明的診斷方法能夠按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種形式進(jìn)行在固相或均相中；一步或者兩步；以?shī)A心法或者競(jìng)爭(zhēng)法，作為非限制性實(shí)例。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，捕獲抗體固定于一個(gè)固相上。作為固相的非限制性實(shí)例，可以使用微孔板，特別是聚苯乙烯微孔板，如丹麥Nunc公司所售。也可以使用固體顆粒或珠、磁珠，如Dynal或Merck-Eurolab(法國(guó))提供的(商標(biāo)為EstaporTM)，或者聚苯乙烯或丙烯試管，等等。
一種免疫測(cè)定形式，如兩種抗體(捕獲和檢測(cè)抗體)的夾心法，特別有利于檢測(cè)生物標(biāo)本中存在的抗原。
通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)抗原的一種免疫測(cè)定形式也是可用的。另外一些免疫測(cè)定模式也能夠涉及，且本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。
ELISA測(cè)定、放射免疫測(cè)定或其它任何檢測(cè)技術(shù)都能夠用來(lái)顯示形成的抗原-抗體復(fù)合物的存在。
試劑盒用來(lái)根據(jù)本發(fā)明的方法檢測(cè)生物液體標(biāo)本中的proBNP(1-108)的試劑盒和試劑，能夠用來(lái)實(shí)施本發(fā)明，它容易進(jìn)行且適用于多種生物標(biāo)本。
用于檢測(cè)生物標(biāo)本中的proBNP(1-108)的試劑盒能夠含有至少一種如上所述定義的抗體。含有至少一種通式(I)或(II)的肽或如上所述定義的一種置換肽作為標(biāo)準(zhǔn)和/或?qū)φ盏牧硗庖恍┰噭┖幸部梢杂脕?lái)實(shí)施本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的另外一個(gè)具體主題是一種檢測(cè)生物液體標(biāo)本中的proBNP(1-108)的試劑盒，其含有-至少一種抗-proBNP(1-108)抗體，其特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能夠特異地識(shí)別人血清或血漿標(biāo)本中的循環(huán)proBNP(1-108)，優(yōu)選地是一種用于捕獲該生物標(biāo)本中存在的proBNP(1-108)的抗體，和-一種經(jīng)標(biāo)記的偶聯(lián)物，它能夠與形成的抗原-抗體復(fù)合物特異結(jié)合。
如上所述，捕獲抗體有利地可以是固定在一個(gè)固相(例如，但不只是，微孔板)上的形式。
一種優(yōu)選的試劑盒至少含有-一種抗-proBNP(1-108)捕獲抗體，其特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)，并且能夠特異地識(shí)別人血清或血漿標(biāo)本中的循環(huán)proBNP(1-108)，該捕獲抗體固定于一個(gè)固相上；和-一種經(jīng)標(biāo)記的檢測(cè)抗體，它針對(duì)proBNP(1-108)的另外一種完整的表位，或者任選地，-一種經(jīng)標(biāo)記的檢測(cè)抗原，它是proBNP(1-108)的一種肽或者是proBNP(1-108)本身。
根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方案，用于檢測(cè)生物標(biāo)本中的proBNP(1-108)的一種試劑盒可以-在一個(gè)容器中含有至少一種如上所述定義的抗體；-在另外一個(gè)容器中含有至少一種如上所述定義的肽，該肽具體可以用作標(biāo)準(zhǔn)和/或?qū)φ铡?br> 下列附圖和實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，而非限制其范圍。
圖例

圖1顯示用蛋白A-sepharose純化的來(lái)自兔#046 805的多克隆抗體與吸附于微孔板上的0.25μg/ml proBNP(1-108)、BNP(1-76)片段、BNP(77-108)或GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，用作對(duì)照蛋白質(zhì))的反應(yīng)性。
圖2顯示在BNP-K3-NHS-sepharose樹(shù)脂上消耗后獲得的，兔#046805的濾過(guò)物的多克隆抗體的反應(yīng)性。這些多克隆抗體以2-20μg/ml的稀釋范圍制備，然后在包被吸附的0.25μg/ml proBNP(1-108)、BNP(1-76)或BNP(77-108)多肽的孔(cupule)上檢測(cè)。
圖3顯示在BNP-K3-NHS-sepharose樹(shù)脂上消耗后獲得的，兔#046832的濾過(guò)物的多克隆抗體的反應(yīng)性。這些多克隆抗體以5-20μg/ml的稀釋范圍制備，然后在包被了吸附的0.25μg/ml proBNP(1-108)、BNP(1-76)或BNP(77-108)多肽的孔上檢測(cè)。
圖4顯示在BNP-K3-NHS-sepharose樹(shù)脂上消耗后獲得的，兔#046805的多克隆血清的洗脫物的反應(yīng)性。這些該多克隆抗體以2-20μg/ml的稀釋范圍制備，然后在包被吸附的0.25μg/ml proBNP(1-108)、BNP(1-76)或BNP(77-108)多肽的孔上檢測(cè)。
圖5顯示在BNP-K3-NHS-sepharose樹(shù)脂上消耗后獲得的，兔#046832的多克隆血清的洗脫物的反應(yīng)性。這些多克隆抗體以5-20μg/ml的稀釋范圍制備，然后在包被吸附的0.25μg/ml proBNP(1-108)、BNP(1-76)或BNP(77-108)多肽的孔上檢測(cè)。
圖6顯示利用斑點(diǎn)技術(shù)，對(duì)來(lái)自兔#046 805的消耗之前的多克隆血清的表位分析(對(duì)于該實(shí)施例，背景噪音為30.4±5.93相對(duì)強(qiáng)度單位)。
圖7顯示利用斑點(diǎn)技術(shù)，對(duì)來(lái)自兔#046 805的在BNP-K3-NHS-sepharose樹(shù)脂上消耗之后的多克隆血清的表位分析(對(duì)于該實(shí)施例，背景噪音為31.3±6.31相對(duì)強(qiáng)度單位)。
圖8顯示稀釋為1/2的雜交瘤3D4的培養(yǎng)上清液的反應(yīng)性，在包被吸附的1μg/ml proBNP(1-108)或BNP(1-76)或BNP(77-108)或肽YTLRAPRSPKMVQGSG(C13P30)的孔上檢測(cè)。
圖9顯示16％丙烯酰胺凝膠的一張照片，其中每種蛋白質(zhì)都遷移(每道1μg蛋白質(zhì))。1道分子量標(biāo)準(zhǔn)；2道proBNP(1-108)-GST；3道GST(陰性對(duì)照蛋白質(zhì))；4道BNP(1-76)-GST；5道BNP(77-108)。
圖10顯示使用3D4雜交瘤產(chǎn)生的抗體對(duì)下列樣品進(jìn)行的Western印跡測(cè)定的結(jié)果proBNP(1-108)-GST(2道)、GST(陰性對(duì)照蛋白質(zhì))(3道)、BNP(1-76)-GST(4道)、BNP(77-108)(5道)，它們加樣到凝膠上(每塊凝膠1μg蛋白質(zhì))，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。
圖11顯示用于proBNP(1-108)IRMA測(cè)定的一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖12顯示對(duì)標(biāo)本中的proBNP(1-108)進(jìn)行的IRMA測(cè)定的結(jié)果，單位為cpm(每分鐘的放射性計(jì)數(shù))，標(biāo)本來(lái)自14名正常個(gè)體和15名心力衰竭患者。
圖13給出了利用根據(jù)本發(fā)明的免疫放射測(cè)定法測(cè)定的proBNP(1-108)濃度(pg/ml)與利用Elecsys自動(dòng)裝置(Hoffmann LaRoche公司的商標(biāo))測(cè)定的BNP(1-76)濃度(pg/ml)之間的相關(guān)性，標(biāo)本來(lái)自14名心力衰竭患者。
圖14顯示根據(jù)本發(fā)明的proBNP(1-108)ELISA測(cè)定的一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖15顯示兔#046 805的多克隆抗體對(duì)于BNP(1-76)和BNP(77-108)的交叉反應(yīng)的評(píng)價(jià)，該抗體未經(jīng)消耗，與生物素偶聯(lián)，在proBNP(1-108)ELISA測(cè)定中與抗BNP(77-108)多克隆抗體一起夾心使用。
圖16顯示來(lái)自兔#046 805的多克隆抗體對(duì)于BNP(1-76)和BNP(77-108)的交叉反應(yīng)的評(píng)價(jià)，該抗體未經(jīng)消耗，與生物素偶聯(lián)，在proBNP(1-108)ELISA測(cè)定中與抗-NT-proBNP(1-29)多克隆抗體一起夾心使用。
實(shí)施例實(shí)施例1用于免疫的肽的合成合成的肽通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生產(chǎn)。例如，可以提到Merrifield類(lèi)型的合成，該方法易于進(jìn)行，因此是有利的(Merrifield，(1963)；R.C.Sheppard(1971)；Atherton等人.(1989))。自動(dòng)化合成儀可以使用Millipore″9050 Plus Pep Synthesizer″、″Pioneer″合成儀或ABI″433A″合成儀。這些肽也能夠通過(guò)均相合成法獲得。
下文中的合成使用“Fmoc”(9-芴基甲氧基羰基)化學(xué)在Pioneer合成儀上進(jìn)行每一步都過(guò)量加入試劑(即被保護(hù)的氨基酸和偶聯(lián)激活劑(TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-脲 四氟硼酸)/HOBt(N-羥基苯并三唑))(“樹(shù)脂上試劑摩爾數(shù)可取代基摩爾數(shù)”之比＝5)。在合成結(jié)束時(shí)，利用基于三氟乙酸的溶液(試劑K)從樹(shù)脂上分離肽。然后在冷卻的醚溶液中沉淀該肽，然后通過(guò)HPLC純化。
本發(fā)明人合成了下列含有鉸鏈區(qū)氨基酸序列R76S77的肽SEQ ID No.6 C-G-R-A-P-R-S-PSEQ ID No.7 乙酰基-C-G-R-A-P-R-S-PSEQ ID No.8 C-G-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No.9 乙?；?C-G-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No.10C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-VSEQ ID No.11C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-GSEQ ID No.12R-A-P-R-S-P-G-CSEQ ID No.13乙酰基-R-A-P-R-S-P-G-CSEQ ID No.14乙?；?C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No.15C-H-R-K-M-V-L-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No.16C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G
(肽C13P30)SEQ ID No.17C-F-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-GSEQ ID No.18C-F-S-I-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-GSEQ ID No.19C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-βASEQ ID No.20C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-A-T-βASEQ ID No.21C-F-S-I-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-A-T-βASEQ ID No.22C-F-S-I-R-A-P-R-S-P-A-L-A-S-G-T-A以及SEQ ID No.109C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S(肽CN32)SEQ ID No.110C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No.111C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-VSEQ ID No.112C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-QSEQ ID No.113C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-GSEQ ID No.114乙酰基-C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-QSEQ ID No.115C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-GSEQ ID No.116C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-SSEQ ID No.117C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-GSEQ ID No.118C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-VSEQ ID No.119C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-QSEQ ID No.120L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-CSEQ ID No.121C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-SSEQ ID No.122C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-GNBβA表示β-丙氨酸。
因此本發(fā)明的主題也包括選自上述序列的任何一種肽。
實(shí)施例2用于免疫的肽與載體蛋白的偶聯(lián)肽與一種載體蛋白KLH(匙孔 血藍(lán)蛋白)、甲狀腺球蛋白、BSA(牛血清白蛋白)通過(guò)不同的官能團(tuán)(硫醇、胺、醛等)偶聯(lián)，以使該肽更具免疫原性。用于鍵合肽與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)劑可以是異雙功能劑或同雙功能劑。最常用的試劑是BS3、sSMCC、SPDP、戊二醛等。采用的偶聯(lián)技術(shù)之一是利用戊二醛作為化學(xué)偶聯(lián)劑，利用KLH作為載體蛋白。KLH與肽的偶聯(lián)利用肽的胺官能團(tuán)(主要由賴(lài)氨酸攜帶的N端基團(tuán)和胺基團(tuán))進(jìn)行。
序列YTLRAPRSPKMVQGSG-NH2(SEQ ID No.16)的肽C13P30或序列YTLRAPRSPKMVQGS-NH2(SEQ ID No.109)的肽CN32的5mg/ml溶液用含有0.15M NaCl的pH7.4的Dulbecco PBS緩沖液制備。對(duì)于注射制劑，一瓶在PBS緩沖液(Pierce #77600)中凍干的20mg KLH吸收2ml水，獲得溶于PBS緩沖液的10mg/ml KLH溶液。
1ml肽溶液(即5mg)與1.25ml KLH溶液(即12.5mg)混合。在抽風(fēng)罩下，向混合物中加入(由25％戊二醛，Sigma #G-5882)即時(shí)制備的2.25ml 2％戊二醛溶液。為了避免形成KLH復(fù)合物，逐滴加入2％戊二醛溶液，同時(shí)攪拌混合液。偶聯(lián)反應(yīng)在室溫下進(jìn)行2小時(shí)30分鐘。加入100mg/ml硼氫化鈉溶液達(dá)到10mg/ml的終濃度，終止偶聯(lián)反應(yīng)。混合物在4℃下溫育過(guò)夜。最后，該溶液在4℃下對(duì)pH7.4的DulbeccoPBS緩沖液透析過(guò)夜。最后等分該溶液，貯存于-80℃。
實(shí)施例3用肽免疫為了生產(chǎn)多克隆抗體，兔(雌性，新西蘭株)用根據(jù)實(shí)施例2與KLH偶聯(lián)的肽Cys-YTLRAPRSPKMVQGSG-NH2免疫。對(duì)于第一次注射，制備1.5ml KLH偶聯(lián)的肽與1.5ml弗氏完全佐劑(Sigma #F-5881)的乳液，對(duì)每只兔皮內(nèi)注射1ml這種乳液(即200μg肽)。通過(guò)皮內(nèi)注射1mlKLH偶聯(lián)的肽(即200μg肽)與弗氏不完全佐劑(Sigma #F-5506)的乳液，給予兩次加強(qiáng)，間隔20天。在第二次加強(qiáng)20天后，以與前幾次加強(qiáng)基本相同的方法給予第三次加強(qiáng)，不同之處是采用皮下注射。后一次加強(qiáng)20天后，并且在評(píng)價(jià)獲得的抗體滴度后，對(duì)兔采血。更具體而言，剩余的研究使用以下多克隆抗體它們來(lái)自用編號(hào)#046 805和046 832區(qū)別的兔，通過(guò)用與KLH偶聯(lián)的肽C-YTLRAPRSPKMVQGS-NH2(SEQ ID No.16)免疫獲得，以及來(lái)自用#L01235區(qū)別的兔，通過(guò)用與KLH偶聯(lián)的肽C-YTLRAPRSPKMVQGS-NH2(SEQ ID No.109)免疫獲得。
實(shí)施例4獲得及純化抗體純化后，兔血清在4℃下以4500轉(zhuǎn)/分離心30分鐘。通過(guò)沉淀分離后，血清用含有1M NaCl的1.5M甘氨酸緩沖液pH8.0對(duì)半稀釋。
實(shí)施例4.a使用蛋白A-sepharose的IgG純化多克隆抗體的純化在蛋白A-sepharose凝膠(Amersham Biosciences#17.1279.02)上通過(guò)親和層析進(jìn)行。從金黃色葡萄球菌中提取的蛋白A與IgG分子的Fc片段特異結(jié)合。然后，在pH3.0下洗脫包括所有亞類(lèi)的IgG。
為了防止氣泡形成，使用的所有緩沖液在上柱之前均在超聲波浴中脫氣15分鐘。
層析柱用12ml蛋白A-sepharose制備。該凝膠柱用蒸餾水和脫氣的水平衡40分鐘，然后用含有0.5M NaCl的pH7.4的Dulbecco PBS緩沖液平衡40分鐘，最后用含有1M NaCl的pH8.0的1.5M甘氨酸緩沖液平衡，直到獲得正確的基線。
然后，用含有1M NaCl的pH8.0的1.5M甘氨酸緩沖液對(duì)半稀釋的10ml兔血清以0.5ml/min的流速通過(guò)該柱。在出現(xiàn)白蛋白峰后，利用以0.1M tris-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)至pH3.0的0.1M檸檬酸溶液洗脫血清IgG?；厥誌gG洗脫峰，在4℃下在pH7.4的Dulbecco PBS緩沖液中快速透析過(guò)夜。對(duì)PBS緩沖液透析后通過(guò)讀取280nm的光密度測(cè)定IgG的濃度。
利用蛋白A純化后，在包被吸附的0.25μg/ml proBNP(1-108)或BNP(1-76)或BNP(77-108)的孔上通過(guò)ELISA檢測(cè)多克隆抗體的反應(yīng)性。圖1列出了來(lái)自兔#046 805的多克隆抗體獲得的結(jié)果。來(lái)自兔#046832的多克隆抗體獲得相同的結(jié)果。來(lái)自兔#046 805和#046 832的多克隆抗體對(duì)于proBNP(1-108)是相對(duì)特異的。然而，我們能夠注意到高濃度下弱抗-BNP(77-108)反應(yīng)性的存在，我們按照實(shí)施例4.b所述的方法，通過(guò)在BNP-K3-NHS-sepharose樹(shù)脂上消耗，使來(lái)自這些兔的多克隆抗體具有單特異性，能夠消除這種反應(yīng)性。
實(shí)施例4.bIgG在BNP-K3-NHS-sepharose樹(shù)脂上的消耗該操作的目的在于消除觀察到的對(duì)于BNP(77-108)的交叉反應(yīng)性。
由于獲得的多克隆抗體的交叉反應(yīng)性位于BNP(77-108)分子的N端位置，因此將BNP(77-108)的該區(qū)正確地呈遞給將要消除的免疫球蛋白至關(guān)重要。為此，利用C末端位置(BNP-K3)中3個(gè)賴(lài)氨酸殘基的延伸合成BNP(77-108)，以促進(jìn)它通過(guò)C末端與NHS-sepharose樹(shù)脂的偶聯(lián)。
如以上實(shí)施例1所述，利用“Fmoc”(9-芴基甲氧基羰基)化學(xué)，在Pioneer合成儀上合成BNP-K3S-P-K-M-V-Q-G-S-G-C-F-G-R-K-M-D-R-I-S-S-S-S-G-L-G-C-K-V-L-R-R-H-K-K-K(SEQ ID No.104)。
5mg BNP-K3用100mM pH8.3的NaHCO3緩沖液溶解，以10mg/ml的濃度加入0.5M NaCl。2ml NHS-sepharose樹(shù)脂(NHS-活化的Sepharose 4 Fast Flow，Amersham Biosciences #17.0906.01)在4℃下以1000轉(zhuǎn)/分離心30秒鐘。樹(shù)脂用15ml 1mM冷HCl溶液洗滌。離心并除去HCl溶液后，樹(shù)脂與10mg/ml的BNP-K3配體混合?；旌衔镌谑覝睾途徛龜嚢柘聹赜?小時(shí)。離心并除去配體溶液后，樹(shù)脂的非反應(yīng)性基團(tuán)用5ml pH8.0的0.1M甘氨酸緩沖液封閉。該混合物在室溫和緩慢攪拌下溫育1小時(shí)。離心并除去封閉緩沖液后，樹(shù)脂吸收5ml 100mMNaHCO3緩沖液pH8.3，加入0.5M NaCl。用該緩沖液洗滌4次。最后一次洗滌后，將該混合物上樣層析柱上。
在制備層析柱后，將10mg來(lái)自兔#046 805或來(lái)自兔#046 832的IgG上樣到柱上。與該柱相連的蠕動(dòng)泵使得兔血清IgG能夠在4℃下循環(huán)過(guò)夜。次日，回收IgG溶液(＝濾過(guò)物)。用含有5M尿素的20mM Tris緩沖液pH8.0洗脫與BNP-K3結(jié)合的IgG級(jí)分(＝洗脫物)。然后檢測(cè)洗脫物與濾過(guò)物，以證實(shí)消耗的效果。圖2和圖3分別顯示用來(lái)自兔#046805和#046 832的多克隆血清的濾過(guò)物進(jìn)行的ELISA檢測(cè)的結(jié)果。圖4和圖5分別顯示用來(lái)自兔#046 805和#046 832的多克隆血清的洗脫物進(jìn)行的ELISA檢測(cè)的結(jié)果。
如預(yù)期的一樣，來(lái)自兔#046 805和#046 832的多克隆血清的濾過(guò)物對(duì)于proBNP(1-108)是特異的對(duì)BNP(1-76)和BNP(77-108)均未見(jiàn)反應(yīng)性。洗脫物保留相當(dāng)大的對(duì)proBNP(1-108)的反應(yīng)性，以及對(duì)BNP(77-108)的反應(yīng)性。這些結(jié)果證實(shí)了在BNP-K3-NHS-sepharose樹(shù)脂上消耗兔多克隆血清的效果。
BNP(77-108)來(lái)自Sigma(#B-5900)，而proBNP(1-108)和BNP(1-76)按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)，在克隆到載體pGEX-2T(Amersham Pharmacia Biotech)內(nèi)，并轉(zhuǎn)染大腸桿菌后，以表達(dá)的重組蛋白的形式產(chǎn)生。原始載體由Berlex Biosciences公司(Richmond，CA，USA)提供，它的制備如Yan等人(PNAS，2000，vol.97，pp.8525-8529)所述。proBNP(1-108)和BNP(1-76)的濃度通過(guò)Bradford法測(cè)定，用于蛋白質(zhì)比色測(cè)定(M.Bradford Anal.Biochem.1976；72248-54)。
實(shí)施例5來(lái)自兔#046 805和#L01235的抗-proBNP(1-108)抗體對(duì)于BNP(1-76)和BNP(77-108)的百分交叉反應(yīng)性的測(cè)定材料1)固相平底Maxisorp微孔板，Nunc(丹麥)。
2)BNP(77-108)來(lái)自Sigma(# B-5900)，而proBNP(1-108)和BNP(1-76)以重組蛋白的形式產(chǎn)生。這些蛋白質(zhì)溶液的濃度通過(guò)Bradford法測(cè)定，用于蛋白質(zhì)比色測(cè)定(M.Bradford Anal.Biochem.1976；72248-54)。
3)使用的偶聯(lián)物是一種過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG多克隆抗體(Sigma #A-9169)。
4)飽和緩沖液Dulbecco PBS緩沖液，pH7.4，含有1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma #A-7888)。
5)稀釋緩沖液Dulbecco PBS緩沖液，pH7.4，含有0.1％ BSA和0.1％ Tween 20。
6)洗滌溶液Dulbecco PBS緩沖液，pH7.4，含有0.1％ Tween 20。
7)顯色溶液顯色溶液由下列成分組成7a)底物緩沖液0.01M檸檬酸和0.04M檸檬酸三鈉的溶液，含有0.33％H2O2，終pH為5.6，和7b)發(fā)色團(tuán)OPD(鄰苯二胺)片。1片OPD溶解于10ml底物緩沖液中。
8)終止溶液4N H2SO4。
方案該測(cè)定在于評(píng)價(jià)多克隆抗體直接對(duì)固定于微孔板的孔中的不同蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)性。
√ 首先用Dulbecco PBS緩沖液pH7.4制備幾種包被溶液第一種含有0.25μg/ml BNP(77-108)，第二種含有0.25μg/ml proBNP(1-108)，第三種含有0.25μg/ml BNP(1-76)，第四種含有0.25μg/ml GST(背景噪音控制蛋白)。
√ 分別向微孔板的孔中加入各100μl這些溶液。
√ 微孔板在4℃下溫育過(guò)夜。
√ 除去包被溶液后，微孔板用含有0.1％Tween 20的300μlDulbecco PBS緩沖液pH7.4洗滌，然后加入含有1％BSA的250μlDulbecco PBS緩沖液pH7.4飽和。
√ 微孔板然后在37℃下溫育1小時(shí)。
√ 然后用洗滌溶液洗滌微孔板(3次)。
√ 向每孔中加入100μl多克隆抗體溶液，對(duì)于來(lái)自兔#046 805的多克隆血清，預(yù)先稀釋為2和1μg/ml，對(duì)于來(lái)自兔#L01235的多克隆血清，1/2500和1/5000稀釋。
√ 反應(yīng)介質(zhì)在室溫下溫育2小時(shí)。
√ 微孔板然后用300μl洗滌溶液洗滌3次。
√ 向微孔板的每個(gè)孔中加入100μl在稀釋緩沖液中1/8000稀釋的過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG多克隆抗體偶聯(lián)物。
√ 反應(yīng)介質(zhì)在室溫下溫育1小時(shí)。
√ 微孔板然后用300μl洗滌溶液洗滌(5次)。向每孔中加入100μl顯色溶液。反應(yīng)體系在室溫下(18-24℃)在暗處顯色20分鐘。
√ 然后向每孔中加入50μl終止溶液。
√ 反應(yīng)終止后，利用分光光度計(jì)讀取490/620nm的光密度。
表I兔#046 805和#L01235的多克隆抗體對(duì)于BNP(1-76)和BNP(77-108)的百分交叉反應(yīng)的測(cè)定結(jié)果對(duì)于一種指定的抗-proBNP(1-108)抗體，它對(duì)吸附的0.25μg/mlBNP(77-108)、對(duì)吸附的0.25μg/ml proBNP(1-108)以及對(duì)吸附的0.25μg/ml GST檢測(cè)，該抗體與BNP(77-108)的百分交叉反應(yīng)用下列公式計(jì)算%=OD(BNP77-108)-OD(GST)OD(proBNP1-108)-OD(GST)×100]]>對(duì)于一種指定的抗-proBNP(1-108)抗體，它對(duì)吸附的0.25μg/mlBNP(1-76)、對(duì)吸附的0.25μg/ml proBNP(1-108)以及對(duì)吸附的0.25μg/ml GST檢測(cè)，該抗體與BNP(1-76)的百分交叉反應(yīng)用下列公式計(jì)算%=OD(BNP1-76)-OD(GST)OD(proBNP1-108)-OD(GST)×100]]>
在膜上合成的肽系列包括32種十五肽，這些肽含有一個(gè)3氨基酸殘基的移位，代表proBNP(1-108)的完整序列。
表II包含32種十五肽的斑點(diǎn)膜，這些肽含有一個(gè)3氨基酸殘基的移位，代表proBNP(1-108)的完整序列。
在膜用添加0.1％ Tween 20、5％封閉緩沖液(Euromedex #SU-07-250)和5％蔗糖的30ml TBS(Tris緩沖鹽溶液)緩沖液pH7.0飽和后，檢測(cè)稀釋為10μg/ml的20ml兔多克隆血清的反應(yīng)性(在37℃和攪拌下溫育1小時(shí)30分鐘)。用添加0.1％Tween 20的TBS緩沖液pH7.0洗滌后，20ml堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗兔IgG偶聯(lián)物(Sigma #A-8025)在室溫和攪拌下溫育1小時(shí)。最后，用30ml洗滌緩沖液進(jìn)行最后一系列洗滌之后，加入30ml底物溶液(30ml CBS(檸檬酸)緩沖液，pH7.0，含有120μl 0.15M BCIP(5-溴-4-氟-3-吲哚基磷酸)，150μl 1M MgCl2和180μl0.1M MTT(溴化噻唑基藍(lán)四唑))，使斑點(diǎn)顯色。掃描該膜，之后利用圖像加工軟件評(píng)價(jià)膜上斑點(diǎn)的強(qiáng)度(相對(duì)強(qiáng)度單位)。背景噪音根據(jù)抗血清檢測(cè)不到的斑點(diǎn)計(jì)算。對(duì)于消耗之前的來(lái)自兔#046 805的多克隆血清，其表位分析結(jié)果在圖6中給出。多克隆血清檢測(cè)到5種肽(斑點(diǎn)22-26)，這5種肽共同的序列是R76S77P。然而，當(dāng)在R76S77P單位的N端位點(diǎn)處添加RAP單位時(shí)，反應(yīng)性顯然提高。對(duì)于在BNP-K3-NHS-sepharose樹(shù)脂上消耗之后的，來(lái)自兔#046 805的多克隆血清，其表位分析結(jié)果在圖7中給出。多克隆血清檢測(cè)到4種肽(斑點(diǎn)22-25)，這4種肽的共同序列是RAPR76S77P。與消耗之前的多克隆血清所見(jiàn)不同，未見(jiàn)對(duì)單獨(dú)的R76S77P單位的反應(yīng)性(斑點(diǎn)26)。這解釋了在BNP-K3-NHS-sepharose樹(shù)脂上消耗后，多克隆血清不再檢測(cè)BNP(77-108)[提示S77P單位對(duì)應(yīng)于BNP(77-108)序列的前兩個(gè)氨基酸]。結(jié)論是，可被來(lái)自兔#046 805的單特異性多克隆血清識(shí)別的表位是RAPR76S77P。
使用來(lái)自兔#046 832的多克隆血清獲得完全相同的結(jié)果可被來(lái)自該兔的單特異性多克隆血清識(shí)別的表位也是RAPR76S77P。
實(shí)施例7通過(guò)Ala-掃描法，消耗之前及之后，來(lái)自兔#046 805和#046 832的多克隆血清的最小表位的鑒定在BNP-K3-NHS-sepharose樹(shù)脂上消耗之前和之后，來(lái)自兔#046805和#046 832的多克隆血清用斑點(diǎn)法檢測(cè)(如實(shí)施例6所述)，以鑒定鉸鏈區(qū)中的最小表位，該表位使得多克隆血清只能特異地識(shí)別proBNP(1-108)。合成一張膜，其含有16種十五肽，它們重復(fù)鉸鏈肽的序列YTLRAPRSPKMVQGS，并且含有一個(gè)氨基酸被丙氨酸殘基(丙氨酸-掃描或“Ala-掃描”)或甘氨酸殘基的鄰居-鄰居置換，該置換每次向右移位一個(gè)氨基酸殘基(表III)。在BNP-K3-NHS-sepharose樹(shù)脂上消耗之前和之后，來(lái)自兔#046 805和#046 832的多克隆血清的Ala-掃描分析結(jié)果在表III中列出。
表III含有16種十五肽YTLRAPRSPKMVQGS的斑點(diǎn)膜，這些肽含有每種氨基酸被丙氨酸或甘氨酸殘基的鄰居-鄰居置換。在BNP-K3-NHS-sepharose樹(shù)脂上消耗之前和之后，來(lái)自兔#046 805和#046 832的多克隆血清的反應(yīng)性
NB置換初始氨基酸的丙氨酸或甘氨酸殘基用下劃線標(biāo)出(A和G)。
在消耗之前的來(lái)自兔#046 805的多克隆血清對(duì)表位的識(shí)別中必需的氨基酸是R76S77P，而來(lái)自兔#046 805的多克隆血清在BNP-K3-NHS-sepharose樹(shù)脂上消耗之后，除了R76S77P單位之外，RA單位也有貢獻(xiàn)。對(duì)于消耗前的來(lái)自兔#046 832的多克隆血清，只有脯氨酸P78有貢獻(xiàn)，而來(lái)自兔#046 832的多克隆血清在BNP-K3-NHS-sepharose樹(shù)脂上消耗之后，有貢獻(xiàn)的單位是R-PR76S77P。因此這些結(jié)果表明，在來(lái)自兔#046 805和#046 832的多克隆抗體對(duì)proBNP(1-108)的特異識(shí)別中，必需的最小表位是RAPR76S77P。
實(shí)施例8通過(guò)Ala-掃描法，來(lái)自兔#L01235的多克隆血清的最小表位的鑒定從開(kāi)始(不需要消耗)即對(duì)proBNP(1-108)特異的來(lái)自兔#L01235的多克隆血清用斑點(diǎn)法檢測(cè)(如實(shí)施例6所述)，以鑒定鉸鏈肽中的最小表位，該表位使多克隆血清只特異地識(shí)別proBNP(1-108)。使用的膜如實(shí)施例7所述。來(lái)自兔#L01235的多克隆血清的Ala-掃描分析結(jié)果在表IV中給出。
表IV含有16種十五肽YTLRPRSPKMVQGS的斑點(diǎn)膜，這些肽含有每種氨基酸被丙氨酸或甘氨酸殘基的鄰居-鄰居置換。來(lái)自兔#L01235的多克隆血清的反應(yīng)性。
NB置換初始氨基酸的丙氨酸或甘氨酸殘基用下劃線標(biāo)出(A和G)。
對(duì)于來(lái)自兔#046 805和#046 832的多克隆血清(實(shí)施例7)，這些結(jié)果表明，在來(lái)自兔#L01235的多克隆抗體對(duì)proBNP(1-108)的特異識(shí)別中，必需的最小表位是RAPR76S77P。
實(shí)施例9用proBNP(1-108)重組蛋白對(duì)小鼠的免疫利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)，用實(shí)施例4.b所述的重組proBNP(1-108)免疫BALB/c小鼠(6周齡，雌性)。在第一次注射時(shí)，制備1ml proBNP(1-108)與1ml弗氏完全佐劑(Sigma #F-5881)的乳液，對(duì)每只小鼠皮下注射300μl這種乳液(即100μg蛋白質(zhì))。間隔15天，通過(guò)腹膜內(nèi)注射300μl proBNP(1-108)(即100μg蛋白質(zhì))與弗氏不完全佐劑(Sigma #F-5506)的乳液，給予兩次加強(qiáng)。第二次加強(qiáng)15天后，與以前相同地給予第三次加強(qiáng)，但是采用皮下注射。最后，在最后一次加強(qiáng)15天后，采集小鼠的血樣，通過(guò)斑點(diǎn)技術(shù)分析免疫應(yīng)答。小鼠12的免疫應(yīng)答證明特別有利于進(jìn)行剩余的研究。
實(shí)施例10proBNP(1-108)序列上可被來(lái)自小鼠12的多克隆抗體識(shí)別的表位的鑒定用來(lái)鑒定proBNP(1-108)序列上可被來(lái)自小鼠12的多克隆抗體識(shí)別的表位的斑點(diǎn)法在實(shí)施例6中描述。
在膜上合成的肽系列包括94種十五肽，每一種均改變一個(gè)氨基酸殘基，代表proBNP(1-108)的完整序列。如實(shí)施例6所述，在該膜上檢測(cè)1/500稀釋的來(lái)自小鼠12的多克隆血清的反應(yīng)性。在掃描該膜后，利用圖像加工軟件評(píng)價(jià)膜上斑點(diǎn)的強(qiáng)度(相對(duì)強(qiáng)度單位)。背景噪音根據(jù)抗血清不能檢測(cè)到的斑點(diǎn)計(jì)算，為30個(gè)相對(duì)強(qiáng)度單位。
位于proBNP(1-108)序列N端位置的三個(gè)區(qū)因此可被來(lái)自小鼠12的抗血清的抗體特別好地檢測(cè)序列H1PLGSPGSASDLETS15(SEQ IDNo.23)(斑點(diǎn)1-12)，序列L17QEQRNHLQGK27(SEQ ID No.123)(斑點(diǎn)17-27)和序列L38EPLQESPRPTG49(SEQ ID No.124)(斑點(diǎn)38-49)。
令人吃驚的是，來(lái)自小鼠12的抗血清也含有能夠識(shí)別其中肽序列
實(shí)施例11特異識(shí)別proBNP(1-108)，基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)的單克隆抗體的產(chǎn)生為了生產(chǎn)單克隆抗體而選擇的小鼠(5周齡BALB/c，雌性)按照下列方案用與KLH(匙孔 血藍(lán)蛋白)偶聯(lián)的肽SEQ ID No.16C-YTLRAPRSPKMVQGSG-NH2(C13P30)免疫皮下注射用弗氏完全佐劑體積-體積稀釋的100μg KLH偶聯(lián)的肽。以三周的間隔，通過(guò)皮下注射用弗氏不完全佐劑體積-體積稀釋的100μg KLH-偶聯(lián)的肽，給予四次加強(qiáng)。
在進(jìn)行淋巴細(xì)胞融合三天前，按照下列方案對(duì)小鼠進(jìn)行超免疫免疫原的總劑量，在此情況下，為100μg與KLH偶聯(lián)的肽C-YTLRAPRSPKMVQGSG-NH2，在無(wú)菌PBS緩沖液中，分成四次注射。第一次和第二次注射均相當(dāng)于總劑量的1/10。以45分鐘的間隔，在不同部位皮下注射。第三次注射相當(dāng)于總劑量的2/10，在第二次注射45分鐘后皮下進(jìn)行。在第三次注射30分鐘后，腹膜內(nèi)注射100μl 1mg/ml異丙嗪在無(wú)菌PBS中的溶液(2.5％非那根，Laboratoires MedevaParma)，以預(yù)防任何過(guò)敏性休克。最后，在15分鐘后，腹膜內(nèi)給予最后一次注射，相當(dāng)于總劑量的6/10。
淋巴細(xì)胞雜交按照Khler和Milstein(Nature，1975；256495-97)所述的方法進(jìn)行。其中使用從小鼠脾臟中提取的淋巴細(xì)胞，和預(yù)先置于RPMI 1640培養(yǎng)基(Bio-Whittaker #BE12-167F)中培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞(P3-X63-Ag8.653)，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充了L-谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素的混合物(Sigma # G-6784)，添加了預(yù)先去補(bǔ)體的10％胎牛血清(Bio-Whittaker #BE02701 E)和8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤(Sigma #A-8526)。預(yù)先置于RPMI-1640培養(yǎng)基(Bio-Whittaker #BE12-167F)中的淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞以每個(gè)骨髓瘤細(xì)胞5個(gè)淋巴細(xì)胞的比例混合，該培養(yǎng)基中添加L-谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素的混合物(Sigma # G-6784)，而不添加胎牛血清。該混合物在室溫下以900轉(zhuǎn)/分離心7分鐘后，加入細(xì)胞沉淀的重懸液，1ml Hybri-Max聚乙二醇(Sigma #P-7777)。在37℃水浴中溫育1分鐘后，細(xì)胞在室溫下以1000轉(zhuǎn)/分離心1分30秒。最后，在37℃水浴中溫育2分鐘后，重懸浮沉淀，以每5秒鐘100μl的速度加入6ml預(yù)先置于37℃的添加了L-谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素的混合物(Sigma #G-6784)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Bio-Whittaker #BE12-167F)，同時(shí)加入9ml相同的培養(yǎng)基。在室溫下以900轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，并除去上清液后，沉淀吸收RPMI 1640培養(yǎng)基(Bio-Whittaker #BE12-167F)，其中添加L-谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素的混合物(Sigma #G-6784)，添加15％預(yù)先去補(bǔ)體的胎牛血清(Bio-Whittaker #BE02701E)，以及HAT(次黃嘌呤，氨基喋呤，胸苷，Sigma #H-0262)，以便每孔分配100μl，120 000個(gè)細(xì)胞。在向預(yù)先加入鼠巨噬細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板的孔中各分配100μl溶液。然后將培養(yǎng)板置于CO2孵箱中。在淋巴細(xì)胞雜交15天后，估計(jì)融合板中存在的克隆數(shù)，表示為雜交瘤發(fā)展的百分?jǐn)?shù)。
通過(guò)ELISA，在proBNP(1-108)、BNP(1-76)、BNP(77-108)和含有序列RAPR76S77P的一種肽(C13P30)上進(jìn)行雜交瘤的篩選。只選擇分泌能夠檢測(cè)proBNP(1-108)和含有序列RAPR76S77P的C13P30肽而基本上不識(shí)別BNP(1-76)或BNP(77-108)的抗體的雜交瘤。選擇的雜交瘤保持培養(yǎng)，通過(guò)有限稀釋克隆。這樣克隆的雜交瘤然后能夠用來(lái)在腹水中生產(chǎn)單克隆抗體。
這樣，本發(fā)明人生產(chǎn)了一種鼠雜交瘤，克隆3D4，它分泌一種同型IgG1κ免疫球蛋白，它具有根據(jù)本發(fā)明的抗體的特征。該雜交瘤在2003年7月31日保藏于CNCM(Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes[國(guó)立微生物保藏中心]，巴斯德研究所，25rue duDocteur Roux，75 724 Paris，Cedex 15，法國(guó))，注冊(cè)號(hào)為CNCM I-3073。
因此，本發(fā)明的主題也包括保藏于CNCM的保藏號(hào)為CNCMI-3073的雜交瘤3D4，以及它分泌的單克隆抗體。
實(shí)施例12通過(guò)ELISA證實(shí)雜交瘤3D4產(chǎn)生的抗體的特異性材料1)固相平底Maxisorp微孔板，Nunc(丹麥)。
2)BNP(77-108)來(lái)自Sigma(# B-5900)，而proBNP(1-108)和BNP(1-76)以重組蛋白的形式產(chǎn)生。這些蛋白質(zhì)溶液的濃度通過(guò)Bradford法測(cè)定，用于蛋白質(zhì)比色測(cè)定(M.Bradford Anal.Biochem.1976；72248-54)。
3)使用的偶聯(lián)物是一種過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的驢抗小鼠IgG多克隆抗體(Jackson Immunoresearch #715-035-150)。
4)飽和緩沖液Dulbecco PBS緩沖液，pH7.4，含有1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma #A-7888)。
5)稀釋緩沖液Dulbecco PBS緩沖液，pH7.4，含有0.1％BSA和0.1％Tween 20。
6)洗滌溶液Dulbecco PBS緩沖液，pH7.4，含有0.1％Tween 20。
7)顯色溶液顯色溶液由下列成分組成7a)底物緩沖液0.01M檸檬酸和0.04M檸檬酸三鈉的溶液，含有0.33％H2O2，終pH為5.6，和7b)發(fā)色團(tuán)OPD(鄰苯二胺)片。1片OPD溶解于10ml底物緩沖液中。
8)終止溶液4N H2SO4。
方案該測(cè)定在于評(píng)價(jià)雜交瘤3D4的培養(yǎng)上清液直接對(duì)固定于微量滴定板的孔中的不同蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)性。
√ 首先用Dulbecco PBS緩沖液pH7.4制備幾種包被溶液第一種含有1μg/ml BNP(77-108)，第二種含有1μg/ml proBNP(1-108)，第三種含有1μg/ml BNP(1-76)。
√ 分別向微孔板的孔中加入各100μl這些溶液。
√ 微孔板在4℃下溫育過(guò)夜。
√ 除去包被溶液后，微孔板用含有0.1％Tween 20的DulbeccoPBS緩沖液pH7.4洗滌，然后加入含有1％BSA的250μl Dulbecco PBS緩沖液pH7.4飽和。
√ 微孔板然后在37℃下溫育1小時(shí)。
√ 然后用300μl洗滌溶液洗滌微孔板(3次)。
√ 向每孔中加入100μl預(yù)先1/2稀釋的雜交瘤3D4上清液。
√ 反應(yīng)介質(zhì)在室溫下溫育2小時(shí)。
√ 微孔板然后用300μl洗滌溶液洗滌3次。
√ 向微孔板的每個(gè)孔中加入100μl偶聯(lián)物，用稀釋緩沖液1/2000稀釋的過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG多克隆抗體√ 反應(yīng)介質(zhì)在室溫下溫育1小時(shí)。
√ 微孔板然后用300μl洗滌溶液洗滌(5次)。向每孔中加入100μl顯色溶液。反應(yīng)體系在室溫下(18-24℃)在暗處顯色20分鐘。
√ 然后向每孔中加入50μl終止溶液。
√ 反應(yīng)終止后，用分光光度計(jì)讀取490/620nm的光密度。
圖8顯示該測(cè)定的結(jié)果雜交瘤3D4上清液產(chǎn)生的抗體只能夠檢測(cè)proBNP(1-108)和C13P30免疫肽，未獲得對(duì)BNP(1-76)或者對(duì)BNP(77-108)的反應(yīng)性。這些結(jié)果證實(shí)了雜交瘤3D4產(chǎn)生的抗體對(duì)proBNP(1-108)的特異性，不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)。
因此，來(lái)源于雜交瘤3D4的根據(jù)本發(fā)明的抗體顯然是一種特異地識(shí)別proBNP(1-108)的抗體，基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)。
實(shí)施例13通過(guò)Western印跡證實(shí)雜交瘤3D4產(chǎn)生的抗體的特異性材料1)常規(guī)SDS-PAGE電泳裝置2)積層膠5％丙烯酰胺3)分離膠16％丙烯酰胺4)陽(yáng)極緩沖液0.2M Tris，pH8.95)陰極緩沖液0.1M Tris-tricine；0.1％SDS6)樣品緩沖液0.5M Tris，pH6.8；25％甘油；2％SDS；14.4mMβ-巰基乙醇；0.1％溴酚藍(lán)。
7)電泳轉(zhuǎn)移裝置。
8)轉(zhuǎn)移緩沖液25mM Tris堿；190mM甘氨酸；20％甲醇；0.05％SDS。
9)BNP(77-108)來(lái)自Sigma(# B-5900)，而proBNP(1-108)-GST、BNP(1-76)-GST和GST(作為陰性對(duì)照)以重組蛋白的形式產(chǎn)生。這些蛋白質(zhì)溶液的濃度通過(guò)Bradford法測(cè)定，用于蛋白質(zhì)比色測(cè)定(M.Bradford Anal.Biochem.1976；72248-54)。
10)使用的偶聯(lián)物是一種過(guò)氧化物酶-偶聯(lián)的驢抗小鼠IgG多克隆抗體(Jackson Immunoresearch #715-035-150)。
11)ECL試劑盒用于通過(guò)Western-blotting檢測(cè)(AmershamBiosciences #RPN2106)。
方案該測(cè)定的實(shí)施包括三個(gè)主要步驟不同蛋白質(zhì)在16％丙烯酰胺凝膠中電泳遷移，然后這些蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，最后Western印跡。
√ 用樣品緩沖液制備多種溶液，終體積為35μl第一種含有1μgproBNP(1-108)-GST，第二種含有1μg GST，第三種含有1μgBNP(1-76)-GST，第四種含有1μg BNP(77-108)。
√ 每種溶液都在100℃水浴中溫育5分鐘，然后加到凝膠的孔中。在120V恒定電壓下通過(guò)丙烯酰胺凝膠遷移1小時(shí)30分。圖9是獲得的丙烯酰胺凝膠的一張照片。加樣的蛋白質(zhì)用考馬斯藍(lán)染色。
√ 遷移后，在120mA下將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上1小時(shí)。
√ 硝酸纖維素膜然后用PBS+0.1％Tween洗滌，在室溫下在PBS緩沖液+0.1％Tween+2％脫脂奶中飽和30分鐘。
√ 用PBS緩沖液+0.1％Tween洗滌3次后，在攪拌下，膜與5ml雜交瘤3D4上清液37℃溫育1小時(shí)。
√ 用PBS緩沖液+0.1％Tween洗滌3次后，在攪拌下，膜與10ml用PBS緩沖液+0.1％Tween+2％脫脂奶1/2000稀釋的過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠IgG偶聯(lián)物室溫溫育1小時(shí)。
√ 用PBS緩沖液+0.1％Tween洗滌3次后，膜浸泡于ECL顯色試劑中，之后暴露于膠片4分鐘。
圖10是獲得的照片的掃描圖像，如該圖所示，雜交瘤3D4上清液產(chǎn)生的抗體只能夠檢測(cè)對(duì)應(yīng)于proBNP(1-108)的帶。雜交瘤3D4的抗體不能檢測(cè)BNP(1-76)、BNP(77-108)以及GST。這些結(jié)果也證實(shí)了雜交瘤3D4產(chǎn)生的抗體對(duì)proBNP(1-108)的特異性。
因此，來(lái)源于雜交瘤3D4的根據(jù)本發(fā)明的抗體顯然是一種特異地識(shí)別proBNP(1-108)的抗體，基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)。
實(shí)施例14通過(guò)斑點(diǎn)法，可被雜交瘤3D4產(chǎn)生的抗體識(shí)別的表位的鑒定為了鑒定可被雜交瘤3D4抗體識(shí)別的表位，通過(guò)斑點(diǎn)法(如實(shí)施例6所述)檢測(cè)雜交瘤3D4的上清液。獲得的結(jié)果表明，3D4抗體可有效識(shí)別含有RAPR76S77P單位的肽序列。
這些結(jié)果與ELISA(實(shí)施例12)和Western印跡(實(shí)施例13)獲得的結(jié)果一致，證實(shí)了3D4抗體對(duì)于proBNP(1-108)的特異性。
實(shí)施例15proBNP(1-108)的免疫放射測(cè)定材料1)固相可拆孔的平底Maxisorp微孔板，Nunc(丹麥)。
2)使用的捕獲抗體是從未消耗的兔#046 805血清中獲得的多克隆抗體。
3)使用的偶聯(lián)物是用I125標(biāo)記的一種抗BNP(77-108)抗體(抗-BN-I125)。它是Shionogi公司所售的Shionoria BNP試劑盒的一種示蹤抗體。
4)飽和緩沖液Dulbecco PBS緩沖液，pH7.4，含有1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma #A-7888)。
5)稀釋緩沖液Dulbecco PBS緩沖液，pH7.4，含有0.1％BSA和0.1％Tween 20(Sigma，#P-1379)，6)洗滌緩沖液Dulbecco PBS緩沖液，pH7.4，含有0.1％Tween20。
7)proBNP(1-108)標(biāo)準(zhǔn)形式為重組蛋白的產(chǎn)物。
方案采用的測(cè)定的原理基于夾心放射免疫測(cè)定法，在可拆孔的平底微孔板中進(jìn)行。這是一種一步測(cè)定法，其中依次加入樣品(或proBNP(1-108)標(biāo)準(zhǔn)溶液)和示蹤劑，中間不必洗滌。
√ 來(lái)自兔#046 805的多克隆抗體用Dulbecco PBS pH7.4緩沖液稀釋為40μg/ml，首先用該抗體制備一種包被溶液。向微孔板的每個(gè)孔中加入300μl該溶液。
√ 微孔板在4℃下溫育過(guò)夜。
√ 除去包被溶液后，微孔板用300μl含有0.1％Tween 20的Dulbecco PBS緩沖液pH7.4洗滌，然后加入300μl含有1％BSA的Dulbecco PBS緩沖液pH7.4飽和。
√ 微孔板然后在37℃下溫育1小時(shí)。
√ 微孔板然后用300μl洗滌溶液(Dulbecco PBS緩沖液，pH7.4，添加0.1％Tween 20)洗滌(3次)。
√ 向每孔中加入100μl標(biāo)準(zhǔn)proBNP(1-108)溶液、血清或血漿。如果存在proBNP(1-108)，它將結(jié)合固相上保留的捕獲抗體。
√ 向每孔中加入200μl即用的抗-BNP-I125示蹤溶液(來(lái)自Shionogi Shionoria BNP試劑盒)。
√ 反應(yīng)介質(zhì)在4℃下溫育過(guò)夜(18-22小時(shí))。
√ 次日，微孔板用300μl洗滌溶液洗滌(3次)。在最后一次洗滌時(shí)，并且在吸出洗滌溶液后，將每個(gè)孔的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到一個(gè)預(yù)先確定的試管中。
√ 用γ計(jì)數(shù)器測(cè)量每孔中存在的放射性，該放射性與結(jié)合的示蹤劑的含量成比例，因此與標(biāo)本中存在的proBNP(1-108)的含量成比例。
圖11顯示使用proBNP(1-108)標(biāo)準(zhǔn)范圍獲得的結(jié)果。
實(shí)施例16人標(biāo)本的測(cè)定結(jié)果14個(gè)來(lái)自正常個(gè)體的標(biāo)本和15個(gè)來(lái)自心力衰竭患者的標(biāo)本利用實(shí)施例15所述的根據(jù)本發(fā)明的proBNP(1-108)IRMA測(cè)定法和Roche公司所售的BNP(1-76)測(cè)定法檢測(cè)，并且在Elecsys自動(dòng)化裝置上進(jìn)行。血樣均采集到含有EDTA的試管中。圖12顯示利用根據(jù)本發(fā)明的proBNP(1-108)IRMA測(cè)定法對(duì)這些標(biāo)本進(jìn)行的檢測(cè)的結(jié)果，單位為cpm(每分鐘的計(jì)數(shù))。對(duì)心力衰竭患者的標(biāo)本獲得的結(jié)果顯著高于正常個(gè)體標(biāo)本的結(jié)果。這些結(jié)果證明心力衰竭患者的標(biāo)本中存在循環(huán)proBNP(1-108)，并且第一次證明了血清proBNP(1-108)是預(yù)測(cè)心力衰竭的一種標(biāo)志物。圖13顯示對(duì)來(lái)自14名心力衰竭患者的標(biāo)本利用根據(jù)本發(fā)明的proBNP(1-108)IRMA測(cè)定法測(cè)定的proBNP(1-108)濃度(pg/ml)與在Elecsys自動(dòng)裝置上通過(guò)Roche測(cè)定獲得的BNP(1-76)濃度(pg/ml)之間的相關(guān)性。觀察到的相關(guān)性是顯著的，系數(shù)R2＝0.85。
實(shí)施例17來(lái)自兔#046 805的多克隆抗體與生物素的偶聯(lián)該偶聯(lián)方法使用生物素的一種N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)衍生物，它可以與IgG的伯胺反應(yīng)，形成一個(gè)酰胺鍵。
通過(guò)將生物素溶解于二甲基甲酰胺中制備(+)-生物素N-琥珀酰亞胺酯(Fluka #14405)的100mM溶液。生物素化在玻璃搖瓶中進(jìn)行。預(yù)先純化但是未消耗的500μg來(lái)自兔#046 805的多克隆抗體置于含有17μl100mM生物素溶液的搖瓶中(生物素/抗體摩爾比為500)。反應(yīng)在Dulbecco PBS緩沖液pH7.4中進(jìn)行。反應(yīng)混合物在緩慢攪拌下室溫溫育1小時(shí)30分鐘。偶聯(lián)后，加入一定體積的2M甘氨酸緩沖液滅活生物素?；旌衔镌诰徛龜嚢柘率覝販赜?0分鐘。最后，混合物在4℃下對(duì)Dulbecco PBS緩沖液pH7.4透析過(guò)夜。次日，以0.02％的終濃度加入疊氮鈉溶液。將偶聯(lián)物貯存于4℃下。
實(shí)施例18proBNP(1-108)的免疫酶測(cè)定也建立一種根據(jù)本發(fā)明的免疫酶測(cè)定。
材料1)固相平底Maxisorp微孔板，Nunc(丹麥)。
2)使用的捕獲抗體是Strategic Biosolution公司所售的一種多克隆抗BNP(77-108)抗體(#B9105RA00-A0)。
3)使用的偶聯(lián)物是按照實(shí)施例17所述的方法與生物素偶聯(lián)的未消耗的來(lái)自兔#046 805的多克隆抗體。
4)鏈霉抗生物素-過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物(Amersham PharmaciaBiotech#RPN1231V)。
5)飽和緩沖液Dulbecco PBS緩沖液，pH7.4，含有1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma #A-7888)。
6)稀釋緩沖液Dulbecco PBS緩沖液，pH7.4，含有0.1％ BSA和0.1％Tween 20。
7)洗滌溶液Dulbecco PBS緩沖液，pH7.4，含有0.1％ Tween 20。
8)proBNP(1-108)標(biāo)準(zhǔn)重組蛋白。
9)顯色溶液顯色溶液由下列成分組成9a)底物緩沖液0.01M檸檬酸和0.04M檸檬酸三鈉的溶液，含有0.33％H2O2，終pH為5.6，和9b)發(fā)色團(tuán)OPD(鄰苯二胺)片。1片OPD溶解于10ml底物緩沖液中。
10)終止溶液4N H2SO4。
方案該測(cè)定的原理基于在平底微孔板中進(jìn)行的夾心型免疫酶測(cè)定法。這是一種兩步測(cè)定法，其中標(biāo)本(或標(biāo)準(zhǔn)溶液)首先與捕獲抗體溫育，然后在溫育和洗滌后加入檢測(cè)抗體。
√ 首先用在Dulbecco PBS pH7.4緩沖液中稀釋為10μg/ml的抗BNP(77-108)多克隆抗體制備一種包被溶液。向微孔板的每個(gè)孔中加入100μl該溶液。
√ 微孔板在4℃下溫育過(guò)夜。
√ 除去包被溶液后，微孔板用300μl含有0.1％Tween 20的Dulbecco PBS緩沖液pH7.4洗滌，然后加入250μl含有1％BSA的Dulbecco PBS緩沖液pH7.4飽和。
√ 微孔板然后在37℃下溫育1小時(shí)。
√ 微孔板然后用洗滌溶液洗滌(3次)。
√ 向每孔中加入100μl標(biāo)準(zhǔn)proBNP(1-108)溶液、血清或血漿。如果存在proBNP(1-108)，它將結(jié)合固相上保留的捕獲抗體。
√ 反應(yīng)介質(zhì)在室溫下溫育2小時(shí)。
√ 微孔板然后用300μl洗滌溶液洗滌(5次)。
√ 向微孔板的每孔中加入100μl生物素化的來(lái)自兔#046 805的多克隆抗體(濃縮為6μg/ml)。
√ 反應(yīng)介質(zhì)在室溫下溫育2小時(shí)。
√ 微孔板然后用300μl洗滌溶液洗滌(5次)。
√ 最后，向微孔板的每孔中加入1/1000稀釋的100μl鏈霉抗生物素-POD偶聯(lián)物。
√ 反應(yīng)介質(zhì)在室溫下溫育1小時(shí)30分鐘。
√ 微孔板然后用300μl洗滌溶液洗滌(5次)。向每孔中加入100μl顯色溶液。反應(yīng)體系在室溫下(18-24℃)在暗處顯色20分鐘。
√ 然后向每孔中加入50μl終止溶液。
√ 反應(yīng)終止后，用分光光度計(jì)讀取490/620nm的光密度。
圖14顯示使用標(biāo)準(zhǔn)proBNP(1-108)范圍獲得的結(jié)果。
實(shí)施例19未消耗的、生物素偶聯(lián)的、來(lái)自#046 805的多克隆抗體對(duì)于BNP(1-76)和BNP(77-108)的交叉反應(yīng)的評(píng)價(jià)，該抗體在proBNP(1-108)ELISA測(cè)定中與抗BNP(77-108)多克隆抗體一起夾心使用。
未消耗的、生物素化的根據(jù)本發(fā)明的抗-proBNP(1-108)抗體(兔#046 805)對(duì)于BNP(1-76)和BNP(77-108)的交叉反應(yīng)，通過(guò)實(shí)施例18所述的proBNP(1-108)ELISA測(cè)定評(píng)價(jià)。5ng/ml-100ng/ml的濃度范圍用proBNP(1-108)、BNP(1-76)和BNP(77-108)制備，通過(guò)實(shí)施例18所述的proBNP(1-108)ELISA測(cè)定法測(cè)定。圖15給出了每種蛋白質(zhì)隨濃度變化的490nm光密度變化的結(jié)果。未見(jiàn)對(duì)于BNP(1-76)或BNP(77-108)的交叉反應(yīng)獲得的信號(hào)相當(dāng)于背景噪音，無(wú)論測(cè)定的濃度如何。在患者中常見(jiàn)的BNP(1-76)和BNP(77-108)濃度下(最高濃度的數(shù)量級(jí)為1ng/ml)，來(lái)自兔#046 805的多克隆抗體能夠以未消耗的形式使用，而不導(dǎo)致產(chǎn)生交叉反應(yīng)。
實(shí)施例20未消耗的、生物素偶聯(lián)的、來(lái)自兔#046 805的多克隆抗體對(duì)于BNP(1-76)和BNP(77-108)的交叉反應(yīng)的評(píng)價(jià)，該抗體在proBNP(1-108)ELISA測(cè)定中與抗NT-proBNP(1-29)多克隆抗體一起夾心使用。
未消耗的、生物素化的、來(lái)自兔#046 805的多克隆抗體對(duì)于BNP(1-76)和BNP(77-108)的交叉反應(yīng)，通過(guò)一種proBNP(1-108)ELISA測(cè)定評(píng)價(jià)，該測(cè)定使用實(shí)施例18所述的方案和試劑，不同之處是在這種情況下，用一種抗-NT-proBNP(1-29)多克隆抗體代替抗BNP(77-108)多克隆抗體。
抗-NT-proBNP(1-29)多克隆抗體根據(jù)實(shí)施例3所述的方案生產(chǎn)，不同之處在于用作免疫原的肽是與KLH偶聯(lián)的肽NT-proBNP(1-29)。5ng/ml-100ng/ml的濃度范圍用proBNP(1-108)、BNP(1-76)和BNP(77-108)制備，通過(guò)proBNP(1-108)ELISA測(cè)定法測(cè)定。圖16給出了每種蛋白質(zhì)隨濃度變化的490nm光密度變化的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的來(lái)自兔#046 805的多克隆抗體未見(jiàn)對(duì)于BNP(1-76)或BNP(77-108)的交叉反應(yīng)；獲得的信號(hào)相當(dāng)于背景噪音，無(wú)論測(cè)定的濃度如何。在患者中常見(jiàn)的BNP(1-76)和BNP(77-108)濃度下(數(shù)量級(jí)為1ng/ml)，來(lái)自兔#046 805的多克隆抗體能夠以未消耗的形式使用，而不會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)。
總之，根據(jù)以上公開(kāi)的整個(gè)公開(kāi)內(nèi)容顯然獲知，本發(fā)明能夠發(fā)現(xiàn)一種位于人proBNP(108)鉸鏈區(qū)的新型表位RAPR76S77P，由它能夠產(chǎn)生含有它的免疫原性肽，并且能夠獲得proBNP(108)特異性抗體，這些抗體基本上不識(shí)別BNP(1-76)或BNP(77-108)，其中一些能夠特異地識(shí)別人血清或血漿標(biāo)本中的循環(huán)proBNP(1-108)。
顯然，本發(fā)明也能夠發(fā)展一種對(duì)循環(huán)proBNP(1-108)的測(cè)定法，從而能夠簡(jiǎn)單、常規(guī)、可靠地診斷心力衰竭。
序列表<110>BIO-RAD PASTEURCNRSUniversity of Monpellier<120>用于診斷心力衰竭的特異性抗體<130>BET 03P0750<150>FR 0210063<151>2002-08-07<160>124<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>108<212>PRT<213>人 proBNP(1-108)<400>1His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly1 5 10 15Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln20 25 30Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr35 40 45Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His50 55 60
Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met65 70 75 80Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser85 90 95Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His100 105<210>2<211>32<212>PRT<213>人proBNP(77-108)<400>2Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp1 5 10 15Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His20 25 30<210>3<211>76<212>PRT<213>人 proBNP(1-76)<400>3His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly1 5 10 15Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln20 25 30Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr35 40 45Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His50 55 60Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg
65 70 75<210>4<211>16<212>PRT<213>人工序列proBNP(70-85)<400>4Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly1 5 10 15<210>5<211>6<212>PRT<213>人工序列proBNP(73-78)<400>5Arg Ala Pro Arg Ser Pro1 5<210>6<211>8<212>PRT<213>人工序列肽<400>6Cys Gly Arg Ala Pro Arg Ser Pro1 5<210>7<211>8<212>PRT<213>人工序列肽
<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>乙?；?amp;lt;400>7Cys Gly Arg Ala Pro Arg Ser Pro1 5<210>8<211>9<212>PRT<213>人工序列肽<400>8Cys Gly Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys1 5<210>9<211>9<212>PRT<213>人工序列肽<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>乙?；?amp;lt;400>9Cys Gly Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys1 5<210>10<211>11
<212>PRT<213>人工序列肽<400>10Cys Gly Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val1 5 10<210>11<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>11Cys Gly Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly1 5 10 15<210>12<211>8<212>PRT<213>人工序列肽<400>12Arg Ala Pro Arg Ser Pro Gly Cys1 5<210>13<211>8<212>PRT<213>人工序列肽<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)
<223>乙酰化<400>13Arg Ala Pro Arg Ser Pro Gly Cys1 5<210>14<211>11<212>PRT<213>人工序列肽<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>乙?；?amp;lt;400>14Cys Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys1 5 10<210>15<211>17<212>PRT<213>人工序列肽<400>15Cys His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro1 5 10 15Lys<210>16<211>17<212>PRT
<213>人工序列肽<400>16Cys Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15Gly<210>17<211>17<212>PRT<213>人工序列肽<400>17Cys Phe Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15Gly<210>18<211>17<212>PRT<213>人工序列肽<400>18Cys Phe Ser Ile Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15Gly<210>19<211>17<212>PRT
<213>人工序列肽<220>
<221>MOD_RES<222>(17)..(17)<223>bAla<400>19Cys Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15Ala<210>20<211>17<212>PRT<213>人工序列肽<220>
<221>MOD_RES<222>(17)..(17)<223>bAla<400>20Cys Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Ala Thr1 5 10 15Ala<210>21<211>17<212>PRT<213>人工序列肽
<220>
<221>MOD_RES<222>(17)..(17)<223>bAla<400>21Cys Phe Ser Ile Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Ala Thr1 5 10 15Ala<210>22<211>17<212>PRT<213>人工序列肽<400>22Cys Phe Ser Ile Arg Ala Pro Arg Ser Pro Ala Leu Ala Ser Gly Thr1 5 10 15Ala<210>23<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>23His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser1 5 10 15<210>24
<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>24Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln1 5 10 15<210>25<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>25Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg1 5 10 15<210>26<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>26Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu1 5 10 15<210>27<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>27Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys1 5 10 15
<210>28<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>28Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu1 5 10 15<210>29<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>29Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val1 5 10 15<210>30<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>30Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr1 5 10 15<210>31<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>31
Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu1 5 10 15<210>32<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>32Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln1 5 10 15<210>33<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>33Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro1 5 10 15<210>34<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>34Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr1 5 10 15<210>35<211>15<212>PRT<213>人工序列肽
<400>35Ser Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp1 5 10 15<210>36<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>36Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg1 5 10 15<210>37<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>37Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala1 5 10 15<210>38<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>38Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly1 5 10 15<210>39<211>15<212>PRT
<213>人工序列肽<400>39Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly1 5 10 15<210>40<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>40Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys1 5 10 15<210>41<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>41Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu1 5 10 15<210>42<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>42Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu1 5 10 15<210>43<211>15
<212>PRT<213>人工序列肽<400>43Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro1 5 10 15<210>44<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>44His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro1 5 10 15<210>45<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>45Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val1 5 10 15<210>46<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>46Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15
<210>47<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>47Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe1 5 10 15<210>48<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>48Arg Ser Pro Lys Met ValGln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys1 5 10 15<210>49<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>49Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg1 5 10 15<210>50<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>50Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser
1 5 10 15<210>51<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>51Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly1 5 10 15<210>52<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>52Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys1 5 10 15<210>53<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>53Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu1 5 10 15<210>54<211>15<212>PRT<213>人工序列肽
<400>54Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His1 5 10 15<210>55<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>55Ala Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15<210>56<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>56Tyr Ala Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15<210>57<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>57Tyr Thr Ala Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15<210>58<211>15<212>PRT<213>人工序列肽
<400>58Tyr Thr Leu Ala Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15<210>59<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>59Tyr Thr Leu Arg Gly Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15<210>60<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>60Tyr Thr Leu Arg Ala Ala Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15<210>61<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>61Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Ala Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15<210>62<211>15
<212>PRT<213>人工序列肽<400>62Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ala Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15<210>63<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>63Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Ala Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15<210>64<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>64Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Ala Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15<210>65<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>65Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Ala Val Gln Gly Ser1 5 10 15<210>66
<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>66Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Ala Gln Gly Ser1 5 10 15<210>67<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>67Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Ala Gly Ser1 5 10 15<210>68<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>68Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Ala Ser1 5 10 15<210>69<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>69Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ala1 5 10 15
<210>70<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>70Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly1 5 10 15<210>71<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>71Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu1 5 10 15<210>72<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>72Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu1 5 10 15<210>73<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>73
Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln1 5 10 15<210>74<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>74Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn1 5 10 15<210>75<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>75Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His1 5 10 15<210>76<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>76Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu1 5 10 15<210>77<211>15<212>PRT<213>人工序列肽
<400>77Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln1 5 10 15<210>78<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>78Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly1 5 10 15<210>79<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>79Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu1 5 10 15<210>80<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>80Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln15 10 15<210>81<211>15<212>PRT
<213>人工序列肽<400>81Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu1 5 10 15<210>82<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>82Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln1 5 10 15<210>83<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>83His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser1 5 10 15<210>84<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>84Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu1 5 10 15<210>85
<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>85Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu1 5 10 15<210>86<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>86Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro1 5 10 15<210>87<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>87Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu1 5 10 15<210>88<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>88Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys1 5 10 15
<210>89<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>89Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser1 5 10 15<210>90<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>90Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg1 5 10 15<210>91<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>91Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu1 5 10 15<210>92<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>92
Glu Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val1 5 10 15<210>93<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>93Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala1 5 10 15<210>94<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>94Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr1 5 10 15<210>95<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>95Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu1 5 10 15<210>96<211>15<212>PRT<213>人工序列肽
<400>96Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile1 5 10 15<210>97<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>97Thr Gly Va1 Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg1 5 10 15<210>98<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>98Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro1 5 10 15<210>99<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>99Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg15 10 15<210>100<211>15<212>PRT
<213>人工序列肽<400>100Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser1 5 10 15<210>101<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>101Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys1 5 10 15<210>102<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>102Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met1 5 10 15<210>103<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>103Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln1 5 10 15<210>104<211>35
<212>PRT<213>人工序列肽<400>104Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Arg Lys Met Asp1 5 10 15Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His20 25 30Lys Lys Lys35<210>105<211>10<212>PRT<213>人工序列肽<400>105Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys1 5 10<210>106<211>12<212>PRT<213>人工序列肽<400>106Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg1 5 10<210>107<211>13<212>PRT<213>人工序列肽
<400>107His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg1 5 10<210>108<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>108Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15<210>109<211>16<212>PRT<213>人工序列肽<400>109Cys Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15<210>110<211>11<212>PRT<213>人工序列肽<400>110Cys Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys1 5 10<210>111<211>13<212>PRT
<213>人工序列肽<400>111Cys Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val1 5 10<210>112<211>14<212>PRT<213>人工序列肽<400>112Cys Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln1 5 10<210>113<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>113Cys Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly1 5 10 15<210>114<211>13<212>PRT<213>人工序列肽<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(1)<223>乙酰化
<400>114Cys Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Va1 Gln1 5 10<210>115<211>14<212>PRT<213>人工序列肽<400>115Cys Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly1 5 10<210>116<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>116Cys Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10 15<210>117<211>16<212>PRT<213>人工序列肽<400>117Cys Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly1 5 10 15<210>118<211>11<212>PRT
<213>人工序列肽<400>118Cys Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val1 5 10<210>119<211>12<212>PRT<213>人工序列肽<400>119Cys Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln1 5 10<210>120<211>12<212>PRT<213>人工序列肽<400>120Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Cys1 5 10<210>121<211>14<212>PRT<213>人工序列肽<400>121Cys Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser1 5 10<210>122
<211>15<212>PRT<213>人工序列肽<400>122Cys Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly1 5 10 15<210>123<211>11<212>PRT<213>人工序列肽<400>123Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys1 5 10<210>124<211>12<212>PRT<213>人工序列肽<400>124Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly1 5 10
權(quán)利要求
1.一種抗proBNP(1-108)抗體，其特征在于首先，它特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列RAPR76S77P(SEQ ID No.5)，基本上不識(shí)別肽BNP(1-76)或BNP(77-108)，其次，它能夠特異地識(shí)別人血清或血漿標(biāo)本中的循環(huán)proBNP(1-108)。
2.如權(quán)利要求1所述的抗proBNP(1-108)抗體，它特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85(SEQ ID No.4)。
3.如權(quán)利要求1所述的抗proBNP(1-108)抗體，它特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84(SEQ ID No.108)。
4.獲得如權(quán)利要求1、2和3之一所述的抗proBNP(1-108)抗體的方法，其中用完整的proBNP(1-108)分子免疫動(dòng)物，然后用BNP(77-108)肽和/或BNP(1-76)肽消耗所獲得的抗血清。
5.獲得如權(quán)利要求1、2和3之一所述的抗proBNP(1-108)抗體的方法，其中用肽免疫動(dòng)物，所述肽選自-下列通式的肽a1-X1-RAPRSP-X2-a2(I)其中，a1可以是H，或者可以代表如下官能團(tuán)或化學(xué)基團(tuán)，其選自硫醇、醇、氨氧基、伯胺或仲胺官能團(tuán)、氨基羧基、生物素基和乙?；?，X1代表一種0-3個(gè)氨基酸的肽序列，它可能來(lái)源于或者可能不來(lái)源于proBNP(1-108)的天然序列，X2代表一種0-7個(gè)氨基酸的肽序列，它可能來(lái)源于或者可能不來(lái)源于proBNP(1-108)的天然序列，a2可以代表OH基、NH2基或烷氧基；-下列通式的肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)其中X可以是H，或者可以代表乙?；?，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸；-下列通式的肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)其中X可以是H，或者可以代表乙?；?，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸；-一種肽，其含有通過(guò)氨基酸Y70、T71、L72、K79、M80、V81、Q82、G83、S84和G85中的一個(gè)或多個(gè)的置換衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)或者衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)的序列，X可以是或者代表乙?；?，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸，且其中Z可以是OH基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸；-具有序列C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G(C13P30SEQ IDNo.16)的肽；-具有序列C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S(CN32SEQ ID No.109)的肽；且任選地，用BNP(77-108)肽和/或BNP(1-76)肽消耗所獲得的抗血清。
6.獲得如下雜交瘤的方法，所述雜交瘤分泌如權(quán)利要求1、2和3之一所述的抗proBNP(1-108)抗體，其中用選自如下的肽免疫動(dòng)物，所述肽選自-下列通式的肽a1-X1-RAPRSP-X2-a2(I)其中，a1可以是H，或者可以代表如下官能團(tuán)或化學(xué)基團(tuán)，其選自硫醇、醇、氨氧基、伯胺或仲胺官能團(tuán)、氨基羧基、生物素基和乙?；?，X1代表一種0-3個(gè)氨基酸的肽序列，它可能來(lái)源于或者可能不來(lái)源于proBNP(1-108)的天然序列，X2代表一種0-7個(gè)氨基酸的肽序列，它可能來(lái)源于或者可能不來(lái)源于proBNP(1-108)的天然序列，a2可以代表OH基、NH2基或烷氧基；-下列通式的肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)其中X可以是H，或者可以代表乙?；?，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸；-下列通式的肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III)其中X可以是H，或者可以代表乙酰基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸；-一種肽，其含有通過(guò)氨基酸Y70、T71、L72、K79、M80、V81、Q82、G83、S84和G85中的一個(gè)或多個(gè)的置換衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)或者衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)的一種序列，X可以是或者代表乙?；?，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸，其中Z可以是OH基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸；-具有序列C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G(C13P30SEQ IDNo.16)的肽；-具有序列C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S(CN32SEQ ID No.109)的肽；從該動(dòng)物中采集分泌免疫球蛋白的淋巴細(xì)胞，將該淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得至少一種分泌免疫球蛋白的雜交瘤。
7.如權(quán)利要求5和6任一項(xiàng)所述的方法，其中通式(II)的肽具有序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85(SEQ ID No.4)。
8.如權(quán)利要求5和6任一項(xiàng)所述的方法，其中通式(III)的肽具有序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84(SEQ ID No.108)。
9.能夠利用如權(quán)利要求6、7和8之一所述的方法生產(chǎn)的雜交瘤。
10.由如權(quán)利要求9所述的雜交瘤分泌的抗proBNP(1-108)單克隆抗體。
11.一種體外診斷人類(lèi)心力衰竭的方法，包括使生物標(biāo)本與如權(quán)利要求1、2、3和10之一所述的抗proBNP(1-108)抗體接觸，并檢測(cè)標(biāo)本中的proBNP(1-108)。
12.一種體外診斷人類(lèi)心力衰竭的方法，包括a)使生物標(biāo)本與如權(quán)利要求1、2、3和10之一所述的抗proBNP(1-108)抗體接觸，b)在允許形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下溫育該混合物，和c)任選地使用能夠與初級(jí)復(fù)合物中存在的proBNP(1-108)特異結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的檢測(cè)抗體，或者使用能夠與針對(duì)初級(jí)復(fù)合物中存在的proBNP(1-108)的抗體結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的檢測(cè)抗原，顯示形成的抗原-抗體復(fù)合物。
13.如權(quán)利要求12所述的診斷方法，它還包括步驟d)將顯示的抗原-抗體復(fù)合物的量與個(gè)體的臨床狀況相關(guān)聯(lián)。
14.一種檢測(cè)生物標(biāo)本中proBNP(1-108)的試劑盒，其含有至少一種如權(quán)利要求1、2、3和10之一所述的抗體。
15.如權(quán)利要求14所述的檢測(cè)生物標(biāo)本中proBNP(1-108)的試劑盒，其(i)在一個(gè)容器中含有至少一種如權(quán)利要求1、2、3和10之一所述的抗體；(ii)在另外一個(gè)容器中含有至少一種選自下列的肽-下列通式的肽a1-X1-RAPRSP-X2-a2(I)其中，a1可以是H，或者可以代表如下官能團(tuán)或化學(xué)基團(tuán)，其選自硫醇、醇、氨氧基、伯胺或仲胺官能團(tuán)、氨基羧基、生物素基和乙?；琗1代表一種0-3個(gè)氨基酸的肽序列，它可能來(lái)源于或者可能不來(lái)源于proBNP(1-108)的天然序列，X2代表一種0-7個(gè)氨基酸的肽序列，它可能來(lái)源于或者可能不來(lái)源于proBNP(1-108)的天然序列，a2可以代表OH基、NH2基或烷氧基；-下列通式的肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)其中X可以是H，或者可以代表乙?；?，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸；-下列通式的肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z (III)其中X可以是H，或者可以代表乙?；?，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸；-一種肽，其含有通過(guò)氨基酸Y70、T71、L72、K79、M80、V81、Q82、G83、S84和G85中的一個(gè)或多個(gè)的置換，衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)或者衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)的一種序列，X可以是或者代表乙?；?，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸，Z可以是一個(gè)OH基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸；-具有序列Y70TLRAP R76S77PKMVQGSG85(SEQ ID No.4)的肽；-具有序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84(SEQ ID No.109)的肽；-具有序列C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G(C13P30SEQ IDNo.16)的肽；-具有序列C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S(CN32SEQ ID No.108)的肽。
16.下列通式的肽a1-X1-RAPRSP-X2-a2(I)，其中，a1可以是H，或者可以代表如下官能團(tuán)或化學(xué)基團(tuán)，其選自硫醇、醇、氨氧基、伯胺或仲胺官能團(tuán)、氨基羧基、生物素基和乙?；?，X1代表一種0-3個(gè)氨基酸的肽序列，其可能來(lái)源于或者可能不來(lái)源于proBNP(1-108)的天然序列，X2代表一種0-7個(gè)氨基酸的肽序列，其可能來(lái)源于或者可能不來(lái)源于proBNP(1-108)的天然序列，a2可以代表OH基、NH2基或烷氧基。
17.下列通式的肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z (II)其中X可以是H，或者可以代表乙?；?，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸。
18.如權(quán)利要求17所述的肽，其具有序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85(SEQ ID No.4)。
19.下列通式的肽X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)其中X可以是H，或者可以代表乙?；?，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸，其中Z可以代表OH基，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸。
20.如權(quán)利要求19所述的肽，其具有序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84(SEQ ID No.108)。
21.一種肽，其含有通過(guò)氨基酸Y70、T71、L72、K79、M80、V81、Q82、G83、S84和G85中的一個(gè)或多個(gè)的置換，衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85-Z(II)或者衍生自序列X-Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84-Z(III)的序列，X可以是或者代表乙?；?，或者不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸，Z可以是OH基，或者是不屬于proBNP(1-108)的序列的1-3個(gè)氨基酸。
22.如權(quán)利要求16所述的肽，其具有選自下列序列的序列SEQ ID No.16C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G(肽C13P30)SEQ ID No.109C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S(肽CN32)SEQ ID No.6C-G-R-A-P-R-S-PSEQ ID No.7乙?；?C-G-R-A-P-R-S-PSEQ ID No.8C-G-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No.9乙酰基-C-G-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No.10C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-VSEQ ID No.11C-G-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-GSEQ ID No.12R-A-P-R-S-P-G-CSEQ ID No.13乙?；?R-A-P-R-S-P-G-CSEQ ID No.110C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-KSEQ ID No.111C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-VSEQ ID No.112C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-QSEQ ID No.113C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-GSEQ ID No.19C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-βASEQ ID No.20C-Y-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-A-T-βASEQ ID No.114乙?；?C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-QSEQ ID No.115C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-GSEQ ID No.116C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-SSEQ ID No.117C-T-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-GSEQ ID No.118C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-VSEQ ID No.119C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-QSEQ ID No.120L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-CSEQ ID No.121C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-SSEQ ID No.122C-L-R-A-P-R-S-P-K-M-V-Q-G-S-G。
23.一種獲得抗proBNP(1-108)抗體的方法，該抗體特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)肽，并且能夠特異地識(shí)別人血清或血漿標(biāo)本中的循環(huán)proBNP(1-108)，在該方法中，用如權(quán)利要求16-22之一所述的肽免疫動(dòng)物，且任選地，用BNP(77-108)肽和/或BNP(1-76)肽消耗所獲得的抗血清。
24.獲得如下雜交瘤的方法，該雜交瘤分泌抗proBNP(1-108)抗體，該抗體特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85、序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84和/或序列RAPR76S77P，基本上不識(shí)別BNP(1-76)和BNP(77-108)肽，并且能夠特異地識(shí)別人血清或血漿標(biāo)本中的循環(huán)proBNP(1-108)，在該方法中，用如權(quán)利要求16-22之一所述的肽免疫動(dòng)物，從該動(dòng)物中提取分泌免疫球蛋白的淋巴細(xì)胞，將該淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得至少一種分泌免疫球蛋白的雜交瘤。
25.一種抗proBNP(1-108)抗體，其特征在于它是通過(guò)如權(quán)利要求23所述的方法獲得的。
26.如權(quán)利要求25所述的抗proBNP(1-108)抗體，它特異地識(shí)別proBNP(1-108)的序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGSG85或序列Y70TLRAPR76S77PKMVQGS84。
27.能夠利用如權(quán)利要求24所述的方法產(chǎn)生的一種雜交瘤。
28.由如權(quán)利要求27所述的雜交瘤分泌的一種抗proBNP(1-108)單克隆抗體。
29.如權(quán)利要求28所述的抗proBNP(1-108)單克隆抗體，它由保藏于CNCM保藏號(hào)為CNCM I-3073的雜交瘤3D4分泌。
30.一種體外診斷人類(lèi)心力衰竭的方法，包括使生物標(biāo)本與如權(quán)利要求25、26、28和29任一項(xiàng)所述的抗proBNP(1-108)抗體接觸，并檢測(cè)標(biāo)本中的proBNP(1-108)。
31.一種體外診斷人類(lèi)心力衰竭的方法，包括a)使生物標(biāo)本與如權(quán)利要求25、26、28和29任一項(xiàng)所述的抗proBNP(1-108)抗體接觸，b)在允許形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下溫育該混合物，和c)任選地使用能夠與初級(jí)復(fù)合物中存在的proBNP(1-108)特異結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的檢測(cè)抗體，或者使用能夠與針對(duì)初級(jí)復(fù)合物中存在的proBNP(1-108)的抗體結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的檢測(cè)抗原，顯示形成的抗原-抗體復(fù)合物。
32.如權(quán)利要求31所述的診斷方法，它還包括步驟d)將顯示的抗原-抗體復(fù)合物的量與個(gè)體的臨床狀況相關(guān)聯(lián)。
33.一種檢測(cè)生物標(biāo)本中的proBNP(1-108)的試劑盒，其含有至少一種如權(quán)利要求25、26、28和29之一所述的抗體。
34.一種檢測(cè)生物標(biāo)本中的proBNP(1-108)的試劑盒，它含有至少一種如權(quán)利要求16-22之一所述的肽作為標(biāo)準(zhǔn)和/或?qū)φ铡?br> 35.一種檢測(cè)生物標(biāo)本中的proBNP(1-108)的試劑盒，其-在一個(gè)容器中含有至少一種如權(quán)利要求25、26、28和29之一所述的抗體；-在另外一個(gè)容器中含有至少一種如權(quán)利要求16-22之一所述的肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及心力衰竭的體外診斷。更具體而言，本發(fā)明涉及一種肽結(jié)構(gòu)域的特異性抗體，該結(jié)構(gòu)域位于proBNP(1－108)的鉸鏈區(qū)R
文檔編號(hào)C07K16/18GK1678635SQ03820838
公開(kāi)日2005年10月5日 申請(qǐng)日期2003年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月7日
發(fā)明者B·波, I·朱利亞尼, F·里尼爾 申請(qǐng)人:比奧-拉德巴斯德公司, 國(guó)家科研中心, 蒙彼利埃第一大學(xué)