專(zhuān)利名稱(chēng)：含有4－羥基－脯氨酸亞結(jié)構(gòu)的肽的合成法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備肽的方法以及在該方法中所涉及的中間體。
一個(gè)方面，本發(fā)明涉及(A)制備游離或鹽形式的式I化合物的方法， 其中R1為反應(yīng)活性取代基或固相連接物；R2為反應(yīng)活性取代基；且R3、R4和R5彼此獨(dú)立地為氫或者與苯環(huán)連接的一個(gè)或多個(gè)取代基，所述取代基選自羥基、氨基、C1-10-烷基、C1-10-烷氧基、C1-10-烷基氨基、二-C1-10-烷基氨基、氨基甲?；1-10-烷基氨基甲?；⒍?C1-10-烷基氨基甲?；?、鹵代-C1-10-烷基、鹵素和硝基；該方法包括(a)使游離或鹽形式的式VI化合物與親電子試劑反應(yīng) 其中R3、R4和R5如上定義；R9為-OH、-OM或-OMX，其中M為金屬且X為親核取代基；R10為-M或-MX，其中M為金屬且X為親核取代基；
并將所得化合物水解以形成其中R2為羥基的式I化合物；(b)任選將其中R2為羥基的式I化合物轉(zhuǎn)化為其中R2不為羥基的式I化合物；(c)任選將式I化合物中的R1轉(zhuǎn)化為另一R1基團(tuán)；(d)任選將被保護(hù)形式的式I化合物去保護(hù)；以及(e)當(dāng)需要時(shí)，將以游離形式獲得的式I化合物轉(zhuǎn)化為所需的鹽形式，反之亦然；(B)制備固相載體系統(tǒng)的方法，該方法包括按照如上所定義的方法制備式I化合物，并將該化合物與適宜衍生或官能化的固相物質(zhì)偶連；(C)游離或鹽形式的式V化合物， 其中R3、R4、R5和R9如上定義；且R7為親核取代基；(D)游離或鹽形式的式VI化合物， 其中R3、R4、R5和R9如上定義；且R10為-M或-MX，其中M為金屬且X為親核取代基。
本發(fā)明提供了制備式I化合物的簡(jiǎn)單途徑，其中式I化合物可用于固相化學(xué)合成。本發(fā)明的方法可直接生成與固相連接的式I化合物，或者氮其中R1為活性取代基時(shí)，式I化合物可容易地在后期與固相偶連?；钚匀〈鵕2的存在允許式I化合物在合成寡聚物和高聚物如糖肽、核苷酸和蛋白質(zhì)中、尤其在固相肽合成中作為連接劑使用。式I化合物、特別是其中R2為鹵素的式I化合物還可在化學(xué)合成中用作保護(hù)試劑來(lái)保護(hù)官能團(tuán)如氨基或羥基。
式V和VI化合物可在式I化合物的制備中用作中間化合物。
式VI化合物可通過(guò)使式V化合物與金屬或有機(jī)金屬化合物反應(yīng)來(lái)制備 其中R3、R4、R5和R9如上定義；且R7為親核取代基。
式V化合物可如下制備(i)使式II化合物與金屬或有機(jī)金屬化合物反應(yīng)， 其中R6和R7均為親核取代基，且R3如上定義，如果需要的話，R3通過(guò)可除去的保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)；和(ii)使(i)中所得的化合物與式III化合物反應(yīng)，
其中R4和R5如上定義，如果需要的話，通過(guò)可除去的保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)。
本發(fā)明的方法可適宜地在單一反應(yīng)容器中進(jìn)行，而不需中間分離步驟。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)具有下述含義“烷基”可以是直鏈或支鏈的。優(yōu)選烷基為C1-4-烷基。
“烷氧基”可以是直鏈或支鏈烷氧基。優(yōu)選烷氧基為C1-4-烷氧基。
“酰氨基”指式-NH-C(O)-R的基團(tuán)，其中R是直鏈或支鏈的C1-10-烷基、環(huán)烷基或芳基。優(yōu)選R為C1-4-烷基。
“酰氧基”指式-O-C(O)-R的基團(tuán)，其中R如上定義。
“芳基”優(yōu)選是C6-10-芳基，例如苯基。
“鹵素”指氟、氯、溴或碘。
“鹵代烷基”指直鏈或支鏈的C1-10-烷基，該烷基被一個(gè)或多個(gè)、例如一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)鹵原子、優(yōu)選氟或氯原子取代。優(yōu)選鹵代烷基是被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氟或氯原子取代的C1-4-烷基。
“有機(jī)金屬化合物”指其中有機(jī)基團(tuán)的碳原子與金屬結(jié)合的化合物。有機(jī)金屬化合物優(yōu)選是烷基金屬化合物，例如烷基鋰，例如直鏈或支鏈C1-10烷基鋰化合物，或者可以是芳基金屬化合物，例如芳基鋰。更優(yōu)選烷基鋰化合物為C3-6烷基鋰化合物，例如丁基鋰或己基鋰。
或者，有機(jī)金屬化合物可以是有機(jī)鎂化合物，例如直鏈或支鏈烷基鎂或芳基鎂化合物，優(yōu)選是C1-6烷基鎂化合物。有機(jī)鎂化合物通稱(chēng)為格氏試劑。有機(jī)鎂化合物優(yōu)選是有機(jī)鎂鹵化物，尤其是碘化物或溴化物。
在另一可選擇的實(shí)施方案中，有機(jī)金屬化合物可以是烷基-或芳基-鋅化合物如C1-6-烷基鋅化合物，或者是C1-6烷基-或芳基-錫化合物。
M優(yōu)選為鋰或鎂。
R1可以是適于將所述化合物與固相連接的反應(yīng)活性取代基。R1可適宜地是-C(O)R′、-C(O)-OR′、-C(O)-NR′R″、-R12-NR′R″、-R12-OR′、-NR′R″或-C(O)X，其中R′和R″彼此獨(dú)立地為氫或者直鏈或支鏈C1-10-烷基，例如C1-4-烷基，R12是直鏈或支鏈C1-10-烷基，例如C1-4-烷基，且X為親核取代基，優(yōu)選為鹵素，例如氯。R1可適宜地位于對(duì)位、鄰位或間位，優(yōu)選位于對(duì)位。
或者，R1可以是與固相物質(zhì)如聚苯乙烯連接的連接物。優(yōu)選該連接物具有式-C(O)-P、-C(O)-OP、-C(O)-NR′-P、-R12NR′-P、-R12OP、-NR′-P、-C(O)-R12-P、-C(O)-OR12-P、-C(O)-NR′-R12-P、-R12-NR′-R12-P、-R12-OR12-P、-NR′-R12-P或-R12-P，其中R′、R″和R12如上定義，且P為固相物質(zhì)。更優(yōu)選R1為-C(O)-OP、-C(O)-OR12-P、-C(O)-NH-P、-C(O)-NH-R12-P、-NH-R12-P或-R12-P，其中R12為甲基，例如-CH2-P。
R2優(yōu)選是適于將所述化合物與生物寡聚物或高聚物或其單體單元(如氨基酸或多肽)連接的反應(yīng)活性取代基，。R2可適宜地為羥基、酰氨基、酰氧基、氨基、鹵素、巰基、C1-10-烷氧基或C6-10-芳氧基，優(yōu)選為鹵素。
式I至VII中的每個(gè)苯環(huán)可被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代。例如，R3可以指與式I、II和IV至VII中的苯環(huán)連接的一至四個(gè)取代基、優(yōu)選一或兩個(gè)取代基。R4和R5可以指與式I、II和IV至VII中的每個(gè)苯環(huán)連接的一至五個(gè)取代基、優(yōu)選一至三個(gè)取代基。每個(gè)取代基可處于它們所連接的苯環(huán)的任意適宜位置。更優(yōu)選R4和/或R5是處于其所連接的苯環(huán)的鄰位或?qū)ξ坏娜〈?br> 如果需要的話，每個(gè)R3、R4和R5可被可除去的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，例如當(dāng)其含有不參與反應(yīng)的-OH或-NH2基團(tuán)時(shí)。保護(hù)基團(tuán)、其引入和除去的方法例如在“有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)”(T.W.Greene等人，John Wiley & SonsInc.，第2版，1991)中有描述。優(yōu)選每個(gè)R3、R4或R5是不需被保護(hù)的基團(tuán)，例如為上述所列出的除羥基、氨基或硝基以外的任何基團(tuán)。
當(dāng)R3、R4或R5為鹵素時(shí)，優(yōu)選為氟或氯。當(dāng)R3、R4或R5為鹵代烷基時(shí)，優(yōu)選為三氟甲基。優(yōu)選R3為C1-4-烷基、鹵素或氫。優(yōu)選R4和R5彼此獨(dú)立地為C1-4-烷基氨基甲?；?、二-C1-4-烷基氨基甲?；?、氨基甲?；?、三氟甲基、氟或氯。優(yōu)選R4和R5相同。
優(yōu)選親核取代基R6和R7彼此獨(dú)立地為鹵素，更優(yōu)選為溴或碘，最優(yōu)選R6和R7均為溴。R7可適宜地位于對(duì)位、鄰位或間位，優(yōu)選位于對(duì)位。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，式II化合物首先與金屬或有機(jī)金屬化合物反應(yīng)，形成式IV化合物
其中R3和R7如上定義，且R8為-M或-MX，其中M為金屬且X為親核取代基，優(yōu)選為鹵素。
當(dāng)金屬為鋰或有機(jī)金屬化合物為有機(jī)鋰化合物時(shí)，R8為-Li。當(dāng)金屬為鎂或有機(jī)金屬化合物為格氏試劑時(shí)，R8為-MgX且X優(yōu)選為鹵素。然后式IV化合物與式III化合物反應(yīng)，形成式V化合物。
式IV和V化合物不需分離或分開(kāi)而可原位制備。
適用于該方法的親電子試劑包括二氧化碳、異氰酸鹽、腈、酰鹵(如光氣)，其導(dǎo)致形成例如其中R1為羧基、氨基甲?；?、烷基氨基甲?；蝓；氖絀化合物?；蛘?，親電子試劑可以是衍生化的固相物質(zhì)，例如Merrifield聚合物，其能使式VI化合物與固相直接偶連。在一個(gè)實(shí)施方案中，親電子試劑是式X′-(CH2)n-P化合物，其中X’為親核取代基如鹵素或甲苯磺酰氧基，n為1至4的整數(shù)，優(yōu)選為1，且P為固相物質(zhì)。
當(dāng)親電子試劑為二氧化碳時(shí)，該方法優(yōu)選包括首先使式V化合物與金屬或有機(jī)金屬化合物反應(yīng)，形成如上定義的式VI化合物，以及使式VI化合物與二氧化碳反應(yīng)，優(yōu)選原位進(jìn)行反應(yīng)。
當(dāng)親電子試劑為二氧化碳時(shí)，優(yōu)選形成鹽形式或游離形式的式VII化合物 其中R3、R4、R5和R9如上定義；且R11為-OH、-OM或-OMX，其中M為金屬且X為親核取代基，優(yōu)選為鹵素。
或者，羧基化步驟包含使式V化合物與二氧化碳在金屬或有機(jī)金屬化合物的存在下反應(yīng)，形成式VII化合物。
水解步驟優(yōu)選包含使其中R11為-OM或-OMX和/或R9為-OM或-OMX的式VII化合物與水或酸反應(yīng)，得到其中R1為羧基且R2為羥基的式I化合物，為鹽或游離形式。適宜的酸包括氯化銨、乙酸、硫酸和鹽酸。還可使用pH-緩沖的溶液。優(yōu)選使用弱酸和/或該步驟在pH為4至7的條件下進(jìn)行。反應(yīng)溫度通常為-50℃至50℃，優(yōu)選為-10℃至10℃。
或者，其中R11為-OM或-OMX的式VII化合物可與親核試劑如胺或鹵化物反應(yīng)，形成式I化合物，其中R1為-C(O)-NR′R"或-C(O)-X，且R′、R″和X如上定義。
本發(fā)明的方法通常在惰性有機(jī)溶劑中進(jìn)行，優(yōu)選在醚溶劑中進(jìn)行，例如乙醚、四氫呋喃和叔丁基甲基醚?；蛘呖墒褂脽N溶劑。步驟(a)的反應(yīng)溫度通常為-30℃至+10℃，優(yōu)選為-5℃至約0℃。反應(yīng)可例如每當(dāng)量式II化合物使用0.5至2當(dāng)量、優(yōu)選0.8至1.2當(dāng)量、最優(yōu)選約1當(dāng)量的金屬或有機(jī)金屬化合物。每當(dāng)量的式II化合物可使用0.5至2當(dāng)量、優(yōu)選0.8至1.2當(dāng)量的式III化合物。
式V化合物與金屬或有機(jī)金屬化合物的反應(yīng)溫度通常為0℃至+50℃，優(yōu)選為+20至+30℃。與親電子試劑(如CO2)反應(yīng)的反應(yīng)溫度通常為0℃至-30℃，優(yōu)選為-5℃至-10℃。水解步驟，例如酸水解步驟，通常在-10℃至+10℃、例如0至+5℃進(jìn)行。每當(dāng)量式V化合物優(yōu)選使用0.5至2當(dāng)量、更優(yōu)選使用0.8至1.2當(dāng)量的金屬或有機(jī)金屬化合物。
基團(tuán)R1和R2可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)化為上述可選擇的R1和R2基團(tuán)，例如通過(guò)酯化、酰胺化或親核取代。例如，其中R2為羥基的式I化合物可通過(guò)與酰鹵如酰氯反應(yīng)而轉(zhuǎn)化為其中R2為鹵素的式I化合物。
優(yōu)選式I化合物為游離形式。游離或鹽形式的化合物可以以水合物或含有結(jié)晶所用的溶劑的溶劑化物的形式獲得。
式I化合物可從反應(yīng)混合物中回收，并以常規(guī)方法純化。
原料式II或III化合物是已知的，或者可按照與本領(lǐng)域類(lèi)似的方法制備。有機(jī)金屬化合物可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法制備，例如通過(guò)使烷基或芳基鹵化物與懸浮在乙醚或四氫呋喃中的金屬如鋰或鎂反應(yīng)來(lái)制備。有機(jī)金屬化合物優(yōu)選在惰性(不含氧)無(wú)水氛圍如氮?dú)庵兄苽浜褪褂谩?br> 本發(fā)明的方法可適宜地包括使其中R1為反應(yīng)活性取代基的式I化合物與固相物質(zhì)偶合的其它步驟。適宜的固相物質(zhì)例如在DE 4306839A1中公開(kāi)，其包括顆粒形式的天然存在或合成的有機(jī)或無(wú)機(jī)聚合物，所述顆粒形式例如是珠狀，或者優(yōu)選是在適宜惰性底物材料上的表層。適宜聚合物物質(zhì)的實(shí)例包括交聯(lián)聚苯乙烯，例如聚苯乙烯柱狀物(pins)、Gly-HMDMA/DMA柱狀物和HEMA柱狀物。式I化合物可通過(guò)使固相上的基團(tuán)與R1反應(yīng)而與固相物質(zhì)方便地偶合。因此，固相物質(zhì)優(yōu)選包含反應(yīng)活性基團(tuán)，如氨基。優(yōu)選其中R1為羧基或活化羧基的式I化合物與載有游離氨基的聚合物反應(yīng)，其中所述羧基例如通過(guò)與二異丙基碳化二亞胺反應(yīng)而活化。
式I化合物可用作連接劑。因此，本發(fā)明的方法還可適宜地包括使任選與固相物質(zhì)連接的式I化合物與生物寡聚物或高聚物或其單體單元偶合的其它步驟。該化合物可通過(guò)使生物分子中存在的基團(tuán)與R2反應(yīng)而方便地與生物分子如氨基酸或多肽偶連。例如，當(dāng)R2為羥基且生物分子為多肽或氨基酸時(shí)，生物分子的末端羧酸可被R2羥基酯化，任選最初經(jīng)式I化合物與酰鹵反應(yīng)，使羥基被鹵素原位取代。
另一方面，本發(fā)明提供了(E)制備式VIII化合物的方法， 其中R12和R13均為可除去的保護(hù)基團(tuán)且R12和R13不同；該方法包括使式IX化合物 與適宜的R12供體化合物反應(yīng)；
(F)用于上述方法的中間體，以通式XIV定義， 其中，R16為除芴甲氧羰基以外的可除去的保護(hù)基團(tuán)，并且不同于R18；R17為氫或可通過(guò)水解或氫解可除去的保護(hù)基團(tuán)；且R18為氫或除芴甲氧羰基以外的可除去的保護(hù)基團(tuán)。
本發(fā)明提供了制備式VIII化合物的簡(jiǎn)單且有效的途徑，其中式VIII化合物可用于合成肽，例如在WO 02/10192中所描述的。式XIV化合物可在式VIII化合物的制備中用作中間化合物。
式IX化合物可由式X化合物制備， 其中R13如上定義，R14為可除去的保護(hù)基團(tuán)，且R14不同于R12和R13，以及R15為可通過(guò)水解或氫解除去的保護(hù)基團(tuán)。
保護(hù)基團(tuán)、其引入和除去的方法例如在“有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)”(T.W.Greene等人，John Wiley & Sons Inc.，第2版，1991)中有描述。適宜的保護(hù)基團(tuán)供體化合物、例如氨基保護(hù)試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，例如提供下述保護(hù)基團(tuán)之一的酐、鹵化物、氨基甲酸酯或N-羥基琥珀酰亞胺。
保護(hù)基團(tuán)R12優(yōu)選是芴甲氧羰基。R13或R16優(yōu)選是除芴甲氧羰基以外的保護(hù)基團(tuán)，并且優(yōu)選比R12和/或R14更不易于通過(guò)水解(例如堿催化水解)和/或氫解除去，例如比芴甲氧羰基和/或芐氧羰基更不易于除去。更優(yōu)選R13或R16為叔丁氧羰基。
優(yōu)選保護(hù)基團(tuán)R14或R18比R12更不易于通過(guò)水解除去，例如比芴甲氧羰基更不易于除去。R14或R18優(yōu)選可通過(guò)氫解除去。適宜的R14或R18取代基包括芐氧羰基、1，1-二甲基丙炔氧基羰基、乙烯氧基羰基、N-羥基哌啶氧基羰基、9-蒽基甲氧羰基和苯基氨基硫代羰基、烯丙基、硝基芐基、三苯甲基、(對(duì)-甲氧基苯基)二苯基甲基、二苯基-4-吡啶基甲基或芐基磺?；?yōu)選R14或R18是含有氧基羰基的保護(hù)基團(tuán)，例如芐氧羰基。
R15或R17可適宜地是(i)C1-10-烷基，例如C1-4-烷基，優(yōu)選甲基、乙基、丙基或除叔丁基以外的丁基，更優(yōu)選甲基。
(ii)C3-8-環(huán)烷基，為未取代的或者被一個(gè)或多個(gè)C1-4-烷基如甲基取代。優(yōu)選環(huán)烷基是C3-6-環(huán)烷基。
(iii)C6-10-芳基，為未取代的或者被一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定取代基如鹵素或硝基取代。優(yōu)選芳基是未取代或被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)鹵素如氯取代的苯基。
(iv)(C6-10-芳基)1-3-C1-10-烷基，為未取代的或者在芳基上(i)被一個(gè)或多個(gè)穩(wěn)定取代基如鹵素或硝基取代；或(ii)被兩個(gè)與它們所連接的碳原子一起形成5-或6-元環(huán)的取代基所取代，其中所述的環(huán)任選含有一個(gè)或兩個(gè)氮或氧原子。(C6-10-芳基)1-3-C1-10-烷基優(yōu)選是(i)(苯基)1-3-C1-4-烷基，更優(yōu)選是芐基、二苯甲基或三苯甲基，其為未取代的或者在每個(gè)苯環(huán)上被一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)鹵素如氯取代，(ii)蒽基甲基，例如9-蒽基甲基，或者(iii)胡椒基。
(v)C6-10-芳基-C1-4-烷氧基-C1-4-烷基，優(yōu)選是芐氧甲基。
(vi)C6-10-芳基-羰基-C1-4-烷基，優(yōu)選是苯甲酰甲基。
優(yōu)選R15或R17是可通過(guò)氫解除去的基團(tuán)，例如芐基、芐氧甲基、苯甲酰甲基、三苯甲基、胡椒基或9-蒽基甲基，優(yōu)選是芐基。
式IX化合物可如下制備(i)使式X酯化合物水解，得到相應(yīng)的羧酸，以及(ii)除去保護(hù)基團(tuán)R14。優(yōu)選水解步驟在除去保護(hù)基團(tuán)R14之前進(jìn)行。保護(hù)基團(tuán)R14可通過(guò)還原氫化(氫解)方便地除去。當(dāng)R15不可通過(guò)氫解除去時(shí)，可適宜地遵循該包括水解步驟的途徑。水解步驟優(yōu)選是堿催化的水解，例如采用氫氧化鈉，并且可在極性溶劑如甲醇中適宜地進(jìn)行。
或者，式IX化合物可通過(guò)其中R15為可通過(guò)氫解除去的基團(tuán)、如芐基的式X化合物的氫化(氫解)來(lái)方便地制備。氫化步驟可采用適宜的催化劑如披鈀炭來(lái)方便地進(jìn)行。
式X化合物可如下制備使式XI化合物 其中X為親核取代基且R14和R15如上定義，與式XII化合物反應(yīng)， 其中R13如上定義。該步驟可在任意適宜的有機(jī)溶劑中進(jìn)行，優(yōu)選在烴溶劑、更優(yōu)選在甲苯中進(jìn)行。
式XII化合物是被保護(hù)的1，2-乙二胺，其中一個(gè)氨基已經(jīng)被可除去的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。式XI中的親核取代基X優(yōu)選是鹵素，例如氟、氯、溴或碘，更優(yōu)選是氯。其中X為鹵素的式XI化合物可通過(guò)使式XIII化合物 與酰鹵反應(yīng)來(lái)制備，所述酰鹵例如是光氣、三光氣、氯甲酸苯酯或4-硝基氯甲酸苯酯，優(yōu)選是4-硝基氯甲酸苯酯。該步驟可適宜地在有機(jī)堿如二甲氨基吡啶的存在下于非極性溶劑如甲苯中進(jìn)行。
式XIII化合物可自商業(yè)購(gòu)得，例如當(dāng)R15為甲基時(shí)可自商業(yè)購(gòu)得，或者可按照本領(lǐng)域已知的方法通過(guò)使4-羥基-脯氨酸酯化而形成，例如通過(guò)與芐醇或甲醇酯化來(lái)形成。然后將所得酯通過(guò)與適宜的R14供體化合物如芐氧羰基-N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)來(lái)進(jìn)行保護(hù)。
式XI化合物不需分離或分開(kāi)，因?yàn)槭絏III化合物可與酰鹵反應(yīng)，并且該反應(yīng)的產(chǎn)物隨后可與式XII化合物在同一容器中反應(yīng)。
在式IX化合物中加入保護(hù)基團(tuán)R12可適宜地在有碳酸鈉/乙腈的存在下進(jìn)行。
式VIII化合物可按照常規(guī)方法從反應(yīng)混合物中回收并純化。
在上述式VIII-XI和XIII化合物中，脯氨酸上的氧基取代基可處于順式或反式位置，優(yōu)選為反式。其順式或反式異構(gòu)體可采用相應(yīng)的順式或反式羥基脯氨酸作為原料來(lái)分別制備。
雖然沒(méi)有具體描述原料的生成，但是這些化合物是已知的，或者可按照本領(lǐng)域已知的類(lèi)似方法或如下所述進(jìn)行制備。
在另一方面，本發(fā)明涉及制備其中R12為芴甲氧羰基且R13為除芴甲氧羰基以外的可除去的保護(hù)基團(tuán)的式VIII化合物的方法，該方法包括使式VIII化合物與芴甲氧羰基供體化合物如芴甲氧羰基-N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)。
本發(fā)明將參考下述具體實(shí)施方案進(jìn)行描述，其中使用下述縮寫(xiě)Fmoc＝芴甲氧羰基Boc＝叔丁氧羰基Cbo＝芐氧羰基OSu＝N-羥基琥珀酰亞胺HPTF＝庚烷級(jí)分JT＝套層溫度HPLC＝高效液相色譜法THF＝四氫呋喃TBME＝叔丁基甲基醚DMF＝二甲基甲酰胺實(shí)施例14-(二苯基-羥基-甲基)-苯甲酸的制備將1，4-二溴苯(47.2g，0.2M)加入THF(240ml)中。該澄清溶液冷卻至-65℃。在30分鐘內(nèi)加入丁基鋰溶液(0.22M，94ml，為在CHX中的20％溶液)。
攪拌5分鐘后，在30分鐘內(nèi)加入二苯酮(36.4g，0.2M，在180ml THF中)(放熱)。將混合物于-65℃另外攪拌30分鐘。然后在30分鐘內(nèi)將溫度升至-10℃，并將該溶液于該溫度下攪拌1小時(shí)。
然后將反應(yīng)混合物重新冷卻至-65℃。在30分鐘內(nèi)加入丁基鋰溶液(0.22M，94ml，在環(huán)己烷中的20％溶液)。
將所得懸浮液用200ml THF稀釋。然后于-65℃通入90分鐘以上的二氧化碳?xì)怏w。溫度升至20℃，并將混合物攪拌過(guò)夜。然后將混合物冷卻至0℃，并在30分鐘內(nèi)加入氯化銨水溶液(120ml 10％溶液)。在此階段形成4-(二苯基-羥基-甲基)-苯甲酸。
將混合物于45℃真空濃縮。殘余物用乙酸調(diào)節(jié)pH為4，并與400mlH2O混合。用2×150ml乙酸乙酯進(jìn)行萃取。有機(jī)相再次用100ml水萃取。所合并的EST-相與10％氫氧化鉀水溶液(2×120ml)一起振搖。所合并的水相于20℃用鹽酸調(diào)節(jié)pH為1-2，然后用2×150ml TBME萃取。所合并的TBME相與50ml水及50ml飽和Na2SO4溶液混合，經(jīng)硫酸鎂干燥，于45℃真空濃縮，得到粗品。
將38.3g粗品于40℃溶于TBME(300ml)中。將所得澄清黃色溶液真空濃縮為60ml(蒸餾出240ml TBME)。將混合物于40℃攪拌1小時(shí)(結(jié)晶)。加入50ml HPTF，混合物冷卻至0℃，并于0℃攪拌1小時(shí)。蒸餾并用2×15ml庚烷級(jí)分洗滌，于45℃真空干燥過(guò)夜，得到白色晶體。
4-(二苯基-羥基-甲基)-苯甲酸與固相的連接將15g 4-(二苯基-羥基-甲基)-苯甲酸和7.54g羥基苯并三唑通過(guò)攪拌15分鐘溶于140ml DMF中。加入15.3ml二異丙基碳二亞胺，溶液于室溫下放置30分鐘。然后將溶液在氨甲基化的聚苯乙烯的存在下于室溫下攪拌過(guò)夜。在用DMF、甲醇和THF洗滌后，將連接劑衍生的載體真空干燥。
實(shí)施例24-(二苯基-羥基-甲基)-苯甲酸的制備(可選擇的方法)在孔干燥的100升Hastelloy-反應(yīng)器中，在20分鐘內(nèi)向12升TBME中加入3.0kg正丁基鋰(20％，在環(huán)己烷中；9.37mol)，溫度保持為-5℃(澄清溶液)。在30分鐘內(nèi)，加入溶于16升TBME中的2.00kg 1，4-二溴苯(8.48mol)，保持溫度為-5℃至0℃。添加容器用3升TBME沖洗。
于-5℃攪拌30分鐘后，在20分鐘內(nèi)加入1.55kg二苯酮(8.50mol)在8升TBME中的溶液，保持溫度為-5℃至0℃。添加容器用3升TBME沖洗。形成極少量的白色固體。在于-5℃攪拌15分鐘后，取過(guò)程控制樣品(HPLC1)。反應(yīng)混合物于-5℃再攪拌25分鐘，溫?zé)嶂?25℃。
在25分鐘內(nèi)加入3.2kg正丁基鋰(20％，在環(huán)己烷中；10.00mol)，保持溫度為+25℃至27℃。該加入過(guò)程略微放熱，顏色變?yōu)槲⒕G色。形成一些沉淀和浮渣。在攪拌20分鐘后取過(guò)程控制樣品(HPLC 2)。根據(jù)HPLC 2的結(jié)果，在于+25℃攪拌35分鐘后再加入0.3kg正丁基鋰。在攪拌15分鐘后，取過(guò)程控制樣品(HPLC 3)。用1.5升TBME沖洗正丁基鋰加入的路線，并將反應(yīng)混合物冷卻至-10℃。
在20分鐘內(nèi)逐份加入1.99kg干冰(固態(tài)CO2)，保持溫度為-10℃至-5℃。該反應(yīng)為放熱反應(yīng)，并且形成微黃色的沉淀。在于-10℃攪拌15分鐘后，加入11升TBME，反應(yīng)混合物溫?zé)嶂?℃。在15分鐘內(nèi)加入5升18％鹽酸水溶液，保持溫度為0℃至+5℃。該加入過(guò)程放熱，并且沉淀溶解(pH≤1)。
將澄清溶液轉(zhuǎn)移至分離池中，反應(yīng)器用5升TBME沖洗。在分離水相后，有機(jī)相用20升水洗滌。在兩層分離后，有機(jī)相用13升5％KOH水溶液萃取。分離出堿性的水相，有機(jī)層再次用13升5％KOH水溶液萃取。將所合并的堿性水層轉(zhuǎn)移至100升Hastelloy-反應(yīng)器中。在20分鐘內(nèi)加入22升TBME和6升18％鹽酸水溶液，溫度為0℃至+5℃。該加入過(guò)程放熱，并且形成白色沉淀，但是沉淀在低pH-值(加入HCl后pH≤1)下再次溶解。將混合物攪拌10分鐘，并轉(zhuǎn)移至分離池中。層分離，水相再次用16升TBME萃取。在層分離后，所合并的有機(jī)相于500mbar/45℃JT下濃縮至4-5升(蒸餾出32升TBME)，并加入晶種。溫度升至50℃，緩慢加入20升HPTF并良好攪拌。白色沉淀于50℃JT攪拌2小時(shí)。套層溫度調(diào)節(jié)為0℃并持續(xù)攪拌過(guò)夜(16小時(shí))，使懸浮液冷卻至0℃。過(guò)濾白色懸浮液，反應(yīng)器用5升母液沖洗5次。殘余物于45℃JT真空(≥10mbar)干燥至恒重(過(guò)夜)。
實(shí)施例3以Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-OMe為原料進(jìn)行的Fmoc-(2S，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH-Boc)-OH的制備1.將二甲氨基吡啶(30.5g，250mmol)和Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-Ome(34.9g，125mmol)溶于甲苯(870ml)中。在20分鐘內(nèi)，于0℃至5℃將4-硝基氯甲酸苯酯(31.5g，157mmol)在甲苯(206ml)中的溶液逐滴加入該溶液中，并另外攪拌2小時(shí)。之后加入Boe-1，2-乙二胺(80.1g，500mmol)在甲苯(205ml)中的溶液并于環(huán)境溫度攪拌12小時(shí)。然后加入濃硫酸(43.7g，450mmol)在水(873ml)中的溶液，同時(shí)維持溫度為20℃至25℃。將白色懸浮液抽濾，并用甲苯(30ml)洗滌。甲苯相依次用水(450ml)和碳酸鈉(10％w/w，450ml)洗滌，并再用水洗滌三次(每次450ml)。甲苯相通過(guò)餾出300ml而共沸干燥，被餾出的300ml用無(wú)水甲苯(2×300ml)連續(xù)替換。于50℃在無(wú)水甲苯溶液中加入庚烷(130ml)，2小時(shí)內(nèi)冷卻至0℃。過(guò)濾所沉淀的產(chǎn)物，用甲苯/庚烷1∶2v/v(70ml)洗滌兩次，于50℃真空干燥，得到白色固態(tài)的Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH-Boc)-OMe。
2.將Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH-Boc)-OMe (20.0g，43.0mmol)溶于四氫呋喃與甲醇的1:1混合物(380ml)中。加入1M氫氧化鈉溶液(51.6ml)，所得混合物于環(huán)境溫度下攪拌4小時(shí)。混合物通過(guò)加入硫酸(50ml，1M)調(diào)節(jié)pH為3。于50℃和50mbar下餾出四氫呋喃和甲醇，直至不再有溶劑餾出。殘余的乳狀溶液用乙酸異丙酯(113ml)和水(57ml)稀釋?zhuān)喾蛛x，乙酸異丙酯相用氯化鈉溶液(10％，113ml)洗滌。餾出(50℃，50mbar)溶劑，得到泡沫狀的Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH-Boc)-OH(19.8g)，其可不經(jīng)純化用于下一反應(yīng)。
3.將投鈀炭(10％，1.94g，0.042mmol)加入Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH-Boc)-OH(19.4g，43.0mmol)在異丙醇(350ml)和水(37ml)中的溶液中。將氫氣通入該溶液達(dá)4小時(shí)，濾除催化劑，殘余物用異丙醇(50ml)與水(50ml)的混合物洗滌。異丙醇/水相經(jīng)餾出2/3體積共沸干燥，所餾出體積用甲苯/異丙醇混合物(1∶1v/v)連續(xù)替換。殘余的干燥溶液真空濃縮(50℃，200mbar)至干，得到(2S，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH-Boc)-OH，為褐色固體，其可不經(jīng)進(jìn)一步純化即可使用。
4.于40℃將(2S，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH-Boc)-OH(5.0g，15mmol)溶于水(25ml)與三乙胺(1.5g，15mmol)的混合物中。30分鐘內(nèi)將Fmoc-OSu(4.65g，14mmol)在乙腈(25ml)中的溶液加入該澄清溶液中，并攪拌2小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物用鹽酸(1m，13ml)調(diào)節(jié)pH至3，另外攪拌1小時(shí)。餾出乙腈(40℃，80mbar)并用乙酸異丙酯替換，得到兩相混合物。分離出下部水相，殘余的有機(jī)層用水洗滌，并用乙酸異丙酯替換蒸餾兩次，然后濃縮成褐色泡沫。將該泡沫溶于乙酸異丙酯(25ml)，并逐滴加入庚烷(200ml)中，由此沉淀出產(chǎn)物。過(guò)濾固體，用乙酸異丙酯/庚烷洗滌，于40℃真空干燥，得到Fmoc-(2S，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH-Boc)-OH。
實(shí)施例4以Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-OBzl為原料進(jìn)行的Fmoc-(2S，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH-Boc)-OH的制備Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-OBzl的合成在T.Makoto，H.Guoxia和V.J.Hruby的J.Org.Chem.2001，66，1038-1042中有描述。重復(fù)實(shí)施例3的方法，但使用Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-OBzl替換Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-OMe，并且僅進(jìn)行步驟1、3和4(省略步驟2)。
實(shí)施例5Fmoc-(2R，4R)-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH-Boc)-OH的制備重復(fù)實(shí)施例3或4的方法，但使用Cbo-(2R，4R)-Pro(4-OH)-OMe或Cbo-(2R，4R)-Pro(4-OH)-OBzl替換Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-OMe或Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-OBzl。
實(shí)施例6Fmoc-(2S，4S)-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH-Boc)-OH的制備重復(fù)實(shí)施例3或4的方法，但使用Cbo-(2S，4S)-Pro(4-OH)-OMe或Cbo-(2S，4S)-Pro(4-OH)-OBzl替換Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-OMe或Cbo-Cbo-(2S，4R)-Pro(4-OH)-OBzl。
權(quán)利要求
1.制備游離或鹽形式的式I化合物的方法， 其中R1為反應(yīng)活性取代基或固相連接物；R2為反應(yīng)活性取代基；且R3、R4和R5彼此獨(dú)立地為氫或者與苯環(huán)連接的一個(gè)或多個(gè)取代基，所述取代基選自羥基、氨基、C1-10-烷基、C1-10-烷氧基、C1-10-烷基氨基、二-C1-10-烷基氨基、氨基甲?；1-10-烷基氨基甲?；?二-C1-10-烷基氨基甲?；?、鹵代-C1-10-烷基、鹵素和硝基；該方法包括(a)使游離或鹽形式的式VI化合物與親電子試劑反應(yīng) 其中R3、R4和R5如上定義；R9為-OH、-OM或-OMX，其中M為金屬且X為親核取代基；R10為-M或-MX，其中M為金屬且X為親核取代基；并將所得化合物水解以形成其中R2為羥基的式I化合物；(b)任選將其中R2為羥基的式I化合物轉(zhuǎn)化為其中R2不為羥基的式I化合物；(c)任選將式I化合物中的R1轉(zhuǎn)化為另一R1基團(tuán)；(d)任選將被保護(hù)形式的式I化合物去保護(hù)；以及(e)當(dāng)需要時(shí)，將以游離形式獲得的式I化合物轉(zhuǎn)化為所需的鹽形式，反之亦然。
2.權(quán)利要求1的方法，其中式VI化合物通過(guò)使式V化合物與金屬或有機(jī)金屬化合物反應(yīng)來(lái)制備， 其中R3、R4、R5和R9如上定義；且R7為親核取代基。
3.權(quán)利要求2的方法，其中式V化合物可如下制備(i)使式II化合物與金屬或有機(jī)金屬化合物反應(yīng)， 其中R6和R7均為親核取代基，且R3如上定義，如果需要的話，R3通過(guò)可除去的保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)；和(ii)使(i)中所得的化合物與式III化合物反應(yīng)， 其中R4和R5如上定義，如果需要的話，通過(guò)可除去的保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)。
4.制備固相載體系統(tǒng)的方法，該方法包括通過(guò)如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所定義的方法制備式I化合物，以及將該化合物與適宜衍生化或官能化的固相物質(zhì)偶連。
5.游離或鹽形式的式VI化合物， 其中R3、R4和R5彼此獨(dú)立地為氫或者與苯環(huán)連接的一個(gè)或多個(gè)取代基，所述取代基選自羥基、氨基、C1-10-烷基、C1-10-烷氧基、C1-10-烷基氨基、二-C1-10-烷基氨基、氨基甲?；1-10-烷基氨基甲?；?、二-C1-10-烷基氨基甲酰基、鹵代-C1-10-烷基、鹵素和硝基，其任選被可除去保護(hù)基團(tuán)保護(hù)；R9為-OH、-OM或-OMX，其中M為金屬且X為親核取代基；且R10為-M或-MX，其中M為金屬且X為親核取代基。
6.制備式VIII化合物的方法， 其中R12和R13均為可除去的保護(hù)基團(tuán)且R12和R13不同；該方法包括使式IX化合物 與適宜的R12供體化合物反應(yīng)。
7.權(quán)利要求6的方法，其中式IX化合物如下制備(i)使式X化合物水解， 其中R13如權(quán)利要求6定義，R14為可除去的保護(hù)基團(tuán)且R14不同于R12和R13，以及R15為可通過(guò)水解或氫解除去的保護(hù)基團(tuán)，得到相應(yīng)的羧酸，以及(ii)除去所得羧酸中的保護(hù)基團(tuán)R14。
8.式XIV化合物 其中R16為除芴甲氧羰基以外的可除去的保護(hù)基團(tuán)，且不同于R18；R17為氫或可通過(guò)水解或氫解除去的保護(hù)基團(tuán)；以及R18為氫或除芴甲氧羰基以外的可除去的保護(hù)基團(tuán)。
9.權(quán)利要求8的化合物，其中R16為叔丁氧羰基。
10.如權(quán)利要求6中所定義的制備式VIII化合物的方法，其中R12為芴甲氧羰基且R13為除芴甲氧羰基以外的可除去的保護(hù)基團(tuán)，該方法包括使式IX化合物與芴甲氧羰基供體化合物反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備肽的方法以及在該方法中所涉及的中間體，例如，制備式(VIII)化合物的方法，其中R
文檔編號(hào)C07K1/00GK1723182SQ200380105385
公開(kāi)日2006年1月18日 申請(qǐng)日期2003年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月12日
發(fā)明者B·維特費(fèi)爾德, W·普里科斯佐維奇, B·埃爾布, W·帕欣格 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司