專利名稱：生物體低分子衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物體低分子衍生物和由該衍生物合成高分子交聯(lián)體，該低分子衍生物是用N-羥基琥珀酸亞胺、N-羥基硫代琥珀酸亞胺或其衍生物修飾具有2個以上羧基的生物體低分子的羧基獲得的。
背景技術(shù)：
到目前為止，在生物體粘合劑和源于生物體的醫(yī)療用設(shè)備的處理(例如源于豬的心臟瓣)中使用具有人工化學(xué)合成的戊二醛等醛的交聯(lián)劑和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺等縮合劑等(例如專利文獻(xiàn)1～6、非專利文獻(xiàn)1)。
特開平7-163650號公報[專利文獻(xiàn)2]特開平9-249751號公報[專利文獻(xiàn)3]特開平10-71199號公報[專利文獻(xiàn)4]特表2000-502380號公報[專利文獻(xiàn)5]特開平8-53548號公報[專利文獻(xiàn)6]特開平8-502082號公報[非專利文獻(xiàn)1]Biomaterials，17卷，765頁(1996)發(fā)明內(nèi)容目前在醫(yī)療用設(shè)備處理等中使用的交聯(lián)劑和縮合劑主要是人工合成的非天然物質(zhì)，已經(jīng)指出其在生物體內(nèi)不代謝而對生物體表現(xiàn)出毒性。因此，限制了在醫(yī)療現(xiàn)場使用時的用途和使用量。為了解決這類問題，要求開發(fā)一種源于生物體的交聯(lián)劑。
本發(fā)明提供一種生物體低分子衍生物和通過使用該衍生物得到的高分子交聯(lián)體，該低分子衍生物是用N-羥基琥珀酸亞胺、N-羥基硫代琥珀酸亞胺或其衍生物修飾具有2個以上的羧基的生物體低分子的羧基獲得的。
即，本發(fā)明為由用N-羥基琥珀酸亞胺、N-羥基硫代琥珀酸亞胺或其衍生物修飾具有2個以上羧基的生物體低分子的羧基中至少一個以上的羧基獲得的生物低分子衍生物。該生物低分子衍生物對人體無害，因為具有2個以上反應(yīng)基(-COOH基)可以迅速反應(yīng)。
而且，本發(fā)明為由用N-羥基琥珀酸亞胺、N-羥基硫代琥珀酸亞胺或其衍生物修飾具有2個以上羧基的生物體低分子的羧基中至少一個以上的羧基獲得的生物低分子衍生物，使用該生物低分子衍生物通過交聯(lián)高分子得到的高分子交聯(lián)體。
該高分子交聯(lián)體在生物體內(nèi)使用后具有在生物體內(nèi)代謝，并經(jīng)一段期間后吸收、消失的特性，不會在體內(nèi)以異物殘留。


圖1為檸檬酸衍生物的核磁共振譜圖。
具體實施例方式
本發(fā)明使用的具有2個以上羧基的生物體低分子為在檸檬酸循環(huán)中存在的三羧酸或二羧酸低分子，例如蘋果酸、草酸一酰乙酸、檸檬酸、順烏頭酸、2-氧代戊二酸或其衍生物。
本發(fā)明的生物體低分子衍生物為將具有2個以上羧基的生物體低分子的羧基在結(jié)合使用碳化二亞胺下與細(xì)胞毒性低的N-羥基琥珀酸亞胺、N-羥基硫代琥珀酸亞胺或其衍生物反應(yīng)，從而引入活性酯基的生物體低分子衍生物。
該反應(yīng)物為相對于0.001～10重量％的生物體低分子，使用0.001～10重量％的N-羥基琥珀酸亞胺、N-羥基硫代琥珀酸亞胺或其衍生物和0.001～20重量％的碳化二亞胺(EDC)，在0～100℃的反映溫度下選擇適宜的條件反應(yīng)1～48小時得到。
另外，作為碳化二亞胺能使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺·鹽酸鹽(EDC)、1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉代乙基)碳化二亞胺·甲硫(meto)-p-甲苯磺酸鹽、二環(huán)己基碳化二亞胺。另外，反應(yīng)溶劑能使用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)。
圖1為在EDC存在下通過檸檬酸和N-羥基琥珀酸亞胺反應(yīng)得到的檸檬酸衍生物的核磁共振譜圖。a的峰表示檸檬酸的亞甲基質(zhì)子，b的峰為源自琥珀酸亞胺的亞甲基質(zhì)子。殘余的2個峰為溶劑(DMSO)。
制備交聯(lián)體時使用的蛋白質(zhì)含有膠原(不依存數(shù)10種類型)、端膠原(Atelocollagen)(不依存數(shù)10種類型)、堿可溶性膠原(不依存于數(shù)10種類型)、明膠、角蛋白、血清清蛋白、卵清蛋白、血紅蛋白、核黃素和球蛋白、血纖維蛋白原等具有氨基的高分子。這些蛋白質(zhì)不依存已知生物。
制備交聯(lián)體時使用的葡萄糖胺聚糖含有硫酸軟骨素、硫酸皮膚素(dermatan)、透明質(zhì)酸、類肝素磺酸酯、肝素、硫酸角質(zhì)素或其衍生物。這些葡萄糖胺聚糖不依存于分子量和已知的生物。
而且，作為其他高分子能含有殼聚糖(不依存脫乙?；群头肿恿?、聚氨基酸(不依存于氨基酸的種類和分子量)、多元醇(不依存于種類和分子量)。
生物體低分子衍生物和高分子的交聯(lián)反應(yīng)為將0.1～50重量％的高分子和0.01～50重量％的生物體低分子衍生物優(yōu)選在30～50℃下反應(yīng)。另外，在兩者混合時，為了容易得到均一的交聯(lián)體優(yōu)選以適宜濃度的溶液將兩者混合。另外，制備該溶液的溶劑除了蒸餾水還能使用生理鹽水、碳酸氫鈉、硼酸、磷酸等的緩沖液、有機溶劑(DMF、DMSO、乙醇)等沒有毒性的溶劑。
(實施例)實施例1-1室溫下在檸檬酸的DMF溶液(5重量％)中加入3.2當(dāng)量分N-羥基琥珀酸亞胺和3.1當(dāng)量分的EDC，攪拌24小時。接著僅減壓蒸去反應(yīng)溶液中的有機溶劑DMF。使用丙酮-正己烷的洗脫劑根據(jù)硅膠柱色層分離法精制得到的殘留物，合成用N-羥基琥珀酸亞胺修飾檸檬酸的3個羧基獲得的衍生物。
實施例1-2以下說明使用實施例1-1中合成的檸檬酸衍生物，通過下述反應(yīng)得到的膠原膠的合成。
(化1)
將24μL的合成的檸檬酸衍生物溶解在976μL的二甲基亞砜溶液中，從該溶液中取出100μL，加入到400μL的1.25重量％的II型膠原磷酸緩沖液中，攪拌之。在室溫下靜置24小時，合成交聯(lián)劑濃度為0.4～40mM的膠原膠。分別測定膠重量后，用凍干機干燥后，再次測定膠重量、核查膠的含水率。分別將膠的含水率列于表1中。
(表1)

實施例2-1室溫下在2-氧代戊二酸的DMF溶液(5重量％)中加入2.2當(dāng)量分N-羥基琥珀酸亞胺和2.1當(dāng)量分的EDC，攪拌24小時。接著僅減壓蒸去反應(yīng)溶液中的有機溶劑DMF。使用丙酮-正己烷的洗脫劑根據(jù)硅膠柱色層分離法精制得到的殘留物，合成用N-羥基琥珀酸亞胺修飾2-氧代戊二酸的2個羧基獲得的衍生物。
實施例2-2以下說明使用實施例2-1中合成的2-氧代戊二酸衍生物，通過下述反應(yīng)得到的膠原膠的合成。
(化2)

將14μL的合成的2-氧代戊二酸衍生物溶解在986μL的二甲基亞砜溶液中，從該溶液中取出100μL，加入到400μL的1.2 5重量％的II型膠原磷酸緩沖液中，攪拌之。在室溫下靜置24小時，合成交聯(lián)劑濃度為0.6～10mM的膠原膠。分別測定膠重量后，用凍干機干燥后，再次測定膠重量，核查膠的含水率。分別將膠的含水率列于表2中。
(表2)

實施例3-1室溫下在順烏頭酸的DMF溶液(5重量％)中加入3.2當(dāng)量分N-羥基琥珀酸亞胺和3.1當(dāng)量分的EDC，攪拌24小時。接著僅減壓蒸去反應(yīng)溶液中的有機溶劑DMF。使用丙酮-正己烷的洗脫劑根據(jù)硅膠柱色層分離法精制得到的殘留物，合成用N-羥基琥珀酸亞胺修飾順烏頭酸的3個羧基獲得的衍生物。
實施例3-2以下說明使用實施例3-1中合成的順烏頭酸衍生物，通過下述反應(yīng)得到的膠原膠的合成。
(化3)

將46μL的合成的順烏頭酸衍生物溶解在954μL的二甲基亞砜溶液中，從該溶液中取出100μL，加入到400μL的1.25重量％的II型膠原磷酸緩沖液中，攪拌之。在室溫下靜置24小時，合成交聯(lián)劑濃度為1～30mM的膠原膠。分別測定膠重量后，用凍干機干燥后，再次測定膠重量，核查膠的含水率。分別將膠的含水率列于表3中。
(表3)

實施例4-1室溫下在蘋果酸的DMF溶液(5重量％)中加入2.2當(dāng)量分N-羥基琥珀酸亞胺和2.1當(dāng)量分的EDC，攪拌24小時。接著僅減壓蒸去反應(yīng)溶液中的有機溶劑DMF。使用丙酮-正己烷的洗脫劑根據(jù)硅膠柱色層分離法精制得到的殘留物，合成用N-羥基琥珀酸亞胺修飾蘋果酸的2個羧基獲得的衍生物。
以下說明使用實施例4-1中合成的蘋果酸衍生物，通過下述反應(yīng)得到的膠原膠的合成。
(化4)

將32μL的合成的蘋果酸衍生物溶解在968μL的二甲基亞砜溶液中，從該溶液中取出100μL，加入到400μL的1.25重量％的II型膠原磷酸緩沖液中，攪拌之。在室溫下靜置24小時，合成交聯(lián)劑濃度為3～50mM的膠原膠。分別測定膠重量后，用凍干機干燥后，再次測定膠重量，核查膠的含水率。分別將膠的含水率列于表4中。
(表4)

實施例5-1室溫下在草酰乙酸的DMF溶液(5重量％)中加入2.2當(dāng)量分N-羥基琥珀酸亞胺和2.1當(dāng)量分的EDC，攪拌24小時。接著僅減壓蒸去反應(yīng)溶液中的有機溶劑DMF。使用丙酮-正己烷的洗脫劑根據(jù)硅膠柱色層分離法精制得到的殘留物，合成用N-羥基琥珀酸亞胺修飾草酰乙酸的2個羧基獲得的衍生物。
實施例5-2以下說明使用實施例5-1中合成的草酰乙酸衍生物，通過下述反應(yīng)得到的膠原膠的合成。
(化5) 將16μL的合成的草酰乙酸衍生物溶解在984μL的二甲基亞砜溶液中，從該溶液中取出100μL，加入到400μL的1.25重量％的II型膠原磷酸緩沖液中，攪拌之。在室溫下靜置24小時，合成交聯(lián)劑濃度為2～40mM的膠原膠。分別測定膠重量后，用凍干機干燥后，再次測定膠重量，核查膠的含水率。分別將膠的含水率列于表5中。
(表5)

工業(yè)實用性如上所述膠化的生物體高分子能直接在患處進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，適用于生物體粘合劑、止血劑、血管栓塞材料、動脈瘤密封劑中的任何一種。而且，通過在一次交聯(lián)反應(yīng)后使用，還可以適用于愈合抑制劑、用于組織再生的擔(dān)架材料、藥物載體。
權(quán)利要求
1.一種生物體低分子衍生物，其特征在于用N-羥基琥珀酸亞胺、N-羥基硫代琥珀酸亞胺或其衍生物修飾具有2個以上羧基的生物體低分子的羧基中至少一個以上羧基。
2.如權(quán)利要求1所述的生物體低分子衍生物，其特征在于具有2個以上的羧基的生物體低分子為在檸檬酸循環(huán)中存在的低分子及其衍生物。
3.如權(quán)利要求1所述的生物體低分子衍生物，其特征在于具有2個以上的羧基的生物體低分子為蘋果酸、草酰乙酸、檸檬酸、順烏頭酸、2-氧代戊二酸或其衍生物。
4.一種使用權(quán)利要求1所述的生物體低分子衍生物通過交聯(lián)高分子獲得的高分子交聯(lián)體。
5.一種如權(quán)利要求4所述的高分子交聯(lián)體，其特征在于高分子為蛋白質(zhì)、葡萄糖胺聚糖、殼聚糖、聚氨基酸、多元醇或其2種或2種以上的混合物。
6.一種如權(quán)利要求4所述的高分子交聯(lián)體，其特征在于高分子為硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質(zhì)酸、類肝素磺酸酯、肝素、硫酸角質(zhì)素或其衍生物制得的葡萄糖胺聚糖。
7.一種如權(quán)利要求4所述的高分子交聯(lián)體，其特征在于高分子為膠原、端膠原、堿可溶性膠原、明膠、角蛋白、血清清蛋白、卵清蛋白、血紅蛋白、核黃素和球蛋白、血纖維蛋白原或其衍生物制得的蛋白質(zhì)。
全文摘要
到目前為止，在生物體用粘合劑和心臟瓣等醫(yī)療用設(shè)備處理中使用的交聯(lián)劑和縮合劑因其是人工合成的非天然物，在生物體內(nèi)不代謝而對生物體表現(xiàn)出毒性。因此，限制了在醫(yī)療現(xiàn)場使用時的用途和用量。本發(fā)明提供一種使用用N－羥基琥珀酸亞胺、N－羥基硫代琥珀酸亞胺或其衍生物修飾生物體低分子羧基獲得的生物低分子衍生物和由該衍生物交聯(lián)各種高分子獲得的高分子交聯(lián)體。
文檔編號C07D207/408GK1681780SQ03821540
公開日2005年10月12日 申請日期2003年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月11日
發(fā)明者田口哲志, 小林尚俊, 田中順三, 齊藤浩史 申請人:獨立行政法人物質(zhì)·材料研究機構(gòu), 古內(nèi)化學(xué)株式會社