專利名稱：含有與低效價抗cd－40抗體或抗cd－28抗體軛合的抗原的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括抗體和抗原的軛合物，其中所述軛合物具有較低的抗體效價(valency)，本發(fā)明還包括所述軛合物的制備方法。
免疫系統(tǒng)由能夠識別特異抗原的淋巴細胞構(gòu)成。B淋巴細胞通過表面免疫球蛋白受體識別處于天然構(gòu)象的抗原，而T淋巴細胞在抗原遞呈細胞(antigen presenting cell)表面識別表現(xiàn)為肽及自身分子的稱為主要組織相容性抗原(MHC)或人體中人白細胞抗原(HLA)的蛋白抗原。抗原遞呈細胞存在不同形式，且可被區(qū)分為例如巨噬細胞和樹突狀細胞的‘經(jīng)典(classical)’抗原遞呈細胞，和包括B淋巴細胞的‘非經(jīng)典’抗原遞呈細胞。T淋巴細胞還可進一步劃分為能殺滅病毒感染的靶細胞的“細胞毒性T淋巴細胞”，及“輔助性T”淋巴細胞。輔助性T淋巴細胞具有調(diào)節(jié)功能并且能夠幫助B淋巴細胞產(chǎn)生特異抗體，或幫助巨噬細胞殺滅細胞內(nèi)病原體。
抗體可存在多種形式，例如存在主要類型IgM、IgG、IgA、IgD和IgE，各自具有不同的‘效應(yīng)子(effector)’功能，藉此來確定所述抗體的作用。效應(yīng)子功能包括補體結(jié)合(導(dǎo)致對炎性反應(yīng)的刺激作用)，其可由IgM、IgA和IgG通過形成抗原和抗體的免疫復(fù)合物來活化。效應(yīng)子功能的另一個例子是抗原對肥大細胞的觸發(fā)，其通過IgE表面與肥大細胞的的交聯(lián)來實現(xiàn)，通過高親和性受體IgE FcR-ε-I(對IgE的Fc區(qū)域的受體)的占據(jù)而被限制在該處。對某些抗體類型還存在亞型(例如人體內(nèi)的IgG包括四種不同亞型，稱為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。所述IgG亞型在豐度和其效應(yīng)子功能上有顯著的區(qū)別。
醫(yī)學(xué)歷史上最重要的成果之一就是疫苗的發(fā)現(xiàn)，其用于預(yù)防多種傳染性疾病。同時還在開發(fā)用于治療各種諸如自體免疫和神經(jīng)變性疾病的非傳染性疾病和各種癌癥的疫苗。許多疫苗是通過使注射入個體的病原體失活或減弱來制備的。被賦予免疫性的個體通過同時產(chǎn)生體液(抗體)和細胞(細胞毒T細胞，CTL’s)反應(yīng)來響應(yīng)。例如某些流行性感冒疫苗是通過用甲醛對病毒進行化學(xué)處理使其失活來制備的，類似地Salk polio疫苗包括用丙內(nèi)酯(propionolactone)滅活的全病毒。對許多病原體(特別是細菌)，化學(xué)或加熱滅活在產(chǎn)生提供保護性免疫的疫苗免疫原的同時，還引起諸如發(fā)熱和注射部位反應(yīng)的副作用。對于細菌的情況，滅活后的有機體往往毒性過大，因而其副作用限制了這類天然疫苗免疫原(例如細胞百日咳疫苗)的應(yīng)用。因此許多現(xiàn)代疫苗是由病原體的保護性抗原制備的，其通過純化或分子克隆從引起副作用的材料中分離得到。這些后者疫苗被稱作‘亞單位疫苗(subunit vaccine)。
亞單位疫苗(例如免疫原為純化的蛋白的疫苗)的開發(fā)是近年來大量研究的焦點。新病原體(例如HIV和B組鏈球菌)的出現(xiàn)，以及抗生素耐藥性的增長造成了對開發(fā)新疫苗及鑒定用于開發(fā)亞單位疫苗的其它候選分子的需求。同樣地，基因和蛋白研究中發(fā)現(xiàn)的新疫苗抗原使得能夠開發(fā)新的候選亞單位疫苗，特別是抗細菌病原體和癌癥的亞單位疫苗。然而，雖然亞單位疫苗試圖避免滅活或削弱的病原體疫苗的副作用，但其‘純凈’狀態(tài)是從通常與整個有機體疫苗相關(guān)聯(lián)的‘危險信號’中分離得到的，并且亞單位疫苗并不總是具有充分的致免疫性。近年來，許多候選的亞單位疫苗沒有通過臨床試驗，而可能獲得成功的則可用作增強對純化抗原的免疫反應(yīng)的適當(dāng)佐劑。佐劑指能通過調(diào)節(jié)免疫細胞的活性來增強對抗原的特異免疫反應(yīng)的物質(zhì)或手段。
我們描述了具有增強功效的佐劑。佐劑指能通過調(diào)節(jié)免疫細胞的活性來增強對抗原的特異免疫反應(yīng)的物質(zhì)或手段。佐劑的例子示例性地包括弗氏佐劑、胞壁酰二肽、脂質(zhì)體。公開號為WO 97/38711的國際申請和美國專利第02/0136722號，除其它外，公開了CD28抗原和CD40抗原軛合物，其作為佐劑導(dǎo)致對所述軛合物的抗原部分的免疫反應(yīng)增強。
CD28/CD40抗原軛合物可通過多種方法用多種可能的交聯(lián)劑來制備。在Pierce Chemical Company Inc.和Molecular Probes Inc.的目錄中描述了多種交聯(lián)劑和交聯(lián)方法。優(yōu)選的軛合方法使用所謂的異型雙功能(hetero-bifunctional)交聯(lián)劑，其在分子的每一端具有不同的官能團，因此其使用可防止直接的抗原-抗原交聯(lián)或抗體-抗體交聯(lián)。然而，除了這些交聯(lián)劑的上述優(yōu)點，在許多情況下仍能形成含有超過一個抗體分子和超過一個抗原分子的軛合物。
例如，如果用sulfo-SMCC和SATA作為交聯(lián)劑，首先對軛合物的其中一種組分用sulfo-SMCC進行馬來酰亞胺修飾(maleimate)，而另一組分用SATA來結(jié)合巰基。所述馬來酰亞胺和巰基修飾都是在伯胺上進行的，而伯胺在抗體和抗原上均有多個(氨基末端殘基(每Ig分子上4個)，及任意賴氨酸殘基)。因此，任意抗原均可能與超過一個抗體分子結(jié)合，而任意抗體分子均有可能與超過一個抗原分子結(jié)合。這樣，可形成大型共價結(jié)合的抗體和抗原復(fù)合物?？捎枚鄠€不同參數(shù)對軛合過程中形成的所述復(fù)合物進行表征i)軛合物的總大小(分子量)；ii)抗體對抗原的比例(重量∶重量)；iii)抗體對抗原的比例(摩爾∶摩爾)；iv)軛合物中的平均抗體分子數(shù)；及v)軛合物中的平均抗原分子數(shù)。
對任一已知分子量的抗原，所有這些參數(shù)均可從(iv)和(v)推導(dǎo)出來。然而，當(dāng)抗原大小變化時，這些數(shù)值之間的關(guān)系會發(fā)生變化，因此最佳的軛合物形式會在小型(肽)、中型(蛋白)和大型(多糖)抗原之間變化。
從體外實驗得知，通過增加所述相互作用的效價可以增強通過CD40及CD28進行的信號傳輸。因此，為了實現(xiàn)最佳的B細胞或T細胞增殖，在加入所述細胞前，將抗-CD40或抗-CD28粘附在組織培養(yǎng)板的塑料上，或通過使用粘附在所述塑料上的抗-Fc抗體，或者甚至通過使用諸如本身粘附在所述組織培養(yǎng)塑料板上的CD32表達L929細胞的Fc受體表達細胞系來進行交聯(lián)從而粘附在所述塑料上(Banchereau et al，Science，1991，252，70-72.)。出人意料地，我們發(fā)現(xiàn)，與體外的誘導(dǎo)增殖不同，通過增加多重效價并不能增強抗體的佐劑作用。實際上，當(dāng)任何一種抗體處于多價狀態(tài)時，所述佐劑作用減弱。
本發(fā)明的一個方面提供一種佐劑，其包括CD28和/或CD40抗體及至少一個抗原的分離的軛合物，其中所述軛合物由低聚復(fù)合物構(gòu)成，其中所述復(fù)合物的抗體效價的平均值不超過每個復(fù)合物約5個抗體分子。
“軛合物”的形成是通過任何能導(dǎo)致抗原與抗體的共軛交聯(lián)或軛合的手段來實現(xiàn)的。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述復(fù)合物具有每個復(fù)合物平均1-4個抗體分子。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中，所述復(fù)合物具有每個復(fù)合物平均1-3個抗體分子。更優(yōu)選每個復(fù)合物1-2個抗體分子。
本發(fā)明的另一方面提供包括本發(fā)明的軛合物的疫苗組合物。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述組合物還包括載體。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中，所述組合物還包括第二佐劑。
在本發(fā)明更進一步優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包括本文所述的CD40軛合物和CD28軛合物的混合物。
下文對術(shù)語“載體”進行了解釋。載體是當(dāng)其與第二分子結(jié)合后能增強后者的免疫反應(yīng)的致免疫分子。某些抗原本質(zhì)上不是致免疫的(即其本身不是致免疫的)，然而當(dāng)與諸如鑰孔(keyhole-limpet)血藍蛋白或破傷風(fēng)類毒素的異物蛋白分子結(jié)合時能產(chǎn)生抗體反應(yīng)。這類抗原含有B-細胞抗原決定簇(epitope)但沒有T細胞抗原決定簇。這類軛合物的蛋白部位(“載體”蛋白)提供T-細胞抗原決定簇，其刺激輔助性T-細胞進而刺激抗原特異B-細胞分化為漿細胞并產(chǎn)生抗所述抗原的抗體。輔助性T-細胞還能刺激其它諸如細胞毒性T-細胞的免疫細胞，而載體能實現(xiàn)類似的產(chǎn)生細胞介導(dǎo)的免疫及抗體的作用。某些缺乏T-細胞抗原決定簇(諸如具有重復(fù)B-細胞抗原決定簇(例如細菌多糖)的聚合物)的抗原本質(zhì)上具有有限的致免疫性。這些被稱為T-非依賴抗原。這類抗原得益于與諸如破傷風(fēng)類毒素的載體結(jié)合，在這種條件下其引起強得多的抗體反應(yīng)。細菌多糖的載體軛合用于制備多種抗諸如流感嗜血桿菌(Hib)和C型腦膜炎球菌的抗細菌感染的‘軛合物疫苗’。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述抗原為T-細胞依賴抗原。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，所述抗原為T-細胞非依賴抗原。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述抗原源自致病菌。
優(yōu)選地，所述抗原源自菌種，所述菌種選自如下細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)；糞腸球菌(Enterococcus faecalis)；結(jié)核分歧桿菌(Mycobacterium tuberculsis)；B組鏈球菌(Streptococcus group B)；肺炎鏈球菌(Streptoccocus pneumoniae)；幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)；淋病雙球菌(Neisseria gonorrhea)；A組鏈球菌(Streptococcus group A)；伯氏螺旋體(Borrelia burgdorferi)；粗球孢子菌(Coccidiodes immitis)；莢膜組織胞漿菌(Histoplasma sapsulatum)；腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)；弗氏志賀菌(Shigella flexneri)；大腸桿菌(Escherichia coli)；流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，所述抗原源自病毒性病原體。
優(yōu)選地，所述抗原源自病毒性病原體，所述病毒性病原體選自人免疫缺陷病毒(HIV1&2)；人T細胞白血病病毒(HTLV 1&2)；埃博拉病毒；人乳頭瘤病毒(例如HPV-2，HPV-5，HPV-8，HPV-16，HPV-18，HPV-31，HPV-33，HPV-52，HPV-54和HPV-56)；乳多空病毒；鼻病毒(rhinovirus)；脊髓灰質(zhì)炎病毒；皰疹病毒；腺病毒(adenovirus)；愛潑斯坦-巴爾病毒；流感病毒，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，所述抗原源自寄生性病原體。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中，所述抗原源自寄生性病原體，所述寄生性病原體選自錐蟲屬(Trypanosoma spp.)、Lieshmania屬、血吸蟲屬(Schistosoma spp.)或原蟲屬(Plasmodium spp.)。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，所述抗原源自真菌病原體。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述抗原源自念珠菌屬(Candida spp.)的真菌病原體，優(yōu)選為白色念珠菌(Candida albicans)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述抗原是腫瘤特異抗原或腫瘤相關(guān)抗原。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，所述抗原是成癮性藥物。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中，所述藥物選自可卡因、煙堿或海洛因。
本發(fā)明的再一方面提供使動物對抗原免疫的方法，包括以足夠刺激引起對所述抗原的免疫反應(yīng)的有效量的本發(fā)明軛合物進行給藥。
在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，所述動物為人。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的方法中，所述動物選自小鼠、大鼠、倉鼠、山羊、母牛、馬、豬、狗、貓或羊。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的方法中，所述免疫反應(yīng)是產(chǎn)生抗體對所述軛合物的作用。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的方法中，所述免疫反應(yīng)是產(chǎn)生能識別所述軛合物的抗原部分的輔助性T-細胞。
優(yōu)選的給藥途徑是皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或鼻內(nèi)途徑，然而所述致免疫方法并不局限于具體的給藥方式。
本發(fā)明的再一方面提供可通過本發(fā)明方法獲得的抗體。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是治療性抗體。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是診斷抗體。優(yōu)選地，所述診斷抗體帶有標(biāo)簽或標(biāo)記。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是單克隆抗體或其結(jié)合片段。優(yōu)選地，所述抗體是人源化抗體或嵌合抗體。
嵌合抗體是通過重組方法制備的具有抗體的可變區(qū)和人抗體的不變區(qū)或恒定區(qū)的抗體。
人源化抗體是通過重組方法制備的結(jié)合了抗體的補體決定區(qū)(CDRs)及人抗體的恒定(C)區(qū)和來自可變(V)區(qū)的框架區(qū)的抗體。
嵌合抗體是所有的小鼠或大鼠抗體V-區(qū)與人抗體C-區(qū)結(jié)合的重組抗體。人源化抗體是將來自嚙齒動物抗體V-區(qū)的補體決定區(qū)與來自人抗體V-區(qū)的框架區(qū)融合的重組雜交抗體。也使用人抗體的C-區(qū)。所述補體決定區(qū)(CDRs)是抗體重鏈和輕鏈的N-末端功能域內(nèi)的區(qū)域，V-區(qū)的主要變異都局限在該區(qū)域。這些區(qū)域在所述抗體分子的表面形成環(huán)。這些環(huán)提供了抗體與抗原之間的結(jié)合面。
來自非人動物的抗體激發(fā)了對異源抗體的免疫反應(yīng)，以及將其從循環(huán)中去除的作用。因為在所述重組雜交抗體中嚙齒動物(即異源)抗體的量減少，而人抗體區(qū)域不引起免疫反應(yīng)，因此當(dāng)注射入人類個體時，嵌合抗體和人源化抗體均具有削弱的抗原性。這導(dǎo)致較弱的免疫反應(yīng)以及所述抗體清除的降低。顯然，這是人類疾病治療中使用治療性抗體時所需要的。人源化抗體設(shè)計為具有較少的“異源”抗體區(qū)域，因此被認為致免疫性小于嵌合抗體。
也能產(chǎn)生單獨的可變區(qū)域，即所謂的單鏈抗體可變區(qū)片段(scFv’s)。如果對特異單克隆抗體存在雜交瘤，則本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員很容易通過RT PCR從所述雜交瘤中提取的mRNA中分離出scFv’s?？蛇x擇地，可進行噬菌體呈現(xiàn)(phage display)篩選來鑒定表達scFv’s的克隆。可選擇地，所述片段是“功能域抗體片段”。功能域抗體是抗體的最小結(jié)合部位(約13kDa)。這種技術(shù)的例子在美國專利第6,248,516、6,291,158、6,127,197號和歐洲專利第0368684號中進行了公開，本文將其整體引入作為參考。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是調(diào)理素抗體。
吞噬作用是由巨噬細胞和多形(polymorphic)白細胞介導(dǎo)的，并且包括微生物、受損或死亡細胞、細胞殘骸、不溶粒子和活化凝血因子的攝取和消化。調(diào)理素是促進上述異物的吞噬作用的試劑。因而，調(diào)理素抗體是能提供相同功能的抗體。調(diào)理素的例子是抗體的Fc部分或補體C3。免疫作用產(chǎn)生的與抗原結(jié)合的免疫復(fù)合物形式的抗體可通過在直接微環(huán)境中將補體固定在所述抗原、分子上來發(fā)揮調(diào)理素作用。
本發(fā)明的再一方面提供制備產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細胞系的方法，包括如下步驟i)使用本發(fā)明的軛合物、組合物、核酸或載體使免疫活性哺乳動物產(chǎn)生免疫；ii)將致免疫后的免疫活性哺乳動物的淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞；iii)對步驟(ii)的雜交瘤細胞產(chǎn)生的單克隆抗體進行篩選，以獲得對所述軛合物的抗原的有結(jié)合活性的抗體；iv)對所述雜交瘤細胞進行培養(yǎng)來增殖和/或分泌所述單克隆抗體；及v)從所述培養(yǎng)上清中回收所述單克隆抗體。
優(yōu)選地，所述免疫活性哺乳動物是嚙齒動物，例如小鼠、大鼠或者倉鼠。
本發(fā)明的再一方面提供可通過本發(fā)明方法得到的雜交瘤細胞系。
本發(fā)明的再一方面提供交聯(lián)抗體及至少一個抗原的方法，其特征在于提供了選擇具有低抗體效價的軛合物的反應(yīng)條件，其中所述抗體能夠結(jié)合CD28或CD40受體多肽。
本發(fā)明的再一方面提供了制備本發(fā)明軛合物的方法，包括對共軛反應(yīng)混合物進行分離。
在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，所述分離包括如下步驟i)提供由異源交聯(lián)的抗體抗原軛合復(fù)合物構(gòu)成的反應(yīng)混合物；ii)將所述反應(yīng)混合物分成含有規(guī)定大小的軛合物的部分；并且任意地iii)分離具有所需抗體效價的軛合物。
在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，所述部分含有抗體效價約為每個復(fù)合物平均5抗體分子的軛合復(fù)合物。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的方法中，所述部分含有抗體效價每個復(fù)合物1-4抗體的復(fù)合物。
在本發(fā)明更進一步優(yōu)選的實施方案中，所述部分含有抗體效價每個復(fù)合物1-3抗體的復(fù)合物。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中，所述部分含有兩個抗體分子的復(fù)合物。優(yōu)選地，所述軛合物是與至少一個抗原連接的單個抗體。
在本發(fā)明優(yōu)選的方法中，所述方法選自尺寸排阻色譜法；親和層析法；示差沉淀方法。
以下將參照如下附圖以示例方式提供了本發(fā)明的實施方案圖l顯示了抗-CD40抗體效價對一級抗-大鼠免疫反應(yīng)的作用；及圖2顯示了增加抗體效價對使用抗-CD40抗體的免疫反應(yīng)的作用。
材料和方法軛合物的抗體效價可通過多種途徑改變，實際上存在本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的多種可行的途徑來實現(xiàn)軛合過程。其示例性地包括以下實施例。
改變抗原的衍生度(degree of derivatisation)使抗原與抗體交聯(lián)的一種方法是對所述抗原使用例如sulfo-SMCC進行馬來酰亞胺修飾，然后將所述馬來酰亞胺修飾的抗原與硫醇化的抗體(可使用SATA或SPDP對抗體進行硫醇化)反應(yīng)。
通過改變反應(yīng)中sulfo-SMCC(硫基-琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-碳酸酯)與抗原的相對濃度可以改變所述抗原的馬來酰亞胺化的程度。
另一種制備軛合物的方法使得能夠?qū)Υ郎y定抗原的衍生度進行精確的測量?？墒褂媒宦?lián)劑SPDP(琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫)-丙酸鹽)對所述抗原進行硫醇化。SPDP在pH7-9條件下與含氨基的抗原反應(yīng)，產(chǎn)生混合的二硫化物。然后，通過用二硫蘇糖醇進行還原，釋放出2-吡啶硫酮發(fā)色團而巰基基團仍保留在所述蛋白上。從釋放的發(fā)色團的數(shù)量(通過吸光率測定)能夠計算出所述抗原上衍生作用的平均比例。顯然，如果該比例為例如3個巰基/抗原分子，則與sulfo-SMCC馬來酰亞胺修飾的抗體形成的后續(xù)軛合物不可能具有超過3的抗體效價。因此，控制衍生度進而控制每抗原分子的硫醇殘基的平均數(shù)量可限制軛合物的抗體效價。
另一種控制效價的方法是改變抗原上的反應(yīng)基團的數(shù)目。因此，可使用例如SPDP或SATA(除其它交聯(lián)劑外)來向抗原上添加巰基基團。這些交聯(lián)劑均與伯胺反應(yīng)，因此可與氨基末端殘基或蛋白上其它位置的賴氨酸殘基進行反應(yīng)?？梢酝ㄟ^定點突變(site-directed mutagenesis)來從重組抗原上去除某些賴氨酸殘基。顯然，可以通過改變合成過程來從肽中去除賴氨酸殘基。當(dāng)然，如果所述抗原序列被改變，則需要重點確認該過程沒有去除重要的抗原決定簇。
衍生的蛋白反應(yīng)中的抗原抗體比例的改變可改變反應(yīng)混合物中的衍生后抗原和抗體的相對比例，其對形成的軛合物的類型產(chǎn)生影響，其還依賴于所述兩種組分的衍生度和相對尺寸。
不同尺寸的軛合物的純化可通過尺寸分離對所形成的軛合物進行純化。例如通過凝膠過濾可將糖蛋白D和200kDa-400kDa的抗體軛合物與更大的軛合物分離。這類軛合物的每軛合物含有不超過兩個抗體分子(每個約150kDa)。
純化較低分子量的軛合物的可選方法是將聚乙二醇(PEG)連續(xù)加入所述軛合物混合物中。沉淀較大的軛合物需要相對較低的PEG濃度，因而增加濃度能沉淀尺寸逐漸減小的軛合物。PEG的替代物可以是諸如硫酸銨的鹽。同樣，增加硫酸銨的濃度可導(dǎo)致尺寸逐漸減小的蛋白/軛合物的沉淀。隨后，可從通過透析重新溶解的沉淀中除去PEG或硫酸鹽。
選擇低效價而非小尺寸的軛合物的另一方法是通過在負載Fc-γ-受體-IIb細胞外功能域的SepharoseCL4B上進行親和層析來減少高效價的軛合物。只有高效價的軛合物會粘附在所述柱上，或者可替代地，在0.15MP NaCl pH7.410mM Na Po4緩沖液的無梯度條件下，所述物質(zhì)種類可依效價的次序洗脫，即低效價先洗脫(在所述柱的“空隙容積(void volume)”中未吸附或吸附較弱)或其后迅速洗脫。
通過對比已知標(biāo)準的凝膠過濾或在某些條件下通過聚丙烯酰胺凝膠電泳可評估純化的軛合物的尺寸。然后還必須測定所述軛合物的活性，最重要的是表明抗原決定簇完整性的與CD40或CD28結(jié)合的抗體的保留及抗原的抗原性的保留。一種檢驗這兩種活性的方法是使用CD40或CD28表達細胞的流式細胞術(shù)(Flow cytometric)染色。將軛合物加入PBS中的細胞中，并在冰上孵育30分鐘。然后對細胞進行清洗，然后加入抗所述抗原的抗體(單克隆或多克隆)在冰上保持30分鐘。然后使用熒光標(biāo)記的第二抗體對所述抗體進行檢測。只有與抗體結(jié)合(到CD40或CD28)且抗原的抗原決定簇完整的軛合物才顯示出陽性染色，并且方便進行致免疫性評估。
噬菌體PEG沉淀/純化已知15％的PEG可從血清中沉淀自由的IgG。因此，對復(fù)合物適用更低的濃度，例如用于沉淀免疫復(fù)合物，或諸如以下的噬菌體病毒體(viron)的更大的分子。
1.向SS-34 Oakridge管中加入30ml噬菌體儲藏菌種(stock)；2.加入7.5ml 20％PEG-8000/2.5M NaCl；3.在冰上孵育30分鐘或更長時間；4.在11K下旋(spin down)噬菌體20分鐘；5.再旋轉(zhuǎn)2-3x以除去所有的PEG溶液(使用微細管尖端幫助去除所有的溶液)；6.將噬菌體在STE(500-1000μl)中重懸；7.轉(zhuǎn)移至eppendorf并在14K旋轉(zhuǎn)10分鐘；8.將上清轉(zhuǎn)移至新的eppendorf并標(biāo)記；9.對噬菌體進行滴定。
STE100ml中加入1ml 1M Tris(pH8)，0.2ml 0.5M EDTA(pH8)，2ml 5M NaCl，高壓滅菌。
PEG100ml中加入20gm PEG-8000和14.6gm NaCl，過濾殺菌。
實施例1與對照大鼠IgG2a相比，大鼠(IgG2a)抗-小鼠CD40在小鼠中誘導(dǎo)了及大增強的抗大鼠IgG2a的免疫反應(yīng)。為了評估抗-CD40效價對所述佐劑效果的作用，制備不同CD40抗體效價的免疫原如下。
a.將單獨的抗-CD40抗體或同種型(isotype)對照抗體作為免疫原，效價為一個CD40抗體/“軛合物”(單體的(Monomeric))。
b.將抗-CD40或同種型對照抗體與抗-大鼠Ig抗體交聯(lián)，得到的效價為兩個CD40抗體/軛合物(二體的(dimeric))。
c.將抗-CD40或同種型對照抗體與生物素基化的(biotinylated)抗-大鼠Ig和抗生物素蛋白交聯(lián)，得到多聚體軛合物(多體的(multimeric))。
為了確保每只小鼠都用等量的抗原混合物致免疫，向所述免疫原中加入對照蛋白，從而使所述免疫原包括下列成分a)10ug CD40或同種型對照mAb，10μg小鼠IgG和5μg抗生素蛋白b)10μg CD40或同種型對照mAb，10μg小鼠抗大鼠IgG和5μg抗生素蛋白c)10μg CD40或同種型對照mAb，10μg生物素基化的小鼠抗大鼠IgG和5μg抗生素蛋白。
對5BALB/c雌性小鼠組進行腹膜內(nèi)致免疫，10天后采血，并如前所述通過ELISA分析血清的抗-大鼠IgG2a反應(yīng)(Barr et al.Immunology 10987-91，2003)。簡而言之，在4℃將96孔ELISA板用10μg/ml PBS中的大鼠IgG2a(GL117)包被過夜。第二天用1％PBS中的魚膠將所述板封閉，并用PBS/0.05％Tween清洗。制備系列的血清稀釋液，在室溫下孵育1小時并清洗后，將多重吸附的(multiadsorbed)的軛合物(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗-小鼠免疫球蛋白)(Sigma)加入孔中，并將所述板繼續(xù)孵育1小時。然后再次清洗所述板，并用基質(zhì)(OPD，Sigma)孵育15分鐘，并在490nm處讀取。滴定度表示為最高血清稀釋度的倒數(shù)，在所述最高血清稀釋度處測試血清表現(xiàn)出比正常小鼠血清更高的OD值。結(jié)果如

圖1所示。
實施例2軛合物效價的提高會降低所述抗體反應(yīng)。用SPDP(Molecular probes，使用Molecular probes提供的方案)對鑰孔血藍蛋白(Sigma)進行修飾，并通過二硫蘇糖醇還原來對巰基基團進行脫保護，隨后進行透析。用sulfo-SMCC(Molecular probes，使用Molecular probes提供的方案)對抗-CD40或同種型對照抗體進行馬來酰亞胺修飾，并將所述修飾后的蛋白混合形成如下的軛合物A)100％抗-CD40抗體(5mg抗體-1mg KLH)B)10％抗-CD40，90％同種型對照抗體(5mg抗體-1mg KLH)C)1％抗-CD40，99％同種型對照抗體(5mg抗體-1mg KLH)。
該方案涉及用來制備相同尺寸和抗原含量，但具有不同CD40抗體效價的軛合物。
對3BALB/c雌性小鼠組進行腹膜內(nèi)致免疫，10天后采血，并如前所述通過ELISA分析血清的抗-KLH反應(yīng)(Barr et al.Immunology 109 87-91，2003)。簡而言之，在4℃將96孔ELISA板用10μg/ml PBS中的KLH包被過夜。第二天用1％PBS中的魚膠將所述板封閉，并用PBS/0.05％Tween清洗。制備系列的血清稀釋液，在室溫下孵育1小時并清洗后，將多重吸附的(multiadsorbed)的軛合物(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗-小鼠免疫球蛋白)(Sigma)加入孔中，并將所述板繼續(xù)孵育1小時。然后再次清洗所述板，并用基質(zhì)(OPD，Sigma)孵育15分鐘，并在490nm處讀取。滴定度表示為最高血清稀釋度的倒數(shù)，在所述最高血清稀釋度處測試血清表現(xiàn)出比正常小鼠血清更高的OD值。
結(jié)果如圖2所示。用所述1％ CD40軛合物致免疫的小鼠表現(xiàn)出最強的抗KLH抗體反應(yīng)。因為據(jù)估計SPDP修飾作用可產(chǎn)生200個反應(yīng)位點/KLH分子，因此C組中所用的軛合物的估計最大CD40抗體效價為2分子抗-CD40/KLH分子。
權(quán)利要求
1.一種佐劑，包括CD28和/或CD40抗體與至少一個抗原的分離的軛合物，其中所述軛合物由低聚復(fù)合物構(gòu)成，其中所述復(fù)合物的抗體效價不超過平均每個復(fù)合物約五個抗體分子。
2.如權(quán)利要求1所述的佐劑，其中所述軛合物包括每個復(fù)合物平均1-4個抗體分子。
3.如權(quán)利要求2所述的佐劑，其中所述復(fù)合物包括每個復(fù)合物平均1-3個抗體分子。
4.如權(quán)利要求2或3所述的佐劑，其中所述復(fù)合物包括每個復(fù)合物平均1-2個抗體分子。
5.疫苗組合物，包括權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的軛合物。
6.如權(quán)利要求5所述的疫苗，其中所述組合物還包括載體。
7.如權(quán)利要求5或6所述的疫苗，其中所述組合物還包括第二佐劑。
8.如權(quán)利要求7所述的疫苗，其中所述組合物包括權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的CD40佐劑和CD28佐劑的混合物。
9.如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的佐劑，其中所述抗原是T-細胞依賴抗原。
10.如權(quán)利要求1-4中任一權(quán)利要求所述的佐劑，其中所述抗原是T-細胞非依賴抗原。
11.如權(quán)利要求9或10所述的佐劑，其中所述抗原源自致病菌。
12.如權(quán)利要求11所述的佐劑，其中所述抗原源自菌種，所述菌種選自金黃色葡萄球菌；表皮葡萄球菌；糞腸球菌；結(jié)核分歧桿菌；B組鏈球菌；肺炎鏈球菌；幽門螺旋桿菌；淋病雙球菌；A組鏈球菌；伯氏螺旋體；粗球孢子菌；莢膜組織胞漿菌；腦膜炎雙球菌；弗氏志賀菌；大腸桿菌；流感嗜血桿菌。
13.如權(quán)利要求9或10所述的佐劑，其中所述抗原源自病毒病原體。
14.如權(quán)利要求13所述的佐劑，其中所述抗原源自病毒病原體，所述病毒病原體選自人免疫缺陷病毒(HIV1 & 2)；人T細胞白血病病毒(HTLV1& 2)；埃博拉病毒；人乳頭瘤病毒(例如HPV-2，HPV-5，HPV-8，HPV-16，HPV-18，HPV-31，HPV-33，HPV-52，HPV-54和HPV-56)；乳多空病毒；鼻病毒；脊髓灰質(zhì)炎病毒；皰疹病毒；腺病毒；愛潑斯坦-巴爾病毒；流感病毒，乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒。
15.如權(quán)利要求9或10所述的佐劑，其中所述抗原源自寄生性病原體。
16.如權(quán)利要求15所述的佐劑，其中所述抗原源自寄生性病原體，所述寄生性病原體選自錐蟲屬、血吸蟲屬或原蟲屬。
17.如權(quán)利要求9或10所述的佐劑，其中所述抗原源自真菌病原體。
18.如權(quán)利要求17所述的佐劑，其中所述抗原源自念珠菌屬的真菌病原體。
19.如權(quán)利要求9或10所述的佐劑，其中所述抗原是腫瘤特異抗原或腫瘤相關(guān)抗原。
20.如權(quán)利要求19所述的佐劑，其中所述抗原是神經(jīng)節(jié)苷酯抗原。
21.如權(quán)利要求19或20所述的佐劑，其中所述抗原是MUC-1。
22.如權(quán)利要求9或10所述的佐劑，其中所述抗原是激素或激素受體。
23.如權(quán)利要求22所述的佐劑，其中所述抗原是N-甲基-D天冬氨酸鹽受體或其部分。
24.如權(quán)利要求9或10所述的佐劑，其中所述抗原是蛋白感染素蛋白。
25.如權(quán)利要求24所述的佐劑，其中所述抗原是淀粉狀蛋白。
26.如權(quán)利要求25所述的佐劑，其中所述抗原是淀粉狀蛋白β或其部分。
27.如權(quán)利要求9或10所述的佐劑，其中所述抗原是精子抗原。
28.如權(quán)利要求9或10所述的佐劑，其中所述抗原是成癮性藥物。
29.如權(quán)利要求28所述的佐劑，其中所述藥物選自可卡因、煙堿或海洛因。
30.使動物對抗原免疫的方法，包括以足夠刺激引起對所述抗原的免疫反應(yīng)的有效量的權(quán)利要求1-29中任一權(quán)利要求所述的軛合物進行給藥。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述動物是人。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述動物選自小鼠、大鼠、倉鼠、山羊、母牛、馬、豬、狗、貓或羊。
33.如權(quán)利要求30-32中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述給藥途徑是皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或鼻內(nèi)途徑。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述途徑是鼻內(nèi)途徑。
35通過權(quán)利要求30-34中任一權(quán)利要求所述的方法獲得的抗體。
36.如權(quán)利要求35所述的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體或其結(jié)合片斷。
37.如權(quán)利要求36所述的抗體，其中所述抗體是人源化抗體。
38.如權(quán)利要求36所述的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體。
39.如權(quán)利要求36-38中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述抗體是調(diào)理素抗體。
40.制備產(chǎn)生權(quán)利要求36所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞系的方法，包括如下步驟i)使用權(quán)利要求1-29的軛合物或組合物使免疫活性哺乳動物產(chǎn)生免疫；ii)將致免疫后的免疫活性哺乳動物的淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞；iii)對步驟(ii)的雜交瘤細胞產(chǎn)生的單克隆抗體進行篩選，以獲得對所述軛合物的抗原的有結(jié)合活性的抗體；iv)對所述雜交瘤細胞進行培養(yǎng)來增殖和/或分泌所述單克隆抗體；及v)從所述培養(yǎng)上清中回收所述單克隆抗體。
41.通過權(quán)利要求40所述的方法獲得的雜交瘤細胞系。
42.交聯(lián)抗體及至少一個抗原的方法，其特征在于提供了選擇具有低抗體效價的軛合物的反應(yīng)條件，其中所述抗體能夠結(jié)合CD28或CD40受體多肽。
43.制備權(quán)利要求1-4或9-29中任一權(quán)利要求所述的佐劑的方法，包括對共軛反應(yīng)混合物進行分離。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，所述分離包括如下步驟i)提供由異源交聯(lián)的抗體抗原軛合復(fù)合物構(gòu)成的反應(yīng)混合物；ii)將所述反應(yīng)混合物分成含有規(guī)定大小的軛合物的部分；并且任意地iii)分離具有所需抗體效價的軛合物。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述部分含有抗體效價約為每個復(fù)合物平均5個抗體分子的軛合復(fù)合物。
46.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述部分含有抗體效價為每個復(fù)合物1-4個抗體的復(fù)合物。
47.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述部分含有抗體效價為每個復(fù)合物1-3個抗體的復(fù)合物。
48.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述部分含有兩個抗體分子的復(fù)合物。
49.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述軛合物是與至少一個抗原連接的單個抗體。
50.通過權(quán)利要求43-49中任一權(quán)利要求所述的分離方法獲得軛合物。
全文摘要
本發(fā)明描述了包括抗－CD40或抗－CD28抗體和抗原的軛合物及制備所述軛合物的方法，其中所述軛合物具有較低的抗體效價。
文檔編號C07K16/18GK1726047SQ200380105827
公開日2006年1月25日 申請日期2003年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月11日
發(fā)明者安德魯·希思, 彼得·萊恩 申請人:艾助萬提斯有限公司