專利名稱：：可用來抵御并治療hiv感染的去免疫化單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及去免疫化抗體，是作為治療人類獲得性免疫缺陷病毒(HIV)和CD4-引起的自身免疫紊亂的有效免疫治療藥物。
背景技術(shù)：
：從發(fā)現(xiàn)HIV是機(jī)體獲得性免疫功能缺乏綜合癥(AIDS)的致病源到現(xiàn)在已有20年，從克隆AIDS病毒并著手揭示它的各種特性開始，到現(xiàn)在已經(jīng)有18年，盡管在這期間為了研制出有效的疫苗而進(jìn)行了大量的科學(xué)研究，但是HIV的免疫治療仍然存在著許多困難。這些困難主要包括1型HIV病毒(主要的HIV病毒類型)的高變異性，HIV病毒傳播途徑和方式的多樣化以及缺少針對HIV病毒的免疫應(yīng)答的了解。摩爾等人的綜述[1]報(bào)導(dǎo)，針對各種抗原決定簇的抗體只對自身同源病毒具有抑制活性，并分離密切相關(guān)的包膜蛋白。此外，識別包膜蛋白的保守區(qū)域越多的單克隆抗體，其潛在的免疫治療靶向性越好，它們絕大多數(shù)不會很強(qiáng)地抑制多種主要的分離物。如何獲得大量抗病毒抗體顯得如此高深莫測，以至于針對HIV的疫苗學(xué)領(lǐng)域主要集中于一些可以提供針對該疾病的方法，最好提供一種希望[2]。原代HIV-1分離物是從限制性培養(yǎng)的患者外周血液單核細(xì)胞(PBMCs)或者含有未被感染的PBMCs患者血漿中獲得的。它們非常類似于可以感染人的HIV野生病毒株[3]。原代分離物很容易和一般實(shí)驗(yàn)室常用的T-熱帶病毒區(qū)分開來，例如IIIb/LAI，SF2和MN，這些病毒已經(jīng)得到繁殖，非常適合在人的T淋巴細(xì)胞系中生長。首先，大多數(shù)的HIV-1的原代分離物屬于M熱帶病毒。它們在培養(yǎng)的T細(xì)胞系中不易生長，但是它們是單核細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞，能夠感染原代T細(xì)胞[4]。其次，原代分離物可以有效抵制各種可溶形式的受體蛋白CD4(rsCD4)重組造成的體外中和作用，而且，相對于中和作用而言，它需要的rsCD4的量要比實(shí)驗(yàn)室使用的品系多200到2700倍[5]。第三，原代分離物也可以抵制由gp120疫苗引起的抗體中和反應(yīng)[6]。原代分離物包括在PBMC培養(yǎng)下的多核體誘導(dǎo)的分離物(SI)和非多核體誘導(dǎo)(NSI)的分離物。大多數(shù)SI原代分離物可以在HIV高敏性的MT2T細(xì)胞系中復(fù)制，但是很少能夠在轉(zhuǎn)化率不高的T細(xì)胞系中復(fù)制，比如通常用來培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室適用分離物的CEM或H9細(xì)胞系。非多核細(xì)胞誘導(dǎo)(NSI)的原代分離物只能在來自外周血液的原代T細(xì)胞中培養(yǎng)。早期錯(cuò)誤的觀點(diǎn)樂觀地認(rèn)為抗體可以對重組HIV-1包裹亞基疫苗產(chǎn)生有效的應(yīng)答(比如gp120和gp160疫苗產(chǎn)物)，利用包裹依賴性疫苗對接種者血清進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)他們的血清能夠在體外中和實(shí)驗(yàn)室HIV-1分離物[7，8]。當(dāng)時(shí)，實(shí)驗(yàn)室適用的分離物和原代分離物之間的本質(zhì)差異并不是很清楚，當(dāng)發(fā)現(xiàn)接種者血清中的抗體大多無法有效地抑制HIV-1原始患者病毒分離物后，這種樂觀的觀點(diǎn)開始動搖[6，9]。早期的疫苗誘導(dǎo)有效抗體的樂觀看法錯(cuò)誤地來源于對猿類免疫缺乏病毒(SIV)滅活病毒預(yù)備物的研究。由于HIV-1和SIV兩者在形態(tài)、遺傳結(jié)構(gòu)、感染及病變過程上的相似，感染SIV的恒河猴似乎可以被用作開發(fā)不同AIDS疫苗和抗HIV抗體的出色的模型。對于SIV模型的早期研究表明，在人T細(xì)胞上生長并且在輔助因子幫助下表達(dá)的SIV病毒的非活性預(yù)備物，能夠使得接種各種高感染致病劑量的人細(xì)胞成熟SIV病毒的短尾猿免于感染[10]，出乎意料的是，將這種從同類猴細(xì)胞中培養(yǎng)出來的SIV病毒儲液再次感染已經(jīng)被免疫過的動物時(shí)，這種保護(hù)竟然消失了。稍后利用猴細(xì)胞成熟的SIV病毒和未感染的人細(xì)胞進(jìn)行的研究表明，對于防止SIV感染的早期研究發(fā)現(xiàn)，可能是由于激發(fā)了對于異基因宿主細(xì)胞蛋白的免疫應(yīng)答，而不是產(chǎn)生了對于病毒編碼產(chǎn)生抗原的應(yīng)答[11]。SIV被動免疫試驗(yàn)表明，一些針對細(xì)胞的抗體有可能引起在缺少細(xì)胞介導(dǎo)免疫的情況下對于SIV感染的保護(hù)作用[12]。針對細(xì)胞抗體提供對恢復(fù)性病毒感染的保護(hù)性免疫的機(jī)制仍然沒有弄清。這種保護(hù)的一種模式可能是通過阻斷一些免疫缺陷病毒在免疫細(xì)胞上的CD4結(jié)合位點(diǎn)來介導(dǎo)的。一直以來被人所知，抗CD4單克隆抗體防止感染，是通過依賴CD4的表面抗原決定部位的方式來實(shí)現(xiàn)的，而不是針對特定的病毒[13，14]。可以識別CD42區(qū)的單克隆抗體5A8，對于SIV感染的短尾猿具有定的免疫功效[15]?？笴D4的單克隆抗體Leu3A和P1，能夠識別在CD4區(qū)中類似CDR2的環(huán)結(jié)構(gòu)，從而能夠防上培養(yǎng)中的原代分離物的感染[5，14]?？笴D4的抗體可以抑制SI和NSI品系HIV1病毒的病毒到細(xì)胞或感染細(xì)胞到未感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[16]。宿主T細(xì)胞表面具有與CD4相關(guān)聯(lián)的宿主細(xì)胞抗原復(fù)合體，它可以幫助病毒結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞，也可以作為保護(hù)性抗細(xì)胞抗體的作用靶位[17，18]。鼠單克隆抗體B4(mAbB4)[17，18]是一個(gè)使用CD4表達(dá)T淋巴細(xì)胞作為免疫原而發(fā)展起來的抗細(xì)胞抗體，其中T淋巴細(xì)胞有例如外周血液單核T細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞以及白血病或淋巴瘤分化來的T細(xì)胞系，如HPB-ALL或SUP-T1。MAbB4在體內(nèi)和體外都具有抑制HIV-1和相關(guān)免疫缺陷病毒的原代分離物活性。特別地，mAbB4能夠阻止HIV和CD4+宿主細(xì)胞的相互結(jié)合。它是一種入口抑制劑，一種新的治療HIV的感染的抗回復(fù)病毒的類型，同時(shí)提供了一種具有潛力的高活力抗回復(fù)病毒治療(HAART)的正交療法。MAbB4可以直接針對宿主細(xì)胞表面抗原復(fù)合體，該復(fù)合體包含與化學(xué)激活受體領(lǐng)域相關(guān)聯(lián)的CD4蛋白，MAbB4通過結(jié)合區(qū)1中類似CDR2環(huán)的CD4外周區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)來識別CD4，這與Leu3A的結(jié)合位點(diǎn)并不一致。美國專利No.5,912,176強(qiáng)有力地表明B4抗體可以廣泛地抑制HIV-1所有進(jìn)化分枝病毒的原代分離物、HIV-2的原代分離物以及SIV病毒的活性。而當(dāng)各種針對細(xì)胞表面抗原的特異性抗體混合使用時(shí)，只有那些含有mAbB4的混合抗體顯示出強(qiáng)烈的抑制HIV-1B分枝病毒的原代分離物活性(24卷，1-10行；47卷，5-10行)。此外，在針對HIV-2原代分離物(如HIV-2ROD)和SIV株系的中和作用檢測中，盡管無法與抗N端V3MN抗體先前對于實(shí)驗(yàn)室適用的HIV-1MN的效果相比，mAbB4還是可以對所有株系表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用(45卷，19-35行)。另有研究證明在小鼠、猩猩和恒河猴體內(nèi)，mAbB4均可與HIV-1、HIV-2的原代分離物以及SIV發(fā)生有效的抑制活性。例如，在病毒感染后，服用mAbB4可以阻斷外周白細(xì)胞(PBL)急性結(jié)合的HIV-1感染小鼠造成免疫缺陷的過程[18]。同樣，在猩猩體內(nèi)，服用mAbB4也可以完全阻斷HIV-1對于猩猩的感染[18]。此外，一定劑量的SIVmac251可以持久地感染恒河猴，而使用適量(4mg/kg)的mAbB4后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的被動免疫可以使得75％的猴子不受SIV原代分離物的感染(美國專利No.5,912,176，50卷，15-22行)。CD4作為HIV感染的受體預(yù)示著只要沒有不適的免疫反應(yīng)，CD4分子就可以作為抗細(xì)胞抗體mAbB4進(jìn)行免疫治療的很好靶位。但是，人體對鼠源抗體產(chǎn)生免疫排斥，會限制鼠源單克隆抗體如mAbB4在人體內(nèi)進(jìn)行治療或診斷中的應(yīng)用。在患者體內(nèi)形成的“HAMA”(人抗鼠抗體)反應(yīng)會影響鼠源抗體到達(dá)特異性抗原靶位，從而降低了這些抗體的療效?？贵w人源化技術(shù)可以降低HAMA反應(yīng)。例如，鼠抗可以被改造成拼接的鼠/人抗體，其中編碼產(chǎn)生小鼠免疫球蛋白的可變區(qū)整個(gè)DNA可以同編碼人免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA相拼接，表達(dá)這種抗體[19]。通過互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的拼接，小鼠DNA序列能夠更好的人源化。通過刪除大鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)編碼六個(gè)CDR的序列，并與人的重鏈和輕鏈的結(jié)構(gòu)序列拼接，就完成了對大鼠Fv區(qū)域的改造，從而可以應(yīng)用于人的臨床治療。改造過后的可變區(qū)序列就能與人的恒定區(qū)進(jìn)行組裝[20]。但是，經(jīng)過拼接和嫁接的抗體仍然具有鼠源的可變區(qū)或CDR區(qū)域，所以仍有可能具有免疫原性。而且，CDR與不相關(guān)的結(jié)構(gòu)嫁接會降低其與人源化抗體的親和性。因此，將鼠源單克隆抗體人源化需要采用同源序列并進(jìn)行分子模型化改造，才能夠更具實(shí)用性。這些方法是用來為鼠源CDR篩選出更加同源的人的結(jié)構(gòu)序列，從而能夠保持較高的親和力，降低鼠源殘基的暴露[21]。既然使鼠源抗體人源化是為了降低其在人體內(nèi)的免疫原性，那么去免疫也是一種有用的可選途徑。去免疫化可以通過去除那些可能在人體內(nèi)產(chǎn)生免疫原性的嚙齒類抗體可變區(qū)的抗原決定基，來降低抗體在人體內(nèi)的免疫原性。在實(shí)際操作中，對抗治療性抗體的一種有效原始免疫應(yīng)答包括對于外來蛋白的處理、依賴MHCII型分子(T細(xì)胞抗原決定簇)的抗原肽的遞呈以及輔助T細(xì)胞的激活。這些輔助T細(xì)胞激發(fā)并增強(qiáng)B細(xì)胞的與治療抗體結(jié)合的抗體的表達(dá)產(chǎn)生。此外，如果治療性抗體(B細(xì)胞抗原決定簇)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)序列在一定的細(xì)胞因子作用下與未成熟B細(xì)胞表面免疫球蛋白(sIg)結(jié)合，B細(xì)胞能夠被刺激分化增殖，提供出各種可溶形式的原始sIg，這些sIg可以與治療性抗體形成復(fù)合體而限制其活性，并使之從患者體內(nèi)被清除。所以為了避免對治療性的mAb產(chǎn)生原始免疫應(yīng)答，B細(xì)胞和T細(xì)胞在抗體內(nèi)的抗原決定簇必須被去除或修飾。如果沒有B細(xì)胞或T細(xì)胞應(yīng)答，對于治療性抗體的原始免疫應(yīng)答可能會減弱或消失。由Biovation公司(阿伯丁，英國)[22，23]開發(fā)的去免疫化技術(shù)主要是去除潛在免疫原性的B細(xì)胞和T細(xì)胞的抗原決定簇。mAbB4的去免疫化的發(fā)明就是應(yīng)用了這種方法。去除B細(xì)胞表面抗原決定簇是使用一定的氨基酸來鑲飾其表面的一些殘基[24]。也成功的去除T細(xì)胞表面的抗原決定簇，對于這些決定簇的識別，是通過三維“肽鏈線化”方法呈現(xiàn)MHCII型分子結(jié)合域，分析出治療性抗體可變區(qū)域的序列，然后從中找到抗原決定簇的[25]。最后的去免疫化抗體是通過化學(xué)方法將鼠源抗體的恒定區(qū)用人抗體恒定區(qū)域來代替完成的[19]。在人的被動免疫治療中，人源化或去免疫化的抗體將會在HIV感染的治療中發(fā)揮重要的作用。我們知道人的抗HIV單克隆抗體2F5和2G12能夠中和HIV的原代分離物，并且已經(jīng)被用來研究感染了HIV的人。同時(shí)也觀察到病毒負(fù)載的短期降低以及CD4+T細(xì)胞的短期增加[26]。這些抗體也被用來在非人靈長類模型中研究對于母代向子代傳染的免疫預(yù)防。無論這些抗體是在出生前通過靜脈灌輸進(jìn)入胎盤、母體還是直接在出生后注入恒河猴嬰兒，這些恒河猴嬰兒能夠抵御猴/人免疫缺陷型病毒(SHIV)的感染。作者認(rèn)為利用重組的抗病毒單克隆抗體進(jìn)行免疫預(yù)防來阻止母代HIV在人類中傳播是很有前景的方法[27]。被動免疫也被提議用于偶然性感染HIV后的快速預(yù)防治療[16，18]。既然一定的CD4特異性單克隆抗體能夠有效地干擾HIV-1原代分離物的對于淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的感染，并且比中和性抗HIV抗體作用更加廣泛[5，18，28]，像mAbB4這樣通過受體介導(dǎo)的定向單克隆抗體可能更適合于作為HIV的預(yù)防以及對于HIV感染的治療。出于這種目的，通過CDR嫁接的方法，已經(jīng)將單克隆抗體5A8(mAb5A8)改造成為人源化的IgG4抗體[28]。作為IgG4的異構(gòu)形式，人源化的mAb5A8在輔助固定作用的CH2區(qū)域缺少了一個(gè)糖基化位點(diǎn)。這一特征有助于提高相似抗體的安全性，盡可能減少患者體內(nèi)CD4+淋巴細(xì)胞的損失。人源化的5A8已經(jīng)進(jìn)入了對HIV感染患者進(jìn)行的臨床試驗(yàn)期[29]。除此之外，抗CD4的單克降抗體已經(jīng)在人風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療中取得了良好的臨床效果[30]。人單克隆抗體HuMax-CD4已經(jīng)進(jìn)入了治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和牛皮癬的臨床試驗(yàn)期[31]。這些應(yīng)用實(shí)施例證實(shí)了去免疫化抗體的潛在用途，例如那些來自B4抗體的去免疫化抗體已經(jīng)成為治療HIV和CD4引起的自身免疫紊亂疾病的免疫治療藥物。引用文獻(xiàn)1.Moore，J.P.，Parren，P.W.H.I.&Burton，D.R.Geneticsubtypes，humoralimmunity，andhumanimmunodeficiencyvirustype1vaccinedevelopment.J.Virol.2001，75(13)，5721-5729.2.Moore.J.P.AIDSvaccinesOnthetrailoftwotrials.Nature2002，415，365-366.3.Sawyer，L.S.W.，Wrin，M.T.，Crawford-Miksza，L.etal.Neutralizationsensitivityofhumanimmunodeficiencyvirustype1isdeterminedinpartbythecellinwhichthevirusispropagated.J.Virol.1994，68(3)，1342-1349.4.Cheng-Mayer，C.，Seto，D.，Tateno，M.&Levy，J.A.BiologicfeaturesofHIV-1thatcorrelatewithvirulenceinthehost.Science1988，240，80-82.5.Daar，E.S.，Li，X.L.，Moudgil，T.&Ho，D.D.HighconcentrationsofrecombinantsolubleCD4arerequiredtoneutralizeprimaryhumanimmunodeficiencyvirustype1isolates.Proc.Nat.Acad.Sci.USA1990，87(17)，6574-6578.6.Mascola，J.R.，Snyder，S.w.，Weislow，O.S.etal.Immunizationwithenvelopesubunitvaccineproductselicitsneutralizingantibodiesagainstlaboratory-adaptedbutnotprimaryisolatesofhumanimmunodeficiencyvirustype1.TheNationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseasesAIDSVaccineEvaluationGroup.JInfectDis1996，173(2)，340-348.7.Belshe，R.B.，Graham，B.S.，Keefer，M.C.etal.NeutralizingantibodiestoHIV-1inseronegativevolunteersimmunizedwithrecombinantgp120fromtheMNstrainofHIV-1.NIAIDAIDSVaccineClinicalTrialsNetwork.JAMA1994，272(6)，475-480.8.Keefer，M.C.，Graham，B.S.，Belshe，R.B.etal.Studiesofhighdosesofahumanimmunodeficiencyvirustype1recombinantglycoprotein160candidatevaccineinHIVtype1-seronegativehumans.TheAIDSVaccineClinicalTrialsNetwork.AIDSResHumRetroviruses1994，10(12)，1713-1723.9.Hanson，C.V.Measuringvaccine-inducedHIVneutralizationReportofaworkshop.AIDSResHumRetroviruses1994，10(6)，645-648.10.Desrosiers，R.C.，Wyand，M.S.，Kodama，T.etal.Vaccineprotectionagainstsimianimmunodeficiencyvirusinfection.ProcNatAcadSciUSA1989，86，6353-6357.11.Stott，E.J.Anti-cellantibodyinmacaques.Nature1991，353(6343)，393.12.Gardner，M.，Rosenthal，A.，Jennings，M.，Yee，J.，Antipa，L.&Robinson，E.J.PassiveimmunizationofrhesusmacaquesagainstSIVinfectionanddisease.AIDSResHumRetroviruses1995，11(7)，843-854.13.Sattentau，Q.J.，Dalgleish，A.G，Weiss，R.A.&Beverley，P.C.L.EpitopesoftheCD4antigenandHIVinfection.Science1986，234，1120-1123.14.Jameson，B.D.，Rao，P.E.，Kong，L.L.etal.LocationandchemicalsynthesisofabindingsiteforHIV-1ontheCD4protein.Science1988，240，1335-1339.15.Reimann，K.A.，Cate，R.L.，Wu，Y.etal.InvivoadministrationofCD4-specificmonoclonalantibodyEffectonproyirusloadinrhesusmonkeyschronicallyinfectedwiththesimianimmunodeficiencyvirusofmacaques.AIDSResHumRetroviruses1995，11(4)，517-525.16.Rieber，E.P.，Reiter，C.，Gurtler，L.，Deinhardt，F(xiàn).&Riethmuller，G.MonoclonalCD4antibodiesafteraccidentalHIVinfection.Lancet1990，336，1007-1008.17.Wang，C.Y.AntibodiesagainstahostcellantigencomplexforpreandpostexposureprotectionfrominfectionbyHIV.USPatentNo.5，912，1761999.18.Wang，C.Y.，Sawyer，L.S.W.，Murthy，K.K.etal.PostexposureimmunoprophylaxisofprimaryisolatesbyanantibodytoHIVreceptorcomplex.Proc.Nat.Acad.Sci.USA1999，96，10367-10372.19.Morrison，S.L.，Johnson，M.L.，Herzenberg，L.A.&Oi，V.T.Chimerichumanantibodymoleculesmouseantigen-bindingdomainswithhumanconstantregiondomains.ProcNatAcadSciUSA1984，81(21)，6851-6855.20.Reichmann，L.，Clark，M.，Waldmann，H.&Winter，G.Reshapinghumanantibodies.Nature1988，332，323-327.21.Co，M.S.，Deschamps，M.，Whitley，R.J.&Queen，C.Humanizedantibodiesforantiviraltherapy.ProcNatAcadSciUSA1991，88，2869-2873.22.Carr，F(xiàn).J.，Carter，G.，Hamilton，A.A.&Adair，F(xiàn).S.Reducingimmunogenicityofproteins-bymodifyingtheaminoacidsequenceoftheproteintoeliminatepotentialepitopesforT-cellsofagivenspecies.InternationalPatentApplicationWO98529761998.23.Adair，F(xiàn).Immunogenicity--Thelasthurdleforclinicallysuccessfultherapeuticantibodies.BioPharm2000，(October)，42-46.24.Padlan，E.A.Apossibleprocedureforredu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發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及去免疫化的抗體，所述去免疫化的抗體來源于對AIDS和其他CD4引起的紊亂進(jìn)行免疫治療的鼠源單克隆抗體B4。本發(fā)明同樣包括使用去免疫化抗體的治療方法。特別地，含有重組基因B4DIVHv1/VK1#7、B4DIVHv1/VK1#16、B4DIVHv1/VK1#21的克隆#7、#16和#21表達(dá)的抗體均來自小鼠單克隆B4抗體(美國專利No.5,912176，1999年6月15日公布)。小鼠單克隆B4抗體具有兩個(gè)主要特征特異性針對CD4+T細(xì)胞上的HIV受體；在體內(nèi)和體外均能抑制HIV原代分離物和相關(guān)免疫缺陷病毒[17，18]。去免疫化的重組抗體通過編碼mAbB4的Fv片段和人IgG1Fc片段的兩者的cDNA或多聚核苷酸相互融合表達(dá)出來的。這一核苷序列中的鼠源Fv區(qū)域通過直接突變?nèi)コ齺碜孕∈蟮闹劓?VH)和κ鏈(Vκ)可變區(qū)處的“人以外”B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原決定基，進(jìn)行去免疫化，這樣就便于在人體內(nèi)開展治療。分別用四個(gè)和三個(gè)cDNA或多聚核苷酸序列來對VH鏈和Vκ鏈進(jìn)行去免疫化。去免疫化抗體還需要通過定點(diǎn)突變改變一個(gè)糖基化位點(diǎn)來加工成N-去糖基化的IgG1的形式，這樣使之無法與輔助物相結(jié)合。所以，去糖基化的去免疫化抗體無法引起限制性CD4+細(xì)胞的輔助性調(diào)節(jié)裂解。這些新的去免疫化抗體仍然保持原來鼠源單克隆抗體的特異性和中和活性。這些由NS0小鼠骨髓瘤細(xì)胞和中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)表達(dá)的抗體能夠在無血清培養(yǎng)條件下大規(guī)模生產(chǎn)，然后用于人。這些去免疫化的抗體同樣能在轉(zhuǎn)基因植物中大規(guī)模生產(chǎn)以降低成本。本發(fā)明中的抗體可以用于HIV感染的預(yù)防、HIV的免疫治療以及CD4引起的自身免疫紊亂，比如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的免疫治療。圖1鼠源單克隆抗體B4(序列號1和2)重鏈的DNA序列、氨基酸序列以及限制性內(nèi)切酶圖譜圖2鼠源單克隆抗體B4(序列號3和4)輕鏈(κ)的DNA序列、氨基酸序列以及限制性內(nèi)切酶圖譜圖3含有HV插入片斷的重鏈表達(dá)載體pSVgptHuIgG1，用于在NS0細(xì)胞中表達(dá)由mAbB4小鼠VH和人CH1融合拼接而成的IgG1重鏈。Igenh是重鏈的增強(qiáng)子。圖4含有Vκ的插入片段的輕鏈表達(dá)載體pSVhygHuK。用于在NS0細(xì)胞中表達(dá)由mAbB4小鼠Vκ與人Cκ融合拼接而成的IgG輕鏈。Igenh和Kappaenh是重鏈和κ鏈的增強(qiáng)子。圖5鼠源B4VH區(qū)，即B4MoVH(序列號2)與四個(gè)去免疫化抗體的VH區(qū)，即B4DIVHv.1-v.4(序列號NOS5-8)的氨基酸序列比對?？虺龅膮^(qū)域是與B4MoVH不同的殘基位置。圖6鼠源B4Vκ區(qū)，即B4MoVK(序列號4)與三個(gè)去免疫化抗體的Vκ區(qū)，即B4DIVKv.1-v.3(序列號9-11)的氨基酸序列比對。框出的區(qū)域是與B4MoVK不同的殘基位置。圖7鼠源B4VH區(qū)，即B4MoVH(序列號1)與四個(gè)去免疫化抗體的VH區(qū)，即B4DIVHv.1-v.4(序列號12-15)的核苷酸序列比對。粗體和下劃線區(qū)域是與B4MoVH不同的殘基位置。圖8鼠源B4Vκ區(qū)，即B4MoVK(序列號3)與三個(gè)去免疫化抗體的Vκ區(qū)，B4DIVHv.1-v.3(序列號16-18)的核苷酸序列比對。粗體和下劃線區(qū)域是與B4MoVK不同的殘基位置。圖9B4拼接抗體和DIVH1/VK1-3去免疫化抗體與rsCD4結(jié)合的相對親和力。圖10B4拼接抗體和DIVH2/VK1-3去免疫化抗體與rsCD4結(jié)合的相對親和力。圖11B4拼接抗體和DIVH3/VK1-3去免疫化抗體與rsCD4結(jié)合的相對親和力。圖12dhfr基因表達(dá)載體，pSI-DHFR。圖13去免疫化抗體的重鏈表達(dá)載體，pcDNA3.1(+)Neo-DeIg1-S，其中B4DIVHv.1與人的CH結(jié)合，用來在CHOdhfr-細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。圖14去免疫化抗體的κ鏈表達(dá)載體，pcDNA3.1Zeo-HuK，其中B4DIVKv.1與人的Cκ結(jié)合，用來在CHOdhfr-細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。圖15去免疫化抗體的κ鏈和DHFR表達(dá)載體，pSI-DHFR/pcDNA3.1zeo-HuK(DD11N)，其中B4DIVKv.1與人的Cκ結(jié)合，用來在CHOdhfr-細(xì)胞中與dhfr進(jìn)行共表達(dá)。圖16SDS-PAGE分析糖苷酶調(diào)節(jié)的遷移率改變，以及考馬斯亮蘭斑點(diǎn)亮度的減小。圖17輔助固定測試。通過學(xué)生的T-檢驗(yàn)得到鼠源mAbB4和去免疫化B4抗體#16、#7相比較的P值分別為0.07和0.0001。圖18鼠源mAbB4的CDRs以及#7、#16和#21克隆的cDNA和氨基酸序列。具體實(shí)施例方式鼠源mAbB4的Fv片段的去免疫化作用是通過對潛在的具有免疫原性的鼠源T細(xì)胞和B細(xì)胞的抗原決定簇的鑒定和剔除來實(shí)現(xiàn)的。在從治療性抗體可變區(qū)識別出抗原決定簇后去除了T細(xì)胞的抗原決定簇。通過三維“肽鏈線化”方法呈現(xiàn)MHCII型結(jié)合域，分析出治療性抗體可變區(qū)域的氨基酸序列[22，25]。從可變區(qū)域去除B細(xì)胞表面至少一個(gè)或者全部抗原決定簇的方法是使用一定的氨基酸來鑲飾細(xì)胞表面的一些殘基，這樣就不會干擾抗體的識別[22，24]。用化學(xué)方法將mAbB4可變區(qū)域DNA序列和人IgG1恒定區(qū)相互拼接，用人的IgG1恒定區(qū)來代替小鼠的恒定區(qū)，從而完全去除了鼠源抗體的恒定區(qū)(CHandCκ)。下面的實(shí)施例1詳細(xì)描述了編碼鼠源mAbB4重鏈和輕鏈可變區(qū)域的DNA的序列、復(fù)原及克隆。圖1顯示了鼠源B4抗體VH的DNA和氨基酸序列。圖2顯示了鼠源B4抗體Vκ的DNA和氨基酸序列。參照其他抗體的序列，確定了CDR在兩條鏈上的位置[32]。B4的VH和Vκ兩條鏈分別與小鼠重鏈亞型V(B)和Kappa鏈亞型III相對應(yīng)[32]。如實(shí)施例2所述，如果希望的話，可以得到包含人全部恒定區(qū)和小鼠全部可變區(qū)的中間狀態(tài)的合成抗體。通過將得到的合成抗體和重組可溶性CD4(rsCD4)相互結(jié)合可以證實(shí)得到了正確的可變區(qū)。編碼鼠源B4VH和Vκ的cDNA或多聚核苷酸序列與人種系VH[33]和Vκ[34]的序列以及人種系J區(qū)域序列相近[35]。帶有人JH6的DP14、B1以及人Jκ2被挑選出來分別作為B4VH、B4Vκ和J區(qū)域序列的人源結(jié)構(gòu)框架參照。在特定的人結(jié)構(gòu)框架序列參照確定后，B4的VH和Vκ框架內(nèi)某些編碼與參照序列不同的氨基酸殘基的核苷酸序列被相應(yīng)的改造為與人源參照序列相一致。對于抗體的結(jié)構(gòu)與結(jié)合至關(guān)重要的氨基酸在這一過程中保持不變。在圖18中列舉了可識別B4VH和Vκ互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的序列，編號為20、22、24、26、28和30。CDR殘基以及CDR附近緊靠的框架結(jié)構(gòu)，如N端的結(jié)構(gòu)性區(qū)域仍然得以保留[24]。其他在這一階段保留下來的鼠源殘基主要是非表面的內(nèi)部殘基。通過這一過程得到的抗體非常類似于一種“鑲飾”的抗體，其表面殘基主要是人源序列，而包裹在內(nèi)部的殘基主要是最初的鼠源序列。把這些序列進(jìn)行多肽線化處理，通過分析它們與人的18種不同的MHCII型同種異型抗免疫球蛋白的結(jié)合情況來鑒別潛在的T細(xì)胞抗原決定簇。初級去免疫化的VH和Vκ的序列已經(jīng)被定義(B4DIVHv.1，B4DIVKv.1)。由于生產(chǎn)初級去免疫化序列需要少量的核苷酸序列替代物，這些替代物可能會影響去免疫分子的結(jié)合作用，所以設(shè)計(jì)了其它3種不同的VHs以及2種不同的Vκs。圖5和圖6分別列出了鼠源和去免疫化VH和Vκ區(qū)的氨基酸序列。圖7和圖8分別列出了鼠源和去免疫化的VH和Vκ區(qū)的核苷酸序列。實(shí)施例3詳細(xì)敘述了構(gòu)建包括5’端序列、先導(dǎo)信號肽、先導(dǎo)內(nèi)含子和鼠源免疫球蛋白啟動子、3’端序列、剪切位點(diǎn)和內(nèi)含子序列在內(nèi)的去免疫化抗體的可變區(qū)的核苷酸序列。一旦去免疫化抗體的重、輕鏈可變區(qū)基因構(gòu)建好，就被轉(zhuǎn)入帶有人IgG1的CH或Cκ區(qū)的表達(dá)載體中。載體中還帶有哺乳動物細(xì)胞(圖3和圖4)的篩選標(biāo)記。重組的載體隨后被轉(zhuǎn)入NS0細(xì)胞中。然后將表達(dá)產(chǎn)生的去免疫化抗體從培養(yǎng)基中純化出來，檢測它和rsCD4的結(jié)合能力以及對HIV-1的中和活性。通過ELISA分析可知12個(gè)不同的mAbB4表現(xiàn)出與rsCD4具有不同的親和性。這12個(gè)B4去免疫化抗體對HIV-1MNA、B、C、D、E亞基的SI原代分離物和采用MT-2微斑法從T細(xì)胞系中分離的HIV-1MN也表現(xiàn)出不同的中和能力[36]。比較四個(gè)重鏈的變異體(VHv.1-4)，發(fā)現(xiàn)它們都能與去免疫化的κ鏈1(VKv.1)相結(jié)合；這表明帶有重鏈1的抗體具有很高的中和所有HIV-1原代分離物的活性，而且活性接近于鼠源mAbB4對于HIV-1VL135、HIV-1UG029和HIV-1TH036的中和活性(表1)。去免疫化的B4抗體無法像鼠源親代抗體那樣有效抑制T細(xì)胞系適應(yīng)的HIV-1MN病毒。去免疫化抗體含有2型或3型κ鏈，具有類似或稍低的中和活性(表2)。比較12個(gè)不同mAbB4，表明具有DIVHv.1重鏈以及IVKv.1鏈的抗體擁有較高的中和所有HIV-1原代分離物的活性，并接近于鼠源mAbB4對HIV-1的中和活性。任何合適的表達(dá)系統(tǒng)都可以生產(chǎn)去免疫化的B4單克隆抗體，其中包括真核細(xì)胞系統(tǒng)，如動物細(xì)胞(哺乳動物細(xì)胞系)、植物細(xì)胞。不過最好在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，如NS0或CHO細(xì)胞。NS0是不產(chǎn)生免疫球蛋白的小鼠骨髓瘤細(xì)胞，可以從英國Porton的歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)庫(EuropeanCollectionofAnimalCellCulture，PortonUK(ECACC85110505號))中獲得。二氫葉酸還原酶缺陷型的CHO細(xì)胞(CHOdfhr-)可從美國模式細(xì)胞培養(yǎng)庫(AmericanTypeCultureCollection(ATCCno.CRL-9096))中獲得。對于需要高表達(dá)的重組抗體，二氫葉酸還原酶缺陷型的CHO細(xì)胞是一種被廣泛用于基因擴(kuò)增的哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)。這種細(xì)胞的生產(chǎn)效率隨著基因拷貝數(shù)的增加而提高，并且生產(chǎn)效率可達(dá)到每天每106個(gè)細(xì)胞能產(chǎn)生100μg特異性抗體[42]。同時(shí)，常用的啟動子也被用于哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)，例如，帶有人細(xì)胞巨化病毒早期啟動子的病毒表達(dá)系統(tǒng)較為常用[37]，其它的適合基因表達(dá)的啟動子也能在哺乳動物細(xì)胞中使用。這些啟動子包括來自病毒的啟動子，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿病毒40(SV40)；或者哺乳動物細(xì)胞中的啟動子，如人延伸因子1α啟動子[38，39]。免疫球蛋白的啟動子可被用于類似NS0細(xì)胞的淋巴細(xì)胞。實(shí)施例2敘述了如何設(shè)計(jì)構(gòu)建含有Ig啟動子、前導(dǎo)信號肽、前導(dǎo)內(nèi)含子、剪切位點(diǎn)、內(nèi)含子序列和適用于接入任何可變插入?yún)^(qū)域限制性酶切位點(diǎn)的載體。通過ELISA和生物活度測定方法，在NS0細(xì)胞中可以方便地篩選出表達(dá)的去免疫化抗體。重組蛋白在哺乳動物細(xì)胞中高水平的表達(dá)可以通過擴(kuò)增轉(zhuǎn)染的DNA進(jìn)而篩選出穩(wěn)定細(xì)胞株來獲得。重組基因可以在DNA擴(kuò)增過程中與篩選標(biāo)記物一起擴(kuò)增，因而CHOdhfr-細(xì)胞和可擴(kuò)增的篩選標(biāo)記二氫葉酸還原酶基因(DHFR)可以用來建立穩(wěn)定細(xì)胞系，來生產(chǎn)大量可用于臨床的表達(dá)產(chǎn)物[40]。同樣，谷氨酸合成酶(GS)基因也可以用來作為篩選標(biāo)記物。由于內(nèi)源性GS在骨髓瘤和雜交瘤細(xì)胞系中沒有足夠的活性，這些細(xì)胞系需要谷氨酸才能存活。轉(zhuǎn)入細(xì)胞的GS基因能夠使得細(xì)胞在缺少谷氨酸的培養(yǎng)基中正常生長。較為適合的是，CHOdfhr-細(xì)胞可以表達(dá)B4去免疫化抗體，并且dhfr又可以作為篩選和擴(kuò)增的標(biāo)記物。實(shí)施例5描述了如何在CHOdhfr-細(xì)胞中構(gòu)建表達(dá)抗體以及DHFR的質(zhì)粒。逐步增加氨甲葉酸(MTX)的濃度，可以增強(qiáng)DHFR和抗體基因的擴(kuò)增，表達(dá)出大量的去免疫化的B4抗體[42]。逐步提高培養(yǎng)基中氨甲葉酸的含量，經(jīng)過幾輪的篩選，可以使得重組CHO細(xì)胞(rCHO)產(chǎn)生特異性抗體的產(chǎn)率達(dá)到10-30pg/細(xì)胞/天。盡管去免疫化抗體在哺乳動物細(xì)胞，如NS0或CHO細(xì)胞，可以有效的表達(dá)，但是為了降低大規(guī)模生產(chǎn)的成本，也可以使用轉(zhuǎn)基因植物。見實(shí)施例10。所有的抗體均屬于糖蛋白。IgG1在CH2區(qū)域中含有N端結(jié)合糖的雙觸角復(fù)合物[43]。這種糖類物質(zhì)的存在對于作用因子行使功能具有重要作用，比如參與補(bǔ)體結(jié)合，以及可以消滅靶細(xì)胞的抗原依賴性的細(xì)胞毒素降解(ADCC)過程[44]。B4抗體靶向作用于CD4受體復(fù)合物，可以破壞CD4+細(xì)胞并且通過結(jié)合補(bǔ)體的IgG1因子的作用免疫抑制CD4+細(xì)胞的功能。因此，N端去糖基化的去免疫B4單克隆抗體與N端糖基化的IgG1抗體相比，對于CD4+細(xì)胞的破壞較少，產(chǎn)生較少的免疫毒副作用。通過突變?nèi)コ齀gG1Fc區(qū)域的N端糖基化位點(diǎn)，可以破壞IgG1與人FcR1的結(jié)合，從而活化補(bǔ)體結(jié)合C1q[45]。主要有兩種去糖基化的途徑用衣酶素處理生產(chǎn)抗體的細(xì)胞，使得糖基前體無法與天冬氨酸結(jié)合；或者通過突變使得297位的天冬酰胺變?yōu)槠渌陌被?。目前去免疫化抗體都是經(jīng)過去除297位的天冬酰胺這一N端結(jié)合的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行修飾的。通過定點(diǎn)突變PCR技術(shù)使得重鏈表達(dá)載體上編碼297位天冬酰胺的密碼子AAC變?yōu)榫幋a組氨酸的密碼子CAC；然后N端去糖基化的去免疫化抗體就能在CHO細(xì)胞中表達(dá)分泌。(圖16)作為用于人的治療性藥物，去免疫化的單克隆抗體功能性與安全性特征往往需要慎重考慮。在文章中，我們估計(jì)這些抗體在體外具有以下的功能(1)中和抑制HIV-1病毒；(2)結(jié)合補(bǔ)體；(3)刺激人淋巴細(xì)胞誘發(fā)免疫應(yīng)答。來自CHO克隆的去免疫化單克隆抗體對于HIV-1的中和活力與通過MT-2微斑法檢測鼠源mAbB4配對物的活性相當(dāng)[36]。在表3中列出的相關(guān)研究的結(jié)果表明由21號克隆表達(dá)的去免疫化抗體DH1DK1CHO#21具有與B4雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的鼠源抗體相當(dāng)?shù)闹泻突盍?。很顯然，這些單克隆抗體必須能夠?qū)τ趤碜訦IV-1五個(gè)進(jìn)化分枝(A-E)的典型病毒有50％的中和能力。與鼠源B4抗體相比，去糖基化的去免疫化抗體DH1DK1CHO#7對于來自分枝B的病毒23135，來自分枝D的病毒UG046以及來自分枝E的病毒TH036表現(xiàn)出增強(qiáng)的中和抑制能力(表3)。使用補(bǔ)體消耗方法來評測去免疫化抗體對于它的原始配對物鼠源mAbB4的補(bǔ)體的結(jié)合能力(實(shí)施例7)。結(jié)果表明去免疫化的B4體的補(bǔ)體結(jié)合能力會降低[圖17]。去免疫化抗體參與的反應(yīng)混合物的上層中存在著比用鼠源單抗反應(yīng)更多的補(bǔ)體。這一結(jié)果表明，去免疫化抗體同人CD4+細(xì)胞上的CD4復(fù)合物結(jié)合并啟動補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的能力要低于原始鼠源抗體結(jié)合誘發(fā)補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的能力。所以使用鼠源B4抗體反應(yīng)的混合物上清中含有較少的補(bǔ)體去裂解激活的SRBC。這樣的結(jié)果意味著在降低補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)方面，去免疫化抗體DH1DK1CHO#7和DH1DK1CHO#16比鼠源mAbB4抗體更加安全；同時(shí)，與預(yù)期中的一樣，N端去糖基化的去免疫化抗體有著最低的補(bǔ)體結(jié)合能力。作為用于人的治療性藥物，鼠源單克隆抗體的免疫原性會使人體產(chǎn)生T細(xì)胞和B細(xì)胞反應(yīng)直接對抗治療性抗體。誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)可能會導(dǎo)致細(xì)胞分裂素的產(chǎn)生，從而調(diào)整人的免疫應(yīng)答機(jī)制，對抗特定的感染源或腫瘤。由于鼠源抗體誘發(fā)的細(xì)胞分裂素造成的對機(jī)體的影響，可能會破壞機(jī)體的自身平衡性，干擾免疫應(yīng)答機(jī)制對抗侵入的病原體或腫瘤。誘導(dǎo)的B細(xì)胞反應(yīng)可能會在人體中形成人抗鼠的抗體。這將會導(dǎo)致形成抗原-抗體免疫復(fù)合物，并在人體其它組織中沉積，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)和/或病發(fā)條件。此外，這些人抗鼠的抗體會結(jié)合治療藥物，降低藥物的有效濃度，從而阻止治療藥物到達(dá)目標(biāo)靶點(diǎn)，如CD4+細(xì)胞?？紤]到上述情況，我們在體外，使用人的外周血液單核細(xì)胞(PBMC)的培養(yǎng)體系，檢測了去免疫單克隆抗體和mAbB4抗體的免疫原性(見實(shí)施例8)。表4顯示了研究結(jié)果。發(fā)現(xiàn)純化的鼠源B4抗體可以刺激人的PBMC產(chǎn)生IL-10和TNF-α；而通常會由抗原激活的Th1CD4分泌的IFN-γ和IL-2以及由Th2CD4細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞分裂素IL-4并沒有被檢測到。相反，由于去免疫化抗體DH1DK1CHO#16以及去糖基化抗體DH1DK1CHO#7沒有誘導(dǎo)人PBMC分泌檢測到的5種細(xì)胞分裂素中的任何一種，因此認(rèn)為它們不具有免疫原性。這一發(fā)現(xiàn)提高了去免疫化抗體作為治療性藥物的安全系數(shù)。已經(jīng)建立好了便于調(diào)控而且較為經(jīng)濟(jì)的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基。如果在細(xì)胞培養(yǎng)中使用動物血清，容易引入外來的抗原，如病毒和其它可以遺傳的物質(zhì)(如瘋牛病病原體)[47]。除此之外，在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的過程中使用動物血清作為原材料花費(fèi)較大?？傊?，由于哺乳動物細(xì)胞會將產(chǎn)生的具有生物治療活性的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中，使用無血清的培養(yǎng)基能夠顯著地簡化之后蛋白的純化過程。由于rCHO具有依賴血清生長的特性，所以需要能夠獲得適于大規(guī)模、無血清、懸浮培養(yǎng)工藝流程的合適的細(xì)胞系表型。實(shí)施例6描述了如何成功地獲得適于懸浮培養(yǎng)，并且在無血清培養(yǎng)基中可以表達(dá)抗體的rCHO克隆，其去免疫化抗體的產(chǎn)率與在含有10％胎牛血清中培養(yǎng)的單層細(xì)胞的產(chǎn)率相當(dāng)。無血清懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生的抗體對于HIV-1的中和反應(yīng)的活力與在10％血清中培養(yǎng)的單層細(xì)胞產(chǎn)生的抗體中和反應(yīng)活力相當(dāng)。綜上所述，這些結(jié)果有力地證明使用去免疫化抗體作為治療性藥物的功效與安全性，它可以減少HIV感染患者體內(nèi)的病毒數(shù)，防止接觸后的感染。用藥方法很普通，并且已有文獻(xiàn)出版。對于抗體的使用，包括但不局限于注射用藥，或直接注射在效應(yīng)處。其中注射用藥也不僅局限于靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射和皮下注射。本發(fā)明包括以上描述的去免疫化抗體的研發(fā)過程、合適的腸胃外用藥方法。用藥方法包括但不局限于藥用無菌等滲溶劑用藥形式。這些溶劑包括用于靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射或直接注射到關(guān)節(jié)及其它部位的鹽溶液和磷酸鹽溶液。本發(fā)明提供的去免疫化抗體用于哺乳動物，特別是人的時(shí)候，抗體劑量因哺乳動物的年齡、體重、身高、性別、整體健康情況、用藥史等因素的不同而有差別?？傮w上說，提供的去免疫化抗體的劑量根據(jù)哺乳動物體重，往往在1mg/kg到20mg/kg范圍內(nèi)，高于或低于這一范圍的劑量需要根據(jù)情況而定。一般，抗體要求靜脈注射(IV)或者肌肉注射(IM)。去免疫化抗體在用于患者時(shí)，需要有一種適合靜脈注射、皮下注射或肌肉注射的用藥形式。這些用藥形式要包括合適的藥物載體，要求無毒無治療作用。這些藥物載體包括離子交換物、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、緩沖溶液物質(zhì)(如磷酸鹽)、氨基乙酸、甘露醇、山梨酸、鹽酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹽類或電解質(zhì)類(如硫酸精蛋白、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、磷酸-氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鈉二水合物、氫氧化鈉、鋅鹽、硅膠、三硅酸鎂)、聚乙烯吡咯烷酮、以纖維素為基礎(chǔ)的物質(zhì)和聚乙二醇。去免疫化抗體在溶劑中的濃度一般在0.1mg/ml到100mg/ml。用藥配方和藥劑配制方法已有記載，見《雷明頓藥物科學(xué)》[51]。最初使用去免疫化抗體時(shí)選擇的劑量一般在1到100mg/kg，優(yōu)選劑量為1到25mg/kg，進(jìn)一步優(yōu)選劑量為1到10mg/kg，最適劑量為2到5mg/kg；可以一次性或分開用藥，也可以持續(xù)用藥。對于若干天或較長時(shí)間的重復(fù)用藥，依據(jù)具體情況，應(yīng)該持續(xù)治療，直到病癥開始受到抑制或者患者情況開始好轉(zhuǎn)。每次間斷性用藥往往從每周一次到六個(gè)月一次不等。最佳用藥劑量、最適治療方案以及用藥頻率均有詳細(xì)文字記錄。同樣，其它去免疫化抗體的劑量均在本發(fā)明包括的范圍內(nèi)，不用再經(jīng)過額外的實(shí)驗(yàn)測定了。在以下的實(shí)施例中，描述了本發(fā)明以及它的使用情況。這些實(shí)施例僅供說明，本發(fā)明的范圍不僅僅局限于此。實(shí)施例1鼠源mAbB4抗體基因的克隆與鑒定1.總RNA的準(zhǔn)備根據(jù)使用手冊，使用Promga(MAIDSon，WT)SV40總RNA分離系統(tǒng)(Cat.No.Z3100)從5×106個(gè)B4雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA。2.編碼小鼠重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(Vκ)的cDNA的擴(kuò)增根據(jù)使用于冊，使用GeneAmpRNAPCRKit(PerkinElmer，Norwalk，CT，partno.N808-0017)，合成編碼VH和Vκ的單鏈cDNA并擴(kuò)增該cDNA。這里對這一過程作簡要描述。使用MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，以16個(gè)寡聚dT作為引物，從1μg的總RNA中合成編碼小鼠重輕鏈的單鏈cDNA。反應(yīng)體系在42℃放置15分鐘，在99℃放置5分鐘，然后在5℃放置5分鐘。使用AmpliTaqDNA聚合酶，以“Themouse-specificIgPrimerSets”(Novagen，MAIDSon，WI，cat.no.69831-1)作為擴(kuò)增引物，擴(kuò)增VH和Vκ的單鏈cDNA。反應(yīng)體系首先95℃加熱1分45秒，然后95℃變性15秒，60℃退火30秒，35個(gè)反應(yīng)循環(huán)，最后72℃保溫10分鐘。擴(kuò)增的cDNA經(jīng)過凝膠純化，克隆進(jìn)pGmTEasy載體(Promega，cat.no.A1360)。根據(jù)插入片段的大小，通過PCR篩選出VH和Vκ克隆。使用雙脫氧鏈終止法對帶有預(yù)期大小的DNA插入片段的VH和Vκ克隆進(jìn)行測序?；パa(bǔ)決定區(qū)(CDRs)的位置通過參考其它抗體序列來決定[32]。B4的VH和Vκ能夠分別結(jié)合在小鼠重鏈V(B)亞群和小鼠kappa鏈III亞群[32]。圖1和2分別列出VH和VκCDRs的DNA和氨基酸序列。實(shí)施例2B4拼接型抗體基因的構(gòu)建以及在NS0細(xì)胞中的表達(dá)1.拼接抗體基因的構(gòu)建B4拼接型抗體由鼠-人抗體鏈組成，是通過把鼠源mAbB4抗體的可變區(qū)基因與人的免疫球蛋白恒定區(qū)基因相結(jié)合，結(jié)合方式類似于Morrison等描述的方式[19]。在這種結(jié)合方式中，小鼠的全部的可變區(qū)與人的抗體的恒定區(qū)連接在一起。這種含有相同人源恒定區(qū)的拼接抗體，為檢測帶有去免疫化可變區(qū)的B4抗體，提供了一個(gè)有用的未去免疫化的對照。為了構(gòu)建拼接的B4抗體，使用VH-PCR1和VK-PCR1[20]載體作為模板，在鼠源的VH和Vκ周圍，引入了5’端序列、前導(dǎo)信號肽、前導(dǎo)內(nèi)含子和鼠源免疫球蛋白啟動子、含有剪切位點(diǎn)和內(nèi)含子序列在內(nèi)的3’端序列。#7克隆中，297位的天冬酰胺被突變?yōu)榻M氨酸。在#7、#16和#21克隆中，κ鏈98位氨基酸的密碼子偶然地由GAT變?yōu)镚AC。但是這兩個(gè)密碼子都編碼天冬氨酸，所以在表達(dá)成抗體的時(shí)候沒有區(qū)別。產(chǎn)生的鼠源HV和VJ表達(dá)結(jié)構(gòu)被克隆入pUC19中，并且DNA全長序列得到了確認(rèn)。使用HindIII和BamHI從pUC19中切下鼠源VH和VL表達(dá)結(jié)構(gòu)片段，然后克隆入分別含有人的IgG1[48]和κ恒定區(qū)[49]的表達(dá)載體pSVgpt和pSVhyg[20](圖3和4)中，同時(shí)載體中還含有哺乳動物細(xì)胞篩選表記。通過測序證實(shí)VH和Vκ正確插入了pSV表達(dá)載體。2.表達(dá)B4拼接載體的宿主細(xì)胞系用于抗體表達(dá)的NS0宿主細(xì)胞系是不產(chǎn)生免疫球蛋白的小鼠骨髓瘤細(xì)胞，它來自于歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)庫(EuropeanCollectionofAnimalCellCultures，PortonUK(ECACCNo.85110505))。通過電轉(zhuǎn)方法將拼接的重鏈和輕鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)入NS0細(xì)胞。在含有10％胎牛血清、0.8μg/ml霉酚酸和250μg/ml黃嘌呤的DMEM培養(yǎng)基中篩選出可以表達(dá)gpt基因的克隆。3.通過人IgGELISA方法檢測抗體的表達(dá)通過ELISA方法檢測人IgG的產(chǎn)量。方法如下在pH9.6的碳酸鹽/碳酸氫鹽包埋緩沖液(Sigma，cat.no.C3041)中，用羊抗人κ的抗體包埋ELISA微孔平板，37℃包埋1小時(shí)。然后用PBST(0.05％Tween20溶于PBS)洗平板三次。這樣就能在平板上形成可以從培養(yǎng)基中捕獲κ鏈的固相免疫吸收劑。用轉(zhuǎn)染克隆的一定條件下的細(xì)胞培養(yǎng)基在37℃下孵育包埋后的平板微孔1小時(shí)，吸干，用PBST洗三次。以過氧化物酶共軛的羊抗人IgGγ鏈特異性抗體(TheBindingSite，cat.no.AP004)作為二抗，O型苯二胺底物(OPD)(Sigma，cat.no.P7288)作為顯色物質(zhì)，篩選出能夠分泌人抗體的細(xì)胞系并進(jìn)行了擴(kuò)增。4.拼接抗體的生產(chǎn)能夠分泌最高水平拼接抗體的轉(zhuǎn)染子NS0被篩選并擴(kuò)增。通過ProSepA親和層析(MilliporeCat.No.113112722)從500ml到1000ml的靜態(tài)培養(yǎng)基中純化抗體。用pH3.0的0.1M甘氨酸溶液洗脫抗體，調(diào)至中性，透析換成用PBS緩沖液。純化的抗體粗制品進(jìn)行過濾滅菌，儲藏在4℃。通過IgGELISA方法測定抗體濃度，以0.1、1、5、10ng的人IgG1作為標(biāo)準(zhǔn)參照(TheBindingSite，cat.no.BP078)。5.相對于鼠源抗體的拼接抗體與rsCD4的相對親和力通過ELISA方法測定拼接抗體與重組可溶性CD4(rsCD4)的相對親和力。ELISA平板直接用含有0.25μg/ml的rsCD4(AmericanBiotechnologies，ColumbiaMD)的碳酸鹽緩沖液(0.1M，pH9.5)包埋，然后用PBS(含3％BSA，0.05％Tween20)溶液封閉平板。以小鼠抗體作為陽性對照，將拼接抗體稀釋成不同的濃度，以過氧化物酶共軛的山羊抗人IgG和綿羊抗鼠的抗體分別來檢測拼接抗體和小鼠抗體，用OPD進(jìn)行顯色。拼接抗體和小鼠抗體在加入固相rsCD4后，在各種抗體濃度下都能檢測到A492的增加。這個(gè)測試證實(shí)了經(jīng)過克隆和測序的重鏈和輕鏈可變區(qū)仍然保持正確的識別位點(diǎn)。相對于原始小鼠抗體的A492，拼接抗體的A492顯示出10倍的下降。實(shí)施例3去免疫可變區(qū)序列的設(shè)計(jì)和構(gòu)建6.去免疫V序列的設(shè)計(jì)把小鼠B4VH和Vκ抗體氨基酸序列與人種系的VH[33]和Vκ[34]以及J區(qū)域序列[49]進(jìn)行對比。與小鼠B4VH和Vκ序列具有最高同源性的人種系的VH、Vκ以及J區(qū)域序列被挑選出來，用來作為參照序列。在確定了作為參照的人的框架序列后，在B4VH和Vκ框架序列中存在的某些暴露在表面的與參照序列不同的氨基酸殘基會被改造為與參照序列相一致的氨基酸[24]。對于抗體的結(jié)構(gòu)與結(jié)合至關(guān)重要的殘基在這一過程中保持不變。例如，N端的鼠源殘基因與最終抗體上的CDR很接近而得以保留。通過一過程得到的序列非常類似于一個(gè)鑲嵌型抗體，抗體的表面主要為人源殘基而包裹在里面的殘基通常是原始小鼠的序列殘基。把這些序列進(jìn)行insilico的多肽線化處理，通過分析它們與人的18種不同的MHCII型同種異型抗免疫球蛋白的結(jié)合情況來鑒別潛在的T細(xì)胞抗原決定簇[25]。初級去免疫化的VH和Vκ氨基酸和cDNA序列已經(jīng)被定義(B4DIVHv.1，圖5和7；B4DIVkv.1，圖6和8)。由于產(chǎn)生初級去免疫化的序列需要少量氨基酸替代物，這些替代物可能會影響去免疫分子的結(jié)合作用，所以設(shè)計(jì)了其它3種不同的VHs(B4DIVHv.2，B4DIVHv3.，B4DIVHv4.，圖5和圖7)以及2種不同的Vκs(B4DIVkv.2，B4DIVkv.3，圖6和圖8)。7.去免疫化抗體序列的構(gòu)建通過定點(diǎn)突變PCR的方法構(gòu)建出與以上設(shè)計(jì)相一致的去免疫化可變區(qū)(QuikChangeTMSite-DirectedMutagenesisKit，Stratagene，cat.no.200518)?？寺〉氖笤碫H和Vκ基因被用來作為模板來產(chǎn)生序列框架的突變進(jìn)而得到去免疫化序列。合成的突變引物對包含要被突變的區(qū)域。產(chǎn)生的去免疫化的V區(qū)域被克隆到pUC19載體中，對于去免疫化的VH和Vκ，它們的全DNA序列被確認(rèn)正確。去免疫化的重鏈和輕鏈的V區(qū)域基因片段利用HindIII和BamHI限制性內(nèi)切酶從pUC19上切下來，然后轉(zhuǎn)入表達(dá)載體psvSVgpt和pSVhyg中(圖3和4)。表達(dá)載體中的去免疫化VH和Vκ的全DNA序列被確認(rèn)正確。實(shí)施例4NS0細(xì)胞表達(dá)的去免疫化抗體的特征8.去免疫化抗體的表達(dá)用于抗體表達(dá)的NS0宿主細(xì)胞系是不產(chǎn)生免疫球蛋白的小鼠骨髓瘤細(xì)胞，它來自于歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)庫(EuropeanCollectionofAnimalCellCultures，PortonUK(No.85110505))。去免疫化的重鏈和輕鏈表達(dá)載體以多種組合(12種組合)電轉(zhuǎn)化共轉(zhuǎn)入NS0細(xì)胞。在含有10％胎牛血清、0.8μg/ml霉酚酸和250μg/ml黃嘌呤的DMEM培養(yǎng)基中篩選出可以表達(dá)gpt基因的克隆。由轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆產(chǎn)生的人IgG可以通過ELISA來檢測。分泌抗體的細(xì)胞系被篩選并擴(kuò)增。9.B4去免疫化抗體的生產(chǎn)表達(dá)B4去免疫化抗體的NS0轉(zhuǎn)染細(xì)胞得到擴(kuò)增后，篩選出具有最好產(chǎn)率的細(xì)胞系。通過ProSepA(Millipore，cat.no.113112722)親和層析從500ml到1000ml的靜態(tài)培養(yǎng)基中純化抗體。用pH3.0的0.1M甘氨酸溶液洗脫抗體，中和后用PBS透析。純化的抗體要求過濾滅菌并儲藏在4℃。通過ELISA方法，測定抗體濃度。10.B4去免疫化抗體結(jié)合rsCD4的親和力圖9-11表示的是四個(gè)B4去免疫重鏈與三個(gè)去免疫輕鏈結(jié)合情況測定的結(jié)果?？贵w去免疫化重鏈1與去免疫化輕鏈1、2或3組合與rsCD4的結(jié)合能力與拼接抗體相同。但重鏈2、3、4與輕鏈1或2組合后與rsCD4結(jié)合能力要比拼接抗體低3倍。重鏈2、3或4與輕鏈3組合后與rsCD4的結(jié)合能力要下降5倍。11.病毒中和測試病毒儲液A亞型患者分離物UG/92/029，來自于世界衛(wèi)生組織HIV分離和定性網(wǎng)絡(luò)組織。C亞型患者分離物ZIM748是由斯坦福大學(xué)D.Katzenstein贈送的。D亞型患者分離物UG266，ESI亞型患者分離物TH32036由美國軍方HIV研究項(xiàng)目提供(SilverSpring，MD)。E亞型患者分離物TH32036同樣是由J.Bradac，NIAID(NIH，Bethesda，MD).贈送的?；颊叻蛛x物在PBMC中傳代。T細(xì)胞系適應(yīng)的HIV-1分離物MN除了個(gè)樣品在PBMC中擴(kuò)增外，其余樣品在H9細(xì)胞中繁殖。在NS0細(xì)胞中產(chǎn)生的B4去免疫化IgG對于病毒中和活性的測試。一般使用MT-2微斑法[36]來檢測，但是熱失活血清要連續(xù)稀釋在50％高葡萄糖，含15％FBS及抗生素的DMEM，以及含2％的谷氨酰胺碳酸氫鹽緩沖液，50％的正常人去纖維蛋白血漿中。依靠分裂素刺激的PBMC的中和反應(yīng)方法本質(zhì)上還是針對HIV的[50]。NS0細(xì)胞產(chǎn)生的B4IgG1去免疫化抗體的中和活力定義為與不含抗體的參照相比能夠使微斑數(shù)目降低50％的抗體濃度?？贵w達(dá)到50％終點(diǎn)濃度是由不同抗體稀釋濃度之間相互補(bǔ)充得到的。比較四條重鏈類型(VHv.1-4)，全部都與去免疫化κ鏈1(VKv.1)結(jié)合，這表明具有重鏈1的抗體擁有對于所有HIV-1原代分離物較高的中和活力，并且這種活力接近鼠源mAbB4抗體對于HIV-1VL135，HIV-1UG029和HIV-1TH036病毒的中和活力(表1)。去免疫化的B4抗體無法抑制T細(xì)胞系適應(yīng)的HIV-1MN病毒。包含κ2或3的去免疫化抗體具有相同或稍低的中和活力(表2)。12種不同類型之間的比較發(fā)現(xiàn)含有DIVHv.1和DIVKv.1鏈的抗體具有較高的抗所有HIV-1原始分離物的中和活力，活力與鼠源mAbB4抗體接近。實(shí)施例5建立穩(wěn)定高表達(dá)去免疫化B4抗體的CHO克隆B4DIVHv.1和B4DIVKv.1分別用于在CHO細(xì)胞中表達(dá)重鏈和輕鏈。12.細(xì)胞系用于生產(chǎn)表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞系是二氫葉酸還原酶缺陷型(CHOdfhr-)的中國倉鼠卵巢細(xì)胞，它來自于臺灣食品工藝研究與開發(fā)研究所的細(xì)胞保藏與研究中心(CCRC，60133)。細(xì)胞需要培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(DFCS，Gibcocatno.26400-044)、次黃嘌呤和胸腺嘧啶(Gibco，catno.11067-030)的IsocovesModifiedDulbecco’sMedium(IMDM，Sigmacat.no.I-3390)培養(yǎng)基中。DHFR標(biāo)記物是用來擴(kuò)增和篩選的。dhfr基因的表達(dá)能夠在二氫葉酸還原酶抑制劑methorexate(MTX)作用下擴(kuò)增。當(dāng)dhfr基因擴(kuò)增時(shí)，其他相鄰的基因也能夠同時(shí)被擴(kuò)增，這樣在每一輪擴(kuò)增后，細(xì)胞被亞克隆，進(jìn)而就能篩選出具有產(chǎn)率不斷增長的克隆。13.質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)DHFR基因的質(zhì)粒使用GeneAmpRNAPCRKit(PerkinElmerpartno.N808-0017)從NS0細(xì)胞總RNA中合成dhfr基因的cDNA。這一基因片段被插入到哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體pSI(Promega，cat.no.E172A)SV40增強(qiáng)子和前啟動子下游，SV40終止子上游的EcoR1位點(diǎn)，用于高水平持續(xù)性表達(dá)(圖12)。表達(dá)B4DIVHv.1重鏈的質(zhì)粒編碼拼接B4重鏈的DNA片段是以pSVgptB4拼接IgG作為模板通過PCR擴(kuò)增得到的。拼接的IgG基因插入到哺乳動物表達(dá)載體pcDNA3.1Neo(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat.no.V790-20)的HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)之間。該插入位置位于CMV增強(qiáng)子和用于高表達(dá)早期啟動子的下游，多聚腺嘌呤信號和用于增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性的牛生長激素(BGH)的終止序列之前。通過HindIII和BamHI位點(diǎn)的拼接，它的可變區(qū)序列被B4DIVHv.1可變區(qū)序列代替，從而得到了表達(dá)B4DIVHv.1重鏈的質(zhì)粒(pCDNA3.1(+)NeoDeIgG1-S，圖13)。表達(dá)去糖基化的B4DIVHv.1重鏈的質(zhì)粒通過突變方法去除IgG1Fc區(qū)域中的N-糖基化位點(diǎn)，可以破壞IgG1結(jié)合人FcγR1的能力，從而激活補(bǔ)體反應(yīng)，結(jié)合C1q[43]。所以去糖基化的去免疫mAbB4抗體比起糖基化抗體，可以較少的破壞CD4+細(xì)胞，具有較小的免疫毒性。為了去除N糖基化位點(diǎn)，用于編碼DIVHv.1重鏈的第297位天冬酰胺密碼子AAC通過定點(diǎn)突變PCR方法(Invitrogen)突變?yōu)榫幋a組氨酸的CAC。表達(dá)B4DIVkv.1輕鏈的質(zhì)粒B4DIVK.1全部輕鏈?zhǔn)峭ㄟ^PCR擴(kuò)增方法由DIVKv.1可變區(qū)和人κ鏈恒定區(qū)組裝成的。以pUC19-B4DIVKv.1為模板拷貝DIVKv.1區(qū)，以來自pSVhygHuCK的B4拼接抗體κ鏈(Vκ)為模板拷貝人κ鏈恒定區(qū)。完整的B4DIVK.1輕鏈DNA片段插入pCDNA3.1zeo(Invitrogen，cat.no.V860-20)的HindIII和EcoR1位點(diǎn)。插入位點(diǎn)位于CMV增強(qiáng)子和用于高表達(dá)前啟動子的下游，多聚腺嘌呤信號和來自BGH用于增加mRNA穩(wěn)定性的終止序列上游(圖14)。共表達(dá)DHFR和B4DIVkv.1輕鏈的質(zhì)粒在κ鏈表達(dá)單元前插入dhfr基因表達(dá)單元構(gòu)建包含DHFR和B4DIVkv.1輕鏈表達(dá)單元的質(zhì)粒。dhfr基因表達(dá)單元是通過PCR方法以pSI-DHFR為模板得到的，然后將其克隆到pcDNA3.1zeoB4DIVkv.1質(zhì)粒的BglII位點(diǎn)(圖15)。14.在CHOdhfr-細(xì)胞中表達(dá)抗體B4DIVHv.1-DIVKv.1pcDNA3.1zeoB4DIVHv.1和pcDNA3.1zeoB4DIVkv.1/DHFR通過電轉(zhuǎn)化共轉(zhuǎn)入CHOdhfr-細(xì)胞中。然后在含有10％DFCS、geneticin(Gibco，cat.no.10131-027)和0.005μMMTX(Sigma，St.Louis，MO，catno.M8047)、不含HT添加物的的IMDM培養(yǎng)基中篩選克隆?？梢员磉_(dá)DHFR和重鏈的細(xì)胞將會在這種選擇性培養(yǎng)基中正常生長。通過ELISA方法測定人IgG的產(chǎn)量。篩選并擴(kuò)增分泌抗體的細(xì)胞系。15.通過MTX介導(dǎo)的DFHR基因擴(kuò)增建立高表達(dá)去免疫化B4抗體的克隆通過逐步提高M(jìn)TX濃度[42]，不斷增加去免疫化mAbB4抗體的產(chǎn)量，擴(kuò)增DFHR和IgG?？寺〖?xì)胞置于從0.005-5μM連續(xù)增加的MTX濃度下3到4周。在每次細(xì)胞擴(kuò)增間隙，篩選出IgG產(chǎn)率增加的亞克隆。16.通過單細(xì)胞克隆建立穩(wěn)定高表達(dá)去免疫化B4抗體的細(xì)胞系通過限制稀釋度，建立最高效表達(dá)抗體的亞克隆系。亞克隆在0.1，0.5和0.25cells/200μl選擇性培養(yǎng)基中重新懸浮培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入96孔板。在篩選前需要在選擇型培養(yǎng)基中培養(yǎng)3到4周。然后從每個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基中取出10μl用ELISA方法測定IgG的表達(dá)情況。高產(chǎn)率的細(xì)胞克隆通過篩選擴(kuò)增后凍存。通過這些擴(kuò)增步驟，IgG最高產(chǎn)率可以達(dá)到10-20ng/細(xì)胞/天。產(chǎn)率從最初的0.1ng/細(xì)胞/天，最后增加了100-200倍。17.在CHO細(xì)胞中生產(chǎn)N-糖基化和N-去糖基化抗體用野生型重鏈以及297位天冬酰胺突變?yōu)榻M氨酸的重鏈質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，并擴(kuò)增。通過ProSepA親和層析(Milliporecat.no.113112722)方法從500ml到1000ml的培養(yǎng)基中純化抗體，用0.1MpH3.0甘氨酸溶液中洗脫，中和后透析到PBS溶液中。純化得到的抗體經(jīng)過過濾滅菌，儲藏在4℃。通過ELISA方法測定抗體濃度。18.通過聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE檢測N-去糖基化具有297位天冬酰胺的重鏈和第297位天冬酰胺突變?yōu)榻M氨酸的N-糖基化和或N-去糖基化的兩種純化的抗體以10％的SDS-PAGE分析，用考馬斯亮蘭和糖蛋白染色劑染色(GelCodeGlycoproteinStain，cat.no.24562，Pierce，RockfordIllinois)。與糖基化的去免疫化抗體相比，297位天冬酰胺突變?yōu)榻M氨酸的糖蛋白在電泳膠上具有較快的遷移率和較弱的糖蛋白染色。用N-糖基化酶F處理蛋白后，并沒有改變突變抗體的凝膠遷移率和染色程度，但增加了野生型N-糖基化抗體的凝膠遷移率，同時(shí)降低了它的染色程度。在使用N-糖基化酶F處理后，野生型和突變型抗體具有相同的凝膠遷移率(圖16A)和糖原蛋白染色深淺度(圖16B)，從而證明了突變抗體成功的發(fā)生了去糖基化。19.CHO細(xì)胞產(chǎn)生的B4去免疫化IgG抗體病毒的中和活力上文已經(jīng)描述了所使用的MT-2微斑法。CHO細(xì)胞產(chǎn)生的B4IgG1去免疫化抗體的中和活力定義為與不含抗體的參照相比能夠使微斑數(shù)目降低50％的抗體濃度(表3)?？贵w達(dá)到50％終點(diǎn)濃度是由不同抗體稀釋濃度之間相互補(bǔ)充得到的。實(shí)施例6B4去免疫化抗體CHO細(xì)胞克隆對于無血清懸浮培養(yǎng)條件的適應(yīng)20.懸浮培養(yǎng)的適應(yīng)將用75T培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的B4CHO細(xì)胞用胰酶消化后一起轉(zhuǎn)入裝有50ml含有10％胎牛血清(DFCS，Gibcocat.no.26400-044)的IsocovesModifiedDulbeccos’Medium培養(yǎng)基(IMDM，Sigmacat.no.I-3390)的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中重新懸浮。懸浮培養(yǎng)的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶放在可以旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)的CO2培養(yǎng)箱中，溫度和濕度條件與單層細(xì)胞培養(yǎng)相同。每隔2到3天，檢測懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的密度，用新的培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋到1-3×105個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)基濃度。在最初的幾周內(nèi)，要密切注意細(xì)胞的生長速率和培養(yǎng)基的混濁程度。21.對于無血清培養(yǎng)基的適應(yīng)一旦懸浮培養(yǎng)的生長情況穩(wěn)定，就將培養(yǎng)基離心后把細(xì)胞重懸于無血清培養(yǎng)基(SFMII，GibcoBRL，Rockville，MD，cat.no.31033-020)中。每隔2到3天，檢測培養(yǎng)細(xì)胞濃度，并及時(shí)用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋，濃度調(diào)整到1-3×105個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)基。在最初的幾周內(nèi)，要密切注意細(xì)胞的生長速率和培養(yǎng)基的混濁程度。22.在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)的去免疫化抗體B4的生產(chǎn)適合無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的去免疫化B4細(xì)胞克隆開始在含有GibcoSFMII培養(yǎng)基的100ml旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶(Bellco)中以2×105的細(xì)胞密度培養(yǎng)。培養(yǎng)采用逐級放大，每當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到6×105cell/ml時(shí)轉(zhuǎn)移，先轉(zhuǎn)移到250ml的培養(yǎng)瓶，再轉(zhuǎn)移到500ml的培養(yǎng)瓶。通過ProSepA親和層析(Milliporecat.no.113112722)方法從500ml的無血清懸浮培養(yǎng)基中純化抗體，用0.1MpH3.0甘氨酸緩沖液洗脫抗體，調(diào)至中性，透析換成PBS緩沖液。純化得到的抗體粗制品經(jīng)過過濾滅菌，儲藏在4℃。通過ELISA方法測定抗體濃度。實(shí)施例7rCHO克隆表達(dá)的去免疫化B4抗體補(bǔ)體結(jié)合作用的分析使用補(bǔ)體消耗方法來評測去免疫化抗體對于它去免疫化類似物B4的補(bǔ)體結(jié)合能力。這一方法使得每個(gè)B4單克隆抗體結(jié)合到新培養(yǎng)的人CD4+細(xì)胞表面CD4復(fù)合物的位置。然后使得抗體部分結(jié)合定量的兔子補(bǔ)體。在反應(yīng)中剩下的補(bǔ)體會對抗激活的綿羊血紅細(xì)胞。這里使用的人CD4+細(xì)胞是從靜脈抽取正常血液中經(jīng)過肝素化后分離得到的。全部血液與無血清RPMI-1640(Gibco，catno.21870-076)1∶1(v/v)稀釋。然后取10ml稀釋的血液加在含有9.0mlFicollHagueTMPlus(AmershamBiosciences，catno.17-1440-02)的50.0ml離心管中(Nunccatno.373660)。在2000rpm下室溫離心30分鐘，分離得到淋巴細(xì)胞。收集含有外周血液單核細(xì)胞(PBMC)的淺黃色分離層，它位于FicollHagueTM和稀釋血清交界處，用佛羅拿緩沖液(pH7.6)洗滌三遍；其中佛羅拿緩沖液(pH7.6)由9.1mM巴比妥鈉(Merck，catno.1.06318.0100)、15.6mM巴比妥(Merck，catno.1.00276.0100)、0.73M氯化鈉、2.5mM氯化鎂、2.5mM氯化鈣配成。然后PBMC以每毫升相同佛羅拿緩沖液中17.0×107細(xì)胞數(shù)的密度懸浮培養(yǎng)。在補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中，先在200.0μl的PBMC培養(yǎng)物(每個(gè)離心管中含3.6×106個(gè)細(xì)胞)中加入30.0μg單獨(dú)純化的單克隆抗體，將混合物在室溫孵育2小時(shí)，使之充分結(jié)合。取預(yù)先以1∶15比例用佛羅拿(Veronal)緩沖液稀釋的兔子補(bǔ)體(Rockland，catno.C304-0010)90.0μl，加入反應(yīng)體系中，37℃下將最終反應(yīng)混合物孵育10分鐘使補(bǔ)體結(jié)合消耗掉。立刻加入350μl激活的綿羊紅血球細(xì)胞(SRBC)(將3ml來自Rockland，catno.R406的100％SRBC用來自Rockland，catno.113-4139的含有100.0μl抗SRBC的抗血清洗滌兩次，再在37℃下處理30分鐘)。然后立即加入最終的SRBC混懸液(最終懸浮液在10.0ml佛羅拿(Veronal)緩沖液中制得)，整個(gè)反應(yīng)體系在37℃下繼續(xù)孵育1小時(shí)來檢測在反應(yīng)體系中剩下的補(bǔ)體。反應(yīng)結(jié)束后，在5000rpm下離心1分鐘，將剩下的完整SRBC離心沉淀下來。取每管離心的上清液150.0μl平均加到ELISA96孔板(BectonDickinson，catno.353915)孔中，在分光光度計(jì)中讀出540nm下的吸光度值，來檢測SRBC的裂解物。結(jié)果是以和對照細(xì)胞裂解液(不含單克隆抗體)比較的百分?jǐn)?shù)表示的(圖17)。實(shí)施例8去免疫化抗體免疫原性分析使用一種體外培養(yǎng)體系來研究單個(gè)單克隆抗體(如mAbsB4，DIVHv1/VK1#7，或DIVHv1/VK1#16)刺激人PBMC的能力。此研究中使用的PBMC是按照上面實(shí)施例7的方法分離得到的。體外PBMC的培養(yǎng)是將PBMC以每孔2.5×106個(gè)細(xì)胞每1.5ml完全培養(yǎng)基RPMI-1640的密度鋪在24孔平板(Corning，catno.3254)中，其中完全培養(yǎng)基RPMI-1640含有青霉素和鏈霉素(Gibco，catno.10378-016)以及胎牛血清(Gibco，catno.10099141)。單克隆抗體以10.0μg每毫升的量加入PBMC培養(yǎng)液中。在單個(gè)培養(yǎng)體系中加入2.0μg/ml的伴刀豆球蛋白(Sigma，catno.C5275)，或者10.0μgPokeweed有絲分裂原(Sigma，cat.no.L-8777)作為陽性對照；不加有絲分裂原和單克隆抗體作為陰性對照。擴(kuò)增培養(yǎng)體系，對每種刺激條件進(jìn)行檢測。在培養(yǎng)開始3、5、7、9天后收集培養(yǎng)物上清液，檢測前在-70℃保存。使用來自eBioscience(USA)細(xì)胞因子試劑盒檢測抗原/有絲分裂原刺激人PBMC培養(yǎng)物上清液中的細(xì)胞因子，從而能夠檢測出有無白細(xì)胞素-2(IL-2)、白細(xì)胞素4(IL-4)、白細(xì)胞素10(IL-10)、干擾素γ(IFN-γ)和腫瘤致死因子α(TNF-α)的存在。分別使用的試劑盒為IL-2(catno.88-7026-22)；IL-4(catno.88-7046-22)；IL-10(catno.88-7106-22)；IFN-γ(catno.88-7316-22)，和TNF-α(catno.88-7346-22)。根據(jù)制造商提供的說明書來進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。實(shí)施例9去免疫化抗體的臨床評價(jià)在人體內(nèi)進(jìn)行單劑量用藥后，開始擴(kuò)大用藥的臨床檢驗(yàn)，來檢驗(yàn)去免疫化的單克隆抗體，如DH1DK1NS0#16或DH1DK1NS0#7靜脈注射的安全性、免疫原性、藥物動力學(xué)和效率。研究中將使用兩輪HAART治療失敗的HIV感染患者分為兩組，每組兩個(gè)患者，沒有安慰劑使用組。組一和組二分別使用抗體DH1DK1NS0#16或DH1DK1NS0#7，劑量依次為1mg/kg和5mg/kg。在第0天開始靜脈注射。在注射前要事先采集血液血清樣本，然后在注射后每隔大約10分鐘，1小時(shí)和12小時(shí)進(jìn)行采集。然后在24小時(shí)、48小時(shí)以及第3、7、14、21、28、35、42、49以及56天采集血液血清樣本。用藥安全性通過體檢、血常規(guī)檢測、整體細(xì)胞計(jì)數(shù)和記錄不良反應(yīng)來評定。淋巴細(xì)胞標(biāo)記物通過FACs進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)，每隔一周來檢測免疫耐受情況?？煽康姆椒ㄊ怯^測如下分子標(biāo)記物CD3/CD4，CD3/CD8，CD14/CD45，CD20/CD45，和抗人IgG1-FITC。每次抽血后，以rsCD4作為固相免疫吸收劑，用ELISA檢測DIH1DK1NS0#7或DIH1DK1NS0#16血漿含量，從而可以測定藥物動力學(xué)特性。使用抗體DIH1DK1NS0#7或DIH1DK1NS0#16作為固相免疫吸收劑通過ELISA方法檢測血清中抗DIH1DK1NS0#7或DIH1DK1NS0#16表達(dá)水平，從而來確定免疫原性。每周通過定量RT-PCR方法檢測血漿中HIVRNA水平，從而確定藥物的效力。實(shí)施例10在轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)B4去免疫化抗體轉(zhuǎn)基因植物也是一種生產(chǎn)去免疫化抗體的相當(dāng)經(jīng)濟(jì)的方式。使用含有編碼去糖基化去免疫化抗體重鏈和輕鏈的7號克隆cDNAs的Agrobacteriumtumefaciens載體，將其轉(zhuǎn)入雙子葉植物煙草(Nicotianatabacum)中，這樣就形成了有效生產(chǎn)B4去免疫化抗體的生物反應(yīng)器植物。使用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI從pcDNA3.1(+)Neo-DeIg1(B4DIVHv.1)-S載體(圖13)上切下來編碼完整去免疫化B4抗體DIH1DK1NS0#7的cDNA，其中包含去糖基化IgG1CH，B4DIVHv.1VH和前導(dǎo)序列。使用HindIII和EcoRI從pcDNA3.1(+)Zeo-HuK(B4DIVKv.1)-S載體(圖14)上切下編碼完整去免疫化B4抗體κ鏈的cDNA，其中包含人κCH、B4DIVKv.1Vκ和前導(dǎo)序列。編碼Ig鏈的cDNA片段連入含有花椰菜花葉病毒35S啟動子的植物表達(dá)載體pMON530。將重組病毒轉(zhuǎn)入E.coliDH5-α中，用來自于克隆cDNAs的放射性標(biāo)記PCR產(chǎn)物篩選出IgcDNA的轉(zhuǎn)化菌。來自陽性克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Agrobacteriumtumefaciens。用重組的A.tumefaciens感染N.tabacum的葉片。從候選的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞產(chǎn)生幼苗。為了得到人的重鏈和輕鏈，準(zhǔn)備葉的提取物，通過ELISA檢測植物產(chǎn)生的重鏈或kappa鏈。由于交叉授粉，會使表達(dá)的重鏈和輕鏈相互交叉。這些過程都有描述。準(zhǔn)備表達(dá)完整去免疫化抗體DIH1DK1NS0#7的雜交轉(zhuǎn)基因植物的葉的提取物，通過ELISA篩選人的IgG。來自反應(yīng)植物中的植物表達(dá)抗體通過它的結(jié)合功能被篩選出來，使用rsCD4ELISA和實(shí)施例4中提到的病毒中和反應(yīng)方法，測定相對于7號克隆抗體活力的植物表達(dá)抗體中和活力大小。同時(shí)，單子葉植物玉米(Zeamays)被用來提高轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)物的表達(dá)以及它的穩(wěn)定性。特別值得注意的是，它的種子儲存啟動子可以使抗體的組織特異性表達(dá)在玉米的胚乳中。玉米蛋白基因的啟動子特別具有這樣的有用的功能。玉米蛋白是合成發(fā)生在玉米胚乳中的儲存蛋白，它的啟動子活性可以在玉米成熟前不斷增強(qiáng)。因此編碼去免疫化抗體DIH1DK1NS0#7重鏈和κ鏈的cDNA分別來自pcDNA3.1(+)Neo-DeIg1(B4DIVHv.1)-S(圖13)和pcDNA3.1(+)Zeo-HuK(B4DIVKv.1)-S(圖14)。這些cDNA被連入具有玉米蛋白基因啟動子和篩選標(biāo)記基因，如熒光素酶的表達(dá)載體中。重組載體轉(zhuǎn)入E.coli中，按照以上描述的方法篩選出含有IgcDNA的克隆。通過粒子轟擊的方法將陽性E.coli轉(zhuǎn)化菌轉(zhuǎn)入玉米小苗種。使用PDS1000/He儀器(Bio-RadLaboratories，HerculesCA)進(jìn)行DNA包裹的粒子轟擊，按照上面的方法通過對提取物中蛋白的熒光測定，篩選出轉(zhuǎn)化株。分離出的轉(zhuǎn)基因玉米是從陽性胚胎長大到成熟的。然后經(jīng)過交叉?zhèn)鞣蹃懋a(chǎn)生出可以生產(chǎn)去免疫化B4抗體的植株。上文描述了如何對抗體進(jìn)行篩選和定性。表1NS0產(chǎn)生的去免疫化B4抗體DIVHv.1-4/VKv.1的中和活性表2NS0細(xì)胞產(chǎn)生的去免疫化B4抗體DIVHv.1-4/VKv.2-3的中和活性表3CHO細(xì)胞(克隆#7和#21)產(chǎn)生的去免疫化B4抗體DIVHv.1VKv.1的中和活性表4單克隆抗體B4及其去免疫化配對物誘導(dǎo)的體外細(xì)胞因子應(yīng)答a，b&c以10.0μg/ml的濃度加入到培養(yǎng)基中的單克隆dBDL，低于檢測水平序列表<110>舒格內(nèi)·林恩王長義<120>可用來抵御并治療HIV感染的去免疫化單克隆抗體<130>1151-4173<140>TBA<160>30<170>PatentInversion3.2<210>1<211>354<212>DNA<213>小鼠<400>1caggttcagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaggatg60tcctgcaaggcttctggatacacattcactgactatgttatacactgggtgaagcagaga120actggacagggccttgagtggattggagagatttatcctggaagtggtagtgcttactcc180aatgcgaagttcaaggacaaggccacactgactgcagacaaatcctccaacacagcctac240atgcagctcagcagtctgacatctgaggactctgcggtctatttctgtgcaagaagaggg300aatggtaccgggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca354<210>2<211>118<212>PRT<213>小鼠<400>2GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuValLysProGlyAla151015SerValArgMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAspTyr202530ValIleHisTrpValLysGlnArgThrGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyGluIleTyrProGlySerGlySerAlaTyrSerAsnAlaLysPhe505560LysAspLysAlaThrLeuThrAlaAspLysSerSerAsnThrAlaTyr65707580MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrPheCys859095AlaArgArgGlyAsnGlyThrGlyPheAlaTyrTrpGlyGlnGlyThr100105110LeuValThrValSerAla115<210>3<211>333<212>DNA<213>小鼠<400>3gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccacc60atctcctgcaaggccggccaaagtgttgattatgatggtgatagttatatgaactggtac120caacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatgttgcatccaatctagaatct180gggatcccagccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccat240cctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcaaagttataaggatccgctc300acgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa333<210>4<211>111<212>PRT<213>小鼠<400>4AspIleValLeuThrGlnSerProAlaSerLeuAlaValSerLeuGly151015GlnArgAlaThrIleSerCysLysAlaGlyGlnSerValAspTyrAsp202530GlyAspSerTyrMetAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnProPro354045LysLeuLeuIleTyrValAlaSerAsnLeuGluSerGlyIleProAla505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuAsnIleHis65707580ProValGluGluGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGlnGlnSerTyr859095LysAspProLeuThrPheGlyAlaGlyThrLysLeuGluLeuLys100105110<210>5<211>118<212>PRT<213>小鼠<400>5GlnValGlnLeuValGlnSerGlyProGluLeuLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAspTyr202530ValIleHisTrpValLysGlnAlaThrGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyGluIleTyrProGlySerGlySerAlaTyrSerAsnAlaLysPhe505560LysAspArgValThrMetThrAlaAspLysSerSerAsnThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuThrSerAspAspThrAlaValTyrPheCys859095AlaArgArgGlyAsnGlyThrGlyPheAlaTyrTrpGlyGlnGlyThr100105110LeuValThrValSerSer115<210>6<211>118<212>PRT<213>小鼠<400>6GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAspTyr202530ValIleHisTrpValArgGlnAlaThrGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyGluIleTyrProGlySerGlySerAlaTyrSerAsnAlaLysPhe505560LysAspArgValThrIleThrAlaAspLysSerThrAsnThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrPheCys859095AlaArgArgGlyAsnGlyThrGlyPheAlaTyrTrpGlyGlnGlyThr100105110LeuValThrValSerSer115<210>7<211>118<212>PRT<213>小鼠<400>7GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAspTyr202530ValIleHisTrpValLysGlnAlaThrGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyGluIleTyrProGlySerGlySerAlaTyrSerAsnAlaLysPhe505560LysAspArgValThrIleThrAlaAspLysSerThrAsnThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrPheCys859095AlaArgArgGlyAsnGlyThrGlyPheAlaTyrTrpGlyGlnGlyThr100105110LeuValThrValSerSer115<210>8<211>118<212>PRT<213>小鼠<400>8GlnValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAspTyr202530ValIleHisTrpValArgGlnAlaThrGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyGluIleTyrProGlySerGlySerAlaTyrSerAsnSerLysPhe505560LysAspArgValThrIleThrAlaAspLysSerThrAsnThrAlaTyr65707580MetGluLeuArgSerLeuArgSerAspAspThrAlaValTyrPheCys859095AlaArgArgGlyAsnGlyThrGlyPheAlaTyrTrpGlyGlnGlyThr100105110LeuValThrValSerSer115<210>9<211>111<212>PRT<213>小鼠<400>9AspIleValLeuThrGlnSerProAlaSerLeuAlaValSerLeuGly151015GlnArgAlaThrIleThrCysLysAlaGlyGlnSerValAspTyrAsp202530GlyAspSerTyrMetAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnProPro354045LysLeuLeuIleTyrValAlaSerAsnLeuGluSerGlyIleProAla505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuAsnIleHis65707580ProValGluGluAsnAspAlaAlaThrTyrTyrCysGlnGlnSerTyr859095LysAspProLeuThrPheGlyGlnGlyThrLysLeuGluIleLys100105110<210>10<211>111<212>PRT<213>小鼠<400>10AspIleValLeuThrGlnSerProAlaSerLeuAlaValSerProGly151015GlnArgAlaThrIleThrCysLysAlaGlyGlnSerValAspTyrAsp202530GlyAspSerTyrMetAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnProPro354045LysLeuLeuIleTyrValAlaSerAsnLeuGluSerGlyIleProSer505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleAsn65707580ProValGluGluAsnAspThrAlaThrTyrTyrCysGlnGlnSerTyr859095LysAspProLeuThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLys100105110<210>11<211>111<212>PRT<213>小鼠<400>11AspIleValLeuThrGlnSerProAlaSerLeuAlaValSerProGly151015GlnArgAlaThrIleThrCysLysAlaGlyGlnSerValAspTyrAsp202530GlyAspSerTyrMetAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnProPro354045LysLeuLeuIleTyrValAlaSerAsnLeuGluSerGlyIleProSer505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleAsn65707580ProValGluGluAsnAspThrAlaThrTyrTyrCysGlnGlnSerTyr859095LysAspProLeuAlaPheGlyProGlyThrLysValGluIleLys100105110<210>12<211>354<212>DNA<213>小鼠<400>12caggttcagctggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggggcttcagtgaaggtg60tcctgcaaggcttctggatacacattcactgactatgttatacactgggtgaagcaggcg120actggacagggccttgagtggattggagagatttatcctggaagtggtagtgcttactcc180aatgcgaagttcaaggacagggtgacaatgactgcagacaaatcctccaacacagcctac240atggagctcagcagtctgacatctgacgacacagcggtctatttctgtgcaagaagaggg300aatggtaccgggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctcttct354<210>13<211>354<212>DNA<213>小鼠<400>13caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcttcagtgaaggtg60tcctgcaaggcttctggatacacattcactgactatgttatacactgggtgaggcaggcg120actggacagggccttgagtggattggagagatttatcctggaagtggtagtgcttactcc180aatgccaagttcaaggacagggtgacaattactgcagacaaatccacaaacacagcctac240atggagctcaggagtctgaggtctgacgacacagcggtctatttctgtgcaagaagaggg300aatggtaccgggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctcttct354<210>14<211>354<212>DNA<213>小鼠<400>14caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcttcagtgaaggtg60tcctgcaaggcttctggatacacattcactgactatgttatacactgggtgaagcaggcg120actggacagggccttgagtggattggagagatttatcctggaagtggtagtgcttactcc180aatgcgaagttcaaggacagggtgacaattactgcagacaaatccacaaacacagcctac240atggagctcaggagtctgaggtctgacgacacagcggtctatttctgtgcaagaagaggg300aatggtaccgggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctcttct354<210>15<211>354<212>DNA<213>小鼠<400>15caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcttcagtgaaggtg60tcctgcaaggcttctggatacacattcactgactatgttatacactgggtgcggcaggcg120actggacagggccttgagtggattggagagatttatcctggaagtggtagtgcttactcc180aattcgaagttcaaggacagggtgacaattactgcagacaaatccacaaacacagcctac240atggagctcaggagtctgaggtctgacgacacagcggtctatttctgtgcaagaagaggg300aatggtaccgggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctcttct354<210>16<211>333<212>DNA<213>小鼠<400>16gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccacc60atcacctgcaaggccggccaaagtgttgattatgatggtgatagttatatgaactggtac120caacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatgttgcatccaatctagaatct180ggcatcccagccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccat240cctgtggaggagaacgatgctgcaacctattactgtcagcaaagttataaggacccgctc300acgttcggtcaggggaccaagctggagatcaaa333<210>17<211>333<212>DNA<213>小鼠<400>17gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctccagggcagagggccacc60atcacctgcaaggccggccaaagtgttgattatgatggtgatagttatatgaactggtac120caacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatgttgcatccaatctagaatct180gggatcccaagtaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcacaatcaac240cctgtggaggagaacgataccgcaacctattactgtcagcaaagttataaggatccgctc300actttcggtcaggggaccaaggtggagatcaaa333<210>18<211>333<212>DNA<213>小鼠<400>18gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctccagggcagagggccacc60atcacctgcaaggccggccaaagtgttgattatgatggtgatagttatatgaactggtac120caacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatgttgcatccaatctagaatct180gggatcccaagtaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcacaatcaac240cctgtggaggagaacgataccgcaacctattactgtcagcaaagttataaggatccgctc300gcgttcggtccggggaccaaggtggagatcaaa333<210>19<211>30<212>DNA<213>小鼠<400>19ggatacacattcactgactatgttatacac30<210>20<211>10<212>PRT<213>小鼠<400>20GlyTyrThrPheThrAspTyrValIleHis1510<210>21<211>51<212>DNA<213>小鼠<400>21gagatttatcctggaagtggtagtgcttactccaatgcgaagttcaaggac51<210>22<211>17<212>PRT<213>小鼠<400>22GluIleTyrProGlySerGlySerAlaTyrSerAsnAlaLysPheLys151015Asp<210>23<211>27<212>DNA<213>小鼠<400>23agagggaatggtaccgggtttgcttac27<210>24<211>10<212>PRT<213>小鼠<400>24ArgGlyAsnGlyThrGlyPheAlaTyrTrp1510<210>25<211>45<212>DNA<213>小鼠<400>25aaggccggccaaagtgttgattatgatggtgatagttatatgaac45<210>26<211>15<212>PRT<213>小鼠<400>26LysAlaGlyGlnSerValAspTyrAspGlyAspSerTyrMetAsn151015<210>27<211>21<212>DNA<213>小鼠<400>27gttgcatccaatctagaatct21<210>28<211>7<212>PRT<213>小鼠<400>28ValAlaSerAsnLeuGluSer15<210>29<211>27<212>DNA<213>小鼠<400>29cagcaaagttataaggacccgctcacg27<210>30<211>9<212>PRT<213>小鼠<400>30GlnGlnSerTyrLysAspProLeuThr1權(quán)利要求1.一個(gè)去免疫化單克隆抗體或去免疫化片斷，其特征在于所述去免疫化單克隆抗體或去免疫化片斷含有一個(gè)Fv抗體重鏈段和一個(gè)Fv抗體輕鏈段，其中，所述Fv抗體重鏈段選自含有SEQIDNOS.5、6、7和8的組，F(xiàn)v抗體輕鏈段選自含有SEQIDNOS.9、10和11的組。2.一個(gè)單克隆抗體或片段，其特征在于所述抗體或片斷含有一個(gè)或多個(gè)B4鼠源抗體變異鏈互補(bǔ)決定區(qū)以及從去免疫化、拼接的人源化單克隆抗體組中篩選出來的SEQIDNOS20、22、24、26、28和30。3.一個(gè)去免疫化的單克隆抗體或片斷，其特征在于所述去免疫化的單克隆抗體或片斷是從包括DIH1DK1#7、DIH1DK1#16和DIH1DK1#21的組中篩選出來的。4.一個(gè)如權(quán)利要求1所述的去免疫化的去糖基化單克隆抗體或片段，其特征在于297位天冬酰胺被突變?yōu)?97位組氨酸，但不僅局限于組氨酸。5.一個(gè)SEQIDNO.12核苷酸，其特征在于編碼權(quán)利要求1中所述的SEQIDNO.5Fv重鏈。6.一個(gè)SEQIDNO.13核苷酸，其特征在于編碼權(quán)利要求1中所述的SEQIDNO.6重鏈。7.一個(gè)SEQIDNO.14核苷酸，其特征在于編碼權(quán)利要求1中所述的SEQIDNO.7重鏈。8.一個(gè)SEQIDNO.15核苷酸，其特征在于編碼權(quán)利要求1中所述的SEQIDNO.8重鏈。9.一個(gè)SEQIDNO.16核苷酸，其特征在于編碼權(quán)利要求1中所述的SEQIDNO.9輕鏈。10.一個(gè)SEQIDNO.17核苷酸，其特征在于編碼權(quán)利要求1中所述的SEQIDNO.10輕鏈。11.一個(gè)SEQIDNO.18核苷酸，其特征在于編碼權(quán)利要求1中所述的SEQIDNO.11輕鏈。12.一個(gè)多聚核苷酸，其特征在于所述多聚核苷酸包括如權(quán)利要求4所述的去免疫化抗體編碼區(qū)。13.一個(gè)重組宿主細(xì)胞，其特征在于所述重組宿主細(xì)胞分泌權(quán)利要求1中所述的去免疫化抗體或抗體片段。14.一個(gè)重組宿主細(xì)胞，其特征在于所述重組宿主細(xì)胞分泌權(quán)利要求2中所述的人單克隆抗體或抗體片斷。15.一個(gè)重組宿主細(xì)胞，其特征在于所述重組宿主細(xì)胞分泌權(quán)利要求3中所述的人單克隆抗體或抗體片斷。16.一個(gè)重組宿主細(xì)胞，其特征在于所述重組宿主細(xì)胞分泌權(quán)利要求4中所述的去糖基化單克隆抗體或抗體片段。17.一種通過用CD4+淋巴細(xì)胞預(yù)防或治療哺乳動物體內(nèi)某種疾病的方法，其特征在于所述方法包含給哺乳動物服用免疫治療有效量的如權(quán)利要求1中所述的抗體或抗體片段。18.一種通過用CD4+淋巴細(xì)胞預(yù)防或治療哺乳動物體內(nèi)某種疾病的方法，其特征在于所述方法包含給哺乳動物服用免疫治療有效量的如權(quán)利要求2中所述的抗體或抗體片段。19.一種通過用CD4+淋巴細(xì)胞預(yù)防或治療哺乳動物體內(nèi)某種疾病的方法，其特征在于所述方法包含給哺乳動物服用免疫治療有效量的如權(quán)利要求3中所述的抗體或抗體片段。20.一種通過用CD4+淋巴細(xì)胞預(yù)防或治療哺乳動物體內(nèi)某種疾病的方法，其特征在于所述方法包含給哺乳動物服用免疫治療有效量的如權(quán)利要求4中所述的抗體或抗體片段。21.一種預(yù)防或治療人體HIV感染的方法，其特征在于所述方法包含給予免疫治療有效量的如權(quán)利要求1中所述的抗體。22.一種預(yù)防或治療人體HIV感染的方法，其特征在于所述方法包含給予免疫治療有效量的如權(quán)利要求2中所述的抗體。23.一種預(yù)防或治療人體HIV感染的方法，其特征在于所述方法包含給予免疫治療有效量的如權(quán)利要求3中所述的抗體。24.一種預(yù)防或治療人體HIV感染的方法，其特征在于所述方法包含給予免疫治療有效量的如權(quán)利要求4中所述的抗體。全文摘要本發(fā)明涉及去免疫化抗體，所述去免疫化抗體是作為治療人免疫缺陷病毒(HIV)和CD4－引起的自身免疫紊亂的有效免疫治療藥物。更確切地說，被如下抗體含有重組基因B4DIVHv1/VK1CHO#7的7號克隆、含有重組基因B4DIVHv1/VK1#16的16號克隆以及含有重組基因B4DIVHv1/VK1#21的21號克隆所表達(dá)的抗體是來自于小鼠B4單克隆抗體(mAbB4)。這些抗體是通過去除可以被人免疫系統(tǒng)識別的特定鼠源決定簇而得到的。這些重組抗體是通過對小鼠單克隆抗體(mAb)B4Fv區(qū)域的拼接和去免疫化得到的。為了提高抗體的安全性，編碼序列可以進(jìn)一步突變后得到去糖基化的IgG1抗體，從而無法與補(bǔ)體結(jié)合。去免疫化抗體保留了鼠源mAbB4抗體對于宿主T細(xì)胞表面含有CD4的受體復(fù)合物的特異性，并且保留了mAbB4抗體中和原代HIV分離物的特殊能力。文檔編號C07K16/00GK1738646SQ200380108771公開日2006年2月22日申請日期2003年11月10日優(yōu)先權(quán)日2003年1月15日發(fā)明者林淑菁,王長怡申請人:美國聯(lián)合生物醫(yī)學(xué)公司