專利名稱：人體內(nèi)的生長激素變異及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種自然存在的生長激素突變；及其在篩選生長激素異常的患者或用于產(chǎn)生適于治療這種異常的變體療法和治療劑中的用途。
一個多世紀前人們就得知人體身材受遺傳因素的影響。盡管早在1912年就認識到通常呈遺傳隱性形式的家族性矮小身材，但是直到又過去了四分之一個世紀，這種家族性的有關內(nèi)容才在科學文獻中有所記載。只有到了1966年，人們才認識到這這種隱性遺傳的矮小身材通常與單一性生長激素(GH)缺乏有關。
據(jù)估測與GH缺乏有關的矮小身材的出生率為1/4000至1/10000。這些病例的大多數(shù)是散發(fā)的和自發(fā)的，但是其中5％至30％的病例具有與該病癥的遺傳病因?qū)W一致的患病的一級親屬(affected first-degreerelative)。GH缺乏的遺傳病因?qū)W通過對家族性矮小身材進行分子遺傳學分析和最初證實的受影響個體腦垂體表達的生長激素(GH1)基因的突變損傷而得到了證實。家族性矮小身材還可能是由于其它基因(例如P0U1F1，PROP1和GHRHR)發(fā)生突變而引起的，而且重要的是如何識別這些不同形式的病癥。
生長激素(GH)是一種通過多種作用促進出生后的骨骼和軟組織進行生長的多功能激素。至于GH的直接和間接作用的相對大小仍然是一個爭議。一方面，已經(jīng)證實了GH在多種組織和器官中的直接作用，而且已證明GH受體存在于多種細胞類型當中。另一方面，大量的數(shù)據(jù)表明GH的主要作用是通過GH-依賴性胰島素樣生長因子I(IGF-I)介導的。IGF-1在多種組織，主要為肝臟中產(chǎn)生，并且通過自己的受體發(fā)揮作用，從而增強多種組織，包括骨、軟骨和骨骼肌的增殖和成熟。除了促進組織的生長，已經(jīng)證明GH還具有其它多種生物學功能，包括生乳作用、導致糖尿病作用、脂肪分解作用和蛋白合成作用，以及鈉和水的潴留。
整個兒童期都需要適量GH來維持正常的生長。GH缺乏的新生兒的身長和體重往往是正常的。某些人后天生長的速度很低并可能伴有陰莖小或禁食低血糖，結(jié)果隨著年齡的增長逐漸演變?yōu)橹钦稀Ｔ谀切┗加袉我恍陨L激素缺乏(IGHD)癥的人體中，骨骼的成熟通常隨著身高增加的遲緩而遲滯。通常出現(xiàn)身體肥胖、比實際年齡顯得年輕的面容和第二次出牙的延遲。在受影響的成年人當中可以見到類似于早衰中見到的皮膚變化。
家族性IGHD包括具有遺傳特征方式的幾種不同病癥。將已知與GH1基因座缺陷相關的IGHD類型以及至今為止發(fā)現(xiàn)的不同類型的基礎損傷列于表1當中。
表1與GH1基因有關的遺傳性疾病的分類
這些損傷的特性有助于對這些類型的IGHD在臨床嚴重程度、遺傳方式和應答于施用的外源GH而形成抗體的傾向方面所存在的差異做出解釋。大多數(shù)的病例是散發(fā)性的，并被推斷為是由大腦損傷引起的，所述大腦損傷包括大腦水腫、染色體異常、組織細胞增多癥、感染、輻射、隔-視覺發(fā)育異常(septo-optic dysplasia)、影響下丘腦或腦垂體的外傷或腫瘤。利用磁共振成像檢測法檢測出約12％的IGHD患者的下丘腦或腦垂體異常。
盡管身材矮小、延遲的“身高速度”或生長速度和延遲的骨骼成熟都被發(fā)現(xiàn)缺乏GH，但是這些患者中沒有一個人確定患有這種疾病，其它身體疾病可能導致這種癥狀。在本說明書的全文中，“身高速度”和生長速度都被解釋為受試者或患者身高的變化速率，諸如每年以厘米計的身高變化。
證實GH缺乏的刺激試驗采用了L-多巴、導致低血糖的胰島素、精氨酸、胰島素-精氨酸、氯壓定(clonidine)、胰高血糖素或普萘洛爾(propranolol)。每次試驗，不足的GH峰值應答不同(通常＜7-10ng/mL)。還應當對所伴發(fā)的LH、FSH、TSH和ACTH的缺乏進行檢測，從而確定垂體機能障礙的嚴重程度，以便制定最佳治療方案。
重組得到的GH已在世界范圍內(nèi)獲得并通過皮下注射來施用。為了獲得最佳結(jié)果，患有IGHD的兒童通常一得到確診就馬上開始替代治療。重組GH的最初使用劑量是基于體重和體表面積，但是精確的用量和用藥次數(shù)可以根據(jù)方案的不同來進行調(diào)整。在青春期，劑量隨著體重的增加而增加到最大用量。因此，當對個體的GH分泌能力重新估評時，應當暫時中斷治療。那些被證實是GH缺乏的人在成年期采用較低劑量的外源GH。
采用GH臺療的病癥包括(i)其中證明了其功效的病癥和(ii)其用途已被報道但未被公認為標準慣例的其它多種病癥。其中證明采用GH治療是有效的病癥包括GH缺乏，單一的或伴有垂體激素缺乏(CPHD)和特納綜合癥?；加蓄^兩種病癥的個體對GH替代治療產(chǎn)生的臨床反應的不同取決于(i)GH缺乏的嚴重程度及其對生長的副作用、開始治療的年齡、出生時的體重、目前體重和GH的使用劑量；和(ii)與所治療相關的缺乏諸如甲狀腺激素缺乏癥的識別和反應；和(iii)治療是否伴有抗-GH抗體的產(chǎn)生。對患有特納綜合癥的個體的治療結(jié)果隨著身材矮小的嚴重程度、染色體互補和開始治療的年齡的不同而不同。
其中已報道采用了GH的其它病癥包括治療某些骨骼發(fā)育異常如軟骨發(fā)育不全(achondroplasia)、普-威綜合癥(Prader-Willisyndrome)、針對外源類固醇繼發(fā)的或伴有慢性炎癥如類風濕性關節(jié)炎的生長抑制、慢性腎衰竭、嚴重的原發(fā)性身材矮小、Russell-Silver綜合癥和子宮內(nèi)生長遲緩。
家族性IGHD的分子遺傳水平特征是幾種病因中重要的一種。所涉及的基因座的識別不但能夠表明生長遲緩的可能的嚴重程度，而且更重要地是，還能夠表明現(xiàn)有各種治療方案的適用度等。而且，基礎基因損傷的檢測能夠證實病癥的遺傳病因。在判斷以下問題時還具有預測價值(i)生長遲緩的嚴重程度和(ii)采用GH治療后形成抗-GH抗體的可能性。在某些實例中，病理學損傷的知識還有助于解釋所述病癥的異常遺傳模式，因此對患病家族的咨詢是重要的。最終，引起表現(xiàn)為功能異常(與非-功能性截然不同)的IGHD病癥的突變損傷的性質(zhì)鑒定使得人們對GH結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了新的認識。
在細胞水平上，單個GH分子結(jié)合了兩個GH受體分子(GHR)，從而使它們二聚化。由GH結(jié)合的兩個GHR分子的二聚作用被認為是信號傳導所必需的，其還與酪氨酸激酶JAK2相關。胞內(nèi)酪氨酸激酶JAK2與GHR胞質(zhì)尾部結(jié)合。GH結(jié)合后，使兩個JAK2分子非常接近從而使得兩個分子之間和GHR胞質(zhì)尾部的酪氨酸殘基之間發(fā)生交叉磷酸化作用。這些磷酸酪氨酸作為細胞信號介導物諸如STAT 5的?？课稽c。然后與磷酸化受體尾部接合的STAT 5使其靠近JAK2，導致通過JAK2使其自身磷酸化。磷酸-STAT 5二聚化并被轉(zhuǎn)位到核，并在其中反式激活GH-應答基因，從而產(chǎn)生觀察到的GH的生物效應。直到最近還假設GH信號主要是通過JAK/STAT途徑介導的。然而，現(xiàn)在已經(jīng)明確GH還可以激活磷脂酰肌醇3′-激酶(PI3K)和由p42/44促細胞分裂原激活的蛋白質(zhì)激酶(MAPK)途徑。STAT 5和PI3K途徑的激活能夠誘導肝IGF-1的產(chǎn)生，而MAPK途徑似乎并不如此。
JAK 2和MAPK的激活取決于GHR胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中不同于參與STAT 5活化的那些區(qū)域的區(qū)域。STAT 5活化需要JAK 2-介導的酪氨酸的534、566和627殘基的磷酸化，所述三個殘基位于GH誘導的MAPK活化作用不需要的GHR的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的C-末端[Hansen等，J Biol Chem 27112669-12673(1996)]。相反，JAK 2和MAPK途徑的激活取決于富含脯氨酸(盒1)的46-氨基酸延伸區(qū)域，該區(qū)域臨近細胞膜[Sotiropoulos等，Endocrinology(內(nèi)分泌學)1351292-1298(1994)]。繼GHR活化后的MAPK活化過程似乎很復雜，包括多個機制。這些機制之一由Shc-Grb2-Sos-Ras途徑的JAK 2-依賴性激活來介導[VanderKuur等，Biol Chem2707587-7593(1995)；VanderKuur等，Endocrinology(內(nèi)分泌學)1384301-4307(1997)]，所述途徑可能涉及多個?？康鞍兹鏘RS-1[Liang等，Endocrinology1413328-3336(2000)]、Gab-1[Kim等，Endocrinology1434856-4867(2000)]和EGF受體[Yamauchi等，Nature39091-96(1997)]。通過Ral和磷酸酶D的Src-依賴性活化而進行的MAPK活化的另一個JAK 2-依賴性機制最近得到了報道[Zhu等，J Biol Chem27745592-45603(2002)]。盡管Src活化單獨足以部分激活MAPK，但是通過GH的MAPK全活化需要JAK 2和Src二者的活化[Zhu等，J Biol Chem27745592-45603(2002)]。
已經(jīng)表明GH的不用作用可以由單一類型的GHR分子介導，不同組織中GHR分子具有不同的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或磷酸化位點。當被JAK2激活時，這些不同的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域可以產(chǎn)生不同的磷酸化途徑，其中一種途徑具有生長效應，其它途徑具有不同的新陳代謝效應。
GH是由前腦垂體的促生長細胞分泌的分子量為22kDa的蛋白質(zhì)。X-射線晶體學研究證明了GH含有以頭對頭-尾對尾的方式排列的兩對平行α螺旋的核心。該結(jié)構(gòu)靠兩個分子內(nèi)二硫鍵來穩(wěn)定(Cys53-Cys165和Cys182-Cys189)。兩個生長激素受體(GHR)分子與GH分子上的兩個結(jié)構(gòu)不同的位點結(jié)合，該過程是按照GHR首先與位點1結(jié)合然后再與位點2結(jié)合的順序進行。GHR與GH的結(jié)合增強了GHR分子的二聚化作用。
GH分子的掃描誘變研究提供了GH與其受體間的結(jié)合相互作用的圖象，同時定點突變被用來檢測特定殘基的功能。因此，Gly120(在人GH的第三個α螺旋中)被Arg所取代的結(jié)果是GHR未能與位點2結(jié)合因而阻斷了GHR的二聚化作用。類似地是，人GH蛋白質(zhì)的殘基Phe44對與催乳素受體進行結(jié)合起著重要作用。最后證明了殘基Asp115，Gly119，Ala122和Leu123對于小鼠GH分子的增強生長的潛力非常關鍵。
二聚化的GHR與分子內(nèi)酪氨酸蛋白激酶JAK2的相互作用導致下游信號轉(zhuǎn)導分子的酪氨酸磷酸化、促細胞分裂原-激活蛋白(MAP)激酶的刺激和信號轉(zhuǎn)導物和轉(zhuǎn)錄激活劑(STAT蛋白)的誘導。以這種方式，GH通過多個不同的信號途徑能夠影響多個基因的表達。
幾種不同的GH同種型(isoform)是由GH1基因(GH1的參考序列如圖4所示)表達產(chǎn)生的。在9％的GH1轉(zhuǎn)錄物中，外顯子2被剪接到外顯子3的45bp的另一受體剪接位點，因而缺失了32至46位氨基酸殘基，并產(chǎn)生一種代替正常22kDa蛋白質(zhì)的20kDa的同種型。該20kDa的同種型似乎能夠刺激生長和分化。決定其它受體剪接位點選擇性所涉及的因素還未被定性，但是其非常明顯具有復雜的特性。在垂體腫瘤組織中已檢測到一種痕量的由缺失了外顯子3編碼的32至71位密碼子產(chǎn)生的17.5kDa的同種型。據(jù)報道垂體組織中存在著缺少外顯子3和4或外顯子2、3和4的剪接產(chǎn)物，但是這些似乎編碼非活性的蛋白產(chǎn)物。GH的一種24kDa糖基化變體已有記載。22kDa的主要同種型的氨基酸序列如圖5所示，其中顯示了GH1基因編碼區(qū)域的核苷酸序列和含有26個氨基酸前導肽的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。側(cè)面的數(shù)字是指氨基酸殘基的編號。側(cè)面粗體垂直箭頭上的數(shù)字指明了外顯子的邊界。末端密碼子以星號標記。
編碼垂體生長激素(GH1)的基因位于染色體17q23上五個相關基因簇中(

圖1)。該66.5kb基因簇已被完全測序[Chen等，Genomics4479-497(1989)以及參見圖4]。存在于生長基因簇中的其它基因座是兩個絨毛膜生長催乳激素基因(CSH1和CSH2)、一個絨毛膜生長催乳激素假基因(CSHP1)和一個生長激素基因(GH2)。這些基因被長度為6至13kb的基因間區(qū)隔開，處于相同的轉(zhuǎn)錄方向，在胎盤中表達，并受控于下游組織特異性增強子。GH2基因座編碼與由GH1來源的生長激素具有13個氨基酸差別的蛋白質(zhì)。全部五個基因共有非常類似的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有被短的內(nèi)含子在相同位置間斷的五個外顯子，在GH1中分別為長度為260bp、209bp、92bp和253bp(圖2)。
GH1基因的外顯子1含有60bp的5′-非翻譯序列(盡管其它轉(zhuǎn)錄起始位點位于-54)、密碼子-26至-24和對應于26個氨基酸的前導序列的起點的密碼子-23的頭一個核苷酸。外顯子2編碼前導肽的其余部分和成熟GH的頭31個氨基酸。外顯子3-5分別編碼32-71、72-126和127-191位氨基酸。外顯子5還編碼最后位于多腺苷酸化位點的112bp的3′-非翻譯序列。在GH1多腺苷酸化位點3′100bp處存在一個Alu重復序列元件。盡管所述五個相關基因在整個5′側(cè)翼區(qū)域和編碼區(qū)域是高度同源的，但是它們在3′側(cè)翼區(qū)域則是不同的。
對GH1基因進行了大量的調(diào)查研究，結(jié)果在人GH1基因啟動子/五個非翻譯區(qū)域的5′端中鑒定出相同的已知多態(tài)性，并且在我們的共同懸而未決的專利申請WO03/042245中進行了詳細記載。另外，其它調(diào)查研究已經(jīng)證明了GH1基因中的總體缺失、GH1基因中的微小缺失和單個堿基對取代。GH1基因的所有這些變體被記載在我們的共同懸而未決的專利申請WO03/042245中，因此技術讀者參照該專利可以得到更多的有關存在的GH1變體性質(zhì)的背景信息。
由于至今記載的家族性GH缺乏的大多數(shù)病例被以常染色體隱性特性遺傳下來，該遺傳性缺乏情形的某些實例一直未被認知似乎是由于家族規(guī)模小的原因。類似地，可能將由GH1基因發(fā)生多個突變(de novomutations)引起的GH缺乏的病例分為散發(fā)性，而且對這種病癥的遺傳學解釋既沒有引起人們的興趣也沒有進行探討。最后，根據(jù)用于定義缺乏狀態(tài)的標準，可能GH缺乏表型和基因型圖譜的整個寬泛程度從未引起臨床上的關注。由于這些原因，目前對GH缺乏流行的估測可能并不準確，因而嚴重低估了在人群中的真實流行程度。
因此我們對GH1基因進行了進一步的調(diào)查研究。我們的調(diào)查研究結(jié)果是鑒定出了新型且意義重大的變體，該變體與GH的診斷和治療密切相關。我們認為所述新型變體的確定表明由于目前依賴于基于放射-免疫測定的GH“功能測試”，因而對GH缺乏的診斷不足。而且表明急需研發(fā)一種真正的功能性診斷方法。
因此本發(fā)明提供了生長激素核酸分子GH1的分離的變體，該變體含有以下取代+1491C→G，其中1491指的是相對于被指定為1的轉(zhuǎn)錄起始位點的核苷酸位點。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了分離的生長激素核酸分子GH1的變體，該變體含有編碼含有Ile179Met取代的蛋白質(zhì)即GH蛋白的核酸分子。
具體地是，本發(fā)明提供了如上定義的核酸序列，其中所述序列是DNA或RNA序列，諸如cDNA或mRNA。
因此本發(fā)明還提供了變體GH1的轉(zhuǎn)錄物，如含有所述GH1變體所編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(下文稱作‘GH變體’)。
因此本發(fā)明的另一個方面提供了分離的多肽，該多肽是生長激素蛋白GH的變體，而且含有Ile179Met取代。
出乎意料的是，我們的研究已經(jīng)證明我們已經(jīng)鑒定出了一種變體GH，其獨特地差異地激活受體-介導的細胞信號途徑。其不僅是一種以這種獨特方式發(fā)揮作用的激動劑，而且在檢測和治療生長激素缺乏方面還是極其重要的。這意味著鑒定生長激素缺乏的試驗應該集中在循環(huán)(或內(nèi)源性)生長激素激活一種以上的受體-介導的細胞信號途徑的能力上。我們的調(diào)查研究詳細揭示了循環(huán)生長激素的完全功效以及相應的任何生長激素缺乏的性質(zhì)或鑒定。
因此可以看出，沒有集中在上述變體鑒別或受體-介導的細胞信號途徑的差異活化上面的生長激素缺乏的研究，鑒別不出循環(huán)生長激素活性的潛在缺乏，并因此鑒別不出生長激素缺乏。
因此，本發(fā)明提供了篩選懷疑具有功能障礙的GH的個體的篩選方法，該篩選方法包括步驟(a)從個體獲得含有人GH1基因的核酸分子的試驗樣品；(b)對所述分子測序；(c)檢測所述序列中的+1491C→G的取代；和(d)如果所述取代存在則斷定存在GH功能障礙。
優(yōu)選地，所述試驗樣品含有可以通過常規(guī)法提取的基因組DNA。
在本發(fā)明的篩選方法中，所述測序步驟可采取常規(guī)方式來進行，例如通過PCR對GH1基因的適當區(qū)域進行測序。
因此，本發(fā)明還提供了篩選懷疑具有功能障礙的GH的個體的篩選方法，該篩選方法包括步驟
(a)自所述個體獲得含有生長激素GH多肽的試驗樣品；(b)對所述多肽進行測序；(c)檢測所述序列中的Ile179Met取代；和(d)如果所述取代存在則斷定存在GH功能障礙。
上述篩選方法包括能夠臨床實施的且為功能性GH缺乏提供早期診斷的單一血液檢驗。這種早期診斷意味著能夠盡早開始GH治療，從而降低GH功能障礙的任何有害影響。
因此，本發(fā)明進一步提供了適于用來實施本發(fā)明的篩選方法的試劑盒，該試劑盒含有(a)具有對應于GH1基因的+1491區(qū)域的核酸序列的寡核苷酸，所述區(qū)域含+1491C→G取代；和(b)具有對應于(a)中所指區(qū)域中的野生型序列的核酸序列的寡核苷酸；和任選地(c)一種或多種適于實施PCR的試劑以便擴增患者DNA的目的區(qū)域。
這些試劑可包括，例如，對應于含有核苷酸+1491的GH1基因的外顯子的PCR引物和/或本文所定義的引物；和/或用于PCR的其它試劑，諸如Taq DNA聚合酶。
優(yōu)選地，所述試劑盒中的引物或寡核苷酸含有20至25個堿基對，諸如針對變異序列的20個堿基對和針對野生型的20個堿基對。在任何情況下，對寡核苷酸必須進行選擇以便其針對所選區(qū)域是唯一的，并且在基因組中的其它位置上不重復出現(xiàn)。
也可以使用其它核苷酸的檢測方法，諸如納米技術中采用的信號擴增方法(諸如Q-Dots)。而且，還可以采用單分子檢測方法(諸如STM)。在這種情況下，本發(fā)明的試劑盒可以含有一種或多種適用于這種選擇方法的試劑。
或者，本發(fā)明的所述篩選方法和相應的試劑盒可以基于一種或多種所謂的“替代標記物(surrogate marker)”，所述“替代標記物”是GH1變體或GH變體是否存在的指示，或者與GH1變體或GH變體的存在與否有關聯(lián)，所述“替代標記物”諸如是蛋白質(zhì)/氨基酸序列，如特異于GH變體或GH1的變體的抗體。這種所述“替代標記物”可含有(a)任何生物分子(包括但不限于核苷酸、蛋白質(zhì)、糖類和脂類)；(b)化合物(包括但不限于藥物及其代謝物和其它化合物)；和/或(c)物理特征，其在個體中存在與否或存在量是可測的，并且與本發(fā)明的GH變體或GH1的變體的存在有關系。
而且，本發(fā)明可選擇的合適篩選方法可進一步包括獲得含GH變體(即含有hGH的Ile179Met變異的蛋白質(zhì)/多肽序列)的試驗樣品，該GH變體通過常規(guī)的蛋白質(zhì)測序法(包括質(zhì)譜、微陣列分析、熱測序法等)和/或基于抗體的檢測方法(例ELISA)以及進行這種蛋白測序法中的一種或多種方法可鑒定的。
在可選的情況下，本發(fā)明的試劑盒可以含有用于這種可選方法的一種或多種試劑。
本發(fā)明的另一方面還提供了含Ile179Met取代的而且進一步為受體-介導的細胞信號途徑提供了差異激活的分離的生長激素多肽或蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述分離的多肽或蛋白質(zhì)變體激活STAT5途徑，但顯示對MAPK途徑的激活降低。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述MAPK途徑的活性的降低為低于野生型GH蛋白質(zhì)活性的70％。而且更優(yōu)選地，低于50％以及更特別地低于45％或更低。
本發(fā)明的另一方面還提供了分離的生長激素蛋白，該蛋白的特征是在螺旋4的C一端部分中具有氨基酸取代。更優(yōu)選地，所述取代發(fā)生在或臨近于針對GHR殘基Trp169或Trp104的結(jié)合位點上。
本發(fā)明的另一方面還提供了特征在于具有降低的激活MAPK途徑的能力的分離的生長激素多肽或蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述MAPK途徑是ERK途徑。
本發(fā)明的另一個方面提供了篩選懷疑具有功能障礙的GH的個體的篩選方法，該篩選方法包括步驟(a)自所述個體獲得試驗樣品，該樣品包括所述個體的內(nèi)源性生長激素；(b)檢測所述生長激素以確定其是否激活受體介導的MAPK細胞信號途徑和激活到什么程度；和(c)如果與野生型GH相比，MAPK細胞信號降低了，則斷定存在GH功能障礙。
本發(fā)明的另一個方面提供了上述GH1(核酸)變體或GH(多肽/蛋白質(zhì))變體用于診斷生長激素功能障礙或研發(fā)合適GH治療劑的用途。
本發(fā)明的另一個方面提供了特異于本發(fā)明的分離的生長激素多肽或蛋白質(zhì)的抗體。
本發(fā)明還提供了含本發(fā)明的GH1或GH變體以及藥學可接受載體的組合物。
而且，本發(fā)明提供了(a)含本發(fā)明的核酸分子的載體；(b)含所述載體(a)的宿主細胞，如細菌宿主細胞；和(c)用于制備本發(fā)明的GH變體的方法，該方法包括(i)培養(yǎng)所述宿主細胞(b)；和(ii)從所述培養(yǎng)基中回收由此制備的GH變體。
(d)如上所述由序列、載體或細胞編碼或表達的存在于所述培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)或氨基酸序列。
現(xiàn)在參照以下實施例來闡明本發(fā)明。
圖1表示在17q23染色體上的GH1基因的位置，涉及四個平行進化同源基因即CSHP1，CSH1，GH2和CSH2；圖2是詳細描述GH1基因，顯示了內(nèi)含子、外顯子、非翻譯區(qū)域、信號肽、編碼區(qū)和聚腺苷酸尾的圖解；圖3表示GH1的啟動子和與之相關的高水平的序列多態(tài)性；圖4表示GH1基因的參考核酸序列結(jié)構(gòu)；圖5表示GH1基因的核酸編碼序列和相應的多肽序列；
圖6是對生長激素蛋白與相應受體相互作用的分子模建圖解。該圖表示GH殘基Ile179側(cè)鏈與GHR殘基Trp169之間的緊密聯(lián)系。Ile179殘基通過空間填充模型來表示。Trp169由棒模型表示，其中GHR殘基167-169分子表面以綠色表示；圖7表示ERK和STAT 5激活的時間過程。所示數(shù)據(jù)是采用磷-特異性ERK和STAT 5抗體探測的Western印跡，表明依賴于時間的ERK(A)和STAT 5(B)的激活過程。ERK印跡表示上面較弱的帶對應于ERK 1以及下面較深的帶對應于ERK 2。印跡通過圖像光密度測定法來分析，而且數(shù)據(jù)(整合的密度值IDV)針對全部的ERK或STAT 5被標準化，并且相對GH處理時間(C)作圖，結(jié)果表明經(jīng)GH處理后的ERK激活(陰影柱形圖)在10分鐘時達到峰值，以及STAT 5(實心柱形圖)在5-10分鐘時達到峰值；圖8表示野生型(Wt，A，d)和Ile179Met GH(Met，B，E)對ERK(A-C)和STAT 5(D-F)劑量依賴的(0.5-20nM)的激活過程的Western印跡分析。印跡通過圖像光密度測定法來分析，而且數(shù)據(jù)(整合的密度值IDV)針對全部的ERK或STAT 5被標準化，結(jié)果表明在所有的被研究劑量，GH變體(陰影柱型圖)與野生型GH(實心柱形圖)相比對ERK(C)的激活降低了，這與變體(陰影柱型圖)與野生型GH(實心柱形圖)對STAT 5(F)的類似激活相反；和圖9表示野生型(三角形)和Ile179Me t變體GH的GHR的結(jié)合特性。數(shù)據(jù)表示為被特定125I-標記的GH在0.1-20nM劑量范圍內(nèi)被未標記的野生型和變體GH所取代的量(％B/Bo)。每個點是四個獨立實驗的平均值±SEM。
實施例1-患者的選擇-安達盧西亞(Andalucia)/巴塞羅那(Barcelona)研究在西班牙的安達盧西亞建立一支不同的患者組?；贔SS的分類選中了74個青春期前的兒童，即他們表現(xiàn)出家族性的身材矮小，在Hormone Research45[(增刊2)64-66(1996)]中由Ranke所定義。這些患者具有至少一個遺傳性身材矮小家族成員。研究中的所有兒童的身高偏差評分(height deviation score)(SDS)為總?cè)丝谄骄抵?2SDS。經(jīng)過藥理學刺激實驗后的所有受試者均顯示正常的GH分泌(峰值GH≥10ng/mL)。所采用的藥理學試驗采用的是氯壓定(34例)，普萘洛爾(25例)和胰島素(15例)。每個參加中心和多地區(qū)道德委員會對遺傳學的研究給予了許可。參與個體也都簽署了同意意見。
針對身高、體重指數(shù)、父母身高、中值父母身高(mid-parentalheight)、IGF-1和IGFBP-3的水平、以ng/mL計的峰值GH分泌和GHBP(以百分數(shù)表示)計算了標準差分值。針對其中發(fā)現(xiàn)了新的GH1基因損傷的兩個個體(B4和B49)的這些數(shù)據(jù)和針對被研究的個體組的組平均值被示于表2。
表2與組平均值比較的具有新型GH1突變的個體的生長參數(shù)和試驗室研究
*全部生長學數(shù)據(jù)獲自該年齡實施例2-GH1-特異性片段的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增對按照實施例1選擇的患者和對照進行3.2kb GH1-特異性片段的PCR擴增。利用常規(guī)方法從患者的淋巴細胞中提取基因組DNA。
相應于GH1特異序列設計寡核苷酸引物GH1F(5′GGGAGCCCCAGCAATGC3′；-615至-599)和GH1R(5′TGTAGGAAGTCTGGGGTGC 3′；+2598至+2616)以利用ExpandTM高保真系統(tǒng)(Roche)PCR擴增含人GH1基因的3.2kb的單一基因組DNA片段。
將兩支獨立的薄壁的0.65ml PCR管用于每個反應。第一支管裝有500納克(ng)的每種引物(GH1F和GH1R)、200μM dATP、dTTP、dCTP和dGTP和200ng的患者基因組DNA，用無菌水將終體積調(diào)節(jié)到25μl。第二支管裝有5μl 10x反應緩沖液，用無菌水將終體積調(diào)節(jié)到24.25μl。兩支管放置在冰上5分鐘。然后，將0.75μl的ExpandTM聚合酶混合物加到第二支管中，將內(nèi)容物混合后轉(zhuǎn)移到第一支管中。將該管離心30秒鐘并用30μl輕礦物油(Sigma)覆蓋在反應混合物上。然后將該反應混合物放置在被設置成95℃的480或9700PCR編程式熱循環(huán)儀(PerkinElmer)中。
然后在下述條件下對所述反應混合物進行擴增95℃保持2分鐘后進行30個循環(huán)的95℃ 30秒鐘、58℃ 30秒鐘以及68℃ 2分鐘。在最后20個循環(huán)中，每個循環(huán)的68℃的延伸步驟被延長5秒鐘。然后進一步在68℃下溫育7分鐘，接著在進行分析前將反應物冷卻到4℃。針對每套反應物，還要設置空白對照(陰性對照)。除了不含基因組DNA外，空白反應物含所有的試劑，并被用來確保所有的試劑不被污染。
在進行嵌套PCR前，取十分之一的體積(5μl)在1.5％的瓊脂凝膠上進行分析，檢測PCR擴增是否成功。然后將已經(jīng)成功進行了PCR-擴增的這些樣品稀釋100倍進行嵌套PCR。
另外，在我們的研究中，用于測序的另外的反向引物是GHBFR(5′TGGGTGCCCTCTGGCC3′；-262至-278)，GHSEQ1R(5′AGATTGGCCAAATACTGG3′；+215至+198)，GHSEQ2R(5′GGAATAGACTCTGAGAAAC3′；+785至+767)，GHSEQ3R(5′TCCCTTTCTCATTCATTC3′；+1281至+1264)，GHSEQ4R(5′CCCGAATAGACCCCGC3′；+1745至+1730)[以轉(zhuǎn)錄起始位點作為+1來編號；GenBank序號J03071]。將含序列變體的樣品克隆到pGEM-T(Promega，Madison WI)中，然后針對每一個體的至少四個克隆進行測序。
實施例3-嵌套PCR在每種情況下對實施例2中制備的片段進行嵌套PCR，產(chǎn)生7個重疊的亞片段，這7個亞片段一起覆蓋了完整的GH1基因。另外，PCR擴增除了三個患者之外的所有患者的基因座控制區(qū)域(參見實施例5)。
利用Taq Gold DNA聚合酶(Perkin-Elmer)PCR-擴增起始的3.2kbPCR產(chǎn)物的7個重疊的亞片段。用于這些反應的寡核苷酸及其由GH1基因參考序列測定出的序列位置列于表6。
將經(jīng)稀釋的長(3.2kb)PCR產(chǎn)物的1μl等分樣品加到0.2ml的薄壁PCR管或96孔微滴板的一個孔中。再加入5μl的10x反應緩沖液，500ng的合適引物對(例如GH1DF和GH1DR)，終濃度達到200μM的dATP，dTTP，dCTP和dGTP，加無菌水至體積49.8μl，接著加入0.2μl Taq Gold聚合酶。
然后將所述管或微滴板放置在Primus 96熱循環(huán)儀(MWG Biotech)中，并按照以下條件循環(huán)95℃保持12分鐘接著共進行32個循環(huán)的95℃ 30秒鐘、58℃ 30秒鐘和72℃ 2分鐘。然后進一步在72℃下溫育10分鐘，接著將反應物冷卻到4℃進行分析。
取十分之一體積(5μl)的反應混合物在0.8％瓊脂糖凝膠上進行分析以確定在利用WAVETMDNA片段分析系統(tǒng)(Transgenomic Inc.Crewe，Cheshire，UK)進行變性高壓液相層析(DHPLC)前所述反應物是否有效。為了增加異源雙鏈的形成，在95℃下將PCR產(chǎn)物變性5分鐘，接著逐漸重退火45分鐘至50℃。將產(chǎn)物加載到DNAsep柱(Transgenomic Inc.)上，并在0.1M三乙胺醋酸酯緩沖液(TEAA pH 7.0)中用2％/分鐘的線性乙腈(BDH Merck)梯度以0.9ml/分鐘的恒定流速進行洗脫。梯度的起點和終點根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小來調(diào)節(jié)。每個擴增樣品的分析需要6.5-8.5分鐘，其中包括柱再生和平衡的時間。在利用DHPLCMelt軟件(http//insertion.stanford.edu/melt.html)確定的熔點溫度(TM)下對樣品進行分析，并將結(jié)果列于表3中。利用UV-C檢測器(Transgenomic Inc.)檢測被洗脫的DNA片段。
表3用于DHPLC分析和DNA測序的寡核苷酸引物
從對于根據(jù)上述實施例1A所選患者獲得的樣品，進行以下過程(實施例4 & 5)實施例4-GH1-特異性長PCR片段的DNA測序在Primus 96(MWG)或9700(Perkin Elmer)PCR熱循環(huán)儀中的0.2ml管或96-孔微滴板中利用BigDye(RTM)測序試劑盒(Perkin Elmer)對含GH1-特異性長PCR片段的克隆進行測序。用于測序的寡核苷酸引物是GH1S1(5′GTGGTCAGTGTTGGAACTGC3′-556至-537)；GH3DF(5′CATGTAAGCCAAGTATTTGGCC3′+189至+210)；GH4DF(5′GACTTTCCCCCGCTGTAAATAAG3′+541至+560)；和GH6DF(5′TCCCCAATCCTGGAGCCCCACTGA3′+1099和+1122)。
利用3.2pmol的合適引物和4μl BigDye測序混合物以20μl的終體積對1μg被克隆的DNA進行測序。然后將所述管或微滴板放置在熱循環(huán)儀中并按照以下方式進行循環(huán)96℃保持2分鐘，接著將96℃保持30秒鐘、50℃保持15秒鐘和60℃保持4分鐘循環(huán)30次。然后在純化前將反應物冷卻到4℃。
通過向完成的測序反應中加入80μl的75％異丙醇進行純化。然后進行混合并在室溫下保持30分鐘。然后在室溫下以14000rpm將所述反應物進行離心20分鐘。然后去除上清液并向沉淀中加入250μl的75％異丙醇。將樣品進行混合并在室溫下以14000rpm離心5分鐘。去除上清液并在75℃下將沉淀干燥2分鐘。
然后利用ABI Prism 377或3100(Applied Biosystems)DNA測序儀分析樣品。
實施例5-GH1基因突變和多態(tài)性對來自巴塞羅那的74名家族性身材矮小的患者進行序列分析發(fā)現(xiàn)了三個具有潛在病理學意義的突變-360A→G(患者B4)，+1029位點的GTC→ATC(Val 110→Ile)(患者B53；該變異也被記載在共同申請的待審專利申請PCT/GB01/2126中)和+1491位點的ATC→ATG(Ile179→Met)(患者49)。參見表4。
由于在對照樣品中發(fā)現(xiàn)了四個Ile110等位基因(0.025的頻率)，這種變異以多態(tài)頻率發(fā)生在一般人群當中。分子模建表明該取代對GH的結(jié)構(gòu)可能具有損害作用；進化保守的Val110殘基在螺旋3的N-末端形成疏水核的一部分，其被具有較長側(cè)鏈Ile所取代預計將產(chǎn)生空間位阻。與該預測一致，Ile110變體具有大大降低的(正常的40％)激活JAK/STAT信號傳導途徑的能力。因此Val110→Ile的取代表現(xiàn)出與GH活性降低相關的功能多態(tài)性，而且其可能影響身高。該變異與啟動子單倍型(haplotype)2有關，其具有非常正常的活性。
關于Ile179Met變異Ile179位于螺旋結(jié)構(gòu)4中的hGH蛋白的表面。在hGHbp/hGH 2∶1復合體中，Ile179直接與位點1的‘熱點(hot-spot)’殘基TRP104和TRP169發(fā)生作用。因此可能Ile179被蛋氨酸殘基所取代會干擾位點1的精確立體結(jié)構(gòu)，因而影響信號傳導，導致hGH的功能發(fā)生重大改變。
(c)對照中的GH1編碼序列變異的研究還利用實施例2和3中的方法對總共80個白種(Caucasian origin)健康英國人的GH1基因的編碼區(qū)域進行了篩選以便尋找變體。在單個個體中發(fā)現(xiàn)了五個沉默取代[Asp26位點的GAC→GAT，Ser85位點的TCG→TCC，Ser85位點的TCG→TCA，Thr123位點的ACG→ACA和Asn109位點的AAC→AAT。Thr123多態(tài)性變體之前已被報道過(Counts等，Endocr Genet255-60(2001))。
另外，還發(fā)現(xiàn)了三個錯義取代[ACC→ATC，Thr27→Ile；AAC→GAC，Asn47→Asp；GTC→ATC，Val110→Ile，分別為1，1和4等位基因/160等位基因]；在我們的共同申請的待審專利申請PCT/GB01/2126(患者66)中公開的患者研究中只發(fā)現(xiàn)了Val10→Ile取代。分子模建表明這種取代對GH結(jié)構(gòu)可能會產(chǎn)生不利影響；在螺旋3的N-末端Val110形成了疏水核的一部分，其被較長側(cè)鏈Ile取代后將產(chǎn)生空間位阻。因此不管對照還是患者人群中發(fā)生Val110→Ile取代都影響身高。其它解釋如上述實施例5(b)所述。盡管如此，在對照人群中較少的錯義突變卻證明了患者組中發(fā)現(xiàn)的損傷的病理學意義。
實施例6 Ile 179 Met變體的生物學活性經(jīng)全長人GH受體(GHR)轉(zhuǎn)染且根據(jù)提高的GHR表達水平篩選出來的細胞HK293細胞(HK293Hi細胞)被用來測定GH變體的生物活性[Ross等，Mol Endocrinol11265-73(1997)；von Laue等，J Endocrinol165301-311(2000)]。將細胞鋪板到24孔板(每孔100000個細胞)中，在含10％FCS的DMEMF-12(1∶1)中保持24小時。利用基于脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染試劑(FuGENE 6，Roche Molecular Biochemicals)以及STAT5-反應性螢光素酶報道基因構(gòu)建體[Ross等，同前，von Laue等，同前]和用以調(diào)整轉(zhuǎn)染效率的組成型表達的β-半乳糖苷酶的表達載體(pCH110；Amersham Pharmacia Biotech)過夜共轉(zhuǎn)染細胞。然后將細胞與用含2.5×10-7M地塞米松的無血清DMEMF-12(1∶1)稀釋到已知常規(guī)濃度范圍(0.1-10nM)內(nèi)的變體和野生型GH一起溫育6小時以使GHR進行二聚化、STAT5活化且螢光素酶表達。溫育后，對細胞進行裂解，并利用Promega螢光素酶分析系統(tǒng)在微板發(fā)光計(Applied Biosystems)中測定螢光素酶。因此螢光素酶的表達提供了GHR活性的測量，因而也提供了GH變體的生物活性的測量。以一式四份的形式進行實驗，并至少重復3次。通過方差分析(ANOVA)并利用Student-NewmanKeuls多重比較檢驗進行比較來對螢光素酶分析數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
實施例7-哺乳細胞的GH分泌研究將大鼠垂體(GC)細胞系用含有包括了野生型GH1完整基因的3.2kb片段的pGEM-T質(zhì)粒(受控于單倍型1啟動子)和受控于其相關單倍型的錯義變體的等價構(gòu)建體進行轉(zhuǎn)染。將細胞鋪板到24-孔板(每孔200000個細胞)中，并在含15％馬血清和2.5％FCS的DMEM(完全培養(yǎng)基)中培養(yǎng)過夜。利用基于脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染試劑Tfx-20(Promega)將細胞用500ng GH1質(zhì)粒和β-半乳糖苷酶表達載體(pCH110；Amer sham Pharmacia Biotech)進行共轉(zhuǎn)染。在每孔含1μl Tfx-20的200μl無血清培養(yǎng)基中進行1小時的轉(zhuǎn)染，然后向每孔中加入0.5ml的完全培養(yǎng)基。將細胞培養(yǎng)48小時，回收培養(yǎng)基并裂解細胞以便進行β-半乳糖苷酶分析，以校正轉(zhuǎn)染效率的差異。利用與大鼠GH不發(fā)生交叉反應的人GH IRMA(NicholsInstitute Diagnostics)定量分析培養(yǎng)基中的GH的變體。如生物活性試驗所述進行實驗和數(shù)據(jù)分析。
實施例8-錯義變體的功能性特征通過取代人GH的X-射線結(jié)晶結(jié)構(gòu)中的合適氨基酸殘基來模建(model)成熟蛋白中的錯義突變。
分子模建(Molecular modelling)通過檢測人GH的X-射線結(jié)晶結(jié)構(gòu)中的合適氨基酸殘基來對Ile179Met變體進行結(jié)構(gòu)分析(PDB3HHR)[19]。比較野生型和突變型GH結(jié)構(gòu)的靜電作用、氫鍵、疏水性作用和表面暴露。利用ICM分子模建軟件包(Molsoft LLC，San Diego，CA)繪制分子圖(圖6)。
實施例9-GH變體的蛋白水解消化將胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或蛋白酶K(全部得自Sigma，Poole，UK)加到由表達野生型GH或Ile179Met變體(60nM)的昆蟲細胞回收到的100μl培養(yǎng)基中以使終濃度達到0.1μg/ml，然后在37℃下溫育1小時。之前對野生型GH的劑量-依賴性研究表明0.1μg/ml是由所有三種酶啟動降解反應的濃度。處理1小時后，加入10μl胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制劑(500μg/ml)來終止胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化作用，加入1μl PMSF(0.1M)來終止蛋白酶K的消化作用。然后將每個反應再在37℃下溫育15分鐘。利用微型凝膠裝置(Bio-Rad Laboratories)在12％的凝膠上進行SDS-PAGE來對樣品進行分析。也對在37℃下溫育了1小時的未被消化的等量野生型GH和Ile179Me t變體進行跑膠。如以前所述[Lewis等，J Neuroendrocinol14361-367(2002)]將凝膠電印跡到PVDF膜上，用小鼠單克隆抗人GH抗體(Lab Vision，F(xiàn)remont，CA，USA)進行探測，稀釋1∶500倍，利用抗小鼠IgG-HRP綴合物(1∶5000，Amersham Biosciences)進行檢測，通過增強化學發(fā)光進行顯色(ECLPlus，Amersham Biosciences)。利用Alpha Imager 1200數(shù)字顯象系統(tǒng)(Alpa Innotech Corp，San Leandro，CA，USA)對膜(film)進行分析，并將結(jié)果表示為酶降解后的GH殘余量占未消化GH的百分率。將實驗重復3次并通過雙尾t-試驗進行統(tǒng)計學評估。
實施例10-MAP激酶途徑的活化通過用野生型GH和Ile179Met變體刺激3T3-F442A脂肪原細胞研究Ile179Met變體激活MAP激酶信號轉(zhuǎn)導途徑至與野生型GH相同程度的能力。將細胞(250000)鋪板到10cm的培養(yǎng)皿中，并在實驗前利用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)三天。用PBS洗所述平板，并以無血清DMEM中溫育進行兩次連續(xù)2小時沖洗期。在第二次沖洗結(jié)束時將GH直接挑到(spiked)無血清DMEM中，并將細胞培養(yǎng)適當?shù)臅r間。然后除去培養(yǎng)基，并用含1mM原釩酸鈉的冰冷的PBS沖洗細胞，用含1mM原釩酸鹽和1mM PMSF的0.5ml Laemmli緩沖液進行裂解，并按照上文所述利用10％凝膠通過SDS-PAGE進行分析。將凝膠印跡到PVDF膜上，并利用抗體進行探測，所述抗體檢測在Thr202/Tyr204殘基磷酸化的活化(磷酸化的)形式的p42/p44MAP激酶(Cell Signaling Technology)以及在Tyr694/Tyr699殘基磷酸化的STAT 5(Upstate Biotechnology)。進行印跡、利用ECL Plus(Amersham)進行觀測，并按照上文所述進行圖像分析。為了確保泳道間加載的蛋白量相同，剝下印跡并利用識別完整MAPK或STAT 5(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)的抗體進行再探測。磷-特異性和完整的STAT 5抗體與STAT 5a和5b具有相同的交叉反應。根據(jù)采用的初級抗體，第二抗體是抗小鼠或是抗兔IgG-HRP綴合物(1∶5000，Amersham Biosciences)。按照上述方法通過圖像光密度測定法對膜進行分析。磷-MAP和磷-STAT 5的結(jié)果參照同一樣品中的完整MAP或STAT5進行標準化。
還進行了確定MAPK和STAT 5被我們的實驗模型中的野生型GH激活的時間歷程的初步的研究。由GH激活STAT 5是快速的，高峰出現(xiàn)在5-10分鐘，接著逐漸下降，而MAPK的激活高峰在10分鐘，接著飛快下降，經(jīng)過60分鐘返回到活化基礎水平(圖7)。因此選擇10分鐘GH的處理時間來進行下面的研究，因為這是MAPK的最大激活時間，而且是處于STAT 5的最大激活的平臺期。采用一定濃度范圍的野生型GH和變異GH(0.5-2.0nM)將細胞處理10分鐘并分析MAPK和STAT 5的活化(圖8)。
實施例11-Ile179Met變體的功能性特征通過源自19個脊椎動物的直向同源GH蛋白的ClustalW多序列比對檢測了疏水性殘基Ile179的進化保守性[Krawczak等Gene237143-151(1999)]。
實施例12-受體結(jié)合研究利用被全長人GHR轉(zhuǎn)染的且基于提高的GHR表達篩選的HK293hi細胞(HK293hi細胞)進行受體結(jié)合研究[Ross等，Mol Endocrinol11265-273(1997)；von Laue等，J.Endocrinol165301-311(2000)]。利用氯胺T(0.7mM)將2μg GH(人垂體碘化等級，Calbiochem，SanDiego，CA，USA)用37MBq碘-125(Amersham Biosciences，LittleChalfont，Bucks，UK)標記45秒達到87MBq/nM的比活性，并利用Sephadex G-10柱進行純化。將細胞鋪板到12孔平板(每孔300000個細胞)中，并在含10％胎牛血清的DMEM/F-12(1∶1)中培養(yǎng)過夜。用無血清DMEM/F-12將培養(yǎng)物沖洗一次，在無血清培養(yǎng)基中于37℃下預培養(yǎng)3小時，然后用含1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液(PBS-BSA)沖洗兩次，并與具有不同含量的野生型或Ile179Met GH的1ml PBS-BSA中被標記的GH一起在室溫下溫育3小時(200000cpm/孔)。在溫育結(jié)束時，用PBS-BSA將細胞沖洗兩次并用1M NaOH溶解以便對所結(jié)合的125I-GH進行定量。在兩個孔中進行實驗(n＝4)，并通過對數(shù)據(jù)進行Scatchard分析來計算出Kd值。
結(jié)果Ile179Met變體的功能特征通過源自19個脊椎動物的直向同源GH蛋白的ClustalW多序列比對檢測了疏水性殘基Ile179的進化保守性[Krawczak等Gene237143-151(1999)]。該殘基在除了海龜以外的所有脊椎動物中是疏水性纈氨酸，表明在人譜系中Ile的取代是保守性的。與人GH平行進化同源基因簇的比較結(jié)果表明與Ile179相似的殘基是CSH1，CSH2和CSH中的Met(CSHP1)。這與已通過基因轉(zhuǎn)換成為模板的保守Ile179Met取代一致。
通過取代人GH的X-射線晶體結(jié)構(gòu)中的殘基來模建Ile179Met取代。Ile179位于螺旋4的C-末端區(qū)域，其參與位點1結(jié)合，而且當其被部分暴露時，能夠與“熱點”GHR殘基Trp169的側(cè)鏈發(fā)生疏水性作用。而且與GHR間的作用發(fā)生在Ile179的側(cè)鏈和主鏈原子與GHR的殘基Lys167和Gly168的主鏈原子之間。Ile179側(cè)鏈被蛋氨酸的側(cè)鏈的取代在與Trp169殘基的側(cè)鏈之間產(chǎn)生了不希望有的范德華力(例如空間的)，而且表明這些疏水作用在取代過程中可能是保守的。進行受體結(jié)合研究來確定野生型GH和Ile179Met變體對GHR親合性。但氨酸殘基的引入沒能改變受體的結(jié)合(圖9)；發(fā)現(xiàn)野生型和Ile179Met GH分子的Kd值分別是1.99nM和2.04nM。這表明如果野生型和變體GH的結(jié)合特性間存在著差異，那么這種差異是很微小(subtle)的且不會改變靜態(tài)系統(tǒng)中測定的Kd。丙氨酸-掃描誘變已經(jīng)鑒定出Ile179Met是作為決定受體親合力的殘基的組成部分；非保守性丙氨酸取代導致GHR結(jié)合的急劇下降(Kd從0.34增到0.92nM)[Cunningham和Wells，Science2441081-1084(1989)]?？紤]到Ile179對受體結(jié)合親合力起作用這樣一個事實，Ile179Met變體可能對GHR受體結(jié)合起著微小(subtle)的作用。
因此我們研究了Ile179Met GH變體與GHR間的干擾作用是否能夠?qū)е耂TAT 5和MAPK途徑的活化降低。通過螢光素酶報道基因測定對STAT5活化進行了間接研究，通過Western印跡測定被激活的磷酸-STAT5的水平來直接研究STAT 5的活化。通過Western印跡測定被激活的磷酸-MAPK的水平來直接研究MAPK的活化。
Ile179Met變體在昆蟲細胞中進行表達，并采用螢光素酶報道基因分析系統(tǒng)(11，12)來測定其信號轉(zhuǎn)導活性。欲成為生物活性的GH，其必須與兩個GHR分子結(jié)合由此引發(fā)受體二聚化。GHR的二聚化激活了細胞內(nèi)的酪氨酸激酶JAK2，其轉(zhuǎn)而通過磷酸化作用激活轉(zhuǎn)錄因子STAT 5。磷酸化的STAT 5發(fā)生二聚化，轉(zhuǎn)位到核中，并與STAT 5-反應性啟動子結(jié)合，由此啟動GH-反應性基因的表達。本文采用的GH生物活性分析試驗需要該途徑的所有步驟具有功能。濃度為1nM時，與野生型GH相比，發(fā)現(xiàn)Ile179Met變體具有激活JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導途徑的正常(99±4％野生型)活性(圖10)，所述濃度大約為GH在該試驗系統(tǒng)中的ED50值。盡管該變體可能清楚地表明對靜態(tài)體外系統(tǒng)沒有不良影響，但是其可能對不是JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導途徑具有不良影響?；蛘?，Ile179Met取代可能對GH的折疊、分泌或體內(nèi)穩(wěn)定性產(chǎn)生不良影響，或者對仍不明確的GH軸產(chǎn)生不良作用。
進行利用特異于磷酸化(被激活的)形式的MAPK和STAT 5的抗體進行的Western印跡實驗來評價Ile179Met變體激活MAP激酶和STAT 5途徑的能力。在整個研究的濃度范圍內(nèi)Ile179Met變體顯示激活MAPK的能力降低，然而在STAT 5的活化方面沒有差異(新圖8)。分析利用最大單劑量的GH(20nM)進行的多次實驗所得到的數(shù)據(jù)表明Ile179Met激活MAPK的能力顯著降低到僅為野生型水平的45％(對于Ile179Met變體為基礎活化水平的4.35±0.66倍，而對于野生型GH為基礎活化水平的9.76±2.52倍；平均值±SEM，n＝5獨立實驗，p＜0.05，Student’s t-檢驗，圖8)。這與在20nM的濃度時該變體激活STAT 5的能力與野生型GH水平相同(野生型為基礎水平的36.50倍，而Ile179Met變體為基礎水平的38.62倍)的情況不同。Western印跡數(shù)據(jù)證實了由STAT 5-反應性螢光素酶報道基因測定得到的結(jié)果，表明野生型GH與Ile179Met變體具有類似的活性水平。相反，MAPK的活化只為野生型GH引發(fā)的一半水平。
為了進一步探討這些可能性，在大鼠垂體GC細胞中對Ile179Met變體的分泌情況進行了研究。將在GH1啟動子單倍型1控制下的野生型GH1基因轉(zhuǎn)染到GC細胞中，結(jié)果表明引起人GH的分泌(利用人GH-特異性抗體由ELISA檢測到的)超過48小時，分泌濃度為64pM。Ile179Met變體(也受控于GH1啟動子單倍型1，其在患者B49體內(nèi)與該啟動子順式結(jié)合)的分泌水平按照上述方法測定，所測到的GH分泌水平被表示為野生型的百分比。由于分泌是野生型值的97±4％，可推斷該突變可能對GH的分泌幾乎沒有或根本沒有影響。
最后，Ile179Met變體還被胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K作用以確定該變體是否比野生型GH更易蛋白水解裂解。然而，事實證明Ile179Met變體抗蛋白水解裂解的能力與野生型GH相似，表明兩種形式的GH在蛋白折疊方面沒有明顯差異。在本文中值得考慮的是，我們以前鑒定的GH變體的大約67％[Millar等，Hum Mutat21424-440(2003)]與野生型GH相比其對蛋白水解的敏感性增加了。與不存在錯誤折疊一致，Ile179Met變體在大鼠垂體細胞中的分泌水平與野生型GH沒有區(qū)別。
據(jù)我們所掌握的知識，由受體激動劑激活的細胞信號途徑的差異活化難以預測。與Ile179Met變體相反，我們實驗室以前的研究所鑒定出的所有GH變體或者分泌水平低或者激活JAK/STAT途徑的活性低或者兩者都低[Millar等，Hum Mutat21424-440(2003)]。因此我們相信GHR被Ile179Met GH變體激活后能夠正常激活JAK 2，但不能激活Src，結(jié)果導致STAT 5的完全激活，但僅僅部分激活MAPK。
在表現(xiàn)為身材矮小的兒童體內(nèi)GH變體能正常激活STAT 5但對MAPK的激活降低，這些情形產(chǎn)生了一些有趣的問題，即有關MAPK在介導GH活性方面可能發(fā)揮的作用。以前的研究表明MAPK不參與IGF1基因表達的GH誘導[Shoba等，Endocrinology1423980-3986(2001)；Frago等，Endocrinology1434113-4122(2002)]。然而，仍有可能的是該變體可能仍然對先證者所證明的身材矮小有影響，也許與編碼其它GH軸蛋白的非相連基因座位的變體共同作用。因此在調(diào)節(jié)GH的促進生長效應方面，MAPK途徑可能比已鑒定的所起的作用更大。
表4在針對有家族性身材矮小的74名個體進行的篩選中發(fā)現(xiàn)的GH1基因損傷
核苷酸的編號是基于GH1參考序列(GenBank序號J03071)，其中+1＝轉(zhuǎn)錄起始位點。按照Horan等(2003)為臨近的單倍型啟動子編號。之前已由Miyata等所報道(1997)。
權(quán)利要求
1.分離的人生長激素核酸分子GH1的變體，該變體含有以下取代+1491C→G，其中1491指的是相對于被指定為1的轉(zhuǎn)錄起始位點的核苷酸位點。
2.分離的生長激素核酸分子GH1的變體，含有編碼一種蛋白質(zhì)的核酸分子，該蛋白質(zhì)即為GH蛋白質(zhì)，而且該蛋白質(zhì)含取代Ile179Met。
3.如權(quán)利要求1或2所述的分離的核酸分子，其中所述分子是gDNA、cDNA或mRNA。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的核酸分子的轉(zhuǎn)錄物。
5.如權(quán)利要求1、2或3所述的核酸分子編碼的分離多肽。
6.分離的多肽，為生長激素蛋白GH的變體，而且含有取代Ile179Met。
7.篩選懷疑具有功能障礙的GH的個體的篩選方法，該篩選方法包括步驟(a)從個體獲得含有人GH1基因的核酸分子的試驗樣品；(b)測序所述分子；(c)檢測所述序列中的+1491C→G的取代；和(d)如果所述取代存在則斷定存在GH功能障礙。
8.如權(quán)利要求7所述的篩選方法，其中所述測序步驟包括PCR技術。
9.篩選懷疑具有功能障礙的GH的個體的篩選方法，該篩選方法包括步驟(a)從所述個體獲得含有生長激素GH多肽的試驗樣品；(b)對所述多肽進行測序；(c)檢測所述序列中的Ile179Met取代；和(d)所述取代存在則斷定存在GH功能障礙。
10.適于用來實施權(quán)利要求7、8或9所述篩選方法的試劑盒，該試劑盒含有(a)具有對應于GH1基因的+1491區(qū)域的核酸序列的寡核苷酸，所述區(qū)域含+1491C→G取代；和(b)具有對應于(a)中所指區(qū)域中的野生型序列的核酸序列的寡核苷酸；和任選地(c)一種或多種適于實施PCR的試劑以便擴增患者DNA的目的區(qū)域。
11.適于在權(quán)利要求7-9所述方法中使用的，以及任選地在權(quán)利要求10所述試劑盒中提供的寡核苷酸。
12.含Ile179Met取代的而且進一步為受體-介導的細胞信號途徑提供了差異激活的分離的生長激素多肽或蛋白質(zhì)。
13.如權(quán)利要求12所述的分離多肽或蛋白質(zhì)，其中所述多肽或蛋白質(zhì)激活STAT5途徑，而顯示對MAPK途徑的激活降低。
14.如權(quán)利要求13所述的分離多肽或蛋白質(zhì)，其中所述MAPK途徑活性的降低為低于野生型GH蛋白質(zhì)活性的70％。
15.如權(quán)利要求14所述的分離的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述降低的活性為低于50％。
16.如權(quán)利要求13所述的分離的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述降低的活性為低于45％。
17.分離的生長激素多肽或蛋白質(zhì)，其特征在于激活MAP激酶途徑的能力降低了。
18.如權(quán)利要求17所述的分離的多肽或蛋白質(zhì)，其中所述MAPK途徑是ERK途徑。
19.一種篩選懷疑具有功能障礙的GH的個體的篩選方法，該篩選方法包括步驟(a)獲得源自所述個體的試驗樣品，該樣品含有所述個體的內(nèi)源性生長激素；(b)檢測所述生長激素來確定其是否激活受體介導的MAPK細胞信號途徑以及激活到什么程度；和(c)如果與野生型GH相比，MAPK細胞信號降低了，斷定存在GH功能障礙。
20.如權(quán)利要求1-3所述的分離的核酸分子用于診斷生長激素功能障礙或開發(fā)合適療法的用途。
21.如權(quán)利要求12-18所述的分離的多肽或蛋白質(zhì)用于診斷生長激素功能障礙或開發(fā)合適療法的用途。
22.特異于權(quán)利要求12-18所述分離的生長激素多肽或蛋白質(zhì)的抗體。
23.含權(quán)利要求1-3所述核酸分子以及藥用載體的藥物組合物。
24.含權(quán)利要求12-18所述分離的多肽或蛋白質(zhì)以及藥用載體的藥物組合物。
25.含權(quán)利要求1-3所述核酸分子的載體。
26.含權(quán)利要求25所述載體的宿主細胞。
27.用于制備權(quán)利要求12-18所述分離的多肽或蛋白質(zhì)的方法，包括(a)培養(yǎng)權(quán)利要求26的宿主細胞；和(b)從所述培養(yǎng)基中回收由所述細胞產(chǎn)生的多肽或蛋白質(zhì)。
28.由權(quán)利要求27所述方法生產(chǎn)的多肽或蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及自然發(fā)生的生長激素突變；用于檢測該突變的方法及其在篩選具有生長激素功能障礙的患者的用途或用于生產(chǎn)適于治療這種異常的變異蛋白的用途。
文檔編號C07K14/61GK1711280SQ200380103099
公開日2005年12月21日 申請日期2003年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月12日
發(fā)明者D·N·庫珀, A·M·普羅克特, J·格雷戈里, D·S·米勒, M·劉易斯, A·尤利德 申請人:加的夫大學學院咨詢有限公司