專利名稱：篩選線粒體機能調(diào)節(jié)劑的方法和所獲得的新調(diào)節(jié)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選線粒體機能調(diào)節(jié)劑的方法和所獲得的新調(diào)節(jié)劑。
在過去十多年中，深入的國際研究揭示了線粒體在細胞凋亡和程序性細胞死亡其它相關(guān)形式中的關(guān)鍵作用。盡管線粒體不是唯一能夠調(diào)控程序性細胞死亡的細胞器，但是大量實驗證據(jù)暗示，線粒體是細胞凋亡“中央執(zhí)行者”的重要成分。因此，利用分離的線粒體所作的體外調(diào)控線粒體功能的研究，對于解釋細胞死亡機制以及鑒定新的治療性藥物都具有重要意義。
線粒體代謝和線粒體膜的通透性狀態(tài)是細胞生命和死亡決定的基本檢查點，而且事實上，在哺乳動物程序性細胞死亡過程中，線粒體經(jīng)歷著不同的結(jié)構(gòu)和功能改變。根據(jù)實驗，阻斷呼吸鏈開啟生物突發(fā)性災(zāi)變的試劑和能改變線粒體膜透性的分子是細胞死亡(包括壞死性、程序性和自吞性類型的細胞死亡)的有效調(diào)節(jié)劑。在程序性細胞死亡(也稱作凋亡)過程中，線粒體修飾變化通常包括基質(zhì)腫脹、外膜透化(OMP)內(nèi)膜凋亡效應(yīng)器(比如細胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子、endoG、和Smac/Diablo)、以及內(nèi)部跨膜電勢(Δψm)損耗。這些事件的確切層次(hierarchy)尚在爭議中，且可能依賴于細胞類型和細胞死亡途徑二者。經(jīng)常導(dǎo)致該線粒體膜透化(MMP)的一種熟知現(xiàn)象是線粒體透性轉(zhuǎn)變(MPT)。MPT能導(dǎo)致快速線粒體腫脹(也即，線粒體尺寸變大和該細胞器粒度減小)、外膜破裂，并能誘導(dǎo)線粒體跨膜電勢(Δψm)損耗。
Bcl-2家族的促-和抗-凋亡成員通過與腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白(ANT；在內(nèi)膜中，IM)、電壓依賴型陰離子通道(VDAC；在外膜中，OM)互作、和/或通過自身的通道形成活性調(diào)控內(nèi)部和外部線粒體膜透化(MMP)。ANT和VDAC是透性轉(zhuǎn)變孔(PTP)的主要成分，在兩個線粒體膜并列的位置組織形成一個多聚蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。PTP是對任意＜1.5kDa的分子通透的非特異性孔，在氧化脅迫、高Ca2+或低ATP濃度情況下它在內(nèi)線粒體膜中打開。PTP的開放導(dǎo)致線粒體大大腫脹、外膜破裂并釋放出誘導(dǎo)細胞凋亡的內(nèi)膜成分。此外，線粒體逐漸去極化從而抑制氧化磷酸化和刺激ATP水解。環(huán)孢菌素A或該化合物與線粒體親環(huán)蛋白(肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶)結(jié)合的衍生物抑制環(huán)開放。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過以單個線粒體為基礎(chǔ)的FCM(流式細胞術(shù))分析可以對分離的線粒體的形態(tài)學(xué)和Δψm變化進行實時定量。用該方法，他們已經(jīng)開發(fā)出一種篩選線粒體機能調(diào)節(jié)劑的方法，并已獲得一個MMP肽性(peptidic)誘導(dǎo)劑新家族。
通過該細胞器前向散射(forward scatter)(FSC)的顯著提高和側(cè)向散射(side scatter)(SSC)的減小來檢測線粒體的逐漸腫脹。這兩項觀察結(jié)果都與分光光度吸光度數(shù)據(jù)顯著相關(guān)。加載JC-1探針后發(fā)生Δψm變化。該陽離子親脂性染料在高度能量激化的線粒體(放射出紅色熒光)中形成J-凝集物，然而在低Δψm細胞器(結(jié)合綠色熒光)的基質(zhì)中僅以單體存在。隨著JC-1紅色熒光和JC-1紅色/綠色熒光比率逐漸降低——二者都由J-凝集物的解離導(dǎo)致，Δψm降低。
本發(fā)明因此涉及通過實時流式細胞術(shù)分析篩選線粒體功能調(diào)節(jié)劑的方法，其特征表現(xiàn)在實施例1至3。
實施例1描述了用FCM制備線粒體的特征盡管純化的小鼠肝臟線粒體是小細胞器(1-2μm)，但是它們可以通過流式細胞術(shù)用Δψm-敏感型染料MitoTrackerGreen檢測，純度達到95％。而且，可以用該Δψm-敏感型染料JC-1評估它們的功能這些細胞器大部分是是極有活力的(energetically competent)，因為超過90％具有升高的Δψm。
實施例2顯示對分離的線粒體可以如何定量其腫脹，以及實時分析相對于定時流式細胞術(shù)的優(yōu)勢。事實上，定時和實時FCM允許發(fā)生由PTP開啟物鈣誘導(dǎo)的以下變化。實時可以得到完整的積分以估計這些形態(tài)學(xué)變化的速率。
然而，對于比如protonophore羰基氰間-氯苯腙(CCCP)這樣的線粒體形態(tài)學(xué)上的緩慢變化，實時是有利的，因為它能夠跟隨低的但是顯著的粒度(SSC)降低而不伴有可檢測的大小(FSC)改變。事實上，用實時熒光檢測追蹤平均SSC信號和平均前向散射(FSC)信號，結(jié)果顯示，CCCP誘導(dǎo)出不能被傳統(tǒng)的分光光度吸光度分析檢測到的SSC減少。
當用形成抗生素肽丙甲甘肽的離子通道誘導(dǎo)PTP-依賴型線粒體腫脹時，還觀察到同時發(fā)生的FSC升高和SSC減少。有趣的是，用該分子，SSC變化不如FSC變化快。因此，實時分析可以更好地定義不同的PTP修飾物。
實施例3證實，實時熒光測定分析區(qū)域可以如何擴展至Δψm。實時分析可以表征線粒體完整性和區(qū)分各種不同的PTP-依賴型和PTP-非依賴型MMP誘導(dǎo)物。事實上，通過單獨測試或與比如Bongkretic酸、釕紅、和環(huán)孢菌素A這樣的抑制劑結(jié)合測試鈣、丙甲甘肽和CCCP藥物，它可以允許對這些藥物的機理(mechanistic)方面做快速鑒定。作為一個該方法實用性的舉例，這些分析表明，至少在這些實驗條件下，Δψm損失不早于由Ca2+誘導(dǎo)的線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)重塑。因此對線粒體大小/結(jié)構(gòu)和Δψm狀態(tài)的同時流式細胞術(shù)實時記錄可用作一種定義MMP事件層次的工具。
對SSC和JC1-桔色(JC1-orange)的同時檢測因而是一種快速且敏銳的篩選和定量MMP-抑制劑效應(yīng)的方法。
如同上述實施例所示，該實時方法可用于表征包括肽和小分子的多種分子誘導(dǎo)的線粒體膜透化(MMP)。所述的實時方法還可用于研究呼吸鏈的不同抑制劑(丙二酸、抗霉素A、KCN、寡霉素、或protonophore解偶聯(lián)劑CCCP)對MMP的效應(yīng)。
本發(fā)明因此涉及篩選線粒體機能調(diào)節(jié)劑的方法，包括將待被測試化合物添加到純化的分離線粒體制備物中、并同時對線粒體形態(tài)學(xué)做實時熒光檢測分析從而通過染料熒光將膜完整性分析與線粒體形態(tài)計量參數(shù)(SSC/FSC參數(shù))分析相結(jié)合。
膜完整性分析用JC-1染料完成以表征線粒體跨膜電勢Δψm和研究線粒體膜透性的任何變化。
用藥理學(xué)誘導(dǎo)物或比如鈣、CCCP、丙甲甘肽、Bongkretic酸、釕紅、環(huán)孢菌素A、DIDS這樣的線粒體透性調(diào)節(jié)劑進一步表征線粒體膜透化機制。
這樣的一種方法使得能夠研究例如Bcl-2家族成員和呼吸抑制劑對PTP-相關(guān)MMP的影響，并可用于例如鑒定和設(shè)計單獨或組合誘導(dǎo)線粒體透性變化的新試劑，所述化合物為例如化學(xué)藥品、肽、來自人或非人來源的生物提取物(例如來自哺乳動物、動物、細菌、酵母、或植物，為天然或通過基因工程創(chuàng)造的)。
本發(fā)明還涉及所述方法用于旨在調(diào)控MMP而設(shè)計新試劑的用途。
本發(fā)明還涉及如上述定義、包括診斷或表征患有疾病、尤其是遺傳疾病或代謝疾病的患者中的線粒體功能的方法。
所述上述定義的方法還可用于定義能夠治療由此揭示的、任何遵循患者發(fā)展的缺陷的試劑。
在一種特定實施方式中，利用上述對線粒體的實時FCM分析進行篩選，本發(fā)明人定義了線粒體活性肽。
本發(fā)明因此涉及被加入純化的、分離線粒體后誘導(dǎo)線粒體膜透化(MMP)的合成肽，所述合成肽由L或D氨基酸組成，C末端受酰胺化合物保護或類似保護，且在N末端帶有?；?、烷基、生物素基團、或其它修飾。
本發(fā)明還涉及所述肽及其含有簡單的插入、缺失、或突變而不改變線粒體功能的衍生物。
本發(fā)明的肽具有以下序列ATLSALLAALRRIQRA (SEQ ID N°1)RKKRRQRRRGGATLSALLAALRRIQRA (SEQ ID N°2)RKKRRQRRRCGGLETRTETWMSSEGAWKQIQKVETWALRH (SEQ ID N°3)RKKRRQRRRCGGLANKKGAWLDSTKATRYLVKTESWILRN (SEQ ID N°4)GG*CRGDMFG*CGGLLFIHFRIGSRHSRIG (SEQ ID N°5)RIEIWILRH (SEQ ID N°6)RIAIWILRH (SEQ ID N°7)RKKRRQRRRGGRIEIWILRH (SEQ ID N°8)
RKKRRQRRRGGRIAIWILRH (SEQ ID N°9)EHWSYWLRPGGGLLFIHFRIGCRHSRIG (SEQ ID N°10)EHWSYWLRPGGGGGSLLFIHFRIGCRHSRIG (SEQ ID N°11)及其衍生物。
該列表中，星號表示半胱氨酸間的二硫橋。
在序列ID 10和11中，W6殘基可有利地被D-氨基酸DW取代。
所述肽表現(xiàn)誘導(dǎo)線粒體改變和MMP，并具有誘導(dǎo)培養(yǎng)的細胞凋亡的能力，且因此具有可用于治療一些人類疾病的能力。
這些序列的所述線粒體特性示于實施例4中，證實了該技術(shù)檢測線粒體透性誘導(dǎo)物的能力。
在上述測試過程中，本發(fā)明人觀察到了一套高度預(yù)示著作用于線粒體透性的能力的結(jié)構(gòu)特征。該結(jié)構(gòu)特性可用于鑒定或設(shè)計大范圍的肽調(diào)控MMP。
本發(fā)明涉及具有以下特征的任何含有至少8個氨基酸和直至50個氨基酸的肽-至少一部分肽結(jié)構(gòu)是兩親性α螺旋，-2、3或4個氨基酸帶正電荷(賴氨酸[K]或精氨酸[R])，且位于螺旋同一側(cè)，-當用螺旋輪(helical wheel)描繪該螺旋時，R和/或K氨基酸形成一簇(參見附圖15)，-當被加入純化、分離的線粒體中時，它們誘導(dǎo)變化(超微結(jié)構(gòu)或膜透性)。
表現(xiàn)這些特性并具有線粒體活性的肽的例子如下所列RKKRRQRRRGGGAWKHAQRIEIWILRH(SEQ ID N°12)RKKRRQRRRGGGAWKHAQRIETWILRH(SEQ ID N°13)RKKRRQRRRGGGAWKHAQRVESWILRN(SEQ ID N°14)RKKRRQRRRGGGAWKRACRMETWILRH(SEQ ID N°15)RKKRRQRRRGGGAWKQIQKVETWALRH(SEQ ID N°16)RKKRRQRRRGGGAWRQVEKVETWALRH(SEQ ID N°17)RKKRRQRRRGGGAWKHAQRIAIWILRH(SEQ ID N°18)
AWKHAQRIAIWILRH (SEQ ID N°19)GG*CRGDMFG*CGGRIEIWILRH (SEQ ID N°20)GG*CRGDMFG*CGGRIAIWILRH (SEQ ID N°21)GG*CGRGDSPG*CGGRIEIWILRH (SEQ ID N°22)GG*CGRGDSPG*CGGRIAIWILRH (SEQ ID N°23)其中*C＝參與環(huán)狀二硫橋的半胱氨酸EHWSYWLRPGGGRIEIWILRH(SEQ ID N°24)EHWSYWLRPGGGRIAIWILRH(SEQ ID N°25)EHWSYWLRPGGGGGSRIEIWILRH (SEQ ID N°26)EHWSYWLRPGGGGGSRIAIWILRH (SEQ ID N°27)EHWSYWLRPGGGGGSGAWKHAQRIEIWILRH (SEQ ID N°28)EHWSYWLRPGGGGGSGAWKHAQRIAIWILRH (SEQ ID N°29)EHWSYWLRPGGGLLFIHFKIGCKHSKIG (SEQ ID N°30)EHWSYWLRPGGGGGSLLFIHFKIGCKHSKIG (SEQ ID N°31)EHWSYWLRPGGGLLFIHFRIGSRHSRIG (SEQ ID N°32)EHWSYWLRPGGGGGSLLFIHFRIGSRHSRIG (SEQ ID N°33)EHWSYWLRPGGGLLFIHFKIGSKHSKIG (SEQ ID N°34)EHWSYWLRPGGGGGSLLFIHFKIGSKHSKIG (SEQ ID N°35)其中，W6殘基可以有利地被D-氨基酸dw取代。
所述肽有利地在C-末端位置含有比如酰胺基團和標記物或連接基團這樣的穩(wěn)定化基團，例如生物素基團。它們還可包括L-或D-氨基酸retro-inverso、還原的肽主鏈、或被翻譯成假肽。
本發(fā)明還涉及結(jié)合于肽運輸系統(tǒng)的所述肽，且可選地在所述肽和運輸系統(tǒng)間含有接頭。該肽運輸系統(tǒng)有利地可以是細胞外或細胞內(nèi)靶向序列、抗體或其片段(ScFv)。該接頭可以是允許肽獨立于肽運輸系統(tǒng)采用螺旋結(jié)構(gòu)的序列，可由2至6個比如丙氨酸或甘氨酸這樣的氨基酸、或二硫橋、或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)已知的任何方法形成。所述肽還能通過保留線粒體調(diào)節(jié)能力的插入、缺失或突變進行修飾。
可以針對可能的治療用途根據(jù)靶細胞將所述肽分成各家族第1組誘導(dǎo)各種不同細胞類型的細胞死亡的合成肽。這些肽誘導(dǎo)細胞凋亡的能力示于實施例5。
RKKRRQRRRGGRIEIWILRH (SEQ ID N°8)RKKRRQRRRGGRIAIWILRH (SEQ ID N°9)RKKRRQRRRGGGAWKHAQRIEIWILRH (SEQ ID N°36)RKKRRQRRRGGGAWKHAQRIETWILRH (SEQ ID N°37)RKKRRQRRRGGGAWKHAQRVESWILRN (SEQ ID N°38)RKKRRQRRRGGGAWKRACRMETWILRH (SEQ ID N°39)RKKRRQRRRGGGAWKQIQKVETWALRH (SEQ ID N°40)RKKRRQRRRGGGAWRQVEKVETWALRH (SEQ ID N°41)RKKRRQRRRGGATLSALLAALRRIQRA (SEQ ID N°2)RKKRRQRRRCGGLETRTETWMSSEGAWKQIQKVETWALRH (SEQ ID N°3)RKKRRQRRRCGGLANKKGAWLDSTKATRYLVKTESWILRN (SEQ ID N°4)第2組誘導(dǎo)腺癌細胞系細胞死亡的合成肽對這些肽作用于腺癌細胞的能力的證明示于實施例6。
EHWSYWLRPGGGRIEIWILRH (SEQ ID N°42)EHWSYWLRPGGGRIAIWILRH (SEQ ID N°43)EHWSYWLRPGGGGGSRIEIWILRH (SEQ ID N°44)EHWSYWLRPGGGGGSRIAIWILRH (SEQ ID N°45)EHWSYWLRPGGGGGSGAWKHAQRIEIWILRH (SEQ ID N°46)EHWSYWLRPGGGGGSGAWKHAQRIAIWILRH (SEQ ID N°47)EHWSYWLRPGGGLLFIHFRIGCRHSRIG (SEQ ID N°10)EHWSYWLRPGGGGGSLLFIHFRIGCRHSRIG (SEQ ID N°11)EHWSYWLRPGGGLLFIHFKIGCKHSKIG (SEQ ID N°48)EHWSYWLRPGGGGGSLLFIHFKIGCKHSKIG (SEQ ID N°49)EHWSYWLRPGGGLLFIHFRIGSRHSRIG (SEQ ID N°50)
EHWSYWLRPGGGGGSLLFIHFRIGSRHSRIG (SEQ ID N°51)EHWSYWLRPGGGLLFIHFKIGSKHSKIG (SEQ ID N°52)EHWSYWLRPGGGGGSLLFIHFKIGSKHSKIG (SEQ ID N°53)第3組誘導(dǎo)人臍靜脈胚胎細胞(HUVECs)細胞死亡的合成肽?；钚宰C明示于實施例7。
GG*CRGDMFG*CGGRIEIWILRH (SEQ ID N°54)GG*CRGDMFG*CGGRIAIWILRH (SEQ ID N°55)GG*CGRGDSpG*CGGRIEIWILRH (SEQ ID N°56)GG*CGRGDSPG*CGGRIAIWILRH (SEQ ID N°57)GG*CRGDMFG*CGGLLFIHFRIGSRHSRIG(SEQ ID N°5)*C＝參與環(huán)狀二硫橋的半胱氨酸因此，本發(fā)明提供使分子正面或負面作用于MMP的方法。如本發(fā)明人所示，上述肽誘導(dǎo)MMP這些線粒體-活性肽的細胞可透過性形式是Δψm損失以及經(jīng)凋亡的細胞死亡的有效誘導(dǎo)物。因此，所述的新《mito-》熒光檢測方法可以成為鑒定新線粒體毒性或線粒體保護性藥物的有用的、可靠的工具。
此外，通過使用篩選出的分子以及由線粒體毒性結(jié)構(gòu)域序列和肽運輸系統(tǒng)構(gòu)成的嵌合分子誘導(dǎo)腫瘤細胞系(尤其是腺癌)、或HUVECs的細胞死亡，本發(fā)明人證實了，這些序列作為潛在的線粒體毒性分子可用于設(shè)計新治療性分子的用途。
正面作用于MPP的分子可用于治療例如癌癥和自身免疫疾病，負面作用于MPP的分子將顯示細胞保護性效應(yīng)(神經(jīng)保護、心臟保護和肝臟保護，例如對抗急性或慢性缺血)。這樣的藥物還可用于治療代謝疾病比如肥胖和糖尿病。更特別的是，本發(fā)明的分子可用于治療與MPP或其它包括細胞死亡在內(nèi)的功能失調(diào)相關(guān)的病理。
參照附圖1至13，以下給出了本發(fā)明的其它特征和益處。
實施例1利用流式細胞術(shù)分析線粒體純化的小鼠肝臟線粒體是可以通過流式細胞術(shù)用Δψm-敏感型染料MitoTrackerGreen檢測的小細胞器(1-2μm)(附圖1A)。事實上，F(xiàn)SC/SSC參數(shù)的正確分選(gating)允許選擇包含95.5％線粒體的事件群體(附圖1B、C)。與細胞大小/體積高度相關(guān)(Salzman等人1990)的FSC，可以評估線粒體大小，而與粒度和折射指數(shù)相關(guān)的SSC參數(shù)，是與線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)相關(guān)的物理參數(shù)。這些細胞器大多數(shù)都是極有活力的(energetically competent)，因為如同通過用Δψm-敏感型染料JC-1標記所揭示的(附圖1D)，超過90％的細胞器具有提高的Δψm。
實施例2線粒體腫脹測定定時(fixed time)與實時(real time)FCM鈣(Ca2+)作為PTP激活劑(開啟物(opener))作用于線粒體誘導(dǎo)劑量依賴型SSC減少和FSC增加(附圖2A、B)。該效應(yīng)與545nm處的劑量依賴型吸光度損失高度相關(guān)(典型的腫脹；附圖2B，C，D)。有趣地是，SSC減少(內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化)似乎是添加低Ca2+劑量后可測定的最敏感參數(shù)(附圖2B)。事實上在比典型腫脹(吸光度)更高的程度下直到7.5μM才檢測到SSC(附圖2B)。如同所預(yù)期的，這些變化被用PTP抑制劑(關(guān)閉物(closer))環(huán)孢菌素A(CsA)對線粒體進行預(yù)處理所降低(附圖2B)。此外，F(xiàn)SC/SSC比率與分光光度測定數(shù)據(jù)高度相關(guān)(附圖2E)?？傊?，那些數(shù)據(jù)表明，通過評估線粒體SSC(內(nèi)部結(jié)構(gòu))和FSC(大小)流式細胞術(shù)能可靠地證明線粒體腫脹。
對大小和結(jié)構(gòu)參數(shù)的實時流式細胞記錄可以擴展該方法的潛能。為此，在存在(附圖3；Ctr.)或不存在(附圖3；Ca2+)Ca2+的情況下記錄20分鐘線粒體的基本FSC和SSC特征。在對照線粒體中未觀察到FSC、SSC和FSC/SSC比率的變化。相反，Ca2+誘導(dǎo)FSC、FSC/SSC比率驚人的提高和線粒體結(jié)構(gòu)的快速減少(SSC)(附圖3；Ca2+)。然后，可用完整積分(integral calculus)估計這些形態(tài)學(xué)變化的速率(附圖3D)。有趣的是，添加Ca2+后的結(jié)構(gòu)變化(SSC)速率在處理后一分鐘內(nèi)為最大，暗示著SSC參數(shù)是一個對與腫脹相關(guān)的變化非常敏感的感應(yīng)器(sensor)。
當用protonophore羰基氰間(meta-)氯苯腙(CCCP)處理時，線粒體群體經(jīng)歷一個雖低卻顯著的粒度(SSC)減少而沒有可檢測的大小(FSC)改變。事實上，用實時熒光檢測追蹤平均SSC信號和平均前向散射(FSC)信號似乎顯示，CCCP誘導(dǎo)出不能被傳統(tǒng)的分光光度檢測吸光度分析(附圖4B)檢測到的SSC減少(附圖4A)。Ca2+誘導(dǎo)的PTP-開啟與快且強的FSC/SSC比率上升相關(guān)，這是FSC增加和SSC減少同時發(fā)生的結(jié)果。此外，CsA-介導(dǎo)的對Ca2+-誘導(dǎo)的變化的抑制可以由實時FSC-SSC分析正確跟蹤(附圖4)。當用形成抗生素肽丙甲甘肽的離子通道誘導(dǎo)產(chǎn)生PTP-非依賴型線粒體腫脹時，也觀察到同時發(fā)生的FSC增加和SSC減少。有趣的是，用該分子，SSC變化不如FSC變化快。丙甲甘肽誘導(dǎo)的MMP不受CsA預(yù)處理(未顯示)的抑制且與分光光度檢測吸光度分析非常相關(guān)(附圖4A、B)。此外，對用丙甲甘肽或Ca2+處理后FSC/SSC比率的實時熒光檢測追蹤是敏感的，且與傳統(tǒng)的分光光度檢測吸光度分析非常相關(guān)(附圖4C、D)。
實施例3用實時FCM估計的線粒體功能利用羰花青染料5，5′，6，6′，-四氯-1，1，3，3′-四乙苯并咪唑羰花青吲哚(5，5′，6，6′-tetracholoro-1，1，3，3′-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanine)(JC-1)可以將實時熒光檢測分析的區(qū)域擴展到Δψm。當向純化的線粒體加載JC-1(0，11納摩爾JC-1/□g蛋白質(zhì))時，J-凝集物的形成(桔紅色熒光)隨著時間增加，在15-20分鐘后達到最大值(附圖5)。添加CCCP對Δψm的抑制導(dǎo)致JC-1桔色熒光的快速減少和單體JC-1綠色熒光的緩慢增加(附圖6)。相反，PTP-依賴型(由Ca2+誘導(dǎo))和PTP-非依賴型(由丙甲甘肽誘導(dǎo))線粒體膜透化(MMP)同時激發(fā)JC-1桔色熒光的減少和JC-1綠色熒光的顯著增加。這些現(xiàn)象最可能由J-凝集物解離成JC-1單體導(dǎo)致。如同預(yù)計的，丙甲甘肽和Ca2+而非CCCP誘導(dǎo)線粒體FSC/SSC比率快速提高(附圖6E)。在用Ca2+處理后同時對SSC(腫脹)和JC1-桔色(Δψm損失)減少所作的實時分析揭示了這些參數(shù)間明晰的相關(guān)性。這些分析還表明，至少在這些實驗條件下，Δψm損失不早于由Ca2+誘導(dǎo)的線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)重塑(附圖7)。相反，CCCP處理誘導(dǎo)出快速的Δψm損失，這出現(xiàn)在非常緩慢且低的SSC減少之前。因此，對線粒體大小/結(jié)構(gòu)和Δψm狀態(tài)的同期流式細胞術(shù)實時記錄可用作定義MMP事件層次的工具。
對SSC和JC1-桔色的同期檢測也是快速篩選和定量MMP抑制劑效應(yīng)的方法。相應(yīng)地，對照PTP-抑制劑CsA完全消除了由Ca2+誘導(dǎo)的SSC減少和Δψm損失(附圖8)。用bongkrekic酸(BA)——一種影響ANT構(gòu)象的ANT配體，預(yù)處理，大大降低由Ca2+誘導(dǎo)的Δψm損失并部分影響SSC減少。對由Ca2+誘導(dǎo)的MMP的另一種有效的抑制劑是釕紅，釕紅通過對Ca2+單向轉(zhuǎn)運物(uniporter)的藥理學(xué)抑制阻止Ca2+向線粒體中積累。釕紅抑制80％的由Ca2+誘導(dǎo)的Δψm損失和SSC減少(附圖8)。相反，由丙甲甘肽誘導(dǎo)的MMP不受CsA、BA和釕紅的影響。
實施例4肽誘導(dǎo)的線粒體變化在線粒體中實時FCM分析測試對應(yīng)于ATLSALLAALRRIQRA (SEQ ID N°1)RKKRRQRRRGGATLSALLAALRRIQRA (SEQ ID N°2)RKKRRQRRRCGGLETRTETWMSSEGAWKQIQKVETWALRH (SEQ ID N°3)RKKRRQRRRCGGLANKKGAWLDSTKATRYLVKTESWILRN (SEQ ID N°4)GG*CRGDMFG*CGGLLFIHFRIGSRHSRIG(SEQ ID N°5)RIEIWILRH(SEQ ID N°6)RIAIWILRH(SEQ ID N°7)RKKRRQRRRGGRIEIWILRH (SEQ ID N°8)RKKRRQRRRGGRIAIWILRH (SEQ ID N°9)EHWSYWLRPGGGLLFIHFRIGCRHSRIG (SEQ ID N°10)EHWSYWLRPGGGGGSLLFIHFRIGCRHSRIG (SEQ ID N°11)的肽以及線粒體腫脹特性，劑量范圍是1至20μM。以線粒體變化的誘導(dǎo)表示的結(jié)果概括在下表1中
表1肽誘導(dǎo)分離線粒體中的MMP。
實施例5用MMP誘導(dǎo)物誘導(dǎo)細胞凋亡通過用MMP誘導(dǎo)肽處理對培養(yǎng)的人細胞誘導(dǎo)出凋亡特征。所顯示的實施例涉及肽seq.ID n°3 RKKRRQRRRCGGLETRTETWMSSEGAWKQIQKVETWALRH。附圖9顯示肽對分離的線粒體的特征，證明了劑量依賴型特異性腫脹(A)和細胞色素C的釋放(B)。之后在細胞上測試該肽用肽或假擬物處理處于指數(shù)生長期的HeLa細胞，之后通過熒光顯微鏡或FACS分析以確定凋亡。示于附圖10中的結(jié)果證明了凋亡誘導(dǎo)的劑量和時間相關(guān)效應(yīng)。
對肽SEQ.ID n°4 RKKRRQRRRCGGLANKKGAWLDSTKATRYLVKTESWILRN進行了類似的實驗，描述于附圖11和12中。這些附圖證明了該肽對細胞內(nèi)線粒體的去穩(wěn)定化作用。
實施例6用MMP誘導(dǎo)物對腺癌細胞誘導(dǎo)細胞凋亡在不存在(對照)或存在肽(對應(yīng)于SEQ ID N°11的肽或具有HWSYWLRPG-GGGGS SEQ ID N°59的相關(guān)對照肽(經(jīng)實時測試證實對線粒體沒有活性))的情況下培養(yǎng)處于指數(shù)生長期的細胞。受試人類細胞為非腺癌細胞Jurkat和乳腺腺癌MDA-MD-231細胞。與5至20μM肽孵育24小時后，使細胞接受FACS分析以確定由FACS分析顯示的由Δψm損失誘導(dǎo)和細胞膜透性誘導(dǎo)所證實的線粒體凋亡。表2顯示以證明凋亡的細胞百分數(shù)表示的典型結(jié)果，清楚的顯示了尤其是在腺癌細胞中的凋亡。
表2通過與線粒體透性誘導(dǎo)肽孵育在培養(yǎng)細胞中誘導(dǎo)調(diào)亡。給出了凋亡細胞的％。
實施例7用MMP誘導(dǎo)物在HUVEC中誘導(dǎo)細胞凋亡。
用Seq.ID N°5或相關(guān)對照GG*CRGDMFG*CG(未發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)MMP離子分離的線粒體)處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞，通過FACS分析以劑量和時間相關(guān)方式評估凋亡。附圖13顯示結(jié)果，清楚地證明了用該肽處理的HUVEC細胞中的凋亡誘導(dǎo)。
材料和方法線粒體分離和純化肝臟線粒體分離自3～4周齡Balb-c小鼠(IFFA CREDO，SaintGermain sur l′Arbresle，F(xiàn)rance)。動物在腦部脫位處死前禁食過夜。如(Jacotot，2000)所述制備肝臟線粒體。所有步驟在4℃下完成。最后，將細胞器重懸于“腫脹緩沖液”中，該緩沖液由200mM蔗糖、5mM琥珀酸鹽、10mM Tris-MOPS(pH 7.4)、1mM H3PO4、2μM魚藤酮、和10μM EGTA組成，pH＝7.4。在該緩沖液中完成分光光度分析和流式細胞術(shù)分析。用Bradford檢測法確定分離的線粒體蛋白質(zhì)含量。
測試線粒體的試劑用1-30μM鈣(CaCl2，MERCK)、和5μg/ml丙甲甘肽(SIGMA)誘導(dǎo)線粒體膜透化(MMP)。在加入MMP-誘導(dǎo)劑前四分鐘以10μM添加釕紅(SIGMA)和PTP抑制劑環(huán)孢菌素A(CSA，BIOMOL)。用解偶聯(lián)劑羰基氰化物m-氯苯腙(mClCCP，SIGMA)以20μM完全瓦解Δψm。
用分光光度法檢測大幅度腫脹用Ultrospec 3300pro分光熒光計(Amersham Pharmacia Bioech，Cambridge，England)通過測定545nm處的吸光度(A545)檢測大幅度腫脹(Bernardi等人，1992)。將線粒體重懸于1ml腫脹緩沖液中，蛋白質(zhì)濃度為100μg/ml。記錄四分鐘基礎(chǔ)吸光度，向樣品中加入MPP-誘導(dǎo)試劑，在接下來的16分鐘根據(jù)吸光度減少來監(jiān)控大幅度腫脹。數(shù)據(jù)用數(shù)據(jù)捕獲軟件(Excel，Uppsala，Sweden)記錄。腫脹曲線用Microsoft Excel軟件繪制。腫脹陽性對照是用30μM CaCl2處理誘導(dǎo)的。特定的腫脹百分數(shù)根據(jù)如下計算(ACa2+-AReagent)×100/(ACa2+-Ainit)，ACa2+、AReagent和Ainit分別對應(yīng)于獲自用CaCl2-處理的、試劑處理的、和預(yù)處理的線粒體的吸光度值。
純化線粒體的流式細胞分析用裝備有15mW氣冷的(air-cooled)488nm氬激光的三色FACSCalibur血細胞計數(shù)器(Becton Dickinson，San Jose，CA)進行熒光活化的流式細胞術(shù)。正確設(shè)置好前向角度光散射(FSC)-側(cè)向角度光散射(SSC)探測器(參見附圖1)后進行線粒體分析。通過對FSC-SSC散射圖(附圖1)的適當分選來區(qū)分線粒體和細胞碎片以及噪聲背景(Radcliff G，Jaroszeski MJ 1998Methods Mol Biol 911-24Basicsof flow cytometry)。用Δψm-不敏感線粒體染料MitoTrackerGreen(MTG，Molecular Probes，Eugene，OR)(Jacotot等人，2001)標記線粒體，由此獲得對這一分選有效性的整體確認(Jacotot等人，2001)。簡言之，室溫下將線粒體(1.5μg蛋白質(zhì))重懸于400μl含有200nMMTG的腫脹緩沖液中15分鐘。立即用CellQuest Pro軟件(BectonDickinson)在細胞計數(shù)器中分析細胞器。使用電壓調(diào)至907的PMT將MTG熒光聚集在FL-1信道(530+/-15nm)中并以對數(shù)放大方式分析。記錄并分析了來自20,000個分選的線粒體的數(shù)據(jù)。
用流式細胞術(shù)對線粒體形態(tài)學(xué)狀態(tài)做的定時和實時分析用前向散射(FSC)光電二極管通過細胞器在低角度下的光散射分析線粒體大小。信號用E-00裝置收集，對數(shù)擴大率為5.41。通過垂直方向的光散射評估線粒體結(jié)構(gòu)。用電壓為581、且線性放大率(gain)調(diào)至4.27的敏感側(cè)向散射(SSC)光電倍增器管(PMT)來評估。純化線粒體的與腫脹相關(guān)的形態(tài)學(xué)變化通過線粒體大小(FSC)的增加和細胞器結(jié)構(gòu)的減少(SSC)用CellQuest Pro軟件監(jiān)測。用FCS Assistant軟件計算FSC/SSC比率，該比率允許將大小和結(jié)構(gòu)兩個變量整合到僅一個參數(shù)中。
FSC主要根據(jù)總體線粒體大小確定。根據(jù)所建議的模型來計算光散射特性(得自Rayleigh-Debye-Gans近似值)，人們可以想到，線粒體基質(zhì)折射系數(shù)的變化也影響FSC。
對100μl腫脹緩沖液中含有10μg蛋白質(zhì)的線粒體樣品做了定時分析。樣品用MPP-誘導(dǎo)劑于25℃處理30分鐘。立即將樣品用流式細胞術(shù)分析，并記錄來自20.000個線粒體的數(shù)據(jù)。根據(jù)前向散射確定的特定腫脹百分數(shù)計算如下(FSCCa2+-FSCReagent)×100/(FSCCa2+-FSCCo)，F(xiàn)SCCa2+、FSCReagent和FSCCo分別為對應(yīng)于獲自用CaCl2處理的、試劑處理的和未處理的線粒體的FSC值。類似計算用于確定對SSC和FSC/SSC比率數(shù)值的特定腫脹百分數(shù)。
對800μl腫脹緩沖液中含有1.5μg蛋白質(zhì)的線粒體樣品(＝2ng/□1)做了實時實驗。樣品用流式細胞計數(shù)器捕獲五分鐘以記錄基礎(chǔ)形態(tài)學(xué)標準。之后將試劑加入樣品中，并記錄隨后15分鐘的光散射變化。對定時和實時分析樣品流速均固定為12μl+/-3μl/min。
繪制出FSC或SSC參數(shù)相對于時間的圖表后得到腫脹曲線，時間刻度為1分鐘的不連續(xù)間隔。得自各間隔線粒體的平均FSC和SSC是用CellQuest Pro軟件計算的，并輸入Microsoft Excel軟件。
用流式細胞術(shù)對分離的線粒體中的Δψm做的定時和實時分析通過5，5′，6，6′，-四氯-1，1，3，3′-四乙苯并咪唑羰花青吲哚(JC-1，Molecular Probes)的摻入估計線粒體跨膜電勢(Δψm)。該電勢敏感型陽離子染料在線粒體基質(zhì)中根據(jù)Nernst方程式(Reers等人，1991)積累。與JC-1單體相關(guān)的JC-1綠色熒光收集在FL-1信道中。與J-凝聚物形成相關(guān)的JC-1桔色熒光收集在FL-2信道(585+/-21nm)中(Reers等人，1991)。利用電壓分別調(diào)至907和622的PMT，兩種熒光都以對數(shù)放大模式記錄。通過調(diào)節(jié)如下調(diào)節(jié)補償網(wǎng)絡(luò)來避免光譜重疊FL1-18.5％FL2和FL2-25.4％FL1。JC-1桔色/綠色熒光比率用FCS輔助軟件計算。
對100μl腫脹緩沖液中含有10μg蛋白質(zhì)的線粒體樣品進行對Δψm的定時檢測。將樣品于25℃用MPT-誘導(dǎo)藥物處理15分鐘，以800nM在37℃下黑暗中加入JC-1。立即用流式細胞術(shù)分析樣品，并記錄獲自20.000個線粒體(基于FSC-SSC參數(shù)分選)的數(shù)據(jù)。該檢測方法可以對高度能量化的線粒體(同時具有桔色和綠色熒光)和去極化的線粒體(僅帶綠色熒光)的百分比進行定量，如附圖1的部分C2所示。
對400μl腫脹緩沖液中含有1.5μg蛋白質(zhì)的線粒體樣品進行對Δψm的實時監(jiān)控。以400nM載入JC-137℃保持15分鐘。之后加入400μl腫脹緩沖液，將樣品捕獲在流式細胞計數(shù)器上4分鐘以記錄基礎(chǔ)Δψm。之后向樣品中添加藥物，在接下來的16分鐘記錄Δψm變化。根據(jù)前面對腫脹曲線的所記載的繪制去極化曲線；時間刻度劃分為不連續(xù)的1分鐘時間段，用CellQuest Pro軟件計算相應(yīng)線粒體亞組的JC-1桔色和JC-1綠色熒光的平均值并輸入Microsoft Excel軟件。
電子顯微術(shù)將線粒體在0.1M Soerensen緩沖液(0.1M磷酸鹽，pH＝7.2)(Prolabo，F(xiàn)ontenay sous Bois，F(xiàn)rance)中的3.2％戊二醛(Sigma，St Quentin Fallavier，F(xiàn)rance)中4℃固定16小時。之后，將線粒體在0.1M Soerensen緩沖液pH＝7.2中洗滌一次，在0.1M二甲基砷酸鹽緩沖液pH＝7.2(Prolabo)中洗滌兩次。室溫下將樣品用含有1％OSO4酸(Ubichem)的0.1M二甲基砷酸鹽緩沖液固定1小時。線粒體在0.2M二甲基砷酸鹽緩沖液中的1％OSO4酸(Ubichem)中洗滌三次后，線粒體在30％甲醇中脫水，用2％乙酸雙氧鈾(Merck，F(xiàn)ontenaySous Bois，F(xiàn)rance)在30％甲醇中染色，在一系列乙醇溶液(50-100％)中脫水。之后將樣品在氧化丙稀中孵育15分鐘，包埋在環(huán)氧(Epon812，Merck)中。樣品用Leica超薄切片機切片后，用乙酸雙氧鈾和Pb-citrate(Merck)染色。用Jeol 1200EX顯微鏡觀察。
Caspase-3活化和凋亡的檢測用CaspaTag TM試劑盒(Intergen)中的caspase-3(FLICA，F(xiàn)AM-DEVD-FMK)的熒光抑制劑進行Caspase-3活化。根據(jù)7-氨基放射菌素D(7-AAD)摻入(SIGMA)來測定HeLa細胞凋亡過程中出現(xiàn)的質(zhì)膜完整性喪失。向細胞中加入20mg/ml 7-AAD于37℃保持15分鐘。將細胞用胰蛋白酶消化，并重懸于PBS中，立即捕獲于FACSCalibur上。用F1-1信道檢測FAM-DEVD-FMK相關(guān)熒光。7-AAD熒光收集在F1-3信道(＞650nm)中。
用熒光顯微術(shù)檢測凋亡HeLa細胞用1μM和Hoechst 33-342JC-1染色15分鐘，并用DM IRB倒置熒光顯微鏡(Leica)觀察。
統(tǒng)計分析通過線性回歸分析計算相關(guān)性。p值＜0.05視為顯著。對各分析，給出R2。


附圖1用細胞熒光測定法鑒定分離的線粒體。A.對分離的小鼠肝臟線粒體的超微結(jié)構(gòu)觀察。示出了代表性電子顯微圖。B.流式細胞術(shù)測定肝臟線粒體大小(前向散射(Forward Scatter)，F(xiàn)SC)和粒度(側(cè)向散射(Side Scatter)，SSC)。適當?shù)腇SC(對數(shù)刻度)和SSC(線性刻度)設(shè)置使得能夠檢測低SSC和變化FSC的事件(區(qū)域1)、以及具有變化的SSC和均一FSC(橢圓形門，區(qū)域2)的事件。C.各區(qū)域的線粒體含量。用Δψm-不敏感性線粒體染料MitoTrackerGreen(MTG，200nM，黑色柱狀圖)對線粒體染色，平行與未染色樣品(Co.灰線)。對各選擇區(qū)域(MTG)標出了被標記線粒體(MTG+事件)的百分數(shù)。D.純化線粒體中Δψm狀態(tài)的估計。將分離的線粒體用Δψm-敏感性熒光染料JC-1(800nM)處理15分鐘，并在FL-1和FL-2兩個信道中流式細胞術(shù)測定熒光。給出了各信號區(qū)中的事件百分數(shù)。位于區(qū)域1(在B中定義)中的事件保持不被MTG和JC-1染色并相應(yīng)于噪音背景，而區(qū)域2(在B中定義)相應(yīng)于95.5％具有高能化狀態(tài)的線粒體(90.5％JC-1桔色線粒體)。
附圖2通過定時流式細胞術(shù)估計線粒體腫脹的劑量應(yīng)答將Ca2+以指定的劑量加到純化線粒體中。A.Ca2+誘導(dǎo)劑量依賴型SSC減少和FSC增加(FSC平均值和SSC平均值以散布圖表示)。注意到，經(jīng)Ca2+-處理的線粒體群體在FSC-SSC散布圖的右側(cè)和內(nèi)部形成一個特征性的“類似于新月形”的形狀。B.用分光光度法和流式細胞術(shù)分析由Ca2+-誘導(dǎo)的線粒體腫脹的比較分析(FSC和SSC參數(shù))。在10μMCsA存在和不存在下將線粒體用Ca以指定劑量處理30分鐘。C.545nm的吸光度相對于FSC/SSC比率的比較分析。D.ΔFSc和ΔA545間的線性相關(guān)。ΔA545，對應(yīng)于未處理樣品和經(jīng)Ca2+處理監(jiān)控30分鐘后的吸光度差異。ΔFSc和ΔSSC對應(yīng)于對FSC和SSC參數(shù)的相似計算。E.ΔSSC和ΔA545間的線性相關(guān)性。C和D部分表示，用FSC增加和SSC減少評估的線粒體腫脹與545nm處的吸光度下降顯著相關(guān)。
附圖3通過流式細胞術(shù)對Ca2+誘導(dǎo)的腫脹做的定時與實時檢測。
A、C線粒體在存在(A)或不存在(C)30μM Ca2+下孵育20分鐘后的定時分析。示出了代表性散點圖(SSC/FSC)分析和電子顯微圖。B、D不存在(B)或存在(D)30μM Ca2+下對FSC(左)、SSC(中)、和FSC/SSC比率(右)的實時監(jiān)控。記錄了5分鐘的FSC、SSC、和FSC/SSC比率基礎(chǔ)水平。之后，加入30μM Ca(垂直箭頭)，之后的15分鐘監(jiān)控形態(tài)學(xué)變化。白線對應(yīng)于平均FSC、SSC和FSC/SSC值。在各實時散點圖下面，計算出了線粒體變化的速率(ΔFSC/min+/-SD，ΔSSC/min+/-SD，和ΔFSC/SSC/min+/-SD；n＝7)。
附圖4對PTP-依賴型和PTP-非依賴型線粒體腫脹的細胞熒光法實時探測。
(A和B)用流式細胞術(shù)和分光光度法監(jiān)控的線粒體腫脹時間進程。對照線粒體，和用20μM mClCCP、30μM Ca2+、和5μM丙甲甘肽處理的樣品。在添加Ca2+前用10μM CsA預(yù)處理線粒體5分鐘，由此進行CsA抑制實驗。箭頭表示相應(yīng)分子的添加。A.平均FSC(黑色曲線)和SSC(灰色曲線)值記錄了20分鐘。B.通過分光光度法測量的545nm處的吸光度(經(jīng)典的腫脹檢測方法)。C.對由30μM Ca2+誘導(dǎo)的線粒體腫脹的實時監(jiān)控，通過FSC/SSC比率(黑線)相對于545nm處的吸光度(灰線)來評估。D.FSC/SSC比率變化的速率(黑線，灰色柱形圖)相對于545nm處的吸光度(灰線)。平均值和標準差獲自七個獨立實驗。
附圖5JC-1在分離的線粒體中的實時摻入記錄兩分鐘線粒體的基礎(chǔ)自身熒光。之后，將線粒體暴露于Δψm-敏感性線粒體染料JC-1(400nM)，接下來用細胞熒光測定兩色分析23分鐘。A.JC-1的時間-依賴型摻入。白色曲線對應(yīng)于JC-1綠色(上圖；FL-1)和桔色熒光(下圖；FL-2)的平均值。注意到，JC-1桔色熒光(J-凝集物形成)在孵育15-20分鐘后達到一個平臺。B.對JC-1摻入的散點圖FL-1/FL-2分析。將記錄下的事件(A.)作為以下時間段中所發(fā)生事件的總和進行再次分析0-2分鐘(基礎(chǔ)自身熒光)、2-8分鐘、8-14分鐘、14-20分鐘和20-25分鐘。適當?shù)男盘枀^(qū)允許對未染色、單染色、和雙重染色線粒體的百分數(shù)進行定量。
附圖6用流式細胞術(shù)實時監(jiān)控Δψm對JC-1桔色熒光(A.和B.)、JC-1綠色熒光(C.和D.)和FSC/SSC比率(E.和F.)的實時共監(jiān)控。將加載了JC-1的線粒體暴露于或者不暴露于(Co.)20μM mClCCP、30μM Ca2+、或5μM丙甲甘肽。示出時間-F1-2(A.)和時間-F1-1(C.)散點圖。箭頭表示加入藥物的時刻。示出了熒光的最后和初始平均值間的差異(Δ)。去極化曲線(B.、D.和F.)獲自對應(yīng)的散點圖(事件的平均值以每分鐘為基礎(chǔ))，并以線性刻度表示。
附圖7通過實時流式細胞術(shù)共監(jiān)控經(jīng)Ca2+處理的線粒體中的SSC和Δψm將純化的線粒體暴露于30□M Ca2+(A.)或20μM mClCCP(B.)，之后做SSC/FSC定時散點圖分析(1)和實時FCM(2，3，4，5)。1.線粒體用Ca2+或mClCCP處理前和20分鐘后進行分析。橢圓形區(qū)域(紅點)對應(yīng)于完整線粒體，桔色點(區(qū)域外的所有事件)對應(yīng)于腫脹線粒體。2.時間-SSC散點圖分析。3.時間-FL-2(JC-1桔色熒光)散點圖分析。注意，添加Ca2+后(A.中的箭頭)，線粒體保持紅色(也即，在1中所定義的橢圓形區(qū)域內(nèi))幾秒鐘，并在內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化和Δψm崩潰的同時迅速變?yōu)榻凵?。添加Ca2+七分鐘后達到穩(wěn)定。4.對比平均SSC和平均Δψm(JC-1桔色熒光)時間應(yīng)答曲線(n＝7+/-SD)。5.SSC和Δψm變化間的相關(guān)性。
附圖8PTP-依賴型和PTP-非依賴型線粒體膜透化的FCM分析將線粒體暴露于50μM BA、10μM Csa、或10μM釕紅5分鐘，之后用Ca2+(30μM)或丙甲甘肽(5μg/ml)處理30分鐘。然后，對線粒體做Δψm(JC-1桔色熒光)和SSC(Mean+/-SD；n＝3)的FCM分析。
附圖9肽SEQ ID N°3誘導(dǎo)MMP。
A.相對于對照肽，評估了分離線粒體的活性和證實的特異性腫脹。B.細胞色素C釋放通過對上清液做蛋白質(zhì)印跡檢測了未處理(1)、或用5μM丙甲甘肽(2)或10μM肽seq.ID N°2處理的線粒體在30分鐘過程中的細胞色素C釋放。
附圖10由MMP調(diào)控肽誘導(dǎo)的細胞凋亡。
將HeLa細胞與5或10μM肽Seq.ID n°3孵育24或48小時，或不經(jīng)處理。A.之后用JC-1和Hoechst染料對細胞染色。通過免疫熒光顯微鏡觀察并對JC-1低的細胞以及核濃縮進行計數(shù)(3次實驗的平均值)。B.細胞熒光顯微術(shù)，與或不與5μM肽孵育24小時并用JC-1染料染色后。C.與B相同的條件，并用7AAD染色，以及利用FACS分析探測Caspase 3活性。D.對7AAD染色的FACS分析。
附圖11Seq ID n°4表現(xiàn)出線粒體細胞毒性。
向HeLa細胞添加5或10μM肽序列，并在24和48小時時通過FAX表征凋亡。
附圖12Seq.ID n°3和4的比較細胞毒性效應(yīng)。
將HeLa細胞與5或10μM肽Seq.ID n°3或Seq ID n°4孵育24或48小時，和不經(jīng)處理。A.對7AAD染色的FACS分析。B.與或不與5μM肽孵育24小時并用7AAD染色，以及利用FACS分析探測Caspase 3活性。
附圖13Seq.ID n°5對人內(nèi)皮細胞(HUVEC)的細胞毒性效應(yīng)。
將HUVEC細胞與5或30μM肽Seq.ID n°5、對照肽孵育24至96小時，或不經(jīng)處理。用7AAD染色后通過FACS分析表現(xiàn)凋亡的特征。A.劑量應(yīng)答與對照肽。B.延長與或不與10μM肽孵育的時間并用7AAD染色，并通過FACS分析探測。
權(quán)利要求
1.一種篩選線粒體機能調(diào)節(jié)劑的方法，包括將待被測試化合物添加到純化的分離線粒體制備物中、以及同時采用對線粒體形態(tài)學(xué)的熒光檢測分析，尤其是實時熒光檢測分析，通過染料熒光將形態(tài)計量參數(shù)(SSC/FSC參數(shù))分析與膜完整性分析相結(jié)合。
2.權(quán)利要求1的方法，其中對膜完整性的分析是通過利用JC-1染料表征線粒體跨膜電勢Δψm并研究線粒體膜透性的任何改變來完成的。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中線粒體膜透化機制進一步用比如鈣、CCCP、丙甲甘肽、Bongkrekic acid、釕紅、環(huán)孢菌素A、DIDS這樣的線粒體透性藥理學(xué)誘導(dǎo)物或調(diào)節(jié)劑來表征。
4.權(quán)利要求1至3之中任一項的方法，進一步包括研究內(nèi)源或外源線粒體調(diào)節(jié)劑，比如Bc1-2家族成員和針對PTP-相關(guān)MMP的呼吸抑制劑。
5.權(quán)利要求1至3之中任一項的方法，進一步包括鑒定誘導(dǎo)MMP或防止MMP被其它試劑單獨或結(jié)合誘導(dǎo)的化合物。
6.權(quán)利要求1至5之中任一項的方法，進一步包括設(shè)計和定義新的旨在調(diào)控MMP的試劑。
7.權(quán)利要求1至6中任一項的方法，進一步包括定義和制備實施該方法的試劑或試劑盒。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至4之中任一項的方法，進一步包括表征特定線粒體中的線粒體反應(yīng)性，用于確定來自生理或病理狀態(tài)的各種組織、或病理學(xué)來源比如腫瘤的線粒體中的線粒體機能。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至4之中任一項的方法，進一步包括診斷或表征患有疾病、尤其是遺傳疾病或代謝疾病的患者的線粒體機能。
10.通過利用根據(jù)權(quán)利要求1至4的方法鑒定的、并表現(xiàn)出能夠?qū)Ψ蛛x的線粒體調(diào)控MMP的試劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的肽，具有MMP調(diào)控潛力，選自下組ATLSALLAALRRIQRA (SEQ ID N°1)RKKRRQRRRGGATLSALLAALRRIQRA (SEQ ID N°2)RKKRRQRRRCGGLETRTETWMSSEGAWKQIQKVETWALRH (SEQ ID N°3)RKKRRQRRRCGGLANKKGAWLDSTKATRYLVKTESWILRN (SEQ ID N°4)GG*CRGDMFG*CGGLLFIHFRIGSRHSRIG (SEQ ID N°5)RIEIWILRH(SEQ ID N°6)RIAIWILRH(SEQ ID N°7)RKKRRQRRRGGRIEIWILRH (SEQ ID N°8)RKKRRQRRRGGRIAIWILRH (SEQ ID N°9)EHWSYWLRPGGGLLFIHFRIGCRHSRIG (SEQ ID N°10)EHWSYWLRPGGGGGSLLFIHFRIGCRHSRIG (SEQ ID N°11)及其衍生物。所述肽有利地在C-末端和N末端位置含有穩(wěn)定化基團，比如酰胺烷基或?；鶊F和標記物或連接基團，例如生物素基團。它們還可包括L-或D-氨基酸retro-inverso、還原的肽主鏈、或被翻譯成假肽。本發(fā)明還涉及結(jié)合于肽運輸系統(tǒng)的所述肽，且可選地在所述肽與運輸系統(tǒng)間含有接頭。該肽運輸系統(tǒng)有利地可以是細胞外或細胞內(nèi)靶向序列、抗體或其片段(ScFv)。該接頭可以是允許肽獨立于肽運輸系統(tǒng)采用螺旋結(jié)構(gòu)的序列，可由2至6個比如丙氨酸或甘氨酸這樣的氨基酸、或二硫橋、或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)已知的任何方法形成。所述肽還能通過保留線粒體調(diào)節(jié)能力的插入、缺失或突變進行修飾。
12.通過模擬權(quán)利要求11中所述的肽而獲得的肽，表現(xiàn)出MMP調(diào)控機能的特征，定義如下-包含至少8個氨基酸且可多至50個氨基酸-至少一部分肽結(jié)構(gòu)是兩親性α螺旋，-2、3或4個氨基酸帶正電荷(賴氨酸[K]或精氨酸[R])，且位于螺旋同一側(cè)，-當用螺旋輪描繪該螺旋時，R和/或K氨基酸形成一簇(參見附圖15)，-當被加入純化、分離的線粒體中時，它們誘導(dǎo)出變化(超微結(jié)構(gòu)或膜透性)。這樣的肽的實例選自如下RKKRRQRRRGGGAWKHAQRIEIWILRH(SEQ ID N°12)RKKRRQRRRGGGAWKHAQRIETWILRH(SEQ ID N°13)RKKRRQRRRGGGAWKHAQRVESWILRN(SEQ ID N°14)RKKRRQRRRGGGAWKRACRMETWILRH(SEQ ID N°15)RKKRRQRRRGGGAWKQIQKVETWALRH(SEQ ID N°16)RKKRRQRRRGGGAWRQVEKVETWALRH(SEQ ID N°17)RKKRRQRRRGGGAWKHAQRIAIWILRH(SEQ ID N°18)AWKHAQRIAIWILRH(SEQ ID N°19)GG*CRGDMFG*CGGRIEIWILRH (SEQ ID N°20)GG*CRGDMFG*CGGRIAIWILRH (SEQ ID N°21)GG*CGRGDSPG*CGGRIEIWILRH (SEQ ID N°22)GG*CGRGDSPG*CGGRIAIWILRH (SEQ ID N°23)其中*C＝參與環(huán)狀二硫橋的半胱氨酸EHWSYWLRPGGGRIEIWILRH (SEQ ID N°24)EHWSYWLRPGGGRIAIWILRH (SEQ ID N°25)EHWSYWLRPGGGGGSRIEIWILRH (SEQ ID N°26)EHWSYWLRPGGGGGSRIAIWILRH (SEQ ID N°27)EHWSYWLRPGGGGGSGAWKHAQRIEIWILRH(SEQ ID N°28)EHWSYWLRPGGGGGSGAWKHAQRIAIWILRH(SEQ ID N°29)EHWSYWLRPGGGLLFIHFKIGCKHSKIG (SEQ ID N°30)EHWSYWLRPGGGGGSLLFIHFKIGCKHSKIG(SEQ ID N°31)EHWSYWLRPGGGLLFIHFRIGSRHSRIG (SEQ ID N°32)EHWSYWLRPGGGGGSLLFIHFRIGSRHSRIG(SEQ ID N°33)EHWSYWLRPGGGLLFIHFKIGSKHSKIG (SEQ ID N°34)EHWSYWLRPGGGGGSLLFIHFKIGSKHSKIG(SEQ ID N°35)其中，W6殘基可以被D-氨基酸dw替代。這些肽與權(quán)利要求10中所定義的它們的衍生物一起被要求保護。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種篩選線粒體機能調(diào)節(jié)劑的方法，包括將一種待測試化合物添加到純化的分離線粒體制備物中、以及同時采用對線粒體形態(tài)學(xué)的熒光檢測分析，尤其是實時熒光檢測分析，通過染料熒光將形態(tài)計量參數(shù)(SSC/FSC參數(shù))分析與膜完整性分析相結(jié)合。用于獲得誘導(dǎo)線粒體膜透性的肽的用途。
文檔編號C07K14/47GK1720452SQ200380104774
公開日2006年1月11日 申請日期2003年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月2日
發(fā)明者E·雅克托特, H·勒克伍爾, D·勒伯拉特 申請人:薩拉普托斯股份公司