專利名稱：人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
俗稱的破傷風(fēng)是一種由破傷風(fēng)桿菌感染所引起的常見而且死亡率很高的疾病。破傷風(fēng)桿菌廣泛地存在于土壤，灰塵，鐵銹等處，很容易隨著創(chuàng)傷，如一般性外傷，婦女生產(chǎn)嬰兒時(shí)的創(chuàng)傷等等感染人體。當(dāng)人被破傷風(fēng)桿菌感染之后，在七天左右的潛伏期內(nèi)，細(xì)菌在人體內(nèi)大量繁殖并釋放毒素。破傷風(fēng)毒素通過破壞人體神經(jīng)細(xì)胞而對(duì)人造成致命的傷害。死亡率高達(dá)90％以上。毒素一旦結(jié)合到神經(jīng)細(xì)胞上，立即引發(fā)劇烈的神經(jīng)癥狀，病人痛苦不堪，很快死去。當(dāng)病人被確診為感染破傷風(fēng)桿菌后，由于此時(shí)體內(nèi)已有大量細(xì)菌和毒素，使用抗菌素已來(lái)不及拯救病人生命，唯一有效的治療方法是使用抗破傷風(fēng)毒素的抗體?？蛊苽L(fēng)毒素的抗體通與毒素進(jìn)行中和反應(yīng)而使毒素失活，消除。雖然注射破傷風(fēng)疫苗可以完全預(yù)防上述情況發(fā)生。但由于沒有接種疫苗或免疫效應(yīng)過期從而導(dǎo)致破傷風(fēng)桿菌感染的情況依然非常普遍。
目前我國(guó)用于臨床的抗破傷風(fēng)毒素的抗體均為動(dòng)物抗血清(主要為馬的抗破傷風(fēng)毒素抗血清)。動(dòng)物的抗血清作為人體的異物抗原，經(jīng)常會(huì)引起人體過敏反應(yīng)。嚴(yán)重過敏者為患者總數(shù)的大約20％-30％。更為嚴(yán)重的是，越來(lái)越多的動(dòng)物的病毒經(jīng)過變異開始感染人類，象瘋牛癥那樣的情況一旦發(fā)生在馬身上，其后果不堪設(shè)想。因而這種產(chǎn)品亟待淘汰，而由人源的經(jīng)過純化的無(wú)病毒等雜質(zhì)污染抗體來(lái)取代。利用基因重組技術(shù)制備人源的抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體應(yīng)是最理想的選擇，因?yàn)檫@將從根本上克服市場(chǎng)現(xiàn)有抗血清的嚴(yán)重過敏反應(yīng)的困擾以及可能的由病毒污染造成的危害。
利用傳統(tǒng)的細(xì)胞融合技術(shù)制作人源抗體非常困難，因?yàn)槌Ｓ玫碾s交瘤技術(shù)在人-人雜交瘤技術(shù)尚無(wú)重大突破。其原因一方面是因?yàn)檎也坏嚼硐氲淖鳛槿诤嫌玫娜四[瘤細(xì)胞，現(xiàn)有的人-人雜交瘤也很不穩(wěn)定，產(chǎn)生的抗體甚至不夠做檢測(cè)用。另一方面人的細(xì)胞內(nèi)有很多被抑制的致病病毒，一旦被激活這些病毒可以重新活躍而復(fù)制，從而對(duì)抗體產(chǎn)品產(chǎn)生污染，使用很不安全。如果碰到很稀少的抗體，分離到這些抗體的漿細(xì)胞的機(jī)率就很小，因?yàn)槟苄纬煞€(wěn)定雜交瘤的只是占所有生產(chǎn)抗體漿細(xì)胞的很少一部分，丟失很嚴(yán)重。這些因素適得能用雜交瘤技術(shù)找到抗體的細(xì)胞株很難實(shí)現(xiàn)。
另外一種制作抗體的方法是利用基因工程技術(shù)?；蚬こ炭贵w又稱重組抗體，它是在充分認(rèn)識(shí)抗體IgG基因結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)上，應(yīng)用DNA重組技術(shù)在基因水平上對(duì)抗體分子進(jìn)行拼接組裝成的抗體.基因工程抗體既保留了天然抗體的特異性和生物學(xué)活性，更可以通過工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)達(dá)到無(wú)限量純化的產(chǎn)品，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
迄今世界上已成功構(gòu)建多種基因工程抗體，包括幾種基本類型，即人鼠嵌合抗體(chimeric antibody，即將人IgG區(qū)與鼠的抗體可變區(qū)相連接，從而在同一抗體分子中含有不同種屬來(lái)源的抗體片段)，改型抗體(reshapingantibody)亦稱為人源化抗體(humanized antibody，即為進(jìn)一步減少融合抗體中鼠源抗體引起的免疫反應(yīng)，將融合抗體中鼠源可變區(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步改造)；人源抗體(human antibody，即人類自身產(chǎn)生的抗體)等。其中人源抗體由于是100％來(lái)自人的基因，不含有任何外來(lái)基因，因而給人應(yīng)用不會(huì)造成過敏反應(yīng)，最適合于臨床應(yīng)用。
利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)人鼠融合抗體和人源化抗體(humanized antibody)的技術(shù)成熟，產(chǎn)品已市場(chǎng)化。迄今用于臨床的多為鼠源性單克隆抗體，但其可能對(duì)人引起的超敏反應(yīng)嚴(yán)重地限制了它在臨床的應(yīng)用。利用基因工程制備和生產(chǎn)完全的人源抗體(亦即全部為人基因)是世界上一項(xiàng)新興技術(shù)和產(chǎn)業(yè)。技術(shù)的關(guān)鍵在于如何獲得能表達(dá)抗體肽鏈的基因片段。目前獲得能表達(dá)抗體肽鏈的基因片段使用的一種辦法是從人體血液中將生產(chǎn)所需抗體的B淋巴細(xì)胞挑選出來(lái)，代表技術(shù)如抗體庫(kù)法(phage antibody library)。該法是將人的體細(xì)胞基因中的全部抗體基因克隆在噬菌體外殼蛋白基因的上游，使抗體蛋白片段與外殼蛋白的融合產(chǎn)物同時(shí)表達(dá)在噬菌體顆粒的表面。因而，只需利用固定化的抗原，就可以從抗體庫(kù)中篩選出表面帶有特異抗體片段的呈示噬菌體克隆。但此法最大的缺點(diǎn)是其篩選的抗體對(duì)抗原的親和力不高，直接應(yīng)用的臨床價(jià)值不大。這是因?yàn)閺娜说捏w細(xì)胞的抗體基因庫(kù)選出的抗體都是初始的抗體，未曾經(jīng)過與抗原接觸而引發(fā)的基因突變，與抗原結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)等自然篩選淘汰過程。另一種獲得人源抗體基因片段的方法是改造小鼠的基因，使其產(chǎn)生人源的抗體。還有人將人外周血白細(xì)胞與探針標(biāo)記的抗原混合，從而將其中生產(chǎn)抗體的漿細(xì)胞挑選出來(lái)，再?gòu)闹蝎@得抗體基因。
抗體工程的最終目的是在一個(gè)合適的系統(tǒng)中，使外源基因高效表達(dá)。它包括外源基因的克隆，轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)譯，加工，及表達(dá)產(chǎn)物的分離純化等過程?；蚬こ痰谋磉_(dá)系統(tǒng)可以分為原核和真核表達(dá)系統(tǒng)。完整抗體蛋白因是糖基化蛋白質(zhì)，只能用真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。真核表達(dá)系統(tǒng)包括酵母，植物，昆蟲和哺乳動(dòng)物系統(tǒng)，其中哺乳動(dòng)物系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)最適合人源抗體的表達(dá)，因?yàn)樵撓到y(tǒng)保證表達(dá)的蛋白質(zhì)的糖基化與人的完全一致。這點(diǎn)對(duì)抗體的臨床應(yīng)用很重要，因?yàn)椴徽_糖基化的抗體缺乏一些應(yīng)有的生物功能(如補(bǔ)體激活，體內(nèi)半衰期)，并可造成過敏反應(yīng)。最近，一些新技術(shù)陸續(xù)出臺(tái)，希望能通過酵母基因改造使其進(jìn)行哺乳動(dòng)物般糖基化。如果只表達(dá)抗體的可變區(qū)部分，還可用原核系統(tǒng)，比如細(xì)菌來(lái)表達(dá)。
利用哺乳動(dòng)物系統(tǒng)表達(dá)可以在細(xì)胞水平進(jìn)行，比如用人的骨髓瘤細(xì)胞，亦可通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行。后者將抗體基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物的卵細(xì)胞，使克隆出的動(dòng)物能夠自動(dòng)地表達(dá)克隆的抗體，并從奶或其它分泌物中大量地分泌出來(lái)。該法避免了大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞的工業(yè)化投資，具有很大的經(jīng)濟(jì)前景。
近年來(lái)陸續(xù)已有幾篇有關(guān)發(fā)明和制備人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的報(bào)道。但這些抗體有的雖能與破傷風(fēng)毒素結(jié)合，但不能中和毒素的毒性；有的可以中和毒素的毒性，但效價(jià)不高。因而至今都沒有真正具備商業(yè)開發(fā)價(jià)值的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體。能夠找到并能進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的高效中和破傷風(fēng)毒素人源抗單克隆抗體仍是人們追求的方向?？贵w中和毒素的效價(jià)越高，其臨床應(yīng)用的價(jià)值越大。只有高效并能中和毒素的抗體才具有市場(chǎng)開發(fā)的價(jià)值。抗體中和毒素的能力顯然是由其化學(xué)結(jié)構(gòu)決定的。遺憾的是至今人們都不清楚什么樣的結(jié)構(gòu)可賦予抗體高效價(jià)。因而尋找高效抗體依然是可遇而不可求的隨機(jī)過程，其結(jié)果是不可預(yù)見的。
高效抗體的篩選有賴于能否獲得大量有關(guān)的資源。目前報(bào)道過的所有篩選抗破傷風(fēng)毒素抗體的方法都只能獲取生產(chǎn)抗體漿細(xì)胞的其中一部分，甚至一小部分，因而篩選出高效價(jià)抗體克隆的幾率很小。必須找到更好的方法，以獲得全部的生產(chǎn)抗體的漿細(xì)胞，從而提高篩選出高效價(jià)抗體克隆的幾率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有產(chǎn)品存在的上述缺點(diǎn)，而提供一種人源的抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用，其基于目前我國(guó)所使用的用于臨床的抗破傷風(fēng)毒素的抗體均為動(dòng)物抗血清(主要為馬抗破傷風(fēng)毒素抗血清)，動(dòng)物的抗血清作為人體的異物抗原，經(jīng)常會(huì)引起人體過敏反應(yīng)，更為嚴(yán)重的是，越來(lái)越多的動(dòng)物的病毒經(jīng)過變異開始感染人類，因而這種產(chǎn)品亟待淘汰，而由人源的經(jīng)過純化的無(wú)病毒等雜質(zhì)污染抗體來(lái)取代。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體，其特征在于，其為人源抗體，包括抗體可變區(qū)，該可變區(qū)包括或不包括抗體的恒定區(qū)，該抗體具有中和破傷風(fēng)毒素的能力，抗體可變區(qū)的基因和蛋白質(zhì)序列如序列1所示。
前述的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體，其特征在于，所述抗體可變區(qū)的基因和蛋白質(zhì)序列包括序列1所示的同系物或修飾物；同系物為抗體可變區(qū)的蛋白序列其同系性達(dá)到上述序列的60％或以上、70％或以上、80％或以上；修飾物為對(duì)人源抗體的氨基酸或它們的核酸序列通過取代、增加或截短進(jìn)行改變的產(chǎn)物仍舊保留人源抗體表達(dá)抗體蛋白具有中和破傷風(fēng)毒素的能力。
前述的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體，其特征在于，所述同系物和修飾物還包括對(duì)抗體蛋白質(zhì)翻錄合成后的修飾，使表達(dá)的抗體蛋白具有中和破傷風(fēng)毒素的能力，以達(dá)到增強(qiáng)治療或預(yù)防效應(yīng)、提高在體外的穩(wěn)定性或?qū)w內(nèi)蛋白酶的抵御能力。
前述的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體，其特征在于，所述抗體的恒定區(qū)是人源免疫球蛋白重鏈或輕鏈的恒定區(qū)中的任何一種；該重鏈恒定區(qū)是人源IgG，IgM，IgA，IgE，IgD的恒定區(qū)，以及包括有絞鏈區(qū)(hinge region)的重鏈恒定區(qū)或重鏈恒定區(qū)中的任何片段；所述輕鏈恒定區(qū)片段是人體免疫球蛋白輕鏈的κ或λ的恒定區(qū)。
本發(fā)明人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的制備方法，其特征在于，其包括利用基因重組技術(shù)的方法和化學(xué)合成的方法來(lái)制備和生產(chǎn)；其中，利用基因重組技術(shù)的方法來(lái)制備，包括A、抗體基因的克隆與序列分析；B、抗體基因表達(dá)載體的構(gòu)建；C、在一個(gè)合適的系統(tǒng)或宿主持正義中，將抗體基因表達(dá)D、大量培養(yǎng)和擴(kuò)增抗體表達(dá)宿主；E、對(duì)表達(dá)的抗體分離純化F、對(duì)表達(dá)抗體的定性和定量分析。
前述的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述抗體基因的表達(dá)載體是質(zhì)粒載體、病毒載體、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的載體或者通用載體。
前述的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述抗體基因載體可轉(zhuǎn)入一個(gè)合適的系統(tǒng)或宿主中加以表達(dá)，適合的表達(dá)體系包括動(dòng)物和植物的細(xì)胞，細(xì)胞株、細(xì)菌或酵母；該動(dòng)物也可以是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
前述的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的方法，其特征在于，還包括A、檢測(cè)抗體蛋白質(zhì)或基因核酸的序列；B、檢測(cè)抗體在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)對(duì)注射的破傷風(fēng)毒素具有抑制其毒性的功能。
本發(fā)明的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體在制備預(yù)防破傷風(fēng)細(xì)菌感染藥品中的應(yīng)用。
本發(fā)明的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體在制備破傷風(fēng)細(xì)菌感染的診斷制劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了幾種新的利用基因重組技術(shù)制造出的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體，其基因和蛋白質(zhì)序列與現(xiàn)有報(bào)道的不相同，該抗體的特點(diǎn)是具有很高的中和破傷風(fēng)毒素的能力。通過小白鼠試驗(yàn)證明，上述抗體可保護(hù)動(dòng)物抵御破傷風(fēng)毒素的攻擊。此外，抗體作為藥物與國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的抗體比較，還具有以下優(yōu)點(diǎn)1、不會(huì)誘發(fā)明顯的過敏反應(yīng)目前國(guó)內(nèi)使用的是馬血清抗體，容易誘發(fā)嚴(yán)重過敏反應(yīng)。而此抗體是利用基因重組技術(shù)制造的人源抗體(百分之百的人基因)，因而從理論上講不會(huì)誘發(fā)明顯過敏反應(yīng)。
2、有很高的效價(jià)這些抗體具有遠(yuǎn)比過去報(bào)道高得多的中和毒素的能力。用小白鼠體內(nèi)試驗(yàn)證明本發(fā)明的抗體可完全保護(hù)小鼠抵御致死劑量的破傷風(fēng)毒素的攻擊。
3、可以無(wú)限量地生產(chǎn)。
4、長(zhǎng)效確保體內(nèi)維持有效的藥物濃度。
5、可以做到產(chǎn)品無(wú)動(dòng)物病毒污染此抗體的生產(chǎn)過程可以采用世界上最先進(jìn)的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)，其生產(chǎn)流程中可以采取不使用任何動(dòng)物制劑，因而產(chǎn)品避免了動(dòng)物或人的病毒的污染。震驚世界的瘋牛病，SARS等動(dòng)物傳染性疾病肆虐歐洲及世界各地的事實(shí)，使人們清醒地看到，使用動(dòng)物血清的生物制劑存在著巨大的污染隱患，甚至嚴(yán)重威脅人類的健康，而本產(chǎn)品在此方面具有優(yōu)勢(shì)。
四、附圖和附表說(shuō)明表1為本發(fā)明篩選分泌抗破傷風(fēng)毒素抗體的人源漿細(xì)胞的部分總結(jié)。
表2為本發(fā)明碘125標(biāo)記的抗破傷風(fēng)毒素抗體和人源免疫球蛋白IgG1在兔子體內(nèi)的半壽期。
表3為本發(fā)明基因重組抗破傷風(fēng)毒素抗體對(duì)動(dòng)物體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果。


圖1為本發(fā)明克隆的若干人源抗破傷風(fēng)毒素抗體可變區(qū)cDNA片段的凝膠電泳圖。
圖2為本發(fā)明構(gòu)建的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體輕鏈的表達(dá)載體示意圖。
圖3為本發(fā)明構(gòu)建的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體重鏈的表達(dá)載體示意圖。
圖4為本發(fā)明基因重組的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體重鏈和輕鏈cDNA片段的凝膠電泳圖。
圖5為CHO細(xì)胞上清中所表達(dá)分泌的基因重組抗破傷風(fēng)毒素抗體的測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖6為本發(fā)明單一及混合抗體對(duì)動(dòng)物的保護(hù)作用圖。
五具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及幾種新的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體，包括由這些新抗體的基因和蛋白序列、生物功能、測(cè)定方法、生產(chǎn)制造這些抗體的方法，以及利用這些抗體制備治療破傷風(fēng)桿菌感染的藥物和用于制備診斷破傷風(fēng)細(xì)菌感染的制劑。
本發(fā)明中應(yīng)用的一些用語(yǔ)的確切定義1、抗原能引起動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生特異免疫反應(yīng)的物質(zhì)。
2、人源抗體人體合成出的抗體.人源抗體共分為IgG，IgA，IgM，IgD，IgE 5大類。其中IgG又分為IgG1，IgG2，IgG3，IgG4亞類，它們的重鏈被相應(yīng)地命名為IgG□1，IgG□2，IgG□3，IgG□4。輕鏈則有κ或λ兩個(gè)型。各種不同類型的抗體的基因和蛋白質(zhì)序列是不同的(詳見下)。
3、抗體的基本結(jié)構(gòu)(一)四肽鏈結(jié)構(gòu)各類抗體的基本結(jié)構(gòu)都是四條肽鏈的對(duì)稱結(jié)構(gòu)，包括二條相同的重鏈和二條相同的輕鏈。兩條重鏈之間和兩條輕鏈之間及重鏈和輕鏈間，分別借二硫鍵連接。抗體的重鏈由400多個(gè)氨基酸組成。根據(jù)重鏈抗原性的不同可將其分為5類，由它們組成的抗體分別稱為IgM，IgG，IgD，IgA，IgE.抗體的輕鏈各含有200多個(gè)氨基酸，輕鏈有κ或λ兩個(gè)型。(二)恒定區(qū)和可變區(qū)在抗體輕鏈和重鏈肽鏈的N端(含有大約107-130個(gè)氨基酸殘基)為抗體的可變區(qū)，分別稱為重鏈的可變區(qū)和輕鏈的可變區(qū)。這個(gè)區(qū)的氨基酸排列順序隨抗體特異性不同而有所變化，故稱可變區(qū)(即V區(qū))。在多肽的C端，這個(gè)區(qū)的氨基酸數(shù)量和排列順序等都比較穩(wěn)定，故稱為恒定區(qū)(即C區(qū))。所以，不同抗體的恒定區(qū)序列和結(jié)構(gòu)彼此之間區(qū)別不大，但其可變區(qū)的序列和結(jié)構(gòu)區(qū)別很大?？贵w的可變區(qū)是決定抗體特異性的部位。(三)抗體的絞鏈區(qū)抗體的重鏈的一個(gè)可轉(zhuǎn)動(dòng)的區(qū)域(即hinge區(qū)域)。
4、同源抗體源于同一種屬動(dòng)物的抗體，比如應(yīng)用于人的抗體如若是由其它人產(chǎn)生的抗體稱為同源抗體。人對(duì)同源抗體不產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)。如果用于人的抗體是由不同種屬動(dòng)物產(chǎn)生的則稱為不同源或異源抗體。由于不同種屬動(dòng)物產(chǎn)生的抗體其抗原特征很不相同，因而人對(duì)異源抗體會(huì)產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)。
5、抗體的特異性一種抗原與其所誘發(fā)產(chǎn)生的抗體之間的關(guān)系猶如鑰匙與鎖的關(guān)系，是相互針對(duì)的，特異的。
6、抗體與抗原結(jié)合的親和力抗原與抗體抗原與抗體之間的親合力是指特異抗體與其所針對(duì)的抗原結(jié)合的緊密程度，親合力越大表示結(jié)合的越緊密。
7、抗體和破傷風(fēng)毒素的中和反應(yīng)破傷風(fēng)毒素的不同部位都可誘發(fā)產(chǎn)生抗體。只有那些針對(duì)毒素的特殊重要部位產(chǎn)生的抗體，才可以通過與該部位的結(jié)合而消除(亦即中和掉)毒素的功能。中和效價(jià)是指能中和固定量的毒素所需抗體的數(shù)量。所需的抗體量越少，該抗體中和效價(jià)越高?？贵w中和毒素的效價(jià)取決于抗體與毒素結(jié)合的緊密程度，是由抗體的化學(xué)結(jié)構(gòu)決定的。
8、漿細(xì)胞漿細(xì)胞是激活的B細(xì)胞，能生產(chǎn)分泌抗體。每個(gè)漿細(xì)胞只能生產(chǎn)針對(duì)一種抗原的抗體。
9、破傷風(fēng)毒素破傷風(fēng)毒素是破傷風(fēng)桿菌釋放的毒素，是一種分子量為150,000Da大小的蛋白質(zhì)，其病理作用是破壞人體神經(jīng)細(xì)胞而對(duì)人造成致命的傷害。
10、蛋白融合將兩個(gè)不同蛋白質(zhì)的基因片斷相連接，其表達(dá)產(chǎn)物是一條由兩個(gè)不同蛋白質(zhì)彼此之間以肽鍵相連接的單鏈蛋白質(zhì)。
11、免疫排斥反應(yīng)動(dòng)物對(duì)輸入體內(nèi)的其它不同種屬動(dòng)物的組織，器官或物質(zhì)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，甚至導(dǎo)致該組織器官或物質(zhì)壞死。
本發(fā)明提供了幾種新的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體，其特征在于，這些抗體是100％的人源抗體，它們的可變區(qū)的基因和蛋白質(zhì)序列是新的，其結(jié)構(gòu)包括抗體的可變區(qū)，(包括或不包括恒定區(qū))，該抗體具有中和破傷風(fēng)毒素的能力，其中，可變區(qū)的基因和蛋白質(zhì)序列如序列以及序列的同系物和修飾物組成，其中恒定區(qū)是人源免疫球蛋白重鏈或輕鏈的恒定區(qū)中任何一種。
本發(fā)明還提供了獲取絕大部分生產(chǎn)抗體的漿細(xì)胞資源的方法，從而提高篩選出高效價(jià)抗體克隆的幾率，該方法的特征是利用漿細(xì)胞表面受體進(jìn)行分離獲取。
本發(fā)明還提供了制備和生產(chǎn)這幾種人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的方法，其中包括利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)制造的方法。利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)制造的方法主要技術(shù)包括(1)抗體基因的克隆與序列分析；(2)抗體基因表達(dá)載體的構(gòu)建。(3)在一個(gè)合適的系統(tǒng)或宿主中，將抗體基因表達(dá)；(4)大量擴(kuò)增表達(dá)抗體的宿主系統(tǒng)；(5)對(duì)表達(dá)的抗體分離純化(6)對(duì)表達(dá)抗體的定性和定量分析。
上述利用基因重組技術(shù)的方法來(lái)制備和生產(chǎn)人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的方法，其中抗體基因的表達(dá)載體可利用質(zhì)粒載體、病毒載體或其它通用的載體，也可是動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的載體。
上述利用基因重組技術(shù)的方法來(lái)制備和生產(chǎn)人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的方法，其中抗體基因載體可轉(zhuǎn)入一個(gè)合適的系統(tǒng)中加以表達(dá)，其中適合的表達(dá)體系包括動(dòng)物和植物的細(xì)胞、細(xì)胞株或酵母、細(xì)菌，表達(dá)體系也可以是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
本發(fā)明提供了對(duì)上述人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的測(cè)試方法為，1、檢測(cè)抗體蛋白質(zhì)或基因核酸的序列；2、同時(shí)檢測(cè)抗體在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)破傷風(fēng)毒素具有保護(hù)作用。
本發(fā)明提供了上述這些人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體在制備用于治療破傷風(fēng)細(xì)菌感染的藥物的應(yīng)用，該抗體可用于制備預(yù)防破傷風(fēng)細(xì)菌感染藥物，上述抗體可被單獨(dú)或與其它成分一起制備各種劑型藥物，或與其它藥物一起制備成混合藥物或混合治療制劑。
本發(fā)明提供了上述這些人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體在制備診斷破傷風(fēng)細(xì)菌感染的制劑的應(yīng)用。
本發(fā)明技術(shù)方案的簡(jiǎn)述本發(fā)明是由下述主要技術(shù)步驟實(shí)現(xiàn)的(1)篩選出人的能生產(chǎn)分泌效價(jià)很高的抗破傷風(fēng)毒素抗體的漿細(xì)胞；(2)從這些細(xì)胞完整調(diào)出該抗體的可變區(qū)序列；(3)構(gòu)建抗體基因適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體；(4)將抗體基因載體放到適當(dāng)?shù)南到y(tǒng)或宿主內(nèi)表達(dá)出來(lái)，并選出穩(wěn)定表達(dá)抗體的克??；(5)收集并純化抗體；(6)通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選出那些能高效中和破傷風(fēng)毒素的抗體克??；(7)大量擴(kuò)增表達(dá)抗體的宿主；(8)純化制備抗體；(9)利用生產(chǎn)出的抗體制備用于治療破傷風(fēng)桿菌感染的藥物和制劑；(10)抗體用于體內(nèi)證明其對(duì)動(dòng)物對(duì)于破傷風(fēng)毒素的保護(hù)作用。
有關(guān)本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明提供了幾種人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體，其特征在于這些抗體是人源抗體，其結(jié)構(gòu)包括抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)，其可變區(qū)的基因和蛋白質(zhì)序列與現(xiàn)有報(bào)道的不相同，該抗體具有中和破傷風(fēng)毒素的能力。
上述的幾種新的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體，其抗體可變區(qū)的基因和蛋白質(zhì)序列是由序列1以及序列1的同系物和修飾物組成；同系物指抗體可變區(qū)的蛋白序列，其同系性達(dá)到上述序列的60％或以上、70％或以上、80％或以上；修飾物指這種修飾包括對(duì)序列1的氨基酸或它們的核酸序列通過取代，增加或截短加以改變，但改變的產(chǎn)物仍舊保留該抗體的主要特征，即表達(dá)的抗體蛋白具有中和破傷風(fēng)毒素的能力。此外，同系物和修飾物還指那些對(duì)抗體序列改變和修飾的目的是為了達(dá)到增強(qiáng)治療或預(yù)防效應(yīng)；或是為了提高產(chǎn)品在體外的穩(wěn)定性或?qū)w內(nèi)蛋白酶的抵御能力；或?qū)＠贵w蛋白質(zhì)在翻錄合成后所做的修飾，由這些變化衍生出的產(chǎn)物只要保留有本發(fā)明抗體的主要特征，也即表達(dá)的抗體蛋白具有中和破傷風(fēng)毒素的能力，應(yīng)屬本發(fā)明的范圍。
上述的幾種新的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體，其結(jié)構(gòu)包括抗體的可變區(qū)或抗體的恒定區(qū)，這些抗體可變區(qū)的基因和蛋白質(zhì)序列是由序列1以及序列1的同系物和修飾物組成，而這些抗體的恒定區(qū)可以是人源免疫球蛋白重鏈或輕鏈的恒定區(qū)中任何一種，即可變區(qū)片段可與不同的人體免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)或輕鏈的恒定區(qū)融合。這里重鏈恒定區(qū)所指的是人源IgG，IgM，IgA，IgE，IgD；這其中的IgG包括IgG1，IgG2，IgG3，IgG4；其中輕鏈的恒定區(qū)片段包括人體免疫球蛋白輕鏈的κ或λ的恒定區(qū)。這里重鏈恒定區(qū)所指的是包含有絞鏈區(qū)(hingeregion)以及CH1，CH2和CH3區(qū)域或其中的任何片段。
對(duì)本發(fā)明人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的改變和修飾，如下的各種改變和修飾應(yīng)當(dāng)包括在本發(fā)明之內(nèi)。
基本上說(shuō)，如果對(duì)上述抗體的改變和修飾是為了達(dá)到增強(qiáng)治療或預(yù)防效應(yīng)；或是為了提高產(chǎn)品在體外的穩(wěn)定性(對(duì)體內(nèi)蛋白酶的抵御能力)；或?qū)Ρ景l(fā)明人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的蛋白質(zhì)在翻錄合成后所做的修飾，如改變糖化或磷酸化成分，由這些變化衍生出的產(chǎn)物只要保留有本人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的主要特征，亦即表達(dá)的抗體蛋白具有中和破傷風(fēng)毒素的能力，既應(yīng)當(dāng)包括在本發(fā)明之內(nèi)。
這種修飾包括對(duì)本發(fā)明人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的氨基酸或它們的核酸序列通過取代，增加或截短來(lái)加以改變，但改變的產(chǎn)物仍舊保留本發(fā)明人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的主要特征，比如亮氨酸可被異亮氨酸或頡氨酸取代，酸性氨基酸之間(或堿性氨基酸之間，中性氨基酸之間，極性氨基酸之間或非極性氨基酸之間，芳香性氨基酸之間)等等可相互取代。一般認(rèn)為，只要改變后的產(chǎn)物與本發(fā)明的各種抗體的序列，尤其是可變區(qū)序列有80％或以上相同，同時(shí)具有中和破傷風(fēng)毒素的能力，就應(yīng)屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
另外，本發(fā)明人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體蛋白質(zhì)或它們的核酸序列亦可在其側(cè)鏈化學(xué)基團(tuán)上加上其它化合物而保留本發(fā)明人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的主要特征，如鹽基，從而增加其可溶性；或同位素，如鈷60，碘125，硫35等等，或熒光物，或它們的核酸序列嵌合雜交，如毒素片段，以達(dá)到殺傷靶細(xì)胞的作用。這些都是普遍運(yùn)用的保留本發(fā)明人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體主要特征的方法。
本發(fā)明的上述人源抗破傷風(fēng)毒素抗體的另外特征是它們可以在體內(nèi)中和破傷風(fēng)毒素，這種中和破傷風(fēng)毒素的能力遠(yuǎn)比過去報(bào)道的性能高得多，其可在體內(nèi)和體外高效地中和破傷風(fēng)毒素。本發(fā)明實(shí)施案例提供了有關(guān)的試驗(yàn)結(jié)果用小白鼠試驗(yàn)證明，上述抗體可保護(hù)動(dòng)物抵御破傷風(fēng)毒素的攻擊，具有很高的效價(jià)。如果將兩種不同的抗體混合使用，其中中和破傷風(fēng)毒素的劑量比單獨(dú)使用一種抗體會(huì)進(jìn)一步明顯減少，治療效果顯著提高。
本發(fā)明的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體是通過下述幾個(gè)主要技術(shù)步驟實(shí)現(xiàn)的(1)篩選出人源生產(chǎn)分泌抗破傷風(fēng)毒素抗體的漿細(xì)胞；(2)從這些細(xì)胞完整調(diào)出該抗體的可變區(qū)序列；(3)構(gòu)建抗體基因適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體；(4)將抗體基因載體放到適當(dāng)?shù)乃拗鲀?nèi)表達(dá)出來(lái)，并選出穩(wěn)定表達(dá)抗體的克?。?5)通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選出那些能高效中和破傷風(fēng)毒素的抗體克隆。(6)測(cè)定這些抗體的核酸或蛋白序列。
首先，本發(fā)明篩選獲得產(chǎn)生并分泌抗破傷風(fēng)毒素的B淋巴漿細(xì)胞是通過下述獨(dú)創(chuàng)方法而實(shí)現(xiàn)的首先從一新近用破傷風(fēng)疫苗免疫的健康捐血者獲得外周血。經(jīng)常規(guī)的方法分離出外周血中的主要B-淋巴細(xì)胞組份，比如通過密度離心方法。分泌抗體的漿細(xì)胞由于表面帶有某些特有的蛋白質(zhì)，利用與這些蛋白特異結(jié)合的方法可將這些漿細(xì)胞分離出來(lái)。比如漿細(xì)胞表面帶有趨化因子受體CXCR3。利用與CXCR3特異結(jié)合的配體IP-10通過細(xì)胞誘導(dǎo)移動(dòng)實(shí)驗(yàn)方法將漿細(xì)胞分離出。將漿細(xì)胞稀釋并放到96孔板(平均每孔1-2個(gè)細(xì)胞)對(duì)每個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)。漿細(xì)胞培養(yǎng)過程需要加入一些特殊的生長(zhǎng)因子，比如經(jīng)同位素射線照射過的EL-4-B5細(xì)胞作為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，淋巴介素IL-2等。經(jīng)過若干天的培養(yǎng)，收集細(xì)胞的上清液。通過檢測(cè)(比方用酶聯(lián)免疫方法檢測(cè))上清中有無(wú)與破傷風(fēng)毒素的特異結(jié)合的抗體，篩選出一些能分泌抗破傷風(fēng)毒素抗體的漿細(xì)胞克隆。本發(fā)明使用的通過漿細(xì)胞表面受體獲取產(chǎn)生抗體細(xì)胞的方法相比過去曾經(jīng)報(bào)道過的所有方法具有明顯的長(zhǎng)處，因?yàn)?，理論上本發(fā)明的方法可使我們獲得幾乎全部的生產(chǎn)抗體的漿細(xì)胞，從而使篩選出高效價(jià)抗體克隆的幾率大大提高；而其他的方法，比如細(xì)胞融合法，都只能獲取生產(chǎn)抗體的漿細(xì)胞的其中一部分，甚至一小部分，所以這些方法使篩選出高效價(jià)抗體克隆的幾率明顯減少。
將抗破傷風(fēng)毒素抗體的基因從這些漿細(xì)胞克隆復(fù)制出來(lái)可以利用多種不同的方法。比方本實(shí)施案例1中描述的方法，或其它靈敏的方法，將上述篩選出的漿細(xì)胞的信使RNA提取出來(lái)，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生化反應(yīng)將全部信使RNA轉(zhuǎn)變成cDNA；利用設(shè)計(jì)的特殊引物(比如實(shí)施例2所述)將各個(gè)樣本中抗體的重鏈或輕鏈的可變區(qū)經(jīng)靈敏的PCR方法(比方雀巢式PCR)分別克隆出來(lái)。當(dāng)然，也可將整個(gè)抗體的輕鏈和重鏈，亦即包括可變區(qū)和衡定區(qū)的整個(gè)基因片段克隆出來(lái)，測(cè)定克隆的基因序列。
本發(fā)明提供了如何制備上述人源抗破傷風(fēng)毒素抗體的辦法，包括化學(xué)合成方法和基因重組方法。其中，化學(xué)合成方法可以是將抗體蛋白質(zhì)先分作幾個(gè)片段分別進(jìn)行合成，然后，再按其序列前后將這些片段相互連接起來(lái)。其中蛋白質(zhì)合成可以用固相或液相合成兩種主要技術(shù)方法，這兩種技術(shù)的具體方法與一般目前通用技術(shù)方法相同，在此不再描述。利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)制造上述抗體的方法主要技術(shù)包括(1)抗體基因表達(dá)載體的構(gòu)建；(2)在一個(gè)合適的系統(tǒng)或宿主中，將抗體基因表達(dá)；(3)對(duì)表達(dá)系統(tǒng)或宿主的大規(guī)模擴(kuò)增；(4)對(duì)表達(dá)抗體的純化分離；(5)對(duì)表達(dá)抗體的定性和定量分析。
本發(fā)明構(gòu)建上述抗破傷風(fēng)毒素抗體基因的表達(dá)載體具體是通過下述方法實(shí)現(xiàn)的首先選擇適合表達(dá)人源抗體的表達(dá)載體。由于抗體是糖基化蛋白質(zhì)，真核細(xì)胞表達(dá)載體應(yīng)是比較合適的，比如哺乳動(dòng)物表達(dá)載體和酵母細(xì)胞表達(dá)載體都很合適。表達(dá)抗破傷風(fēng)毒素抗體基因的載體可用質(zhì)粒載體，如實(shí)施例3所示的抗體重鏈hCg1載體和抗體輕鏈hCK載體，它們都是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的質(zhì)粒載體，分別表達(dá)人源抗體重鏈的和輕鏈的恒定區(qū)。也可是病毒載體，植物表達(dá)載體，酵母表達(dá)載體或其它通用的載體，或是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所用的載體。載體中可帶有各種調(diào)控基因片段，比如啟動(dòng)子(如CMV啟動(dòng)子)，和增強(qiáng)子(如EU增強(qiáng)子)等等。為了篩選方便，載體還可裝進(jìn)針對(duì)不同抗菌素的阻抗基因，如此抗Neomycin和抗Puromycin的基因。載體中還可加入其它的基因片段，只要這些基因所達(dá)到的目的是有關(guān)本發(fā)明人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的基因的表達(dá)，都應(yīng)屬于本發(fā)明的范疇。將克隆的抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)基因用特定的限制性內(nèi)切酶切下，并將重鏈和輕鏈的可變區(qū)基因分別接到表達(dá)載體中，與抗體的恒定區(qū)片段連接。如果克隆的是整個(gè)抗體的基因片段(包括可變區(qū)和恒定區(qū)的整個(gè)基因片段)，則將這整個(gè)基因片段克隆到一個(gè)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中。
本發(fā)明還提供了為表達(dá)上述抗破傷風(fēng)毒素抗體基因所必需的系統(tǒng)或宿主。上述構(gòu)建好的表達(dá)載體通過電擊法或其它方法被導(dǎo)入合適的宿主中進(jìn)行表達(dá)?？贵w是糖基化蛋白質(zhì)，故最好采用真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。比如，哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)就很適合人源抗體的表達(dá)，因?yàn)樵撓到y(tǒng)保證表達(dá)的蛋白質(zhì)的糖基化與人的完全一致。另外通過基因改造的酵母系統(tǒng)(該酵母系統(tǒng)進(jìn)行哺乳動(dòng)物般糖基化)也很合適進(jìn)行表達(dá)。利用哺乳動(dòng)物系統(tǒng)表達(dá)可以在細(xì)胞水平進(jìn)行，比如常用的有CHO細(xì)胞，HEK293細(xì)胞，COS細(xì)胞，NS/O或HELA細(xì)胞，還可是昆蟲細(xì)胞，如Rf9細(xì)胞，或者是酵母細(xì)胞，尤其是經(jīng)基因改造后能進(jìn)行哺乳動(dòng)物相同的糖基化的酵母等等。亦可通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行。后者將抗體基因?qū)Ｈ雱?dòng)物的卵細(xì)胞，使克隆出的動(dòng)物能夠自動(dòng)地表達(dá)克隆的抗體，并從奶或其它分泌物中大量地分泌出來(lái)。該法避免了大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞的工業(yè)化投資，具有很大的經(jīng)濟(jì)前景。比方本發(fā)明實(shí)施例4中采用的CHO細(xì)胞作為表達(dá)上述抗破傷風(fēng)毒素抗體基因所必需的宿主。它的長(zhǎng)處是利用CHO表達(dá)生產(chǎn)蛋白制劑是目前世界上最成熟和受歡迎的辦法。大工業(yè)化生產(chǎn)工藝已成熟；CHO細(xì)胞可在無(wú)血清培養(yǎng)液中生長(zhǎng)傳代。這使得整個(gè)生產(chǎn)過程無(wú)需使用任何動(dòng)物制劑，從而避免了病毒污染；用CHO細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)工藝已得到國(guó)際認(rèn)可。若干種用此方法生產(chǎn)出的蛋白制劑已完全達(dá)到臨床合格標(biāo)準(zhǔn)。選出能穩(wěn)定表達(dá)分泌抗體，而且這些抗體能中和破傷風(fēng)毒素的宿主細(xì)胞。經(jīng)過初步篩選后，進(jìn)一步可通過檢測(cè)載體的抗菌素阻抗基因的表達(dá)，或檢測(cè)分泌抗體的能力。具體方法見本文，舉例如本發(fā)明實(shí)施案例4。
本發(fā)明提供了如何將前述的抗破傷風(fēng)毒素抗體基因以分泌蛋白形式生產(chǎn)表達(dá)的方法，比如在蛋白基因的氨基末端加上先導(dǎo)序列，使表達(dá)的產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)細(xì)胞以外的上清液中。先導(dǎo)序列在蛋白質(zhì)分泌過程中被截掉。附件1給出了一些先導(dǎo)序列的例子。如果是利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)表達(dá)，則載體構(gòu)建可將抗體以分泌蛋白方式分泌到動(dòng)物的排泄物，如乳汁中。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了如何生產(chǎn)上述人源抗破傷風(fēng)毒素抗體的方法，包括了以基因重組，發(fā)酵技術(shù)為生產(chǎn)手段生產(chǎn)抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的方法。該方法是通過下述技術(shù)實(shí)現(xiàn)的原則上，上述制備人源抗破傷風(fēng)毒素抗體的方法，如利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如CHO細(xì)胞，酵母宿主或表達(dá)系統(tǒng)，都可通過大規(guī)模來(lái)培養(yǎng)這些宿主達(dá)到批量生產(chǎn)抗體的目的。比方利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)抗體，可以利用滾筒式培養(yǎng)瓶，或纖維管式培養(yǎng)瓶，或發(fā)酵罐式增加細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模。每項(xiàng)技術(shù)都有成熟工藝，也有成功產(chǎn)品為例，具體所用的設(shè)備及發(fā)酵工藝如一般通用方法，在此不做進(jìn)一步說(shuō)明。具體方法舉例如本發(fā)明實(shí)施案例6。
本發(fā)明還提供了如何提高抗體產(chǎn)品產(chǎn)量的辦法。目前有若干種不同的提高基因表達(dá)水平的方法。舉例如下如本發(fā)明實(shí)施例中使用的將Dhfr(dihydrofolatereductase)基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，利用提高Dhfr酶底物MTX(methotrexate)的辦法篩選出高表達(dá)細(xì)胞株，以供生產(chǎn)使用。本發(fā)明列舉的實(shí)施例顯示生產(chǎn)分泌出的抗體產(chǎn)量可達(dá)3毫克/109細(xì)胞每天分泌到1升培養(yǎng)上清。通過進(jìn)一步的篩選還可使產(chǎn)量提高更多。
本發(fā)明的抗體基因還可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)利用動(dòng)物來(lái)表達(dá)生產(chǎn)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以達(dá)到很高的表達(dá)水平，生產(chǎn)成本低。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了如何將生產(chǎn)分泌的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體產(chǎn)物分離純化的方法，具體是通過下述方法實(shí)現(xiàn)的許多種方法都可將抗體產(chǎn)品分離純化。比如實(shí)施例7所采用的親合層析分離方法。親合層析可利用各種不同的能與表達(dá)抗體特異結(jié)合的物質(zhì)，比如實(shí)施例7中使用蛋白質(zhì)A，將其偶連到載體支撐物上。蛋白質(zhì)A通過與抗體特異結(jié)合，達(dá)到理想的分離純化結(jié)果。除了蛋白質(zhì)A還有其它一些能與抗體特異結(jié)合的蛋白質(zhì)或模擬化合物作親合層析。除了親合層析分離方法還有其它種方法可用來(lái)分離抗體產(chǎn)品，比如灌注層析技術(shù)等等，在此不加詳述，具體方法可參考有關(guān)資料。
本發(fā)明還提供了分泌人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的鑒定和篩選方法，通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選出那些能中和破傷風(fēng)毒素，并能在體內(nèi)對(duì)破傷風(fēng)毒素起保護(hù)作用的抗體及其表達(dá)宿主克隆。該項(xiàng)技術(shù)可通過下述方法實(shí)現(xiàn)抗破傷風(fēng)毒素抗體可根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征和生物功能特征來(lái)利用各種方法進(jìn)行鑒定。比方用酶聯(lián)反應(yīng)(ELISA)方法和同位素標(biāo)記抗體競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)方法(RIA)可以檢測(cè)抗體本身的化學(xué)特征.利用與破傷風(fēng)毒素的免疫中和反應(yīng)(抗原抗體中和反應(yīng))實(shí)驗(yàn)，或?qū)ψ⑸淦苽L(fēng)毒素的動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)等等方法可以檢定抗體的功能特征，以及中和毒素能力的大小。具體舉例說(shuō)，將轉(zhuǎn)入抗體基因表達(dá)載體的細(xì)胞培養(yǎng)并收集培養(yǎng)上清液。通過上述方法中來(lái)分析鑒定轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞是否合成并分泌抗體。挑選出那些能夠分泌抗體，而且該抗體可以中和破傷風(fēng)毒素的細(xì)胞株。這些細(xì)胞株很可能發(fā)生具有醫(yī)用價(jià)值。這些鑒定方法還可用來(lái)對(duì)生產(chǎn)的抗體質(zhì)量和效價(jià)進(jìn)行檢定。上述許多方法，如ELISA，RIA，抗原抗體中和反應(yīng)實(shí)驗(yàn)都是常規(guī)應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法，在此無(wú)須詳述，具體操作可參考如免疫學(xué)方法類書刊雜志或本發(fā)明的實(shí)施案例4和9。破傷風(fēng)毒素動(dòng)物體內(nèi)保護(hù)實(shí)驗(yàn)具體方法舉例如本發(fā)明的實(shí)施例9。
本發(fā)明的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體的應(yīng)用該人源抗破傷風(fēng)毒素抗體由于能夠高效中和破傷風(fēng)毒素，可應(yīng)用于制作治療破傷風(fēng)桿菌感染的各類藥物和藥物組合物，以及用于制備診斷破傷風(fēng)桿菌感染的各種制劑或制劑組合物，具體見實(shí)施例9所述。其中用于制備治療破傷風(fēng)桿菌感染的各類藥物和藥物組合物本發(fā)明的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體，由于能夠高效地中和破傷風(fēng)毒素，可用來(lái)制備藥物和藥物組合物來(lái)治療破傷風(fēng)桿菌感染所造成的致命傷害。具體舉例見本發(fā)明的實(shí)施例9。本發(fā)明包括上述人源抗破傷風(fēng)毒素抗體可被制備成不同的藥物劑型，單獨(dú)或與其它成分一起。比如(但不限于)作為藥品的劑型可以是注射藥品，口服藥品或局部用藥(包括直腸給藥，或噴霧給藥的劑型如鼻部噴霧或口吸噴霧等)的各種劑型。比方實(shí)施案例9是作為溶液靜脈給藥的例子。本發(fā)明還包括上述的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體被制備成與其它藥物或方法一起的聯(lián)合治療制劑或技術(shù)。比方(但不限于)本發(fā)明的抗體可與其它治療感染藥物一起使用，達(dá)到不僅抑制破傷風(fēng)毒素，還殺死感染病源的效果。
本發(fā)明的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體作為藥物有很多優(yōu)勢(shì)，其中包括1、由于該抗體是人源抗體，不會(huì)引起明顯的過敏反應(yīng)；2、由于該抗體在體內(nèi)的半壽期很長(zhǎng)，能夠很好地維持藥品有效濃度；3、由于其具有很高的中和破傷風(fēng)毒素的能力，因而用量少，治療效果顯著；4、可以通過采用無(wú)動(dòng)物源污染的生產(chǎn)工藝，從而大大減低由病毒污染造成的危害。以上優(yōu)點(diǎn)顯然大大地提高了本發(fā)明的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體作為藥物的臨床應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體可用于制備診斷破傷風(fēng)桿菌感染的各種制劑或制劑組合物。比方(但不限于)將抗體同位素標(biāo)記后用于破傷風(fēng)桿菌感染的診斷。本發(fā)明還包括上述的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體被單獨(dú)或成與其它藥物，制劑或方法一起制備的聯(lián)合診斷制劑或技術(shù)。
實(shí)施例1獲得和篩選產(chǎn)生分泌抗破傷風(fēng)毒素抗體的人源漿細(xì)胞。
從一新近用破傷風(fēng)疫苗免疫的20歲男姓健康捐血者獲得100毫升的外周血。該捐血者無(wú)任何慢性病史，捐血時(shí)無(wú)任何疾病癥狀，15天之前接受破傷風(fēng)疫苗免疫，除此而外在過去的一年中未注射任何其它疫苗。將該全血經(jīng)EDTA處理，并通過Ficoll的密度梯度半小時(shí)離心，3000轉(zhuǎn)/分鐘。將Ficoll中間層吸出，從而獲得血液白細(xì)胞。將白細(xì)胞懸浮液放到細(xì)胞培養(yǎng)瓶于37度保溫1小時(shí)，以除去粘附在塑料表面的單核細(xì)胞。將抗CD19抗體偶聯(lián)的磁珠(Dynabeads)與清洗過的未粘附的白細(xì)胞混合(20個(gè)磁珠/1×108細(xì)胞/毫升)并在4℃在旋轉(zhuǎn)器中保溫30分鐘。利用磁場(chǎng)力將磁珠分離。將磁珠上的B淋巴細(xì)胞按照Dynal產(chǎn)品提供的方法分離下來(lái)。將所有的B細(xì)胞懸浮到300微升培養(yǎng)液里，加到transwell膜板(Bacton& Dicson)的上孔里。該孔膜的下面加上趨化因子，比如IP-10。經(jīng)保溫3小時(shí)收集由上孔移動(dòng)到下孔的漿細(xì)胞。將收集到的漿細(xì)胞稀釋并放到96孔板(平均每孔1-2個(gè)細(xì)胞)對(duì)每個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)。經(jīng)過10天的培養(yǎng)，收集細(xì)胞的上清液。通過酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)上清中有無(wú)分泌的抗破傷風(fēng)毒素的抗體。酶聯(lián)免疫反應(yīng)法簡(jiǎn)述如下將破傷風(fēng)毒素(北京生物制品所)過夜吸附到酶聯(lián)反應(yīng)板上。與含有牛乳蛋白的緩沖液保溫以除去了非特異結(jié)合。之后，將上述收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液加到酶聯(lián)反應(yīng)板上，共同保溫2小時(shí)。清洗后加酶標(biāo)二抗(鼠抗人IgG抗體)并保溫2小時(shí)。清洗除去未游離的二抗，加入酶底物對(duì)結(jié)合的酶標(biāo)二抗顯色。酶標(biāo)顯色的結(jié)果表示上清標(biāo)本中抗破傷風(fēng)毒素抗體的含量。利用此法篩選出一些能分泌抗破傷風(fēng)毒素抗體的漿細(xì)胞克隆總結(jié)如表1。從200個(gè)克隆中共發(fā)現(xiàn)23個(gè)漿細(xì)胞分泌抗破傷風(fēng)毒素抗體。其中兩個(gè)克隆產(chǎn)生的抗體與毒素結(jié)合的效價(jià)特別高(也即結(jié)合的濃度很低)。
實(shí)施例2克隆人源抗破傷風(fēng)毒素抗體可變區(qū)基因片段。
首先將實(shí)施例1篩選出的漿細(xì)胞克隆的細(xì)胞用含有NP-40，RNA酶抑制劑的溶解液在4℃溶解10-30分鐘。將細(xì)胞溶解液與含有逆轉(zhuǎn)錄酶的緩沖液混合。通過逆轉(zhuǎn)錄生化反應(yīng)將每個(gè)克隆的mRNA分別轉(zhuǎn)變成cDNA庫(kù)。具體如下逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的條件為65℃3分鐘，緩慢降溫至22℃，保溫3分鐘。加入新鮮的含有逆轉(zhuǎn)錄酶的緩沖液。38℃保溫100分鐘。之后，65℃保溫以使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)終止。
設(shè)計(jì)一組引物如下所示，以克隆抗體的輕鏈和重鏈。VH引物包括GGG AAT TCC CAT GGA CTG GAC CTG GAGGG AAT TCA TGG ACA TAC TTT GTT CCA CCCA AGC TTG CTC YTG GAG SAG GGY GCC AGG GGG AAVK恒定區(qū)引物包括TTA GGA TCC ATG GTG TTG CAG ACC CAG GTCTCC AGC TTC ATC AGA TGG CGG GAA GATV□引物包括ATG GCC TGG GTC TCC TTC TAC CTAATG GCC TGG ATG ATG CTT CTC CTCGAG TCA TTC TCG ACT GCT AGC CAC AGT ACG TAG GAC GGT SAS CTT GGT CC利用上述引物和dNTP混合物將各樣品中抗體的重鏈或輕鏈連帶前導(dǎo)序列復(fù)制出來(lái)。5’-末端及3’-末端分別接上限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)。PCR條件如下94℃1分鐘，50℃2分鐘，72℃2分鐘，共5個(gè)循環(huán)，之后72℃4分鐘；接下來(lái)94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘，35個(gè)循環(huán)，最后72℃4分鐘。
利用設(shè)計(jì)的另一組引物可以把抗體輕鏈和重鏈的可變區(qū)克隆出來(lái)。圖1顯示的是克隆出的若干個(gè)人源抗破傷風(fēng)毒素抗體可變區(qū)的DNA片段(PCR產(chǎn)物)的凝膠電泳圖。復(fù)制出的重鏈和輕鏈的可變區(qū)大小約為440bp。復(fù)制出的抗體重鏈和輕鏈大小約為1400bp。
將抗體的重鏈和輕鏈的基因分別接到pCR2.1質(zhì)粒載體(INVITROGEN)DNA中。利用抗菌素Ampicillin篩選出克隆成功的菌株。制備該菌株的質(zhì)粒載體。測(cè)定該質(zhì)粒載體中克隆的基因序列。
序列1顯示的包括抗體B和抗體D重鏈可變區(qū)序列和輕鏈可變區(qū)序列。
實(shí)施例3構(gòu)建人源抗破傷風(fēng)毒素抗體的表達(dá)載體。
圖2和圖3為抗體重鏈載體hCg1和抗體輕鏈載體hCK示意圖。在這兩個(gè)載體中我們選擇以CMV為啟動(dòng)子，以EU為增強(qiáng)子。載體的大小約為7000bp。在這兩個(gè)載體中，抗體IgG重鏈的恒定區(qū)IgGγ1和輕鏈的恒定區(qū)k的cDNA已分別接到載體CMV為啟動(dòng)子的下游。將上述實(shí)施例1所克隆出并接在pCR2.1質(zhì)粒載體的抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)基因片段用特定的限制性內(nèi)切酶切下，并分離純化。將重鏈和輕鏈的可變區(qū)基因分別接到兩個(gè)不同的表達(dá)載體中輕鏈的可變區(qū)基因接到抗體輕鏈載體hCK中，與其帶有的人源抗體輕鏈的k恒定區(qū)基因片段的5‘末端相連；重鏈的可變區(qū)基因接到抗體重鏈載體hCg1中，與其帶有的人源抗體重鏈的IgGγ1恒定區(qū)基因片段的5‘端相連。不同的細(xì)胞克隆出的抗體被分別命名為QA(即輕鏈A)和ZA(即重鏈A)；QB和ZB；QD和ZD，等等。
圖4顯示的是基因重組的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體重鏈和輕鏈cDNA片段的凝膠電泳圖。
實(shí)施例4人源抗破傷風(fēng)毒素抗體基因在真核細(xì)胞CHO里的表達(dá)。
具體方法如下將接好的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體重鏈基因載體和抗體輕鏈基因載體，比如載體QD和載體ZD的cDNA線性化后，用電擊法轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞內(nèi)。由于抗體重鏈載體hCg1帶有抗Gentamycin的基因，所以用Gentamycin(G418)來(lái)篩選抗體重鏈的表達(dá)；由于抗體輕鏈載體hCK帶有抗Puromycin的基因，所以用Puromycin來(lái)篩選抗體輕鏈的表達(dá)；經(jīng)過用G418(1毫克/毫升)，和Purimycin□(2.5微克/毫升)3-4周的篩選，篩選出同時(shí)對(duì)Puromycin及Gentamycin都不敏感的細(xì)胞株，冷凍收藏.該細(xì)胞株為穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞克隆。這些細(xì)胞克隆有可能生產(chǎn)完整的抗體。為確認(rèn)這一點(diǎn)，還需要作進(jìn)一步檢測(cè)，如實(shí)施案例5。
實(shí)施例5鑒定基因重組并表達(dá)分泌的抗體是由重鏈和輕鏈組成的完整抗體。
將上述細(xì)胞株B和D培養(yǎng)兩周后，分別收集各自的細(xì)胞培養(yǎng)上清。通過ELISA方法鑒定轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞是否合成并分泌抗體。具體說(shuō)來(lái)，將收集的培養(yǎng)上清液與制備好的鼠抗人IgG1抗體和鼠抗人□鏈抗體利用酶聯(lián)反應(yīng)作檢測(cè)試驗(yàn)。圖5顯示克隆D和B的基因已被插入CHO細(xì)胞(倉(cāng)鼠細(xì)胞)基因并成功表達(dá)，合成的抗體蛋白已分泌到培養(yǎng)液中，因而可以與抗人體IgG抗體呈劑量依賴的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)。另外，通過凝膠電泳和SDS-page試驗(yàn)證實(shí)，分泌抗體的分子量在不還原的條件下為75kDa，在還原的條件下顯示兩條帶，其分子量分別為50kDa和23kDa(結(jié)果為顯示)，說(shuō)明了分泌的抗體是具有輕鏈和重鏈的完整體。
實(shí)施例6利用無(wú)血清培養(yǎng)液制備生產(chǎn)基因重組的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體。
為了獲得高產(chǎn)細(xì)胞株，我們將Dhfr基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到表達(dá)抗體的CHO細(xì)胞。利用提高培養(yǎng)液中MTX的辦法篩選出高表達(dá)細(xì)胞株。將CHO細(xì)胞克隆D和B在含有5％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。每3天更換一次培養(yǎng)液。在此過程中逐漸將RPMI1640培養(yǎng)液用INVITROGEN的無(wú)血清培養(yǎng)液取代，并將小牛血清的濃度減至1-2％。此后將該CHO細(xì)胞克隆D和B在2升滾筒式培養(yǎng)瓶中用無(wú)血清培養(yǎng)液在37℃分別大量培養(yǎng)。其間不斷部分更換培養(yǎng)液，并將細(xì)胞濃度維持在大約0.5-1×106/毫升。收集培養(yǎng)上清液，將其作超濾濃縮，然后4℃短期保存；或?qū)⑵淅鋬龈稍?，?20℃長(zhǎng)期保存。
實(shí)施例7分離純化表達(dá)生產(chǎn)的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體。
將實(shí)施例6中收集的CHOB和CHOD細(xì)胞培養(yǎng)上清液經(jīng)超濾濃縮后(過濾分子大小為10,000Da)。將該抗體濃縮液通過蛋白質(zhì)A制備的親和柱層吸方法進(jìn)行純化。首先將CL-4B-Protein A(Pharmacia)緩慢裝進(jìn)層析柱，并用PH7.0的磷酸(Tris)緩沖液平衡。將該抗體濃縮液緩慢加到層析柱里，室溫下保溫10分鐘以使抗體與之結(jié)合。用pH3.0的0.1M甘氨酸(Glycine)緩沖液將抗體洗脫下來(lái)(洗脫速度100-150厘米/小時(shí))。之后再用pH2.0的0.1M Glycine緩沖液將抗體進(jìn)一步洗脫。通過抗人體IgG的ELISA方法測(cè)定，從300毫升上清中得到100毫克人源抗體。經(jīng)分離純化測(cè)定，CHO B和CHO D細(xì)胞生產(chǎn)分泌抗體的產(chǎn)量為每1×106細(xì)胞每天分泌20微克。因?yàn)樵摽寺〖?xì)胞對(duì)Puromycin和Neomycin都不敏感，說(shuō)明表達(dá)的蛋白是由重鏈和輕鏈嵌合蛋白組成的完整抗體。
實(shí)施例8抗破傷風(fēng)毒素抗體在動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力實(shí)驗(yàn)。
50微克純化并用碘125標(biāo)記的抗破傷風(fēng)毒素的抗體，或人源免疫球蛋白IgG1(Sigma)由左耳靜脈分別打入體重2公斤的兔子體內(nèi)。每隔1小時(shí)從兔子的右耳靜脈取5毫升血。從第二天開始，改為每隔1-2天抽從后者取一次樣。通過測(cè)定同位素檢測(cè)血液中人的免疫球蛋白重鏈的含量。如下面表2所示，I125標(biāo)記的抗破傷風(fēng)毒素的抗體蛋白和人源的免疫球蛋白IgG1的半壽期相同，都大約為110小時(shí)。由于已知人源免疫球蛋白IgG1在人體內(nèi)的半衰期為21天，因而本發(fā)明的抗破傷風(fēng)毒素的抗體蛋白其體內(nèi)半衰期應(yīng)與人源免疫球蛋白IgG1相似，應(yīng)是目前臨床所用的馬的抗血清的半衰期很多倍。
實(shí)施例9人源抗破傷風(fēng)毒素抗體對(duì)動(dòng)物的保護(hù)作用試驗(yàn)。
將蛋白質(zhì)A親和層析分離純化的抗體D粗制備物對(duì)動(dòng)物進(jìn)行保護(hù)作用的試驗(yàn)，并與目前臨床唯一使用的藥品抗破傷風(fēng)牛血清制劑的療效進(jìn)行比較。舉例如下將破傷風(fēng)毒素標(biāo)抗(目前臨床使用的藥品即抗破傷風(fēng)毒素的馬血清制劑)4.5IU/ml(由北京生物制品所檢定)和破傷風(fēng)毒素(武漢生物制品研究所)分別溶于硼砂緩沖液。取試驗(yàn)小白鼠若干，每組三只，共5組。將未經(jīng)純化的上述細(xì)胞D分泌的上清液冷凍干燥物溶于蒸溜水。以不同濃度(0.1mg/kg-10mg/kg，蛋白質(zhì)/體重)的含有人源抗破傷風(fēng)毒素抗體的細(xì)胞B和D分泌上清與固定量的破傷風(fēng)毒素混合。作為對(duì)照，將0.5IU/ml的破傷風(fēng)毒素標(biāo)抗D與同樣劑量的破傷風(fēng)毒素混合。將各混合物在37℃結(jié)合1小時(shí)之后，分別給小鼠肌肉注射(0.4ml/只)。每天上午，下午各觀察一次，記錄小鼠發(fā)病與死亡情況。結(jié)果(表3)顯示，目前臨床使用的藥品即抗破傷風(fēng)毒素的馬血清制劑(破傷風(fēng)毒素標(biāo)抗)治療組在69小時(shí)之后動(dòng)物全部死亡。而以本發(fā)明的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體治療的動(dòng)物在治療劑量為0.4mg/kg體重或以上時(shí)全部正常，不發(fā)病。本發(fā)明的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體百分之百地保護(hù)動(dòng)物防御致死量的破傷風(fēng)毒素的攻擊。重復(fù)試驗(yàn)得到相同的結(jié)果。初步實(shí)驗(yàn)還顯示如果將抗體B和D混合注射，其中和同等量破傷風(fēng)毒素所需劑量比單純使用一種抗體所需劑量減少3-10倍，重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到相同結(jié)果。
初步實(shí)驗(yàn)還顯示，本發(fā)明的基因重組的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體的效價(jià)相當(dāng)高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抗體粗制品的中和毒素的效價(jià)已相當(dāng)于31,000IU/克蛋白質(zhì)粗制備物。本試驗(yàn)使用的抗體是利用含有牛血清培養(yǎng)液生產(chǎn)的，并只經(jīng)過蛋白質(zhì)粗制備物中含有大量的非特意免疫球蛋白。所以本發(fā)明的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體真實(shí)的中和效價(jià)應(yīng)是31,000IU/克的至少若干倍，效價(jià)相當(dāng)高。
圖表說(shuō)明表1篩選分泌抗破傷風(fēng)毒素抗體的人源漿細(xì)胞的部分總結(jié)

表2碘125標(biāo)記的抗破傷風(fēng)毒素抗體和人源免疫球蛋白IgG1在兔子體內(nèi)的半壽期

表3基因重組抗破傷風(fēng)毒素抗體對(duì)動(dòng)物體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果破傷風(fēng)標(biāo)抗4.5IU/毫升，北京生物制品檢定所破傷風(fēng)毒素2001年6月，武漢生物制品研究所試驗(yàn)動(dòng)物普通小鼠約16克/只(試驗(yàn)一)發(fā)病與死亡情況-正常+++發(fā)病程度由輕到重表示為+，++，+++，++++□死亡*注射后的時(shí)間

(試驗(yàn)二)發(fā)病與死亡情況-正常++++發(fā)病程度由輕到重表示為+，++，+++，++++Φ死亡*注射后的時(shí)間

圖1為本發(fā)明克隆的若干人源抗破傷風(fēng)毒素抗體可變區(qū)cDNA片段的凝膠電泳圖。顯示的是克隆出的若干個(gè)人源抗破傷風(fēng)毒素抗體可變區(qū)的DNA片段(PCR產(chǎn)物)的凝膠電泳圖。復(fù)制出的重鏈和輕鏈的可變區(qū)大小約為440bp。圖中在箭頭所指位置從左到右依此為輕鏈可變區(qū)QA，QB,Qc，重鏈可變區(qū)ZB。
圖2為本發(fā)明構(gòu)建的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體輕鏈的表達(dá)載體示意圖。圖中CMV為啟動(dòng)子，EU為增強(qiáng)子。載體的大小約為7000bp.VK為輕鏈的可變區(qū)，CK為輕鏈的恒定區(qū)，NheI和xhoI所標(biāo)之處為該限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)，Ampicillin和Puromycin為該抗菌素阻抗基因。
圖3為本發(fā)明構(gòu)建的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體重鏈的表達(dá)載體示意圖。圖中CMV為啟動(dòng)子，EU為增強(qiáng)子。載體的大小約為7000bp.VH為重鏈的可變區(qū)，CH為重鏈的恒定區(qū)，NheI和xhoI所標(biāo)之處為該限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)，Ampicillin和Neomycin為該抗菌素阻抗基因。
圖4為本發(fā)明基因重組的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體重鏈和輕鏈cDNA片段的凝膠電泳圖。顯示的是的兩個(gè)人源抗破傷風(fēng)毒素抗體輕鏈和輕鏈的cDNA片段(PCR產(chǎn)物)的凝膠電泳圖。復(fù)制出的重鏈和輕鏈大小分別為1.4kb和0.7kb。圖中所示從左到右依此為(1)100bp分子標(biāo)準(zhǔn)物，(2)B抗體重鏈cDNA片段，(3)D抗體重鏈cDNA片段，(4)B抗體輕鏈cDNA片段，(5)D抗體輕鏈cDNA片段，(6)質(zhì)粒載體。
圖5為本發(fā)明CHOB和CHOD細(xì)胞上清中所表達(dá)分泌的基因重組抗破傷風(fēng)毒素抗體的測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將收集的細(xì)胞CHOB和CHOD培養(yǎng)上清液加到酶聯(lián)反應(yīng)板上，與制備好的鼠抗人IgG 1抗體作結(jié)合試驗(yàn)。酶標(biāo)顯色的結(jié)果表示上清標(biāo)本中人源抗體的含量。顯示的是克隆抗體D(圓形)和B(三角形)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的CHO細(xì)胞(倉(cāng)鼠細(xì)胞)所表達(dá)的人源抗體蛋白已分泌到培養(yǎng)液中，因而可以與抗人體IgG抗體呈劑量依賴的結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)。
圖6為比較單一抗體對(duì)動(dòng)物的保護(hù)作用圖。給每組小鼠(每組2支)肌肉注射同樣致死劑量的破傷風(fēng)毒素，隔夜后分別給小鼠腹腔注射抗體D(125ng/只)或不同劑量的抗體D的混合物(1∶1重量比)。圖中顯示的是能夠保護(hù)動(dòng)物不致死所用的抗體劑量。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
序列1本發(fā)明的人源抗破傷風(fēng)毒素抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的核酸及氨基酸序列<110>龔小迪<120>人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體<160>8<210>1<211>143<212>PRT<213>人(human)<220>
<221>V-region<222>
<223>人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體D的輕鏈可變區(qū)蛋白質(zhì)的氨基酸序列(PS.QD)<400>1Met Asp Arg Gly Ala Leu Ala His Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp1 5 10 15Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser20 25 30Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45Gln Ile Ile Gly Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln lys Pro Gly Lys50 55 60Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val65 70 75 80Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr85 90 95Ile Ser Ser Leu Gln Arg Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln100 105 110Ser Tyr Ser Gly Leu Arg Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu115 120 125Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro130 135 140 143<210>2<211>142<212>PRT<213>人(human)<220>
<221>V-region<222>
<223>人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體B的輕鏈可變區(qū)蛋白質(zhì)的氨基酸序列(PS.QB)<400>2Met AspMet Glu Phe Leu Val Gln Leu Leu Phe Val Leu Leu Leu Trp1 5 10 15Leu Pro Asp Ile Thr Gly Glu Ile ValMet Thr Gln Ser Pro Ala Thr20 25 30Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser35 40 45Gln Ser Ile Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln50 55 60Thr Pro Arg Leu Leu Ile Phe Gly Ala Ser Thr Arg Ala Asn Gly Ile65 70 754 80Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr85 90 95Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln100 105 110Tyr Asn Asn Gly Ser Gly Ala Phe Gly Gln Gly Thr Ser Trp Arg Ser115 120 125Asn Glu Leu Trp Leu His His Leu Ser Ser Ser Ser Arg His130 135 140 142<210>3<211>147<212>PRT<213>人(human)<220>
<221>V-region
<222>
<223>人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體D的重鏈可變區(qū)蛋白質(zhì)的氨基酸序列(PS.ZD)<400>3Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Arg Ala Ala Leu Leu Arg Gly1 5 10 15Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Arg Tyr AlaMet His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Val Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Gly Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala65 70 75 80Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn85 90 95Thr Leu Phe Val GlnMet Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly SerMet Val Arg Gly Asp Gly Arg Asp115 120 125Asp Phe Trp Gly Gln Gly ThrMet Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr130 135 140Lys Gly Pro147<210>4<211>148<212>PRT<213>人(human)<220>
<221>V-region<222>
<223>人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體B的重鏈可變區(qū)蛋白質(zhì)的氨基酸序列(PS.ZB)<400>4Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly1 5 10 15Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Asn Leu Ser Gly Gly Thr Phe35 40 45Asn Ile Tyr Ala Ile Ser Asp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu TrpMet Gly Gly Val Ile Pro Ile His Gly Ala Val His Tyr Ala65 70 75 80Gln Lys Phe Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser85 90 95Thr Ala TyrMet Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr AlaMet100 105 110
Tyr Tyr Cys Gly Leu Leu Thr Thr Lys Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Thr115 120 125Met Asp Val Trp Gly Gln Gly ThrMet Val Thr Val Ser Ser Ala Ser130 135 140Thr Lys Gly Pro148<210>5<211>430<212>CDS<213>人(human)<220>
<221>V-region<222>
<223>人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體D的輕鏈可變區(qū)核酸序列(NS.QD)<400>5Atggacaggg gggccctggc gcaccttctg ggtctcctgc tactctggct ccgaggtgcc60agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga120gtcaccatca cttgccgggc aagtcagatc attggcagtt atttaaattg gtatcagcag180aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc cataccgcat ccagtttgca aagtggggtc240ccaccaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctcttaccat cagcagtctg300caacgtgaag atattgcaac ttactactgt caacagagtt acagtggcct caggtggacg360ttcggccaag ggaccaagct ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc420ttcccgccat----- 430<210>6<211>426<212>CDS<213>人(human)<220>
<221>V-region<222>
<223>人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體B的輕鏈可變區(qū)核酸序列(NS.QB)<400>6Atggacatgg agttcctggt gcagcttctc ttcgtcctgc tactctggct cccagatatc60actggagaga tagtgatgac gcagtctcca gccaccctgt ctgtgtctcc aggggaaaga120gccaccctct cctgcagggc cagtcagagt attagcagca acttagcctg gtatcagcag180aagcctggcc agactcccag gctcctcatc tttggtgcat ccaccagggc caatggcatc240ccagccaggt tcagtggcag tgggtatggg acagagttca cgctcaccat tagcagcctg300cagtctgaag attttgcagt ttattactgt cagcaatata ataatgggtc cggggcgttc360ggccaaggga ccagctggag atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc420cgccat 426<210>7<211>442
<212>CDS<213>人(human)<220>
<221>V-region<222>
<223>人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體D的重鏈可變區(qū)核酸序列(NS.ZD)<400>7Atggagcttg ggctgagctg ggtttttcgc gctgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag60gtgcagctgg tggagtctgg gggaggtgtg gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc120tgtgttggct ctggattcac cttcagtcgt tatgctatgc attgggtccg ccaggctccg180ggcaaggggc tggagtgggt ggcatcaaca tcatatgatg gaggcaataa atactacgca240gactccgtga agggccgatt caccatttcc agagacaatt ccaagaacac cttatttgtg300caaatgagca gcctgagagc agaggacacg gctgtttatt actgtgcgag agatgggagt360atggttcgcg gagacggaag ggatgacttc tggggccagg gaaccatggt caccgtctcc420tcagctagca ccaagggccc at 442---cg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc gca agc ttt ata aag ggc gaa ttc<210>8<211>445<212>CDS<213>人(human)<220>
<221>V-region<222>
<223>人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體B的重鏈可變區(qū)核酸序列(NS.ZB)<400>8Atggactgga cctggagggt cttcttcgtg gtggcagcgg ctacaggtgt ccagtcccag60gtacagctgg tgcagtcagg ggccgaggtg aagaagcctg ggtcctcggt gaaggtctcc120tgcaaccttt ctggaggcac cttcaacatc tatgctatca gctgggtgcg acaggcccct180ggacaagggc ttgagtggat gggaggggtc atcccgatcc atggtgcagt gcactacgcc240cagaagttcc aggatagagt caccattacc gcggacgagt ccacgagcac agcctacatg300gagctgagca gcctgagatc tgacgacacg gccatgtatt attgtggcct tctgactacg360aagaattact actactacta caccatggac gtctggggcc aagggaccat ggtcaccgtc420tcctcagcta gcaccaaggg cccat 44權(quán)利要求
1.一種人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體，其特征在于，其為人源抗體，包括抗體可變區(qū)，該可變區(qū)包括或不包括抗體的恒定區(qū)，該抗體具有中和破傷風(fēng)毒素的能力，抗體可變區(qū)的基因和蛋白質(zhì)序列為序列1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體，其特征在于，所述抗體可變區(qū)的基因和蛋白質(zhì)序列包括序列1所示的同系物或修飾物；同系物為抗體可變區(qū)的蛋白序列其同系性達(dá)到上述序列的60％或以上、70％或以上、80％或以上；修飾物為對(duì)人源抗體的氨基酸或它們的核酸序列通過取代、增加或截短進(jìn)行改變的產(chǎn)物仍舊保留人源抗體表達(dá)抗體蛋白具有中和破傷風(fēng)毒素的能力。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體，其特征在于，所述同系物和修飾物還包括對(duì)抗體蛋白質(zhì)翻錄合成后的修飾，使表達(dá)的抗體蛋白具有中和破傷風(fēng)毒素的能力，以達(dá)到增強(qiáng)治療或預(yù)防效應(yīng)、提高在體外的穩(wěn)定性或?qū)w內(nèi)蛋白酶的抵御能力。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體，其特征在于，所述抗體的恒定區(qū)是人源免疫球蛋白重鏈或輕鏈的恒定區(qū)中的任何一種；該重鏈恒定區(qū)是人源IgG，IgM，IgA，IgE，IgD的恒定區(qū)，以及包括有絞鏈區(qū)的重鏈恒定區(qū)或重鏈恒定區(qū)中的任何片段；所述輕鏈恒定區(qū)片段是人體免疫球蛋白輕鏈的κ或λ的恒定區(qū)。
5.一種如權(quán)利要求1所述的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的制備方法，其特征在于，其包括利用基因重組技術(shù)的方法和化學(xué)合成的方法來(lái)制備和生產(chǎn)；其中，利用基因重組技術(shù)的方法來(lái)制備，包括A、抗體基因的克隆與序列分析；B、抗體基因表達(dá)載體的構(gòu)建；C、在一個(gè)合適的系統(tǒng)或宿主持正義中，將抗體基因表達(dá)D、大量培養(yǎng)和擴(kuò)增抗體表達(dá)宿主；E、對(duì)表達(dá)的抗體分離純化F、對(duì)表達(dá)抗體的定性和定量分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述抗體基因的表達(dá)載體是質(zhì)粒載體、病毒載體、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的載體或者通用載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述抗體基因載體為轉(zhuǎn)入一個(gè)合適的系統(tǒng)或宿主中加以表達(dá)，適合的表達(dá)體系包括動(dòng)物和植物的細(xì)胞，細(xì)胞株、細(xì)菌或酵母；該動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體的方法，其特征在于，還包括A、檢測(cè)抗體蛋白質(zhì)或基因核酸的序列；B、檢測(cè)抗體在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)對(duì)注射的破傷風(fēng)毒素具有抑制其毒性的功能。
9.權(quán)利要求1所述的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體在制備預(yù)防破傷風(fēng)細(xì)菌感染藥品中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體在制備破傷風(fēng)細(xì)菌感染的診斷制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人源抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體及其制備方法和用途，其為人源抗體，包括抗體可變區(qū)，該可變區(qū)包括或不包括抗體的恒定區(qū)，該抗體具有中和破傷風(fēng)毒素的能力，抗體可變區(qū)的基因和蛋白質(zhì)序列如序列1所示；其具有不會(huì)誘發(fā)明顯的過敏反應(yīng)，有較高的效價(jià)且長(zhǎng)效，產(chǎn)品無(wú)動(dòng)物病毒污染，可以無(wú)限量地生產(chǎn)；本發(fā)明還提供了其生物功能、測(cè)定方法、生產(chǎn)制造方法及其應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K16/18GK1634991SQ20031012218
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2003年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月30日
發(fā)明者龔疆紅, 李卓婭 申請(qǐng)人:龔小迪