專利名稱：乙二半胱氨酸(ec)－藥物結(jié)合物、組合物及用于組織特異性疾病顯像的方法
背景技術(shù)：
I.發(fā)明領(lǐng)域概括地說本發(fā)明涉及標(biāo)記、放射顯像、放射性免疫治療和化學(xué)合成領(lǐng)域。更具體地說，它涉及一種放射性標(biāo)記靶配體的策略。它進一步涉及使用這些放射性標(biāo)記的配體靶向腫瘤血管發(fā)生、缺氧、細(xì)胞凋亡、疾病受體、疾病作用途徑和疾病細(xì)胞周期，以及用于評價藥物治療劑在這些生物化學(xué)過程中的效應(yīng)的方法。
II.相關(guān)技術(shù)的描述血管發(fā)生，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖形成新血管，是轉(zhuǎn)移途徑的基本要素。這些血管提供了某些細(xì)胞離開原組織部位并進入循環(huán)的主要路徑。對于許多疾病組織而言，血管密度可以提供潛在或存活的轉(zhuǎn)移的預(yù)后指示物，因為高血管化的腫瘤比血管化不充分的組織具有較高的轉(zhuǎn)移發(fā)生率(Bertolini等，1999；Cao，1999；Smith等，2000)。
通過使用抗血管生成劑阻斷血管發(fā)生和腫瘤發(fā)展也許是可行的。目前，處于臨床試驗階段的抗血管生成劑包括天然的血管發(fā)生抑制劑(例如血管他丁、內(nèi)皮他丁、血小板因子-4)，(Jiang等，2001；Dhanabal等，1999；Moulton等，1999；Jouan等，1999)特異性的內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制劑(例如TNP-470、沙利度胺、白細(xì)胞介素-12)，(Logothetis等，2001；Moreira等，1999；Duda等，2000)中和血管生成肽的藥劑(例如成纖維細(xì)胞生長因子或血管內(nèi)皮生長因子的抗體、蘇拉明及其類似物、tecogalan)(Bocci等，1999；Sakamoto等，1995)或它們的受體，(Pedram等，2001)干擾血管基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的藥劑(例如金屬蛋白酶抑制劑、抑制血管的(angiostatic)甾類化合物)，(Lozonschi等，1999；Maekawa等，1999；Banerjeei等，2000)抗粘著分子，(Liao等，2000)抗體如抗整聯(lián)蛋白αvβ3，(Yeh等，2001)以及其它通過多種不同作用機理調(diào)節(jié)血管發(fā)生的藥物(Gasparini1999)。
例如許多惡性腫瘤是血管發(fā)生依賴性的。若干實驗研究表明原發(fā)腫瘤生長、侵入和轉(zhuǎn)移需要新生血管形成(Sion-Vardy等，2001；Guang-Wu等、2000；Xiangming等，1998)。與腫瘤相關(guān)的血管發(fā)生是一種受正性和負(fù)性可溶性因子支配的復(fù)雜的、多級過程。血管生成表型的獲得是腫瘤發(fā)展的通常途徑，并且活性血管發(fā)生與導(dǎo)致腫瘤發(fā)展的分子機制有關(guān)(Ugurel等，2001)。例如，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種有絲分裂素，成形素，內(nèi)皮細(xì)胞的化學(xué)引誘物和在體內(nèi)是有力的血管穿透性介質(zhì)(Szus等，2000)。白細(xì)胞介素-8(IL-8)是一種嗜中性白細(xì)胞的化學(xué)引誘劑并且是有效的生成血管因子(Petzelbauer等，1995)。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)在幾種人癌癥中與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)(Smith等，1999)。對化療的癌癥患者已經(jīng)測定了血管生成因子表達的預(yù)測值(例如VEGF、bFGF、微血管密度、IL-8、MMP-2和MMP-9)。這些因子調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移和血管發(fā)生并且可以預(yù)測個體癌癥患者轉(zhuǎn)移的可能性(Slaton等，2001)。
在程序性細(xì)胞死亡中細(xì)胞凋亡缺陷在腫瘤發(fā)病機理中起重要作用。這些缺陷允許腫瘤細(xì)胞超過它們的正常預(yù)期壽命而生存，并且不再需要外源性存活因子。當(dāng)腫瘤質(zhì)量膨脹時細(xì)胞凋亡缺陷還保護其免受缺氧和氧化應(yīng)激。它們還使細(xì)胞增殖失控的遺傳變化累積，結(jié)果是在腫瘤發(fā)展過程中干擾分化、血管發(fā)生，細(xì)胞運動性和侵入性增加(Reed，1999)。事實上，細(xì)胞凋亡缺陷被認(rèn)為是一種原癌基因激活的重要補體，因為許多驅(qū)動細(xì)胞分裂喪失調(diào)節(jié)的癌基因蛋白質(zhì)還觸發(fā)細(xì)胞凋亡(Green和Evan，2002)。類似地，DNA修復(fù)和染色體分離缺陷通常觸發(fā)細(xì)胞自殺作為對于根除(readicating)遺傳不穩(wěn)定的細(xì)胞的防衛(wèi)機制。因此，細(xì)胞凋亡缺陷允許遺傳不穩(wěn)定的細(xì)胞繼續(xù)生存，為進行性的侵蝕性克隆的選擇提供了機會(Ionov等，2000)。細(xì)胞凋亡缺陷還通過允許上皮細(xì)胞在懸掛而不附著于細(xì)胞外基質(zhì)的狀態(tài)下繼續(xù)生存而促進轉(zhuǎn)移(Frisch和Screaton，2001)。它們還促進對免疫系統(tǒng)的抵抗，因為許多用于攻擊腫瘤的武器包括溶細(xì)胞的T細(xì)胞(CTL)和自然殺傷細(xì)胞(NK)、依賴細(xì)胞凋亡機器的完整(Tschopp等，1999)。最后，在細(xì)胞凋亡中與癌癥相關(guān)的缺陷在化學(xué)抗性和輻射抗性中起作用，升高了細(xì)胞死亡的閾值從而殺死腫瘤需要較高的劑量(Makin和Hickman，2000)。因此，缺陷的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)是癌癥生物學(xué)的的基本方面。
就通過非外科的方法成功根除癌細(xì)胞而論，所有途徑最終歸結(jié)于血管發(fā)生和細(xì)胞凋亡。目前臨床使用的所有的細(xì)胞毒性抗癌藥基本上都阻斷血管發(fā)生和誘導(dǎo)惡性細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。盡管結(jié)合微管的藥物、DNA損傷物質(zhì)、和核苷是治療癌癥中的重要武器，但新類的靶向治療可能不久會出現(xiàn)。這些新類的靶向治療可能會不久出現(xiàn)，這是建立以下基礎(chǔ)之上的來自對血管發(fā)生和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象基礎(chǔ)分子機制更深刻了解的策略已經(jīng)出現(xiàn)(Reed，2003)。
雖然血管生成因子和細(xì)胞凋亡因子反映了血管發(fā)生和細(xì)胞凋亡狀態(tài)，但這些物質(zhì)可能不能充分反映腫瘤的治療反應(yīng)。目前，評估腫瘤內(nèi)血管發(fā)生和細(xì)胞凋亡的方法依賴對在新生血管形成的區(qū)域內(nèi)微血管密度的計數(shù)和用FACS技術(shù)對錨定蛋白的觀察。在組織活檢之后，進行組織樣品的免疫組織化學(xué)。兩種技術(shù)都是侵入性的并不能重復(fù)地進行。
閃爍腫瘤顯像的改進被更多腫瘤特異放射性藥物的開發(fā)確定。由于腫瘤特異性更強，放射性標(biāo)記的配體和放射性標(biāo)記的抗體已經(jīng)開辟了腫瘤閃爍檢測的新紀(jì)元并且經(jīng)歷了廣泛的臨床前研發(fā)和評價(Mathias等，1996，1997a，1997b)。放射性核素顯像方式(正電子發(fā)射斷層成像，PET；單光子發(fā)射計算機斷層照相，SPECT)是映射放射性核素標(biāo)記的放射性示蹤劑的位置和濃度的診斷性截面顯像技術(shù)。雖然CT和MRI能提供相當(dāng)多的關(guān)于腫瘤的位置和程度的解剖學(xué)信息，但這些顯像方式還不能區(qū)分侵入性損害與水腫、放射壞死、分級(grading)或神經(jīng)膠質(zhì)增生。PET和SPECT可通過測量代謝活性而用于定位和表征腫瘤。FMISO已經(jīng)用于診斷頭部和頸部腫瘤、心肌梗塞、炎癥、以及腦缺血(Martin等1992；Yeh等1994；Yeh等1996；Liu等1994)。腫瘤與正常組織的攝取之比用作評價腫瘤缺氧的基線(Yet等1996)。雖然利用[18F]FDG進行腫瘤代謝顯像被清楚地證實，但將分子成像劑引進臨床實踐還依賴其它因素如容易獲取和同位素成本等。[18F]氟去氧葡萄糖(FDG)已經(jīng)用于診斷腫瘤、心肌梗塞、和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。此外，PET放射合成必須迅速，因為正電子同位素的半衰期短。18F化學(xué)過程是復(fù)雜的并且不能在異類分子中重現(xiàn)。
已經(jīng)利用氮和硫螯合物以99mTc標(biāo)記了幾種化合物(Blondeau等，1967；Davison等，1980)。已知雙氨基乙硫醇四齒配體，也稱作二氨基二硫醇(diaminodithol)化合物，在氧代锝基團與兩個硫醇硫原子和兩個胺氮原子有效結(jié)合的基礎(chǔ)上形成很穩(wěn)定的Tc(V)0絡(luò)合物。用99mTc-2-吡咯硫酮(pyrrolthiones)標(biāo)記的2-pyrrolthiones的放射性金屬絡(luò)合物已經(jīng)開發(fā)用作顯像和治療用的放射性藥物(WO0180906A2)。99mTc-L，L-乙二半胱氨酸(99mTc-EC)是近來的成功的N2S2螯合物的例子。EC可以用99mTc容易和高效地標(biāo)記，獲得高的放射化學(xué)純度和穩(wěn)定性，通過主動小管運輸經(jīng)腎排泄(Surma等，1994；VanNerom等，1990，1993；Verbruggen等，1990，1992)。此外，與乙二半胱氨酸(EC)螯合以及與各種配體結(jié)合的99mTc已經(jīng)開發(fā)用作組織特異性疾病的顯像劑、預(yù)測工具或用作將治療劑輸送至哺乳動物體內(nèi)特定部位的工具(WO 0191807A2，AU 0175210A5)。99mTc-EC-螯合物已經(jīng)開發(fā)用于腎顯像和腎功能的檢查(US 5986074和US 5955053)。制備99mTc-EC絡(luò)合物的方法和用于實施所述方法的試劑盒也已經(jīng)開發(fā)(US5268163和WO 9116076A1)。
然而，仍然需要開發(fā)新的物質(zhì)以靶向腫瘤血管發(fā)生、缺氧、細(xì)胞凋亡缺陷、疾病受體、疾病作用途徑、疾病細(xì)胞周期，除此之外還用于評價藥物治療劑對這些生物化學(xué)過程的效應(yīng)。
發(fā)明概述概括地說，本發(fā)明的某些實施方案涉及包含與靶向配體結(jié)合的N2S2螯合物的化合物，其中靶向配體是疾病細(xì)胞周期靶向化合物、腫瘤血管發(fā)生靶向配體、腫瘤細(xì)胞凋亡靶向配體、疾病受體靶向配體、阿密磷定、血管他丁、單克隆抗體C225、單克隆抗體CD31、單克隆抗體CD40、卡培他濱、COX-2、脫氧胞苷酸、富勒烯、赫賽汀、人血清白蛋白、乳糖、促黃體生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙利度胺、鐵傳遞蛋白或三甲基賴氨酸。
本發(fā)明的具體方面包括下式的N2S2螯合物 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8獨立地為H或CH3；R9為H、CH3、疾病細(xì)胞周期靶向化合物、阿密磷定、血管他丁、抗EGF受體受體、單克隆抗體CD31、單克隆抗體CD40、卡培他濱、COX-2、脫氧胞苷酸、富勒烯、赫賽汀、人血清白蛋白、乳糖、促黃體生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙利度胺、鐵傳遞蛋白或三甲基賴氨酸；R10為H、CH3、疾病細(xì)胞周期靶向化合物、阿密磷定、血管他丁、抗EGF受體、單克隆抗體CD31、單克隆抗體CD40、卡培他濱、COX-2、脫氧胞苷酸、富勒烯、赫賽汀、人血清白蛋白、乳糖、促黃體生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙利度胺、鐵傳遞蛋白或三甲基賴氨酸；n為0或1；m為0或1；當(dāng)n為1時，X為水溶性肽、C1-C20烷基、谷氨酸、多聚谷氨酸、天冬氨酸、多聚天冬氨酸、乙酸溴乙酯、乙二胺或賴氨酸，或當(dāng)n為0時，X為直連鍵；當(dāng)m為1時，Y為水溶性肽、C1-C20烷基、谷氨酸、多聚谷氨酸、天冬氨酸、多聚天冬氨酸、乙酸溴乙酯、乙二胺或賴氨酸，或當(dāng)m為0時，Y為直連鍵；且M為99mTc、188Re、186Re、183Sm、166Ho、90Y、89Sr、67Ga、68Ga、111In、183Gd、59Fe、225Ac、212Bi、211At、45Ti、60Cu、61Cu、67Cu、64Cu或62Cu。
在優(yōu)選的實施方案中，如前所述的化合物，其中R9和R10獨立地為H、CH3、COX-2、抗EGF受體、赫賽汀、血管他丁或沙利度胺；且M為99mTc。
在另一優(yōu)選的實施方案中，如前所述的化合物，其中所述的疾病細(xì)胞周期靶向化合物為腺苷或噴昔洛韋。
血管發(fā)生靶向是指用某種試劑與新生血管形成，如腫瘤細(xì)胞的新生血管形成相結(jié)合。下面的說明書對此進行更詳細(xì)的論述。用于該用途的試劑為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的用于進行各種腫瘤測量，包括腫瘤血管床尺寸的測量、和腫瘤體積的測量的試劑。其中一些試劑與血管壁結(jié)合。一個本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將熟悉可用于該用途的試劑。
腫瘤細(xì)胞凋亡靶向是指用試劑與經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞或有細(xì)胞凋亡危險性的細(xì)胞結(jié)合。這些試劑通常用于提供在一群細(xì)胞，如腫瘤中細(xì)胞凋亡、或程序性細(xì)胞死亡的程度或危險性的指示劑。一個本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將熟悉用于該用途的試劑。在下面的說明書中對腫瘤細(xì)胞凋亡靶向進行更詳細(xì)的論述。
在疾病受體靶向中，開發(fā)了一些配體以便它們能與在疾病狀態(tài)，如腫瘤中過度表達的特異性細(xì)胞受體結(jié)合。這類被作為靶子的受體的例子包括雌激素受體、雄激素受體、垂體受體、鐵傳遞蛋白受體和孕酮受體?？捎糜诩膊?受體靶向的試劑的例子如表1所示。在下面的說明書中對疾病受體靶向進行更詳細(xì)的論述。
疾病細(xì)胞周期靶向是指在增殖細(xì)胞中受增量調(diào)節(jié)的試劑的靶向。用于該用途的化合物可用來測量在細(xì)胞中的各種參數(shù)，如腫瘤細(xì)胞中的DNA含量。這些試劑中有許多是核苷類似物。在下面的說明書中提供關(guān)于疾病細(xì)胞周期靶向的進一步論述。
本發(fā)明的某些基于藥物的配體可用于測量受試者對藥物的藥理反應(yīng)。在測定受試者對藥物應(yīng)用的反應(yīng)中可測量許多參數(shù)。一個本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將熟悉可測量的反應(yīng)的種類。這些反應(yīng)在某種程度上依賴于各種因素，包括所評價的具體藥物、正在接受治療的受試者的具體的疾病或狀況、以及受試者的特性。在測量藥物的評價中可應(yīng)用放射性標(biāo)記的試劑。在本說明書的其它部分中提供關(guān)于藥物評價的進一步論述。
在一實施方案中還原劑可以是連二亞硫酸根離子、亞錫離子或亞鐵離子。放射性核素優(yōu)選99mTc。
在另一實施方案中，疾病細(xì)胞周期靶向化合物是腺苷或噴昔洛韋。
本發(fā)明的另一方面包括顯像哺乳動物體內(nèi)某一部位的方法，其包括步驟a)施用診斷有效量的下式N2S2螯合物 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8獨立地為H或CH3；R9為H、CH3、疾病細(xì)胞周期靶向化合物、阿密磷定、血管他丁、抗EGF受體、單克隆抗體CD31、單克隆抗體CD40、卡培他濱、COX-2、脫氧胞苷酸、富勒烯、赫賽汀、人血清白蛋白、乳糖、促黃體生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙利度胺、鐵傳遞蛋白、或三甲基賴氨酸；R10為H、CH3、疾病細(xì)胞周期靶向化合物、阿密磷定、血管他丁、抗EGF受體、單克隆抗體CD31，單克隆抗體CD40，卡培他濱、COX-2、脫氧胞苷酸、富勒烯、赫賽汀、人血清白蛋白、乳糖、促黃體生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙利度胺、鐵傳遞蛋白、或三甲基賴氨酸；n為0或1；m為0或1；當(dāng)n為1時，X為水溶性肽、C1-C20烷基、谷氨酸、多聚谷氨酸、天冬氨酸、多聚天冬氨酸、乙酸溴乙酯，乙二胺或賴氨酸，或當(dāng)n為0時，X為直連鍵；當(dāng)m為1時，Y為水溶性肽、C1-C20烷基、谷氨酸、多聚谷氨酸、天冬氨酸，多聚天冬氨酸、乙酸溴乙酯、乙二胺或賴氨酸，或當(dāng)m為0時，Y為直連鍵；M為99mTc、188Re、186Re、183Sm、166Ho、90Y，89Sr、67Ga、68Ga、111In、183Gd、59Fe、225Ac、212Bi、211At、45Ti、60Cu、61Cu、67Cu、64Cu或62Cu；和b)檢測源自所述位于部位的化合物的放射性信號。M優(yōu)選99mTc。疾病細(xì)胞周期靶向化合物可以是腺苷或噴昔洛韋。所述部位可以是腫瘤、感染、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜、心臟癌、肺癌、腦癌、肝癌、葉酸(+)癌、ER(+)癌、脾癌、胰腺癌或腸癌。
本發(fā)明的另一方面包括用于制備放射性藥物制劑的試劑盒，其包含a)含預(yù)定量的下式化合物的密封容器 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8獨立地為H或CH3；R9為H、CH3、疾病細(xì)胞周期靶向化合物、阿密磷定、血管他丁、抗EGF受體、單克隆抗體CD31、單克隆抗體CD40、卡培他濱、COX-2、脫氧胞苷酸、富勒烯、赫賽汀、人血清白蛋白、乳糖、促黃體生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙利度胺、鐵傳遞蛋白、或三甲基賴氨酸；R10為H、CH3、疾病細(xì)胞周期靶向化合物、阿密磷定、血管他丁、抗EGF受體、單克隆抗體CD31，單克隆抗體CD40，卡培他濱、COX-2、脫氧胞苷酸、富勒烯、赫賽汀、人血清白蛋白、乳糖、促黃體生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙利度胺、鐵傳遞蛋白、或三甲基賴氨酸；n為0或1；m為0或1；當(dāng)n為0時X為水溶性肽、C1-C20烷基、谷氨酸、多聚谷氨酸、天冬氨酸、多聚天冬氨酸、乙酸溴乙酯、乙二胺或賴氨酸，或當(dāng)n為0時X為直連鍵；當(dāng)m為1時，Y為水溶性肽、C1-C20烷基、谷氨酸、多聚谷氨酸、天冬氨酸、多聚天冬氨酸、乙酸溴乙酯、乙二胺或賴氨酸，或當(dāng)m為0時，Y為直連鍵；和b)足量的與99mTc、188Re、186Re、183Sm、166Ho、90Y、89Sr、67Ga、68Ga、111In、183Gd、59Fe、225Ac、212Bi、211At、45Ti、60Cu、61Cu、67Cu、64Cu或62Cu結(jié)合的還原性標(biāo)記物。還原性標(biāo)記物可以與99mTc結(jié)合。疾病細(xì)胞周期靶向化合物可以是腺苷或噴昔洛韋。
本發(fā)明的一方面包括一種試劑，該試劑用于制備包含下式N2S螯合物的閃爍顯像劑 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8獨立地為H或CH3；R9為H、CH3、疾病細(xì)胞周期靶向化合物、阿密磷定、血管他丁、抗EGF受體、單克隆抗體CD31、單克隆抗體CD40、卡培他濱、COX-2、脫氧胞苷酸、富勒烯、赫賽汀、人血清白蛋白、乳糖、促黃體生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙利度胺、鐵傳遞蛋白、或三甲基賴氨酸；R10為H、CH3、疾病細(xì)胞周期靶向化合物、阿密磷定、血管他丁、抗EGF受體、單克隆抗體CD31，單克隆抗體CD40、卡培他濱、COX-2、脫氧胞苷酸、富勒烯、赫賽汀、人血清白蛋白、乳糖、促黃體生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙利度胺、鐵傳遞蛋白、或三甲基賴氨酸；n為0或1；m為0或1；當(dāng)n為1時，X為水溶性肽、C1-C20烷基、谷氨酸、多聚谷氨酸、天冬氨酸、多聚天冬氨酸、乙酸溴乙酯、乙二胺或賴氨酸，或當(dāng)n為0時，X為直連鍵；當(dāng)m為1時，Y為水溶性肽、C1-C20烷基、谷氨酸、多聚谷氨酸、天冬氨酸、多聚天冬氨酸、乙酸溴乙酯、乙二胺或賴氨酸，當(dāng)m為0時，Y為直連鍵；且M為99mTc、188Re、186Re、183Sm、166Ho、90Y、89Sr、67Ga、68Ga、111In、183Gd、59Fe、225Ac、212Bi、211At、45Ti、60Cu、61Cu、67Cu、64Cu或62Cu。M優(yōu)選99mTc且疾病細(xì)胞周期靶向化合物優(yōu)選腺苷或噴昔洛韋。
本發(fā)明還涉及評價目的藥劑的藥理學(xué)性質(zhì)的方法，其包括(1)制備該試藥與N2S2螯合物的結(jié)合物，(2)將放射性核素加入到所述的結(jié)合螯合物中形成放射性結(jié)合物；(3)將所述放射性結(jié)合物施用給受試者；和(4)評價該藥劑的藥學(xué)性質(zhì)。目的藥劑可以為藥物治療劑。在某些實施方案中N2S2螯合物為乙二半胱氨酸。受試者可以是任何一種受試者，如實驗動物或人。在某些實施方案中，評價藥劑的藥學(xué)性質(zhì)包括評價藥試劑的生物分布、評價該藥劑的生物穩(wěn)定性、或評價該藥劑的生物消除。
附圖簡述下面的附圖成為本說明書的一部分并被包括在本說明書中以進一步說明本發(fā)明的某些方面。通過參考這些圖中的一個或多個圖結(jié)合本文中給出的具體實施方案的詳細(xì)說明可以更透徹地理解本發(fā)明。


圖1乳腺癌細(xì)胞中99mTc-EC-血管他丁的體外細(xì)胞攝取。
圖2用未標(biāo)記的血管他丁在乳腺癌細(xì)胞中進行的99mTc-EC-血管他丁的體外阻斷研究。
圖3加入未標(biāo)記的血管他丁之后99mTc-EC-血管他丁的抑制百分率。
圖4在攜帶乳腺腫瘤的大白鼠體內(nèi)99mTc-EC-抗血管生成劑的腫瘤攝取。
圖599mTc-EC-抗血管生成劑的腫瘤與肌肉計數(shù)密度之比。
圖699mTc-EC-血管他丁的閃爍顯像圖。
圖799mTc-EC-C225的HPLC色譜圖。
圖8EC-C225和C225的體外比較。
圖9在攜帶A431vulvic腫瘤的裸鼠體內(nèi)99mTc-EC-C225的生物分布圖10在攜帶A431vulvic腫瘤的裸鼠體內(nèi)腫瘤99mTc-EC-C225與組織計算密度之比。
圖11病例研究1對頭部和頸部癌癥的99mTc-EC-C225掃描左頸內(nèi)靜脈二腹肌淋巴結(jié)。
圖12病例研究2對頭部和頸部癌癥的99mTc-EC-C225掃描左舌底和口底。
圖1399mTc-EC-COX-2的合成。
圖14EC-COX-2-酯的NMR光譜數(shù)據(jù)。
圖15EC-COX-2的NMR光譜數(shù)據(jù)。
圖16乳腺癌細(xì)胞中99mTc-EC-試劑的體外細(xì)胞攝取。
圖1799mTc-EC-COX-2的閃爍顯像圖。
圖18EC-沙利度胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖19EC-喹唑啉的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖20氨基噴昔洛韋的合成。
圖21EC-噴昔洛韋(EC-鳥嘌呤)的合成。
圖22人癌細(xì)胞系中99mTc-EC-噴昔洛韋(99mTc-EC-鳥嘌呤)的體外細(xì)胞攝取。
圖2399mTc-EC-噴昔洛韋(99mTc-EC-鳥嘌呤)的閃爍顯像圖。
圖2499mTc-EC-噴昔洛韋(99mTc-EC-鳥嘌呤)的放射自顯影圖。
圖25EC-脫氧胞苷酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖26卡培他濱的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖27EC-腺苷的合成。
圖2899mTc-EC-腺苷的放射自顯影圖。
圖2999mTc-EC-LHRH的閃爍顯像圖。
圖30人卵巢癌細(xì)胞中99mTc-EC-試劑的體外細(xì)胞攝取。
圖3199mTc-EC-LH的閃爍顯像圖。
圖3299mTc-EC-鐵傳遞蛋白的放射自顯影圖。
圖33EC-TML的合成。
圖34EC-TML的質(zhì)譜。
圖35在攜帶乳腺腫瘤的大白鼠體內(nèi)99mTc-EC-TML的生物分布。
圖3699mTc-EC-TML的閃爍顯像圖。
圖37EC-吡哆醛的合成。
圖3899mTc-富勒烯-EC-藥物結(jié)合物的合成。
圖39188Re-EC脫氧葡萄糖的合成。
圖40188Re-EC-甲硝噠唑的合成。
圖41188Re-和99mTc-標(biāo)記的EC-噴昔洛韋(EC-鳥嘌呤)的體外細(xì)胞培養(yǎng)。
圖42188Re-EC-甲硝噠唑的體外細(xì)胞培養(yǎng)。
圖43A-43C99mTc-EC-脫氧葡萄糖(試劑盒制劑)的體外細(xì)胞培養(yǎng)。
示例性實施方案的描述I.本發(fā)明本發(fā)明通過提供新的放射性標(biāo)記的EC結(jié)合物而克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，其中放射性標(biāo)記的EC結(jié)合物被設(shè)計成能靶向腫瘤血管發(fā)生、缺氧、細(xì)胞凋亡缺陷、疾病受體、疾病作用途徑、疾病細(xì)胞周期。這類放射性標(biāo)記的EC結(jié)合物還可以用于評價藥物治療劑對上述的生物化學(xué)過程的效應(yīng)。更具體地說，本發(fā)明提供放射性標(biāo)記的99mTc-EC結(jié)合物以靶向腫瘤血管發(fā)生、缺氧、細(xì)胞凋亡缺陷、疾病受體、疾病作用途徑、疾病細(xì)胞周期，除此之外還用于評價藥物治療劑對這些生物化學(xué)過程的效應(yīng)。
II.放射性藥物在核醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，通過檢測少量的體內(nèi)給藥(internally-administered)的放射性標(biāo)記的示蹤化合物(稱為放射性示蹤劑或放射性藥物)的分布對某些病理狀況進行定位或?qū)ζ涑潭冗M行評價。檢測這類放射性藥物的方法通常是已知的顯像或放射顯像方法。
III.放射顯像方法在放射顯像中，放射標(biāo)記物是放射γ射線的放射性核素并利用檢測γ射線的照相機對放射性示蹤劑定位(這種方法通常稱為γ閃爍法)。顯像的部位是可檢測的，因為要么所選擇的放射性示蹤劑位于病理部位(稱為正反差)，要么所選擇的放射性示蹤劑特異性不位于這些病理部位(稱為負(fù)反差)。
IV.放射性核素各種放射性核素已知用于放射顯像和放射免疫治療，包括67Ga/68Ga、99mTc、111In、123I、125I、169Yb或186Re/188Re。由于顯像特性更好和價格更低，人們已經(jīng)嘗試當(dāng)可能時用相應(yīng)的99mTc標(biāo)記的化合物代替123I、131I、67Ga和111In標(biāo)記的化合物。由于具有有利的物理特性和極低的價格($0.21/mCi)，優(yōu)選99mTc標(biāo)記的放射性藥物。雖然已有報道可用99mTc有效地標(biāo)記DTPA-藥物結(jié)合物(Mathias等，1997)，DTPA基團與99mTc螯合不如與111In螯合穩(wěn)定(Goldsmith，1997)。
對于人體內(nèi)的最佳放射顯像必須考慮許多因素。為了使檢測效率最佳，優(yōu)選放射100-200keV范圍γ能量的放射性核素。為了使患者輻射吸收劑量最小，放射性核素的物理半衰期應(yīng)與提供的顯像過程一樣短。為了允許在任何一天和在一天的任何時候檢測，在臨床中心備有總是可得到的放射性核素源是有利的。99mTc是優(yōu)選的放射性核素，因為它放射140keV的γ射線，具有6小時的物理半衰期，且易于利用鉬-99/锝-99m發(fā)生器(generator)原位獲得。
V.乙二半胱氨酸本發(fā)明利用99mTc-EC結(jié)合物作為標(biāo)記物以靶向腫瘤血管發(fā)生、缺氧、細(xì)胞凋亡缺陷、疾病受體、疾病作用途徑和疾病細(xì)胞周期，除此之外還用于評價藥物治療劑對這些生物化學(xué)過程的效應(yīng)。
與組織靶向配體結(jié)合EC的優(yōu)點是組織靶向配體的特異性結(jié)合性質(zhì)在目標(biāo)區(qū)域集中放射性信號?？梢韵胂笫褂?9mTc-EC結(jié)合物作為標(biāo)記策略與所設(shè)計的配體結(jié)合可能是有效的，其中所述配體用于靶向疾病受體、缺氧、細(xì)胞凋亡途徑、疾病細(xì)胞周期、疾病作用途徑、放射免疫治療，和評價藥物治療劑對這些生物化學(xué)過程的效應(yīng)。本發(fā)明的某些實施方案的例子可見于表1。
表1
VI.99m锝-EC絡(luò)合物99mTc通常由鉬-99/锝-99m發(fā)生器以99mTc高锝酸鹽(Tc04-；+7氧化態(tài)的锝)而獲得。不過，高锝酸鹽不能與其它化合物很好結(jié)合。因此，為了放射標(biāo)記一種化合物必須將99mTc高锝酸鹽轉(zhuǎn)化為別的形式。由于锝在水溶液中不能形成穩(wěn)定的離子，因此它在這樣的溶液中必須保持配位絡(luò)合物的形式，這種配位絡(luò)合物具有足夠的動力學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定性以防止分解和99mTc的最終轉(zhuǎn)化為不溶性二氧化锝或者轉(zhuǎn)回到高锝酸鹽。
就放射性標(biāo)記而言，99mTc絡(luò)合物形成螯合物特別有利，其中包圍锝離子的所有供電子團由單一的螯合配體-在本發(fā)明中為乙二半胱氨酸提供。這就允許螯合的99mTc與組織特異性配體要么直接結(jié)合要么通過乙二半胱氨酸和配體之間的單一連接物結(jié)合。
锝具有許多氧化態(tài)+1、+2、+4、+5、+6和+7。當(dāng)為+1氧化態(tài)時，稱之為Tc MIBI。Tc MIBI必須用加熱反應(yīng)生產(chǎn)(Seabold等1999)。對本發(fā)明而言當(dāng)使用N2S2螯合物時，Tc為+4氧化態(tài)是重要的。該氧化態(tài)對于與EC形成N2S2螯合物是理想的。因此，在與本發(fā)明的藥物結(jié)合物形成放射性锝的絡(luò)合物時，锝絡(luò)合物，優(yōu)選99mTc高锝酸鹽，在還原劑存在的情況下與本發(fā)明的藥物結(jié)合物起反應(yīng)。
優(yōu)選用于本發(fā)明的還原劑為將Tc還原為其+4氧化態(tài)的氯化亞錫(SnCl2)形式的亞錫離子。不過，應(yīng)考慮到其它還原劑，如連二硫酸根離子或亞鐵離子也可以用于本發(fā)明中。還應(yīng)當(dāng)考慮到還原劑可以為固態(tài)的還原劑。還原劑的量可能是重要的，因為必須避免膠體的形成。例如，每約100-約300mCi的Tc高锝酸鹽優(yōu)選使用約10-約100μg SnCl2。最優(yōu)選的量為每約200mCi的Tc高锝酸鹽和約2ml鹽水使用約0.1mg SnCl2。這樣典型地生成足夠在5名患者中使用的Tc-EC-組織特異性配體結(jié)合物。
在組合物中包括抗氧化劑和過渡螯合劑(transition chelator)以防止乙二半胱氨酸氧化通常也是重要的。用于本發(fā)明中優(yōu)選的抗氧化劑是維生素C(抗壞血酸)。不過，應(yīng)考慮到也可以使用其它抗氧化劑如生育酚、吡哆醇、維生素B1或蘆丁。過渡螯合劑的例子包括葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、葡萄糖二酸鹽、枸櫞酸鹽和酒石酸鹽。在某些實施方案中，過渡螯合劑為葡糖酸鹽或葡萄糖二酸鹽，兩者都不干擾乙二半胱氨酸的穩(wěn)定性。
VII.EC配體通常，用于本發(fā)明中的配體要么具有氨基，要么具有羥基，它們能與EC在一個或兩個酸臂(arms)上結(jié)合。倘若氨基或羥基不能獲得(例如酸官能團)，期望的配體還可以采用本發(fā)明的方法通過加入連接物，如乙二胺、氨基丙醇、二亞乙基三胺、天冬氨酸、多聚天冬氨酸、谷氨酸、多聚谷氨酸或賴氨酸與EC結(jié)合和用99mTc標(biāo)記。可考慮用于本發(fā)明的配體包括但不限于血管發(fā)生/抗血管發(fā)生配體、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、糖酵解標(biāo)記物(glycolysis markers)、抗代謝物配體、細(xì)胞凋亡/缺氧配體、DNA嵌入劑、細(xì)胞受體標(biāo)記物、肽、核苷酸、抗微生物劑如抗生素或抗真菌劑、器官特異性配體以及糖或模擬葡萄糖的試劑。
EC本身是水溶性的。本發(fā)明的EC-藥物結(jié)合物也必須是水溶性的。用于本發(fā)明中的許多配體是水溶性的，或當(dāng)與EC結(jié)合時形成水溶性的化合物。不過，若組織特異性配體不是水溶性的，不過可以使用增加配體溶解度的連接物。連接物可以與脂肪醇、芳香醇、胺、肽、羧基、肽或它們的任何一種組合結(jié)合。連接物可以為多聚氨基酸(肽)、氨基酸、丙氨酸精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸鹽、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸或者它們的任何一種組合。更優(yōu)選的連接物可以為谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸或它們的任何一種組合。
還可以構(gòu)想的是本發(fā)明的EC-組織特異性配體藥物結(jié)合物可與其它放射性核素螯合和用于放射性核素治療。通常認(rèn)為事實上任何一種α，β-發(fā)射體、γ-發(fā)射體、或β，γ-發(fā)射體都可用于本發(fā)明中。優(yōu)選的α發(fā)射體包括鉍-213、砹-211和鐳-223。優(yōu)選的β，γ-發(fā)射體包括166Ho、188Re、186Re、153Sm和89Sr。優(yōu)選的β-發(fā)射體包括90Y和225Ac。優(yōu)選的γ-發(fā)射體包括67Ga、68Ga、64Cu、62Cu和111In。優(yōu)選的α-發(fā)射體包括211At和212Bi。還可以構(gòu)想的是順磁性物質(zhì)如Gd、Mn、Cu或Fe可與EC螯合用于本發(fā)明中。
VIII.制備EC絡(luò)合物的試劑盒絡(luò)合物和制備這類絡(luò)合物的工具適宜以試劑盒的形式提供，試劑盒包括裝有將被標(biāo)記的預(yù)定量的本發(fā)明EC-組織特異性配體結(jié)合物和足量的用99mTc標(biāo)記結(jié)合物的還原劑的密封小瓶。本發(fā)明的99mTc標(biāo)記的閃爍顯像劑可通過將適量的99mTc或99mTc絡(luò)合物加入到裝有EC-組織特異性配體結(jié)合物和還原劑的小瓶中并在下文實施例1所述的條件下反應(yīng)來制備。試劑盒還可包含常規(guī)的藥物添加劑，如調(diào)節(jié)滲透壓的藥學(xué)上可接受的鹽、緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑等等。
在某些實施方案中，組合物中含抗氧化劑和過渡螯合劑以防止乙二半胱氨酸氧化。在某些實施方案中，抗氧化劑為維生素C(抗壞血酸)。不過，應(yīng)考慮到也可以使用其它本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的抗氧化劑如生育酚、吡哆醇、維生素B1或蘆丁。用于本發(fā)明中的過渡螯合劑的例子包括但不限于葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、葡萄糖二酸鹽、枸櫞酸鹽和酒石酸鹽。在本發(fā)明的某些實施方案中，過渡螯合劑為葡糖酸鹽或葡萄糖二酸鹽，因為兩者都不干擾乙二半胱氨酸的穩(wěn)定性。試劑盒的組分可為液體、冷凍或干燥的形式。在優(yōu)選的實施方案中，試劑盒組分以冷干的形式提供。
IX.放射性標(biāo)記的試劑本發(fā)明提供的放射性標(biāo)記的試劑或結(jié)合物具有適當(dāng)量的放射活性。形成99mTc放射性絡(luò)合物時，通常優(yōu)選在含濃度為每毫升約0.01毫居里(mCi)至約300mCi放射活性的溶液中形成放射性絡(luò)合物。
本發(fā)明提供的99mTc標(biāo)記的閃爍顯像劑可被用來顯現(xiàn)哺乳動物體內(nèi)的部位。按照本發(fā)明，99mTc標(biāo)記的閃爍顯像劑以單一的可注射的單位劑量應(yīng)用。按照本發(fā)明任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常用載體如無菌鹽水溶液或血漿，都可在放射性標(biāo)記之后使用，用于配制診斷顯像的各個器官、腫瘤等的可注射溶液。通常，將應(yīng)用的單位劑量的放射能為約0.01mCi至約300mCi，優(yōu)選10mCi至約200mCi。以單位劑量注射的溶液為約0.01mL-約10mL。在靜脈內(nèi)注射應(yīng)用之后，如有需要可在放射性標(biāo)記的試劑引入患者體內(nèi)數(shù)小時乃至更長的時間后進行體內(nèi)器官或腫瘤的顯像。大多數(shù)情況上，足量的應(yīng)用劑量便會在約0.1小時內(nèi)聚集于顯像的區(qū)域以允許拍攝γ閃爍圖。按照本發(fā)明用于診斷或預(yù)后的閃爍顯像的任何常規(guī)方法都可使用。
X.99mTc-EC結(jié)合物的應(yīng)用本發(fā)明的99mTc-EC標(biāo)記策略還可用于預(yù)后目的?？梢詷?gòu)想列在表1中的EC-結(jié)合物可給患腫瘤的患者應(yīng)用?？梢詷?gòu)想使用99mTc-EC與配體作為標(biāo)記策略可能是有效的，其中所述配體被設(shè)計用于靶向疾病受體、缺氧標(biāo)記物、細(xì)胞凋亡缺陷、疾病細(xì)胞周期、疾病作用途徑，和評價藥物治療劑對這些生物化學(xué)過程的效應(yīng)?？蛇M行顯像以確定99mTc-EC-結(jié)合物對抗與疾病受體、缺氧標(biāo)記物、細(xì)胞凋亡缺陷、疾病細(xì)胞周期、疾病作用途徑相關(guān)的患者具體問題的有效性，和評價藥物治療劑對這些生物化學(xué)過程的效應(yīng)。用這種方法醫(yī)生能迅速確定哪一種99mTc-EC-結(jié)合物將對于患者最有效并設(shè)計相應(yīng)的療法或治療模式。這種新方法代表一種對目前選擇藥物和實施一輪化療的方法的顯著改進，原來的方法在癌癥化療劑的有效性能被確定之前可能花費患者幾個月的時間和相當(dāng)?shù)馁M用。
本發(fā)明還可以用于監(jiān)測成功經(jīng)受了化療或輻射處理的前述患者的病情發(fā)展以確定癌癥是否減輕或正在轉(zhuǎn)移。有癌癥家族歷史或已經(jīng)確診為攜帶與癌癥有關(guān)的基因的人們可以接受健康專家使用本發(fā)明的方法進行的監(jiān)測。本發(fā)明的方法和藥物治療劑還可以由健康專業(yè)人員使用以監(jiān)測癌癥是否已經(jīng)在由暴露于致癌因子的環(huán)境而有患癌癥危險因素的人體內(nèi)開始發(fā)展。
XI.腫瘤血管發(fā)生靶向在整篇申請中，“腫瘤血管發(fā)生靶向”是指用試劑與腫瘤新生血管形成和腫瘤細(xì)胞結(jié)合。用于該用途的試劑為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的用于進行各種腫瘤測量，包括腫瘤血管床尺寸的測量、和腫瘤體積的測量的試劑。其中一些試劑與血管壁結(jié)合。一個本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將熟悉可用于該用途的試劑。腫瘤血管發(fā)生靶向配體是一種用于如上定義的腫瘤血管發(fā)生靶向的配體。這類試劑的例子包括99mTc-EC-西樂葆(EC-COX-2)、99mTc-EC-C225、99mTc-EC-赫賽汀、99mTc-EC-血管他丁，99mTc-EC-沙利度胺已經(jīng)開發(fā)用于評價血管發(fā)生的生化過程。
XII.腫瘤細(xì)胞凋亡靶向“腫瘤細(xì)胞凋亡靶向”是指用一種試劑與經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞或有細(xì)胞凋亡危險性的細(xì)胞結(jié)合。這些試劑通常用于提供在一群細(xì)胞，如腫瘤中，細(xì)胞凋亡、或程序性細(xì)胞死亡的程度或危險率的指示劑。一個本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將熟悉用于該用途的試劑。細(xì)胞凋亡靶向試劑的例子如表1所示?！澳[瘤細(xì)胞凋亡靶向配體”是一種能進行在該段中定義的腫瘤細(xì)胞凋亡靶向的配體。本發(fā)明的靶向配體可包括TRAIL，它是與TNF相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體，是在各種轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中快速誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的腫瘤壞死因子配體家族的成員之一。本發(fā)明的靶向配體還可包括半胱天冬酶-3靶向配體。
細(xì)胞凋亡抑制因子是用于藥物發(fā)現(xiàn)的靶子，其概念是廢除它們的細(xì)胞保護作用且對腫瘤細(xì)胞恢復(fù)細(xì)胞凋亡敏感性(Reed，2003)。
XIII.疾病受體靶向在“疾病受體靶向”中，開發(fā)了一些試劑以便它們能與在疾病狀態(tài)如腫瘤中，過度表達的某些細(xì)胞受體結(jié)合。這類被作為目標(biāo)的受體的例子包括雌激素受體、雄激素受體、垂體受體、鐵傳遞蛋白受體和孕酮受體?？捎糜诩膊?受體靶向的試劑的例子如表1所示。
放射性標(biāo)記的配體，如噴曲肽、善得定、鐵傳遞蛋白和垂體肽，與細(xì)胞受體結(jié)合，其中一些細(xì)胞受體在某些細(xì)胞上過度表達。因為這些配體不是免疫原性的且能迅速從血漿中清除，與抗體顯像相比受體顯像似乎更有前途。
在本發(fā)明中，發(fā)明人發(fā)展了一系列新的受體配體。這些配體是99mTc-EC-促黃體生成激素(99mTc-EC-LH)和99mTc-EC-鐵傳遞蛋白。
XIV.疾病細(xì)胞周期靶向用于體內(nèi)測量細(xì)胞增殖的基于基因的類似物已經(jīng)由PET證實(Alauddin等，2001)。
疾病細(xì)胞周期靶向是指在增殖細(xì)胞中受增量調(diào)節(jié)的試劑的靶向。用于該用途的化合物可用來測量在細(xì)胞中的各個參數(shù)，如腫瘤細(xì)胞中的DNA含量。
這些試劑中有許多是核苷類似物。例如，嘧啶核苷(例如，2′-氟-2′-脫氧-5-碘-1-β-D-阿拉伯呋喃糖尿嘧啶[FIAU]、2′-氟-2′-脫氧-5-碘-1-β-D-核呋喃糖-尿嘧啶[FIRU]、2′-氟-2′-5-甲基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖尿嘧啶[FMAU]、2′-氟-2′-脫氧-5-碘代乙烯基-1-β-D-核呋喃糖尿嘧啶[IVFRU])和無環(huán)鳥苷9-[(2-羥基-1-(羥甲基)乙氧基)甲基]鳥嘌呤(GCV)和9-[4-羥基-3-(羥甲基)丁基]鳥嘌呤(PCV)(Tjuvajev等，2002；Gambhir等，1998；Gambhir等，1999)及其它18F-標(biāo)記的無環(huán)鳥苷類似物，如8-氟-9-[(2-羥基-1-(羥甲基)乙氧基)甲基]鳥嘌呤(FGCV)(Gambhir等，1999；Namavari等，2000)、8-氟-9-[4-羥基-3-(羥甲基)丁基]鳥嘌呤(FPCV)(Gambhir等，2000；Iyer等，2001)、9-[3-氟-1-羥基-2-丙氧基甲基]鳥嘌呤(FHPG)(Alauddin等，1996；Alauddin等，1999)、和9-[4-氟-3-(羥甲基)丁基]鳥嘌呤(FHBG)(Alauddin和Conti，1998；Yaghoubi等，2001)已經(jīng)開發(fā)為報道分子底物用于顯像野生型和突變型(Gambhir等，2000)HSV1-tk的表達顯像。一個本領(lǐng)域或普通技術(shù)人員將熟悉這些試劑及其它用于疾病細(xì)胞周期靶向的試劑。
在本發(fā)明中，發(fā)明人發(fā)展了一系列疾病細(xì)胞周期靶向配體。例如，這些配體包括99mTc-EC-腺苷和99mTc-EC-噴昔洛韋(EC-鳥嘌呤)。
XV.藥物評價本發(fā)明的某些基于藥物的配體可用于測量受試者對藥物的藥理學(xué)反應(yīng)。在測定受試者對藥物應(yīng)用的反應(yīng)中可測量許多參數(shù)。一個本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將熟悉可測量的反應(yīng)的種類。這些反應(yīng)在某種程度上依賴于各種因素，包括所評價的具體藥物、正在接受治療的受試者的具體疾病或狀況、以及受試者的特性。在測量藥物的評價中可應(yīng)用放射性標(biāo)記的試劑。
在本發(fā)明中，發(fā)明人發(fā)展了一種新的基于藥物的配體99mTc-EC-肉毒堿(Taggart等，1999)。這些試劑的其它例子如表1所示。
XVI.藥物制劑本發(fā)明的藥物組合物含有效量的放射性標(biāo)記的乙二半胱氨酸衍生物，或更具體為99mTc-EC衍生物或溶解或分散于藥學(xué)上可接受的載體中的其它試劑。短語“藥學(xué)上可接受的”是指分子實體和組合物當(dāng)適當(dāng)?shù)貞?yīng)用到動物(如人)時不產(chǎn)生有害的、過敏的或其它不良反應(yīng)。根據(jù)目前的公開含至少一種放射性標(biāo)記的乙二半胱氨酸衍生物或其它活性成分的藥物組合物將為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，如Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版Mack Printing Company，1990所示例的，該書在此引入作為參考。此外，對于動物(例如人)的施用，應(yīng)當(dāng)理解制劑應(yīng)該滿足FDA Office的生物制品標(biāo)準(zhǔn)所要求的無菌、致熱原性、一般的安全隆和純度標(biāo)準(zhǔn)。
本文中使用的“藥學(xué)上可接受的載體”包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩(wěn)定劑、凝膠劑、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、矯味劑、著色劑、類似的物質(zhì)以及它們的組合，上述物質(zhì)為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知(例如，參見Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，MackPrinting Company，1990，第1289-1329頁，在此引入作為參考)。除任何與活性成分不相容的常規(guī)載體之外，都可考慮將其應(yīng)用在治療或藥物組合物中。
放射性標(biāo)記的乙二半胱氨酸衍生物可含不同類型的載體，取決于它是否將以固體、液體或氣霧劑的形式應(yīng)用以及對于該給藥途徑如注射是否必須是無菌。本發(fā)明的制劑可以靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、內(nèi)傷部位、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)(intravitreally)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部地、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、囊泡內(nèi)(intravesicularlly)、粘膜、心包內(nèi)、臍內(nèi)(intraumbilically)、眼內(nèi)、經(jīng)口地、局部地、局部(locally)、注射、輸注、連續(xù)輸注、直接局部灌注浸浴靶細(xì)胞、經(jīng)導(dǎo)管、經(jīng)灌洗、以脂類組合物(例如脂質(zhì)體)的方式給藥，或通過其它方法或上述為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方式的任何組合方式給藥(例如，參見Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，MackPrinting Company，1990，Mack Printing Company，1990，在此引入作為參考)。
給患者應(yīng)用的本發(fā)明組合物的實際用藥量可由身體和生理因素，如體重、疾病的嚴(yán)重程度、所治療的疾病種類、早先的或并行的治療、患者的特發(fā)病以及有關(guān)給藥途徑而確定?？傊?fù)責(zé)給藥的醫(yī)師將確定組合物中活性成分的濃度和個體受試者的合適劑量。
例如，在某些實施方案中，藥物組合物可含至少約0.1％的放射性標(biāo)記的乙二半胱氨酸衍生物。例如，在其它實施方案中，活性化合物可占單位劑量重量的約2％-約75％，或約25％-約60％，以及其中任何可導(dǎo)出的范圍。在其它非限制性例子中，劑量也可包括每次給藥約0.1mg/kg/體重、0.5mg/kg/體重、1mg/kg/體重、約5mg/kg/體重、約10mg/kg/體重、約20mg/kg/體重、約30mg/kg/體重、約40mg/kg/體重、約50mg/kg/體重、約75mg/kg/體重、約100mg/kg/體重、約200mg/kg/體重、約350mg/kg/體重、約500mg/kg/體重、約750mg/kg/體重，至約1000mg/kg/體重或更高，以及其中任何可導(dǎo)出的范圍。在根據(jù)本文中列舉的數(shù)量可導(dǎo)出的范圍的非限制性例子中，基于上述的數(shù)量可以按約10mg/kg/體重至約100mg/kg/體重等的劑量范圍給藥。
在任何情況下，組合物都可含各種抗氧化劑以阻止一種或多種成分的氧化。另外，防腐劑，如各種抗菌劑和抗真菌劑，可以防止微生物的作用，包括但不限于對羥苯甲酸酯(例如，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞或它們的組合。
放射性標(biāo)記的乙二半胱氨酸衍生物可以游離堿、中性或鹽的形式配制成組合物。藥學(xué)上可接受的鹽包括由無機堿例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或如異丙胺、三甲胺、組氨酸或普魯卡因這樣的有機堿與游離的羧基產(chǎn)生的鹽。
在組合物為液態(tài)形式的實施方案中，載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)、脂類(例如甘油三酯、植物油、脂質(zhì)體)以及它們的組合。適當(dāng)?shù)牧鲃有钥梢酝ㄟ^下述方式維持例如通過利用包衣如卵磷脂；通過維持在載體如液態(tài)的多元醇或脂類中分散的所要求的粒徑；通過利用表面活性劑如羥丙基纖維素；或諸如此類方法的組合。在很多情況下，優(yōu)選包括等滲劑，如糖、氯化鈉或它們的組合。
無菌可注射的溶液制備如下將在所需量的合適溶劑中的放射性標(biāo)記的乙二半胱氨酸衍生物根據(jù)需要與上文列舉的不同量的其它組分混合，之后過濾滅菌。通常，分散體通過將各種滅菌的活性成分摻入到含堿性分散介質(zhì)和/或其它組分的無菌賦形劑中來制備。在用于配制無菌可注射的溶液、混懸液或乳劑的情況下，優(yōu)選的制備方法為真空干燥或冷凍干燥技術(shù)，它們能由預(yù)先無菌過濾的液體介質(zhì)產(chǎn)生活性成分加任何其它所需組分的粉末。必要時液體介質(zhì)應(yīng)適當(dāng)?shù)鼐彌_且在注射之前液體稀釋劑首先用足量的鹽或葡萄糖調(diào)至等滲。也可考慮制備用于注射的高度濃縮的組合物，在這種情況下可以構(gòu)想使用DMSO作為溶劑以產(chǎn)生非常迅速的滲透、將高濃度的活性劑輸送至小區(qū)域內(nèi)。
組合物在制備和貯存的條件下必須是穩(wěn)定的，且必須防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染。應(yīng)理解內(nèi)毒素污染最低應(yīng)保持在安全限度內(nèi)，例如低于0.5ng/mg蛋白質(zhì)。
在具體的實施方案中，通過在組合物中使用吸收延遲劑，如單硬脂酸鋁、明膠或其組合可以延長可注射組合物的吸收。
XVII.聯(lián)合治療本發(fā)明的一個方面是放射性標(biāo)記的乙二半胱氨酸衍生物可與另一種藥劑或治療方法(優(yōu)選另一種癌癥治療法)聯(lián)合使用。放射性標(biāo)記的乙二半胱氨酸衍生物可在其它試劑治療之前或之后間隔數(shù)分鐘至數(shù)周使用。在其它試劑和表達構(gòu)建體分開地應(yīng)用于細(xì)胞的實施方案中，通常要確保在各自釋放的時間之間的有效時段不會超出，這樣以使試劑和表達構(gòu)建體還能在細(xì)胞上發(fā)揮有利的聯(lián)合效應(yīng)。例如，在這樣的情況下，應(yīng)考慮可與放射性標(biāo)記的乙二半胱氨酸衍生物基本上同時(即在不到約一分鐘內(nèi))地應(yīng)用兩種、三種、四種或更多種藥征(modalities)接觸細(xì)胞、組織或生物體。另一方面，可將一種或多種藥劑在放射性標(biāo)記的乙二半胱氨酸衍生物給藥之前和/或之后約1分鐘、約5分鐘、約10分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約45分鐘、約60分鐘、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約13小時、約14小時、約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時、約25小時、約26小時、約27小時、約28小時、約29小時、約30小時、約31小時、約32小時、約33小時、約34小時、約35小時、約36小時、約37小時、約38小時、約39小時、約40小時、約41小時、約42小時、約43小時、約44小時、約45小時、約46小時、約47小時，至約48小時或更長時間內(nèi)給藥。在某些其它的實施方案中，藥劑可在放射性標(biāo)記的乙二半胱氨酸衍生物給藥之前和/或之后約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約16天、約17天、約18、約19天、約20天、至約21天內(nèi)給藥。然而，在一些情況下，可能需要顯著延長治療時間，其中各自給藥之間空幾周(例如約1周、約2周、約3周、約4周、約5周、約6周、約7周、約8周或更長時間)。
可以采用不同的組合，放射性標(biāo)記的乙二半胱氨酸衍生物為“A”而第二試劑(可以是任何一種其它的治療劑)為“B”A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A將本發(fā)明的治療性表達構(gòu)建體應(yīng)用給患者將遵循通常的化學(xué)治療給藥的方案，若載體有毒性，應(yīng)注意載體的毒性。可以預(yù)料治療周期將根據(jù)需要重復(fù)。還可考慮各種標(biāo)準(zhǔn)的治療和外科手術(shù)與所述的砷劑聯(lián)合應(yīng)用。這些治療包括但不限于化學(xué)治療、放射治療、免疫治療、基因治療和外科手術(shù)。
a.化學(xué)治療癌癥治療還包括基于化學(xué)藥品和放射線治療的各種聯(lián)合治療。例如，聯(lián)合化療包括順氯氨鉑(CDDP)、卡鉑、丙卡巴肼、氮芥、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安、nitrosurea、放線菌素、柔紅霉素、阿霉素、博來霉素、plicomycin、絲裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫西芬、雷洛昔芬、雌激素受體結(jié)合劑、紫杉酚、吉西他濱、諾維本、法呢基-蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移酶抑制劑、順鉑、5-氟尿嘧啶、新長春堿、長春滅瘟堿和氨甲喋呤、或上述任何一種類似物或衍生物變體。
b.放射治療其它引起DNA損傷并且已經(jīng)廣泛應(yīng)用的因子包括通常被稱為γ-射線、X-射線、和/或直接輸送到腫瘤細(xì)胞的放射性同位素的這些因子。還可考慮其它形式的DNA損傷因子，如微波和紫外線照射。所有這些因子很可能會引起DNA、DNA前體、DNA的復(fù)制和修復(fù)、以及染色體的裝配和維持的廣泛損害。X-射線的劑量范圍為50-200倫琴長期應(yīng)用(3-4周)的每日劑量至2000-6000倫琴的單次劑量。放射性同位素的劑量范圍變化很大，取決于同位素的半衰期、發(fā)射的射線的強度和種類、以及腫瘤細(xì)胞的攝取。術(shù)語“接觸”和“暴露，”當(dāng)應(yīng)用于細(xì)胞時，在本文中用于描述治療性構(gòu)建體和化學(xué)治療劑或放射治療劑被輸送到靶細(xì)胞或被置于與靶細(xì)胞的直接鄰近的方法。為了達到使細(xì)胞殺死或停滯的目的，將兩種治療劑以有效殺死細(xì)胞或阻止其分裂的合并量輸送至細(xì)胞。
c.免疫治療免疫療法通常依賴免疫效應(yīng)細(xì)胞和分子對癌細(xì)胞的靶向和破壞的應(yīng)用。免疫效應(yīng)器可以是例如腫瘤細(xì)胞表面上一些標(biāo)記物的特異性抗體。單獨的抗體可以起治療效應(yīng)器的作用或者它可以招幕其它細(xì)胞去實際上實施細(xì)胞殺死的功能?？贵w也可以與藥物或毒素(化學(xué)治療的、放射性核苷酸、蓖麻毒A鏈、霍亂菌毒素、百日咳毒素等。)結(jié)合而僅僅起靶向劑的作用。另外，效應(yīng)器可以是運載表面分子的淋巴細(xì)胞，其中表面分子與腫瘤細(xì)胞靶直接或間接相互作用。不同的效應(yīng)細(xì)胞包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞。
因此，免疫治療可用作聯(lián)合治療的一部分，與基因治療結(jié)合。聯(lián)合治療的常規(guī)方法在下面論述。通常，腫瘤細(xì)胞一定帶有一些接受靶向作用的標(biāo)記物，即在大部分其它的細(xì)胞上不存在的標(biāo)記物。存在許多腫瘤標(biāo)記物并且在本發(fā)明的上下文中其中任何一種都適合于靶向。常見的腫瘤標(biāo)記物包括癌胚抗原、前列腺特異性抗原、泌尿道腫瘤相關(guān)抗原、胎兒抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、Sialyl Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受體、層粘連蛋白受體、erb B和p155。
d.基因在另一實施方案中，第二治療為另一種基因治療，其中治療性多核苷酸在第一治療劑之前、之后、或同時給藥。將治療劑和編碼基因產(chǎn)物的載體一起輸送將對靶組織有聯(lián)合的抗過度增殖的作用。
e..外科手術(shù)大約60％癌癥患者會進行某些類型的手術(shù)，它包括預(yù)防性、診斷性或腫瘤分類、治療性和緩解性外科手術(shù)治療性外科手術(shù)是一種可以與其他治療如本發(fā)明治療、化學(xué)治療、放射治療、激素治療、基因治療、免疫治療和/或替換治療結(jié)合應(yīng)用。治療性外科手術(shù)包括切除，其中整個或部分癌組織從身體上或部分地移除、摘除、和/或破壞。腫瘤切除是指從身體上的切除至少部分腫瘤。除腫瘤切除之外，外科手術(shù)治療還包括激光手術(shù)、冷凍手術(shù)、電外科手術(shù)、以及錯抄控制(miscopically controlled)的外科手術(shù)(Mohs’外科手術(shù))。可進一步考慮本發(fā)明可以與淺表癌癥(superficial cancers)、初癌、或附帶量組織(incidental amounts of normal tissue)的切除結(jié)合應(yīng)用。
XVIII.EC的合成按照以前描述的方法EC以兩步法合成來制備(Ratner和Clarke，1937；Blondeau等，1967；均在此引入作為參考)。合成其前體L-噻唑烷-4-甲酸(m.p195°，報道值196-197°)。然后制備EC(m.p.237°，報道值251-253°)。通過1H-NMR和快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)確定其結(jié)構(gòu)。
XIX.閃爍顯像和放射自顯像研究在靜脈注射18.5MBq的99mTc-標(biāo)記的放射性示蹤劑0.5、2和4小時后利用配備有低能量、平行孔準(zhǔn)直儀的γ照相機獲得閃爍影像。
通過定量圖像分析儀獲得全身放射自顯影(Cyclone StoragePhosphor System，Packard，Meridian，CI.)。在靜脈注射37MBq的99mTc-EC-葉酸鹽之后，在1小時時將動物殺死并將身體固定于羧甲基纖維素(4％)中。將冷凍的身體置于恒冷切片機(LKB 2250低溫切片機)上并切成100μm冠狀縫切面。將各切面解凍并置于載玻片上。然后使載玻片與多用途磷存儲屏(phosphor storage screen)(MP，7001480)接觸并曝光15小時以進行99mTc-標(biāo)記)。磷屏被紅光激光器激發(fā)，并記錄所產(chǎn)生的藍光，該藍光與先前吸收的能量成比例。
XX.定義本文中使用的術(shù)語“放射性核素”定義為一種在具體的實施方案中能分裂而發(fā)射微粒子或電磁輻射的放射性核素(一種能在可測量的使用壽命內(nèi)存在并且能根據(jù)該原子核的電荷、質(zhì)量、數(shù)量、和量子態(tài)進行區(qū)分的原子種類)。該術(shù)語可以與術(shù)語“放射性同位素”互換使用。
本文中使用的術(shù)語“治療劑”定義為一種為疾病或醫(yī)療的狀況提供治療的藥劑。具體實施方案中的藥劑能改善疾病或醫(yī)療狀況的至少一種癥狀或參數(shù)。例如，在腫瘤治療中，治療劑縮小腫瘤的尺寸、抑制或阻止腫瘤的生長或轉(zhuǎn)移、或消除腫瘤。例子包括藥物，如抗癌藥物、基因治療組合物、放射性核素、激素、營養(yǎng)藥、或它們的組合。
本文中使用的術(shù)語“腫瘤”定義為組織中細(xì)胞不受控制的和累進性生長。專業(yè)技術(shù)人員知道存在其它的同義術(shù)語，如瘤或惡性腫瘤。在具體的實施方案中，腫瘤為實體瘤。在其它的具體實施方案中，腫瘤要么由為原發(fā)瘤要么為源自癌癥轉(zhuǎn)移的形式，這些癌癥如肝、前列腺、胰腺、頭部和頸部、乳房、腦、結(jié)腸、腺、口腔、皮膚、肺、睪丸、卵巢、宮頸、子宮內(nèi)膜、膀胱、胃、以及上皮的癌癥(如疣)。
本文中使用的術(shù)語“藥物”定義為有助于疾病或醫(yī)療狀況的治療，或者能控制或改善任何與疾病或醫(yī)療狀況有關(guān)的生理或病理條件。在具體的實施方案中，藥物為99mTc-EC-藥物結(jié)合物。
本文中使用的術(shù)語“抗癌藥物”定義為用于治療癌癥，例如實體瘤的藥物?？拱┧幬飪?yōu)選地縮小腫瘤的尺寸、抑制和/或阻止腫瘤的生長和/或轉(zhuǎn)移、和/或消除腫瘤。
本文說明書中使用的“一”可以意味著一或多。當(dāng)與“包括”結(jié)合使用時，本文權(quán)利要求書中使用的“一”可以意味著一或一以上。本文中使用的“另一種”可以意味著至少另一種或更多。
XXI.實施例列舉以下實施例以舉例說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解以下實施例中公開的技術(shù)代表發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明的實踐中作用較好的技術(shù)，因此可以被認(rèn)為構(gòu)成其實踐的優(yōu)選方式。然而，根據(jù)本發(fā)明的公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以對公開的具體實施方案進行許多變化并且仍然能獲得相似的結(jié)果。
實施例1用EC-血管他丁靶向整聯(lián)蛋白(αvβ3)a.乙二半胱氨酸(EC)的合成整聯(lián)蛋白(αvβ3)是一種可以用本發(fā)明化合物EC-血管他丁靶向的疾病血管生成靶。按照以前描述的方法以兩步合成來制備EC(Ratner和Clarke，1937；Blondeau等，1967；均在此引入作為參考)。合成其前體，L-噻唑烷-4-甲酸(m.p.195°，報道值196-197°)。然后制備EC(m.p.237°，報道值251-253°)。通過1H-NMR和快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)確定其結(jié)構(gòu)。
b.99mTc-EC-血管他丁的放射合成將碳酸氫鈉(1N，1ml)加入到攪拌的EC溶液(3.27mg，12.2μmol)中。向該無色溶液中加入硫代-N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS，Pierce Chemical Co.，Radford，IL)(3.0mg，13.8μmol)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC，2.0mg，10.5μmol)(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)。然后加入血管他丁(32.7mg，0.93μmol)。將該混合物在室溫下攪拌18小時。將該混合物透析48小時(M.W.截斷值為10,000)。在冷凍干燥后稱量EC-血管他丁重17mg(產(chǎn)率100％)。將99mTc-高锝酸鹽(5.5mCi)(SyncorPharmaceutical Inc，Houston，TX)加入到裝有在0.2ml水中的EC-血管他丁(10μg，0.5nmol)和氯化錫(II)(SnCl2，100g，0.53μmol)冷凍干燥殘留物的小瓶中。將產(chǎn)物用葡聚糖凝膠G-25柱(柱床體積10ml)(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)純化并用PBS(5ml)洗脫。每個試管中收集1毫升洗脫液。分離出第3和4管內(nèi)的產(chǎn)物，得到3.9mCi(70％)。通過射線-TLC掃描器用1M乙酸銨∶甲醇(4∶1)作為洗脫劑評估放射化學(xué)純度(Bioscan，Washington，DC)。使用配備有GPC柱(Biosep SEC-S3000，7.8×300mm，Phenomenex，Torrance，CA)和兩個檢測器(NaI和UV)的高效液相色譜儀(HPLC)分析該產(chǎn)物的純度。洗脫劑為在PBS中的0.1％LiBr(10mM)且流速為1.0ml/min。
c.體外細(xì)胞攝取分析和組織分布研究將不同濃度血管他丁(0-200μM)的體外細(xì)胞培養(yǎng)物用99mTc-EC-血管他丁(4μCi/50,000個細(xì)胞/孔)在0.5-2小時時在RBACRL-1747中孵育。在癌細(xì)胞中加入未作標(biāo)記的血管他丁后99mTc-EC-血管他丁的攝取顯著減少,暗示攝取的受體機制(圖1-2)。血管他丁的IC-50為176μM(R2＝0.998)(圖3)。
對攜帶乳腺腫瘤的大白鼠中的生物分布進行評估(RBACRL-1747，n＝3/時間間隔，靜脈注射)。在移植14-17天之后當(dāng)腫瘤直徑達到大約1cm時進行研究。應(yīng)用放射性示蹤劑之后，在0.5-4小時時將大白鼠處死。將所選擇的組織摘取、稱重并使用γ計數(shù)器(Packard Instruments，Downers Grove，IL)計算放射性強度。各樣品中示蹤劑的生物分布以每克組織濕重中的注射劑量之百分比(％ID/g)計算。99mTc-EC-血管他丁在攜帶腫瘤的大白鼠中的生物分布顯示作為時間函數(shù)的腫瘤與組織計數(shù)密度之比增加(圖4-5)。
d.閃爍顯像研究在0.5-4小時時對攜帶乳腺腫瘤的大白鼠進行閃爍顯像研究(0.3mCi/大鼠，n＝3，靜脈注射)。對照組應(yīng)用99mTc-EC。計算機描繪的目標(biāo)區(qū)域用于測定腫瘤攝取(計數(shù)/像素)和腫瘤/非腫瘤計數(shù)密度之比。平面圖像證實腫瘤可以用放射性標(biāo)記的血管他丁(圖6)清楚地顯現(xiàn)。
許多其它的蛋白質(zhì)和肽也可適于采用實施例1中描述的該技術(shù)。這包括EC-VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)、EC-內(nèi)皮他丁(抗內(nèi)皮細(xì)胞)、EC-干擾素α(抗-FGF)。
實施例2用EC-C225單克隆抗體靶向EGFRa.99mTc-EC-C225的放射合成EGFR是一種可用本發(fā)明化合物99mTc-EC-C225單克隆抗體靶向的疾病血管生成靶。臨床階段的抗-EGF受體R MAb C225(IMC-C225)從ImClone Systems，Inc.(Somerville，NJ)獲得。將C225(20mg)與EC(28.8mg，0.11mmol在1.4ml的1N NaHCO3中)、硫代-NHS(23.3mg，0.11mmol)和EDC(16.6mg，0.09mmol)一起攪拌。透析后，得到17mg EC-C225。將100mCi的Na99mTc04加入到裝有1mg EC-C225和100μgSnCl2的小瓶中并將產(chǎn)物用G-25柱純化并用PBS洗脫，得到80mCi99mTc-EC-C225。99mTc-EC-C225的放射化學(xué)純度為100％(HPLC，凝膠滲透柱，0.1％LiBr在10mM PBS中，pH7.4)。比放射性活度為2Ci/μmol(圖7)。
例如，免疫測定(蛋白質(zhì)印跡和免疫沉淀)和細(xì)胞增殖測定用于檢測EC-C225的完整性。簡而言之，已知DiFi細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)過程中當(dāng)與C225接觸時經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。將細(xì)胞接種在24-孔的培養(yǎng)皿上。通過向0.5ml的培養(yǎng)基中加入50ul的10mg/ml MTT(溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑)(Sigma)測定細(xì)胞的生活力并將細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)3小時，之后用在二甲基甲酰胺/H2O中含20％SDS、pH4.7的緩沖液在37℃下溶解細(xì)胞6h以上。然后通過測量胞溶產(chǎn)物在595nm處的吸光率和相應(yīng)未處理的細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化測定值而測定細(xì)胞的生活力。結(jié)果表明EC-C225在DiFi細(xì)胞中具有誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的生物活性。與之相反，與未處理的對照細(xì)胞相比較EC-Na對細(xì)胞增殖沒有顯示出任何影響(圖8)。
b.組織分布研究對生長在裸鼠體內(nèi)的A431(一種過度表達EGFR的異種移植物)中的生物分布進行評估(1μCi/小鼠，10μg/小鼠，n＝3/時間間隔，靜脈注射)。在移植14-17天之后當(dāng)腫瘤直徑達到大約1cm時進行研究。應(yīng)用放射性示蹤劑之后，在0.5-4小時時將小鼠處死。摘取所選組織，稱重并用γ計數(shù)器進行放射性強度計數(shù)。各樣品中示蹤劑的生物分布以每克組織濕重中的注射劑量之百分比(％ID/g)計算。生物分布研究表明腫瘤與肌肉計數(shù)密度之比作為時間函數(shù)增加(圖9)。腫瘤攝取(％ID/g)為1±0.2％。腫瘤總攝取為注射劑量的6％(圖10)。
c.閃爍顯像研究在5名患者中用HNSCC在0.5-24小時時進行SPECT顯像(25-30mCi/患者)。在C225抗體治療與放射治療聯(lián)合治療之前每名患者都經(jīng)歷了掃描。計算機描繪的目標(biāo)區(qū)域用于測定腫瘤攝取(計數(shù)/像素)和腫瘤/非腫瘤計數(shù)密度之比。臨床SPECT圖像表明腫瘤可在0.5-4小時時顯現(xiàn)。圖像及結(jié)果如圖11-12所示。
其它的抗體也可適于采用該EC技術(shù)，包括EC-赫賽汀(抗HER2)、EC-CD31、EC-CD40(免疫調(diào)節(jié)劑)、EC-HSA(人血清白蛋白)。
實施例3用EC-COX-2靶向COX-2酶a.乙氨基COX-2(EA-COX-2)的合成COX-2酶為一種疾病血管生成靶，它可用本發(fā)明化合物EC-COX-2靶向。將N-4-(5-對甲苯基-3-三氟甲基-吡唑-1-基)苯磺酰胺(COX-2抑制劑)(114.4mg，0.3mmol)溶解于氯仿(2ml)中。向該溶液中，加入DBU 44.9μl(0.3mmol在0.5ml氯仿中)和乙基異氰酸根合醋酸酯33.7μl(0.3mmol在0.5ml氯仿中)。將該反應(yīng)物在室溫下攪拌6小時。真空蒸發(fā)溶劑。以氯仿甲醇作為洗脫劑將產(chǎn)物從硅膠填充柱中分離。酯形式的COX-2(化合物I)的產(chǎn)量為135mg(88.1％)。合成流程圖如圖13所示。NMR光譜數(shù)據(jù)記錄在圖14中。
將化合物I(102mg，0.2mmol)溶解于2ml的甲醇中并加入乙二胺(72.9μl)。將該反應(yīng)物在室溫下攪拌24小時。以氯仿甲醇作為洗脫劑將產(chǎn)物從硅膠填充柱中分離。分離出所需的乙氨基COX-2(EA-COX-2)(化合物II)(91mg，86.7％產(chǎn)率)?；衔颕I的NMR光譜數(shù)據(jù)記錄在圖15中。
b.EC-乙氨基COX-2(EC-COX-2)的合成為了溶解EC，將NaOH(1N，0.6ml)加入到攪拌的EC(42.3mg，0.15mmol)的水(3ml)溶液中。向該無色的溶液中，加入硫代-NHS(65.1mg，0.3mmol)和EDC(57.5mg，0.3mmol)。然后加入EA-COX-2(78.6mg，0.15mmol)。將混合物在室溫下攪拌24小時然后用分子截斷值為500的Spectra/POR分子多孔膜(Spectrum MedicalIndustries Inc，Houston，TX)透析48小時。透析之后，將產(chǎn)物凍干。產(chǎn)物重87.5mg(產(chǎn)率75％)。
c.用99mTc放射性標(biāo)記EC-COX-299mTc-EC-COX-2的放射合成通過將需要量的99mTc-高锝酸鹽加入到裝有EC-COX-2(5mg)、SnCl2(100μg)、Na2HPO4(13.5mg)、抗壞血酸(0.5mg)、谷氨酸(2mg)和EC(0.5mg)的冷凍干燥殘留物的自制試劑盒中來實現(xiàn)。制劑的最終pH為7.4。放射化學(xué)純度通過TLC(ITLCSG，Gelman Sciences，Ann Arbor，MI)分別用乙酸銨(1M在水中)∶甲醇(4∶1)洗脫進行測定。根據(jù)射線-TLC(Bioscan，Washington，DC)分析，放射化學(xué)純度＞95％。
d.體外細(xì)胞攝取分析和組織分布研究將腫瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)物用99mTc-EC-COX-2(4μCi/50,000細(xì)胞/孔)于0.5-2小時時在RBA CRL-1747中孵育。與99mTc-EC(圖1和16)相比攝取有顯著的增加。
對攜帶乳腺腫瘤的大白鼠中的生物分布進行評估(RBACRL-1747，n＝3/時間間隔，靜脈注射)。在移植14-17天之后當(dāng)腫瘤直徑達到大約1cm時進行研究。應(yīng)用放射性示蹤劑之后，在0.5-4小時時將大白鼠處死。摘取所選組織，稱重并用γ計數(shù)器(PackardInstruments，Downers Grove，IL)進行放射性強度計數(shù)。各樣品中示蹤劑的生物分布以每克組織濕重中的注射劑量之百分比(％ID/g)計算。與99mTc-EC相比99mTc-EC-COX-2在有腫瘤的大白鼠中的生物分布顯示腫瘤與組織計數(shù)密度之比作為時間函數(shù)的增加(表2和3)。表299mTc-EC在攜帶乳腺腫瘤的大白鼠中的生物分布
所顯示的數(shù)值代表3只動物的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
表399mTc-EC-COX-2在攜帶乳腺腫瘤的大白鼠中的生物分布每克組織重量中的注射劑量之百分比(n＝3/時間間隔，靜脈注射)
所顯示的數(shù)值代表3只動物的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
e.閃爍顯像研究在0.5-4小時時對攜帶乳腺腫瘤的大白鼠進行閃爍顯像研究(0.3mCi/大鼠，n＝3，靜脈注射)。對照組應(yīng)用99mTc-EC。平面圖像證實腫瘤可以用99mTc-EC-COX-2(圖17)清楚地顯現(xiàn)。
其它的小分子可適于采用該EC技術(shù)，包括EC-沙利度胺(抗VEGF)、EC-喹唑啉類似物(抗EGF受體R)。其結(jié)構(gòu)如圖18-19所示。
實施例4用EC-噴昔洛韋靶向染色質(zhì)a.EC-噴昔洛韋的合成噴昔洛韋是一種鳥嘌呤類似物，用于靶向疾病細(xì)胞周期靶。EC-噴昔洛韋的合成以三步法完成(如圖20-21所示)。起始原料，3-N-三苯甲基-9-(4-甲苯磺酰-3-鄰三苯甲基甲基丁基)鳥嘌呤(噴昔洛韋類似物)，按照已公開的方法(Allaudin 2001)制備。將噴昔洛韋類似物(500mg，0.52mmol)溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF，15ml)中。向該溶液中，加入疊氮化鈉(160mg，2.5mmol)。將該反應(yīng)物在100℃下加熱一整夜。將溶劑與水混合并用乙酸乙酯萃取。真空蒸干溶劑。疊氮基產(chǎn)物重400mg(產(chǎn)率93％)。不經(jīng)進一步純化，將疊氮基噴昔洛韋類似物(400mg，0.48mmol)在四氫呋喃(THF，15ml)中用三苯基膦(655mg，2.5mmol)還原。將該反應(yīng)物攪拌過夜。加入鹽酸(5N，0.5ml)并將反應(yīng)物回流5小時。然后蒸發(fā)溶劑。將反應(yīng)混合物用水洗滌并用乙酸乙酯萃取。收集水層并用NaHCO3(1N)將pH調(diào)至7-8。凍干后，該氨基噴昔洛韋類似物重120mg(90％)。
向攪拌的EC(50mg，0.2mmol)在NaHCO3(1N)(2m1)中的溶液中，加入硫代-NHS(95.5mg，0.44mmol)和EDC(84.5mg，0.44mmol)。然后加入含氨基噴昔洛韋類似物的鹽水(350mg，1.38mmol)。將該混合物在室溫下攪拌24小時。用分子截斷值為500的Spectra/POR分子多孔膜(Spectrum Medical Industries Inc.，Houston，TX)將混合物透析48小時。透析之后，將產(chǎn)物凍干。產(chǎn)物重100mg(產(chǎn)率67％)。
b.體外細(xì)胞攝取分析將腫瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)物用99mTc-EC-噴昔洛韋(4-6μCi/50,000細(xì)胞/孔)在0.5-2小時時在人卵巢癌和子宮癌細(xì)胞中孵育。與99mTc-EC相比攝取有顯著的增加(圖22)。
c.閃爍顯像研究在0.5-4小時時對攜帶人子宮腫瘤的小鼠進行閃爍顯像研究(0.1mCi/大鼠，n＝3，靜脈注射)。對照組應(yīng)用99mTc-EC。平面圖像證實腫瘤可以用99mTc-EC-噴昔洛韋清楚地顯現(xiàn)(圖23)。通過定量圖像分析儀獲得全身放射自顯影(Cyclone Storage Phosphor System，Packard，Meridian，CT)。在靜脈注射0.1m Ci的99mTc-EC-噴昔洛韋之后，在1小時時將動物殺死并將身體固定于羧甲基纖維素(4％)中。將冷凍的身體置于恒冷切片機上(LKB 2250低溫切片機)并切成100μm的冠狀縫切面。將各切面解凍并置于載玻片上。然后使載玻片與多用途磷存儲屏(MP，7001480)接觸并曝光15小時。在注射99mTc-EC-噴昔洛韋后1小時完成的放射自顯影顯示了腫瘤活性(圖24)。
其它的小分子可適用于采用該實施例中的EC技術(shù)，包括EC-去氧胞苷酸、EC-卡培他濱(胞苷類似物)。其結(jié)構(gòu)如圖25-26所示。
實施例5用EC-腺苷靶向染色質(zhì)a.EC-腺苷的合成染色質(zhì)為一種可用本發(fā)明化合物EC-腺苷靶向的疾病血管生成靶。向攪拌的EC(45.6mg，0.17mmol)在NaHCO3(1N)(0.7ml)中的溶液中，加入硫代-NHS(80.3mg，0.37mmol)和EDC(71.0mg，0.37mmol)。然后加入起始原料，N，N-二甲基-3’-氨基腺苷(氨基腺苷類似物)(50mg，0.17mmol)。將該混合物物在室溫下攪拌24小時。用分子截斷值為500的Spectra/POR分子多孔膜(Spectrum MedicalIndustries Inc.，Houston，TX)將混合物透析48小時。透析之后，將產(chǎn)物凍干。產(chǎn)物重65.2mg(產(chǎn)率69.4％)。EC-腺苷(EC-ADN)的合成如圖27所示。
b.體外細(xì)胞攝取分析將腫瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)物用99mTc-EC-腺苷(4-6μCi/50,000細(xì)胞/孔)在0.5-2小時時在人卵巢癌細(xì)胞中孵育。與99mTc-EC相比攝取有顯著的增加(圖22)。
c.放射自顯影研究通過定量圖像分析儀獲得全身放射自顯影(Cyclone StoragePhosphor System，Packard，Meridian，CT)。在靜脈注射0.1mCi的99mTc-EC-腺苷之后，在1小時時將動物殺死并將身體固定于羧甲基纖維素(4％)中。將冷凍的身體置于恒冷切片機(LKB 2250低溫切片機)上并切成100μm的冠狀縫切面。將各切面解凍并置于載玻片上。然后使載玻片與多用途磷存儲屏(MP，7001480)接觸并曝光15小時。在注射99mTc-EC-腺苷后1小時完成的放射自顯影顯示了腫瘤活性(圖28)。
實施例6用EC-LHRH靶向GnRH受體a.EC-LHRH的合成GnRH受體為一種疾病組織受體，它可用本發(fā)明化合物EC-LHRH靶向。向攪拌的EC(4.6mg，0.017mmol)在NaHCO3(1N)(0.5ml)中的溶液中，加入硫代-NHS(3.72mg，0.017mmol)和EDC(3.3mg，0.017mmol)。然后加入起始原料，促黃體素釋放激素(人的LHRH，Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)(50mg，0.042mmol)。將該混合物在室溫下攪拌24小時。用分子截斷值為1,000的Spectra/POR分子多孔膜(Spectrum Medical Industries Inc.，Houston，TX)將混合物透析48小時。透析之后，將產(chǎn)物凍干。產(chǎn)物重51mg(產(chǎn)率93.4％)。
b.體外細(xì)胞攝取分析將腫瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)物用99mTc-EC-LHRH(4-6μCi/100,000細(xì)胞/孔)在0.5-2小時時在人前列腺癌細(xì)胞中孵育。使用兩種類型的細(xì)胞系。它們要么對雄激素(LNCap)敏感要么對雄激素(PC-3)治療無反應(yīng)。與99mTc-EC相比攝取有顯著的增加(圖29)。
c.閃爍顯像研究在0.5-4小時時對攜帶乳腺腫瘤的大白鼠進行閃爍顯像研究(0.1mCi/大鼠，n＝3，靜脈注射)。對照組應(yīng)用99mTc-EC。平面圖像證實腫瘤可以用99mTc-EC-LHRH清楚地顯現(xiàn)(圖30)。
實施例7用EC-LH抗體靶向促黃體生成激素受體a.EC-LH抗體的合成促黃體生成激素受體為一種疾病組織受體，它可用本發(fā)明化合物EC-LH抗體靶向。向攪拌的EC(0.51mg，1.90μmol)在NaHCO3(1N)(0.1ml)中的溶液中，加入硫代-NHS(0.41mg，1.9μmol)和EDC(0.36mg，1.9μmol)。然后加入起始原料，促黃體生成激素抗體(SigmaChemical Company，St.Louis，MO)(5.1mg)。將該混合物在室溫下攪拌18小時。用分子截斷值為10,000的Spectra/POR分子多孔膜(Spectrum Medical Industries Inc.，Houston，TX)將混合物透析48小時。透析之后，將產(chǎn)物凍干。產(chǎn)物重5.1mg(產(chǎn)率97％)。
b.體外細(xì)胞攝取分析和組織分布研究將腫瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)物用99mTc-EC-LH抗體(4μCi/50,000細(xì)胞/孔)在0.5-2小時時在RBA CRL-1747(乳腺癌細(xì)胞)中孵育。與99mTc-EC相比攝取有顯著的增加(圖31)。對攜帶乳腺腫瘤的大白鼠中的生物分布進行評估(RBACRL-1747，n＝3/時間間隔，靜脈注射)。在移植14-17天之后當(dāng)腫瘤直徑達到大約1cm時進行研究。應(yīng)用放射性示蹤劑之后，在0.5-4小時時將大白鼠處死。摘取所選擇的組織，稱重并用γ計數(shù)器(PackardInstruments，Downers Grove，IL)進行放射性強度計數(shù)。各樣品中示蹤劑的生物分布以每克組織濕重中注射劑量之百分比(％ID/g)計算。與99mTc-EC相比99mTc-EC-LH抗體在攜帶腫瘤的大白鼠中的生物分布顯示腫瘤與組織計數(shù)密度之比作為時間函數(shù)的增加(表2和3)。
表499mTc-EC-LH在攜帶乳腺腫瘤的大白鼠中的生物分布每克組織重量中的注射劑量之百分比(n＝3/時間間隔，靜脈注射)
所顯示的數(shù)值代表3只動物的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
c.閃爍顯像研究在0.5-4小時時對攜帶乳腺腫瘤的大白鼠進行閃爍顯像研究(0.1mCi/大鼠，n＝3，靜脈注射)。對照組應(yīng)用99mTc-EC。平面圖像證實腫瘤可以用99mTc-EC-噴昔洛韋清楚地顯現(xiàn)(圖32)。
實施例8用EC-鐵傳遞蛋白靶向鐵傳遞蛋白受體a.99mTc-EC-鐵傳遞蛋白的放射合成鐵傳遞蛋白受體為一種疾病組織受體，它可用本發(fā)明化合物EC-鐵傳遞蛋白靶向。將鐵傳遞蛋白(100mg)與EC(15mg，0.056mmol，在1.0ml的1N NaHCO3中)、硫代-NHS(11.6mg，0.056mmol)和EDC(10.7mg，0.056mmol)一起攪拌。透析后(截斷MW 10,000)，得到110mg的EC-鐵傳遞蛋白(96％)。將100mCi的Na99mTc04加入到裝有5mg EC-C225和100μg SnCl2的小瓶中并將產(chǎn)物用G-25柱純化和用PBS洗脫，得到80mCi的99mTc-EC-鐵傳遞蛋白。
b.閃爍顯像和放射自顯影研究在0.5-4小時時對攜帶人子宮腫瘤的小鼠進行閃爍顯像研究(0.1mCi/大鼠，n＝3，靜脈注射)。對照組應(yīng)用99mTc-EC。平面圖像證實腫瘤可以用99mTc-EC-鐵傳遞蛋白清楚地顯現(xiàn)(圖23)。通過定量圖像分析儀獲得全身放射自顯影(Cyclone Storage PhosphorSystem，Packard，Meridian，CT)。在靜脈注射0.1mCi的99mTc-EC-鐵傳遞蛋白之后，在1小時時將動物殺死并將身體固定于羧甲基纖維素(4％)中。將冷凍的身體置于恒冷切片機(LKB 2250低溫切片機)上并切成100μm的冠狀縫切面。將各切面解凍并置于載玻片上。然后使載玻片與多用途磷存儲屏(MP，7001480)接觸并曝光15小時。在注射99mTc-EC-鐵傳遞蛋白后1小時完成的放射自顯影顯示了腫瘤活性(圖33)。
其它的蛋白質(zhì)和肽也可適于采用該EC技術(shù)，包括EC-生長激素抑制素、EC-半胱天冬酶、EC-內(nèi)啡肽、EC-PSA，EC-p53、EC-奧曲肽(結(jié)構(gòu)如圖34所示)。
實施例9用EC-阿霉素靶向腫瘤拓?fù)洚悩?gòu)酶a.EC-阿霉素的合成組織對治療藥物的反應(yīng)可用本發(fā)明的化合物確定。用本發(fā)明化合物EC-阿霉素靶向腫瘤拓?fù)洚悩?gòu)酶。向攪拌的EC(55.1mg，0.21mmol)在NaHCO3(1N)(2ml)中的溶液中，加入硫代-NHS(44.6mg，0.21mmol)和EDC(39.4mg，0.21mmol)。然后加入起始原料，阿霉素(119.2mg，0.21mmol)。將該混合物在室溫下攪拌24小時。用分子截斷值為500的Spectra/POR分子多孔膜(Spectrum Medical IndustriesInc.，Houston，TX)將混合物透析48小時。透析之后，將產(chǎn)物凍干。產(chǎn)物重135mg(產(chǎn)率78％)。EC-阿霉素(EC-Doxo)的合成如圖35所示。
b.體外細(xì)胞攝取分析將腫瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)物用99mTc-EC-阿霉素(4-6μCi/50,000細(xì)胞/孔)在0.5-2小時時在對阿霉素敏感的(MDA 231，低HER2)和耐阿霉素的(MDA 453，高HER2)人乳腺癌細(xì)胞中孵育。對阿霉素敏感的細(xì)胞比耐阿霉素的細(xì)胞攝取多(圖36)。
其它小分子也可適于采用本實施例中的EC技術(shù)，包括EC-紫杉醇、EC-托泊替康、EC-氟他胺、EC-反義、EC-他莫西芬、EC-米托蒽醌、EC-絲裂霉素、EC-萬古霉素、EC-博來霉素。
實施例10用EC-肉毒堿靶向脂類代謝a.EC-肉毒堿(EC-TML)的合成肉毒堿，2-羥基-3-三甲銨丁酸鹽對于脂肪酸氧化是重要的，并且它是靶向疾病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一個例子。6-三甲銨賴氨酸(TML)是肉毒堿的類似物。EC與TML的氨基結(jié)合。向攪拌的EC(34.9mg，0.13mmol)在NaOH(1N)(0.5ml)中的溶液中，加入硫代-NHS(62mg，0.29mmol)和EDC(54.8mg，0.29mmol)。然后加入起始原料，TML(50mg，0.13mmol)。將該混合物在室溫下攪拌24小時。用分子截止值為500的Spectra/POR分子多孔膜(Spectrum Medical IndustriesInc.，Houston，TX)將混合物透析48小時。透析之后，將產(chǎn)物凍干。產(chǎn)物重74.2mg(產(chǎn)率93.8％)。EC-肉毒堿(EC-TML)的合成如圖37所示。EC-TML的質(zhì)譜如圖38所示。
b.體外細(xì)胞攝取分析將腫瘤細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)物用99mTc-EC-肉毒堿(4-6μCi/50,000細(xì)胞/孔)在0.5-2小時時在乳腺癌細(xì)胞中孵育。99mTc-EC-肉毒堿比99mTc-EC攝取多(圖16)。
c.閃爍顯像研究在0.1-4小時時對攜帶乳腺腫瘤的大白鼠進行閃爍顯像研究(0.1mCi/大鼠，n＝3，靜脈注射)。對照組應(yīng)用99mTc-EC。觀察到高的腫瘤/肌肉和心臟/肌肉計數(shù)密度之比(圖39)。平面圖像證實腫瘤可以用99mTc-EC-TML清楚地顯現(xiàn)(圖40)。
實施例11用EC-脫氧葡萄糖靶向葡糖胺和葡萄糖代謝a.EC-脫氧葡萄糖(EC-DG)的合成用本發(fā)明化合物EC-脫氧葡萄糖靶向一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，葡糖胺代謝。將氫氧化鈉(1N，1ml)加入到攪拌的EC(110mg，0.41mmol)在水(5ml)中的溶液中。向該無色的溶液中，加入硫代-NHS(241.6mg，1.12mmol)和EDC(218.8mg，1.15mmol)。然后加入D-葡糖胺鹽酸鹽(356.8mg，1.65mmol)。將混合物在室溫下攪拌24小時并將pH調(diào)至6.4-7.0。用截斷值為500的Spectra/POR分子多孔膜(Spectrum Medical Industries Inc，Houston，TX)將混合物透析48小時。透析之后，將產(chǎn)物用冷凍干燥器(Labconco，Kansas City，MO)凍干。產(chǎn)物重291mg(產(chǎn)率60％)。1H-NMR(D2O)δ2.60-2.90(m，4H和EC的-CH2-SH)，2.95(t，2H，葡糖胺5-CH-CH2OH)3.20(d，4H，葡糖胺6-CH2OH)，3.30-3.95(m，6H 葡糖胺1，3，4-CH和4H EC的CH2-SH)3.30-3.66(m，4H，EC的CH2-CH2-)，4.15-4.30(t，2H，EC的NH-CH-CO)，4.60(d，2H，葡糖胺2-CH-NH2).FABMS m/z 591(M+，20).結(jié)構(gòu)如圖41所示。
b.99mTc-EC-DG的組織分布研究將雌性無胸腺的裸鼠(NCr-nu/nu，NCI，Bethasda，MD)由一位作者在中背部位接種人肺癌細(xì)胞(A549腫瘤細(xì)胞系，3×106細(xì)胞/小鼠，肌內(nèi)注射)。在腫瘤達到6mm之后，用99mTc-EC-DG和18F-FDG進行獨立的生物分布研究。每只靜脈內(nèi)接受99mTc-EC-DG或18F-FDG(n＝3/時點)。注射強度為1-3μCi/小鼠。99mTc-EC-DG的注射質(zhì)量為0.2mg/嚙齒動物。在放射性示蹤劑給藥之后，處死嚙齒動物并摘取所選擇的組織，稱重并進行放射性強度計數(shù)。作為時間的函數(shù)，99mTc-EC-DG的腫瘤/肌肉之比和腫瘤/腦之比較高，而18F-FDG的腫瘤/血液之比較高(表4和5)。
表518FDG在攜帶肺腫瘤小鼠中的生物分布每克組織重量中的注射劑量之百分比
所顯示的數(shù)值代表3只動物的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
表699mTc-EC-DG在攜帶肺腫瘤小鼠中的生物分布每克組織重量中的注射劑量之百分比
所顯示的數(shù)值代表3只動物的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
c.γ閃爍顯像研究將雌性Fischer 344大白鼠(每只250-275g)(Harlan，Inc，Indianapolis，IN)由一位作者用來自13762腫瘤細(xì)胞系(s.c.106細(xì)胞/大鼠，對Fischer大白鼠特異性的腫瘤細(xì)胞系)接種乳腺腫瘤細(xì)胞。8-10天后，測量腫瘤的體積為0.3-0.6cm。在靜脈注射300μCi的99mTc-EC或99mTc-EC-DG(n＝3/試劑，總共6只大白鼠)0.5，2和4小時之后獲得閃爍顯像。腫瘤組織和肌肉(在對稱部位)之間的ROI用于測定腫瘤/非腫瘤之比。可由99mTc-EC-DG檢測到的最小腫瘤體積為3mm。中等大小的腫瘤(6mm)在每個時間點顯示較高的攝取。心、腎、肝、和膀胱被顯現(xiàn)(圖42)。
其它小分子可適于采用在該實施例中的EC技術(shù)，包括EC-阿密磷定、EC-乳糖、EC-吡哆醛(結(jié)構(gòu)如圖43所示)、EC-富勒烯(EC-碳60，結(jié)構(gòu)如圖44所示)。
根據(jù)本發(fā)明的公開，本文中公開和要求保護的所有組合物和/或方法無需過多實驗都可制備和實施。盡管本發(fā)明的組合物和方法只根據(jù)優(yōu)選的實施方案進行了描述，但對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是所述組合物和/或方法和在本文描述的方法中的步驟或步驟的順序在不背離本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍的情況下可進行變化。更具體地說，顯而易見的是在化學(xué)性質(zhì)上和生理學(xué)上都相關(guān)的某些試劑可代替本文中描述的試劑而將取得相同的或相似的結(jié)果。所有這些對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯而易見的相似的替換和改變都被認(rèn)為在附加的權(quán)利要求中定義的本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思的范圍之內(nèi)。
d.188Re-EC-DG的合成和配制為了開發(fā)試劑盒形式的EC-DG，將溶解在0.2ml水中的EC-DG(10mg)與在10ml的中等小瓶中的氯化錫(2mg在0.2ml水中)和葡萄糖酸鹽(3mg)一起凍干并在標(biāo)記前在室溫下貯存。標(biāo)記時，將凍干的粉末在鹽水中(0.5ml)重建并加入高锝酸鹽(10mCi)。將試劑盒在55℃下加熱30分鐘(或在75℃下加熱15分鐘)。由射線-TLC測得的99mTc-EC-DG的放射化學(xué)純度高于95％(鹽水，Rf0.8)(圖39)。類似的方法可適于其它EC-試劑，如EC-甲硝噠唑(EC-MN)(圖40)和EC-噴昔洛韋(亦稱作EC-Guan)。為了證實Re-188和Tc-99m之間的相似性，將Re-188和Tc-99m標(biāo)記的EC-Guan和EC-甲硝噠唑進行細(xì)胞培養(yǎng)。兩者的攝取沒有顯著的差異(圖41和圖42)。
在本發(fā)明的組合物中包含抗氧化劑和過渡螯合劑以阻止乙二半胱氨酸氧化或許也很重要。例如抗氧化劑可以是維生素C(抗壞血酸)。不過，也可使用其它本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的抗氧化劑，如生育酚、吡哆醇、硫胺或蘆丁。任何本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的過渡螯合劑也可結(jié)合本發(fā)明使用。過渡螯合劑的例子包括葡庚糖酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡萄糖二酸鹽、枸櫞酸鹽、和酒石酸鹽。在某些實施方案中，過渡螯合劑為葡萄糖酸鹽或葡萄糖二酸鹽，它們不干擾乙二半胱氨酸的穩(wěn)定性。含或不含過渡螯合劑(葡萄糖酸鹽或葡萄糖二酸鹽)的99mTc-EC-脫氧葡萄糖(EC-DG)體外細(xì)胞培養(yǎng)不干擾99mTc-EC-DG的穩(wěn)定性(圖43A-43C)。
參考文獻以下參考文獻在一定的程度上提供了示例性的程序或?qū)Ρ疚闹械拿枋鲅a充的其它說明，特別引入本文作為參考。
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權(quán)利要求
1.包含與靶向配體結(jié)合的N2S2螯合物的化合物，其中靶向配體是疾病細(xì)胞周期靶向化合物、腫瘤血管發(fā)生靶向配體、腫瘤細(xì)胞凋亡靶向配體、疾病受體靶向配體、阿密磷定、血管他丁、單克隆抗體C225、單克隆抗體CD31、單克隆抗體CD40、卡培他濱、COX-2、脫氧胞苷酸、富勒烯、赫賽汀、人血清白蛋白、乳糖、促黃體生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙利度胺、鐵傳遞蛋白或三甲基賴氨酸。
2.權(quán)利要求1的化合物，其進一步定義為 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8獨立地為H或CH3；R9為H、CH3、疾病細(xì)胞周期靶向化合物、腫瘤血管發(fā)生靶向配體、腫瘤細(xì)胞凋亡靶向配體、疾病受體靶向配體、阿密磷定、血管他丁、單克隆抗體C225、單克隆抗體CD31、單克隆抗體CD40、卡培他濱、COX-2、脫氧胞苷酸、富勒烯、赫賽汀、人血清白蛋白、乳糖、促黃體生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙利度胺、鐵傳遞蛋白或三甲基賴氨酸；R10為H、CH3、疾病細(xì)胞周期靶向化合物、腫瘤血管發(fā)生靶向配體、腫瘤細(xì)胞凋亡靶向配體、疾病受體靶向配體、阿密磷定、血管他丁、單克隆抗體C225、單克隆抗體CD31、單克隆抗體CD40、卡培他濱、COX-2、脫氧胞苷酸、富勒烯、赫賽汀、人血清白蛋白、乳糖、促黃體生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙利度胺、鐵傳遞蛋白或三甲基賴氨酸；n為0或1；m為0或1；當(dāng)n為1時，X為水溶性肽、C1-C20烷基、谷氨酸、多聚谷氨酸、天冬氨酸、多聚天冬氨酸、乙酸溴乙酯、乙二胺或賴氨酸，或當(dāng)n為0時X為直連鍵；當(dāng)m為1時，Y為水溶性肽、C1-C20烷基、谷氨酸、多聚谷氨酸、天冬氨酸、多聚天冬氨酸、乙酸溴乙酯、乙二胺或賴氨酸，或當(dāng)m為0時Y為直連鍵；以及M為99mTc，188Re，186Re，183Sm，166Ho，90Y，89Sr，67Ga，68Ga，111In，183Gd，59Fe，225Ac，212Bi，211At，45Ti，60Cu，61Cu，67Cu，64Cu或62Cu.
3.權(quán)利要求1的化合物，其中靶向配體包括腫瘤血管發(fā)生靶向配體。
4.權(quán)利要求3的化合物，其中靶向配體包括COX-2、抗EGF、赫賽汀、血管他丁或沙利度胺。
5.權(quán)利要求1的化合物，其中靶向配體為疾病細(xì)胞周期靶向配體。
6.權(quán)利要求5的化合物，其中靶向配體包括腺苷、噴昔洛韋、FIAU、FIRU、IVFRU、GCV、PCV、FGCV、FPCV、FHPG、FHBG或鳥嘌呤。
7.權(quán)利要求1的化合物，其中靶向配體包括腫瘤細(xì)胞凋亡靶向配體。
8.權(quán)利要求7的化合物，其中靶向配體包括TRAIL或半胱天冬酶-3靶向配體。
9.權(quán)利要求2的化合物，其中靶向配體包括疾病受體靶向配體。
10.權(quán)利要求9的化合物，其中靶向配體包括雌激素、雄激素、促黃體生成激素、鐵傳遞蛋白或黃體酮。
11.權(quán)利要求1的化合物，其中靶向配體包括肉毒堿或阿霉素。
12.權(quán)利要求1的化合物，其中靶向配體包括噴昔洛韋或腺苷。
13.權(quán)利要求1的化合物，其中靶向配體包括阿密磷定。
14.權(quán)利要求1的化合物，其中靶向配體包括抗EGF受體。
15.權(quán)利要求1的化合物，其中靶向配體包括單克隆抗體CD31。
16.權(quán)利要求1的化合物，其中靶向配體包括單克隆抗體CD40。
17.權(quán)利要求1的化合物，其中靶向配體包括卡培他濱。
18.權(quán)利要求1的化合物，其中靶向配體包括脫氧胞苷酸。
19.權(quán)利要求1的化合物，其中靶向配體包括富勒烯。
20.權(quán)利要求1的化合物，其中靶向配體包括人血清白蛋白。
21.權(quán)利要求1的化合物，其中靶向配體包括乳糖。
22.權(quán)利要求1的化合物，其中靶向配體包括吡哆醛。
23.權(quán)利要求1的化合物，其中靶向配體包括喹唑啉。
24.權(quán)利要求1的化合物，其中靶向配體包括三甲基賴氨酸。
25.權(quán)利要求1的化合物，其中靶向配體包括疾病細(xì)胞周期靶向化合物。
26.權(quán)利要求25的化合物，其中疾病細(xì)胞周期靶向化合物包括腺苷、噴昔洛韋、FIAU、FIRU、IVFRU、GCV、PCV、FGCV、FHPG、FHBG或鳥嘌呤。
27.權(quán)利要求1的化合物，其中N2S2螯合物進一步定義為乙二半胱氨酸。
28.權(quán)利要求1的化合物，進一步包含放射性核素。
29.權(quán)利要求28的化合物，其中放射性核素包括99mTc、188Re、186Re、183Sm、166Ho、90Y、89Sr、67Ga、68Ga、111In、183Gd、59Fe、225Ac、212Bi、211At，45Ti、60Cu、61Cu、67Cu、64Cu或62Cu。
30.權(quán)利要求1的化合物，進一步包含位于靶向配體和螯合物之間的水溶性肽、C1-C20烷基、谷氨酸、多聚谷氨酸、天冬氨酸、多聚天冬氨酸、乙酸溴乙酯、乙二胺或賴氨酸。
31.合成與靶向配體結(jié)合的放射性標(biāo)記的N2S2螯合物的方法，其包括步驟a)獲得權(quán)利要求1的化合物；b)將所述化合物與放射性核素和還原劑混合得到放射性核素標(biāo)記的衍生物，其中N2S2螯合物與放射性核素形成螯合物。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述還原劑為連二亞硫酸根離子、亞錫離子或亞鐵離子。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述放射性核素為99mTc、188Re、186Re、183Sm、166Ho、90Y、89Sr、67Ga、68Ga、111In、183Gd、59Fe、225Ac、212Bi、211At，45Ti、60Cu、61Cu、67Cu、64Cu或62Cu。
34.顯像哺乳動物體內(nèi)部位的方法，其包括步驟a)將診斷有效量的權(quán)利要求28的化合物施用到所述部位；和b)檢測來自所述定位于部位的化合物的放射性信號。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述部位為腫瘤。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述部位為感染部位。
37.權(quán)利要求34的方法，其中所述部位為乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜、心臟癌、肺癌、腦癌、肝癌、葉酸(+)癌、ER(+)癌、脾癌、胰腺癌或腸癌。
38.用于制備放射性藥物制劑的試劑盒，其包括a)包含預(yù)定量化合物的密封容器，其中所述化合物為放射性核素標(biāo)記的權(quán)利要求1的N2S2螯合物-靶向配體結(jié)合物；和b)足量的還原劑。
39. 權(quán)利要求38的試劑盒，進一步包含放射性核素。
40.權(quán)利要求39的試劑盒，其中該放射性核素為99mTc、188Re、186Re、183Sm、166Ho、90Y、89Sr、67Ga、68Ga、111In、183Gd、59Fe、225Ac、212Bi、211At，45Ti、60Cu、61Cu、67Cu、64Cu或62Cu。
41.權(quán)利要求37的試劑盒，進一步包含抗氧化劑。
42.權(quán)利要求41的試劑盒，其中抗氧化劑為維生素C、生育酚、吡哆醇、維生素B1或蘆丁。
43.權(quán)利要求42的試劑盒，其中抗氧化劑為維生素C。
44.權(quán)利要求38的試劑盒，進一步包含過渡螯合劑。
45.權(quán)利要求44的試劑盒，其中過渡螯合劑為葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、葡萄糖二酸鹽、枸櫞酸鹽或酒石酸鹽。
46.權(quán)利要求45的試劑盒，其中過渡螯合劑為葡糖酸鹽或葡萄糖二酸鹽。
47.權(quán)利要求38的試劑盒，其中還原劑為氯化錫(II)或三苯基膦。
48.評價目的物質(zhì)的藥理學(xué)性質(zhì)的方法，其包括a)制備該物質(zhì)與N2S2螯合物的結(jié)合物；b)將放射性核素加入到所述結(jié)合的螯合物中形成放射性結(jié)合物；c)將所述放射性結(jié)合物施用到受試者；和d)評價該物質(zhì)的藥理學(xué)性質(zhì)。
49.權(quán)利要求48的方法，其中目的物質(zhì)為藥劑。
50.權(quán)利要求48的方法，其中N2S2螯合物為乙二半胱氨酸。
51.權(quán)利要求48的方法，其中所述受試者為實驗動物。
52.權(quán)利要求48的方法，其中所述受試者為人。
53.權(quán)利要求48的方法，其中評價物質(zhì)的藥理學(xué)性質(zhì)包括評價該物質(zhì)的生物分布。
54.權(quán)利要求48的方法，其中評價物質(zhì)的藥理學(xué)性質(zhì)包括評價該物質(zhì)的生物穩(wěn)定性。
55.權(quán)利要求48的方法，其中評價物質(zhì)的藥理學(xué)性質(zhì)包括評價該物質(zhì)的生物消除。
全文摘要
概括地說，本發(fā)明提供一種新的利用化合物的標(biāo)記策略，該化合物為與靶向配體(targeting ligand)結(jié)合的N2S2螯合物，其中該靶向配體為疾病細(xì)胞周期靶向化合物、腫瘤血管發(fā)生靶向配體、腫瘤細(xì)胞凋亡靶向配體、疾病受體靶向配體、阿密磷定、血管他丁、單克隆抗體C225、單克隆抗體CD31.單克隆抗體CD40、卡培他濱、COX－2、脫氧胞苷酸、富勒烯、赫賽汀、人血清白蛋白、乳糖、促黃體生成激素、吡哆醛、喹唑啉、沙利度胺、鐵傳遞蛋白或三甲基賴氨酸。本發(fā)明還涉及應(yīng)用目的化合物的試劑盒、以及利用本發(fā)明的化合物評價目的物質(zhì)藥理學(xué)性質(zhì)的方法。
文檔編號C07K16/46GK1723042SQ200380105318
公開日2006年1月18日 申請日期2003年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月7日
發(fā)明者D·J·楊, D-F·于, 吳昌錫, J·L·小布里彥特 申請人:得克薩斯大學(xué)體系董事會, 細(xì)胞>點有限責(zé)任公司