專(zhuān)利名稱(chēng)：酪氨酸酶活性調(diào)整劑、其制法及含該調(diào)整劑的外用制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括具有酪氨酸酶抑制或促進(jìn)活性的化合物作為活性成分的酪氨酸酶活性調(diào)整劑；并涉及包括該調(diào)整劑的外用制劑。本發(fā)明還涉及制備該化合物的方法。
具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及具有酪氨酸酶抑制活性的新型熊果苷酯化合物，包括該化合物作為活性成分的酪氨酸酶抑制劑，并涉及包括該抑制劑的外用制劑。此外，本發(fā)明涉及包括十一碳烯酸、其鹽或酯衍生物作為活性成分的酪氨酸酶抑制劑，并涉及包括該抑制劑的外用制劑。另外，本發(fā)明還涉及包括抗壞血酸或其衍生物作為活性成分的酪氨酸酶活性促進(jìn)劑以及包括該酪氨酸酶活性促進(jìn)劑的外用制劑。本發(fā)明也涉及用酶制備酯化合物的方法，該方法適用于制備酪氨酸酶抑制劑或促進(jìn)劑。
背景技術(shù)：
在具有酪氨酸酶抑制活性的化合物中，通常使用諸如熊果苷和曲酸的天然物質(zhì)作為化妝品和其它領(lǐng)域的美白劑(例如，Journal of thePharmaceutical Society of Japan，112(4)，pp.276-282，1992；Journalof the Pharmaceutical Society of Japan，115(8)，pp.626-632，1995；BIO INDUSTRY，11(4)，206，1994；和Biosci.Biotech.Biochem.，61，11，pp.1926-1928，1997)。然而，當(dāng)用于皮膚外用制劑如化妝品時(shí)，上述化合物的缺點(diǎn)在于它們具有高的親水性并因此具有差的皮膚吸收性。因此，需要開(kāi)發(fā)具有更高疏水性的熊果苷衍生物或其它化合物。苯酚部分被酯化的熊果苷衍生物是已知的美白劑(日本待審專(zhuān)利No.1999-71225)。此外，通過(guò)將熊果苷的6位轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基酯得到的化合物是已知的美白化妝品(日本待審專(zhuān)利No.1993-194181)。而且，已報(bào)道了利用脂肪酶通過(guò)熊果苷與肉桂酸乙烯酯的酯交換反應(yīng)選擇性酯化熊果苷的6位得到的化合物(Bioscience Biotechnology andBiochemistry，61，11，pp.1926-1928，1997)。然而，還沒(méi)有證實(shí)熊果苷衍生物的酪氨酸酶抑制活性和基于該活性的皮膚美白效果，而且還沒(méi)有得到具有令人滿(mǎn)意的效果的熊果苷衍生物。
十一碳烯酸是從人體皮膚中得到的C11不飽和脂肪酸，并起到皮膚清潔劑的重要作用。商業(yè)上是通過(guò)蓖麻油的熱解來(lái)生產(chǎn)該酸。已知十一碳烯酸及其鹽及衍生物具有抗菌作用，而且據(jù)報(bào)道可用作皮膚清潔劑(日本待審專(zhuān)利No.2002-114669)。最近已開(kāi)發(fā)海藻糖酯作化妝品原料(日本待審專(zhuān)利No.2001-278752和No.1993-137994)。但是還沒(méi)有報(bào)道十一碳烯酸、其鹽和酯衍生物的酪氨酸酶抑制活性。
同時(shí)，已知作為變老現(xiàn)象的白發(fā)是由于缺少轉(zhuǎn)移到角化細(xì)胞中的黑色素所致。因此，研究人員主要研究了酪氨酸酶活性促進(jìn)組分和黑素生成促進(jìn)組分以開(kāi)發(fā)白發(fā)抑制劑。具體地說(shuō)，研究人員已試圖從天然產(chǎn)物和各種其它物質(zhì)的提取物中發(fā)現(xiàn)白發(fā)抑制活性，并試圖利用各種化合物作為活性成分。例如，日本待審專(zhuān)利No.1995-316048建議了ω-烷氧羰基烷基銨，其鹽，ω-烷氧羰基烷基三烷基銨及其鹽作為黑素生成促進(jìn)劑是有效的。也推薦腺苷衍生物(日本待審專(zhuān)利No.1994-305940)和二氫羽扇醇衍生物(日本待審專(zhuān)利No.2002-3381)。然而，上述化學(xué)品的安全性沒(méi)有保證。日本待審專(zhuān)利No.1993-78222建議了一種包括日本黃連屬的水或乙醇提取物作為活性成分的白發(fā)抑制劑。日本待審專(zhuān)利No.1995-285874建議了一種包括貝類(lèi)如海扇、貽貝、牡蠣等提取物的黑素生成促進(jìn)劑。日本待審專(zhuān)利No.1999-124318建議了一種包括至少選自問(wèn)荊(Equisetum arvense L.)、金銀花(Lonicerajaponica Thunb.)、香茶菜(Plectranthus japonicus)、葡萄(Vitis viniferaL.)、絲瓜(Luffa cylindrica Roem.)、接骨木(Sambucus nigra)、懸鉤子(Rucus aculeatus L.)、棗(Zizyphus jujuba)和其提取物之一作為活性成分的白發(fā)抑制劑。日本待審專(zhuān)利No.1995-316026建議了一種包括至少一種選自Tricholomataceae、Hydnaceae、Polyporaceae、Fistulinaceae、Mucronoporaceae、Helvellaceae、Strophariaceae和Agaricaceae族擔(dān)子菌類(lèi)培養(yǎng)液和細(xì)胞提取物的黑素生成促進(jìn)劑發(fā)用制劑。日本待審專(zhuān)利No.1999-189541公開(kāi)了卡瓦胡椒(Pipermethysticum)和其提取物具有黑素生成促進(jìn)效果。此外，在genusSpyridia和Dictyota dichotoma的海藻提取物(日本待審專(zhuān)利No.1998-330218)，人參(Panax ginseng C.A.Meyer)、Panax notoginseng、丹參(Salvia miltiorrhiza)、Yucca elephantipes、枇杷(Eriobotrya japonicaLindley)、金銀花(Lonicera japonica)和Sarsaparilla的提取物(日本待審專(zhuān)利No.2001-288098)以及無(wú)花果(Ficus carica)、桑樹(shù)(Morusalba)和其提取物(日本待審專(zhuān)利No.2002-47130)證實(shí)有黑素生成促進(jìn)效果。但是，植物和動(dòng)物提取物的生產(chǎn)受原材料可供量的限制，而且提取物具有原材料濃度不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，導(dǎo)致性能不可靠。因此，需要開(kāi)發(fā)具有充分的酪氨酸酶活性促進(jìn)效果和黑素生成促進(jìn)效果的合成化合物。
在食品工業(yè)中，通過(guò)使用疏水性醇和脂肪酸作為原材料已將用于制備上述酯化合物的酶催化酯化反應(yīng)應(yīng)用于實(shí)踐中(Bioindustry，19，pp.62-71(2002))。然而，當(dāng)使用在疏水性溶劑中較難溶的親水性化合物作原材料時(shí)，反應(yīng)的收率低，因此難以將該反應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中。日本待審專(zhuān)利No.1996-245680報(bào)道了利用可溶于有機(jī)溶劑的酶在辛烷、己烷等有機(jī)溶劑中制備蔗糖酯的方法。然而，由于蔗糖較難溶于上述有機(jī)溶劑，因此該方法不能得到高的收率。但糖和嘌呤核苷高度溶于DMSO、DMF等有機(jī)溶劑。例如，蔗糖在DMSO中的溶解度為約40％(Advance of Carbohydrate Chemistry andBiochemistry，27，pp.85-125(1972))。嘌呤核苷如鳥(niǎo)苷溶解在含50％或更多DMSO的DMF中。然而，人們認(rèn)為諸如DMF和DMSO的非質(zhì)子有機(jī)溶劑的使用常常容易使水解酶失活，從而難以進(jìn)行反應(yīng)(日本待審專(zhuān)利No.1997-271387和No.1996-9987)。因此尋求即使在其中親水性化合物高度溶解的溶劑中也表現(xiàn)出高活性的酶。目前已發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌和鏈霉菌由來(lái)的蛋白酶在DMF或類(lèi)似溶劑中表現(xiàn)出高活性(Journal ofAmerican Chemical Society，110，pp.584-589(1988))。然而，至今仍未發(fā)現(xiàn)在能夠溶解糖和核苷的溶劑中保持高活性的酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及包括具有酪氨酸酶抑制或促進(jìn)活性的化合物作為活性成分的酪氨酸酶活性調(diào)整劑；包括該活性調(diào)整劑的外用制劑；以及適用于制備該化合物的酯化方法。本發(fā)明詳述如下。
I.本發(fā)明的第一優(yōu)選實(shí)施方案提供了熊果苷酯，其具有比熊果苷顯著高的酪氨酸酶抑制活性并具有改進(jìn)的皮膚吸收性；及其制備方法。
本發(fā)明人進(jìn)行了大量研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在熊果苷的6位引入疏水性取代基提高了熊果苷的抑制活性。本發(fā)明人基于上述發(fā)現(xiàn)進(jìn)行了深入研究并完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了如下的熊果苷酯化合物，酪氨酸酶活性抑制劑，和外用制劑，以及制備熊果苷酯化合物的方法。
1-1.式(1)表示的熊果苷酯化合物式(1) 其中，Ra為疏水基。
1-2.根據(jù)1-1項(xiàng)所述的熊果苷酯化合物，其由式(2)表示式(2)
其中，R1為單鍵，亞烷基或亞芳基。
1-3.根據(jù)1-1項(xiàng)所述的熊果苷酯化合物，其由式(3)表示式(3) 其中，R1為單鍵，亞烷基或亞芳基。
1-4.根據(jù)1-1項(xiàng)所述的熊果苷酯化合物，其由式(4)表示式(4) 其中，R1為單鍵，亞烷基或亞芳基。
1-5.根據(jù)1-1項(xiàng)所述的熊果苷酯化合物，其由式(5)表示
式(5) 其中，R1為單鍵，亞烷基或亞芳基。
1-6.根據(jù)1-1項(xiàng)所述的熊果苷酯化合物，其由式(6)表示式(6) 其中，R1為單鍵，亞烷基或亞芳基；R2為烷基或芳基。
1-7.根據(jù)1-1項(xiàng)所述的熊果苷酯化合物，其由式(7)表示式(7) 其中，R1、R3、R4和R5各自獨(dú)立地為單鍵，亞烷基或亞芳基X表示重復(fù)單元數(shù)并且為1-6。
1-8.根據(jù)1-1項(xiàng)所述的熊果苷酯化合物，其由式(8)表示式(8)
其中，R1為單鍵，亞烷基或亞芳基。
1-9.根據(jù)1-1項(xiàng)所述的熊果苷酯化合物，其由式(9)表示式(9) 其中，R1為單鍵，亞烷基或亞芳基。
1-10.根據(jù)1-1項(xiàng)所述的熊果苷酯化合物，其由式(10)表示式(10) 其中，R1為單鍵，亞烷基或亞芳基。
1-11.酪氨酸酶抑制劑，包括根據(jù)1-1至1-10項(xiàng)所述的熊果苷酯化合物中的至少一種作為活性成分。
1-12.皮膚外用制劑，包括根據(jù)1-11項(xiàng)所述的酪氨酸酶抑制劑。
1-13.制備熊果苷酯化合物的方法，包括進(jìn)行熊果苷與式(11)至(19)之一表示的羧酸化合物的酯化反應(yīng)步驟；更具體地說(shuō)，制備式(1)至(10)之一表示的熊果苷酯化合物的方法，包括進(jìn)行熊果苷與式(11)至(19)之一表示的羧酸化合物的酯化反應(yīng)步驟式(11)A-OCO-R1-CH＝CH2其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基；式(12)A-OCO-R1-C(CH3)＝CH2其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基；式(13)A-OCO-R1-COOCH＝CH2其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基；式(14)A-OCO-R1-COOH其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基；式(15)
A-OCO-R1-COO-R2其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基；R2為烷基或芳基；式(16)A-OCO-R1-[-R3-CH＝CH-R4-]X-R5-CH3其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1、R3、R4和R5各自獨(dú)立地為單鍵，亞烷基或亞芳基；X表示重復(fù)單元數(shù)并且為1-6。
式(17)A-OCO-R1-C(CH3)3其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基；式(18)A-OCO-R1-C6H5其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基；式(19)A-OCO-R1-CH3其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基；1-14.根據(jù)1-13項(xiàng)所述的方法，其中酯化反應(yīng)在酶催化劑存在的條件下進(jìn)行。
1-15.根據(jù)1-13項(xiàng)所述的方法，其中酯化反應(yīng)在化學(xué)催化劑存在的條件下進(jìn)行。
1-16.根據(jù)1-13至1-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中在進(jìn)行酯化反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行脫水處理。
1-17.根據(jù)1-13至1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中在進(jìn)行酯化反應(yīng)后接著進(jìn)行如下步驟使用非極性有機(jī)溶劑從反應(yīng)混合物中萃取和分離未反應(yīng)的羧酸衍生物；以及然后加入過(guò)量的水以萃取和分離未反應(yīng)的熊果苷并沉淀熊果苷酯化合物。
本發(fā)明的第一實(shí)施方案詳述如下。
本發(fā)明的熊果苷酯化合物是通過(guò)在熊果苷的6位引入疏水基得到的化合物，更具體地說(shuō)，包括式(1)至(10)表示的化合物。
本發(fā)明的熊果苷酯化合物可通過(guò)用羧酸化合物酯化熊果苷制得。在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，有時(shí)將羧酸、二羧酸、和羧酸及二羧酸的衍生物統(tǒng)稱(chēng)為“羧酸化合物”。
熊果苷酯化合物的制備詳述如下。
式(2)化合物通過(guò)使熊果苷與式(11)表示的羧酸或羧酸衍生物反應(yīng)可合成式(2)的化合物式(11)A-OCO-R1-CH＝CH2其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基。
亞烷基具有1-16個(gè)碳原子，優(yōu)選2-8個(gè)碳原子。其結(jié)構(gòu)也沒(méi)有限制，可以是直鏈、支鏈、環(huán)狀或其它結(jié)構(gòu)。亞烷基的具體例子包括亞甲基、亞乙基和其它直鏈亞烷基；乙基亞乙基、亞異丙基(isopropylene)和其它支鏈亞烷基；等。亞芳基包括亞苯基等。
式(11)表示的羧酸衍生物的例子包括丙烯酸衍生物和10-十一碳烯酸衍生物。
式(3)化合物通過(guò)使熊果苷與式(12)表示的羧酸或羧酸衍生物反應(yīng)可合成式(3)的化合物式(12)A-OCO-R1-C(CH3)＝CH2其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基。
亞烷基具有1-16個(gè)碳原子，優(yōu)選2-8個(gè)碳原子。其結(jié)構(gòu)沒(méi)有限制，可以是直鏈、支鏈、環(huán)狀或其它結(jié)構(gòu)。亞烷基的具體例子包括亞甲基、亞乙基和其它直鏈亞烷基；乙基亞乙基、亞異丙基和其它支鏈亞烷基；等。亞芳基包括亞苯基等。
式(12)表示的羧酸衍生物的例子包括甲基丙烯酸衍生物。
式(4)化合物通過(guò)使熊果苷與式(13)表示的羧酸或二羧酸衍生物反應(yīng)可合成式(4)的化合物式(13)A-OCO-R1-COOCH＝CH2其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基。
亞烷基具有1-16個(gè)碳原子，優(yōu)選2-8個(gè)碳原子。其結(jié)構(gòu)沒(méi)有限制，可以是直鏈、支鏈、環(huán)狀或其它結(jié)構(gòu)。亞烷基的具體例子包括亞甲基、亞乙基和其它直鏈亞烷基；乙基亞乙基、亞異丙基和其它支鏈亞烷基；等。亞芳基包括亞苯基等。
式(13)表示的二羧酸衍生物的例子包括衍生自乙二酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、壬烷二甲酸、十二烷二甲酸和其它脂族二羧酸的化合物；以及衍生自(鄰-、間-、對(duì)-)苯二甲酸和其它二羧酸的化合物。上述化合物的具體例子包括己二酸二乙烯酯。
式(5)化合物通過(guò)使熊果苷與式(14)表示的二羧酸或其衍生物反應(yīng)可合成式(5)的化合物式(14)A-OCO-R1-COOH其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基。
亞烷基具有6至21個(gè)碳原子，優(yōu)選8至12個(gè)碳原子。其結(jié)構(gòu)沒(méi)有限制，可以是直鏈、支鏈、環(huán)狀或其它結(jié)構(gòu)。亞烷基的具體例子包括亞甲基、亞乙基和其它直鏈亞烷基；乙基亞乙基、亞異丙基和其它支鏈亞烷基；等。亞芳基包括亞苯基等。
式(14)表示的二羧酸及其衍生物的例子包括辛二酸、壬二酸、癸二酸、壬烷二甲酸、十二烷二甲酸和其它脂族二羧酸；(鄰-、間-、對(duì)-)苯二甲酸和其它二羧酸；以及衍生自上述二羧酸的化合物。
式(6)化合物可通過(guò)使熊果苷與式(15)表示的羧酸或二羧酸衍生物反應(yīng)合成式(6)的化合物式(15)A-OCO-R1-COO-R2其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基；R2為烷基或芳基。
亞烷基具有1-16個(gè)碳原子，優(yōu)選2-8個(gè)碳原子。其結(jié)構(gòu)沒(méi)有限制，可以是直鏈、支鏈、環(huán)狀或其它結(jié)構(gòu)。亞烷基的具體例子包括亞甲基、亞乙基和其它直鏈亞烷基；乙基亞乙基、亞異丙基和其它支鏈亞烷基；等。亞芳基可以是諸如亞苯基。
R2為烷基或芳基。烷基具有1-16個(gè)碳原子，優(yōu)選2-8個(gè)碳原子。其具體例子包括甲基、乙基和其它直鏈烷基；異丙基和其它支鏈烷基。芳基可以是如苯基。
式(15)表示的二羧酸衍生物的例子包括衍生自乙二酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、壬烷二甲酸、十二烷二甲酸和其它脂族二羧酸的化合物；以及衍生自(鄰-、間-和對(duì)-)苯二甲酸及其它二羧酸的化合物。
式(7)化合物可通過(guò)使熊果苷與式(16)表示的羧酸或其衍生物反應(yīng)合成式(7)的化合物式(16)A-OCO-R1-[-R3-CH＝CH-R4-]X-R5-CH3其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1、R3、R4和R5各自獨(dú)立地為單鍵，亞烷基或亞芳基；X表示重復(fù)單元數(shù)并且為1-6。
亞烷基具有1至21個(gè)，優(yōu)選2-8個(gè)碳原子。其結(jié)構(gòu)沒(méi)有限制，可以是直鏈、支鏈、環(huán)狀或其它結(jié)構(gòu)。亞烷基的具體例子包括亞甲基、亞乙基和其它直鏈亞烷基；乙基亞乙基、亞異丙基和其它支鏈亞烷基；等。亞芳基包括亞苯基等。
式(16)表示的羧酸及其衍生物的例子包括壬烯二酸、肉豆蔻腦酸、十五碳烯酸、棕櫚油酸、十六碳三烯酸、十七碳烯酸、十七碳二烯酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、γ-亞麻酸、十八碳四烯酸、二十碳烯酸、二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳烯酸和衍生自上述羧酸的化合物。
式(8)化合物可通過(guò)使熊果苷與式(17)表示的羧酸或其衍生物反應(yīng)合成式(8)的化合物式(17)A-OCO-R1-C(CH3)3其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基。
亞烷基具有1-16個(gè)碳原子，優(yōu)選2-8個(gè)碳原子。其結(jié)構(gòu)沒(méi)有限制，可以是直鏈、支鏈、環(huán)狀或其它結(jié)構(gòu)。亞烷基的具體例子包括亞甲基、亞乙基和其它直鏈亞烷基；乙基亞乙基、亞異丙基和其它支鏈亞烷基；等。亞芳基包括亞苯基等。
式(17)表示的羧酸衍生物的具體例子包括衍生自新戊酸的化合物等。
式(9)化合物可通過(guò)使熊果苷與式(18)表示的羧酸或其衍生物反應(yīng)合成式(9)的化合物
式(18)A-OCO-R1-C6H5其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基。
亞烷基具有1-16個(gè)碳原子，優(yōu)選2-8個(gè)碳原子。其結(jié)構(gòu)沒(méi)有限制，可以是直鏈、支鏈、環(huán)狀或其它結(jié)構(gòu)。亞烷基的具體例子包括亞甲基、亞乙基和其它直鏈亞烷基；乙基亞乙基、亞異丙基和其它支鏈亞烷基；等。亞芳基包括亞苯基等。
式(18)表示的羧酸衍生物的具體例子包括衍生自苯甲酸的化合物。
式(10)化合物可通過(guò)使熊果苷與式(19)表示的羧酸或其衍生物反應(yīng)合成式(10)的化合物式(19)A-OCO-R1-CH3其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基。
亞烷基具有1-16個(gè)碳原子，優(yōu)選2-8個(gè)碳原子。其結(jié)構(gòu)沒(méi)有限制，可以是直鏈、支鏈、環(huán)狀或其它結(jié)構(gòu)。亞烷基的具體例子包括亞甲基、亞乙基和其它直鏈亞烷基；乙基亞乙基、亞異丙基和其它支鏈亞烷基；等。亞芳基包括亞苯基等。
式(19)表示的羧酸衍生物的具體例子包括衍生自丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、二十烷酸、二十二烷酸和二十四烷酸的化合物。
優(yōu)選在酶催化劑或化學(xué)催化劑的存在下進(jìn)行上述熊果苷與式(11)至(19)之一表示的化合物的酯化反應(yīng)。
可用的酶催化劑包括諸如脂肪酶、蛋白酶、酯酶和其它已知的酶催化劑。具體例子包括蔥頭假單胞菌(Pseudomonas capacia)由來(lái)的脂肪酶；Candida anterctica由來(lái)的脂肪酶；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)由來(lái)的蛋白酶；鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)由來(lái)的蛋白酶等。在上述酶催化劑中，特別優(yōu)選Candida anterctica由來(lái)的脂肪酶和枯草芽孢桿菌由來(lái)的蛋白酶。
可用的化學(xué)催化劑包括諸如酸、堿、吡啶衍生物和其它已知的催化劑。具體例子包括對(duì)甲苯磺酸、醇鈉、烷氧基鈦、二甲基氨基吡啶、鹽酸、硫酸、乙酸鋅、吡啶、4-吡咯烷基吡啶、二環(huán)己基氨基甲酸等。
由于上述酯化反應(yīng)對(duì)熊果苷的6位具有優(yōu)先選擇性，因此優(yōu)選在酶催化劑存在的條件下進(jìn)行上述酯化反應(yīng)。特別優(yōu)選使用Candidaanterctica由來(lái)的脂肪酶和枯草芽孢桿菌由來(lái)的蛋白酶的反應(yīng)。
當(dāng)使用酶催化劑制備熊果苷酯化合物時(shí)，反應(yīng)溫度為0-100℃，優(yōu)選30-50℃，反應(yīng)時(shí)間為1-340小時(shí)，優(yōu)選24-170小時(shí)?？捎玫娜軇┌ǘ谆柞０罚讈嗧?、吡啶、丙酮、二噁烷和其它溶劑，這些溶劑可單獨(dú)或組合使用。也可使用用作起始原料的羧酸、二羧酸或其衍生物作溶劑。反應(yīng)混合物中熊果苷的濃度為1-40重量％，優(yōu)選1-10重量％。酶與反應(yīng)混合物的比為0.1-20重量％，優(yōu)選0.1-1重量％。優(yōu)選使用相對(duì)于1mol熊果苷為約0.5-約10mol，更優(yōu)選約1-約5mol的羧酸、二羧酸或其衍生物。
當(dāng)使用化學(xué)催化劑制備熊果苷酯時(shí)，反應(yīng)溫度為0-100℃，優(yōu)選40-50℃，而反應(yīng)時(shí)間為1-48小時(shí)，優(yōu)選1-24小時(shí)。可用溶劑包括二甲基甲酰胺，二甲亞砜、吡啶、丙酮和二噁烷，這些溶劑可單獨(dú)或組合使用。反應(yīng)混合物中熊果苷的濃度為1-40重量％，優(yōu)選1-10重量％?；瘜W(xué)催化劑與反應(yīng)溶劑的比為0.1-5重量％，優(yōu)選0.1-1重量％。優(yōu)選使用相對(duì)于1mol熊果苷為約0.5-約10mol，特別優(yōu)選約1-約5mol的羧酸、二羧酸或其衍生物。
在本發(fā)明中，用作起始原料的羧酸、二羧酸或其衍生物優(yōu)選具有游離末端羧基。具有游離末端羧基的化合物的優(yōu)點(diǎn)在于該化合物便宜而且酯化反應(yīng)的副產(chǎn)物只有水。也就是說(shuō)，使用酯化合物作為起始原料的反應(yīng)可能會(huì)產(chǎn)生著色物質(zhì)，因此需要進(jìn)行精制處理，例如柱色譜法，而使用具有游離末端羧基的化合物的反應(yīng)不會(huì)產(chǎn)生上述問(wèn)題。
由于酯化反應(yīng)是可逆的，因此優(yōu)選在熊果苷與具有游離末端羧基的化合物進(jìn)行酯化反應(yīng)的同時(shí)對(duì)該反應(yīng)的副產(chǎn)物水進(jìn)行脫水以有效進(jìn)行酯化。脫水方法沒(méi)有限制，可適當(dāng)?shù)厥褂萌魏我阎椒?。所用方法的例子包括減壓脫水、干燥惰性氣流脫水、通過(guò)在諸如分子篩的有機(jī)物質(zhì)上選擇性吸水的脫水。對(duì)小型反應(yīng)而言，利用分子篩脫水簡(jiǎn)單并且是優(yōu)選的。對(duì)于分子篩的形狀沒(méi)有限制，可以是粉末狀、小球狀等。所用分子篩的比相對(duì)于總反應(yīng)混合物為0.1-50重量％，優(yōu)選1-20重量％。
反應(yīng)后進(jìn)行已知的適當(dāng)分離和精制處理，以從反應(yīng)產(chǎn)物中分離已經(jīng)在熊果苷的6位引入疏水基的化合物，從而得到本發(fā)明的熊果苷酯化合物。
可用的分離和精制方法包括已知的色譜法，例如高效液相色譜法、凝膠過(guò)濾色譜法等?？梢赃m當(dāng)?shù)剡x擇柱子類(lèi)型、流動(dòng)相及其它條件。
也可使用液-液萃取，基于溶解度差別的分級(jí)沉淀和其它分離方法。例如，使用非極性有機(jī)溶劑從酯化反應(yīng)混合物中萃取和分離未反應(yīng)的羧酸衍生物，然后加入過(guò)量的水以萃取和分離未反應(yīng)的熊果苷并同時(shí)沉淀熊果苷酯化合物。需要時(shí)可重復(fù)上述由萃取、分離和沉淀組成的方法，然后收集沉淀，得到本發(fā)明的熊果苷酯化合物。
可用的非極性有機(jī)溶劑包括諸如環(huán)己烷、乙醚、石油醚等，其中優(yōu)選環(huán)己烷。
“過(guò)量的水”是指相對(duì)于用作起始原料的熊果苷化合物重量為約20倍重量的水。
使用如此得到的式(1)至(10)之一表示的熊果苷酯化合物作為活性成分可得到酪氨酸酶抑制劑。
該酪氨酸酶抑制劑包括一種或多種式(1)至(10)表示的熊果苷酯化合物。
可通過(guò)已知方法從一種或多種式(1)至(10)的熊果苷酯化合物或從一種或多種該化合物與適當(dāng)載體的混合物配制酪氨酸酶抑制劑。
可將本發(fā)明的酪氨酸酶抑制劑添加到化妝品、皮膚外用制劑、醫(yī)藥、食品、魚(yú)貝類(lèi)養(yǎng)殖用飼料等，也可用于食品處理。例如，可將酪氨酸酶抑制劑添加到化妝品中以得到具有皮膚美白效果的化妝品。此外，也可將它添加到食品中或用于處理食品表面以防止食品因黑素生成而變色。
酪氨酸酶抑制劑也可用于外用制劑中。具體地說(shuō)，其可適當(dāng)?shù)剡m用于皮膚外用制劑，優(yōu)選皮膚美白用外用制劑。
本發(fā)明的皮膚外用制劑包括一種或多種式(1)至(10)表示的熊果苷酯化合物。
可通過(guò)已知方法將酪氨酸酶抑制劑與適當(dāng)載體的混合物進(jìn)行配制得到該外用制劑。
該外用制劑可含有多種通常用于外用制劑的其它成分，例如水性組分、粉末組分、保濕劑、表面活性劑、防腐劑、增稠劑、紫外線(xiàn)吸收劑、香料等。
外用制劑的劑型可以是諸如軟膏劑、霜?jiǎng)?、乳液、搽劑、洗劑等?br> 外用制劑含有酪氨酸酶抑制有效量的熊果苷酯化合物。熊果苷酯化合物的比相對(duì)于整個(gè)外用制劑為約0.001-約10重量％，優(yōu)選約0.005-約5重量％。
可將該外用制劑以合適的量每天一次或多次施用于諸如臉、頸、臂和手的身體部位上，所述部位容易具有或具有疤、雀斑等或可能被或已被曬黑。
本發(fā)明的熊果苷酯化合物由于引入疏水基而具有改進(jìn)的皮膚吸收性能，而且比熊果苷具有顯著高的酪氨酸酶抑制活性。此外，該熊果苷酯化合物具有大概是基于其糖酯結(jié)構(gòu)的抗多種微生物的抗菌作用；大概是由于其酚羥基基團(tuán)消除性能；和大概是由于酯部分的疏水性和熊果苷部分的親水性的表面化作用。
由于上述特性，本發(fā)明的熊果苷酯化合物可有效地用作化妝品、醫(yī)藥和其它領(lǐng)域中的酪氨酸酶抑制劑或皮膚外用制劑及其它制劑中的活性成分。
II.本發(fā)明的第二優(yōu)選實(shí)施方案提供了包括十一碳烯酸、其鹽或其衍生物作為活性成分的酪氨酸酶抑制劑；以及包括該酪氨酸酶抑制劑的外用制劑，特別是包括該酪氨酸酶抑制劑的皮膚美白用化妝品。
本發(fā)明人進(jìn)行了大量研究并發(fā)現(xiàn)十一碳烯酸、其鹽及其糖酯具有酪氨酸酶抑制活性，并進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
本發(fā)明提供了以下的酪氨酸酶抑制劑和外用制劑。
2-1.酪氨酸酶抑制劑，包括式(20)表示的十一碳烯酸、其鹽、和/或其酯衍生物式(20) 其中，Rb為氫或從糖除去一個(gè)羥基得到的糖殘基。
2-2.根據(jù)2-1項(xiàng)所述的酪氨酸酶抑制劑，其中Rb為從糖除去一個(gè)羥基得到的糖殘基。
2-3.根據(jù)2-1項(xiàng)所述的酪氨酸酶抑制劑，其包括十一碳烯酸和/或其鹽，其中Rb為氫。
2-4.包括根據(jù)2-1至2-3中任一項(xiàng)所述酪氨酸酶抑制劑的外用制劑。
2-5.根據(jù)2-4項(xiàng)所述的外用制劑，其是皮膚美白用化妝品。
本發(fā)明的第二實(shí)施方案詳述如下。
十一碳烯酸、其鹽或其衍生物十一碳烯酸及其鹽是已知的。
十一碳烯酸的鹽的例子包括十一碳烯酸與鈉、鉀、鋰和其它堿金屬的鹽；與鈣、鎂和其它堿土金屬的鹽；與銅、二乙醇胺、銨、二甲基胺、三甲基胺、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、硬脂基二甲基胺等的鹽。
可通過(guò)在選自水、醇(甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇等)、THF、醚、乙腈等的一種或多種溶劑中將十一碳烯酸與堿金屬氫氧化物、堿土金屬氫氧化物、其它金屬氫氧化物或胺混合制備上述鹽。
Rb為氫或?yàn)閺奶浅ヒ粋€(gè)羥基得到的糖殘基。當(dāng)Rb為糖殘基時(shí)，Rb-OH為單糖、二糖、三糖、糖醇或其它糖。
Rb-OH表示的糖的例子包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、N-乙?；咸前?、N-乙?；肴樘前?、核糖、樹(shù)膠醛醣、木糖、鼠李糖和其它單糖；麥芽糖、乳糖、異麥芽糖、纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、海藻糖、異曲二糖、昆布二糖、黑曲霉二糖、sambubiose、新桔皮糖和其它二糖；麥芽三糖、異麥芽三糖、纖維三糖、蜜三糖、龍膽三糖和其它三糖；以及丙三醇、赤藻糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘露醇、纖維醇和其它糖醇。優(yōu)選的糖包括蔗糖和海藻糖。
根據(jù)在日本待審專(zhuān)利No.2000-65290中所述的方法在酶催化劑存在的條件下使十一碳烯酸甲酯、十一碳烯酸乙酯等酯與糖殘基進(jìn)行反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)酯交換反應(yīng)，得到本發(fā)明的十一碳烯酸酯。
可用作催化劑的酶的例子包括芽孢桿菌由來(lái)的蛋白酶、Candidaanterctica由來(lái)的脂肪酶。
通過(guò)使用選自十一碳烯酸、其鹽、及其酯衍生物的化合物或至少上述兩種化合物的混合物作為活性成分可得到酪氨酸酶抑制劑。
可通過(guò)已知方法對(duì)選自十一碳烯酸、其鹽及其酯衍生物中的至少一種化合物單獨(dú)或與適當(dāng)?shù)妮d體混合進(jìn)行配制來(lái)制備該酪氨酸酶抑制劑。
此外，可將該酪氨酸酶抑制劑添加到皮膚美白用化妝品、醫(yī)藥、食品、魚(yú)貝類(lèi)養(yǎng)殖用飼料等，或用于食品處理。酪氨酸酶抑制劑抑制酪氨酸酶活性，從而抑制了黑素生成，因此當(dāng)添加到化妝品時(shí)，其提供了具有皮膚美白效果的化妝品。另外，也可將酪氨酸酶抑制劑添加到因黑色素生成而易于變色的食品中或用于處理該食品的表面以防止變色。十一碳烯酸是原本獲自皮膚的物質(zhì)，因此它的安全性已經(jīng)得到證實(shí)。通過(guò)攝取含十一碳烯酸或其鹽的食品可期待無(wú)安全性問(wèn)題的皮膚美白效果。
在外用制劑中可使用包括選自式(20)表示的十一碳烯酸、其鹽、十一碳烯酸糖酯中的至少一種化合物作為活性成分的酪氨酸酶抑制劑。
該外用制劑優(yōu)選用于皮膚，特別是作為皮膚美白用化妝品，而且可通過(guò)已知制劑技術(shù)來(lái)制備。
該外用制劑可含有其它常用成分，例如水性組分、粉末組分、保濕劑、表面活性劑、防腐劑、增稠劑、紫外線(xiàn)吸收劑、香料等。
該外用制劑含有酪氨酸酶抑制有效量的十一碳烯酸、其鹽、和/或十一碳烯酸糖酯，即相對(duì)于全部外用制劑的比通常為約0.001-約10重量％，優(yōu)選約0.005-約5重量％，更優(yōu)選約0.01-約3重量％，特別優(yōu)選約0.1-約1重量％。
該外用制劑的劑型可以是如軟膏劑、霜?jiǎng)?、乳液、搽劑、洗劑或其它劑型?br> 可將該外用制劑以適當(dāng)?shù)牧棵刻煲淮位蚨啻问┯糜谥T如臉、頸、臂和手的身體部位上，上述部位容易具有或具有疤、雀斑等或可能被或已被曬黑。
基于如下發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明，即十一碳烯酸與二糖的酯具有顯著改進(jìn)的酪氨酸酶抑制活性，該酯的作用機(jī)理與熊果苷的機(jī)理不同，從而提供了具有酪氨酸酶抑制活性的酪氨酸酶抑制劑。具體地說(shuō)，酪氨酸酶活性催化了由一元酚到1，2-二酚(兒茶酚)的羥基化反應(yīng)和由兒茶酚到鄰醌的氧化反應(yīng)，其中熊果苷有效抑制了一元酚的羥基化反應(yīng)，而十一碳烯酸糖酯卻是抑制了兒茶酚的氧化反應(yīng)。也就是說(shuō)，十一碳烯酸糖酯具有與熊果苷不同的酪氨酸酶抑制機(jī)理。更具體地說(shuō)，熊果苷如圖6所示對(duì)苯酚底物比對(duì)兒茶酚底物顯示出更高的抑制活性，而十一碳烯酸糖酯如圖5所示對(duì)苯酚底物和兒茶酚底物均顯示出抑制活性。圖9說(shuō)明了上述機(jī)理。
可將具有上述活性的包括十一碳烯酸、其鹽和/或酯衍生物作為活性成分的酪氨酸酶抑制劑有效地用于化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域中的外用制劑，特別是皮膚外用制劑和皮膚美白用外用制劑。
III.本發(fā)明的第三優(yōu)選實(shí)施方案提供了包括抗壞血酸或其衍生物作為活性成分的酪氨酸酶活性促進(jìn)劑；包括該酪氨酸酶活性促進(jìn)劑的外用制劑，特別是具有改善或防止白發(fā)的顯著效果的外用制劑。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抗壞血酸和抗壞血酸衍生物在低濃度下具有優(yōu)異的酪氨酸酶活性促進(jìn)效果，并進(jìn)行了進(jìn)一步的深入研究。
本發(fā)明包括如下的酪氨酸酶活性促進(jìn)劑和包括該酪氨酸酶活性促進(jìn)劑的外用制劑。
3-1.酪氨酸酶活性促進(jìn)劑，包括抗壞血酸和/或抗壞血酸衍生物作為活性成分。
3-2.根據(jù)3-1項(xiàng)所述的酪氨酸酶活性促進(jìn)劑，其中抗壞血酸衍生物為選自由抗壞血酸脂肪酸酯；抗壞血酸磷酸酯，其脂肪酸酯，以及磷酸酯和脂肪酸酯的鹽；抗壞血酸葡糖苷及其脂肪酸酯；和抗壞血酸硫酸酯，其脂肪酸酯，以及硫酸酯和脂肪酸酯的鹽所組成的組中的至少一種。
3-3.包括3-1或3-2項(xiàng)所述酪氨酸酶活性促進(jìn)劑的外用制劑。
3-4.頭發(fā)用外用制劑，包括3-1或3-2項(xiàng)所述的酪氨酸酶活性促進(jìn)劑，并且優(yōu)選用于防止或改善白發(fā)的外用制劑。
3-5.皮膚外用制劑，包括3-1或3-2項(xiàng)所述的酪氨酸酶活性促進(jìn)劑，而且優(yōu)選用于使皮膚變黑或治療皮膚白斑病的外用制劑。
3-6.根據(jù)3-3至3-5中任一項(xiàng)所述的外用制劑，其中抗壞血酸和抗壞血酸衍生物的總含量相對(duì)于全部外用制劑為0.00001-10重量％。
3-7.根據(jù)3-3至3-5中任一項(xiàng)所述的外用制劑，其中酪氨酸酶活性促進(jìn)劑包括抗壞血酸作為活性成分，并且其中抗壞血酸的含量相對(duì)于全部外用制劑為0.0001-1重量％。
3-8.根據(jù)3-3至3-5中任一項(xiàng)所述的外用制劑，其中酪氨酸酶活性促進(jìn)劑包括選自由抗壞血酸磷酸酯和抗壞血酸葡糖苷所組成的組中的至少一種化合物作為活性成分，并且其中所述至少一種化合物的含量相對(duì)于全部外用制劑為0.001-10重量％。
3-9.根據(jù)3-3至3-5中任一項(xiàng)所述的外用制劑，其中酪氨酸酶活性促進(jìn)劑包括選自由抗壞血酸脂肪酸酯，抗壞血酸磷酸酯的脂肪酸酯，和抗壞血酸葡糖苷的脂肪酸酯所組成的組中的至少一種化合物作為活性成分；并且其中所述至少一種化合物的含量相對(duì)于全部外用制劑為0.00001-0.1重量％。
本發(fā)明的第三實(shí)施方案詳述如下。
本發(fā)明的酪氨酸酶活性促進(jìn)劑包括抗壞血酸和/或抗壞血酸衍生物作為活性成分。在酪氨酸酶活性促進(jìn)劑中，抗壞血酸和抗壞血酸衍生物可單獨(dú)或組合使用。
抗壞血酸是生物體內(nèi)的水溶性抗氧化劑，也稱(chēng)為維生素C?？箟难嶙饔糜谏矬w內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)各種部位的多種目標(biāo)分子?？箟难岚↙-抗壞血酸和D-抗壞血酸，其中本發(fā)明使用L-抗壞血酸。
本發(fā)明所用抗壞血酸衍生物包括在其2-、3-、5-和6-羥基位具有一個(gè)或多個(gè)取代基并具有酪氨酸酶活性促進(jìn)效果的那些。
抗壞血酸衍生物的具體例子包括抗壞血酸脂肪酸酯；抗壞血酸磷酸酯，其脂肪酸酯，以及磷酸酯和脂肪酸酯的鹽；抗壞血酸葡糖苷及其脂肪酸酯；抗壞血酸硫酸酯，其脂肪酸酯，以及硫酸酯和脂肪酸酯的鹽；等。特別優(yōu)選的是在生物體內(nèi)吸收后產(chǎn)生抗壞血酸的那些。
對(duì)上述抗壞血酸衍生物中的脂肪酸，特別是對(duì)抗壞血酸脂肪酸酯、抗壞血酸磷酸酯的脂肪酸酯、抗壞血酸葡糖苷的脂肪酸酯和抗壞血酸硫酸酯的脂肪酸酯中的脂肪酸的類(lèi)型沒(méi)有限制，包括飽和及不飽和脂肪酸以及直鏈和支鏈脂肪酸。對(duì)脂肪酸部分的碳原子數(shù)也沒(méi)有限制，通常為1-24，優(yōu)選8-20，更優(yōu)選10-18。
抗壞血酸脂肪酸酯的例子包括使脂肪酸與抗壞血酸的2-、3-、5-和6位中的至少一個(gè)羥基反應(yīng)得到的酯。上述酯的例子包括抗壞血酸-6-棕櫚酸酯，抗壞血酸-2，6-棕櫚酸酯，抗壞血酸-6-硬脂酸酯，等。
抗壞血酸磷酸酯的例子包括使抗壞血酸的2位羥基與磷酸酯化得到的抗壞血酸-2-磷酸酯。
抗壞血酸磷酸酯的鹽的例子包括堿金屬鹽，堿土金屬鹽和其它抗壞血酸磷酸酯的鹽。具體例子包括抗壞血酸-2-磷酸酯鈉，抗壞血酸-2-磷酸酯鎂，等。
抗壞血酸磷酸酯的脂肪酸酯的例子包括使抗壞血酸磷酸酯中的羥基與脂肪酸進(jìn)一步酯化得到的化合物，例如抗壞血酸-2-磷酸-6-棕櫚酸酯，抗壞血酸-2-磷酸-6-月桂酸酯，抗壞血酸-2-磷酸-6-硬脂酸酯，等。
抗壞血酸磷酸酯的脂肪酸酯的鹽的例子包括抗壞血酸-2-磷酸酯-6-棕櫚酸酯的鈉鹽，抗壞血酸-2-磷酸酯-6-月桂酸酯的鎂鹽，等。
抗壞血酸葡糖苷的例子包括抗壞血酸-2-葡糖苷，其中葡萄糖是通過(guò)糖苷鍵連接到抗壞血酸的2位羥基上的。
抗壞血酸葡糖苷的脂肪酸酯的例子包括使抗壞血酸葡糖苷與脂肪酸進(jìn)一步酯化得到的化合物，例如抗壞血酸-2-葡糖苷-6-棕櫚酸酯，抗壞血酸-2-葡糖苷-6-硬脂酸酯，抗壞血酸-2-葡糖苷-6-月桂酸酯，等。
抗壞血酸硫酸酯的例子包括使抗壞血酸的2位羥基與硫酸酯化得到的抗壞血酸-2-硫酸酯。
抗壞血酸硫酸酯的鹽的例子包括堿金屬鹽，堿土金屬鹽和其它抗壞血酸硫酸酯的鹽。
抗壞血酸硫酸酯的脂肪酸酯的例子包括使抗壞血酸硫酸酯的羥基與脂肪酸進(jìn)一步酯化得到的化合物，例如抗壞血酸-2-硫酸酯-6-棕櫚酸酯，抗壞血酸-2-硫酸酯-6-硬脂酸酯，抗壞血酸-2-硫酸酯-6-月桂酸酯，等。
在上述化合物中，優(yōu)選抗壞血酸脂肪酸酯、抗壞血酸磷酸酯、抗壞血酸磷酸酯的脂肪酸酯、抗壞血酸葡糖苷和抗壞血酸葡糖苷的脂肪酸酯，這是由于它們高度穩(wěn)定而且具有優(yōu)異的酪氨酸酶活性促進(jìn)效果。
在本發(fā)明的酪氨酸酶活性促進(jìn)劑中使用有效量的抗壞血酸和/或抗壞血酸衍生物作為活性成分從而得到優(yōu)異的酪氨酸酶活性促進(jìn)效果。
酪氨酸酶使用酪氨酸作為底物催化酪氨酸的羥基化反應(yīng)和所得DOPA的氧化反應(yīng)。在羥基化反應(yīng)中抗壞血酸和/或抗壞血酸衍生物用作氫供體，從而促進(jìn)了酪氨酸酶的活性。
包括抗壞血酸和/或抗壞血酸衍生物的酪氨酸酶活性促進(jìn)劑通過(guò)經(jīng)皮吸收到達(dá)頭發(fā)根部并作用于黑素細(xì)胞從而顯示出優(yōu)異的黑素生成促進(jìn)效果。
具有該機(jī)理的含抗壞血酸和/或抗壞血酸衍生物作為活性成分的酪氨酸酶活性促進(jìn)劑顯示出優(yōu)異的黑素生成促進(jìn)效果。
可通過(guò)已知方法將抗壞血酸和/或抗壞血酸衍生物單獨(dú)或與適當(dāng)?shù)妮d體混合配制成制劑，得到本發(fā)明的酪氨酸酶活性促進(jìn)劑。
此外，酪氨酸酶活性促進(jìn)劑可用作外用制劑的成分。可通過(guò)已知方法混合酪氨酸酶活性促進(jìn)劑和所需成分和/或適當(dāng)?shù)妮d體制備該外用制劑。
該外用制劑具有優(yōu)異的酪氨酸酶活性促進(jìn)效果和/或優(yōu)異的黑素生成促進(jìn)效果，因此可將其用作如頭發(fā)或皮膚外用制劑。其也可用作治療帕金森氏病的外用制劑，該制劑作用于諸如黑質(zhì)的黑素細(xì)胞。
頭發(fā)用外用制劑的具體例子包括用于防止或改善白發(fā)或者使頭發(fā)成褐色的外用制劑。
頭發(fā)用外用制劑的類(lèi)型沒(méi)有限制，可以是諸如洗發(fā)水、洗發(fā)露(hairrinse)、護(hù)發(fā)劑、卷發(fā)劑、發(fā)乳、養(yǎng)發(fā)劑、發(fā)膠、護(hù)發(fā)素、染發(fā)劑、增發(fā)劑等。外用制劑的形態(tài)沒(méi)有限制，可以是諸如液體狀、乳液狀、膏狀、凝膠狀、固體狀或其它形狀。
皮膚外用制劑的具體例子包括用于治療白斑病，或用于使皮膚呈棕褐色或黑色的外用制劑。
皮膚外用制劑的類(lèi)型沒(méi)有限制，可以是諸如洗液、乳液、清潔膏、營(yíng)養(yǎng)膏、化妝底液、粉底、浴液、手霜、腿霜、洗面奶、沐浴皂、沐浴露等。外用制劑的形態(tài)沒(méi)有限制，可以是諸如洗液狀、液體狀、膏狀、凝膠狀、乳液狀、固體狀或其它形狀。
該外用制劑可含有有效提高酪氨酸酶活性促進(jìn)劑效力的助劑或已知添加劑。上述助劑和添加劑包括諸如液體石蠟，凡士林和其它烴；巴西棕櫚蠟，日本蠟和其它的蠟；橄欖油，荷荷芭油和其它的油或脂肪；棕櫚酸十八烷醇酯，新戊二醇二異辛酸酯和其它酯；硬脂酸，棕櫚酸和其它高級(jí)脂肪酸；十六烷醇，十八烷醇和其它高級(jí)醇；非離子型、陰離子型、陽(yáng)離子型和兩性表面活性劑；天然和合成香料及色料；對(duì)羥基苯甲酸酯，葡萄糖酸氯己定和其它防腐劑；維生素E，維生素P和其它維生素；BHT和其它抗氧化劑；苯甲酮，氨基苯甲酸和其它紫外線(xiàn)吸收劑；乙醇，丙醇和其它醇；檸檬酸鹽，乙酸鹽和其它pH調(diào)節(jié)劑；適用于本制劑目的應(yīng)用的藥用成分；等。
該外用制劑含有酪氨酸酶活性促進(jìn)有效量的酪氨酸酶活性促進(jìn)劑，用量可根據(jù)使用方式和成分類(lèi)型而適當(dāng)調(diào)節(jié)。
當(dāng)將該外用制劑用于頭發(fā)時(shí)，酪氨酸酶活性促進(jìn)劑的含量相對(duì)于全部外用制劑優(yōu)選為約0.00001-約10重量％，優(yōu)選約0.0001-約0.1重量％。當(dāng)將該外用制劑用于皮膚時(shí)，酪氨酸酶活性促進(jìn)劑的含量相對(duì)于全部外用制劑為約0.00001-約10重量％，優(yōu)選約0.0001-約0.1重量％。
當(dāng)酪氨酸酶活性促進(jìn)劑包括抗壞血酸作為活性成分時(shí)，抗壞血酸的含量相對(duì)于全部外用制劑為約0.0001-約1重量％，優(yōu)選約0.001-約1重量％，更優(yōu)選約0.01-約1重量％，進(jìn)一步優(yōu)選約0.1-約1重量％?？箟难釒缀醪煌ㄟ^(guò)皮膚吸收，因此為將細(xì)胞內(nèi)抗壞血酸濃度調(diào)節(jié)至據(jù)信為有效量的10-4M或更低，適當(dāng)?shù)目箟难釢舛却蟾耪荚撊拷M合物(酪氨酸酶活性促進(jìn)劑)的約0.0001-約1重量％。
當(dāng)酪氨酸酶活性促進(jìn)劑包括選自抗壞血酸磷酸酯和抗壞血酸葡糖苷中的至少一種化合物作為活性成分時(shí)，所述至少一種化合物相對(duì)于全部外用制劑為約0.001-約10重量％，優(yōu)選約0.01-約10重量％，更優(yōu)選約0.01-約1重量％，進(jìn)一步優(yōu)選約0.1-約1重量％。抗壞血酸磷酸酯和抗壞血酸葡糖苷比抗壞血酸具有更高的穩(wěn)定性，而且與抗壞血酸相比具有改進(jìn)的皮膚滲透性和/或皮膚吸收性。因此，為將細(xì)胞內(nèi)抗壞血酸磷酸酯/抗壞血酸葡糖苷濃度調(diào)節(jié)至據(jù)信為顯著活化效果的有效量的10-2M至10-4M，適當(dāng)?shù)目箟难崃姿狨?抗壞血酸葡糖苷濃度大概占全部組合物(酪氨酸酶活性促進(jìn)劑)的約0.001-約10重量％。
當(dāng)酪氨酸酶活性促進(jìn)劑包括選自抗壞血酸脂肪酸酯、抗壞血酸磷酸酯的脂肪酸酯和抗壞血酸葡糖苷的脂肪酸酯中的至少一種化合物作為活性成分時(shí)，所述至少一種化合物相對(duì)于全部外用制劑為約0.00001-約0.1重量％，優(yōu)選約0.0001-約0.1重量％，更優(yōu)選約0.001-0.1重量％，進(jìn)一步優(yōu)選約0.01-0.1重量％?？箟难嶂舅狨ズ涂箟难嵫苌锸歉叨确€(wěn)定的而且具有相當(dāng)高的皮膚滲透性。因此，為將細(xì)胞內(nèi)抗壞血酸脂肪酸酯/抗壞血酸衍生物濃度調(diào)節(jié)至據(jù)信為有效量的10-4M或更低，適當(dāng)?shù)目箟难嶂舅狨?抗壞血酸衍生物濃度大概占全部組合物(酪氨酸酶活性促進(jìn)劑)的約0.00001-約0.1重量％。
本發(fā)明提供了使用抗壞血酸和/或抗壞血酸衍生物作為活性成分的具有優(yōu)異酪氨酸酶活性促進(jìn)活性或優(yōu)異的黑素生成促進(jìn)活性的酪氨酸酶活性促進(jìn)劑和外用制劑，其中抗壞血酸和/或抗壞血酸衍生物具有很高的安全性并能夠低成本生產(chǎn)。
目前抗壞血酸和抗壞血酸衍生物已用作黑素生成抑制劑，但本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抗壞血酸和抗壞血酸衍生物可用作酪氨酸酶活性促進(jìn)劑和酪氨酸酶活性促進(jìn)制劑及外用制劑的活性成分。
本發(fā)明的酪氨酸酶活性促進(jìn)劑是高度安全的，并能夠以低成本的生產(chǎn)，而且顯示出優(yōu)異的酪氨酸酶活化效果和黑素生成促進(jìn)效果。此外，包括該酪氨酸酶活性促進(jìn)劑的外用制劑也顯示出優(yōu)異的酪氨酸酶活化效果和黑素生成促進(jìn)效果。
可將該酪氨酸酶活性促進(jìn)劑和包括該酪氨酸酶活性促進(jìn)劑的外用制劑有效地用于化妝品、醫(yī)藥和其它領(lǐng)域以促進(jìn)酪氨酸酶活性或黑素生成。例如，可將它們用作頭發(fā)用外用制劑以防止或改善白發(fā)，或作為皮膚外用制劑以使皮膚變黑或治療皮膚白斑病。
IV.本發(fā)明的第四優(yōu)選實(shí)施方案提供了在能夠溶解糖類(lèi)和核苷的溶劑中用酶制備酯的方法。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在非質(zhì)子有機(jī)溶劑中Candida antarctica由來(lái)的A型脂肪酶具有很高的活性。本發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)使用蔗糖作為底物能夠使反應(yīng)具有特別的選擇性，并在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了深入研究。
本發(fā)明也提供了如下制備酯的方法。
4-1.制備酯的方法，包括在非質(zhì)子有機(jī)溶劑中、在Candidaantarctica由來(lái)的A型脂肪酶存在下用脂肪酸和/或其衍生物酯化含羥基化合物。
4-2.根據(jù)4-1項(xiàng)所述的方法，其中非質(zhì)子有機(jī)溶劑選自由二甲基甲酰胺，二甲亞砜，二甲基甲酰胺與二甲亞砜的混合物所組成的組。
4-3.根據(jù)4-1或4-2項(xiàng)所述的方法，其中含羥基化合物選自由糖類(lèi)、核苷類(lèi)、糖醇類(lèi)和含羥基氨基酸所組成的組中的至少一種。
4-4.根據(jù)4-3項(xiàng)的方法，其中含羥基化合物是糖類(lèi)。
4-5.根據(jù)4-1項(xiàng)的方法，其中含羥基化合物是蔗糖，并且其中酯是式(21)表示的化合物式(21)
其中，Rc為C1-24脂肪酸殘基。
本發(fā)明的第四實(shí)施方案詳述如下。
根據(jù)本發(fā)明第四實(shí)施方案制備酯的方法包括在非質(zhì)子有機(jī)溶劑中在Candida antarctica由來(lái)的A型脂肪酶的存在下用脂肪酸和/或其衍生物酯化含羥基化合物。
本實(shí)施方案所用“酯化”是指酯的合成，包括酯化反應(yīng)和酯交換反應(yīng)。具體地說(shuō)，酯化包括羧酸與醇的反應(yīng)(R′-COOH+R″-OH R′-COO-R″)；和酯與醇的反應(yīng)(R′-COO-R″+R-OH R′-COO-R)。
脂肪酶在本發(fā)明方法中，使用Candida antarctica由來(lái)的A型脂肪酶作為酶催化劑。
Candida antarctica由來(lái)的脂肪酶被分為A型和B型。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)A型脂肪酶是在非質(zhì)子有機(jī)溶劑中具有很高活性的優(yōu)異酶催化劑。
根據(jù)本發(fā)明，即使使用幾乎不溶于有機(jī)溶劑的含羥基化合物作為底物進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，也能以高收率得到產(chǎn)品。
A型脂肪酶可由發(fā)酵后的脂肪酶通過(guò)諸如凝膠過(guò)濾獲得?；蛘撸ㄟ^(guò)重組DNA技術(shù)由基因編碼A型脂肪酶制備A型脂肪酶。A型脂肪酶的用量相對(duì)于溶劑和脂肪酶的總量為約0.1-約20重量％，優(yōu)選約0.1-約10重量％。
可以適當(dāng)?shù)剡x擇使用A型脂肪酶的反應(yīng)溫度，其通常為約10-約100℃，優(yōu)選約30-約50℃。
非質(zhì)子有機(jī)溶劑本發(fā)明方法在非質(zhì)子有機(jī)溶劑中進(jìn)行。
該非質(zhì)子有機(jī)溶劑的類(lèi)型沒(méi)有限制，可以是諸如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基異丙酰胺、甲酰胺、二甲亞砜、吡啶、N-甲基吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、二丙亞砜或其混合溶劑。
在上述溶劑中，二甲基甲酰胺、二甲亞砜和其混合溶劑能得到高的收率，因此是優(yōu)選的。特別優(yōu)選二甲亞砜。各溶劑在混合溶劑中的比可以適當(dāng)選擇，但該混合溶劑優(yōu)選含至少60％，更優(yōu)選至少80％的二甲亞砜。
含羥基化合物本發(fā)明所用的含羥基化合物沒(méi)有限制，只要它含有至少一個(gè)羥基。該化合物的例子包括糖類(lèi)，核苷類(lèi)，糖醇類(lèi)，含羥基氨基酸，等。
糖類(lèi)的例子包括天然糖和合成糖，例如單糖、寡糖、多糖和其水解產(chǎn)物，等。也可使用上述糖類(lèi)的取代產(chǎn)物和衍生物，例如氨基糖、硫糖、糖醛酸、等。此外，也可使用其溶劑化物。
單糖的例子包括葡萄糖，果糖，甘露糖，半乳糖，抗壞血酸，和其它的C2-8，優(yōu)選C5-7化合物。
寡糖的例子包括海藻糖及其二水合物；蔗糖，麥芽糖，纖維二糖，乳糖和其它二糖；蜜三糖和其它三糖；甘露寡糖，麥芽寡糖，和其它寡糖；等。
多糖的例子包括纖維素，淀粉，殼多糖，殼聚糖，透明質(zhì)酸，甘露聚糖，木聚糖，支鏈淀粉，等。
在上述糖中，優(yōu)選單糖和寡糖，其中特別優(yōu)選二糖。具體地說(shuō)，優(yōu)選葡萄糖、海藻糖和蔗糖，特別優(yōu)選蔗糖。
核苷類(lèi)的例子包括其中脫氧核糖或核糖與腺苷，鳥(niǎo)苷，胞嘧啶，胸腺嘧啶或尿嘧啶連接的化合物，和上述化合物的衍生物。
糖醇類(lèi)的例子包括丙三醇，赤藻糖醇，阿糖醇，木糖醇，山梨糖醇，甘露醇，纖維醇，等。
含羥基氨基酸的例子包括絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，等。
反應(yīng)溶劑中含羥基化合物的濃度為約0.01M至約1M，優(yōu)選約0.1M至約0.5M。
脂肪酸或其衍生物可以適當(dāng)選擇本發(fā)明所用脂肪酸或其衍生物的類(lèi)型。
脂肪酸的例子包括飽和或不飽和脂族單羧酸，二羧酸和分子中具有3個(gè)或更多個(gè)羧基的多羧酸。脂肪酸中合適的碳原子數(shù)通常為1至24，優(yōu)選6至18。
脂族單羧酸的例子包括己酸，山梨酸，辛酸，癸酸，月桂酸，肉豆蔻酸，棕櫚油酸，棕櫚酸，硬脂酸，異硬脂酸，油酸，亞油酸，亞麻酸，十五烷酸，二十烷酸，二十二烷酸，decosenoic acid，花生四烯酸，蓖麻油酸，二羥基硬脂酸，等。在上述單酸中，優(yōu)選棕櫚酸、硬脂酸、己酸、辛酸和月桂酸。
二羧酸的例子包括己二酸，癸二酸等。在上述二酸中，優(yōu)選飽和或不飽和脂族二羧酸，特別是己二酸，這是因?yàn)榭赏ㄟ^(guò)將上述二羧酸轉(zhuǎn)變成二乙烯酯得到可聚合單體。
脂肪酸衍生物的例子包括使上述脂肪酸與醇、脂肪酸的酸酐等反應(yīng)得到的脂肪酸酯。脂肪酸酯的例子包括脂肪酸的乙烯酯，低級(jí)烷基酯，鹵代低級(jí)烷基酯等。在上述酯中，優(yōu)選乙烯酯，這是由于乙烯基在酯交換反應(yīng)中可用作優(yōu)異的離去基團(tuán)。
如本文所用，“低級(jí)烷基”是指C1-6直鏈或支鏈烷基，“鹵代低級(jí)烷基”是指用至少一個(gè)鹵(例如，氟、氯或溴)原子取代的低級(jí)烷基。脂肪酸衍生物的具體例子包括上述脂肪酸的乙烯酯，甲酯，乙酯，三氟乙酯和三氯乙酯，以及己二酸和癸二酸的二乙烯酯。
從反應(yīng)性的角度來(lái)看，特別優(yōu)選己酸乙烯酯，辛酸乙烯酯，月桂酸乙烯酯，豆蔻酸乙烯酯，棕櫚酸乙烯酯，硬脂酸乙烯酯，十一酸乙烯酯，油酸乙烯酯，己二酸二乙烯酯。
上述脂肪酸及其衍生物可單獨(dú)或組合使用。此外，上述脂肪酸及其衍生物可以被羥基、羰基、苯基、鹵原子和/或其它取代基取代。
脂肪酸及其衍生物的濃度可以適當(dāng)?shù)剡x擇，通常相對(duì)于每摩爾含羥基化合物為約1-10mol，優(yōu)選約1.2-約4mol。
蔗糖酯當(dāng)在本發(fā)明制備酯的方法中使用蔗糖作含羥基化合物時(shí)，得到蔗糖2位上的仲羥基被選擇性酯化的化合物。
具體地說(shuō)，當(dāng)在非質(zhì)子有機(jī)溶劑中在Candida antarctica由來(lái)的A型脂肪酶存在下用脂肪酸或其衍生物酯化蔗糖時(shí)，得到下式的化合物 其中，Rc為C1-24脂肪酸殘基。
可從上述溶劑中適當(dāng)?shù)剡x擇非質(zhì)子有機(jī)溶劑，其中優(yōu)選二甲基甲酰胺，二甲亞砜和其混合物，更優(yōu)選二甲亞砜。
可從上述和其它脂肪酸及其衍生物中適當(dāng)?shù)剡x擇需要的脂肪酸及其衍生物。從反應(yīng)性的角度來(lái)看，特別優(yōu)選己二酸二乙烯酯，己酸乙烯酯，辛酸乙烯酯，月桂酸乙烯酯，棕櫚酸乙烯酯和硬脂酸乙烯酯。
實(shí)踐中所用蔗糖酯是通過(guò)使用化學(xué)催化劑的方法制備的并且為單-、二-和三酯的混合物。而且，在上述蔗糖酯中，蔗糖1′-、6-和6′-位上的伯羥基被脂肪酸酯取代。因此，蔗糖酯具有低的親水性，并不能充分溶于水或在水中乳化。相比之下，根據(jù)本發(fā)明可以高收率地得到2位羥基被選擇性酯化的單酯。此外，無(wú)需復(fù)雜步驟即可得到僅2位的仲羥基被選擇性酯化的高純度蔗糖酯。
可將由本發(fā)明方法得到的2位羥基被選擇性酯化的蔗糖酯有利地用作食品、化妝品、洗發(fā)水、護(hù)發(fā)素、醫(yī)藥、農(nóng)藥、清潔劑和其它領(lǐng)域中的乳化劑、表面活性劑等。
即使在使用高水溶性化合物作為起始原料時(shí)，本發(fā)明方法也能有效地制備酯。具體地說(shuō)，本發(fā)明方法可有利地用于制備難以合成的酯和需要用酶選擇性反應(yīng)制備的酯。


圖1是表示利用各種濃度的分子篩制備熊果苷酯時(shí)熊果苷轉(zhuǎn)化率(反應(yīng)率)隨時(shí)間變化的測(cè)量結(jié)果的曲線(xiàn)圖。該分析是利用HPLC進(jìn)行的。
圖2表示利用各種濃度的分子篩制備熊果苷酯時(shí)熊果苷轉(zhuǎn)化率(反應(yīng)率)隨時(shí)間變化的測(cè)量結(jié)果的曲線(xiàn)圖。該分析是利用HPLC進(jìn)行的。
圖3是表示熊果苷和實(shí)施例1中所得熊果苷酯化合物對(duì)得自蘑菇的酪氨酸酶的抑制活性的評(píng)價(jià)結(jié)果的曲線(xiàn)圖。
圖4是表示熊果苷和實(shí)施例1中所得熊果苷酯化合物對(duì)小鼠黑素瘤細(xì)胞黑素生成抑制效果的評(píng)價(jià)結(jié)果的曲線(xiàn)圖。
圖5是表示實(shí)施例2-1和2-4中分別用焦兒茶酚和苯酚作為底物時(shí)十一碳烯酸海藻糖酯的酪氨酸酶抑制活性的測(cè)量結(jié)果的曲線(xiàn)圖?！?ο-兒茶酚”表示用兒茶酚作為底物的測(cè)量結(jié)果，而“-·-苯酚”表示用苯酚作為底物的測(cè)量結(jié)果。
圖6是表示比較例2-1和2-3中分別用兒茶酚和苯酚作為底物時(shí)熊果苷的酪氨酸酶抑制活性的測(cè)量結(jié)果的曲線(xiàn)圖?！?ο-兒茶酚”表示用兒茶酚作為底物的測(cè)量結(jié)果，而“-·-苯酚”表示用苯酚作為底物的測(cè)量結(jié)果。
圖7是表示實(shí)施例2-1和2-3以及比較例2-2的結(jié)果的曲線(xiàn)圖，其中用兒茶酚作為底物測(cè)量酪氨酸酶抑制活性。
圖8是表示實(shí)施例2-5和比較例2-4的結(jié)果的曲線(xiàn)圖，其中用苯酚作為底物測(cè)量酪氨酸酶抑制活性。
圖9是圖示說(shuō)明熊果苷和十一碳烯酸的酪氨酸酶抑制活性的圖。熊果苷主要抑制單酚的羥基化反應(yīng)，而十一碳烯酸則抑制兒茶酚的氧化反應(yīng)。
圖10是表示抗壞血酸和抗壞血酸衍生物的酪氨酸酶活性促進(jìn)率的圖表。
圖11是表示反應(yīng)的酯變換率的一組曲線(xiàn)圖，該反應(yīng)是通過(guò)向0.25M蔗糖和1M己二酸二乙烯酯的DMF或DMSO溶液中加入Candidaantarctica由來(lái)的A型脂肪酶(CAL-A)或Candida antarctica由來(lái)的B型脂肪酶(CAL-B)并將混合物在40℃保持24小時(shí)進(jìn)行的?！唉稀北硎居肁型脂肪酶的反應(yīng)變換率，而“·”表示用B型脂肪酶的反應(yīng)變換率。
圖12-A是表示反應(yīng)的蔗糖酯變換率的曲線(xiàn)圖，該反應(yīng)是通過(guò)向0.125M蔗糖和0.5M己二酸二乙烯酯在由DMF和DMSO以各種比組成的混合溶劑中加入Candida antarctica由來(lái)的A型脂肪酶(CAL-A)，然后在30℃攪拌24小時(shí)進(jìn)行的。圖12-B是表示反應(yīng)的蔗糖酯變換率的曲線(xiàn)圖，該反應(yīng)是通過(guò)向0.125M蔗糖和0.5M己二酸二乙烯酯在由DMF和DMSO以各種比組成的混合溶劑中加入Candida antarctica由來(lái)的B型脂肪酶(CAL-B)，然后在30℃攪拌7天進(jìn)行的。
圖13是表示反應(yīng)的酯變換率的曲線(xiàn)圖，該反應(yīng)是通過(guò)向0.25M麥芽糖和1M己二酸二乙烯酯在二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)的溶液中加入10mg/ml的Candidaantarctica由來(lái)的A型脂肪酶(CAL-A)，然后在40℃攪拌24小時(shí)進(jìn)行的。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式以下實(shí)施例和比較例是為了進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，而決不是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1-1將枯草芽孢桿菌由來(lái)的蛋白酶(0.5g，由Nagase ChemteX公司制造)加入到72.6ml含6.8g熊果苷、21g 10-十一碳烯酸乙烯酯和3.8g水的二甲基甲酰胺溶液中，然后在30℃和130rpm的條件下攪拌1周。轉(zhuǎn)化率為80％。產(chǎn)品的TLC分析表明基本上僅形成單酯。將酶催化反應(yīng)混合物過(guò)濾以去除酶粉末，然后將濾液減壓濃縮去除DMF。將該濃縮液加入到填充有100g硅膠的柱中并用8∶1的氯仿和乙醇洗脫。收集產(chǎn)品并濃縮得到6-O-(10-十一碳烯?；?熊果苷的晶體。收率為62％。13C-NMRδ101.6(C1)，76.4(C2)，73.2(C3)，70.1(C4)，73.7(C5)，63.4(C6)，115.5，117.7，150.2152.4(苯酚)，172.8(C＝O)，114.6，138.9(CH＝CH2)，24.4，28.3，28.5，28.7，33.2，33.6(CH2)。元素分析計(jì)算值為C23H34O8C，63.01；H，7.76，測(cè)量值C，63.16；H，7.75。
用類(lèi)似方法使各種脂族羧酸乙烯酯與熊果苷在枯草芽孢桿菌由來(lái)的蛋白酶存在下反應(yīng)。結(jié)果如表1-1所示。
表1-1使用枯草芽孢桿菌由來(lái)的蛋白酶的熊果苷酯合成

實(shí)施例1-2將熊果苷(2.8g)和己二酸二乙烯酯(9.5g)溶解在40.5ml吡啶中并加入5g鏈霉菌屬由來(lái)的堿性蛋白酶(由Toyobo Co.Ltd.制造)，然后在30℃和130rpm的條件下攪拌4天。產(chǎn)品的TLC分析表明僅有單酯形成。將酶催化反應(yīng)混合物過(guò)濾以去除酶粉末，然后將濾液減壓濃縮以去除吡啶。將該濃縮液加入到填充有100g硅膠的柱中并用4∶1的己烷∶乙酸乙酯洗脫。收集產(chǎn)品并濃縮得到6-O-(乙烯基己二酰基)熊果苷的晶體。分離收率為85％。H-NMRδ1.556(4H，m，-CH2CH2-)，2.320(2H，m，-COCH2-)，2.430(2H，t，-CH2CO-)，3.12-3.29(3H，m，H-2，3，4)，3.508(1H，m，H-5)，4.070(1H，q，H-6)，4.310(1H，dd，H-6)，4.640(1H，dd，＝CH2)，4.675(1H，d，H-1)，4.900(1H，dd，＝CH2)，5.11-5.32(3H，m，OH-2，3，4)，6.66(2H，m，Φ)，6.83(2H，m，Φ)，7.21(1H，q，-CH＝)。
此外，在其它與上面相同的條件下在DMF，DMSO或N-甲基-2-吡咯烷酮中進(jìn)行反應(yīng)。作為起始原料的熊果苷迅速酯化，TLC分析檢測(cè)到在上述溶劑中單酯是主要產(chǎn)物。但是與在吡啶中不同，也產(chǎn)生了二酯、三酯和四酯。
實(shí)施例1-3將1g 4-吡咯烷吡啶(由Wako Pure Chemical Ind.Ltd.制造)加入到76.2ml含6.8g熊果苷和21g 10-十一碳烯酸乙烯酯的DMF溶液中，然后在80℃和130rpm的條件下攪拌24小時(shí)。產(chǎn)品的TLC分析表明產(chǎn)生了單酯、二酯、三酯和多酯。將反應(yīng)混合物減壓濃縮以去除DMF，然后加入到填充有100g硅膠的柱中，并用8∶1的氯仿∶甲醇洗脫。收集所制得的單酯并濃縮得到6-O-(10-十一碳烯?；?熊果苷的晶體。收率為10％。13C-NMRδ101.6(C1)，76.4(C2)，73.2(C3)，70.1(C4)，73.7(C5)，63.4(C6)，115.5，117.7，150.2152.4(苯酚)，172.8(C＝O)，114.6，138.9(CH＝CH2)，24.4，28.3，28.5，28.7，33.2，33.6(CH2)。元素分析計(jì)算值C23H34O8C，63.01；H，7.76，測(cè)量值C，63.06；H，7.81。
用類(lèi)似方法使各種脂族羧酸乙烯酯與熊果苷在4-吡咯烷吡啶的存在下反應(yīng)。結(jié)果如表1-2所示。
表1-2使用4-吡咯烷吡啶的熊果苷酯的合成

實(shí)施例1-4將熊果苷(0.3g)和己二酸二乙烯酯(1g)溶解在4ml DMF中并向其中加入10mg二甲基氨基吡啶，然后在80℃攪拌3小時(shí)。產(chǎn)物的TLC分析表明形成了單酯、二酯、三酯和四酯。將反應(yīng)混合物減壓濃縮以去除DMF。然后加入到填充有100g硅膠的柱中并用8∶1的氯仿∶甲醇洗脫。收集單酯并濃縮得到6-O-(乙烯基己二?；?熊果苷的晶體。收率為21％。
實(shí)施例1-5將熊果苷(327mg)和10-十一碳烯酸(885mg)溶解在錐形燒瓶中的4.0ml 1，4-二噁烷/DMSO(＝9∶1)混合溶劑中。在加入0.4g的4A活化分子篩后加入40mg Candida anterctica由來(lái)的固定化脂肪酶(由Novozymes制造)，然后在40℃和130rpm的條件下攪拌1周。通過(guò)使用微波爐的簡(jiǎn)單方法將分子篩活化。具體地說(shuō)，將4A分子篩置于已在微波爐中加熱1分鐘的燒瓶中，然后立即使用真空泵減壓冷卻至室溫；該方法進(jìn)行三次。酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的TLC分析表明僅有單酯產(chǎn)生。將該酶催化反應(yīng)混合物過(guò)濾以去除酶和分子篩，然后將濾液減壓濃縮。向濃縮液中加入甲醇(4ml)和水(2.5ml)后再加入己烷(5ml)以將未反應(yīng)的十一碳烯酸萃取到己烷層。該己烷萃取進(jìn)行6次，然后使用蒸發(fā)器濃縮水層。向濃縮液中加入8ml水以形成白色沉淀，然后通過(guò)離心分離去除上清液。進(jìn)行3次上述水萃取以去除DMSO和未反應(yīng)的熊果苷。收集白色沉淀并減壓干燥，得到287g粉末。
用100％乙酸乙酯精制后產(chǎn)物的TLC分析證實(shí)未反應(yīng)的10-十一碳烯酸已被去除且只有單酯化合物形成。對(duì)精制后的產(chǎn)物進(jìn)行NMR分析，發(fā)現(xiàn)其與實(shí)施例1-1中得到的酯化合物相同，即6-O-(10-十一碳烯酰基)熊果苷。
酯的收率為91％。本實(shí)施例所用方法未使用硅膠柱精制，因此簡(jiǎn)單易行。
實(shí)施例1-6將熊果苷(33mg)和10-十一碳烯酸(89mg)溶解在錐形燒瓶中的4.0ml 1，4-二噁烷中。在加入0-15重量％的4A活化分子篩后加入40mg Candida anterctica由來(lái)的固定化脂肪酶(由Novozymes制造)，然后在40℃和130rpm的條件下攪拌1周。該分子篩已用與實(shí)施例1-5相同的方法活化。通過(guò)HPLC分析檢測(cè)熊果苷轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的變化。HPLC分析的條件如下設(shè)備Shimazu LC-10，柱TSK gel Amide-80，流動(dòng)相溶劑乙腈/水(＝90∶10)，流速1.0ml，檢測(cè)示差折射。
結(jié)果如圖1所示。用作脫水劑的分子篩的加入顯著提高了熊果苷的轉(zhuǎn)化率(反應(yīng)率)。分子篩濃度越高，則轉(zhuǎn)化率越高。
實(shí)施例1-7使用與實(shí)施例1-6相同的方法進(jìn)行酶催化反應(yīng)，除了熊果苷的用量為55mg至872mg(0.05M至0.8M)和所用10-十一碳烯酸的摩爾數(shù)是熊果苷的4倍之外。通過(guò)HPLC分析測(cè)量熊果苷轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的變化。結(jié)果如圖2所示。熊果苷濃度越高，則反應(yīng)率越高。然而，熊果苷濃度高于0.6M時(shí)不會(huì)進(jìn)一步提高反應(yīng)率。
評(píng)價(jià)1利用脯氨酸評(píng)價(jià)酪氨酸酶抑制活性通過(guò)使用脯氨酸的方法(Analytical Biochemiatry，179，375-381，1989)測(cè)量本發(fā)明熊果苷酯化合物的酪氨酸酶抑制活性。將40μl的溶解在pH 7.5的0.1M磷酸鹽緩沖液中的0.794M L-脯氨酸，40μl的0.037M 1，2-二羥基苯和1.41ml實(shí)施例1-1所得的6-O-(10-十一碳烯酰基)熊果苷的各種濃度溶液之一在吸光度測(cè)量用試管中攪拌。加入350μg/ml的酪氨酸酶(得自蘑菇，SIGMA)溶液(10μl)，然后在525nm下攪拌10秒檢測(cè)吸光度隨時(shí)間的變化。除了使用熊果苷代替6-O-(10-十一碳烯?；?熊果苷外，重復(fù)上述步驟。結(jié)果如圖3所示。
圖3表明通過(guò)酯化熊果苷6位碳上的羥基得到的化合物比未酯化熊果苷具有顯著改進(jìn)的酪氨酸酶抑制活性。
評(píng)價(jià)2利用小鼠黑素瘤細(xì)胞評(píng)價(jià)黑素生成抑制效果將小鼠黑素瘤B16細(xì)胞(3.6×105)加入到含15ml的補(bǔ)充有10％FCS的D-MEM培養(yǎng)基的75cm2培養(yǎng)瓶中，在含5％二氧化碳的氣體中于37℃培養(yǎng)過(guò)夜以使細(xì)胞粘連。將培養(yǎng)基換成15ml的含熊果苷的0.1％DMSO溶液或含實(shí)施例1-1所得6-O-(10-十一碳烯?；?熊果苷的的0.1％DMSO溶液之一的補(bǔ)充有10％FCS的D-MEM培養(yǎng)基。在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)兩天后，再次將培養(yǎng)基換成15ml含0.1％DMSO溶液的培養(yǎng)基并在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)兩天。培養(yǎng)后，回收細(xì)胞并測(cè)量細(xì)胞的濕重。在測(cè)量細(xì)胞濕重后，將細(xì)胞小粒懸浮于總體積為700μl的MilliQ水中。對(duì)細(xì)胞懸浮液超聲粉碎15分鐘，然后與700μl的6N氫氧化鈉水溶液混合以完全溶解細(xì)胞并提取黑色素。然后測(cè)量在405nm處的吸光度。以405nm處的吸光度/細(xì)胞濕重(μg)表示每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的黑色素。將未加入熊果苷或熊果苷十一碳烯酸酯時(shí)每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的黑色素看作100％，測(cè)量在各種濃度下熊果苷十一碳烯酸酯或熊果苷的黑素生成抑制效果。結(jié)果如圖4所示。
圖4表明當(dāng)用黑素瘤細(xì)胞測(cè)試時(shí)熊果苷十一碳烯酸酯的黑素生成抑制效果比熊果苷高約100倍。
實(shí)施例2-1用脯氨酸(Analytical Biochemiatry，179，375-381，1989)測(cè)量十一碳烯酸糖酯的酪氨酸酶抑制活性。具體地說(shuō)，將溶解在pH 7.5的0.1M磷酸鹽緩沖液中的0.749M L-脯氨酸(40μl)，0.037M焦兒茶酚和1.41ml的各種濃度之一的海藻糖十一碳烯酸酯(Tre-Unde)溶液(40μl)在吸光度測(cè)量用試管中攪拌。然后，加入350μg/ml的酪氨酸酶(得自蘑菇，SIGMA)溶液(10μl)，并在525nm下攪拌3分鐘后測(cè)量吸光度的變化，證實(shí)對(duì)酪氨酸酶的抑制。結(jié)果如圖5所示。
實(shí)施例2-2用與實(shí)施例2-1相同的方法測(cè)試十一碳烯酸(Unde)的酪氨酸酶抑制活性，并證實(shí)其抑制了酪氨酸酶活性。結(jié)果如圖7所示。
實(shí)施例2-3用與實(shí)施例2-1相同的方法測(cè)試蔗糖十一碳烯酸酯(Suc-Unde)的酪氨酸酶抑制活性，并證實(shí)其抑制了酪氨酸酶活性。結(jié)果如圖7所示。
比較例2-1用與實(shí)施例2-1相同的方法并使用焦兒茶酚作為底物測(cè)試熊果苷的酪氨酸酶抑制活性，并證實(shí)其抑制了酪氨酸酶活性。結(jié)果如圖6所示。
比較例2-2用與實(shí)施例2-1相同的方法測(cè)試海藻糖二(十一碳烯酸)酯(Tre-di-Unde)的酪氨酸酶抑制活性，并證實(shí)其沒(méi)有抑制酪氨酸酶活性。結(jié)果如圖7所示。
實(shí)施例2-4通過(guò)使用焦兒茶酚的改進(jìn)方法，利用苯酚作為底物檢測(cè)十一碳烯酸糖酯的酪氨酸酶抑制活性。具體地說(shuō)，將40μl溶解在pH 7.5的0.1M磷酸鹽緩沖液中的0.749M L-脯氨酸，40μl 0.037M苯酚和1.41ml的各種濃度的海藻糖十一碳烯酸酯(Tre-Unde)的溶液在測(cè)量吸光度用試管中攪拌。然后，加入350μg/ml的酪氨酸酶(衍生自蘑菇，SIGMA)溶液(10μl)，并在525nm下攪拌15分鐘測(cè)量吸光度的變化，結(jié)果證實(shí)吸光度的增加被抑制，即酪氨酸酶被抑制。結(jié)果如圖5所示。
實(shí)施例2-5用與實(shí)施例2-4相同的方法測(cè)試蔗糖十一碳烯酸酯(Suc-Unde)的酪氨酸酶抑制活性，結(jié)果證實(shí)其抑制了酪氨酸酶活性。結(jié)果如圖8所示。
比較例2-3用與實(shí)施例2-4相同的方法測(cè)試熊果苷的酪氨酸酶抑制活性，結(jié)果證實(shí)其抑制了酪氨酸酶活性。結(jié)果如圖6所示。
比較例2-4用與實(shí)施例2-4相同的方法測(cè)試海藻糖油酸酯(Tre-Ole)的酪氨酸酶抑制活性，結(jié)果證實(shí)其沒(méi)有抑制酪氨酸酶活性。結(jié)果如圖8所示。
實(shí)施例3-1在脯氨酸的存在下用苯酚作為底物，使用抗壞血酸和抗壞血酸衍生物作為測(cè)量酪氨酸酶活性促進(jìn)作用的被測(cè)物質(zhì)。
苯酚是被酪氨酸酶羥基化的，此時(shí)需要?dú)涔w。所得焦兒茶酚被酪氨酸酶氧化形成鄰醌。在脯氨酸的存在下定量測(cè)量所形成的鄰醌的量以測(cè)定酪氨酸酶活性。
具體地說(shuō)，該測(cè)量是如下進(jìn)行的。將40μl溶解在pH 7.5的0.1M磷酸鹽緩沖液中的0.749M L-脯氨酸，40μl的0.037M苯酚和1.41ml各種濃度的被測(cè)物質(zhì)的溶液之一在測(cè)量吸光度用試管中攪拌。然后，加入350μg/ml的酪氨酸酶(得自蘑菇，SIGMA)溶液(10μl)，并在525nm下攪拌15分鐘測(cè)量吸光度的變化以測(cè)定酪氨酸酶活性。
酪氨酸酶活性促進(jìn)率是以受抑制或促進(jìn)的酪氨酸酶活性相對(duì)于未加入被測(cè)物質(zhì)時(shí)顯示的酪氨酸酶活性的百分比來(lái)表示的。100％的酪氨酸酶活性促進(jìn)率表示酪氨酸酶活性比未加入被測(cè)物質(zhì)時(shí)的活性提高了2倍。
在被測(cè)物質(zhì)中，抗壞血酸是L-抗壞血酸(Wako Pure Chemical Ind.Ltd.，Number016-04805)，抗壞血酸衍生物是下式表示的抗壞血酸-2-葡糖苷(Wako Pure Chemical Ind.Ltd.，Number074-04581)、抗壞血酸-2-磷酸酯[抗壞血酸磷酸酯鎂鹽(Wako Pure Chemical Ind.Ltd.，Number013-12061)]、和抗壞血酸-6-棕櫚酸酯(Wako PureChemical Ind.Ltd.，Number011-13662)。
圖10表示測(cè)量結(jié)果。
如圖10所示，抗壞血酸在10-3M至10-1M的濃度下表現(xiàn)出酪氨酸酶抑制活性，而在10-4M和更低的濃度下顯示出酪氨酸酶活性促進(jìn)作用。
抗壞血酸棕櫚酸酯、抗壞血酸脂肪酸酯在10-4M和更低的濃度下顯示出酪氨酸酶活性促進(jìn)作用。
抗壞血酸磷酸酯和抗壞血酸葡糖苷在10-2M至10-4M濃度下表現(xiàn)出酪氨酸酶活性促進(jìn)作用。
實(shí)施例4-1將Candia anterctica由來(lái)的A型脂肪酶(Chirazyme，L5，lyoCAL-A)加入到0.25M蔗糖和1M己二酸二乙烯酯的二甲基甲酰胺(DMF)或二甲亞砜(DMSO)溶液中至濃度為10mg/ml，然后在40℃反應(yīng)24小時(shí)以測(cè)定酯轉(zhuǎn)化率。反應(yīng)混合物的HPLC分析證實(shí)蔗糖已基本定量地轉(zhuǎn)化為酯。HPLC的分析條件如下所示柱TSK gel Amide-80洗脫液乙腈/水(3/1)檢測(cè)示差折射比較例4-1除了使用Candia anterctica由來(lái)的B型脂肪酶(Chirazyme，L2，lyoCAL-B)代替Candia anterctica由來(lái)的A型脂肪酶(Chirazyme，L5，lyoCAL-A)之外，重復(fù)實(shí)施例4-1的步驟以測(cè)定酯變換率。
圖11表示實(shí)施例4-1和比較例4-1的酯變換率。圖11表明在DMF和DMSO中，A型脂肪酶比B型脂肪酶的活性高。特別是在DMSO中活性非常的高。
實(shí)施例4-2將Candia anterctica由來(lái)的A型脂肪酶(Chirazyme，L5，lyo)(10mg/ml)加入到0.125M蔗糖和0.5M己二酸二乙烯酯在由各種比的DMF和DMSO組成的混合物中，然后在30℃反應(yīng)24小時(shí)以測(cè)定蔗糖酯變換率。反應(yīng)混合物的HPLC分析證實(shí)蔗糖已基本定量地轉(zhuǎn)化為酯。HPLC的分析條件如下所示柱TSK gel Amide-80洗脫液乙腈/水(3/1)檢測(cè)示差折射比較例4-2將Candia anterctica由來(lái)的B型脂肪酶(Chirazyme，L2，lyo)(10mg/ml)加入到0.125M蔗糖和0.5M己二酸二乙烯酯在由各種比的DMF和DMSO組成的混合物中，然后在30℃攪拌7天以測(cè)定蔗糖酯變換率。反應(yīng)混合物的HPLC分析證實(shí)蔗糖已基本定量地轉(zhuǎn)化為酯。HPLC的分析條件與實(shí)施例4-2相同。
圖12表示實(shí)施例4-2和比較例4-2的酯變換率。圖12表明在DMF和DMSO的混合溶劑中A型脂肪酶(CAL-A)比B型脂肪酶(CAL-B)的活性高。特別是混合溶劑的DMSO比越高，則A型脂肪酶所表現(xiàn)出的活性就越高。
實(shí)施例4-3將麥芽糖(0.25M)和己二酸二乙烯酯(1M)溶解在二甲基甲酰胺、二甲亞砜或N-甲基吡咯烷酮(NMP)中并加入10mg/ml Candiaanterctica由來(lái)的A型脂肪酶(Chirazyme，L5，lyoCAL-A)，然后在40℃攪拌24小時(shí)以測(cè)定酯變換率。反應(yīng)混合物的HPLC分析證實(shí)麥芽糖已基本定量地轉(zhuǎn)化為酯。HPLC的分析條件如下所示柱TSK gel Amide-80洗脫液乙腈/水(3/1)檢測(cè)示差折射比較例4-3除了使用Candia anterctica由來(lái)的B型脂肪酶(Chirazyme，L2，lyoCAL-B)代替Candia anterctica由來(lái)的A型脂肪酶(Chirazyme，L5，lyoCAL-A)之外，重復(fù)實(shí)施例4-3的步驟以測(cè)定酯變換率。
圖13表示實(shí)施例4-3和比較例4-3的酯變換率。圖13表明當(dāng)使用麥芽糖時(shí)，A型脂肪酶與B型脂肪酶不同，A型脂肪酶在各種非質(zhì)子有機(jī)溶劑中均表現(xiàn)出顯著的活性。
實(shí)施例4-4將Candia anterctica由來(lái)的A型脂肪酶(Chirazyme，L5，lyoCAL-A)(500mg)懸浮在150ml的6.42g(0.125M)蔗糖和10.7g(0.5M)己酸乙烯酯的二甲基甲酰胺溶液中。將該酶催化反應(yīng)混合物在30℃和130rpm的條件下攪拌24小時(shí)。在與實(shí)施例4-1相同的條件下進(jìn)行反應(yīng)混合物的HPLC分析，結(jié)果證實(shí)蔗糖已基本定量地轉(zhuǎn)化為酯。
反應(yīng)混合物的TLC分析證實(shí)僅有一種反應(yīng)產(chǎn)物形成。從反應(yīng)混合物中過(guò)濾出不溶物并利用蒸發(fā)器減壓濃縮濾液，然后將濃縮液加入到硅膠柱(氯仿∶甲醇＝12∶1)中以分離和精制酯從而得到6.5g白色晶體(收率79％)。13C NMR分析證實(shí)已經(jīng)形成了在蔗糖2位引入己酸殘基的蔗糖2-己酸酯。13C NMR(DMSOd6)δ88.70(C1)，72.99(C2)，70.05(C3)，69.83(C4)，72.56(C5)，60.31(C6)，61.14(C1′)，104.23(C2′)，75.3(C3′)，82.63(C4′)，73.75(C5′)，62.32(C6′)實(shí)施例4-5將Candia anterctica由來(lái)的A型脂肪酶Chirazyme，L5，lyoCAL-A)(500mg)懸浮在150ml的6.42g(0.125M)蔗糖和12.8g(0.5M)辛酸乙烯酯的二甲基甲酰胺溶液中。將該酶催化反應(yīng)混合物在30℃和130rpm的條件下攪拌24小時(shí)。在與實(shí)施例4-1相同的條件下進(jìn)行反應(yīng)混合物的HPLC分析，結(jié)果證實(shí)蔗糖已基本定量地轉(zhuǎn)化為酯。從反應(yīng)混合物中過(guò)濾出不溶物并將濾液濃縮，然后將濃縮液在填充有100g硅膠的柱中用氯仿∶甲醇(12∶1，v/v)洗脫得到6.8g白色晶體(收率68％)。13C NMR分析證實(shí)形成了在蔗糖2位引入辛酸殘基的蔗糖2-辛酸酯。
13C NMR(DMSOd6)δ88.71(C1)，72.96(C2)，70.05(C3)，69.85(C4)，72.55(C5)，60.35(C6)，61.13(C1′)，104.25(C2′)，75.27(C3′)，82.62(C4′)，73.80(C5′)，62.39(C6′)實(shí)施例4-6將Candia anterctica由來(lái)的A型脂肪酶(Chirazyme，L5，lyoCAL-A)(500mg)懸浮在150ml的6.42g(0.125M)蔗糖和15g(0.5M)癸酸乙烯酯的二甲基甲酰胺溶液中。將該酶催化反應(yīng)混合物在30℃和130rpm的條件下攪拌3天。在與實(shí)施例4-1相同的條件下進(jìn)行反應(yīng)混合物的HPLC分析，結(jié)果證實(shí)蔗糖已基本定量地轉(zhuǎn)化為酯。用與實(shí)施例4-5相同的方法分離產(chǎn)物，得到6.0g白色晶體(收率64％)。13C NMR分析證實(shí)形成了在蔗糖2位引入癸酸殘基的蔗糖2-癸酸酯。
13C NMR(DMSOd6)δ88.72(C1)，72.94(C2)，70.07(C3)，69.86(C4)，72.53(C5)，60.34(C6)，61.21(C1′)，104.30(C2′)，75.27(C3′)，82.59(C4′)，實(shí)施例4-7將Candia anterctica由來(lái)的A型脂肪酶(Chirazyme，L5，lyoCAL-A)(500mg)懸浮在150ml的6.42g(0.125M)蔗糖和17g(0.5M)月桂酸乙烯酯的二甲基甲酰胺溶液中。將該酶催化反應(yīng)混合物在30℃和130rpm的條件下攪拌3天。在與實(shí)施例4-1相同的條件下進(jìn)行反應(yīng)混合物的HPLC分析，結(jié)果證實(shí)蔗糖已基本定量地轉(zhuǎn)化為酯。用與實(shí)施例4-5相同的方法分離產(chǎn)物，得到6.9g白色晶體(收率70％)。13C NMR分析證實(shí)形成了在蔗糖2位引入月桂酸殘基的蔗糖2-月桂酸酯。
13C NMR(DMSOd6)δ88.80(C1)，72.95(C2)，70.10(C3)，69.88(C4)，72.55(C5)，60.33(C6)，61.19(C1′)，104.30(C2′)，75.31(C3′)，82.62(C4′)，73.83(C5′)，62.35(C6′)實(shí)施例4-8將Candia anterctica由來(lái)的A型脂肪酶(Chirazyme，L5，lyoCAL-A)(250mg)懸浮在25ml的2.14g(0.25M)蔗糖和5g(1M)己二酸二乙烯酯的二甲基甲酰胺溶液中。將該酶催化反應(yīng)混合物在30℃和130rpm的條件下攪拌2天。在與實(shí)施例4-1相同的條件下進(jìn)行反應(yīng)混合物的HPLC分析，結(jié)果證實(shí)蔗糖已基本定量地轉(zhuǎn)化為酯。用與實(shí)施例4-5相同的方法分離產(chǎn)物，得到2.6g白色晶體(收率81％)。13C NMR分析證實(shí)形成了在蔗糖2位引入己二酸乙烯酯殘基的蔗糖2-己二酸乙烯酯。
13C NMR(DMSOd6)δ88.70(C1)，72.99(C2)，70.05(C3)，69.83(C4)，72.56(C5)，60.31(C6)，61.14(C1′)，104.28(C2′)，75.30(C3′)，82.63(C4′)，73.75(C5′)，62.32(C6′)，23.49，32.76，33.18(-CH2-)，98.12，141.26(-C＝C-)，170.33，172.62(-C＝O)比較例4-4除了使用爪哇毛霉(Mucor javanicus)由來(lái)的脂肪酶(脂肪酶M)、黑色曲霉(Aspergillus niger)由來(lái)的脂肪酶(脂肪酶A′)或Candidacylindracea由來(lái)的脂肪酶(脂肪酶AY)代替Candia antarctica由來(lái)的脂肪酶(脂肪酶A)之外，重復(fù)實(shí)施例4-8的步驟以測(cè)定蔗糖酯變換率。
表4-1表示使用在實(shí)施例4-8和比較例4-4中的各種酶轉(zhuǎn)變成蔗糖2-己二酸乙烯酯的變換率。
表4-1

如表4-1所示，Candia anterctica由來(lái)的A型脂肪酶比得自其它微生物的脂肪酶具有顯著高的變換率。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了包括具有酪氨酸酶抑制或促進(jìn)活性的化合物作為活性成分的酪氨酸酶活性調(diào)整劑，以及包括該該調(diào)整劑的外用制劑。本發(fā)明還提供了制備該化合物的方法。
具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了具有酪氨酸酶抑制活性的新型熊果苷酯化合物，包括該化合物作為活性成分的酪氨酸酶抑制劑，以及包括該抑制劑的外用制劑。
此外，本發(fā)明還提供了包括十一碳烯酸、其鹽和/或其酯衍生物作為活性成分的酪氨酸酶抑制劑，和包括該酪氨酸酶抑制劑的外用制劑。
此外，本發(fā)明還提供了包括抗壞血酸和/或其衍生物作為活性成分的酪氨酸酶活性促進(jìn)劑，和包括該酪氨酸酶活性促進(jìn)劑的外用制劑。
本發(fā)明也提供了用酶制備酯的方法，該方法適用于制備酪氨酸酶抑制劑或促進(jìn)劑。
本發(fā)明的新型熊果苷酯化合物由于在熊果苷的6位羥基引入了疏水基而具有比熊果苷更高的酪氨酸酶抑制活性。疏水基的引入也改進(jìn)了該化合物的皮膚吸收性。而且，該化合物具有大概基于糖酯結(jié)構(gòu)的抗多種微生物的抗菌作用；大概由于其酚羥基的自由基消除性能；和大概基于酯部分的疏水性和熊果苷部分的親水性的表面活性作用。
包括該化合物作為活性成分的酪氨酸酶抑制劑和包括該抑制劑的外用制劑顯示出顯著的酪氨酸酶抑制效果，并因此可將其有效地用于皮膚外用制劑、皮膚美白用化妝品和化妝品及醫(yī)藥領(lǐng)域中的添加劑等。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是基于以下發(fā)現(xiàn)十一碳烯酸和二糖的酯通過(guò)與熊果苷不同的作用機(jī)理極大抑制了酪氨酸酶活性。具體地說(shuō)，酪氨酸酶催化了由一元酚到1，2-二酚(兒茶酚)的羥基化反應(yīng)和由兒茶酚到鄰醌的氧化反應(yīng)，而熊果苷有效抑制了一元酚的羥基化反應(yīng)，而十一碳烯酸、其鹽和其酯衍生物抑制了兒茶酚的氧化反應(yīng)。
特別是十一碳烯酸的酯衍生物由于引入了疏水基而改進(jìn)了皮膚吸收性。此外，該酯衍生物具有大概由于十一碳烯酸基團(tuán)的抗多種微生物的抗菌作用，以及大概由于酯部分的疏水性和熊果苷部分的親水性的表面活性作用。
包括具有上述性能的十一碳烯酸、其鹽和/或其酯衍生物作為活性成分的酪氨酸酶抑制劑和包括該抑制劑的外用制劑可有效地用于化妝品、皮膚美白用化妝品以及化妝品或醫(yī)藥領(lǐng)域中的添加劑等。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是基于以下發(fā)現(xiàn)抗壞血酸和抗壞血酸衍生物具有優(yōu)異的酪氨酸酶活性促進(jìn)作用和優(yōu)異的黑素生成促進(jìn)作用。
盡管目前已將抗壞血酸和抗壞血酸衍生物用作黑素生成抑制劑，但本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)抗壞血酸和抗壞血酸衍生物具有酪氨酸酶活性促進(jìn)作用和黑素生成促進(jìn)作用。
抗壞血酸和抗壞血酸衍生物不僅安全，而且可以低成本生產(chǎn)。
包括具有上述優(yōu)點(diǎn)的抗壞血酸和/或其衍生物作為活性成分的酪氨酸酶活性促進(jìn)劑以及包括該促進(jìn)劑的外用制劑不僅安全，可低成本的生產(chǎn)，而且具有優(yōu)異的酪氨酸酶活化作用和優(yōu)異的黑素生成促進(jìn)作用。
酪氨酸酶活性促進(jìn)劑和包括該促進(jìn)劑的外用制劑適用于化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域，例如防止或改善白發(fā)的頭發(fā)用制劑或外用制劑；使皮膚變黑或治療皮膚白斑病的皮膚用制劑或外用制劑；等。
本發(fā)明也提供了制備酯的酶催化法，該方法可使用含羥基化合物作為起始原料并且能夠以高收率制備酯。
目前，酶催化的酯交換反應(yīng)主要在疏水性有機(jī)溶劑中進(jìn)行，而根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)使用特定的酶時(shí)，酶催化的酯交換反應(yīng)可在諸如DMSO的非質(zhì)子有機(jī)溶劑中進(jìn)行。這就可能用含羥基化合物作為起始原料在含羥基化合物具有很高溶解度的溶劑中以高收率得到酯。
此外，當(dāng)在本發(fā)明方法中使用蔗糖作為含羥基化合物時(shí)，就會(huì)得到蔗糖2位的羥基被選擇性酯化的酯。
目前所得蔗糖脂肪酸酯主要是1′-，6-和/或6′-位伯羥基被酯化得到的單酯，二酯和三酯的混合物。在本發(fā)明中，可以高收率得到2位仲羥基被選擇性酯化的蔗糖單酯化合物。
由本發(fā)明方法得到的蔗糖酯具有高親水性和優(yōu)異的溶解性、乳化性和穩(wěn)定性等，并可作為乳化劑、表面活性劑等適用于食品、化妝品、洗發(fā)水、洗發(fā)露、醫(yī)藥、農(nóng)藥、清潔劑和其它領(lǐng)域。
本發(fā)明方法是使用幾乎不溶于疏水性有機(jī)溶劑的含羥基化合物作為起始原料制備酯的優(yōu)異方法；而且是制備難以合成和/或需要選擇性酶催化反應(yīng)的酯的方法。
權(quán)利要求
1.式(1)表示的熊果苷酯化合物式(1) 其中，Ra為疏水基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熊果苷酯化合物，其由式(2)表示式(2) 其中，R1為單鍵、亞烷基或亞芳基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熊果苷酯化合物，其由式(3)表示式(3) 其中，R1為單鍵、亞烷基或亞芳基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熊果苷酯化合物，其由式(4)表示式(4) 其中，R1為單鍵、亞烷基或亞芳基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熊果苷酯化合物，其由式(5)表示式(5) 其中，R1為單鍵、亞烷基或亞芳基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熊果苷酯化合物，其由式(6)表示式(6) 其中，R1為單鍵、亞烷基或亞芳基；R2為烷基或芳基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熊果苷酯化合物，其由式(7)表示式(7) 其中，R1、R3、R4、和R5各自獨(dú)立地為單鍵、亞烷基或亞芳基；X表示重復(fù)單元數(shù)并且為1-6。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熊果苷酯化合物，其由式(8)表示式(8) 其中，R1為單鍵、亞烷基或亞芳基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熊果苷酯化合物，其由式(9)表示式(9) 其中，R1為單鍵、亞烷基或亞芳基。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熊果苷酯化合物，其由式(10)表示式(10) 其中，R1為單鍵、亞烷基或亞芳基。
11.酪氨酸酶抑制劑，包括權(quán)利要求1-10所述熊果苷酯化合物中的至少一種作為活性成分。
12.皮膚外用制劑，包括權(quán)利要求11所述的酪氨酸酶抑制劑。
13.制備熊果苷酯化合物的方法，包括進(jìn)行熊果苷與式(11)-(19)之一表示的羧酸化合物的酯化反應(yīng)步驟式(11)-(19)式(11)A-OCO-R1-CH＝CH2其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基；式(12)A-OCO-R1-C(CH3)＝CH2其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基；式(13)A-OCO-R1-COOCH＝CH2其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基；式(14)A-OCO-R1-COOH其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基；式(15)A-OCO-R1-COO-R2其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基；R2為烷基或芳基；式(16)A-OCO-R1-[-R3-CH＝CH-R4-]X-R5-CH3其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1、R3、R4和R5各自獨(dú)立地為單鍵，亞烷基或亞芳基；X表示重復(fù)單元數(shù)并且為1-6；式(17)A-OCO-R1-C(CH3)3其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基；式(18)A-OCO-R1-C6H5其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基；式(19)A-OCO-R1-CH3其中，A為氫或取代或未取代烷基或乙烯基；R1為單鍵，亞烷基或亞芳基。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中酯化反應(yīng)在酶催化劑存在的條件下進(jìn)行。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中酯化反應(yīng)在化學(xué)催化劑存在的條件下進(jìn)行。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中在進(jìn)行酯化反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行脫水處理。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中在酯化反應(yīng)步驟后接著進(jìn)行如下步驟用非極性有機(jī)溶劑從酯化反應(yīng)混合物中萃取和分離未反應(yīng)的羧酸衍生物；以及然后加入過(guò)量的水以萃取和分離未反應(yīng)的熊果苷并沉淀熊果苷酯化合物。
18.酪氨酸酶抑制劑，包括式(20)表示的十一碳烯酸、其鹽和/或其酯衍生物式(20) 其中，Rb為氫或從糖除去一個(gè)羥基得到的糖殘基。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的酪氨酸酶抑制劑，其中Rb為從糖除去一個(gè)羥基得到的糖殘基。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的酪氨酸酶抑制劑，其包括十一碳烯酸和/或其鹽，其中Rb為氫。
21.包括權(quán)利要求18所述酪氨酸酶抑制劑的外用制劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的外用制劑，其是皮膚美白用化妝品。
23.酪氨酸酶活性促進(jìn)劑，包括抗壞血酸和/或抗壞血酸衍生物作為活性成分。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的酪氨酸酶活性促進(jìn)劑，其中抗壞血酸衍生物為選自由抗壞血酸脂肪酸酯；抗壞血酸磷酸酯，其脂肪酸酯，以及磷酸酯和脂肪酸酯的鹽；抗壞血酸葡糖苷及其脂肪酸酯；和抗壞血酸硫酸酯，其脂肪酸酯，以及硫酸酯和脂肪酸酯的鹽所組成的組中的至少一種。
25.包括權(quán)利要求23所述酪氨酸酶活性促進(jìn)劑的外用制劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的外用制劑，其是頭發(fā)用外用制劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的外用制劑，其是皮膚用外用制劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的外用制劑，其中抗壞血酸和抗壞血酸衍生物的總含量相對(duì)于全部外用制劑為0.00001-10重量％。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的外用制劑，其中酪氨酸酶活性促進(jìn)劑包括抗壞血酸作為活性成分，并且其中抗壞血酸的含量相對(duì)于全部外用制劑為0.0001-1重量％。
30.根據(jù)權(quán)利要求25所述的外用制劑，其中酪氨酸酶活性促進(jìn)劑包括選自由抗壞血酸磷酸酯和抗壞血酸葡糖苷所組成的組中的至少一種化合物作為活性成分，并且其中所述至少一種化合物的含量相對(duì)于全部外用制劑為0.001-10重量％。
31.根據(jù)權(quán)利要求25所述的外用制劑，其中酪氨酸酶活性促進(jìn)劑包括選自由抗壞血酸脂肪酸酯、抗壞血酸磷酸酯的脂肪酸酯和抗壞血酸葡糖苷的脂肪酸酯所組成的組中的至少一種化合物作為活性成分，并且其中所述至少一種化合物的含量相對(duì)于全部外用制劑為0.00001-0.1重量％。
32.制備酯的方法，包括在非質(zhì)子有機(jī)溶劑中、在Candidaantarctica由來(lái)的A型脂肪酶存在下用脂肪酸或其衍生物酯化含羥基化合物。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中非質(zhì)子有機(jī)溶劑選自由二甲基甲酰胺、二甲亞砜、二甲基甲酰胺與二甲亞砜的混合物所組成的組。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中含羥基化合物選自由糖類(lèi)、核苷類(lèi)、糖醇類(lèi)和含羥基氨基酸所組成的組中的至少一種。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中含羥基化合物為糖類(lèi)。
36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中含羥基化合物為蔗糖，并且其中酯為式(21)表示的化合物式(21) 其中，Rc為C1-24脂肪酸殘基。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了含具有酪氨酸酶抑制或促進(jìn)活性的化合物作為活性成分的酪氨酸酶活性調(diào)整劑，含該調(diào)整劑的外用制劑，以及制備上述化合物的方法。
文檔編號(hào)C07H15/203GK1703419SQ20038010123
公開(kāi)日2005年11月30日 申請(qǐng)日期2003年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月10日
發(fā)明者常盤(pán)豐, 北川優(yōu), 吉野賢二, 柳谷周作, 樂(lè)隆生, 戶(hù)谷哲造, 嵨川博巳 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所, 東洋紡織株式會(huì)社