專利名稱：Ngf拮抗劑和阿片樣藥劑在治療疼痛中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過施用神經(jīng)生長因子拮抗劑與阿片樣鎮(zhèn)痛劑的組合預(yù)防或治療患者中疼痛的方法和組合物。
背景技術(shù)：
重度疼痛通常用阿片樣鎮(zhèn)痛劑治療，但不幸的是其具有很多不良副作用，包括降低胃能動性，腎絞痛，精神混濁和呼吸抑制。神經(jīng)生長因子(NGF)是第一個被鑒定的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，其在外周和中樞神經(jīng)元的發(fā)育和生存中的作用已經(jīng)得到很好的特征描述。已經(jīng)證實，NGF是外周交感和胚胎感覺神經(jīng)元以及基底前腦膽堿能神經(jīng)元的發(fā)育中至關(guān)重要的生存和維持因子(Smeyne等，Nature 368246-249(1994)；Crowley等，Cell 761001-1011(1994))。NGF上調(diào)神經(jīng)肽在感覺神經(jīng)元中的表達(dá)(Lindsay，等，Nature 337362-364(1989))，其活性通過兩種不同的膜結(jié)合受體(TrkA酪氨酸激酶受體和p75受體)介導(dǎo)，所述p75受體在結(jié)構(gòu)上與腫瘤壞死因子受體家族的其它成員相關(guān)(Chao，等，Science 232518-521(1986))。
除了對神經(jīng)系統(tǒng)的作用外，NGF越來越多地被提示涉及神經(jīng)系統(tǒng)外的過程。例如，已經(jīng)證實，NGF能增強(qiáng)血管通透性(Otten等，Eur J Pharmacol.106199-201(1984))，增強(qiáng)T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫應(yīng)答(Otten，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8610059-10063(1989))，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分化和肥大細(xì)胞增殖以及導(dǎo)致可溶性生物信號從肥大細(xì)胞釋放(Matsuda，等，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 856508-6512(1988)；Pearce，等，J Physio.372379-393(1986)；Bischoff等，Blood 792662-2669(1992)；Horigome，等，J Biol.Chem.26814881-14887(1993))。
NGF由多種細(xì)胞類型產(chǎn)生，包括肥大細(xì)胞(Leon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913739-3743(1994))，B淋巴細(xì)胞(Torcia等，Cell 85345-356(1996)，角質(zhì)形成細(xì)胞(Di Marco等，J Biol.Chem.26822838-22846))，平滑肌細(xì)胞(Ueyama，等，J Hypertens.111061-1065(1993))，成纖維細(xì)胞(Lindholm，等，Eur.J.Neuosci. 2795-801(1990))，支氣管上皮細(xì)胞(Kassel，等，Clin，Exp.Allergy 311432-40(2001))，腎小球系膜細(xì)胞(Steiner等，Am.J Physiol.261F792-798(1991))和骨骼肌肌管(Schwartz，等，JPhotochem，Photobiol.B 66195-200(2002))。在神經(jīng)系統(tǒng)以外的多種細(xì)胞類型上發(fā)現(xiàn)了NGF受體。例如，在人類單核細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞上已發(fā)現(xiàn)了TrkA。
在人類患者以及在一些動物模型中已經(jīng)觀察到增加的NGF水平和多種炎性病癥之間的關(guān)聯(lián)。這包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Bracci-Laudiero，等，Neuroreport 4563-565(1993))，多發(fā)性硬化(Bracci-Laudiero，等，Neurosci.Lett.1479-12(1992))，銀屑病(Raychaudhuri，等，Acta Derm.l′enereol.7884-86(1998))，關(guān)節(jié)炎(Falcimi，等，Ann.Rheum.Dis.55745-748(1996))，間質(zhì)性膀胱炎(Okragly，等，J.Urology 161438-441(1991))和哮喘(Braun，等，Eur.J Immunol.283240-3251(1998))。
一致性地，外周組織中NGF水平增高與痛覺過敏及炎癥相關(guān)，并已經(jīng)在多種形式的關(guān)節(jié)炎中觀察到。受類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎影響的患者的滑膜表達(dá)高水平的NGF，而在未發(fā)炎的滑膜中，已有報道滑膜NGF是無法檢測到的(Aloe，等，Arch.Rheum.35351-355(1992))。在實驗性誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的大鼠中也觀測到相似的結(jié)果(Aloe等，Clin.Exp.Rheumatol.10203-204(1992))。已有報道顯示，在轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎小鼠中，NGF的水平增高并且肥大細(xì)胞數(shù)量增加(Aloe，等，Int.J.Tissue Reactions-Exp.Clin.Aspects 15139-143(1993))。
治療疼痛的藥物療法有兩個一般類別，其均有缺點。第一類包括非類固醇抗炎藥(NSAIDs)，其可用于治療輕度疼痛，但其治療用途受限于不良胃腸道反應(yīng)諸如胃腐蝕、消化性潰瘍形成或十二指腸和結(jié)腸的炎癥及長期使用造成的腎毒性，第二類包括嗎啡和相關(guān)阿片樣藥劑，其可用于治療中度至重度疼痛，但其治療用途受限于不良作用諸如鎮(zhèn)靜作用、意識錯亂、便秘、呼吸抑制、精神混濁、腎絞痛、長期使用的耐受和成癮危險。因此，需要具有較少或不具有副作用的可用于治療疼痛的化合物。
阿片樣鎮(zhèn)痛劑是一類良好確立的鎮(zhèn)痛劑。它們有時也稱作阿片劑。術(shù)語“阿片樣藥劑”(與“阿片樣鎮(zhèn)痛劑”互換使用)通常在一般意義上意指具有嗎啡樣活性的所有藥物(天然或合成的)。合成和半合成的阿片樣鎮(zhèn)痛劑是五類化合物的衍生物菲(phenanthrene)；苯基庚基胺；苯基哌啶；嗎啡喃和苯并嗎吩烷。這些化合物在藥理學(xué)上具有不同的活性，有些是針對阿片樣藥劑受體的強(qiáng)激動劑(例如嗎啡)；其它的是中度至輕度激動劑(例如可待因)；而其它的表現(xiàn)出混合的激動劑-拮抗劑活性(例如納布啡)；而其它的是部分激動劑(例如烯丙嗎啡)。阿片樣部分激動劑諸如烯丙嗎啡(嗎啡的N-烷基類似物)可對嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)產(chǎn)生拮抗作用，當(dāng)單獨給藥時，其憑借自身特性可以作為強(qiáng)效鎮(zhèn)痛劑。
在所有阿片樣鎮(zhèn)痛劑中，嗎啡的應(yīng)用最為廣泛。不幸的是，除了其有用的治療特性外，嗎啡還具有大量副作用。另一不良特性是耐受性和軀體依賴性的形成，其限制了此類化合物的臨床用途。因此，需要開發(fā)采用較低劑量的阿片樣鎮(zhèn)痛劑諸如嗎啡的治療方法，由此降低副作用的發(fā)生和耐受性和依賴性的可能性，從而避免與停止施用相關(guān)的藥物戒斷的主要問題。非常需要開發(fā)可以增強(qiáng)阿片樣藥劑的疼痛治療的其它形式。
本文所引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利申請和出版物均全文引入作為參考。
發(fā)明概述本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)，NGF的拮抗劑與阿片樣鎮(zhèn)痛劑組合能有效治療疼痛。所述治療通常能夠使得劑量降低的阿片樣鎮(zhèn)痛劑產(chǎn)生相同量的疼痛降低效果和/或允許對阿片樣藥劑疼痛治療的其它形式的增強(qiáng)。
第一方面，本發(fā)明公開了治療(或，在其它實施方案中，預(yù)防)疼痛的方法，包括施用一定量的神經(jīng)生長因子拮抗劑和一定量的阿片樣鎮(zhèn)痛劑，以便通過聯(lián)合兩者提供有效的疼痛緩減。NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑的相對量和比例可有所變化。在某些實施方案中，施用足量的NGF拮抗劑以便將阿片樣鎮(zhèn)痛劑的正常劑量降低至少約50％，所述阿片樣鎮(zhèn)痛劑的正常劑量是產(chǎn)生相同程度的疼痛改善作用所需的量。在某些實施方案中，施用足量的NGF拮抗劑以便將實現(xiàn)相同程度的疼痛改善作用所需的阿片樣鎮(zhèn)痛劑的正常劑量降低至少約5％、至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約60％、至少約70％、至少約80％，或至少約90％，或更高。
另一方面，本發(fā)明提供了增強(qiáng)阿片樣鎮(zhèn)痛劑的疼痛治療的方法，包括施用有效量的阿片樣鎮(zhèn)痛劑及有效量的NGF拮抗劑。如本文所使用的，聯(lián)合施用包括同時施用和/或在不同的時間施用。聯(lián)合施用還包括作為共制劑(co-formulation)施用(即，NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑存在(組合)于同一組合物中)和/或作為分開的組合物施用。如本文所使用的，“聯(lián)合施用”意在包括將有效量的阿片樣鎮(zhèn)痛劑和NGF拮抗劑施用于個體的任何情況。如本文進(jìn)一步所述，應(yīng)當(dāng)理解的是，NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑可以以不同的給藥頻率或間隔進(jìn)行施用。例如，抗NGF抗體可每周施用，而阿片樣鎮(zhèn)痛劑可更頻繁的施用。應(yīng)當(dāng)理解的是，NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑可采用相同的施用途徑或不同的施用途徑進(jìn)行施用，而不同的給藥方案可隨著施用過程而改變。施用可在疼痛發(fā)作之前進(jìn)行。
另一方面，本發(fā)明提供了在個體中降低疼痛發(fā)生率、改善疼痛、緩解疼痛的方法；和/或延遲疼痛的發(fā)生或發(fā)展的方法，所述方法包括施用有效量的阿片樣鎮(zhèn)痛劑及有效量的NGF拮抗劑。
本發(fā)明的方法適用于治療或預(yù)防具有任何病因?qū)W的疼痛，包括通常采用阿片樣鎮(zhèn)痛劑治療的疼痛，例如，胰腺炎、腎結(jié)石、頭痛、dismennorhea、肌與骨骼的疼痛(例如腰痛)、扭傷、內(nèi)臟痛、卵巢囊腫、前列腺炎、膀胱炎、化學(xué)或熱燒傷、或癌癥(諸如前列腺癌骨轉(zhuǎn)移、乳癌骨轉(zhuǎn)移、肺癌骨轉(zhuǎn)移、胰腺癌)。
本發(fā)明方法中適用的NGF拮抗劑是能夠直接或間接導(dǎo)致NGF生物活性減弱的任何藥劑。在某些實施方案中，NGF拮抗劑(例如，抗體)結(jié)合(物理上相互作用于)NGF、結(jié)合NGF受體(諸如trkA受體和/或p75)和/或降低(阻礙和/或阻滯)下游NGF受體信號傳導(dǎo)(例如，激酶信號傳導(dǎo)抑制劑)。由此，在某些實施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合(物理上相互作用于)NGF。在其它實施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合NGF受體(諸如TrkA受體和/或p75)。在其它實施方案中，NGF拮抗劑降低(阻礙和/或阻滯)下游NGF受體信號傳導(dǎo)(例如，激酶信號傳導(dǎo)抑制劑)。在其它實施方案中，NGF拮抗劑抑制(減少)NGF合成和/或釋放。在另一實施方案中，NGF拮抗劑是TrkA免疫粘合素。在某些實施方案中，NGF拮抗劑選自以下一種或多種抗NGF抗體，針對NGF的反義分子(包括針對編碼NGF的核酸的反義分子)，針對NGF受體(諸如trkA和/或p75)的反義分子，NGF抑制性化合物，NGF結(jié)構(gòu)類似物，與NGF結(jié)合的TrkA和/或p75受體的顯性失活突變體，抗TrkA抗體，抗p75抗體，和激酶抑制劑。在另一實施方案中，NGF拮抗劑是抗NGF抗體。在其它實施方案中，抗NGF抗體識別人NGF。在其它實施方案中，抗NGF抗體特異性地結(jié)合人NGF。而在其它實施方案中，所述抗體與選自Mab 911，MAb 912和MAb 938的一種或多種小鼠單克隆抗體結(jié)合基本上相同的NGF表位6(參見Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000))。在某些實施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合NGF(諸如hNGF)且不顯著性結(jié)合相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，諸如NT-3，NT4/5，和/或BDNF。而在其它實施方案中，抗NGF抗體是人源化的(諸如本文所述的抗體E3)。在某些實施方案中，抗NGF抗體是抗體E3(如本文所述)。在其它實施方案中，抗NGF抗體包含抗體E3的一個或多個CDR(s)(諸如一個、兩個、三個、四個、五個，或在有些情況下所有六個來自E3的CDRs)。在其它實施方案中，抗體是人的。而在其它實施方案中，抗NGF抗體包含表1中所示重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO1)和表2中所示輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。而在其它實施方案中，抗體包含修飾的恒定區(qū)，諸如免疫上惰性的恒定區(qū)，例如，該恒定區(qū)不能觸發(fā)補體介導(dǎo)的裂解，或不能刺激抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。在其它實施方案中，恒定區(qū)按照Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624；PCT申請序號PCT/GB99/01441；和/或UK專利申請序號9809951.8中所述進(jìn)行修飾。
在某些實施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合NGF分子。而在其它實施方案中，NGF拮抗劑是特異性結(jié)合NGF(諸如人NGF)的抗體。但是，NGF拮抗劑可以可選地結(jié)合trkA受體。NGF拮抗劑可以是抗人NGF(抗hNGF)單克隆抗體，其能結(jié)合hNGF并有效地抑制hNGF與人TrkA(hTrkA)的結(jié)合和/或有效地抑制TrkA受體的活化。
抗NGF抗體對NGF(諸如hNGF)的結(jié)合親和力可以是約0.10nM至約0.80nM、約0.15至約0.75nM和約0.18至約0.72nM。而一個實施方案中，結(jié)合親和力為約2pM-22pM。在某些實施方案中，結(jié)合親和力為約10nM。在其它實施方案中，結(jié)合親和力小于約10nM。在其它實施方案中，結(jié)合親和力為約0.1nM或約0.07nM。在其它實施方案中，結(jié)合親和力小于約0.1nM，或小于約0.07nM。在其它實施方案中，結(jié)合親和力為約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM和約50pM中的任一項至約2pM、約5pM、約10pM、約15pM、約20pM和約40pM中的任一項。在某些實施方案中，結(jié)合親和力為約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM，或約50pM，或小于約50pM。在某些實施方案中，結(jié)合親和力小于約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM，或約50pM。而在其它實施方案中，結(jié)合親和力為約2pM、約5pM、約10pM、約15pM、約20pM、約40pM，或大于約40pM。如本領(lǐng)域眾所周知的，結(jié)合親和力可用KD，或解離常數(shù)進(jìn)行表示，結(jié)合親和力增加相應(yīng)于KD降低?？筃GF小鼠單克隆抗體911(Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000)對人NGF的結(jié)合親和力為約10nM，而人源化抗NGF抗體E3(本文所述)對人NGF的結(jié)合親和力為約0.07nM。
在NGF拮抗劑是抗體的情況下，抗體可以是抗體片段，包括選自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段的抗體片段、由抗體片段形成的diabody、單鏈抗體分子和多特異性抗體，和單鏈Fv(scFv)分子。
阿片樣鎮(zhèn)痛劑可以是表現(xiàn)出嗎啡樣生物活性的任何化合物。在某些實施方案中，阿片樣鎮(zhèn)痛劑是以下的一項或多項嗎啡、可待因、雙氫可待因、二乙酰嗎啡、氫可酮、氫嗎啡酮、左啡烷、羥嗎啡酮、阿芬太尼、丁丙諾啡、布托啡諾、芬太尼、舒芬太尼、哌替啶、美沙酮、納布啡、丙氧芬和噴他佐辛；或其藥學(xué)上可接受的鹽。
NGF拮抗劑和/或阿片樣鎮(zhèn)痛劑可借助任何適宜的途徑施用于個體。例如，其可經(jīng)口、靜脈內(nèi)、舌下、皮下、動脈內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)直腸、脊柱內(nèi)、胸內(nèi)、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)、舌下、經(jīng)皮或通過吸入而一同或分開，和/或同時和/或相繼地進(jìn)行施用。施用可以是全身性的(例如，靜脈內(nèi))或局部性的。
第二方面，本發(fā)明公開了包含神經(jīng)生長因子拮抗劑和/或阿片樣鎮(zhèn)痛劑的組合物。神經(jīng)生長因子拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑可一起與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑聯(lián)合存在，或它們可以存在于分開的組合物中。另一方面，本發(fā)明提供了NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑的協(xié)同性組合物。
第三方面，本發(fā)明公開了用于本文所述任何方法的藥盒，所述藥盒包括NGF拮抗劑和/或阿片樣鎮(zhèn)痛劑。該藥盒可進(jìn)一步包括用于本文所述任何方法的說明書。該說明書可包括NGF拮抗劑與阿片樣藥劑的聯(lián)合施用(即，同時施用和/或在不同的時間施用)。在某些實施方案中，NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑被包裝在一起，但它們可以在或不在相同的容器內(nèi)。由此，在某些實施方案中，藥盒包括存在于相同容器中的NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑，和用于本文所述任何方法的說明書。在其它實施方案中，藥盒包括存在于分開的容器中的NGF拮抗劑和阿片樣藥劑。
附圖簡介

圖1顯示了用嗎啡聯(lián)合NGF拮抗劑(小鼠抗NGF抗體911，Hongo，等，Hybridoma 19215-227(2000))進(jìn)行治療的動物中累積的疼痛評分降低。手術(shù)前單獨用抗NGF抗體(“911”)以0.3mg/kg進(jìn)行治療比單獨用0.3mg/kg嗎啡進(jìn)行治療更有效地降低了靜止痛(resting pain)，而用抗NGF抗體聯(lián)合嗎啡進(jìn)行治療比單獨用嗎啡或單獨用抗NGF抗體更有效地降低了靜止痛。
圖2顯示了用嗎啡聯(lián)合NGF拮抗劑(抗NGF抗體911)進(jìn)行治療的動物中累積的疼痛評分降低。用抗NGF抗體加嗎啡的治療比單獨用嗎啡或單獨用抗NGF抗體更有效地降低了靜止痛。
圖3顯示了手術(shù)和用抗NGF抗體和/或嗎啡進(jìn)行治療后動物中觀察到的靜止痛評分。動物在手術(shù)前15小時用NGF拮抗劑(抗NGF抗體911)進(jìn)行治療，在手術(shù)后一天檢測疼痛行為。對動物進(jìn)行無嗎啡(實線)、0.3mg/kg嗎啡(虛線)或1.0mg/kg嗎啡(點線)的檢測。與單獨用0.3mg/kg嗎啡進(jìn)行治療相比，0.3mg/kg嗎啡聯(lián)合0.3mg/kg抗NGF抗體或1mg/kg抗NGF抗體進(jìn)行的治療顯著改善了疼痛緩減(即，靜止痛降低)。此外，抗NGF抗體的單獨治療產(chǎn)生了與以0.3mg/kg給藥的嗎啡等價的疼痛緩減。用1.0mg/kg抗NGF抗體加0.3mg/kg嗎啡的治療產(chǎn)生至少等于單獨使用1mg/kg嗎啡所得的疼痛緩減。
發(fā)明詳述我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)疼痛可通過施用有效量的NGF拮抗劑(諸如抗NGF抗體)及阿片樣鎮(zhèn)痛劑進(jìn)行治療或預(yù)防。本發(fā)明的方法和組合物可用于治療或預(yù)防通常用阿片樣鎮(zhèn)痛劑進(jìn)行治療的疼痛。通過使用神經(jīng)生長因子拮抗劑聯(lián)合阿片樣鎮(zhèn)痛劑，根據(jù)本發(fā)明，目前可以用較低劑量的阿片樣鎮(zhèn)痛劑來治療疼痛，由此降低了與使用阿片樣鎮(zhèn)痛劑相關(guān)的副作用(例如呼吸抑制、便秘、腎絞痛、惡心和嘔吐，和耐受性和依賴性以及藥物戒斷相關(guān)問題)的可能性。在某些實施方案中，施用足量的NGF拮抗劑以便將實現(xiàn)相同程度的疼痛改善作用所需的阿片樣鎮(zhèn)痛劑的正常劑量降低至少約5％、至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％，或至少約90％，或更高。
采用阿片樣鎮(zhèn)痛劑的疼痛治療還可按本文所述，通過聯(lián)合施用阿片樣鎮(zhèn)痛劑及NGF拮抗劑而得以增強(qiáng)。
在一個方面中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防個體(包括哺乳動物，人類和非人類)中疼痛的方法，包括聯(lián)合施用有效量的NGF拮抗劑及有效量的阿片樣鎮(zhèn)痛劑。另一方面，本發(fā)明提供了增強(qiáng)阿片樣鎮(zhèn)痛劑治療或預(yù)防個體中疼痛的方法，包括聯(lián)合施用有效量的NGF拮抗劑(諸如抗NGF抗體)及有效量的阿片樣鎮(zhèn)痛劑。另一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防、改善和/或防止疼痛的發(fā)展或進(jìn)展的方法。
在某些實施方案中，抗NGF抗體能結(jié)合NGF和有效抑制NGF與其TrkA和/或p75受體的體內(nèi)結(jié)合，和/或有效抑制NGF激活其TrkA和/或p75受體。
另一方面，本發(fā)明提供了改善、延遲疼痛的發(fā)生和/或防止疼痛的進(jìn)展的方法。
本發(fā)明的阿片樣鎮(zhèn)痛劑的實例包括(但不限于)嗎啡、可待因、雙氫可待因、二乙酰嗎啡、氫可酮、氫嗎啡酮、左啡烷、羥嗎啡酮、阿芬太尼、丁丙諾啡、布托啡諾、芬太尼、舒芬太尼、哌替啶、美沙酮、納布啡、丙氧芬和噴他佐辛；或其藥學(xué)上可接受的鹽。在某些實施方案中，阿片樣鎮(zhèn)痛劑是嗎啡；或其藥學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明所用阿片樣鎮(zhèn)痛劑的鹽的示例包括硫酸嗎啡、鹽酸嗎啡、酒石酸嗎啡、磷酸可待因、硫酸可待因、重酒石酸二氫可待因、鹽酸二乙酰嗎啡、重酒石酸氫可酮、鹽酸氫嗎啡酮、酒石酸左啡烷、鹽酸羥嗎啡酮、鹽酸阿芬他尼、鹽酸丁丙諾啡、酒石酸布托啡諾、枸櫞酸芬太尼、鹽酸哌替啶、鹽酸美沙酮、鹽酸納布啡、鹽酸丙氧芬、萘磺酸丙氧芬(2-萘磺酸(1∶1)一水化物)，和鹽酸噴他佐辛。在一個實施方案中，阿片樣鎮(zhèn)痛劑是硫酸嗎啡。
本發(fā)明的方法和組合物可用于治療具有任何病因?qū)W的疼痛，包括急性和慢性疼痛、具有炎性成分的任何疼痛，和通常用阿片樣鎮(zhèn)痛劑處方治療的任何疼痛。疼痛的實例包括外科手術(shù)后疼痛(post-surgical pain)、處置后疼痛(post-operative pain)(包括牙痛)、偏頭痛、頭痛和三叉神經(jīng)痛、與燒傷、傷口或腎結(jié)石相關(guān)的疼痛、與創(chuàng)傷(包括創(chuàng)傷性頭損傷)相關(guān)的疼痛、神經(jīng)性疼痛、與肌骨骼的病癥，諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、胰腺炎、炎性腸病、強(qiáng)直性脊椎炎、血清陰性(非類風(fēng)濕性)關(guān)節(jié)病、非關(guān)節(jié)性風(fēng)濕病和關(guān)節(jié)周疾病相關(guān)的疼痛，以及與癌癥相關(guān)的疼痛(包括“突發(fā)性疼痛”(break-through pain)和與終末期癌相關(guān)的疼痛)、周圍神經(jīng)病和皰疹后神經(jīng)痛。具有炎性成分的疼痛的實例(除上述某些疾病外)包括風(fēng)濕痛、與粘膜炎相關(guān)的疼痛，和痛經(jīng)。在某些實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于治療或預(yù)防手術(shù)后疼痛和癌癥疼痛。
NGF拮抗劑和/或阿片樣鎮(zhèn)痛劑可借助任何適宜的途徑施用于個體。例如，其可經(jīng)口、靜脈內(nèi)、舌下、皮下、動脈內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)直腸、脊柱內(nèi)、胸內(nèi)、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)、舌下、經(jīng)皮或通過吸入而一同或分開，和/或同時，和/或相繼地進(jìn)行施用。施用可以是全身性的(例如，靜脈內(nèi))或局部性的。
另一方面，本發(fā)明提供了治療疼痛的組合物和藥盒，其包括適用于本文所述任何方法的NGF拮抗劑(諸如抗NGF抗體、抗NGF單克隆抗體)和/或阿片樣鎮(zhèn)痛劑。在某些實施方案中，抗NGF抗體能有效抑制NGF結(jié)合其TrkA和/或p75受體和/或能有效抑制NGF激活其TrkA和/或p75受體。
一般技術(shù)實施本發(fā)明采用(除非另有指明)分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))，微生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，其均為本領(lǐng)域的已知技術(shù)。所述技術(shù)在本領(lǐng)域中已得到充分的描述，諸如，Molecular CloningA Laboratory Manual，second edition(Sambrook，等，1989)Cold SpringHarbor Press；Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait，ed.，1984)；Methods inMolecularBiology，Humana Press；Cell BiologyA Laboratory Notebook(J.E.Cellis，ed.，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue CultureLaboratoryProcedures(A.Doyle，J.B.Griffiths，和D.G.Newell，eds.，1993-8) J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos，eds.，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel，等，eds.，1987)；PCRThe Polymerase Chain Reaction，(Mullis，等，eds.，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等，eds.，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodiesa practical approach(D.Catty.，ed.，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal antibodiesa practical approach(P.Shepherd和C.Dean，eds.，Oxford University Press，2000)；Using antibodiesalaboratory manual(E.Harlow 和D.Lane(Cold Spring HarborLaboratory Press，1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra，eds.，Harwood Academic Publishers，1995)。
定義“抗體”(與復(fù)數(shù)形式互換使用)是能夠通過至少一個抗原識別位點而特異性結(jié)合靶諸如糖、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽等的免疫球蛋白分子，所述抗原識別位點位于免疫球蛋白分子的可變區(qū)內(nèi)。如本文所使用的，該術(shù)語不僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，還包括其片段(諸如Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)v)、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體、雙體(diabodies)線性抗體、單鏈抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和包含具有所需特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其它修飾的構(gòu)型。抗體包括任何類型的抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或其亞類)，所述抗體無須是任何特定類型。根據(jù)抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可被分為不同的類型。免疫球蛋白有五個主要類型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，而其中某些還可進(jìn)一步分為亞型(同種型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。與不同類型免疫球蛋白相對應(yīng)的重鏈恒定區(qū)被分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類型的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。
“單克隆抗體”是指均質(zhì)抗體群，其中單克隆抗體由抗原的選擇性結(jié)合所涉及的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)組成。單克隆抗體群具有高度特異性，針對單一的抗原位點。術(shù)語“單克隆抗體”不僅包括完整單克隆抗體和全長單克隆抗體，還包括其片段(諸如Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)v)，單鏈(ScFv)，其突變體，包含抗體部分的融合蛋白質(zhì)，人源化單克隆抗體，嵌合單克隆抗體和包含具有所需特異性的抗原識別位點并能夠結(jié)合抗原的免疫球蛋白分子的任何其它修飾構(gòu)型。這不意在限制抗體的來源和制備其的方式(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動物等)。
“人源化”抗體是指具有基本上源于非人類物種的免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點的分子，該分子的剩余免疫球蛋白結(jié)構(gòu)基于人類免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和/或序列。抗原結(jié)合位點可以包括融合至恒定區(qū)的完整可變區(qū)或被移植至可變區(qū)中適宜構(gòu)架區(qū)上的僅僅互補決定區(qū)(CDRs)?？乖Y(jié)合位點可以是野生型的或通過一個或多個氨基酸置換而修飾的，例如，被修飾以便更近似于人類免疫球蛋白。某些形式的人源化抗體保留了所有CDR序列(例如，包含來自小鼠抗體的所有六個CDRs的人源化小鼠抗體)。其它形式的人源化抗體相對于原始抗體具有一個或多個改變的CDRs(一個、兩個、三個、四個、五個、六個)。在某些情況下，人類免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基或其它殘基被相應(yīng)的非人類殘基置換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體和供體抗體中未見的殘基。
本文所使用的術(shù)語“神經(jīng)生長因子”和“NGF”是指神經(jīng)生長因子和其保留了至少部分NGF活性的變體。如本文所使用的，NGF包括所有哺乳動物物種的天然序列NGF，包括人類、犬、貓、馬或牛的。
“NGF受體”是指由NGF結(jié)合或激活的多肽。NGF受體包括任何哺乳動物物種的TrkA受體和p75受體，所述哺乳動物物種包括(但不限于)人、犬、貓、馬、靈長類或牛。
“NGF拮抗劑”是指可阻滯、抑制或降低(包括顯著性地)NGF生物活性(包括由NGF信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的下游通路，諸如受體結(jié)合和/或誘導(dǎo)針對NGF的細(xì)胞反應(yīng))的任何分子。術(shù)語“拮抗劑”并非意在任何具體的生物作用機(jī)制，應(yīng)理解其清楚地包括和包含所有可能的與NGF的藥理學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)相互作用(無論是直接的還是間接的、或無論是與NGF、其受體的相互作用還是通過另一機(jī)制的相互作用)，及其結(jié)果(可通過多種不同的且化學(xué)上相異的組合物實現(xiàn))。示例性NGF拮抗劑包括，但不限于，抗NGF抗體、針對NGF的反義分子(包括針對編碼NGF的核酸的反義分子)，NGF抑制性化合物，NGF結(jié)構(gòu)類似物，與NGF結(jié)合的TrkA受體的顯性失活突變體，TrkA免疫粘合素，抗TrkA抗體，抗p75抗體，和激酶抑制劑。為了本發(fā)明的目的，應(yīng)當(dāng)明確地認(rèn)識到術(shù)語“拮抗劑”包括所有先前鑒別的、可導(dǎo)致NGF自身，NGF生物活性(包括但不限于其介導(dǎo)疼痛的任何方面的能力)或該生物活性的結(jié)果以任何有意義的程度被實質(zhì)上終止、降低或中和的術(shù)語、名稱和功能狀態(tài)及特征。在某些實施方案中，NGF拮抗劑(例如，抗體)結(jié)合(物理上相互作用于)NGF，結(jié)合NGF受體(諸如trkA受體和/或p75受體)，降低(阻礙和/或阻滯)下游NGF受體信號傳導(dǎo)，和/或抑制(降低)NGF合成、生成或釋放。在其它實施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合NGF并防止TrkA受體二聚化和/或TrkA自磷酸化。在其它實施方案中，NGF拮抗劑抑制或降低NGF合成和/或生成(釋放)。本文中提供了各種NGF拮抗劑的實例。
本文所使用的“抗NGF抗體”是指一種抗體，其能夠結(jié)合NGF和抑制NGF生物活性和/或由NGF信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的下游通路。
““TrkA免疫粘合素”是指包含TrkA受體片段和免疫球蛋白序列的可溶性嵌合分子，所述片段例如是TrkA受體的胞外域，該分子保留了TrkA受體的結(jié)合特異性。
NGF的“生物活性”通常是指結(jié)合NGF受體和/或激活NGF受體信號通路的能力。并非意在限制，生物活性包括以下的任一項或多項結(jié)合NGF受體(諸如p75和/或TrkA)的能力；促進(jìn)TrkA受體二聚化和/或自磷酸化的能力；激活NGF受體信號通路的能力；促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖、生存、生長及其它細(xì)胞生理學(xué)改變的能力，所述改變包括(在神經(jīng)元(包括外周和中樞神經(jīng)元)的情況下)在神經(jīng)元形態(tài)學(xué)、突觸發(fā)生、突觸功能、神經(jīng)遞質(zhì)和/或神經(jīng)肽釋放和損傷后再生方面的改變；和介導(dǎo)疼痛的能力。
術(shù)語“表位“意指蛋白質(zhì)抗原上抗體(單克隆或多克隆抗體)的結(jié)合位點。
本文所使用的“治療”是獲得有益的或需要的臨床結(jié)果的方法。為了本發(fā)明的目的，有益的或需要的臨床結(jié)果包括(但不限于)以下一項或多項改善或減輕疼痛，包括急性、慢性、炎性、神經(jīng)性或手術(shù)后的疼痛的任何方面。為了本發(fā)明的目的，有益的或需要的臨床結(jié)果包括(但不限于)以下一項或多項減輕嚴(yán)重度，減輕與疼痛(包括疼痛的任何方面)相關(guān)的一種或多種癥狀(諸如縮短疼痛持續(xù)期和/或降低疼痛敏感性或感覺)。
疼痛的“發(fā)生率降低”是指對嚴(yán)重度(其可包括降低了對通常用于治療該病癥的其它藥物和/或療法的需要和/或量(例如，暴露量))、持續(xù)時間和/或頻率(包括例如，在個體中延遲疼痛的發(fā)生或增加疼痛發(fā)生前的時間)的任何降低。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能理解，個體對治療的反應(yīng)會有不同，因此，例如“降低個體中疼痛發(fā)生率的方法”反映的是基于如下的合理預(yù)期而聯(lián)合施用本文所述的NGF拮抗劑及本文所述的阿片樣鎮(zhèn)痛劑，所述合理預(yù)期為所述施用可能會在特定個體中導(dǎo)致疼痛發(fā)生率降低的預(yù)期。
疼痛或疼痛的一種或多種癥狀的“改善”是指與未聯(lián)合施用NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑相比，疼痛的一種或多種癥狀的減輕或改善?！案纳啤边€包括縮短或減少癥狀的持續(xù)時間。
疼痛或疼痛的一種或多種癥狀的“緩解”是指在用NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行聯(lián)合治療的個體或個體群中，減輕疼痛的一種或多種不良臨床表現(xiàn)的程度。
如本文所使用的，“延遲”疼痛的發(fā)展是指延遲、阻礙、減緩、延緩、穩(wěn)定和/或推遲疼痛的進(jìn)展。該延遲可以是各種長度的時間，這要根據(jù)病史和/或要治療的個體而定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚的是，實際上，充分或顯著的延遲包括預(yù)防，其中個體不會發(fā)生疼痛?！把舆t”癥狀發(fā)展的方法是指該方法與未使用該方法相比，能夠降低給定時間期限中癥狀發(fā)展的可能性和/或減輕給定時間期限中癥狀的程度。所述比較典型地采用統(tǒng)計學(xué)顯著性數(shù)目的受試者基于臨床研究進(jìn)行。
疼痛的“發(fā)展”或“進(jìn)展”是指病癥的最初顯現(xiàn)和/或接著發(fā)生的進(jìn)展。疼痛的發(fā)展可采用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)進(jìn)行檢測和評估。然而，發(fā)展還指無法檢測到的進(jìn)展。為了本發(fā)明的目的，發(fā)展或進(jìn)展是指癥狀的生物學(xué)過程?！鞍l(fā)展”包括病狀出現(xiàn)(occurrence)、復(fù)發(fā)和發(fā)作。本文所使用的疼痛的“發(fā)作”或“出現(xiàn)”包括初次發(fā)作和/或復(fù)發(fā)。
“有效量”是足以產(chǎn)生有益的或需要的臨床結(jié)果的量，所述結(jié)果包括疼痛感覺的緩解或減輕。為了本發(fā)明的目的，NGF拮抗劑和阿片樣藥劑的有效量包括這樣的量，該量足以治療、改善、減輕任何類型的疼痛的強(qiáng)度，包括急性、慢性、炎性、神經(jīng)性或手術(shù)后疼痛的強(qiáng)度。在某些實施方案中，阿片樣鎮(zhèn)痛劑和NGF拮抗劑的有效量是這樣的NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑的量，該量能夠?qū)τ谕饨绱碳さ拿舾虚撜{(diào)節(jié)至可與健康個體中觀測到的水平相當(dāng)?shù)乃?。在其它實施方案中，該水平可不與健康個體中觀測到的相當(dāng)，但其與不接受聯(lián)合治療的情況相比而言降低。NGF拮抗劑的有效量還包括足以增強(qiáng)疼痛的阿片樣藥劑治療(療效)(如本文所述)或降低疼痛治療或預(yù)防所必需的阿片樣藥劑的劑量(如本文所述)的NGF拮抗劑的量。如本領(lǐng)域中所理解的，與阿片樣藥劑聯(lián)合的NGF拮抗劑的有效量可根據(jù)，尤其是，疼痛類型(和患者病史以及其它因素諸如所使用的NGF拮抗劑和/或阿片樣藥劑的類型(和/或劑量)而變化。在本文中，有效量還可以是實現(xiàn)協(xié)同作用的NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑的量。在本發(fā)明文中，拮抗劑的有效量通常是指足以導(dǎo)致阿片樣藥劑對疼痛的治療效果增強(qiáng)(其又可以意味著劑量降低和/或觀察到某些其它有益效果)和/或?qū)е屡c單獨的阿片樣藥劑治療相比而言的有益效果的量。NGF拮抗劑的“有效量”還可導(dǎo)致與單獨施用NGF拮抗劑或阿片樣藥劑相比而言的協(xié)同作用。在某些實施方案中，“有效量”是足以延遲疼痛發(fā)展的量。
“個體”是脊椎動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選為人。哺乳動物包括(但不限于)農(nóng)用動物、運動用動物、寵物、靈長類、馬、牛、犬、貓、小鼠和大鼠。
術(shù)語“阿片樣鎮(zhèn)痛劑”是指具有嗎啡樣活性的所有藥物(天然的或合成的)。合成和半合成的阿片樣鎮(zhèn)痛劑是五類化合物的衍生物菲；苯基庚基胺；苯基哌啶；嗎啡喃和苯并嗎吩烷，所有這些均在該術(shù)語的范圍之內(nèi)。示例性阿片樣鎮(zhèn)痛劑包括可待因、雙氫可待因、二乙酰嗎啡、氫可酮、氫嗎啡酮、左啡烷、羥嗎啡酮、阿芬太尼、丁丙諾啡、布托啡諾、芬太尼、舒芬太尼、哌替啶、美沙酮、納布啡、丙氧芬和噴他佐辛或其藥學(xué)上可接受的鹽。
如本文所使用的，“聯(lián)合”施用包括同時施用和/或在不同的時間施用。聯(lián)合施用還包括以共制劑形式施用(即，NGF拮抗劑和阿片樣藥劑存在于同一組合物中)或以分開的組合物施用。如本文所使用的，聯(lián)合施用意在包括將阿片樣藥劑和NGF拮抗劑施用于個體(其可同時和/或分開發(fā)生)的任何情況。如本文進(jìn)一步所述，應(yīng)當(dāng)理解的是，NGF拮抗劑和阿片樣藥劑可以以不同的劑量頻率或間隔進(jìn)行施用。例如，抗NGF抗體可每周施用，而阿片樣藥劑可更頻繁的施用。應(yīng)當(dāng)理解的是，NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑可采用相同的施用途徑或不同的施用途徑進(jìn)行施用。
“手術(shù)后疼痛”(post-surgical pain)(可與術(shù)語“切割后”或“創(chuàng)傷后疼痛”互換)是指由深入個體組織中的外傷，諸如切割、刺傷、切開、撕裂或損傷，引起或?qū)е碌奶弁?包括由所有手術(shù)過程(無論是侵入性的或是非侵入性的)導(dǎo)致的疼痛)。本文所使用的“手術(shù)后疼痛”不包括無外部物理創(chuàng)傷而出現(xiàn)(引進(jìn)或?qū)е?的疼痛。在某些實施方案中，手術(shù)后疼痛為內(nèi)部或外部(包括外周的)的疼痛，而損傷、切割傷、創(chuàng)傷、撕裂或切割的發(fā)生可以是偶然的(例如伴隨創(chuàng)傷)或有意的(例如伴隨手術(shù)切割)。本文所使用的“疼痛”包括傷害感受和疼痛感覺，而疼痛可采用疼痛評分以及本領(lǐng)域其它眾所周知的方法進(jìn)行客觀和主觀的評估。本文所述的手術(shù)后疼痛包括異常性疼痛(即，對正常非有害刺激的反應(yīng)增強(qiáng))和痛覺過敏(即，對正常有害刺激或不適刺激的反應(yīng)增強(qiáng))，其又可能具有熱或機(jī)械性(觸覺的)性質(zhì)。在一些實施方案中，疼痛具有熱敏感性、機(jī)械敏感性和/或靜止痛的特征。在某些實施方案中，手術(shù)后疼痛包括機(jī)械性誘導(dǎo)的疼痛或靜止痛。在其它實施方案中，手術(shù)后疼痛包括靜止痛。如本領(lǐng)域所眾所周知的，疼痛可以是原發(fā)或繼發(fā)疼痛。
當(dāng)阿片樣藥劑治療的一個方面被改善時(與施用阿片樣藥劑而不施用NGF拮抗劑時相比較)，疼痛的阿片樣藥劑治療被“增強(qiáng)”。例如，相對于不存在NGF拮抗劑時的阿片樣鎮(zhèn)痛劑的療效，疼痛的阿片樣藥劑治療效果可在存在NGF拮抗劑的情況下得到提高。作為另一實例，可通過聯(lián)合施用NGF拮抗劑及阿片樣鎮(zhèn)痛劑，“增強(qiáng)”阿片樣藥劑對疼痛的治療或預(yù)防，所述聯(lián)合施用能更好地緩解疼痛(例如，當(dāng)所使用的阿片樣藥劑的劑量不能有效治療或預(yù)防疼痛時)。
本發(fā)明的方法本文所公開的所有方法中涉及NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑時，也包括包含這些藥劑之一種或多種的組合物。本發(fā)明可用于治療個體(包括所有哺乳動物，人類和非人類)中疼痛。
在一個方面中，本發(fā)明提供了在個體中治療疼痛的方法，其包括聯(lián)合施用有效量的NGF拮抗劑及有效量的阿片樣鎮(zhèn)痛劑。在某些實施方案中，施用足量的NGF拮抗劑以便將實現(xiàn)相同程度的疼痛改善作用所需的阿片樣鎮(zhèn)痛劑的正常劑量降低至少約5％、至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％，或至少約90％，或更高。
另一方面，本發(fā)明提供了在個體中增強(qiáng)阿片樣鎮(zhèn)痛劑的疼痛治療的方法，其包括聯(lián)合施用有效量的NGF拮抗劑和有效量的阿片樣鎮(zhèn)痛劑。
在某些實施方案中，疼痛包括以下任何一項或多項急性和/或慢性疼痛、具有炎性成分的任何疼痛、外科手術(shù)后疼痛、處置后疼痛(包括牙痛)、偏頭痛、頭痛和三叉神經(jīng)痛、與燒傷、傷口或腎結(jié)石相關(guān)的疼痛、與創(chuàng)傷(包括創(chuàng)傷性頭損傷)相關(guān)的疼痛、神經(jīng)性疼痛、和與癌癥相關(guān)的疼痛(包括“突發(fā)性”痛和與終末期癌相關(guān)的疼痛)。在其它實施方案中，疼痛是通常用阿片樣鎮(zhèn)痛劑(諸如嗎啡)治療的任何疼痛，例如，胰腺炎、腎結(jié)石、頭痛、痛經(jīng)、肌與骨骼的疼痛(例如腰痛)、扭傷、內(nèi)臟痛、卵巢囊腫、前列腺炎、膀胱炎、化學(xué)或熱燒傷、癌癥(諸如前列腺癌骨轉(zhuǎn)移、乳癌骨轉(zhuǎn)移、肺癌骨轉(zhuǎn)移、胰腺癌)。
另一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防、改善和/或防止疼痛的發(fā)展或進(jìn)展的方法。由此，在某些實施方案中，在疼痛事件(諸如手術(shù))之前施用NGF拮抗劑(諸如抗NGF抗體)和/或阿片樣鎮(zhèn)痛劑。例如，可在可能導(dǎo)致疼痛的活動或有危險導(dǎo)致疼痛的活動(諸如外傷或手術(shù))前30分鐘、1小時、5小時、10小時、15小時、24小時或甚至更長時間，諸如1日，幾日甚或1周、2周、3周或更長時間施用NGF拮抗劑。
對疼痛的治療或預(yù)防的評估是本領(lǐng)域眾所周知的。評估可根據(jù)客觀檢測，諸如觀測行為諸如對刺激的反應(yīng)，面部表情等來實施。評估還可根據(jù)主觀檢測，諸如患者對疼痛的特征描述，采用各種疼痛等級來進(jìn)行。參見例如，Katz等，Surg Clin North Am.(1999)79(2)231-52；Caraceni等，J Pain Symptom Manage(2002)23(3)239-55。
應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)聯(lián)合施用NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑時(以單一或以分開的組合物)，神經(jīng)生長因子拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑的比例將與表現(xiàn)出期望效應(yīng)相一致。在某些實施方案中，該比例按神經(jīng)生長因子拮抗劑對阿片樣鎮(zhèn)痛劑的重量計，為大約1∶1。在某些實施方案中，該比例可以是約0.001∶約1至約1000∶約1，或約0.01∶約1至約100∶約1。其它比例也是可預(yù)期的。
應(yīng)當(dāng)理解的是，神經(jīng)生長因子(NGF)拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑用于治療或預(yù)防疼痛所需要的量不僅會隨著具體所選的化合物或組合物變化，還會隨著施用途徑、要治療的病癥的性質(zhì)和患者的年齡和狀態(tài)而變化，其最終取決于主治醫(yī)師的判斷。
NGF拮抗劑本發(fā)明的方法使用NGF拮抗劑，其是指能夠阻滯、抑制或降低(包括顯著性地)NGF生物活性(包括由NGF信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的下游通路，諸如受體結(jié)合和/或引起對NGF的細(xì)胞反應(yīng))的任何分子。術(shù)語“拮抗劑”并非意在任何具體的生物活性機(jī)制，而且應(yīng)當(dāng)認(rèn)為其明確包括和包含所有可能的與NGF的藥理學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)相互作用及其結(jié)果，這可通過各種不同的，且化學(xué)趨異的組合物實現(xiàn)。示例性NGF拮抗劑包括，但不限于，抗NGF抗體，針對NGF的反義分子(包括針對編碼NGF的核酸的反義分子)，針對NGF受體(諸如trkA受體和/或p75受體)的反義分子(包括針對編碼TrkA和/或p75的核酸的反義分子)，NGF抑制性化合物，NGF結(jié)構(gòu)類似物，與NGF結(jié)合的TrkA受體的顯性失活突變體，TrkA免疫粘合素，抗TrkA抗體，抗p75抗體，和激酶抑制劑。為了本發(fā)明的目的，應(yīng)當(dāng)明確地認(rèn)識到術(shù)語“拮抗劑”包括所有先前鑒別的術(shù)語、名稱和功能狀態(tài)和特性，它們可以引起NGF自身、NGF生物活性(包括但不限于NGF介導(dǎo)疼痛之任何方面的能力)或該生物活性的結(jié)果以任何有意義的程度被實質(zhì)上無效、降低或中和。在某些實施方案中，NGF拮抗劑(例如，抗體)結(jié)合(物理上相互作用于)NGF，結(jié)合NGF受體(諸如trkA受體和/或p75受體)，和/或降低(阻礙和/或阻滯)下游NGF受體信號。由此，在某些實施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合(物理上相互作用于)NGF。在其它實施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合NGF受體(諸如TrkA受體或p75)。在其它實施方案中，NGF拮抗劑降低(阻礙和/或阻滯)下游NGF受體信號(例如，激酶信號的抑制劑)。在其它實施方案中，NGF拮抗劑抑制(減少)NGF合成和/或釋放。在另一實施方案中，NGF拮抗劑是TrkA免疫粘合素。在另一實施方案中，NGF拮抗劑不是抗NGF抗體。在某些實施方案中，NGF拮抗劑結(jié)合NGF(諸如hNGF)且不顯著性結(jié)合相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，諸如NT-3，NT4/5，和/或BDNF。在其它實施方案中，NGF拮抗劑是抗NGF抗體。而在其它實施方案中，抗NGF抗體是人源化的(諸如本文所述的抗體E3)。在某些實施方案中，抗NGF抗體是抗體E3(如本文所述)。在其它實施方案中，抗NGF抗體包括抗體E3的一個或多個CDR(s)(諸如一個、兩個、三個、四個、五個，或在一些情況下所有六個來自E3的CDRs)。在其它實施方案中，抗體是人的。而在其它實施方案中，抗NGF抗體包括表1中所示重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO1)和表2中所示輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。而在其它實施方案中，抗體包括修飾的恒定區(qū)，諸如免疫學(xué)上惰性的恒定區(qū)，例如，該恒定區(qū)不能觸發(fā)補體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解，或不能刺激抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。在其它實施方案中，恒定區(qū)按照Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624；PCT申請序號PCT/GB99/01441；和/或UK專利申請序號9809951.8中所述進(jìn)行修飾。
抗NGF抗體在本發(fā)明的某些實施方案中，NGF拮抗劑包括抗NGF抗體?？筃GF抗體應(yīng)表現(xiàn)出以下任何一種或多種特征(a)結(jié)合NGF；(b)抑制NGF生物活性或由NGF信號功能介導(dǎo)的下游通路；(c)預(yù)防或治療疼痛的任何方面，特別是在與阿片樣鎮(zhèn)痛劑聯(lián)合的情況下；(d)阻滯或降低NGF受體活化(包括TrkA受體二聚化和/或自磷酸化)；(e)增加NGF的清除；(f)抑制(減少)NGF合成、生成或釋放；(g)增強(qiáng)疼痛的阿片樣藥劑治療。
抗NGF抗體是本領(lǐng)域已知的，參見例如，PCT公開序號WO01/78698，WO 01/64247，美國專利5,844,092、5,877,016和6,153,189；Hongo等，Hybridoma，19215-227(2000)；Cell.Molec.Biol.13559-568(1993)；GenBank登記序號U39608、U39609、LI 7078或L 17077。
在某些實施方案中，抗NGF抗體是命名為抗體“E3”的人源化小鼠抗NGF單克隆抗體，其包括人類重鏈IgG2a恒定區(qū)(其中包含以下突變A330P331至S330S331(氨基酸編號參照野生型IgG2a序列；參見Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624))；人類輕鏈κ恒定區(qū)；以及表1和2所示的重鏈和輕鏈可變區(qū)。
表1重鏈可變區(qū)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVS(SEQ ID NO1)。
表2輕鏈可變區(qū)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRT(SE Q ID N02)。
編碼E3重鏈可變區(qū)或E3輕鏈可變區(qū)的下列多核苷酸于2003年1月8日保藏于ATCC。
載體Eb.911.3E是編碼表2中所示輕鏈可變區(qū)的多核苷酸；載體Eb.pur.911.3E是編碼表2中所示輕鏈可變區(qū)的多核苷酸而載體Db.911.3E是編碼表1中所示重鏈可變區(qū)的多核苷酸。
在另一實施方案中，抗NGF抗體包括抗體E3的一個或多個CDR(s)(諸如一個、兩個、三個、四個、五個，或在一些情況下所有六個來自E3的CDRs)。確定CDR區(qū)是本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)。
可用于本發(fā)明的抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段(例如，F(xiàn)ab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fc等)、嵌合抗體、雙特異性抗體、雜綴合抗體(heteroconjugate antibody)、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白質(zhì)、人源化抗體和包含具有所需特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其它修飾的構(gòu)型，包括抗體的糖基化變體，抗體的氨基酸序列變體和共價修飾的抗體?？贵w可以是小鼠源、大鼠源、人源或任何其它來源的(包括嵌合的或人源化抗體)。為了本發(fā)明的目的，抗體以抑制NGF和/或由NGF信號功能介導(dǎo)的下游通路的方式與NGF反應(yīng)。而一個實施方案中，抗體是人類抗體，其識別人類NGF上的一個或多個表位。在另一實施方案中，抗體是小鼠或大鼠抗體，其識別人類NGF上的一個或多個表位。在另一實施方案中，抗體識別選自以下的NGF上的一個或多個表位靈長動物、犬、貓、馬和牛的NGF。在其它實施方案中，抗體包括修飾的恒定區(qū)，諸如免疫學(xué)上惰性的恒定區(qū)，例如，該恒定區(qū)不能觸發(fā)補體介導(dǎo)的裂解，或不能刺激抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。ADCC活性可采用美國專利號5,500,362中所述方法進(jìn)行評估。在其它實施方案中，恒定區(qū)按照Eur.J.Immunol.(1999)292613-2624；PCT申請序號PCT/GB99/01441；和/或UK專利申請序號9809951.8中所述進(jìn)行修飾。
抗NGF抗體對NGF(諸如hNGF)的結(jié)合親和力可以是約0.10至約0.80nM、約0.15至約0.75nM和約0.18至約0.72nM。在一些實施方案中，結(jié)合親和力是約2pM、約5pM、約10pM、約15pM、約20pM、約40pM或大于約40pM。而一個實施方案中，結(jié)合親和力為約2pM-22pM。在其它實施方案中，結(jié)合親和力小于約100nM，約50nM，約10nM，約1nM，約500pM，約100pM，約50pM，約10pM。在某些實施方案中，結(jié)合親和力為約10nM。在其它實施方案中，結(jié)合親和力小于約10nM。在其它實施方案中，結(jié)合親和力為約0.1nM或約0.07nM。在其它實施方案中，結(jié)合親和力小于約0.1nM，或小于約0.07nM。在其它實施方案中，結(jié)合親和力為約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM或約50pM的任一項至約2pM、約5pM、約10pM、約15pM、約20pM或約40pM的任一項。在某些實施方案中，結(jié)合親和力為約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM或約50pM的任一項，或小于約50pM。而在其它實施方案中，結(jié)合親和力為約2pM、約5pM、約10pM、約15pM、約20pM、約40pM或大于約40pM。
測定抗體對NGF的結(jié)合親和力的一個方法是檢測抗體的單功能性Fab片段的結(jié)合親和力。為了獲得單功能性Fab片段，可用木瓜蛋白酶酶切或重組表達(dá)抗體(例如，IgG)。抗體的抗NGF Fab片段的親和力可通過表面等離子共振(BlAcore3000TM表面等離子共振(SPR)系統(tǒng)，BIAcore，INC，Piscaway NJ)進(jìn)行測定。CM5芯片可用N-乙基-N′-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)根據(jù)廠商說明書進(jìn)行活化。人類NGF可在10mM醋酸鈉pH 4.0中稀釋，并以0.005mg/mL的濃度注射到活化的芯片上。采用跨各芯片通道的變化流動時間，得到兩個范圍的抗原密度用于詳細(xì)動力學(xué)研究的100-200反應(yīng)單位(RU)以及用于篩選試驗的500-600RU。該芯片可用乙醇胺封閉。再生研究顯示出，Pierce洗脫緩沖液(產(chǎn)品號21004，Pierce Biotechnology，Rockford IL)和4M NaCl(2∶1)的混合物經(jīng)過注射200次以上，能有效地除去結(jié)合的Fab，而在芯片上保留hNGF的活性。HBS-EP緩沖液(0.01M HEPES，pH 7.4，0.15 NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性劑P29)被用作BIAcore測定的運行緩沖液。純化的Fab樣品的連續(xù)稀釋物(0.1-10×估計的KD)以100μL/分鐘注射1分鐘，允許多達(dá)2小時的解離時間。Fab蛋白質(zhì)的濃度通過ELISA和/或SDS-PAGE電泳，采用已知濃度的Fab(通過氨基酸分析測定的)作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定。通過采用BIA評估程序，將數(shù)據(jù)與1∶1 Langmuir結(jié)合模型(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam，L. Petersson，B.(1994).MethodsEnzymology 6.99-110)相擬合而同時得到動力學(xué)締合速率(kon)和解離速率(koff)。以kon/koff計算平衡解離常數(shù)(KD)值。該方案適用于測定抗體對任何物種的NGF的結(jié)合親和力，所述任何物種的NGF包括人類NGF，其它脊椎動物的NGF(在某些實施方案中，哺乳動物)(諸如小鼠NGF、大鼠NGF、靈長類NGF)，并且該方案也適用于與其它神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，諸如相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白NT3，NT4/5和/或BDNF一起使用。
在某些實施方案中，抗體結(jié)合人類NGF，而不顯著性結(jié)合來自其它脊椎動物物種(在某些實施方案中，哺乳動物)的NGF。在某些實施方案中，抗體結(jié)合人類NGF以及來自其它脊椎動物物種(在某些實施方案中，哺乳動物)的一種或多種NGF。而在其它實施方案中，抗體結(jié)合NGF，且不顯著性地與其它神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(諸如相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，NT3，NT4/5和/或BDNF)發(fā)生交叉反應(yīng)。在某些實施方案中，抗體結(jié)合NGF以及至少一種其它神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。在某些實施方案中，抗體結(jié)合哺乳動物物種的NGF，諸如馬或犬的，但不顯著性結(jié)合來自其它哺乳動物物種的NGF。
表位可以是連續(xù)的或不連續(xù)的。而一個實施方案中，抗體與選自以下的抗體基本上結(jié)合相同的hNGF表位MAb 911、MAb 912和MAb 938，如Hongo等，Hybridoma，19215-227(2000)中所述。在另一實施方案中，抗體與MAb 911基本上結(jié)合相同的hNGF表位。而在另一實施方案中，抗體與MAb 909基本上結(jié)合相同的表位。Hongo等，如上。例如，表位可包括以下之一或多個hNGF的可變區(qū)1(氨基酸23-35)中的殘基K32、K34和E35；hNGF的可變區(qū)4(氨基酸81-88)中的殘基F79和T81；可變區(qū)4中的殘基H84和K88；hNGF的可變區(qū)5(氨基酸94-98)和hNGF的C末端(氨基酸111-118)之間的殘基R103；hNGF的前可變區(qū)(pre-variableregion)1(氨基酸10-23)中的殘基Ell；hNGF的可變區(qū)2(氨基酸40-49)和hNGF的可變區(qū)3(氨基酸59-66)之間的Y52；hNGF的C末端中的殘基L112和S113；hNGF的可變區(qū)3中的殘基R59和R69；或hNGF的前可變區(qū)1中的殘基V18、V20和G23。此外，表位可以包括hNGF的可變區(qū)1，可變區(qū)3，可變區(qū)4，可變區(qū)5，N末端區(qū)和/或C末端區(qū)的一個或多個。而在另一實施方案中，抗體顯著性降低hNGF的殘基R103的溶劑可達(dá)性。應(yīng)當(dāng)理解，雖然上述表位涉及人類NGF，但本領(lǐng)域技術(shù)人員能將人類NGF的結(jié)構(gòu)和其它物種的NGF相比對，并鑒別這些表位的可能對應(yīng)物。
在一個方面中，能夠抑制NGF的抗體(例如，人的，人源化的，小鼠的，嵌合的)可通過采用表達(dá)NGF的全長或部分序列的免疫原進(jìn)行制備。另一方面，可使用包含過表達(dá)NGF的細(xì)胞的免疫原?？墒褂玫拿庖咴牧硪粚嵗前LNGF或NGF蛋白質(zhì)的部分的NGF蛋白質(zhì)。
抗NGF抗體可通過本領(lǐng)域已知的任何方法制備。宿主動物免疫接種的途徑和方案通常與用于抗體刺激和制備的成熟常規(guī)技術(shù)保持一致，如本文進(jìn)一步所述的。制備人類和小鼠抗體的一般技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并已被本文公開。
可以想到，任何哺乳動物受試者(包括人類)或來自其的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞均可被操作以便作為制備哺乳動物(包括人類)雜交瘤細(xì)胞系的基礎(chǔ)。典型地，用一定量的免疫原(包括如本文所述的)經(jīng)腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、口服、皮下、足底內(nèi)和/或皮內(nèi)接種宿主動物。
雜交瘤可由淋巴細(xì)胞和永生化骨髓瘤細(xì)胞制備，其中采用Kohler，B.和Milstein，C.(1975)Nature 256495-497的一般體細(xì)胞雜交技術(shù)或按Buck，D.W.等，In Vitro，18377-381(1982)所修飾的技術(shù)?，F(xiàn)有的骨髓瘤細(xì)胞系(包括但不限于X63-Ag8.653和來自Salk Institute，Cell DistributionCenter，San Diego，Calif.，USA的那些細(xì)胞系)可用于雜交。一般地，該技術(shù)包括采用促融劑諸如聚乙二醇，或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的電方法來融合骨髓瘤細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞。融合后，從融合培養(yǎng)基中分離細(xì)胞然后在選擇性生長培養(yǎng)基諸如次黃嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培養(yǎng)基中生長，以清除未雜交的親本細(xì)胞。本文所述任何培養(yǎng)基(添加或未添加血清)均可用于培養(yǎng)分泌單克隆抗體的雜交瘤。作為細(xì)胞融合技術(shù)的另一可選方式，由EBV永生化的B細(xì)胞可被用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗NGF單克隆抗體。將雜交瘤擴(kuò)增并亞克隆，如有需要，通過常規(guī)免疫測定方法(例如，放射免疫測定、酶免疫分析法或熒光免疫分析)對上清液檢測抗免疫原活性。
可作為抗體來源的雜交瘤包括能夠產(chǎn)生特異性針對NGF或其部分的單克隆抗體的親本雜交瘤的所有衍生物、后代細(xì)胞。
采用已知的方法可在體外或體內(nèi)生長能產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤。通過常規(guī)的免疫球蛋白純化方法，諸如硫酸銨沉淀、凝膠電泳、透析、色譜法和超濾(如需要)，可從培養(yǎng)基或體液中分離單克隆抗體。如果存在不需要的活性，可通過，例如，將制品過由附著于固相的免疫原制成的吸附劑和從免疫原上洗脫或釋放所需抗體而將不需要的活性除去。采用人類NGF或包含靶氨基酸序列的片段(通過雙功能性試劑或衍生化試劑，例如馬來酰亞胺苯甲?；腔牾啺孵?通過半胱氨酸殘基的綴合)，N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOC12或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基基團(tuán))而與在要免疫的物種中具有免疫原性的蛋白質(zhì)(例如，匙孔蟲戚血蘭蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)綴合)，免疫宿主動物，可產(chǎn)生抗體群(例如，單克隆抗體)。
如有需要，可對感興趣的抗NGF抗體(單克隆或多克隆)測序，然后將多核苷酸序列克隆至載體中來表達(dá)或增殖。編碼目的抗體的序列可被保持于宿主細(xì)胞的載體中，然后可將宿主細(xì)胞擴(kuò)增并冷凍備用。在可選的方式中，多核苷酸序列可被用于遺傳操作以對抗體“人源化”或增強(qiáng)抗體的親和力或抗體的其它特征。例如，如果抗體被用于人類臨床試驗和治療，可以對恒定區(qū)進(jìn)行工程化處理以便更加類似人類恒定區(qū)從而避免免疫反應(yīng)?？赡苄枰獙贵w序列進(jìn)行遺傳操作以便獲得對NGF更高的親和力和抑制NGF的更高效能。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很明顯的是，可以對抗NGF抗體進(jìn)行一個或多個多核苷酸的改變而仍保留其與NGF的結(jié)合能力。
對單克隆抗體人源化有四個一般步驟。它們是(1)確定起始抗體輕和重可變區(qū)的核苷酸和預(yù)測的氨基酸序列(2)設(shè)計人源化抗體，即，決定在人源化過程中使用何種抗體構(gòu)架區(qū)(3)實際的人源化方法學(xué)/技術(shù)和(4)轉(zhuǎn)染和表達(dá)人源化抗體。參見，例如，美國專利序號4,816,567；5,807,715；5,866,692；6,331,415；5,530,101；5,693,761；5,693,762；5,585,089和6,180,370。
包含來源于非人類免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點的大量“人源化”抗體分子已被公開，包括具有與人類恒定區(qū)融合的嚙齒類或修飾的嚙齒類V區(qū)和其相關(guān)互補決定區(qū)(CDRs)的嵌合抗體。參見，例如，Winter等，Nature349293-299(1991)，Lobuglio等，Proc.Nat.Acad.Sci. USA 864220-4224(1989)，Shaw等，J Immunol.1384534-4538(1987)和Brown等，CancerRes.473577-3583(1987)。其他參考文件公開了將嚙齒類CDRs在與適宜的人類抗體恒定區(qū)融合前植入人類支持構(gòu)架區(qū)(FR)中。參見，例如，Riechmann等，Nature 332323-327(1988)，Verhoeyen等，Science 2391534-1536(1988)和Jones等，Nature 321522-525(1986)。另一參考文件公開了由重組鑲嵌的嚙齒類構(gòu)架區(qū)支持的嚙齒類CDRs。參見，例如，歐洲專利公開號519596。這些“人源化”分子的設(shè)計目的在于將針對嚙齒類抗人抗體分子的不需要的免疫反應(yīng)最小化，所述免疫反應(yīng)限制了這些部分在人類受者中治療應(yīng)用的持續(xù)時間和功效。還可使用的抗體人源化的其它方法被公開于Daugherty等，Nucl.Acids Res.192471-2476(1991)和美國專利序號6,180,377；6,054,297；5,997,867；5,866,692；6,210,671和6,350,861和PCT公開序號WO01/27160中。
而在另一可選方式中，完全人類抗體可通過使用商業(yè)小鼠獲得，所述小鼠已被工程操作以表達(dá)特異性人類免疫球蛋白。被設(shè)計為產(chǎn)生更需要的(例如，完全人類抗體)或更強(qiáng)的免疫反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因動物也可用于生成人源化或人類抗體。所述方法的實例為Abgenix公司(Fremont，CA)的XenomouseTM和Medarex公司(Princeton，NJ)的HuMAb-Mouse和TCMouseTM。
顯而易見的是，雖然上述內(nèi)容涉及人源化抗體，但所公開的一般原理也適用于定制抗體而用于，例如，犬、貓、靈長類、馬和牛中。此外顯而易見的是，本文所述抗體人源化的一個或多個方面可與，例如CDR移植、構(gòu)架突變和CDR突變聯(lián)合。
在一個可選方式中，抗體可采用本領(lǐng)域已知的任何方法重組地制備和表達(dá)。在另一可選方式中，抗體可通過噬菌體展示技術(shù)而重組地制備。參見，例如，美國專利序號5,565,332；5,580,717；5,733,743和6,265,150；和Winter等，Annu.Rev.Immunol.12433-455(1994)?？蛇x地，噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，Nature 348552-553(1990))可被用于從來自未免疫供者的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因庫中體外制備人類抗體和抗體片段。根據(jù)該技術(shù)，將抗體V區(qū)基因以符合讀框方式克隆至絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因中，并以功能性抗體片段而展示在噬菌體顆粒的表面上。因為絲狀噬菌體顆粒包括噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，基于抗體功能特性的選擇也導(dǎo)致選擇出編碼展示這些特性的抗體的基因。由此，噬菌體模擬了B細(xì)胞的某些特性。噬菌體展示可以以多種方式實施，綜述參見例如，Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion inStructural Biology 3，564-571(1993)。幾種V基因區(qū)段來源可被用于噬菌體展示。Clackson等，Nature 352624-628(1991)從來自免疫小鼠的脾的V基因的小隨機(jī)組合文庫中分離了多種抗唑酮抗體?？蓸?gòu)建來自未免疫人類供者的V基因庫，而且基本上根據(jù)Mark等，J Mol.Biol. 222581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)所述技術(shù)可分離針對一系列不同抗原(包括自體抗原)的抗體。在天然免疫反應(yīng)中，抗體基因以高速率累積突變(體細(xì)胞高變)。引入的某些改變將提供更高的親和力，展示高親和力表面免疫球蛋白的B細(xì)胞在隨后抗原攻擊期間被優(yōu)先復(fù)制和分化。該天然過程可通過使用被稱為“鏈改組”(chain shuffling)的技術(shù)進(jìn)行模擬，Marks，等，Biol/Technol.10779-783(1992))。在該方法中，通過噬菌體展示得到的“初級”人類抗體的親和力可通過隨后用獲自未免疫供者的V區(qū)基因天然突變體庫(repertoires)替換重和輕鏈V區(qū)基因而得以提高。該技術(shù)能夠生產(chǎn)具有pM-nM范圍親和力的抗體和抗體片段。制備非常大的噬菌體抗體庫的策略(也稱為“the mother-of-all libraries”)已被公開于Waterhouse等，Nucl.Acids Res.212265-2266(1993)?；蚋慕M還可被用于從嚙齒類抗體中衍生人類抗體，其中人類抗體具有與起始嚙齒類抗體相似的親和力和特異性。根據(jù)該方法(也被稱為“表位印記”(epitopeimprinting))，通過噬菌體展示技術(shù)得到的嚙齒類抗體的重或輕鏈V區(qū)基因被人類V區(qū)基因庫替換，產(chǎn)生嚙齒類-人類嵌合體。在抗原上的選擇導(dǎo)致分離能恢復(fù)功能性抗原結(jié)合位點的人類可變區(qū)，即，表位支配(印記)配偶體的選擇。當(dāng)重復(fù)該過程以便替換剩余的嚙齒類V區(qū)時，得到人類抗體(參見PCT申請序號WO 93/06213，1993年4月1日公布)。與通過CDR移植的嚙齒類抗體傳統(tǒng)人源化不同，該技術(shù)提供了完全的人類抗體，其不含有嚙齒類來源的構(gòu)架或CDR殘基。顯然，雖然上述內(nèi)容涉及人源化抗體，但所述一般原則也適用于定制抗體在例如，犬、貓、靈長類、馬和牛中使用。
抗體可通過如下方法重組制備，即首先從宿主動物中分離抗體和產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，得到基因序列，和使用該基因序列以在宿主細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞)中重組表達(dá)抗體。可使用的另一方法是在植物(例如，煙草)或轉(zhuǎn)基因乳中表達(dá)抗體序列。在植物或乳中重組表達(dá)抗體的方法已被公開。參見，例如，Peeters等，Vaccine 192756(2001)；Lonberg，N.和D.Huszar Int.Rev.Immunol 1365(1995)和Pollock，等，J Immunol Methods 231147(1999)。制備抗體衍生物，例如，人源化抗體、單鏈抗體等的方法是本領(lǐng)域已知的。
免疫測定法和流式細(xì)胞分選技術(shù)諸如熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)也可被用于分離特異性針對NGF的抗體。
抗體可與多種不同的載體結(jié)合。載體可以是活性的和/或惰性的。眾所周知的載體的實例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、玻璃、天然和改性的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁石。根據(jù)本發(fā)明的目的，載體的性質(zhì)可以是可溶的或不可溶的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能知曉用于結(jié)合抗體的其它適宜載體，或能夠采用常規(guī)實驗確定所述載體。
采用常規(guī)技術(shù)(例如，通過采用能夠特異性結(jié)合編碼單克隆抗體的重和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)可很容易地對編碼單克隆抗體的DNA分離和測序。雜交瘤細(xì)胞是所述DNA的優(yōu)選來源。一經(jīng)分離，可將DNA置于表達(dá)載體中(諸如WO 87/04462中公開的表達(dá)載體)，然后將其轉(zhuǎn)染至不另外產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌細(xì)胞，猿COS細(xì)胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞中，以便在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。參見例如，PCT公開序號WO 87/04462。DNA還可通過如下方式進(jìn)行修飾，例如，通過用人類重和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列替換同源鼠序列(Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.816851(1984))或通過將非免疫球蛋白多肽的編碼序列的全部或部分共價連接至免疫球蛋白的編碼序列。以該方式，制備具有本文所述抗NGF單克隆抗體的結(jié)合特異性的“嵌合”或“雜合”抗體。
抗NGF抗體可采用本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行表征。例如，一種方法是鑒別其結(jié)合的表位，或“表位作圖”。本領(lǐng)域中存在多種已知的用于蛋白質(zhì)上表位的定位的作圖和表征方法，包括解析抗體-抗原復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，競爭測定法，基因片段表達(dá)測定法和基于合成肽的測定法，其被描述于，例如，Harlow和Lane，抗體使用，實驗室手冊(Using Antibodies，a Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York，1999的第11章中。在其它實例中，表位作圖可被用于測定抗NGF抗體所結(jié)合的序列。表位作圖可獲自多種商業(yè)來源，例如，Pepscan Systems(Edelhertweg 15，8219 PH Lelystad，The Netherlands)。表位可以是線性表位，即，包含在一段氨基酸序列中，或可以是由不一定包含在一段氨基酸序列中的多個氨基酸的三維相互作用形成的構(gòu)象表位?？煞蛛x或合成(例如，重組地)具有各種長度的肽(例如，至少4-6個氨基酸長度)，并與抗NGF抗體用于結(jié)合測定法。在另一實例中，抗NGF抗體所結(jié)合的表位可通過采用來自NGF序列的重疊肽和測定其與抗NGF抗體的結(jié)合而在系統(tǒng)篩選中得以確定。根據(jù)基因片段表達(dá)測定法，編碼NGF的開放讀碼框被隨機(jī)或由特異性遺傳構(gòu)建體進(jìn)行片段化，然后測定表達(dá)的NGF片段與要被檢測的抗體的反應(yīng)性。基因片段可通過，例如，PCR進(jìn)行制備，然后在存在放射性氨基酸的情況下，于體外轉(zhuǎn)錄和翻譯為蛋白質(zhì)。然后通過免疫沉淀和凝膠電泳測定抗體與放射性標(biāo)記的NGF片段的結(jié)合。某些表位還可通過采用噬菌體顆粒表面上展示的大型隨機(jī)肽序列文庫(噬菌體文庫)進(jìn)行鑒別?？蛇x地，由重疊肽片段組成的確定文庫可被用在簡單結(jié)合測定法中檢測與試驗抗體的結(jié)合。在其它實例中，可實施抗原結(jié)合域的誘變，域交換試驗和丙氨酸掃描誘變以便鑒別對于實現(xiàn)表位結(jié)合而言需要的、足夠的和/或必須的殘基。例如，可采用突變NGF實施域交換試驗，所述突變NGF中，NGF多肽的不同片段已被來自非常相關(guān)的、但抗原性不同的蛋白質(zhì)(諸如神經(jīng)營養(yǎng)蛋白家族的其它成員)的序列替換(交換)。通過評估抗體對突變NGF的結(jié)合，可評估特定NGF片段對抗體結(jié)合的重要性。
而可用于表征抗NGF抗體的另一方法是使用已知結(jié)合相同抗原(即，NGF上的各種片段)的其它抗體的競爭測定法，以測定抗NGF抗體是否與其它抗體結(jié)合相同的表位。競爭測定法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的?？捎糜诒景l(fā)明的競爭測定法的抗體的實例包括MAb 911，912，938，如Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000)中所述。
其它NGF拮抗劑可使用非抗NGF抗體的NGF拮抗劑。在本發(fā)明的某些實施方案中，NGF拮抗劑包括至少一種能夠阻滯或降低功能性NGF表達(dá)的反義分子。NGF的核苷酸序列是已知的，可很容易地從公眾可得到的數(shù)據(jù)庫中獲得。參見例如，Borsani等，Nuc.Acids Res.1990，18，4020；登錄號NM 002506；Ullrich等，Nature 303821-825(1983)。制備能夠特異性結(jié)合NGF mRNA而不與其它多核苷酸發(fā)生交叉反應(yīng)的反義寡核苷酸分子是常規(guī)的方法。靶向的實例性位點包括，但不限于，起始密碼子，5′調(diào)節(jié)區(qū)，編碼序列和3′非翻譯區(qū)。在某些實施方案中，寡核苷酸的長度為約10-100個核苷酸，長度為約15-50個核苷酸，長度為約18-25個核苷酸，或更多。寡核苷酸可包括本領(lǐng)域眾所周知的主鏈修飾諸如，硫代磷酸酯鍵和2′-O糖修飾。示例性反義分子包括美國公開序號20010046959中公開的NGF反義分子；還可參見http//www.rna-tec.com/repair.htm。
在其它實施方案中，NGF拮抗劑包括至少一種能夠阻滯或降低功能性NGF受體(諸如TrkA和/或p75)表達(dá)的反義分子。Woolf等，J.Neuroscie(2001)21(3)1047-55；Taglialetela等，J Neurochem(1996)66(5)1826-35。TrkA和p75的核苷酸序列是已知的，并可很容易地從公眾可得到的數(shù)據(jù)庫中獲得。
可選地，采用基因敲除、嗎啉寡核苷酸、RNAi或核酶，以本領(lǐng)域眾所周知的方法可降低NGF表達(dá)和/或釋放。參見http//www.macalester.edu/～montgomery/RNAi.html；
http//pub32.ezboard.com/fmorpholinosfrml9.showMessage？topicID＝6.topic；http//www.highveld.com/ribozyme.html。
在其它實施方案中，NGF拮抗劑包括至少一種NGF抑制性化合物。本文所使用的“NGF抑制性化合物”是指除抗NGF抗體之外的化合物，其能夠直接或間接地減少、抑制、中和或終止NGF生物活性。NGF抑制性化合物應(yīng)表現(xiàn)出以下任一項或多項特性(a)結(jié)合NGF；(b)抑制NGF生物活性或由NGF信號功能介導(dǎo)的下游通路；(c)特別是與阿片樣鎮(zhèn)痛劑聯(lián)合，預(yù)防或治療疼痛的任何方面；(d)阻滯或降低NGF受體活化(包括TrkA受體二聚化和/或自磷酸化)；(e)增加NGF的清除；(f)抑制(減少)NGF合成、生成或釋放；(g)增強(qiáng)阿片劑的疼痛治療。示例性NGF抑制性化合物包括美國公開序號20010046959中所述的小分子NGF抑制劑；抑制NGF與p75結(jié)合的化合物，如PCT公開序號WO 00/69829中所述；抑制NGF與TrkA/p75結(jié)合的化合物，如PCT公開序號WO 98/17278中所述。NGF抑制性化合物的其它實例包括PCT公開序號WO 02/17914和WO02/20479中所描述的，以及美國專利序號5,342,942；6,127,401；和6,359,130中所描述的化合物。其它示例性NGF抑制性化合物是作為NGF的競爭性抑制劑的化合物。參見美國專利序號6,291,247。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可制備其它小分子NGF抑制性化合物。
在某些實施方案中，NGF抑制性化合物結(jié)合NGF。靶向(結(jié)合)的示例性位點包括，但不限于，NGF中結(jié)合TrkA受體和/或p75受體的部分，和NGF中鄰近受體結(jié)合區(qū)的那些部分和負(fù)責(zé)(部分地)受體結(jié)合部分的正確三維形狀的那些部分。在另一實施方案中，NGF抑制性化合物結(jié)合NGF受體(諸如TrkA和/或p75)，并抑制NGF生物活性。靶向的示例性位點包括TrkA和/或p75中結(jié)合NGF的那些部分。
在包含小分子的實施方案中，小分子的分子量可以是約100-20,000道爾頓，500-15,000道爾頓，或1000-10,000道爾頓。小分子的文庫可通過商業(yè)獲得。小分子可采用本領(lǐng)域任何已知方法進(jìn)行施用，包括吸入、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)口、經(jīng)腸、腸胃外、鼻內(nèi)或經(jīng)皮。一些實施方案中，當(dāng)NGF-拮抗劑是小分子時，其將以0.1-300mg/kg患者體重的比率，分為1-3或更多劑量進(jìn)行施用。對于正常體重的成年患者，可施用范圍為1mg-5g/劑的劑量。
在其它實施方案中，NGF拮抗劑包括至少一種NGF結(jié)構(gòu)類似物。本發(fā)明中的“NGF結(jié)構(gòu)類似物”是指三維結(jié)構(gòu)與NGF的部分三維結(jié)構(gòu)相似并在生理條件下于體外或體內(nèi)結(jié)合NGF受體的化合物。而一個實施方案中，NGF結(jié)構(gòu)類似物結(jié)合TrkA和/或p75受體。示例性NGF結(jié)構(gòu)類似物包括，但不限于，PCT公開序號WO 97/15593中所述二環(huán)肽；美國專利序號6,291,247中所述二環(huán)肽；美國專利號6,017,878中所述環(huán)狀化合物；和PCT公開序號WO 89/09225中所述源于NGF的肽。適宜的NGF結(jié)構(gòu)類似物還可通過對NGF-受體結(jié)合進(jìn)行分子模建，例如通過PCT公開序號WO 98/06048中所述方法進(jìn)行設(shè)計和合成。NGF結(jié)構(gòu)類似物可以是單體或是通過與相同或不同結(jié)構(gòu)的任何所需組合形成的二聚體/寡聚體，以便得到提高的親和力和生物效應(yīng)。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一種TrkA受體和/或p75受體的顯性失活突變體的NGF拮抗劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可制備例如，TrkA受體的顯性失活突變體以便使該受體結(jié)合NGF并由此作為“槽子”(sink)俘獲NGF。然而，顯性失活突變體在結(jié)合NGF后不具有受體(例如TrkA受體)的正常生物活性。示例性顯性失活突變體包括，但不限于，下述參考文件中公開的突變體Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998，95，10884；Eide等，J.Neurosci.1996，16，3123；Liu等，J Neurosci 1997，17，8749；Klein等，Cell 1990，61，647；Valenzuela等，Neuron 1993，10，963；Tsoulfas等，Neuron 1993，10，975和Lamballe等，EMBO J 1993，12，3083，各參考文件均全文引入此處作為參考。顯性失活突變體可以用蛋白質(zhì)形式或用可以在體內(nèi)表達(dá)顯性失活突變體例如突變TrkA受體的表達(dá)載體形式進(jìn)行施用。蛋白質(zhì)或表達(dá)載體可采用本領(lǐng)域任何已知方法進(jìn)行施用，諸如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)口、經(jīng)腸、腸胃外、鼻內(nèi)、經(jīng)皮或通過吸入。例如，表達(dá)載體的施用包括局部或全身施用，包括注射、口服施用、基因槍或插入導(dǎo)管施用，及局部施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可很熟練地施用表達(dá)載體以獲得外源蛋白質(zhì)在體內(nèi)的表達(dá)。參見例如，美國專利序號6,436,908；6,413,942和6,376,471。
還可使用包含反義多核苷酸、表達(dá)載體或亞基因組多核苷酸的治療性組合物的靶向遞送。受體介導(dǎo)的DNA遞送技術(shù)已被公開于，例如，F(xiàn)indeis等，Trends Biotechnol.(1993)11202；Chiou等，Gene TherapeuticsMethods And Applications Of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff，ed.)(1994)；Wu等，J.Biol.Chem.(1988)263621；Wu等，J Biol Chem.(1994)269542；Zenke等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)873655；Wu等，J.Biol.Chem.(1991)266338。包含多核苷酸的治療性組合物在基因治療方案中以約100ng至約200mg(或更多)DNA的量局部施用。在某些實施方案中，在基因治療過程期間還可施用小于約500ng、約500ng至約50mg、約1μg至約2mg、約5μg至約500μg和約20μg至約100μg的DNA或更高的濃度范圍。本發(fā)明的治療性多核苷酸和多肽可采用基因遞送運載體進(jìn)行遞送。基因遞送運載體可以是病毒或非病毒來源的(通常參見，Jolly，Cancer Gene Therapy(1994)151；Kimura，Human Gene Therapy(1994)5845；Connelly，Human Gene Therapy(1995)1185；和Kaplitt，NatureGenetics(1994)6148)。所述編碼序列的表達(dá)可采用內(nèi)源性哺乳動物啟動子或異源性啟動子和/或增強(qiáng)子進(jìn)行引導(dǎo)。編碼序列的表達(dá)可以是組成性的或被調(diào)節(jié)的。
用于遞送所需多核苷酸和在所需細(xì)胞中實現(xiàn)表達(dá)的基于病毒的載體是本領(lǐng)域眾所周知的。示例性基于病毒的載體包括，但不限于，重組反轉(zhuǎn)錄病毒(參見例如，PCT公開序號WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805；美國專利序號5,219,740和4,777,127；GB專利號2,200,651；和EP專利號0 345 242)，基于甲病毒的載體(例如，辛德比斯病毒載體、塞姆利基森林病毒(ATCCVR-67，ATCC VR-1247)，羅斯河病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))，和腺相關(guān)病毒(AAV)載體(參見，例如，PCT公開序號WO 94/12649，WO93/03769；WO93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)。還可使用如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3147中所述的，與死腺病毒相連接的DNA的施用。
還可使用非病毒遞送運載體和方法，包括但不限于，單獨地未與死腺病毒連接的或與之連接的聚陽離子濃縮的DNA(參見例如，Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3147)；與配體連接的DNA(參見例如，Wu，J Biol.Chem.(1989)26416985)；真核細(xì)胞遞送運載體細(xì)胞(參見例如，美國專利序號5,814,482；PCT公開序號WO 95/07994；WO 96/17072；WO 95/30763；和WO 97/42338)和核電荷中和或與細(xì)胞膜融合。還可使用裸DNA。示例性裸DNA導(dǎo)入方法已被公開于PCT公開序號WO 90/11092和美國專利序號5,580,859中。可作為基因遞送運載體的脂質(zhì)體已被公開于美國專利序號5,422,120；PCT公開序號WO95/13796；WO94/23697；WO 91/14445；和EP專利號0524968。其它方法已被公開于Philip，Mol.Cell Biol.(1994)142411和Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)911581中。
很明顯，表達(dá)載體可被用于指導(dǎo)任何本文所述的基于蛋白質(zhì)的NGF拮抗劑(例如，抗NGF抗體，TrkA免疫粘合素等)的表達(dá)。例如，能夠阻滯(部分至全部阻滯)NGF和/或NGF生物活性的其它TrkA受體片段是本領(lǐng)域已知的。
在另一實施方案中，NGF拮抗劑包含至少一種TrkA免疫粘合素。本文所使用的TrkA免疫粘合素是指可溶性嵌合分子，其包含TrkA受體的胞外域(或其部分)和免疫球蛋白序列，其保留了TrkA受體的結(jié)合特異性(在一些實施方案中，基本上保留了trkA受體的結(jié)合特異性)，且能結(jié)合NGF。TrkA免疫粘合素能夠阻滯(降低和/或抑制)NGF生物活性，如本文所述。
TrkA免疫粘合素是本領(lǐng)域中已知的，且已發(fā)現(xiàn)其能阻滯(降低或抑制)NGF與TrkA受體的結(jié)合。參見，例如，美國專利序號6,153,189。一個實施方案中，TrkA免疫粘合素包括能夠結(jié)合NGF的TrkA受體氨基酸序列(或基本上保留了trkA受體的結(jié)合特異性的氨基酸序列)和免疫球蛋白序列(或基本上保留了trkA受體的結(jié)合特異性的氨基酸)的融合。在某些實施方案中，TrkA受體是人類TrkA受體序列，且所述融合是與免疫球蛋白恒定區(qū)序列的融合。在其它實施方案中，免疫球蛋白恒定區(qū)序列是免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列。在其它實施方案中，兩個TrkA受體-免疫球蛋白重鏈融合物的締合(例如，借助通過二硫鍵的共價鍵)產(chǎn)生同型二聚體免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)。免疫球蛋白輕鏈可進(jìn)一步與二硫鍵鍵合的二聚體中的一個或兩個TrkA受體-免疫球蛋白嵌合體締合以生成同型三聚體或同型四聚體結(jié)構(gòu)。適宜的TrkA免疫粘合素的實例包括如美國專利序號6,153,189中所述的那些。
在另一實施方案中，NGF拮抗劑包含至少一種抗TrkA抗體，該抗體能阻滯、抑制、改變和/或降低NGF與TrkA受體的物理相互作用和/或下游信號，由此降低和/或阻滯NGF生物活性。抗TrkA抗體是本領(lǐng)域已知的。示例性抗TrkA抗體包括如PCT公開序號WO 97/21732，WO00/73344，WO 02/15924和美國公開序號20010046959所述的那些。
在另一實施方案中，NGF拮抗劑包含至少一種抗p75抗體，該抗體能阻滯、抑制和/或降低NGF與p75受體的物理相互作用和/或下游信號，由此降低和/或阻滯了NGF生物活性。
在另一實施方案中，NGF拮抗劑包含至少一種激酶抑制劑，該抑制劑能抑制與TrkA和/或p75受體活性相關(guān)的下游激酶信號傳導(dǎo)。示例性激酶抑制劑是K252a或K252b，其是本領(lǐng)域已知的并已被公開于Knusel等，J.Neurochem.59715-722(1992)；Knusel等，J Neurochemistry 57955-962(1991)；Koizumi等，J.Neuroscience 8715-721(1988)；Hirata等，Chemical Abstracts 111728，XP00204135，參見摘要以及12th CollectiveChemical Substance Index，p.34237，c.3(5-7)，55-60，66-69)，p.34238，c.1(41-44)，c.2(25-27，32-33)，p.3423，c.3(48-50，52-53)和美國專利序號6,306,849。
可以預(yù)期，若臨床醫(yī)師需要，將可鑒定大量其它類型的NGF拮抗劑。
NGF拮抗劑的鑒定采用本領(lǐng)域已知的方法，可對抗NGF抗體和其它NGF拮抗劑進(jìn)行鑒定和特征描述，其中由所述已知方法可檢測和/或測定NGF生物活性的降低、改善或中和。例如，美國專利序號5,766,863和5,891,650中公開的激酶受體活化(KIRA)測定法可用于鑒定NGF拮抗劑，該ELISA型測定法適于定性或定量地檢測激酶的活化(其中測定受體蛋白酪氨酸激酶(以下稱為“rPTK”)，例如TrkA受體的激酶結(jié)構(gòu)域的自磷酸化作用)，以及適用于鑒定和表征選擇的rPTK，例如，TrkA的可能拮抗劑。此測定法的第一階段包括激酶受體(例如，TrkA受體)的激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化，其中受體存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞膜中。該受體可以是內(nèi)源性受體或可以將編碼受體或受體構(gòu)建體的核酸轉(zhuǎn)化至細(xì)胞中。典型地，第一固相(例如，第一測定板的孔)用基本上均質(zhì)的所述細(xì)胞群(通常是哺乳動物細(xì)胞系)進(jìn)行包被，以便將細(xì)胞粘附于固相。通常，細(xì)胞具有貼壁性，由此自然地粘附于第一固相。如果使用“受體構(gòu)建體”，其通常包含激酶受體和Flag多肽的融合。Flag多肽在此測定法的ELISA部分中被俘獲劑(常是俘獲抗體)識別。然后，將分析物，諸如候選抗NGF抗體或其它NGF拮抗劑，與NGF一同加入具有貼壁細(xì)胞的孔中，由此將酪氨酸激酶受體(例如TrkA受體)暴露于(或接觸)NGF和分析物。該測定法能夠鑒定可抑制TrkA的配體NGF對TrkA的活化的抗體(或其他NGF拮抗劑)。在暴露于NGF和分析物之后，采用裂解緩沖液(其中含有增溶性去污劑)以溶解貼壁的細(xì)胞，然后輕柔攪拌，由此釋放細(xì)胞裂解產(chǎn)物，其可被直接用于本測定法的ELISA部分，而無須對細(xì)胞裂解產(chǎn)物濃縮或澄清化。
然后將由此制備的細(xì)胞裂解產(chǎn)物置于本測定法的ELISA階段。作為ELISA階段的第一步，用俘獲劑(常是俘獲抗體)包被第二固相(通常是ELISA微量滴定板的孔)，所述俘獲劑特異性結(jié)合酪氨酸激酶受體，或(在受體構(gòu)建體的情況下)結(jié)合Flag多肽。對第二固相實施包被，以便使俘獲劑粘附于第二固相。俘獲劑一般是單克隆抗體，但，如本文實施例中所述，還可以使用多克隆抗體。然后將得到的細(xì)胞裂解產(chǎn)物暴露于，或接觸粘附的俘獲劑，以便使受體或受體構(gòu)建體粘附于(或被俘獲于)第二固相。然后實施洗滌步驟，以便除去未結(jié)合的細(xì)胞裂解產(chǎn)物，而保留俘獲的受體或受體構(gòu)建體。然后將粘附的或俘獲的受體或受體構(gòu)建體暴露于或接觸能夠鑒定酪氨酸激酶受體中磷酸化的酪氨酸殘基的抗磷酸酪氨酸抗體。而一個實施方案中，抗磷酸酪氨酸抗體與酶綴合(直接或間接)，所述酶催化非放射性顏色試劑的顏色改變。由此，可通過隨后試劑的顏色改變而檢測受體的磷酸化?？蓪⒃撁钢苯咏Y(jié)合于抗磷酸酪氨酸抗體，或可將綴合性分子(例如，生物素)綴合于抗磷酸酪氨酸抗體上，隨后可借助此綴合性分子而將酶結(jié)合于抗磷酸酪氨酸抗體上。最終，例如，通過顏色試劑的顏色改變來檢測抗磷酸酪氨酸抗體與俘獲的受體或受體構(gòu)建體的結(jié)合。
NGF拮抗劑還可通過將候選試劑和NGF孵育和監(jiān)測以下一項或多項特性而進(jìn)行鑒定(a)結(jié)合NGF；(b)抑制NGF生物活性或由NGF信號功能介導(dǎo)的下游通路；(c)阻滯或降低NGF受體活化(包括TrkA受體二聚化和/或自磷酸化)；(d)增加NGF的清除；(e)特別是與阿片樣鎮(zhèn)痛劑聯(lián)合，預(yù)防、改善或治療疼痛的任何方面；(f)抑制(減少)NGF合成、生成或釋放；(g)增強(qiáng)疼痛的阿片樣藥劑治療。在某些實施方案中，NGF拮抗劑可通過將候選試劑和NGF孵育并監(jiān)測結(jié)合及與之伴隨的NGF生物活性的降低或中和而進(jìn)行鑒定。結(jié)合測定法可采用純化的NGF多肽，或采用天然表達(dá)或轉(zhuǎn)染表達(dá)NGF多肽的細(xì)胞來實施。而一個實施方案中，結(jié)合測定法是競爭性結(jié)合測定法，其中評估候選抗體與已知NGF拮抗劑競爭結(jié)合NGF的能力。該測定法可以用多種形式(包括ELISA形式)實施。在其它實施方案中，NGF拮抗劑可通過將候選試劑和NGF孵育并監(jiān)測與之伴隨的對TrkA受體的二聚化和/或自磷酸化的抑制而進(jìn)行鑒定。
初步鑒定后，可通過生物測定法(已知用于檢測靶向生物活性)來進(jìn)一步證實和精細(xì)化候選抗NGF拮抗劑的活性?？蛇x地，生物測定法可被用于直接篩選候選物。例如，NGF促進(jìn)應(yīng)答細(xì)胞中多種形態(tài)學(xué)上可識別的改變。其包括，但不限于，促進(jìn)PC 12細(xì)胞的分化和增強(qiáng)神經(jīng)突從這些細(xì)胞的生長(Urfer等，Biochem.364775-4781(1997)；Tsoulfas等，Neuron 10975-990(1993))，促進(jìn)神經(jīng)突從應(yīng)答性感覺和交感神經(jīng)節(jié)外植體向外生長(Levi-Montalcini，R.和Angeletti，P.神經(jīng)生長因子，Physiol.Rev.48，534-569，1968)以及促進(jìn)NGF依賴性神經(jīng)元諸如胚胎背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)或交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的存活(例如，Chun & Patterson，Dev.Biol.75705-711，(1977)；Buchman & Davies，Development 118989-1001，(1993)。由此，用于NGF生物活性抑制的測定法需要將NGF應(yīng)答細(xì)胞與NGF加分析物，諸如候選抗NGF抗體或候選NGF拮抗劑一同培養(yǎng)。適宜時間后，測定細(xì)胞反應(yīng)(細(xì)胞分化、神經(jīng)突向外生長或細(xì)胞存活)。
候選NGF拮抗劑阻滯或中和NGF生物活性的能力還可通過監(jiān)測候選劑在胚胎大鼠背根神經(jīng)節(jié)存活生物測定法中抑制NGF介導(dǎo)的存活的能力而進(jìn)行評估，如Hongo等，Hybridoma 19215-227(2000)中所述。
組合物本發(fā)明的組合物包含有效量的NGF拮抗劑(諸如抗NGF抗體)和/或阿片樣鎮(zhèn)痛劑，如本文多種實施方案中所述。在某些實施方案中，該組合物還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。在某些實施方案中，該組合物用于本文所述的任何方法中(諸如治療手術(shù)后疼痛的方法)。所述組合物以及其配制方法的實例也在前面和下面的章節(jié)中給出描述。NGF拮抗劑和阿片樣藥劑可存在于單一組合物中，或是分開的組合物中。由此，在某些實施方案中，NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑存在于相同組合物中。在其它實施方案中，NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑存在于分開的組合物中。
在另一方面中，本發(fā)明提供了NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑的協(xié)同性組合物。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療疼痛(諸如手術(shù)后疼痛)的包含NGF拮抗劑的藥物組合物，其中所述使用包括同時和/或相繼施用阿片樣鎮(zhèn)痛劑。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療疼痛的包含阿片樣鎮(zhèn)痛劑的藥物組合物，其中所述使用包括同時和/或相繼施用NGF拮抗劑。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療疼痛的、包含以分開、同時和/或相繼方式施用的NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑的藥物組合物。在某些實施方案中，NGF拮抗劑是抗NGF抗體(諸如本文所述的抗體E3)。在其它實施方案中，阿片樣鎮(zhèn)痛劑是嗎啡。而在其它實施方案中，NGF拮抗劑是抗NGF抗體而阿片樣鎮(zhèn)痛劑是嗎啡。
應(yīng)當(dāng)理解的是，組合物可包含一種以上NGF拮抗劑。例如，組合物可包含一類NGF拮抗劑的一個以上成員(例如，能識別NGF不同表位的抗NGF抗體的混合物)，以及不同類NGF拮抗劑的成員(例如，抗NGF抗體和NGF抑制性化合物)。其它示例性組合物包含一種以上識別相同表位的抗NGF抗體、結(jié)合NGF不同表位的不同種抗NGF抗體或不同的NGF抑制性化合物。在其它實施方案中，組合物包含一種或多種選自以下的NGF拮抗劑結(jié)合(物理上相互作用于)NGF的拮抗劑(例如，抗體)，結(jié)合NGF受體(諸如trkA受體或p75受體)的拮抗劑，和/或降低(阻礙和/或阻滯)下游NGF受體信號的拮抗劑。
本發(fā)明使用的組合物可進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams和Wilkins，Ed.K.E.Hoover.)，以凍干制劑或水溶液的形式?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在劑量和濃度上對受者是無毒的，其可包括緩沖液諸如磷酸鹽、枸櫞酸鹽和其它有機(jī)酸；包括維生素C和甲硫氨酸的抗氧化劑；防腐劑(諸如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲氯銨；苯扎氯銨，芐索氯銨，酚，丁基或芐基醇；對羥苯甲酸烷基酯諸如對羥基苯甲酸甲基或丙基酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇和間甲苯酚)；低分子量(低于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖和其它糖類包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖酐；螯合劑諸如EDTA；糖諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽性反荷離子諸如鈉；金屬復(fù)合物(例如Zn蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。本文進(jìn)一步描述了藥學(xué)上可接受的賦形劑。
本文所述的組合物可包括已知可用于治療疼痛的其它化合物。NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑，及其組合物還可以與增強(qiáng)和/或補充藥劑的功效的其它藥劑聯(lián)合使用。
藥盒本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明方法的藥盒。本發(fā)明的藥盒包括一個或多個包含NGF拮抗劑(諸如抗NGF抗體，諸如本文所述的人源化抗體E3)和/或阿片樣鎮(zhèn)痛劑的容器，而在某些實施方案中，還包括根據(jù)本發(fā)明的任何方法進(jìn)行使用的說明書。在某些實施方案中，藥盒包括抗NGF抗體(諸如本文所述的抗體E3)。在其它實施方案中，藥盒包括抗NGF抗體，該抗體包含抗體E3的一個或多個CDR(s)(諸如一個、兩個、三個、四個、五個，或在一些實施方案中所有六個來自E3的CDRs)。藥盒還可包括根據(jù)鑒別個體是否具有疼痛或個體是否有發(fā)生疼痛的危險而選擇適用于治療的個體的說明書。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于本發(fā)明所述任何方法的藥盒，所述藥盒包括NGF拮抗劑。而在其它實施方案中，藥盒包含抗體(諸如本文所述的抗體E3)。而在其它實施方案中，說明書包括關(guān)于聯(lián)合施用NGF拮抗劑及阿片樣鎮(zhèn)痛劑來治療、預(yù)防和/或改善任何疼痛(諸如手術(shù)后疼痛)的說明。
在某些實施方案中，藥盒包括NGF拮抗劑(諸如抗NGF抗體)，阿片樣鎮(zhèn)痛劑，和同時和/或相繼施用NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑以有效治療疼痛的說明書。在另一實施方案中，藥盒包括NGF拮抗劑(諸如抗NGF抗體)，和同時和/或相繼施用NGF抗體和阿片樣鎮(zhèn)痛劑以有效治療疼痛的說明書。在其它實施方案中，藥盒包括NGF拮抗劑(諸如抗NGF抗體)，和阿片樣鎮(zhèn)痛劑(諸如嗎啡)，和分開、同時和/或相繼施用NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑以有效治療疼痛的說明書。
在某些實施方案中，藥盒包括抗NGF抗體。在其它實施方案中，抗NGF抗體是包含表1中所示重鏈可變區(qū)和表2中所示輕鏈可變區(qū)的抗體。而在其它實施方案中，抗NGF抗體是本文所述的抗體E3。
NGF拮抗劑(諸如抗NGF抗體)和阿片樣鎮(zhèn)痛劑可存在于分開的容器中或在單個容器中。應(yīng)當(dāng)理解，藥盒可包括獨立的一種組合物或兩種或多種組合物(其中一種組合物包括NGF拮抗劑而一種組合物包括阿片樣鎮(zhèn)痛劑)。
本發(fā)明的藥盒是適宜的包裝形式。適宜的包裝形式包括，但不限于小瓶、瓶、罐、軟包裝(例如，密封Mylar或塑料袋)，等。藥盒可任選地提供其它組分諸如緩沖液和說明信息。
關(guān)于使用NGF拮抗劑的說明書一般包括這樣的信息，即，用于預(yù)期治療的劑量、給藥方案和給藥途徑。容器可以是單位劑量、大包裝(例如，多劑量包裝)或亞單位劑量。本發(fā)明的藥盒中提供的說明書通常是寫于標(biāo)簽或包裝插入物(例如，藥盒包含的紙片)上的說明書，但機(jī)器可讀說明書(例如，由磁或光存儲碟片攜帶的說明書)也是可接受的。
標(biāo)簽或包裝插入物指明組合物用于治療、改善和/或預(yù)防手術(shù)后疼痛。說明書可被提供用于實施本文所述任何方法。
本發(fā)明的藥盒是適宜的包裝形式。適宜的包裝形式包括，但不限于小瓶、瓶、罐、軟包裝(例如，密封Mylar或塑料袋)，等。聯(lián)合特定裝置，諸如吸入器、經(jīng)鼻給藥裝置(例如，霧化器)或輸注裝置諸如微泵而進(jìn)行使用的包裝也是可預(yù)期的。藥盒可具有無菌入口(例如容器可以是靜脈內(nèi)給藥溶液袋或瓶，其具有可通過皮下注射針頭刺穿的塞子)。容器也可具有無菌入口(例如容器可以是靜脈內(nèi)給藥溶液袋或瓶，其具有可通過皮下注射針頭刺穿的塞子)。組合物中至少一種活性成分是NGF拮抗劑，諸如抗NGF抗體。容器可進(jìn)一步包含第二藥學(xué)上活性藥劑。
藥盒可任選地提供其它組分諸如緩沖液和說明信息。通常，藥盒包括容器和容器上的或與之連接的標(biāo)簽或包裝插入物。
NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑的施用和治療評估NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑可借助任何適宜的途徑施用于個體。例如，其可經(jīng)口、靜脈內(nèi)、舌下、皮下、動脈內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)直腸、脊柱內(nèi)、胸內(nèi)、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)、舌下、透皮或通過吸入而一同或分開進(jìn)行施用。它們可經(jīng)口，例如以通過本領(lǐng)域已知的方法制備的片劑、錠劑、膠囊劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑、咀嚼膠、棒棒糖(lolliopop)、栓劑等形式進(jìn)行施用。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，本文所述的實例并非意在限制而是用于例舉說明可用技術(shù)。
由此，在某些實施方案中，NGF拮抗劑(諸如抗NGF抗體)可按照已知的方法而被施用于個體，諸如靜脈內(nèi)施用，例如，推注或經(jīng)一段時間連續(xù)輸注，通過肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)口、吸入或局部途徑。商業(yè)上可獲得的用于液體制劑的霧化器(包括噴射霧化器和超聲霧化器)可用于施用。液體制劑可被直接霧化，而凍干的粉末可在復(fù)水之后被霧化?？蛇x地，NGF拮抗劑可采用碳氟化合物制劑和定量吸入器進(jìn)行氣霧化，或以凍干且研碎的粉末形式被吸入。
位點特異性的或靶向的局部遞送技術(shù)也可用于施用。位點特異性的或靶向的局部遞送技術(shù)的實例包括各種NGF拮抗劑和/或阿片樣鎮(zhèn)痛劑的可植入的貯存源或局部遞送導(dǎo)管，諸如輸注導(dǎo)管、留置導(dǎo)管或針頭導(dǎo)管，合成移植物，外膜包裹物(adventitial wraps)，分流器(shunt)和支架或其它可植入的裝置，位點特異性載體，直接注射，使用患者自控鎮(zhèn)痛(PCA)技術(shù)或裝置和/或直接施用。參見例如，PCT公開序號WO 00/53211和美國專利公開序號5,981,568。
NGF拮抗劑(諸如抗NGF抗體)的各種制劑均可被用于給藥。在某些實施方案中，NGF拮抗劑可單獨地進(jìn)行施用。在某些實施方案中，NGF拮抗劑包括抗NGF抗體，且可以是各種制劑，包括包含藥學(xué)上可接受的賦形劑的制劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑是本領(lǐng)域已知的，是相對惰性的物質(zhì)，其能促進(jìn)藥理學(xué)上有效的物質(zhì)的施用。例如，賦形劑賦予形狀或稠度，或發(fā)揮稀釋劑的作用。適宜的賦形劑包括(但不限于)穩(wěn)定劑、濕潤劑和乳化劑、改變摩爾滲透壓濃度的鹽、成膠囊劑、緩沖液和透皮促進(jìn)劑。用于胃腸外和非胃腸外藥物遞送的賦形劑以及制劑已被公開于Remington，等，The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing(2000)。
在某些實施方案中，NGF拮抗劑可被制備為用于通過注射(例如，經(jīng)腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)等)給藥的制劑。由此，這些藥劑可與藥學(xué)上可接受的載體諸如鹽水、林格氏液、葡萄糖溶液等組合。具體的劑量方案，即，劑量、給藥時間和重復(fù)，應(yīng)根據(jù)具體的個體和個體的醫(yī)療史決定。劑量方案(包括使用的NGF拮抗劑)可隨時間改變。
施用抗NGF抗體可采用任何適宜的方法，包括經(jīng)注射(例如，經(jīng)腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)等)?？筃GF抗體還可經(jīng)由吸入進(jìn)行施用，如本文所述。一般地，對于施用抗NGF抗體，初始候選劑量可以是約2mg/kg。在某些實施方案中，典型的每日劑量可以是約3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg至30mg/kg至100mg/kg或更高，這要根據(jù)上述因素決定。對于在數(shù)日或更長時間(根據(jù)病癥)內(nèi)的重復(fù)施用，持續(xù)治療直至出現(xiàn)期望的癥狀抑制或直至達(dá)到降低疼痛的足夠治療水平。示例性的劑量方案包括施用初始劑量為約2mg/kg，隨后抗NGF抗體的每周維續(xù)劑量為約1mg/kg，或隨后每隔一周維續(xù)劑量為約1mg/kg。然而，其它劑量方案也是可用的，這取決于醫(yī)師希望實現(xiàn)的藥代動力學(xué)衰減模式。例如，1-4次每周的劑量是可以預(yù)期的。其它劑量方案包括不超過1次/日，1-4次/周，或更低頻率的方案。在某些實施方案中，化合物可按約1次/周，約1-4次/月施用。本文中公開了抗NGF抗體的劑量。該治療的進(jìn)展可通過常規(guī)技術(shù)和測定法而被很容易地監(jiān)測。
在某些實施方案中，當(dāng)NGF拮抗劑不是抗體時，根據(jù)本發(fā)明的NGF拮抗劑可(在某些實施方案中)按0.1-300mg/kg患者體重的速率分成1-3個劑量施用，或如本文所述施用。在某些正常體重的成年患者中，可以施用約0.3-5.00mg/kg的劑量。具體的劑量方案，即，劑量、給藥時間和重復(fù)，將取決于具體的個體和個體的醫(yī)療史，以及各藥劑的特性(諸如藥劑的半壽期，和本領(lǐng)域眾所周知的其它考慮因素)。
阿片樣鎮(zhèn)痛劑的施用劑量水平可以是不超過用于此類鎮(zhèn)痛劑的常規(guī)劑量水平的劑量水平。在某些實施方案中，阿片樣鎮(zhèn)痛劑以降低的水平施用。適宜的劑量水平要根據(jù)所選阿片樣鎮(zhèn)痛劑的鎮(zhèn)痛效果而定，但典型的適宜水平是約0.001-25mg/kg/日，約0.005-10mg/kg/日，或約0.05-1mg/kg/日，或更低?；衔锏慕o藥方案可以是多達(dá)6次/日(或更多)，1-4次/日，或其可以以更低的頻率施用。在某些實施方案中，連續(xù)地，或非常頻繁地(如使用PCA)施用阿片樣鎮(zhèn)痛劑。
當(dāng)聯(lián)合施用時(以單一或以分開的組合物)，神經(jīng)生長因子拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑的比例將與表現(xiàn)出期望的效應(yīng)相一致。在某些實施方案中，該比例按神經(jīng)生長因子拮抗劑對阿片樣鎮(zhèn)痛劑的重量計，為大約1∶1。在某些實施方案中，該比例可以是約0.001∶約1至約1000∶約1，或約0.01∶約1至100∶約1。其它比例也是可預(yù)期的。
應(yīng)當(dāng)理解的是，神經(jīng)生長因子拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑用于治療或預(yù)防疼痛所需要的量不僅會隨著具體所選的化合物或組合物而變化，還會隨著施用途徑、要治療的病癥的性質(zhì)和患者的年齡和狀態(tài)、治療過程或階段而變化，其最終取決于主治醫(yī)師的判斷。例如，NGF拮抗劑(例如抗NGF抗體)的適宜劑量取決于施用的NGF拮抗劑(或其組合物)，要治療的疼痛類型和嚴(yán)重度，藥劑是否被用于預(yù)防性或治療性目的，在先治療、患者的臨床史和對藥劑的反應(yīng)，和主治醫(yī)師的判斷。典型地，臨床醫(yī)師將施用NGF拮抗劑，諸如抗NGF抗體，直至劑量達(dá)到可實現(xiàn)需要的結(jié)果的劑量。
經(jīng)驗性考慮因素，諸如半壽期，一般將有助于對劑量的確定。例如，與人類免疫系統(tǒng)相容的抗體，諸如人源化抗體或完全人類抗體可被用于延長抗體的半壽期和防止抗體被宿主的免疫系統(tǒng)攻擊。施用頻率可在治療過程期間進(jìn)行確定和調(diào)整，通常(但非必須地)這基于疼痛的治療和/或抑制和/或改善和/或延緩而定。可選地，NGF拮抗劑和/或阿片樣鎮(zhèn)痛劑的持久連續(xù)釋放制劑可能是適宜的。獲得持續(xù)釋放的多種制劑和裝置是本領(lǐng)域所已知的。
在一個實施方案中，在已一或多次接受NGF拮抗劑施用以治療疼痛的個體中可以經(jīng)驗性地確定NGF拮抗劑的劑量。聯(lián)合阿片樣鎮(zhèn)痛劑，給予個體遞增劑量的NGF拮抗劑(例如，抗NGF抗體)。為了評估治療的功效，可跟蹤疼痛的指征。
根據(jù)本發(fā)明的方法施用NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑可以是連續(xù)的或間斷的，這要依賴于例如受者的生理條件、施用目的是治療性的還是預(yù)防性的，以及本領(lǐng)域執(zhí)業(yè)醫(yī)師已知的其它因素。NGF拮抗劑的施用可以是在一個預(yù)選的時間段內(nèi)基本上連續(xù)的或可以是一系列的間隔給藥，例如，在疼痛發(fā)生之前；期間；或之后；疼痛發(fā)生之前和之后；期間和之后；之前和期間；或之前、期間和之后。例如，施用可以是在損傷、切割、創(chuàng)傷、手術(shù)和其它任何可能引起疼痛的事件之前、期間和/或之后。
在某些實施方案中，可存在一種以上NGF拮抗劑，諸如抗體。這些拮抗劑可以是彼此相同或彼此不同的?？纱嬖谥辽僖环N、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種或更多種不同的NGF拮抗劑。一般而言，所述NGF拮抗劑具有彼此間無不利影響的互補活性。NGF拮抗劑還可與增強(qiáng)和/或補充該藥劑的功效的其它藥劑聯(lián)合使用。
在某些實施方案中，可存在一種以上阿片樣鎮(zhèn)痛劑。這些阿片樣鎮(zhèn)痛劑彼此間可以是相同或不同的?？纱嬖谥辽僖环N、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種或更多種不同的阿片樣鎮(zhèn)痛劑。通常，這些阿片樣鎮(zhèn)痛劑具有不會彼此發(fā)生不良影響的互補活性。阿片樣鎮(zhèn)痛劑還可與能夠增強(qiáng)和/或互補藥劑效能的其它藥劑聯(lián)合使用。
根據(jù)本發(fā)明所使用的NGF拮抗劑(諸如抗體)和阿片樣鎮(zhèn)痛劑的治療性制劑可通過將具有所需純度的抗體與任選的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington，The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.Mack Publishing(2000))混合而制備成凍干制劑或水溶液的形式用于保藏?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所使用的劑量和濃度下不具有對受者的毒性，并可包括緩沖液諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；鹽諸如氯化鈉；包括抗壞血酸和甲硫氨酸的抗氧化劑；防腐劑(諸如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲氯銨；苯扎氯銨，芐索氯銨；苯酚，丁基或芐基醇；對羥苯甲酸烷基酯諸如對羥苯甲酸甲基或丙基酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲苯酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖，和包括葡萄糖、甘露糖或糊精的其它糖類；螯合劑諸如EDTA；糖諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽性反荷離子諸如鈉；金屬復(fù)合物(例如Zn蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
包含NGF拮抗劑(諸如抗體)的脂質(zhì)體可通過本領(lǐng)域已知的方法制備，所述方法諸如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 774030(1980)；和美國專利序號4,485,045和4,544,545中所示。美國專利序號5,013,556中公開了循環(huán)時間提高的脂質(zhì)體。尤其有用的脂質(zhì)體可通過采用脂質(zhì)組合物的反相蒸發(fā)法來生成，所示脂質(zhì)組合物包含磷脂酰膽堿、膽固醇和聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。將脂質(zhì)體擠壓通過具有確定孔徑的濾器，以便生成具有所需直徑的脂質(zhì)體。
活性成分還可截留在膠體遞藥系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳劑、納米粒和納米囊)或粗乳劑中，或者在例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微囊，例如，羥甲基纖維素或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊中。所述技術(shù)已被公開于Remington，The Science and Practice ofPharmacy 20th Ed.Mack Publishing(2000)中。
可制備緩釋制劑。緩釋制劑的適宜實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)，該基質(zhì)的形式可以是成形物、例如膜，或微囊。緩釋基質(zhì)的實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇)、聚乳酸(美國專利號3,773,919)、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射的微球體)、蔗糖醋酸異丁酸酯和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
用于體內(nèi)施用的制劑必須是無菌的。這可通過例如，經(jīng)過除菌濾過膜的過濾而很容易地實現(xiàn)。治療性抗NGF抗體組合物通常被置于具有無菌入口的容器中，所述容器為例如，靜脈用溶液袋或瓶(其具有可通過皮下注射針頭刺穿的塞子)。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以是單位劑型諸如片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、溶液或混懸劑，或栓劑，而用于經(jīng)口、非胃腸的或經(jīng)直腸的使用，或通過吸入或吹入的施用。
為了制備固體組合物諸如片劑，將主要活性成分與藥學(xué)載體，例如常規(guī)壓片成分諸如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸氫鈣或樹膠和其它藥學(xué)稀釋劑，例如水，混合，以形成包含本發(fā)明化合物或其無毒性藥學(xué)上可接受鹽的均質(zhì)混合物的固體預(yù)制組合物(preformulation composition)。當(dāng)提及這些預(yù)制組合物為均質(zhì)形式時，其意指活性成分均勻地分散于整個組合物中以致使組合物可易于細(xì)分為同等有效的單位劑型諸如片劑、丸劑和膠囊劑。該固體預(yù)制組合物然后被細(xì)分為上述類型的單位劑型，其中包含約0.01mg-約0.1mg-500mg本發(fā)明的活性成分。新型組合物的片劑或丸劑可被包衣或復(fù)合以生成能提供長效優(yōu)勢的劑型。例如，片劑或丸劑可包括內(nèi)部劑量和外部劑量組分，后者為包封在前者上的形式。該兩種組分可被腸衣分開，腸衣的作用在于抵抗胃內(nèi)崩解和使內(nèi)部組分可完好地進(jìn)入十二指腸或延遲釋放。多種材料可用于所述腸衣或包衣層，這些材料包括多種聚合酸(polymeric acid)和聚合酸與諸如紫膠、鯨蠟醇和乙酸纖維素的材料的混合物。
本發(fā)明的組合物可摻入用于經(jīng)口或注射給藥的液體形式中，該液體形式包括水溶液、適當(dāng)調(diào)味的糖漿劑、水性或油性混懸劑，和采用食用油諸如棉子油、芝麻油、椰子油或花生油的調(diào)味乳劑，以及酏劑和相似的藥學(xué)載體。適用于水性懸浮液的分散劑或懸浮劑包括合成和天然的樹膠諸如西黃蓍膠、阿拉伯膠、藻酸鹽、右旋糖酐、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或明膠。活性成分還可被摻入高粘性的控釋產(chǎn)品諸如蔗糖醋酸異丁酯或其它產(chǎn)品中。這些制劑可被用于口服給藥或注射。該注射可導(dǎo)致藥物的局部貯存，其可在1日至3個月的時期內(nèi)在局部釋放。
用于經(jīng)注射給藥的組合物包括含有NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑作為活性成分以及表面活性劑(或濕潤劑或表面活性劑)或乳劑形式(如油包水或水包油乳劑)的那些組合物。
適宜的表面活性劑包括，特別是，非離子表面活性劑，諸如聚氧乙烯失水山梨醇(例如TweenTM20、40、60、80或85)和其它失水山梨醇(例如SpanTM20、40、60、80或85)。具有表面活性劑的組合物應(yīng)適宜地包括0.05-5％或0.1-2.5％的表面活性劑。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，如有需要，可加入其它成分，例如甘露醇或其它藥學(xué)上可接受的載體。
適宜的乳劑可采用商業(yè)上可獲得的脂肪乳，諸如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM和LipiphysanTM來制備?；钚猿煞挚扇芙庥陬A(yù)先混合的乳劑組合物中或可選地其可溶解于油(例如豆油、紅花油、棉籽油、麻油、玉米油或杏仁油)和通過將磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合而形成的乳液中。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，可加入其它成分，例如甘油或葡萄糖，來調(diào)整乳劑的張力。適宜的乳劑通常包含不超過20％的油，例如，5-20％。脂肪乳可包含0.1-1.0μm，特別是0.1-0.5μm的脂肪滴，且pH為5.5-8.0。
一些實施方案中，乳劑組合物可通過將神經(jīng)生長因子拮抗劑和IntralipidTM或其組分(豆油、卵磷脂、甘油和水)混合來制備。
用于吸入或吹入的組合物包括在藥學(xué)可接受的水性或有機(jī)溶劑或其混合物中的溶液和混懸液，和粉末。液體或固體組合物可包含上述適宜的藥學(xué)上可接受的賦形劑。組合物通過經(jīng)口或經(jīng)鼻的呼吸途徑進(jìn)行施用以便產(chǎn)生局部或全身效應(yīng)。在優(yōu)選無菌的藥學(xué)上可接受的溶劑中的組合物可通過使用氣體而被霧化。霧化后的溶液可經(jīng)由噴霧裝置直接呼吸，或可將噴霧裝置連接于面罩、帷罩或間歇正壓呼吸機(jī)上。溶液、混懸液或粉末組合物可由能以適宜的方式遞送制劑的裝置進(jìn)行施用(包括經(jīng)口或經(jīng)鼻)。
治療效果可通過本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行評估。
以下實施例用于例舉說明而并非限制本發(fā)明。
實施例實施例1抗NGF單克隆抗體聯(lián)合阿片樣鎮(zhèn)痛劑用于治療手術(shù)后疼痛我們采用模擬手術(shù)后疼痛的疼痛模型來評估抗NGF抗體聯(lián)合阿片樣鎮(zhèn)痛劑(嗎啡)的功效。每一實驗包括16只動物(n＝8/組)。
動物。對于每一實驗而言，在使用前，于正常光照條件下，舍養(yǎng)16只體重為200-220g的雄性成年Sprague Dawley大鼠(Harlan；Indianapolis，IN)至少一周，食物和水隨意取用。
在手術(shù)前一日，將大鼠于實驗籠中適應(yīng)2小時后，將大鼠分為兩組一組在手術(shù)前15小時接受抗體，另一組在該時刻接受載體(5％葡萄糖/0.45％鹽水USP)。將抗NGF拮抗劑抗體Mab 911(參見Hongo，等，Hybridoma 19215-227(2000))以0.3-20mg/kg的濃度經(jīng)腹膜內(nèi)(i.p.)給藥。手術(shù)后24小時，將0.1、0.3、1和3mg/kg多種濃度的硫酸嗎啡經(jīng)皮下(s.c.)給予所有動物。沒有動物接受多于兩種不同的嗎啡劑量，這些劑量相隔至少兩小時，較大的劑量總是在第二次給予。例如，在典型的實驗中，半數(shù)動物在手術(shù)前15小時經(jīng)腹膜內(nèi)(i.p.)接受抗NGF抗體劑量，在動物的一只后爪上實施手術(shù)，并留置恢復(fù)。手術(shù)后22時，檢測大鼠的“基線”靜止痛，兩小時后給予較低劑量的嗎啡(通常是0.3mg/kg)。給予嗎啡劑量后30分鐘，如前檢測靜止痛，給予初始嗎啡劑量后兩小時，給予較高劑量(通常是1.0mg/kg)。再經(jīng)過30分鐘后，按下述再次檢測靜止痛。
根據(jù)Brennan，等，Pain 64493-501(1996)所公開的步驟實施手術(shù)。用2％異氟烷和空氣混合物麻醉動物，并于手術(shù)期間經(jīng)由鼻錐維持。用聚維酮碘墊準(zhǔn)備右后爪的跖面，經(jīng)皮膚和肌膜做1-cm中心縱向切口，始于距踵邊0.5em處并向足趾延伸。將足保持于彎曲狀態(tài)，用尺進(jìn)行測量。用彎鉗提起跖肌然后縱向切開。在起端(origin)和止端(insertion)之間，將肌肉最大深度切開。手術(shù)全程通過用紗布墊施加按壓來控制出血。以兩次褥式縫合(5-0黑色單股縫線線(ethilon))閉合傷口。這些縫合打結(jié)5-6次，第一個結(jié)松扎。用桿菌肽溶液擦洗傷口點。行為試驗開始前，允許動物恢復(fù)，將其靜置于干凈籠中至少兩小時。
評估靜止痛。將累積的疼痛評分用于評估與承重相關(guān)的疼痛。將動物置于干凈塑料籠中的塑料網(wǎng)(網(wǎng)格8mm2)上，將塑料籠提升至高處平臺(h18”)，以便觀察其爪的底面。20分鐘適應(yīng)期后，以0-2級評估承重。如果爪變白或擠壓在網(wǎng)上則評分為0，這提示承受全部體重。如果爪偏向于僅以皮膚接觸網(wǎng)，而沒有皮膚變白或皮膚凹痕，則評分為1。如果爪完全松離網(wǎng)，則評分為2。如果大鼠仍處于靜止，爪退縮被認(rèn)為是2。在30分鐘內(nèi)，每5分鐘觀察各個動物1分鐘。在1/2小時期間所得6個評分的總和(0-12)被用于評估有切口的足中的疼痛。還計算了評分為2的頻率，并將其用于評估嚴(yán)重疼痛或動物對爪的完全保護(hù)的發(fā)生率。在手術(shù)前24小時(基線)，和手術(shù)后2小時、24小時對所有動物進(jìn)行測驗。承重與動物愿意使用肢體的程度優(yōu)良相關(guān)，由此是對疼痛緩減的有效測量。
以下方法步驟被用于圖1、2和3中所述實驗。將動物分為兩組(對照組和抗體治療組)。在手術(shù)前15小時，將小鼠抗NGF抗體Mab 911(Hongo等，如上)經(jīng)腹膜內(nèi)施用(0.3mg/kg體重和/或1mg/kg體重，依據(jù)試驗而定)。對照動物不接受抗體，而接受0mg/kg，0.3mg/kg，或1mg/kg嗎啡，如本文所述。按照上述實施手術(shù)，于手術(shù)后22小時在兩組中評估靜止痛(“基線”)。手術(shù)后24小時，用嗎啡以0.3mg/kg處理所有動物，在嗎啡處理后30分鐘開始評估靜止痛。在手術(shù)后26小時再給予1.0mg/kg的嗎啡，然后在該最后嗎啡劑量后30分鐘開始再次評估靜止痛。所有的嗎啡處理均通過皮下(動物的頸背下)實施。這些實驗的結(jié)果如圖1、2和3中所示。
圖1顯示了在接受0.3mg/kg抗NGF抗體911和0、0.3mg/kg體重或1.0mg/kg體重嗎啡的動物中檢測的靜止痛評分。該實驗證實了與僅用嗎啡或僅用抗NGF抗體進(jìn)行治療相比，用嗎啡聯(lián)合抗NGF抗體(抗NGF抗體911)治療的動物中累積的疼痛評分降低。因此，抗NGF抗體治療聯(lián)合嗎啡治療比僅用嗎啡或僅用抗NGF抗體能更有效地降低靜止痛。這些結(jié)果還顯示出在手術(shù)前僅用NGF拮抗劑以0.3mg/kg進(jìn)行治療比僅用嗎啡以0.3mg/kg進(jìn)行治療能更有效地降低靜止痛。
圖2顯示了在接受1.0mg/kg抗NGF抗體911和0、0.3mg/kg體重或1mg/kg體重嗎啡的動物中檢測的靜止痛評分。這些結(jié)果證實了與僅用抗NGF抗體或僅用嗎啡進(jìn)行治療相比，用嗎啡聯(lián)合抗NGF抗體治療的動物中累積的疼痛評分降低。由此，抗NGF抗體加嗎啡比僅用嗎啡或僅用抗NGF抗體能更有效地降低靜止痛。這些結(jié)果還顯示出在手術(shù)前僅用抗NGF抗體以1mg/kg進(jìn)行治療比僅用嗎啡以0.3mg/kg進(jìn)行治療能更有效地降低靜止痛。
圖3顯示了用0.3mg/kg或1.0mg/kg抗NGF抗體和0、0.3mg/kg或1mg/kg體重嗎啡按照上述方法步驟治療后的靜止痛評分。與僅用0.3mg/kg嗎啡治療相比，0.3mg/kg嗎啡聯(lián)合0.3mg/kg抗NGF抗體或1mg/kg抗NGF抗體的治療顯著地提高了疼痛緩減。圖3中所示結(jié)果還證實，僅用0.3mg/kg或1mg/kg抗NGF抗體進(jìn)行治療(即，無嗎啡治療)提供了與用0.3mg/kg劑量的嗎啡治療后等同的疼痛緩減。此外，用抗NGF抗體以1.0mg/kg進(jìn)行治療聯(lián)合用嗎啡以0.3mg/kg進(jìn)行治療產(chǎn)生了至少等價于僅用1mg/kg嗎啡所獲得的疼痛緩減。這些結(jié)果證實了用抗NGF抗體治療降低了實現(xiàn)有效疼痛緩減所需的嗎啡量。
這些實驗證實了抗NGF抗體加嗎啡的治療比僅用嗎啡或僅用抗體治療能更有效地降低靜止痛。
雖然通過示例性說明和實施例為便于清楚理解的目的對上述發(fā)明進(jìn)行了一定詳細(xì)程度的描述，但說明書和實施例并非意在限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.一種治療個體中疼痛的方法，其包括對個體施用一定量的神經(jīng)生長因子(NGF)拮抗劑和一定量的阿片樣鎮(zhèn)痛劑，由此NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑聯(lián)合提供有效的疼痛緩減。
2.權(quán)利要求1的方法，其中阿片樣鎮(zhèn)痛劑選自嗎啡、可待因、雙氫可待因、二乙酰嗎啡、氫可酮、氫嗎啡酮、左啡烷、羥嗎啡酮、阿芬太尼、丁丙諾啡、布托啡諾、芬太尼、舒芬太尼、哌替啶、美沙酮、納布啡、丙氧芬和噴他佐辛。
3.權(quán)利要求2的方法，其中阿片樣鎮(zhèn)痛劑是嗎啡。
4.權(quán)利要求1的方法，其中NGF拮抗劑是抗NGF抗體。
5.權(quán)利要求3的方法，其中NGF拮抗劑是抗NGF抗體。
6.權(quán)利要求4或5的方法，其中抗NGF抗體結(jié)合人類NGF。
7.權(quán)利要求6的方法，其中抗NGF抗體結(jié)合人類NGF，親和力為約10nM或小于約10nM。
8.權(quán)利要求5的方法，其中抗NGF抗體是人類抗體。
9.權(quán)利要求5的方法，其中抗NGF抗體是人源化抗體。
10.權(quán)利要求1的方法，其中疼痛是手術(shù)后疼痛。
11.權(quán)利要求4的方法，其中疼痛是手術(shù)后疼痛。
12.一種用于治療疼痛的藥物組合物，其包含有效量的NGF拮抗劑和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述使用包括同時或相繼施用阿片樣藥劑拮抗劑。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中NGF拮抗劑是抗NGF抗體。
14.一種用于治療疼痛的藥盒，其包含NGF拮抗劑，和同時或相繼施用NGF拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑以有效治療疼痛的說明書。
全文摘要
本發(fā)明公開了治療或預(yù)防疼痛的方法，其包括施用一定量的神經(jīng)生長因子拮抗劑和一定量的阿片樣鎮(zhèn)痛劑，使二者聯(lián)合能夠提供有效的疼痛緩減。本發(fā)明還公開了包含神經(jīng)生長因子拮抗劑和阿片樣鎮(zhèn)痛劑的組合物以及包含其的藥盒。
文檔編號C07K16/22GK1878794SQ200380105337
公開日2006年12月13日 申請日期2003年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月8日
發(fā)明者D·L·謝爾頓, G·J·韋爾加拉 申請人:里納特神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)公司