專利名稱：用作轉(zhuǎn)化生長因子β蛋白質(zhì)的溶解賦形劑的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及溶解蛋白質(zhì)的賦形劑和試劑。特別地，本發(fā)明涉及在多種生物化學(xué)的條件下保持或增加蛋白質(zhì)溶解度的組合物和方法。本發(fā)明也涉及用于使已經(jīng)從溶液沉淀出來的蛋白質(zhì)再溶解的方法和組合物。在特別的方面中，本發(fā)明涉及保持或增加屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族的蛋白質(zhì)溶解度的組合物和方法。
背景技術(shù)：
TGF-β超家族由存在于脊椎動物和無脊椎動物中的25種以上不同的信號蛋白質(zhì)組成。TGF-β超家族的蛋白質(zhì)成員影響各種各樣的生物進(jìn)程，包括細(xì)胞生長、細(xì)胞生長抑制、組織修復(fù)、細(xì)胞分化、細(xì)胞程序性死亡、背腹側(cè)胚胎體軸的形成，和胞外基質(zhì)成分的分泌(Ebendal等.1998，Journal of Neuroscience 51139)。因此，TGF-β超家族的成員提供用于開發(fā)藥物激動劑和拮抗劑的有吸引力的標(biāo)靶，從而可用來治療受一個(gè)或多個(gè)超家族成員活性影響的多種人類疾病或病癥。例如，TGF-β超家族成員的拮抗劑和激動劑已經(jīng)實(shí)際應(yīng)用于組織修復(fù)和再生的范圍，以及多潛能干細(xì)胞分化成為優(yōu)選譜系的細(xì)胞或組織的范圍內(nèi)。此外，TGF-β超家族成員也提供用于基因治療的標(biāo)靶。已經(jīng)描述了該家族許多成員的克隆和表達(dá)。(參見例如美國專利號4,877,864；5,108,922；5,013,649；5,116,738；5,106,748；5,187,076；5,141,905；5,688,678；5,661,007；5,637,480；5,639,638；5,658,882；和5,635,372)。
在TGF-β超家族的成員中有骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP)。起初確定BMPs為軟骨和骨形成的調(diào)節(jié)子。隨后的工作已經(jīng)表明BMPs，類似于其他的TGF-β超家族成員，在許多不同的生物進(jìn)程，包括胚胎發(fā)生和多種器官和組織的形態(tài)發(fā)生中起作用。另外，BMPs在幾個(gè)不同的細(xì)胞類型，例如造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、和神經(jīng)元細(xì)胞的生長、分化和趨化性中發(fā)揮作用(Reddi，1998，Nature Biotechnology 16247；Ebendal，同上)。
BMPs，類似于TGF-β超家族的其他成員，在不同的動物種屬之間是高度保守的。例如成人BMP-2，與小鼠和大鼠的BMP-2是完全同源的。BMP-2的生物活性形式是由二硫化物連接羧基端114個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)域組成的同源二聚體。BMP-2通過結(jié)合由異低聚物組成的細(xì)胞表面受體而對靶細(xì)胞施加其影響。該受體是2個(gè)絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的復(fù)合物(參見Ebendal，同上；Reddi同上)。
已經(jīng)克隆出BMP-2的人同系物，Wozney，1989，Prog.GrowthFactor Res.1(4)267。重組的人BMP-2可以是表達(dá)全長BMP-2中第266-396位或第283-396位氨基酸的片段。這些片段形成同源二聚體和異二聚體而產(chǎn)生6種不同的同工型。6種二聚的同工型是指＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283、Q283/Q283、＜Q283/T266、Q283/T266，和T266/T266，并且可通過陽離子交換層析來分離(
圖1)。號碼283或266是指全長rhBMP-2中N-末端氨基酸的位置。字母是指N-末端的氨基酸(即Q或T)，而″＜″是指283位的谷氨酰胺(Q)環(huán)化形成焦谷氨酸。因此，例如＜Q283/Q283是指rhBMP-2二硫化物連接的二聚體，其中二聚體的一個(gè)單體具有環(huán)化的N-末端谷氨酰胺，而另一個(gè)單體沒有環(huán)化。
rhBMP-2在需要骨再生時(shí)有一些臨床應(yīng)用。因此，rhBMP-2可用于脊柱融合術(shù)以治療退化的椎間盤(disk)疾病。rhBMP-2也可用來治療長骨骨折。它還可用來治療缺乏足夠的骨質(zhì)量以支持植入物的需要假牙的個(gè)體。
保持蛋白質(zhì)的溶解度對于保持蛋白質(zhì)的生物有效性和/或活性經(jīng)常是很重要的。蛋白質(zhì)溶解度依賴于多種因素。這些因素包括環(huán)境條件，例如pH、鹽濃度、溫度和溶劑的化學(xué)特性，以及目標(biāo)蛋白質(zhì)的固有特性，例如蛋白質(zhì)的初級氨基酸序列和結(jié)構(gòu)構(gòu)象。經(jīng)常地，涉及目標(biāo)蛋白質(zhì)的生物醫(yī)藥和/或藥理學(xué)的應(yīng)用需要的環(huán)境條件不能優(yōu)化目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解度。結(jié)果蛋白質(zhì)會沉淀，從而限制目標(biāo)蛋白質(zhì)的生物有效性和/或活性。因此本發(fā)明的一個(gè)目的是增加目標(biāo)蛋白質(zhì)，例如TGF-β超家族成員的溶解度，并且由此增加其作為藥物組合物或研究試劑的生物有效性和/或活性。
本發(fā)明通過證明rhBMP-2的多種肽片段增加蛋白質(zhì)，例如TGF-β超家族成員的溶解度和/或抑制其沉淀，來達(dá)到增加蛋白質(zhì)溶解度，或抑制蛋白質(zhì)沉淀的目的。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及重組的人BMP-2(rhBMP-2)的T266同工型N-末端17個(gè)氨基酸突出端(extension)及其片段增加蛋白質(zhì)，例如rhBMP-2的溶解度和/或抑制其沉淀的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明也涉及rhBMP2的T266同工型N-末端17個(gè)氨基酸的突出端可使已經(jīng)沉淀析出溶液的蛋白質(zhì)再溶解的發(fā)現(xiàn)。因此，本發(fā)明可用作在藥物組合物或研究試劑中保持或增加目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解度的賦形劑。本發(fā)明也可用于使已經(jīng)沉淀析出溶液的蛋白質(zhì)再溶解。
因此本發(fā)明涉及包括rhBMP-2的T266同工型N-末端17個(gè)氨基酸突出端或其片段的組合物，其抑制目標(biāo)蛋白質(zhì)從溶液沉淀出來，和/或增加其溶解度。在一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)蛋白質(zhì)是TGF-β超家族的成員，例如BMP-2、TGF-β、BMP-12、BMP-13、BMP-6。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)蛋白質(zhì)是rhBMP-2同工型的任何一種，例如Q283/＜Q283、＜Q283/Q283和Q283/Q283。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括編碼rhBMP-2的T266同工型N-末端17個(gè)氨基酸突出端或其片段的DNA序列(SEQ ID NO2)的組合物，其抑制目標(biāo)蛋白質(zhì)從溶液沉淀出來，和/或增加其溶解度。在一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)蛋白質(zhì)是TGF-β超家族的成員，例如BMP-2、TGF-β、BMP-12、BMP-13、BMP-6。在另外的實(shí)施方案中，目標(biāo)蛋白質(zhì)是rhBMP-2同工型的任何一種，例如Q283/＜Q283、＜Q283/Q283和Q283/Q283。
本發(fā)明也涉及抑制目標(biāo)蛋白質(zhì)從溶液沉淀出來和/或增加目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解度的方法。所述的方法包括將目標(biāo)蛋白質(zhì)與足夠量的抑制所述蛋白質(zhì)沉淀的肽或其片段接觸，其中所述的肽包括Thr-Phe-Gly-His-Asp-Gly-Lys-Gly-His-Pro-Leu-His-Lys-Arg-Glu-Lys-Arg(SEQ IDNO1)。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，肽是由包括ACG TTT GGC CACGAC GGC AAA GGC CAC CCC CTG CAC AAA AGA GAG AAAAGA(SEQ ID NO2)的DNA序列編碼的，該肽以足夠的量抑制所述蛋白質(zhì)的沉淀。該目標(biāo)蛋白質(zhì)可以是任何蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)蛋白質(zhì)是TGF-β超家族的成員，例如BMP-2、TGF-β、BMP-12、BMP-13、BMP-6。在另外的實(shí)施方案中，目標(biāo)蛋白質(zhì)是由Q283或＜Q283組成的rhBMP-2同工型亞基的至少一種。
本發(fā)明另外的目的和優(yōu)點(diǎn)部分地將在下列的說明書中闡明，并且部分地將明顯從該說明書，或通過本發(fā)明的實(shí)施加以闡明。本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)可通過在所附的權(quán)利要求中特別指出的要素和組合來實(shí)現(xiàn)和獲得。
可以理解上述的一般說明及其后的發(fā)明詳述都只是例證性和說明性的，而不是如權(quán)利要求來限制本發(fā)明。
結(jié)合并組成本說明書的一部分的附圖，可用來和本說明書一起解釋本發(fā)明的原理。
附圖簡述圖1的色譜圖表明rhBMP-2的6種同工型從陽離子交換柱洗脫出來的洗脫圖譜。
圖2顯示rhBMP2同工型在5mM硫酸鈉中的溶解度。
圖3顯示rhBMP-2同工型Q283/Q283與rhBMP-2同工型T266/T266的再溶解。
圖4顯示rhBMP-2同工型Q283/Q283與rhBMP-2同工型＜Q283/T266的再溶解。
圖5顯示＜Q283/＜Q283與來源于rhBMP-2的N-末端延伸形式(266-396)的合成肽的再溶解。
實(shí)施方案的說明本發(fā)明基于來源于rhBMP-2的肽及其片段增加rhBMP-2的多種同工型的溶解度的意外發(fā)現(xiàn)。該肽包括rhBMP-2(SEQ ID NO1)的氨基酸第266-282位。片段是SEQ ID NO1的至少4個(gè)氨基酸、至少6個(gè)氨基酸、至少8個(gè)氨基酸、至少10個(gè)氨基酸、至少12個(gè)氨基酸、至少14個(gè)氨基酸、至少16個(gè)氨基酸。該肽亦稱為rhBMP T266同工型的N-末端17個(gè)氨基酸突出端。
存在6種rhBMP-2的二聚同工型。6種同工型包括＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283、Q283/Q283、＜Q283/T266、Q283/T266和T266/T266。T266/T266的二聚同工型在存在硫酸鈉時(shí)是高度可溶的，然而與其他同工型相比其生物活性是有限的。當(dāng)透析進(jìn)入無鹽或低鹽緩沖液時(shí)，T266/T266同工型保持為溶解的，同時(shí)在透析除去鹽期間，包含＜Q283或Q283同工型亞基的二聚體沉淀出來。Q283和＜Q283同工型亞基在N-末端上的氨基酸第283位是截短的。因此Q283同工型亞基包含BMP-2的氨基酸第283-396位，其是存在于體內(nèi)的同工型。283同工型亞基不包含T266同工型亞基的17個(gè)N-末端氨基酸突出端，即位于T266同工型亞基上的氨基酸第266-282位。
當(dāng)T266同工型中存在17個(gè)氨基酸突出端時(shí)，它賦予rhBMP-2增加的溶解度。此外，T266同工型的17個(gè)氨基酸的N-末端可使沉淀的rhBMP-2同工型再溶解。令人驚訝地，來源于rhBMP-2的T266同工型的第266-282位N-末端延伸的片段也賦予rhBMP-2增加的溶解度并且抑制沉淀。
因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供增加用作藥物組合物或研究試劑的更多活性形式的rhBMP-2的溶解度，抑制其沉淀，使其再溶解的方法。本發(fā)明另外的實(shí)施方案提供包括來源于rhBMP的T266同工型的肽的組合物，其中所述的肽增加目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解度，和/或抑制目標(biāo)蛋白質(zhì)的沉淀，和/或使已經(jīng)從溶液沉淀析出的目標(biāo)蛋白質(zhì)再溶解。在這種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包括rhBMP-2(SEQ ID NO1)的T266同工型的N-末端17個(gè)氨基酸突出端。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明包含SEQ ID NO1的片段，包括但不限于，例如SEQ ID NO1的氨基酸第6-17位，SEQ ID NO1的第11-17位氨基酸，或SEQ ID NO1的氨基酸第14-17位，當(dāng)其接觸目標(biāo)白質(zhì)時(shí)，增加目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解度和/或抑制目標(biāo)蛋白質(zhì)的沉淀和/或使已經(jīng)從溶液沉淀出來的目標(biāo)蛋白質(zhì)再溶解。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解為了確定SEQ ID NO1的片段增加目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解度，或抑制其沉淀，或使目標(biāo)蛋白質(zhì)再溶解，熟練的技術(shù)人員將比較在使目標(biāo)蛋白質(zhì)與SEQ ID NO1的片段接觸前后，或有和沒有使兩者接觸的情況下目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解度、或沉淀、或再溶解。
在一個(gè)實(shí)施方案中，定義溶解度為，當(dāng)在路徑長度為1厘米的石英比色杯中通過分光光度計(jì)在波長為340納米處測量吸光度為≤0.1。分光光度計(jì)可例如是日立(Hitachi)U-2000。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)由SEQ ID NO1編碼的肽或由SEQID NO1編碼的肽的片段與目標(biāo)蛋白質(zhì)接觸時(shí)，導(dǎo)致所述的目標(biāo)蛋白質(zhì)變得更易溶解，和/或較小可能沉淀出來，和/或如果所述的蛋白質(zhì)已經(jīng)沉淀出來，則使其再溶解。
在本發(fā)明的備選實(shí)施方案中，當(dāng)由包含SEQ ID NO2的DNA序列編碼的肽，或由包含SEQ ID NO2的DNA序列編碼的肽的片段與目標(biāo)蛋白質(zhì)接觸時(shí)，導(dǎo)致所述的目標(biāo)蛋白質(zhì)變得更易溶解，和/或較小可能沉淀出來，和/或如果所述的蛋白質(zhì)已經(jīng)沉淀出來，使其再溶解。
由于已知的遺傳密碼簡并性，一個(gè)以上的密碼子可編碼相同的氨基酸，不同于SEQ ID NO2中所示的序列的DNA序列，可能仍然編碼具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽。這種變化的DNA序列可能由沉默突變產(chǎn)生(例如，在PCR擴(kuò)增期間發(fā)生)，或可能是天然序列的特意誘變的產(chǎn)物。
因此本發(fā)明提供編碼本發(fā)明多肽的分離的DNA序列，選自(a)包含SEQ ID NO2的核苷酸序列的DNA；(b)編碼SEQ ID NO1的多肽的DNA；(c)能夠與(a)或(b)的DNA在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且編碼具有本發(fā)明肽的功能特性的肽的DNA(即，增加目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解度或使目標(biāo)蛋白質(zhì)再溶解)；(d)能夠與(a)或(b)的DNA在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并且編碼具有本發(fā)明肽的功能特性的肽的DNA，以及(e)與(a)、(b)、(c)、或(d)所限定的DNA具有遺傳密碼簡并性，并且編碼具有本發(fā)明肽的功能特性的肽的DNA。當(dāng)然，本發(fā)明包括由這種DNA序列編碼的多肽。
如在此所使用的，中等嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件可由本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員根據(jù)例如，DNA的長度而容易地確定。Sambrook等人闡明了基本的條件，Molecular CloningA Laboratory Manual，2ed.Vol.1，pp.1.101-104，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)并且包括使用硝酸纖維素濾膜的預(yù)洗滌溶液，5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)、雜交條件為大約50％甲酰胺、6×SSC，在大約42℃(或其他類似的雜交溶液，例如Stark′s溶液，在大約50％甲酰胺中，在42℃)，而洗滌條件為大約60℃，0.5×SSC，0.1％SDS。熟練的技術(shù)人員也可根據(jù)例如，DNA的長度容易地確定高嚴(yán)謹(jǐn)條件。一般地，定義這種條件為如上的雜交條件，并且在大約68℃，用0.2×SSC，0.1％SDS洗滌。熟練的技術(shù)人員可認(rèn)識到溫度和洗液的鹽濃度可根據(jù)例如探針長度等因素，按照需要進(jìn)行調(diào)節(jié)。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子也包括與SEQ ID NO2至少80％相同的核苷酸序列。還預(yù)期的實(shí)施方案是核酸分子包括與SEQID NO2至少90％相同、至少95％相同、至少98％相同、至少99％相同、或至少99.9％相同的序列。
可通過目測檢查和數(shù)學(xué)計(jì)算確定同一性百分?jǐn)?shù)。備選地，可利用由Devereux等人(Nucl.Acids Res.12387，1984)描述，并且可以從威斯康星大學(xué)遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(UWGCG)獲得版本6.0的GAP計(jì)算機(jī)程序，比較序列信息來確定2個(gè)核酸序列的同一性百分?jǐn)?shù)。用于GAP程序的優(yōu)選缺省參數(shù)包括(1)核苷酸的一元比較矩陣(包含值為1為相同，而值為0為不相同)，以及Gribskov和Burgess的加權(quán)比較矩陣，Nucl.Acids Res.146745，1986，如Schwartz和Dayhoff編輯的，Atlas of Protein Sequence and Structure，National Biomedical ResearchFoundation，pp.353-358，1979所描述的；(2)每個(gè)缺口的罰分為3.0，每個(gè)缺口中各個(gè)標(biāo)記附加0.10的罰分；以及(3)末端缺口沒有罰分。也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員用于序列比較的其他程序。
本發(fā)明也涉及使得目標(biāo)蛋白質(zhì)更易溶解，或較小可能從溶液沉淀出來的方法，所述的方法包括通過將編碼rhBMP(SEQ ID NO2)的T266同工型N末端17個(gè)氨基酸的DNA序列、或其片段，與編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA序列而遺傳工程化的所述的蛋白質(zhì)退火。編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA序列可以是當(dāng)被翻譯時(shí)產(chǎn)生所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的任何DNA序列(例如基因組DNA、cDNA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的DNA序列(SEQ ID NO2)或其片段與所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基(N)末端退火。在另外的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的DNA序列(SEQ ID NO2)或其片段與所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的羧基(C)末端退火?？蓪⑴cSEQ ID NO2或其片段退火的編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA工程化到本領(lǐng)域已知的任何載體或質(zhì)粒中。表達(dá)載體和克隆載體如下有描述，例如CloningVectorsA Laboratory Manual(Powells等.1985，Supp.1987)和Molecular Cloning A Laboratory Manual第二版(Sambrook等.1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)備選地，可利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley andSons，New York，1989)擴(kuò)增編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA序列。
可通過用與SEQ ID NO2或其片段退火的編碼所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的所有或部分DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生與SEQ ID NO2退火的目標(biāo)蛋白質(zhì)。分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解任何的各種表達(dá)系統(tǒng)都可用來表達(dá)編碼與SEQ ID NO2或其片段退火的目標(biāo)蛋白質(zhì)的DNA。所使用的具體的宿主細(xì)胞對本發(fā)明不是關(guān)鍵的。宿主細(xì)胞的實(shí)例包括，但不限于原核細(xì)胞，例如大腸桿菌，或真核細(xì)胞，例如COS1、CHO、NIH3T3、草地夜蛾(S.Frugiperda)，或啤酒酵母(S.cerevisiae)。這種細(xì)胞可以從各種各樣的來源容易地獲得(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockland，Md.)轉(zhuǎn)染的方法和表達(dá)質(zhì)粒或載體的選擇可能取決于所選擇的宿主系統(tǒng)。例如在上述Ausubel中描述了轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的方法。
本發(fā)明也涉及由SEQ ID NO1編碼的肽或其片段，其中在所述肽或其片段內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸已經(jīng)通過突變、缺失或用不同的氨基酸取代而改變，但不改變該肽的活性，即，所述改變的肽仍然增加目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解度，或抑制其沉淀或備選地使沉淀的目標(biāo)蛋白質(zhì)再溶解。在另外的方面，本發(fā)明涉及由SEQ ID NO1編碼的肽或其片段，其中至少一個(gè)氨基酸已經(jīng)加到C-末端上。在另外的方面，本發(fā)明涉及由SEQ IDNO1編碼的肽或其片段，其中至少一個(gè)氨基酸已經(jīng)加到N-末端上。在另一實(shí)施方案中，肽或其片段中的突變，導(dǎo)致氨基酸取代，其中所述的取代是保守取代。保守取代指用具有相似化學(xué)特性，例如極性、疏水性、電荷的其他氨基酸取代一個(gè)氨基酸。保守取代的實(shí)例包括絲氨酸對蘇氨酸的取代，或精氨酸對賴氨酸的取代，或纈氨酸對丙氨酸的取代。熟練的技術(shù)人員將理解許多保守取代都是可能的。在特別的實(shí)施方案中，改變的肽與由SEQ ID NO1編碼的肽是至少70％相同、80％相同、90％相同或99％相同的。
可使用本領(lǐng)域已知的用于誘變的任何技術(shù)，以產(chǎn)生由SEQ ID NO1編碼的肽的突變體，尤其包括體外定點(diǎn)誘變(Hutchinson等，(1978)Biol Chem.2536551；Zoller and Smith，(1984)DNA，3479-488；Oliphant等，(1986)Gene 44177；Hutchinson等，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83710；Huygen等，(1996)Nature Medicine，2(8)893-898)以及使用TAB接頭(Pharmacia)。PCR技術(shù)可用于定點(diǎn)誘變(Higuchi，1989，″Using PCR to Engineer DNA″，in PCRTechnologyPrinciples and Applications for DNA Amplification，H.Erlich，ed.，Stockton Press，Chapter 6，pp.61-70)。
目標(biāo)蛋白質(zhì)可以是任何蛋白質(zhì)。本發(fā)明的一個(gè)方面中，目標(biāo)蛋白質(zhì)是BMP-2或rhBMP-2。在另外的方面，目標(biāo)蛋白質(zhì)是rhBMP-2的至少一種同工型亞基，例如＜Q283和Q283。rhBMP的同工型亞基可以單體或多聚體，例如二聚體存在。在另一方面，目標(biāo)蛋白質(zhì)是共有BMP-2的序列和/或結(jié)構(gòu)同源性的TGF-β超家族的任何成員，例如TGF-β、BMP-12、BMP-6、BMP-13。
本發(fā)明也提供包括由SEQ ID NO1編碼的肽或其片段，例如SEQID NO1的氨基酸第6-17位、SEQ ID NO1的第11-17位氨基酸、或SEQID NO1的氨基酸第14-17位，和生物學(xué)活性分子的藥物組合物，其中所述的由SEQ ID NO1編碼的肽或其所述的片段增加所述生物學(xué)活性分子和載體的溶解度，和/或抑制其沉淀，和/或使其再溶解。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物學(xué)活性分子是蛋白質(zhì)或肽。因此，生物學(xué)活性分子可以是TGF-β超家族的成員，例如TGF-β、BMP-12、BMP-6、BMP-13，或衍生自TGF-β超家族的成員，例如TGF-β超家族成員的肽片段。該蛋白質(zhì)可以是例如，BMP-2或rhBMP-2。備選地，該蛋白質(zhì)或肽可以是rhBMP-2的同工型亞基，例如＜Q283和Q283。所述的同工型亞基可以是單體或多聚體，例如二聚體。載體可以是本領(lǐng)域已知的任何合適的載體。例如但不限于，該載體可以是可吸收的膠原海綿(ACS)。
本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的片段的肽，包括例如，SEQ ID NO1的氨基酸第6-17位、SEQ ID NO1的第11-17位氨基酸、或SEQ ID NO1的氨基酸第14-17位?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的肽合成的任何方法產(chǎn)生所述的肽或其片段。例如但不限于，可使用固相肽合成來產(chǎn)生本發(fā)明的組合物。例如這種方法由Steward和Young描述(SolidPhase Peptide Synthesis(Freeman and Co.，San Francisco，1969)。
可利用重組DNA技術(shù)制備由SEQ ID NO1編碼的肽或其片段。參見例如，在Sambrook等人.1990，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY中所描述的技術(shù)。原核(例如，大腸桿菌)或真核細(xì)胞(例如，Cos細(xì)胞、CHO細(xì)胞)可用于表達(dá)本發(fā)明的重組肽或其片段。備選地，利用苜蓿丫紋夜蛾(Autographa californica)核多角體病病毒(AcNPV)的昆蟲系統(tǒng)可用于表達(dá)本發(fā)明的肽或其片段。重組的昆蟲病毒可在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞中生長。
本發(fā)明的肽或其片段，可以表達(dá)融合蛋白質(zhì)。融合蛋白質(zhì)提供更大穩(wěn)定性和便于純化該肽或其片段的優(yōu)點(diǎn)。例如但不限于，該肽或其片段可表示為GST融合肽或His標(biāo)記的融合肽。優(yōu)選地，該融合標(biāo)記可被切割，從而可以在純化步驟后除去該標(biāo)記。
本發(fā)明也涉及將藥物組合物遞送到需要治療疾病或病癥的哺乳動物的方法。該藥物組合物包括生物學(xué)活性分子和包含SEQ ID NO1或其片段的肽。該方法包括將藥物組合物施用于所述的哺乳動物以治療所述的病癥。該生物學(xué)活性分子可以是例如，TGF-β超家族的任何成員或當(dāng)與包含SEQ ID NO1或其片段的肽接觸時(shí)，和未與包含SEQ ID NO1或其片段的肽接觸的相同蛋白質(zhì)相比，變得更易溶解、或再溶解的其他蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物學(xué)活性分子是BMP-2或rhBMP-2。
本發(fā)明的方法可用于治療需要施用生物學(xué)活性分子的病癥，其中當(dāng)所述的生物學(xué)活性分子與包含SEQ ID NO1或其片段的肽接觸時(shí)，比未接觸的活性分子是更易溶解的。本發(fā)明的方法可用于治療需要施用生物學(xué)活性分子的病癥，其中當(dāng)所述的生物學(xué)活性分子與包含SEQ IDNO1或其片段的肽接觸時(shí)是再溶解的。在一個(gè)實(shí)施方案中，待治療的病癥需要骨的再生，例如脊柱融合術(shù)或長骨骨折，以及需要生物學(xué)活性分子即，BMP-2或rhBMP-2或rhBMP-2的同工型亞基。
哺乳動物可以是任何哺乳動物，包括但不限于狗、貓、大鼠、小鼠、靈長類、家畜，例如牛、山羊、豬或綿羊。在一個(gè)實(shí)施方案中，該哺乳動物是人。
本發(fā)明的方法可在不防礙SEQ ID NO1的肽或其片段的活性的任何生物化學(xué)藥品和物理?xiàng)l件下實(shí)施。例如但不限于，本發(fā)明的方法可在溫度為20℃和pH為4.5時(shí)實(shí)施，其中該肽的濃度過量于目標(biāo)蛋白質(zhì)的10-20倍摩爾。
本領(lǐng)域中已知的任何方法均可用于確定本發(fā)明的方法是否導(dǎo)致目標(biāo)蛋白質(zhì)溶解度的增加，或?qū)е履繕?biāo)蛋白質(zhì)的再溶解。例如但不限于，測量包含目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶液的吸光度和/或光散射可用于確定本發(fā)明的方法是否增加目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解度或再溶解目標(biāo)蛋白質(zhì)?？稍趯⒛繕?biāo)蛋白質(zhì)與包含SEQ ID NO1或其片段的肽接觸前后進(jìn)行測量。
本發(fā)明的方法可在＞0℃和＜65℃的溫度范圍內(nèi)實(shí)施。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法在20℃的溫度實(shí)施。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法在4℃的溫度實(shí)施。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法在37℃的溫度實(shí)施。
本發(fā)明的方法可在任何pH實(shí)施，只要和未與包含SEQ ID NO1或其片段的肽接觸的所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解度相比，本方法導(dǎo)致目標(biāo)蛋白質(zhì)與包含SEQ ID NO1或其片段的肽接觸時(shí)，其溶解度增加。備選地，本發(fā)明的方法可在當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)與包含SEQ ID NO1或其片段的肽接觸時(shí)，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白質(zhì)再溶解的pH下實(shí)施。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可在＞1和＜7.5之間的pH實(shí)施。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法在生理學(xué)的pH實(shí)施。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明在pH 4.5實(shí)施。
任何濃度的包含SEQ ID NO1或其片段的肽可被用于實(shí)施本發(fā)明的方法，只要該方法使得，和未與包含SEQ ID NO1或其片段的肽接觸的所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解度相比，當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)與包含SEQ ID NO1或其片段的肽接觸時(shí)，其溶解度增加。備選地，任何濃度的包含SEQ IDNO1或其片段的肽均可用于實(shí)施本發(fā)明的方法，只要該方法在當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)與包含SEQ ID NO1或其片段的肽接觸時(shí)，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白質(zhì)再溶解。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用包含SEQ ID NO1或其片段的肽，在1-1,000納摩的濃度范圍內(nèi)實(shí)施。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用包含SEQ ID NO1或其片段的肽，在1-1,000微摩爾的濃度范圍內(nèi)實(shí)施。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用包含SEQ ID NO1或其片段的肽，在1-1,000毫摩的濃度范圍內(nèi)實(shí)施。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用包含SEQ ID NO1或其片段的肽，在1-1,000摩爾的濃度范圍內(nèi)實(shí)施。
本發(fā)明的方法包括將目標(biāo)蛋白質(zhì)與包含SEQ ID NO1或其片段的肽接觸，其中所述的肽或其片段增加目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解度或使目標(biāo)蛋白質(zhì)再溶解。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的方法用以與目標(biāo)蛋白質(zhì)相比存在過量的摩爾數(shù)的包含SEQ ID NO1或其片段的肽來實(shí)施。該肽可與目標(biāo)蛋白質(zhì)相比以1-1000-倍摩爾過量的方式存在。在本發(fā)明另外的方面，本發(fā)明的方法用與包含SEQ ID NO1或其片段的肽相比過量摩爾數(shù)的目標(biāo)蛋白質(zhì)來實(shí)施。目標(biāo)蛋白質(zhì)，相對于包含SEQ ID NO1或其片段的肽可以1-1000-倍摩爾過量的范圍存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用與目標(biāo)蛋白質(zhì)相比10-20倍摩爾過量存在的包含SEQ IDNO1或其片段的肽來實(shí)施。
除了在可操作的實(shí)施例中，或其中另外標(biāo)明，可以理解在本說明書和權(quán)利要求中所使用的表示成分的數(shù)量、反應(yīng)條件諸如此類的所有數(shù)字通過術(shù)語″大約″，在一切情況下是可改變的。因此，除非相反地指明，本說明書和所附權(quán)利要求中闡明的數(shù)值參數(shù)是近似值，其可根據(jù)通過本發(fā)明尋求獲得的所需要特性而變化。至少，但不意圖限制相當(dāng)于本權(quán)利要求范圍的原理的施用，各個(gè)數(shù)值參數(shù)應(yīng)該被視為考慮到有效數(shù)字和常規(guī)四舍五入處理的數(shù)值。
盡管闡明本發(fā)明廣泛范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)是近似值，特定實(shí)施例中闡述的數(shù)值是盡可能精確地加以報(bào)道的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可認(rèn)識到任何數(shù)值，固有地包含在其各自的試驗(yàn)測定中存在的由標(biāo)準(zhǔn)偏差產(chǎn)生的某些必然誤差。
下列實(shí)施例說明，但不是意圖限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1rhBMP-2的6個(gè)同工型的溶解度在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生rhBMP-2，并且包含6種二聚同工型＜Q283/＜Q283，Q283/Q283、＜Q283/T266、Q283/T266和T266/T266。T266亞基的N-末端上具有17個(gè)氨基酸突出端，其在Q283和＜Q283亞基中缺失。這個(gè)延伸由細(xì)胞代謝過程期間PACE酶未能在C-末端切割A(yù)rg282處而產(chǎn)生。其發(fā)生是因?yàn)樵贑HO細(xì)胞中過生產(chǎn)重組的蛋白質(zhì)，因此使PACE酶的載量飽和。
rhBMP-2具有獨(dú)特的溶解度圖譜。它在低鹽濃度和低pH時(shí)溶解度最大。然而，如果鹽濃度增至高于0.15M的離子強(qiáng)度它在更高的pH值保持溶解。為了確定在rh BMP2的不同同工型之間是否存在任何固有溶解度的差異，純化同工型并且用5mM硫酸鈉處理。利用在340nm處吸光度的光散射測量溶解度。
利用5mM Na2SO4作為蛋白質(zhì)沉淀劑進(jìn)行研究。在5mM L-谷氨酸、5mM NaCl、2.5％甘氨酸、0.5％蔗糖、0.01％(w/v)聚山梨酸酯80 pH4.5中，蛋白質(zhì)濃度為0.5mg/mL以及體積為0.5mL下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對于分子的沉淀和再溶解，孵育時(shí)間都是室溫下10分鐘。通過340nm處的光散射測量沉淀程度。
將從用5mM和18mM Na2SO4沉淀的rhBMP-2獲得的上清液進(jìn)行反相和陽離子交換層析。從通過在14,000RPM，與大約2℃至8℃微離心30分鐘沉淀分離上清液。
通過陽離子交換層析分離rhBMP-2的6種二聚同工型(圖1)。孵育與低水平的Na2SO4混合的所有6種rhBMP-2同工型導(dǎo)致同工型沉淀物的指示性吸光度增加。吸光度增加在大約3mM至4mM Na2SO4的范圍內(nèi)是明顯的。通過反相色譜法，比較原始材料和沉淀物上清液中蛋白質(zhì)的濃度來確定沉淀物的數(shù)量。在5mM Na2SO4，蛋白質(zhì)濃度減少至原始數(shù)量的63％。在18mM Na2SO4，蛋白質(zhì)濃度減少至起始濃度的81％。通過陽離子交換層析分析沉淀物的上清液。發(fā)現(xiàn)富集沉淀物的上清液包含T266亞基的二聚體。這個(gè)起始的觀察證明6種rhBMP-2同工型間溶解度的差異。
為了進(jìn)一步研究這個(gè)現(xiàn)象，純化每種同工型，并且與5mM Na2SO4孵育，以更好的評估它們的相對溶解度。通過340nM處的光散射測量同工型的沉淀。在加入5mM Na2SO4后包含T266亞基的所有同工型保持澄清狀態(tài)。包含Q283亞基或＜Q283亞基而非T266亞基的所有同工型變?yōu)槿榘咨⑶覍?dǎo)致340nM處的吸光度增加。這個(gè)結(jié)果表明在存在5mM Na2SO4時(shí)，Q283和＜Q283同工型沉淀，而T266亞基不沉淀(圖2)。
其次的實(shí)驗(yàn)研究T266/T266同工型使沉淀的Q283/Q283同工型再溶解的能力。用5mM Na2SO4沉淀10納摩的Q283/Q283同工型。將不同數(shù)量的T266/T266同工型(也在5mM Na2SO4中)加入沉淀的Q283/Q283同工型，并且在340nM處測量吸光度。向沉淀的Q283/Q283同工型加入T266/T266導(dǎo)致340nM處溶液吸光度呈劑量依賴性的方式減少。在加入5納摩的T266/T266后，10納摩的Q263/Q263變得澄清。這發(fā)生在室溫下孵育10分鐘內(nèi)(圖3)。向10納摩沉淀的Q283/Q283加入＜Q283/T266同工型導(dǎo)致類似的340nM處吸光度的減少，然而需要更高濃度的＜Q283/T266同工型以達(dá)到相同的效果(圖4)。
T266同工型和Q283和＜Q283同工型之間的差異是T266同工型N-末端上17個(gè)氨基酸突出端。進(jìn)行其次的實(shí)驗(yàn)以確定17個(gè)氨基酸突出端或其片段是否能夠再溶解rhBMP-2。合成相應(yīng)于T266同工型N-末端的17個(gè)氨基酸的肽，并且進(jìn)行研究以確定這些肽是否使成熟rhBMP-2再溶解。
合成下列肽S17Thr-Phe-Gly-His-Asp-Gly-Lys-Gly-His-Pro-Leu-His-Lys-Arg-Glu-Lys-Arg(SEQ ID NO1)；S12Gly-Lys-Gly-His-Pro-Leu-His-Lys-Arg-Glu-Lys-Arg(SEQ ID NO1的第6-17位氨基酸)；S7Leu-His-Lys-Arg-Glu-Lys-Arg(SEQ ID NO1的第11-17位氨基酸)；Arg-Glu-Lys-Arg(SEQ ID NO1的氨基酸第14-17位)。
所有的合成肽都能夠使已經(jīng)用5mM Na2SO4沉淀的10納摩＜Q283/＜Q283再溶解(圖5)。溶解能力隨鏈長度而的減少。S4，最小的肽對于再溶解＜Q283/＜Q283仍然是有效的，但是需要高濃度的肽。
用除了硫酸鹽外的其他陰離子檢驗(yàn)合成肽再溶解＜Q283/＜Q283同工型的能力。該肽能夠使被氯化鈉和磷酸鈉沉淀的Q283/＜Q283再溶解。
包含T266亞基的rhBMP-2同工型比只包含＜Q283或Q283亞基的同工型是更易溶解的。在多種陰離子存在的情況下溶解度的增加與T266亞基17個(gè)氨基酸突出端有關(guān)。
由T266的17個(gè)N-末端氨基酸突出端或其片段組成的肽可用作賦形劑以防止陰離子誘導(dǎo)的例如rhBMP-2的蛋白質(zhì)的沉淀。由于TGF-β超家族成員間存在的高度序列和構(gòu)象同源性，T266的17個(gè)N-末端氨基酸突出端或其片段可用作TGF-β超家族任何成員的賦形劑或增溶劑。
T266的N-末端17個(gè)氨基酸突出端可用于溶解或再溶解rhBMP-2或增加其溶解度。因此，在產(chǎn)生或純化蛋白質(zhì)時(shí)，該肽或其片段可用于增加rhBMP-2的溶解度以從該蛋白質(zhì)除去不完全的陰離子。當(dāng)它與rhBMP-2遞送載體的可吸收膠原海綿(ACS)接觸時(shí)，也可用來溶解rhBMP-2蛋白質(zhì)。ACS包含非控制水平的多種陰離子，包括硫酸鹽、磷酸鹽和氯化物。
實(shí)施例2生產(chǎn)具有增加溶解度的rhBMP-2通過PCR，根據(jù)本領(lǐng)域已知的PCR方法產(chǎn)生rhBMP Q283/Q283同工型的DNA片段，該片段的N末端連接有SEQ ID NO2并且其側(cè)翼有限制酶切位點(diǎn)BamH1和Nde1。將PCR產(chǎn)物連接到大腸桿菌表達(dá)載體pT-16b(Novagen，Madison，WI)中。然后該質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。通過用IPTG處理細(xì)胞實(shí)現(xiàn)刺激融合蛋白質(zhì)的表達(dá)，其中該融合蛋白質(zhì)包括具有SEQ ID NO2編碼的肽的rhBMP蛋白質(zhì)和Q283/Q283同工型。通過金屬螯合色譜法，根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法分離重組蛋白質(zhì)(例如Studier等.Methods in Enzymology60-89，1990)。與rhBMP的Q283/Q283同工型相比，該融合蛋白質(zhì)顯示出增加的溶解度，并且例如可用于藥物組合物。
考慮到在此公開的本發(fā)明的說明書和實(shí)施例，本發(fā)明的其他實(shí)施方案對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。認(rèn)為本說明書和實(shí)施例只是例證性的，通過下列的權(quán)利要求表明本發(fā)明得真實(shí)范圍和精神，并且相當(dāng)于其被授權(quán)的完全范圍。
在此引用的所有參考文獻(xiàn)在此全部引入作為參考，為了所有的目的達(dá)到相同的程度，正如各種單獨(dú)的出版物、專利、或?qū)＠暾埦唧w地并且分別地指明為所有目的全部引入作為參考。
序列表<110>Nichols，Pilarin E.L.
Perez-Ramirez，Bernardo<120>用作轉(zhuǎn)化生長因子β蛋白質(zhì)的溶解賦形劑的肽<130>08702.0019 00304<160>2<170>PatentIn versjon 3.1<210>1<211>17<212>PRT<213>Homo sapien<400>1Thr Phe Gly His Asp Gly Lys Gly His Pro Len His Lys Arg Glu Lys1 5 10 15Arg<210>2<211>51<212>DNA<213>Homo sapien<400>2acgtttggcc acgcggcaa aggccacccc ctgcacaaaaa gagagaaaag a5權(quán)利要求
1.一種抑制蛋白質(zhì)從溶液中沉淀出來的組合物，其包含SEQ IDNO1編碼的肽或其片段。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是TGF-β超家族的成員。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是BMP-2。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述的同工型選自＜Q283或Q283。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述的同工型是二聚體。
9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述的二聚體選自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283和Q283/Q283。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的肽或其片段，包含SEQ IDNO1的第6-17位氨基酸。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是TGF-β超家族的成員。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是BMP-2。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中所述的同工型選自＜Q283或Q283。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述的同工型是二聚體。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中所述的二聚體選自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283或Q283/Q283。
19.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的肽包含SEQ ID NO1的第11-17位氨基酸。
20.權(quán)利要求19的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是TGF-β超家族的成員。
21.權(quán)利要求20的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是BMP-2。
22.權(quán)利要求21的組合物，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
25.權(quán)利要求24的組合物，其中所述的同工型選自＜Q283或Q283。
26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述的同工型是二聚體。
27.權(quán)利要求26的組合物，其中所述的二聚體選自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283或Q283/Q283。
28.權(quán)利要求1的組合物，其中所述的肽包含SEQ ID NO1第14-17位的氨基酸。
29.權(quán)利要求28的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是TGF-β超家族的成員。
30.權(quán)利要求29的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是BMP-2。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
32.權(quán)利要求31的組合物，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
33.權(quán)利要求32的組合物，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中所述的同工型選自＜Q283或Q283。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中所述的同工型是二聚體。
36.權(quán)利要求35的組合物，其中所述的二聚體選自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283或Q283/Q283。
37.一種抑制目標(biāo)蛋白質(zhì)從溶液沉淀出來的方法，所述的方法包括將所述的蛋白質(zhì)與有效量的抑制所述蛋白質(zhì)沉淀的肽接觸，其中所述的肽包含SEQ ID NO1或其片段。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是TGF-β家族的成員。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是BMP-2。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
42.權(quán)利要求41的方法，其中該rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述的同工型是二聚體。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述的二聚體選自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283或Q283/Q283。
45.一種藥物組合物，包括生物學(xué)活性分子和包含SEQ ID NO1的肽以及載體。
46.權(quán)利要求45的藥物組合物，其中所述的生物學(xué)活性分子是TGF-β超家族的成員。
47.權(quán)利要求46的藥物組合物，其中所述的TGF-β超家族成員是BMP-2。
48.權(quán)利要求47的藥物組合物，其中所述的BMP-2是rhBMP-2。
49.權(quán)利要求48的藥物組合物，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
50.權(quán)利要求49的藥物組合物，其中所述的同工型是二聚體。
51.權(quán)利要求50的藥物組合物，其中所述的二聚體選自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283或Q283/Q283。
52.權(quán)利要求45的藥物組合物，其中所述的載體是可吸收的膠原海綿。
53.一種將藥物組合物遞送到需要治療病癥或疾病的哺乳動物的方法，所述的方法包括將所述的藥物組合物施用于所述的哺乳動物以治療所述的病癥或疾病，其中所述的藥物組合物包括生物學(xué)活性分子、包含SEQ ID NO1或其片段的肽，以及載體，其中所述的包含SEQID NO1或其片段的肽可增加所述生物學(xué)活性分子的溶解度。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述的生物學(xué)活性分子是TGF-β超家族的成員。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述的TGF-β超家族的成員是BMP-2。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述的BMP-2是rhBMP-2。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述的同工型是二聚體。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述的二聚體選自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283或Q283/Q283。
60.權(quán)利要求53的方法，其中所述的哺乳動物是人。
61.權(quán)利要求53的方法，其中所述的載體是可吸收的膠原海綿。
62.一種使已經(jīng)從溶液沉淀出來的蛋白質(zhì)再溶解的組合物，其包括由SEQ ID NO1編碼的肽或其片段。
63.權(quán)利要求62的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是TGF-β超家族的成員。
64.權(quán)利要求63的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是BMP-2。
65.權(quán)利要求64的組合物，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
66.權(quán)利要求65的組合物，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
67.權(quán)利要求66的組合物，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
68.權(quán)利要求67的組合物，其中所述的同工型選自＜Q283或Q283。
69.權(quán)利要求68的組合物，其中所述的同工型是二聚體。
70.權(quán)利要求69的組合物，其中所述的二聚體選自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283和Q283/Q283。
71.權(quán)利要求62的組合物，其中所述的肽或其片段，包含SEQ IDNO1的第6-17位氨基酸。
72.權(quán)利要求71的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是TGF-β超家族的成員。
73.權(quán)利要求72的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是BMP-2。
74.權(quán)利要求73的組合物，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
75.權(quán)利要求74的組合物，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
76.權(quán)利要求75的組合物，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
77.權(quán)利要求76的組合物，其中所述的同工型選自＜Q283或Q283。
78.權(quán)利要求77的組合物，其中所述的同工型是二聚體。
79.權(quán)利要求78的組合物，其中所述的二聚體選自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283或Q283/Q283。
80.權(quán)利要求62的組合物，其中所述的肽包含SEQ ID NO1的第11-17位氨基酸。
81.權(quán)利要求80的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是TGF-β超家族的成員
82.權(quán)利要求81的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是BMP-2。
83.權(quán)利要求82的組合物，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
84.權(quán)利要求83的組合物，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
85.權(quán)利要求84的組合物，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
86.權(quán)利要求85的組合物，其中所述的同工型選自＜Q283，Q283或T266。
87.權(quán)利要求86的組合物，其中所述的同工型是二聚體。
88.權(quán)利要求87的組合物，其中所述的二聚體選自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q2873或Q283/Q283。
89.權(quán)利要求62的組合物，其中所述的肽包含SEQ ID NO1的氨基酸第14-17位。
90.權(quán)利要求89的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是TGF-β超家族的成員。
91.權(quán)利要求90的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是BMP-2。
92.權(quán)利要求91的組合物，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
93.權(quán)利要求92的組合物，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
94.權(quán)利要求93的組合物，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
95.權(quán)利要求94的組合物，其中所述的同工型選自＜Q283或Q283。
96.權(quán)利要求95的組合物，其中所述的同工型是二聚體。
97.權(quán)利要求96的組合物，其中所述的二聚體選自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283或Q283/Q283。
98.一種使目標(biāo)蛋白質(zhì)再溶解的方法，所述的方法包括將所述的蛋白質(zhì)與有效量的使目標(biāo)蛋白質(zhì)再溶解的肽接觸，其中所述的肽包含SEQ ID NO1或其片段。
99.權(quán)利要求98的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是TGF-β家族的成員。
100.權(quán)利要求99的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是BMP-2。
101.權(quán)利要求100的方法，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
102.權(quán)利要求101的方法，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
103.權(quán)利要求102的方法，其中該rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
104.權(quán)利要求103的方法，其中所述的同工型是二聚體。
105.權(quán)利要求104的方法，其中所述的二聚體選自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283或Q283/Q283。
全文摘要
本發(fā)明涉及包括用于蛋白質(zhì)的賦形劑或增溶劑的組合物。本發(fā)明涉及來源于rhBMP2的T266同工型N－末端延伸的肽具有增加蛋白質(zhì)溶解度之特性的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明也涉及通過將蛋白質(zhì)與包含rhBMP－2的T266同工型的17個(gè)氨基酸突出端的肽接觸，使已經(jīng)沉淀的蛋白質(zhì)再溶解的方法。本發(fā)明也涉及通過將蛋白質(zhì)與包含rhBMP－2的T266同工型的17個(gè)氨基酸突出端的肽接觸，來增加蛋白質(zhì)溶解度的方法。
文檔編號C07K5/00GK1735426SQ03824166
公開日2006年2月15日 申請日期2003年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月13日
發(fā)明者P·E·L·尼科爾斯, B·佩雷斯－拉米雷斯 申請人:惠氏公司