專利名稱：吡唑化合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有HSP90抑制活性的取代的吡唑、該類化合物在醫(yī)學中的用途，所述的醫(yī)學涉及對抑制HSP90活性有響應的疾病如癌，本發(fā)明還涉及包含該類化合物的藥物組合物。
背景技術：
分子伴侶維持蛋白的適宜折疊和構象，在調節(jié)蛋白質合成和降解之間的平衡中至關重要。已經表明它們在調節(jié)許多重要的細胞功能如細胞增殖和細胞凋亡中都很重要(Jolly和Morimoto，2000；Smith等，1998；Smith，2001)。
熱激蛋白(HSP)細胞與許多環(huán)境應激(包括熱激、醇、重金屬和氧化應激)的接觸導致許多通常被稱為熱激蛋白(HSP)的伴侶蛋白的細胞累積。HSP的誘導保護細胞不被最初的應激損害，增強恢復并維持應激耐受狀態(tài)。但是，還已經清楚的是某些HSP也可能通過調節(jié)一系列重要細胞蛋白的正確折疊、降解、定位和功能而在正常的無應激條件下發(fā)揮主要的分子伴侶作用。
存在許多HSP的多基因家族，各個基因產物在細胞表達、功能和定位中方面不同。它們按照分子量進行分類，例如HSP70、HSP90和HSP27。
作為蛋白質錯折疊的結果人類可獲得多種疾病(在Tytell等，2001；Smith等，1998中有綜述)。因此，證明發(fā)展干擾分子伴侶機器的療法可能是有益的。在一些情況(例如阿爾茨海默病、朊病毒病和亨廷頓舞蹈病)中，錯折疊的蛋白可造成導致神經變性疾病的蛋白聚集。另外，錯折疊的蛋白還可導致野生型蛋白功能喪失，從而導致細胞中分子和生理學功能失控。
HSP還與癌癥有關。例如，有HSP差異表達的證據，HSP的差異表達可能與腫瘤惡化有關(Martin等，2000；Conroy等，1996；Kawanishi等，1999；Jameel等，1992；Hoang等，2000；Lebeau等，1991)。由于多種關鍵致癌途徑中涉及HSP90且發(fā)現某些具有抗癌活性的天然產物靶向于這種分子伴侶，已經形成了引人注意的新觀念，即抑制HSP功能在癌癥的治療中可能是有用的。第一種分子伴侶抑制劑目前正在進行臨床試驗。
A)HSP90HSP90占總細胞蛋白的約1-2％，通常以與許多其它蛋白之一締合的二聚體形式存在于細胞中(參見例如Pratt，1997)。其是細胞生存力所必需的并且表現出雙重伴侶蛋白功能(Young等，2001)。其通過在許多蛋白的天然構象被各種環(huán)境應激如熱激改變后與其相互作用、確保足夠的蛋白折疊并預防非特異性聚集而在細胞應激響應中發(fā)揮關鍵作用(Smith等，1998)。此外，最近的結果表明HSP90還可能在對抗突變作用的緩沖中發(fā)揮作用，推測該作用可能是由于校正突變型蛋白的不適宜的折疊而產生的(Rutherford和Lindquist，1998)。但是，HSP90還具有重要的調控作用。在正常的生理學條件下，HSP90與其內質網同系物GRP94一起在細胞中發(fā)揮管家作用，維持多種關鍵客戶蛋白(client protein)的構象穩(wěn)定性和成熟。這些可以被細分為三組(a)甾類激素受體，(b)Ser/Thr或酪氨酸激酶(例如ERBB2、RAF-1、CDK4和LCK)，和(c)表面上不相關的蛋白的集合，所述的表面上不相關的蛋白例如端粒酶hTERT的突變體p53和催化亞基。所有這些蛋白均在細胞的許多生理學和生物化學過程中發(fā)揮關鍵的調控作用。不斷有新的HSP90客戶蛋白被鑒定。
人體內高度保守的HSP90家族由四種基因組成，即胞質HSP90α和HSP90β同工型(Hickey等，1989)、內質網中的GRP94(Argon等，1999)和線粒體基質中的HSP75/TRAP1(Felts等，2000)。認為所有的該族成員均具有相似的作用方式，但是與不同的客戶蛋白結合，這取決于它們在細胞中的定位。例如，已知ERBB2是GRP94的特異性客戶蛋白(Argon等，1999)，并且已經證明1型腫瘤壞死因子受體(TNFR1)和RB均是TRAP1的客戶蛋白(Song等，1995；Chen等，1996)。
HSP90參與一系列與許多客戶蛋白和調節(jié)蛋白的復雜相互作用(Smith，2001)。雖然精確的分子細節(jié)仍然有待說明，但是最近幾年進行的生物化學和X-射線結晶學研究(Prodromou等，1997；Stebbins等，1997)已經為獲悉HSP90的伴侶蛋白功能提供了越來越詳細的資料。
在對這一問題的早期爭論后，現已清楚的是HSP90是一種ATP-依賴性分子伴侶(Prodromou等，1997)，核苷酸結合域的二聚作用對于ATP水解而言是必需的，而ATP水解又是伴侶蛋白功能所必需的(Prodromou等，2000a)。ATP的結合導致形成一種其中N末端結構域彼此較緊密地接觸的環(huán)形二聚體結構，從而產生了被稱為‘夾子機理(clamp mechanism)’的構象轉換(Prodromou和Pearl，2000b)。
已知的HSP90抑制劑所發(fā)現的第一類HSP90抑制劑是苯醌安沙霉素類，其包括化合物除莠霉素(herbimycin)A和格爾德霉素。已經證明它們可逆轉被v-Src致癌基因轉化的成纖維細胞的惡性表型(Uehara等，1985)，并隨后在體外(Schulte等，1998)和體內動物模型中(Supko等，1995)表現出有效的抗腫瘤活性。
免疫沉淀法和親和力基質研究已經表明格爾德霉素的主要作用機理涉及與HSP90的結合(Whitesell等，1994；Schulte和Neckers，1998)。此外，X-射線結晶學研究已經表明格爾德霉素競爭ATP結合部位并抑制HSP90的固有腺苷三磷酸酶活性(Prodromou等，1997；Panaretou等，1998)。而這轉而又可預防能陪伴客戶蛋白的成熟多聚HSP90復合體的形成。因此，客戶蛋白靶向于通過泛素蛋白酶體途徑的降解。17-烯丙基氨基，17-去甲氧基格爾德霉素(17AAG)保留了HSP90的抑制性，在細胞培養(yǎng)和異種移植物模型中導致客戶蛋白消耗和抗腫瘤活性(Schulte等，1998；Kelland等，1999)，但是其肝毒性顯著低于格爾德霉素(Page等，1997)。目前正在進行I期臨床試驗以對17AAG進行評價。
根赤殼菌素是一種已證明可逆轉v-Src和v-Ha-Ras轉化的成纖維細胞的惡性表型的大環(huán)抗生素(Kwon等，1992；Zhao等，1995)。已經證明由于HSP90抑制其可降解許多信號蛋白(Senate等，1998)。X-射線結晶學數據證實根赤殼菌素還與HSP90的N末端結構域結合并抑制固有腺苷三磷酸酶活性(Roe等，1998)。由于該化合物不穩(wěn)定的化學性質，根赤殼菌素在體內缺乏抗腫瘤活性。
已知香豆素抗生素可以在與HSP90的ATP結合部位同源的ATP結合部位與細菌DNA回旋酶結合。已經證明香豆素、新生霉素與HSP90的羧基末端結合，即在與苯醌安沙霉素類和根赤殼菌素所占據的位置不同的位置上進行結合，苯醌安沙霉素類和根赤殼菌素在N-末端上進行結合(Marcu等，2000b)。但是，這也導致HSP90功能的抑制和許多HSP90-陪伴的信號蛋白的降解(Marcu等，2000a)。格爾德霉素不能在新生霉素之后結合HSP90；這表明在N和C末端之間一定存在一些相互作用，這與兩個部位對于HSP90伴侶蛋白性質均很重要的觀點相一致。
已經表明一種以嘌呤為基礎的HSP90抑制劑——PU3使得包括erb-B2在內的信號分子降解并造成乳腺癌細胞的細胞周期停止和分化(Chiosis等，2001)。
作為治療靶標的HSP90由于HSP90涉及調解許多在驅動腫瘤表型中十分重要的信號途徑且發(fā)現某些生物活性天然產物通過HSP90活性發(fā)揮其作用，因此目前估計分子伴侶HSP90是抗癌藥物研發(fā)的一種新靶標(Neckers等，1999)。
格爾德霉素、17AAG和根赤殼菌素的主要作用機理涉及在位于HSP90N-末端結構域中的ATP結合部位與該蛋白結合，從而抑制HSP90固有的腺苷三磷酸酶活性(參見例如Prodromou等，1997；Stebbins等，1997；Panaretou等，1998)。
HSP90腺苷三磷酸酶活性的抑制可防止輔-伴侶蛋白的募集并促進一類HSP90雜絡物的形成，通過該形成，這些客戶蛋白靶向于通過泛素蛋白酶體途徑的降解(參見例如Neckers等，1999；Kelland等，1999)。
用HSP90抑制劑進行治療導致細胞增殖、細胞周期調節(jié)和細胞凋亡(一些在癌癥中十分重要的過程)中所涉及的重要蛋白的選擇性降解。
已經表明HSP90功能的抑制導致細胞增殖、細胞周期調節(jié)和細胞凋亡(一些十分重要的且在癌癥中經常失控的過程)中所涉及的重要信號蛋白的選擇性降解(參見例如Hostein等，2001)。研制用于臨床的針對該靶標的藥物的一個引人注意的原理是通過同時消耗與轉化表型有關的蛋白可以獲得強效抗腫瘤作用并獲得相對于正常細胞而言的對抗癌癥的治療益處。認為HSP90抑制的這些下游事件與HSP90抑制劑在細胞培養(yǎng)和動物模型中的抗腫瘤活性有關(參見例如Schulte等，1998；Kelland等，1999)。
發(fā)明概述本發(fā)明使得可以獲得一類新的取代的吡唑化合物，其是HSP90抑制劑，抑制癌細胞增殖。一個環(huán)碳原子上的芳族取代和毗鄰環(huán)碳原子上的非芳族碳環(huán)或雜環(huán)取代是表征本發(fā)明化合物特征的主要要素。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了式(IA)或(IB)的化合物或其鹽、N-氧化物、水合物或溶劑合物 其中Ar是芳基、芳基(C1-C6烷基)、雜芳基或雜芳基(C1-C6烷基)，其中的任何一個均任選地在其芳基或雜芳基部分上被取代，R1是氫或任選取代的C1-C6烷基；R2是氫、任選取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、C1-C6烷基、C1-C6鏈烯基或C1-C6炔基；或者羧基、甲酰胺或羧酸酯基團；且環(huán)A是非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，其中(i)環(huán)碳任選地被取代，和/或(ii)環(huán)氮任選地被取代，取代基是式-(Alk1)p-(Cyc)n-(Alk3)m-(Z)r-(Alk2)s-Q的基團，其中Alk1、Alk2和AlK3是任選取代的C1-C3烷基，
Cyc是任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基；m、n、p、r和s獨立地是0或1，Z是-O-、-S-、-(C＝O)-、-SO2-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-NRA-、-C(＝O)NRA-、-NRAC(＝O)-、-SO2NRA-或-NRASO2-，其中RA是氫或C1-C6烷基，且Q是氫或任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基。
本發(fā)明化合物的一個子集由以上所定義的式(IA)或(IB)的化合物組成，其中Ar是任選取代的芳基或雜芳基；且環(huán)A是非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，其中(i)環(huán)碳任選地被取代，和/或(ii)環(huán)氮任選地被取代，取代基是式-(Alk1)p-(Z)r-(Alk2)s-Q的基團，其中Alk1、Alk2是任選取代的C1-C3烷基，p、r和s獨立地是0或1，Z是-O-、-S-、-(C＝O)-、-SO2-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-NRA-、-C(＝O)NRA-、-NRAC(＝O)-、-SO2NRA-或-NRASO2-，其中RA是氫或C1-C6烷基，且Q是氫或任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基。
當化合物IA和IB中的R1是氫時，化合物IA和IB是相同化合物的互變異構形式。
本文中所用的術語“羧基”是指式-COOH的基團；術語“羧酸酯基團”是指式-COOR的基團，其中R是實際上或理論上衍生自羥基化合物ROH的基團；且術語“甲酰胺基團”是指式-CONRaRb的基團，其中-NRaRb是實際上或理論上衍生自氨或胺HNRaRb的伯或仲(包括環(huán)狀)氨基。
本文中所用的術語“(C1-C6)烷基”是指具有1至6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，包括例如甲基、乙基、正-丙基、異丙基、正-丁基、異丁基、仲-丁基、叔-丁基、正-戊基和正-己基。
本文中所用的術語“(C1-C6)鏈烯基”是指具有2至6個碳原子且含有至少一個E或Z構型的雙鍵的直鏈或支鏈鏈烯基，包括例如乙烯基和烯丙基。
本文中所用的術語“(C1-C6)炔基”是指具有2至6個碳原子且含有至少一個三鍵的直鏈或支鏈炔基，包括例如乙炔基和丙-2-炔基。
本文中所用的術語“環(huán)烷基”是指具有3-8個碳原子的飽和碳環(huán)基，包括例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基和環(huán)辛基。
本文中所用的術語“環(huán)烯基”是指具有3-8個碳原子且含有至少一個雙鍵的碳環(huán)基，包括例如環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基、環(huán)庚烯基和環(huán)辛烯基。
本文中所用的術語“芳基”是指單-、二-或三-環(huán)的碳環(huán)芳族基團。該類基團的實例有苯基、聯苯基和萘基。
本文中所用的術語“碳環(huán)”是指其環(huán)原子均是碳的環(huán)狀環(huán)或環(huán)體系，包括單環(huán)芳基、環(huán)烷基和環(huán)烯基。
本文中所用的術語“雜芳基”是指含有一個或多個選自S、N和O的雜原子的單-、二-或三-環(huán)的芳族基團。該類基團的實例有噻吩基、苯并噻吩基、呋喃基、苯并呋喃基、吡咯基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、異噻唑基、苯并異噻唑基、吡唑基、噁唑基、苯并噁唑基、異噁唑基、苯并異噁唑基、異噻唑基、三唑基、苯并三唑基、噻二唑基、噁二唑基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、吲哚基和吲唑基。
本文中所用的未限定的術語“雜環(huán)基”或“雜環(huán)”包括以上所定義的“雜芳基”，并且特別意指含有一個或多個選自S、N和O的雜原子的單-、二-或三-環(huán)的芳族或非芳族基團，包括由含有一個或多個與另外的該類基團或單環(huán)碳環(huán)基共價連接的該類雜原子的單環(huán)芳族或非芳族基團所組成的基團。該類基團的實例有吡咯基、呋喃基、噻吩基、哌啶基、咪唑基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、噻二唑基、吡唑基、吡啶基、吡咯烷基、嘧啶基、嗎啉基、哌嗪基、吲哚基、嗎啉基、苯并呋喃基、吡喃基、異噁唑基、苯并咪唑基、亞甲二氧基苯基、亞乙二氧基苯基、馬來酰亞胺基和琥珀酰亞胺基。
除非在其出現的上下文中進行特別說明，否則本文中用于任何部分的術語“取代的”意指被至多4個取代基取代，所述的取代基各自可以獨立地是例如(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、羥基、羥基(C1-C6)烷基、巰基、巰基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷硫基、鹵素(包括氟和氯)、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、腈(-CN)、氧、苯基、-COOH、-COORA、-CORA、-SO2RA、-CONH2、-CONHNH2、-CONHNHRA、-CONHNRARB、-SO2NH2、-CONHRA、-SO2NHRA、-CONRARB、-SO2NRARB、-NH2、-NHRA、-NRARB、-OCONH2、-OCONHRA、-OCONRARB、-NHCORA、-NHCOORA、-NRBCOORA、-NHSO2ORA、-NRBSO2ORA、-NHCONH2、-NRACONH2、-NHCONHRB、-NRACONHRB、-NHCONRARB或-NRACONRARB，其中RA和RB獨立地是(C1-C6)烷基。
本文中所用的術語“鹽”包括堿加成鹽、酸加成鹽和季鹽。本發(fā)明的酸性化合物可以與堿形成包括可藥用鹽或可獸用鹽在內的鹽，所述的堿如堿金屬氫氧化物例如氫氧化鈉和氫氧化鉀；堿土金屬氫氧化物例如氫氧化鈣、氫氧化鋇和氫氧化鎂；有機堿例如N-乙基哌啶、二芐胺等。為堿性的那些化合物(I)可以與無機酸、有機酸形成包括可藥用鹽或可獸用鹽在內的鹽，所述的無機酸例如氫鹵酸如鹽酸或氫溴酸、硫酸、硝酸或磷酸等，所述的有機酸例如乙酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、蘋果酸、水楊酸、檸檬酸、甲磺酸和對-甲苯磺酸等。
因為存在不對稱碳原子，所以本發(fā)明的一些化合物含有一個或多個實際或可能的手性中心。存在多個不對稱碳原子使得在各個手性中心上有許多具有R或S立體化學的非對映異構體。本發(fā)明包括所有該類非對映異構體及其混合物。
在本發(fā)明的化合物中Ar優(yōu)選是2-羥基苯基，更優(yōu)選是2，4-二羥基苯基，其可任選地進一步被取代，例如可以在5-位上被取代。任選的取代基包括例如氯或溴、任選取代的苯基或C1-C6烷基，和在其苯環(huán)上任選地被取代的苯乙基。
R1和R2可以是例如氫、甲基、乙基、正-或異-丙基或羥基乙基。對于R1，優(yōu)選氫，對于R2，優(yōu)選氫或甲基；
環(huán)A可以是例如式(IIA)或(IIB)的環(huán) 其中X表示CH或N，且Y表示CH、O、S或NH，其中(i)環(huán)碳任選地被取代，和/或(ii)環(huán)氮任選地被取代，取代基是式-(Alk1)p-(Cyc)n-(Alk3)m-(Z)r-(Alk2)s-Q的基團，其中Alk1、Alk2和Alk3是任選取代的C1-C3烷基，Cyc是任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基；m、n、p、r和s獨立地是0或1，Z是-O-、-S-、-(C＝O)-、-SO2-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NRA-、-SO2NRA-、-NRAC(＝O)-、-NRASO2-或-NRA-，其中RA是氫或C1-C6烷基，且Q是氫或任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基。
當任選取代的環(huán)A是式(IIA)時，X優(yōu)選是N且Y是NH或CH，更優(yōu)選X是N且Y是其中RA是式-(Alk1)-Q的基團的-NRA-，其中Alk1是C1-C3亞烷基。例如在該類情況中，RA可以是任選取代的芐基且Q可以是任選取代的苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、咪唑基或嗎啉基。
或者，當任選取代的環(huán)A是式(IIA)時，X可以是且Y可以是-NRA-，其中RA是式-(Alk1)p-(Cyc)n-(Alk3)m-(Z)r-(Alk2)s-Q的基團。在許多該類情況中的一種中，p是1且m各自是1，Cyc是亞苯基。
當任選取代的環(huán)A是式(IIA)時，X是N且Y是-NRA-，在本文實施例的化合物中可發(fā)現取代基RA的具體實例。
目前優(yōu)選類型的本發(fā)明的化合物包括式(IC)或(ID)的化合物或其鹽、N-氧化物、水合物或溶劑合物
其中R是氫、任選的取代基或在苯環(huán)上任選地被取代的苯乙基，且R2、m、r、s、Alk3、Z和Alk2的定義如上所述。在該類化合物中，R2可以是氫，R可以是例如氯、溴或在苯環(huán)上任選地被取代的苯乙基，且n可以是0，r可以是1，Z可以是-C(＝O)NH-。
本發(fā)明的具體化合物包括本文中實施例的那些化合物。
本發(fā)明的化合物可以用與本文實施例中所用的方法相似的方法制備，一般而言可以通過以下方法獲得使式(IIA)的化合物與式(IIB)的化合物反應， 形成式(IIC)的中間體化合物，
然后使其與肼H2N-NHR1反應，形成兩種吡唑化合物(1A)和(IB)的混合物，然后將其進行分離。當然，在以上的反應過程中可以酌情保護Ar、環(huán)A和取代基R1和R2中任何可能的活性基團并隨后除去保護基。
式(HA)的化合物可以通過用環(huán)A的陰離子對式(III)化合物的溴進行親核置換來制備 本發(fā)明的一些化合物可以通過將以上的通法方法所制得的本發(fā)明的其它化合物進行化學修飾來獲得。
本發(fā)明的化合物是HSP90的抑制劑，因此可用于治療對抑制HSP90活性有響應的疾病如癌癥；病毒性疾病如丙型肝炎(HCV)(Waxman，2002)；免疫抑制如移植中的免疫抑制(Bijlmakers，2000和Yorgin，2000)；抗炎疾病(Bucci，2000)如類風濕性關節(jié)炎、哮喘、MS、I型糖尿病、狼瘡、銀屑病和炎癥性腸??；囊性纖維化(Fuller，2000)；與血管生成有關的疾病(Hur，2002和Kurebayashi，2001)糖尿病性視網膜病變、血管瘤、銀屑病、子宮內膜異位癥和腫瘤血管生成。本發(fā)明的Hsp90抑制劑還可以保護正常細胞不受化療誘導的毒性的影響并且可用于其中不能發(fā)生細胞凋亡是根本因素的疾病。該類Hsp90抑制劑還可用于其中細胞應激或熱激蛋白響應的誘導可能有益的疾病，例如防止由于心臟(Hutter，1996和Trost，1998)和腦(Plumier，1997和Rajder，2000)中Hsp70升高而引起的低氧-局部缺血損傷。Hsp90抑制劑還可用于其中蛋白錯折疊或聚集是主要起因的疾病，例如瘙癢病/CJD、亨廷頓舞蹈病和阿爾茨海默病(Sittler，2001；Trazelt，1995和Winklhofer，2001)。
因此，本發(fā)明還提供了(i)治療哺乳動物、特別是人的對抑制HSP90活性有響應的疾病或病癥的方法，該方法包括對所述的哺乳動物施用有效量的以上式(IA)或(IB)的化合物；和
(ii)用于人或獸醫(yī)學、特別是用于治療對抑制HSP90活性有響應的疾病或病癥的以上式(IA)或(IB)的化合物；和(iii)以上式(IA)或(IB)的化合物在制備用于控制(其意指治療或預防)對抑制HSP90活性有響應的疾病或病癥的藥物中的用途。
應當理解的是，用于任何特定患者的特定劑量水平將取決于多種因素，包括所用的具體化合物的活性、年齡、體重、總體健康狀況、性別、飲食、施用時間、使用途徑、排泄速率、藥物組合和所治療的具體疾病的致病機理和嚴重程度。一般而言，口服施用制劑的適宜劑量通常為0.1至3000mg，每天一次、兩次或三次施用，或者通過輸入或其它途徑給予相等的日劑量。但是，如本領域常規(guī)所做的那樣，最佳劑量水平和給藥頻率將通過臨床試驗來確定。
本發(fā)明所涉及的化合物可以被制備用于通過任何與其藥動學性質相一致的途徑進行施用?？诜┯玫慕M合物可以是片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、錠劑、液體或凝膠制劑形式，如口服、局部或無菌的胃腸外溶液劑或混懸劑形式。用于口服施用的片劑和膠囊劑可以是單位劑量形式，可以含有常規(guī)的賦形劑如粘合劑例如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、西黃蓍膠或聚乙烯吡咯烷酮；填充劑例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸鈣、山梨醇或甘氨酸；壓片潤滑劑例如硬脂酸鎂、滑石粉、聚乙二醇或二氧化硅；崩解劑例如馬鈴薯淀粉或可接受的濕潤劑如十二烷基硫酸鈉。可以根據常規(guī)藥學實踐中眾所周知的方法對片劑進行包衣?？诜后w制劑可以是例如水性或油性混懸液、溶液、乳劑、糖漿或酏劑形式，或者可以是使用前用水或其它適宜基質重構的干產品形式。適宜的液體制劑可以含有常規(guī)添加劑如混懸劑例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、葡萄糖糖漿、明膠氫化食用脂肪；乳化劑例如卵磷脂、脫水山梨醇單油酸酯或阿拉伯膠；非水性基質(其可包括食用油)例如杏仁油、分餾椰子油、油性酯如甘油、丙二醇或乙醇；防腐劑例如對-羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸，并且如果需要，還可以含有常規(guī)的矯味劑或著色劑。
對于局部應用于皮膚而言，可以將藥物制備成乳膏劑、洗劑或軟膏劑。可用于所述藥物的乳膏或軟膏制劑是本領域中眾所周知的常規(guī)制劑，例如在藥劑學標準教科書如英國藥典中有描述。
所述活性成分還可以在無菌介質中被胃腸外施用。根據所用的基質和濃度，可以將藥物混懸或溶解在基質中。有利地，可以將輔劑如局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑溶解在基質中。
以下實施例對本發(fā)明的具體化合物的制備和活性進行了舉例說明。
實施例14-[3-(5-氯-2，4-二羥基-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯，和實施例24-氯-6-(4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-苯-1，3-二酚 實施例1 實施例2流程

圖1哌嗪子基(piperazino)吡唑的合成。

步驟11-(5-氯-2，4-二羥基-苯基)-乙酮 在氮氣氛下，將乙酸(17.5mL)滴加至4-氯間苯二酚(42.5g，0.293mmol)在三氟化硼醚合物(200mL)中的混懸液中。將該反應混合物在90℃下加熱3.5小時，然后使之冷卻至室溫。在冷卻約1小時后形成固體。將該混合物傾入700ml 10％w/v乙酸鈉水溶液中。將該混合物劇烈攪拌2.5小時。將所形成的淺棕色固體濾出、用水洗滌并風干過夜，得到1-(5-氯-2，4-二羥基-苯基)-乙酮(31.6g，58％)。LCMS[M-H]+185。
步驟21-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基-乙酮 將芐基溴(30mL)加至1-(5-氯-2，4-二羥基-苯基)-乙酮(20g，0.107mole)和碳酸鉀(37g，2.5當量)在乙腈(350mL)中的混合物中。將該混合物在回流下加熱6小時，然后使之冷卻并將其攪拌過夜。將該混合物過濾并用二氯甲烷(3×100mL)洗滌固體。將合并的有機萃取物真空蒸發(fā)，剩余淡黃色固體，將其用己烷(350mL)/乙酸乙酯(15mL)的混合物研磨并過濾，得到灰白色固體，1-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-乙酮(35.4g，90％)。1H NMR(400MHz)與結構一致。
步驟31-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-2-溴-乙酮
將苯基三甲基三溴化銨(7.5g，0.02mol)逐份加至攪拌著的1-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-乙酮(7.09g，0.019mol)在四氫呋喃(100ml)中的溶液中并將該混合物攪拌2小時。將該混合物在水(100ml)和乙醚(2×50ml)之間進行分配。將合并的有機相用硫酸鎂干燥并濃縮，得到米黃色固體。用甲苯(100ml)結晶，得到白色固體形式的1-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-2-溴-乙酮(4.5g)。
LC保留時間為2.97分鐘，非離子(運行時間為3.75分鐘)步驟44-[2-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-2-氧代-乙基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯 將碳酸銫(2.95g，9mmol)分三份加至攪拌著的1-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-2-溴-乙酮(4.4g，9mmol)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.74g，9mmol)在二甲基甲酰胺(20ml)中的溶液中。將該混懸液攪拌2小時，然后將其在水(200ml)和乙酸乙酯(3×50ml)之間進行分配。將合并的有機相用水(100ml)洗滌，用硫酸鎂干燥并濃縮，得到黃色油狀物形式的4-[2-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-2-氧代-乙基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(4g)。
LC保留時間為2.53分鐘[M+H]+551.5(運行時間3.75分鐘)步驟54-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯
將4-[2-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-2-氧代-乙基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(2g，3.6mmol)在二甲基甲酰胺二甲基縮醛(4ml)中的溶液在回流下加熱3小時。向其中再加入一定量二甲基甲酰胺二甲基縮醛(15ml)，并將該混合物在回流下加熱4小時。將該混合物分配到7個微波容器中。向每個微波容器中加入乙醇(1ml)和水合肼(1ml)，并將其各自在120℃下加熱5分鐘。將所有容器的內含物合并并將其在水(50ml)和二氯甲烷(3×30ml)之間進行分配。將合并的有機相濃縮并在bond elute柱(20g)上進行純化，用己烷、然后用己烷∶乙醚4∶1、然后1∶1、然后1∶2、然后1∶4進行洗脫，得到白色固體形式的4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(620mg)。
LC保留時間為2.98分鐘[M+H]+575.5(運行時間為3.75分鐘)步驟64-[3-(5-氯-2，4-二羥基-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(實施例1)將4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(230mg，0.4mmol)在乙酸乙酯(15ml)中的溶液用10％披鈀炭氫化1.5小時。將該混懸液用硅藻土過濾，用二氯甲烷∶乙醇(1∶1)洗滌。濃縮濾液，得到白色固體形式的4-[3-(5-氯-2，4-二羥基苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(實施例1)(72mg)。
LC保留時間為2.24分鐘[M+H]+395.3(運行時間為3.75分鐘)步驟74-氯-6-(4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-苯-1，3-二酚(實施例2)方法A將4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(25mg，0.06mmol)和濃鹽酸(1ml)的混合物在微波中于80℃下加熱5分鐘。將該混合物蒸發(fā)至干，與甲苯一起共沸，得到4-氯-6-(4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-苯-1，3-二酚(10mg)(實施例2)。
LC保留時間為1.37分鐘[M+H]+295.2(運行時間為3.75分鐘)方法B在0℃下，將三氯化硼(1M在二氯甲烷中的溶液；8ml，8mmol)滴加至4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.5g，2.6mmol)在二氯甲烷(15ml)中的溶液中。將所得的混合物在室溫下攪拌1小時、然后用飽和碳酸氫鈉溶液堿化。將該混懸液真空濃縮，與甲苯一起共沸，直至殘余物變干。將殘余物用二氯甲烷∶乙醇(1∶1；15ml)研磨并過濾。將濾液在bond elute柱(20g)上純化，用二氯甲烷∶乙醇∶氨，50∶8∶1、然后20∶8∶1洗脫，得到淡黃色固體形式的4-氯-6-(4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-苯-1，3-二酚(400mg)(實施例2)。
LC保留時間為1.37分鐘[M+H]+295.2(運行時間為3.75分鐘)實施例1的化合物在以下所述的腺苷三磷酸酶試驗中具有活性‘B’，實施例2的化合物具有活性‘A’。
下表中的化合物如流程圖1所述用相應的胺制得并且用HPLC純化?！癏sp90 IC50”欄中的輸入項是在以下所述的腺苷三磷酸酶試驗中所得的結果。

實施例54-氯-6-[4-(4-呋喃-2-基甲基-哌嗪-1-基)-1H-吡唑-3-基]-苯-1，3-二酚 該化合物用流程圖2中所概括的途徑制得流程圖2哌嗪的還原性氨基化。
將三乙酰氧基硼氫化鈉(150mg，0.7mmol)以一份的形式加至4-氯-6-(4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-苯-1，3-二酚(43mg，0.146mmol)、糠醛(0.025ml，0.3mmol)、乙酸(0.5ml)和二氯甲烷(1ml)的混合物中。在氮氣下再攪拌3小時，將反應混合物在水(10ml)和二氯甲烷(3×10ml)之間進行分配。將合并的有機相用硫酸鎂干燥，濃縮并在bond elute柱(5g)上純化，用二氯甲烷∶乙醇∶氨(100∶8∶1)洗脫，得到白色固體形式的4-氯-6-[4-(4-呋喃-2-基甲基-哌嗪-1-基)-1H-吡唑-3-基]-苯-1，3-二酚(10mg)。
LC保留時間為1.68分鐘[M+H]+375.3(運行時間為3.75分鐘)實施例5的化合物在以下所述的腺苷三磷酸酶試驗中具有活性‘B’。
實施例6和7的化合物也根據流程圖2分別用乙醛和3-吡啶基甲醛制備。“Hsp90 IC50”欄中的輸入項是在以下所述的腺苷三磷酸酶試驗中所得的結果。
實施例8 實施例8的化合物如以下2個流程圖中所述進行制備流程圖3哌嗪乙酸乙酯的合成。
步驟14-乙氧基羰基甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁酯
將哌嗪-1-甲酸叔丁酯(2.62g，14mmol)、碳酸銫(5g，15mmol)和溴乙酸乙酯(1.56ml，14mmol)在室溫下攪拌1小時。將該混合物在水(200ml)和乙醚(2×100ml)之間進行分配。將合并的有機相用硫酸鎂干燥并濃縮，得到黃色油狀物，將其結晶，得到淡黃色固體形式的4-乙氧基羰基甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(2.6g)。
1H N.M.R(CDCl3)δ＝1.24(3H，t，J＝7.1Hz)，1.43(9H，s)，2.49(4H，t，J＝5Hz)，3.20(2H，s)，3.44(4H，t，J＝4.8Hz)，4.16(2H，q，J＝7.1Hz)。
步驟2哌嗪-1-基-乙酸乙酯 將4-乙氧基羰基甲基-哌嗪-1-甲酸叔丁酯在90％三氟乙酸(5ml)中的溶液攪拌3小時。將該混合物用飽和碳酸氫鈉溶液堿化并濃縮。將殘余物用乙酸乙酯(30ml)研磨并過濾。濃縮濾液，得到黃色油狀物形式的哌嗪-1-基-乙酸乙酯(約1.5g)。
1H N.M.R(CDCl3)δ＝1.18(3H，t，J＝7.1Hz)，2.40(4H，t，J＝4.1Hz)，2.70(4H，t，J＝4.5Hz)，3.13(2H，s)，3.45(1H，br s)，4.01(2H，q，J＝7.1Hz)。
流程圖4酰肼的合成
步驟3{4-[2-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-2-氧代-乙基]-哌嗪-1-基}-乙酸乙酯 如流程圖1所述用哌嗪-1-基-乙酸乙酯制備該化合物。
LC保留時間為2.32分鐘[M+H]+537.5(運行時間為3.75分鐘)步驟4{4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-基}-乙酸乙酯和{4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-基}-乙酰肼 將{4-[2-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-2-氧代-乙基]-哌嗪-1-基}-乙酸乙酯(1.5g，2.80mmol)在二甲基甲酰胺二甲基縮醛(4ml)中的溶液在微波中于140℃下加熱30分鐘。將該溶液分成兩份，將每份與水合肼(0.1ml)和乙醇(2ml)混合并在微波中于100℃下加熱5分鐘。將合并的混合物濃縮并在bondelute柱上純化，得到{4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-基}-乙酸乙酯(230mg)和{4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-基}-乙酰肼(150mg)。
步驟5{4-[3-(5-氯-2，4-二羥基-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-基}-乙酰肼(實施例8) 與實施例2，步驟7，方法A類似，由{4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-基}-乙酰肼制備該化合物。
LC保留時間為1.40分鐘[M+H]+367.3(運行時間為3.75分鐘)實施例8的化合物在腺苷三磷酸酶試驗中具有活性‘B’。
實施例94-氯-6-{4-[4-(2-羥基-乙基)-哌嗪-1-基]-1H-吡唑-3-基}-苯-1，3-二酚流程圖5哌嗪的烷基化 將4-氯-6-(4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-苯-1，3-二酚(43mg，0.146mmol)、碳酸銫(48mg，0.146mmol)、2-溴乙醇(0.025ml，0.35mmol)和二甲基甲酰胺(1ml)的混合物在室溫下攪拌3天。將該混合物蒸發(fā)至干并將其施加到bondelute柱(5g)上，用二氯甲烷∶甲醇(49∶1)、然后用二氯甲烷、然后用二氯甲烷∶乙醇∶氨(50∶8∶1，然后20∶8∶1)洗脫，得到白色固體形式的4-氯-6-{4-[4-(2-羥基-乙基)-哌嗪-1-基]-1H-吡唑-3-基}-苯-1，3-二酚(10mg)。
LC保留時間為1.36分鐘[M+H]+339.3(運行時間為3.75分鐘)實施例9的化合物在腺苷三磷酸酶試驗中具有活性‘B’。
實施例10至48通過流程圖5中所概述的方法用適宜的烷基化劑、酰化劑或磺?；瘎┲苽洹！癏sp90 IC50”欄中的輸入項是在以下所述的腺苷三磷酸酶試驗中所得的結果，或者，在用星號標明的情況中，是在以下所述的熒光偏振(FP)試驗中所得的結果

步驟22’-(芐氧基)-2-溴-4’-氟苯乙酮將苯基三甲基三溴化銨(1.55g，4.13mmol)加至2’-(芐氧基)-4’-氟苯乙酮(1.01g，4.13mmol)在THF(10ml)中的溶液中，將該混合物在室溫下攪拌45分鐘，在此期間，有機溶液褪色并形成白色沉淀。Tlc分析(9∶1己烷∶EtOAc)表明反應已經進行完全。將混合物傾入水(20ml)中并用乙醚(2×50mL)萃取。將合并的醚萃取物干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑，得到無色油狀物形式的2’-(芐氧基)-2-溴-4’-氟苯乙酮粗品，將其不經純化直接用于下一步。Rf0.47(9∶1己烷∶EtOAc)；δH(CDCl3)7.89(1H，dd，J＝9.4和6.9Hz)，7.45-7.40(5H，m)，6.77-6.74(2H，m)，5.15(2H，s)，4.47(2H，s)；LCMS保留時間2.75分鐘，M+H+323.3/325.3。
步驟32’-(芐氧基)-2-[4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基]-4’-氟苯乙酮將1-(叔丁氧羰基)哌嗪(808mg，4.34mmol)加至2’-(芐氧基)-2-溴-4’-氟苯乙酮(約4.13mmol)和碳酸鉀(856mg，6.20mmol)在DMF中的混合物中并將其在室溫下攪拌18小時。在真空下除去溶劑，將殘余物用乙酸乙酯(150ml)吸收并用水(100ml)和鹽水(100ml)洗滌。將有機層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑。將粗品用快速色譜法純化，用9∶1己烷∶EtOAc、然后用1∶1己烷∶EtOAc洗脫，得到黃色油狀物形式的2’-(芐氧基)-2-[4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基]-4’-氟苯乙酮純品(1.42g，2步的收率為80％)；Rf0.00(9∶1己烷∶EtOAc)，0.50(1∶1己烷∶EtOAc)；δH(CDCl3)7.89(1H，dd，J＝9.3和6.9Hz)，7.48-7.44(5H，m)，6.81-6.77(2H，m)，5.17(2H，s)，3.79(2H，s)，3.51-3.47(4H，m)，2.44-2.41(4H，m)，1.50(9H，s)；LCMS保留時間2.10分鐘，M+H+429.4。
步驟43-[4-氟-2-(芐氧基)苯基]-4-[4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基]-1H-吡唑將2’-(芐氧基)-2-[4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基]-4’-氟苯乙酮(270mg，0.63mmol)在二甲基甲酰胺二甲基縮醛(1.5ml)中的溶液在密封的微波管中于200℃下加熱15分鐘。形成白色沉淀。將該混合物在真空下蒸發(fā)至干，得到4-[1-(2-芐氧基-4-氟-苯甲酰基)-2-二甲基氨基-乙烯基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯粗品。向其中加入乙醇(2mL)和水合肼(2.0ml)并將混合物在密封的微波管中于120℃下加熱30分鐘。將該粗品混合物裝載在干燥的預填充的二氧化硅柱上并將其干燥過夜。用2∶1己烷∶EtOAc洗脫產物，得到黃色膠狀物形式的4-[3-(2-芐氧基-4-氟-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(95mg，33％)；LCMS保留時間2.75分鐘，M+H+453.4。
步驟53-(4-氟-2-羥基苯基)-4-(哌嗪-1-基)-1H-吡唑將三氯化硼(1.0M在DCM中；0.829ml，0.829mmol)加至4-[3-(2-芐氧基-4-氟-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(75mg，0.166mmol)在DCM(7.5ml)中的溶液中。形成棕色沉淀。將該混合物在室溫下攪拌1小時，然后將其傾入碳酸氫鈉飽和水溶液(50ml)中并用DCM(3×50ml)萃取。將合并的有機層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑。將該產物用制備HPLC純化，得到灰白色固體形式的3-(4-氟-2-羥基苯基)-4-(哌嗪-1-基)-1H-吡唑(13mg，30％)；δH(MeOH-d4)7.96(1H，br s)，7.72(1H，s)，6.71-6.64(2H，m)，3.36-3.33(4H，m)，3.13-3.10(4H，m)，2.65(1H，s)；LCMS保留時間1.46分鐘，M+H+263.2。
該實施例52的化合物在Hsp90腺苷三磷酸酶試驗中具有活性‘B’。
實施例533-[4-乙酰氨基-2-羥基苯基]-4-(哌嗪-1-基)-1H-吡唑
試劑和條件a.AcCl，吡啶，DCM，96％；b.AlCl3，180℃，73％；c.BnBr，Cs2CO3，DMF，53％；d.PhNMe3Br3，THF，EE 95％或EE’100％；e.(EtO)2PH.Et3N，THF，＞100％(不純)；f.Cbz-哌嗪，DMF，K2CO3，50％；g.DMFDMA，THF；h.加入NH2NH2·xH2O，MeOH，98％；i.H2，Pd/C，MeOH，41％。
步驟1乙酸3-乙酰氨基苯酯將吡啶(46.32ml，45.30g，572mmol)加至攪拌著的3-氨基苯酚(25.0g，229mmol)在DCM(200ml)中的混懸液中并將該混合物冷卻至0℃。在2.5小時期間，由均壓滴液漏斗向該混合物中滴加乙酰氯(14.45ml，15.95g，203.21mmol)在DCM(100ml)中的溶液(警告放熱)并將該混合物在0℃下再攪拌1小時。將混合物傾入HCl(1.0M在H2O中；350ml)中并分離各層。將水層用另外的DCM(150ml)萃取，將合并的有機層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑。將粗產物在40℃、150mbar下再干燥18小時，得到白色固體形式的乙酸3-乙酰氨基苯酯(42.5g，96％)；δH(CDCl3)7.83(1H，br s)，7.45(1H，t，J＝2.0Hz)，7.23(1H，t，J＝8.1Hz)，7.14-7.11(1H，m)，6.78-6.76(1H，m)，2.28(3H，s)，2.06(3H，s)；LCMS保留時間1.76分鐘，M+H+194.2。
步驟24’-乙酰氨基-2’-羥基苯乙酮用研棒和研缽將乙酸3-乙酰氨基苯酯(10.47g，54.19mmol)研磨成細粉，然后將其在裝配有與供氮設備相連的起泡器的250ml圓底燒瓶中與AlCl3(14.45g，108.40mmol)混合。將該混合物小心加熱至熔化(75℃)，隨后發(fā)生劇烈反應(85℃)(警告反應劇烈放熱并產生氣體。注意這些過程出現的溫度表現出一些變化一所述的溫度是觀察到的最低溫度，對于各過程而言最高溫度是約較其高30℃)。將該混合物冷卻至室溫并用刮刀將棕色固體破碎成粉末。然后，將混合物在180℃下加熱4.25小時并冷卻至室溫。用刮刀將固體物質破碎，并向其中加入冰-水(100ml)。將混合物劇烈攪拌過夜并通過過濾取出純產物。將產物在減壓下干燥(45℃，100mbar)18小時，得到灰白色粉末形式的N-(4-乙酰基-3-羥基-苯基)-乙酰胺(7.66g，73％)；δH(DMSO-d6)12.32(1H，s)，10.28(1H，s)，7.83(1H，d，J＝8.8Hz)，7.35(1H，d，J＝2.0Hz)，7.05(1H，dd，J＝8.8，2.0Hz)，2.56(3H，s)，2.07(3H，s)；LCMS保留時間1.87分鐘，M+H 194.2。
步驟3N-(4-乙酰基-3-芐氧基-苯基)-乙酰胺在室溫下，于5分鐘期間，將芐基溴(4.84ml，6.97g，40.76mmol)滴加至N-(4-乙?；?3-羥基-苯基)-乙酰胺(7.50g，38.82mmol)和Cs2CO3(25.30g，77.64mmol)在DMF(175ml)中的混合物中。攪拌18小時后，在真空下除去溶劑，將殘余物與水(200ml)和DCM(200ml)一起劇烈攪拌至溶解完全。分離各層，再用DCM(2×200ml)萃取水層。將合并的有機層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑。將殘余物用PhMe(150ml)吸收并將其蒸發(fā)至干，于是開始形成結晶。將混合物重新混懸于PhMe(100ml)中并將其與活性炭(5g)一起回流1小時。將該熱溶液過濾并使之冷卻。通過過濾收集產物，得到無色晶體形式的N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺(5.79g，53％)；δH(CDCl3)7.83(1H，m)，7.76(1H，d，J＝8.5Hz)，7.58(1H，brs)，7.45-7.32(6H，m)，6.74(1H，dd，J＝8.5，1.9Hz)，5.15(2H，s)，2.56(3H，s)，2.19(3H，s)；LCMS保留時間2.33分鐘，M+H+284.3。
步驟4N-[3-芐氧基-4-(2，2-二溴-乙?；?-苯基]-乙酰胺將苯基三甲基三溴化銨(102mg，0.272mmol)加至N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺(35mg，0.124mmol)在THF(3.5ml)中的溶液中并在室溫下攪拌2小時。將該混合物在水(25ml)和EtOAc(25ml)之間進行分配，分離各層并將有機層干燥(MgSO4)。在真空下除去溶劑，得到淡棕色固體形式的N-[3-芐氧基-4-(2，2-二溴-乙酰基)-苯基]-乙酰胺粗品(54mg，100％)；δH(CDCl3)7.92(1H，br s)，7.85(1H，d，J＝8.5Hz)，7.55(1H，br s)，7.50-7.35(5H，m)，7.09(1H，s)，6.78(1H，dd，J＝8.5，1.9Hz)，5.20(2H，s)，2.21(3H，s)；LCMS保留時間2.65分鐘，M+H+440.1/442.1/444.1。將該混合物以粗品形式用于下一步。
步驟5N-[3-芐氧基-4-(2-溴-乙?；?-苯基]-乙酰胺方法A將苯基三甲基三溴化銨(241mg，0.641mmol)加至攪拌著的N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺(165mg，0.582mmol)在THF(16ml)中的溶液中并在室溫下攪拌2小時。將該反應混合物傾入水(50ml)中并用乙醚(2×50ml)萃取。將合并的醚萃取物干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑，得到灰白色固體形式的N-[3-芐氧基-4-(2-溴-乙酰基)-苯基]-乙酰胺(200mg，95％)粗品；δH(CDCl3)7.98(1H，br s)，7.92(1H，brs)，7.81(1H，d，J＝8.5Hz)，7.49-7.32(5H，m)，6.82(1H，dd，J＝8.5，1.9Hz)，5.16(2H，s)，4.50(2H，s)，2.20(3H，s)；LCMS保留時間2.52分鐘，M+H+362.2/364.2。雖然該粗品物質被少量其實原料和相應的二溴-化合物污染，但是其純度足以用于步驟6。
方法B在室溫下，將亞磷酸二乙酯(12.6μL，13.5mg，97.6μmol)和三乙胺(13.6μL，9.9mg，97.6μmol)在THF(0.1ml)中的溶液加至攪拌著的N-[3-芐氧基-4-(2，2-二溴-乙?；?-苯基]-乙酰胺(41mg，92.9μmol)在THF(1.5ml)中的溶液中，將該反應攪拌2小時。將混合物傾入EtOAc(20ml)中并用水(20ml)和鹽水(20ml)洗滌。將有機層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑，得到N-[3-芐氧基-4-(2-溴-乙?；?-苯基]-乙酰胺(40mg，＞100％)，通過NMR發(fā)現其被亞磷酸二乙酯衍生的污染物所污染。該物質可不經進一步純化成功地用于
*在FP試驗中進行試驗實施例494-氯-6-(5-甲基-4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-苯-1，3-二酚 步驟14-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1-(甲苯-4-磺?；?-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯 將對甲苯磺酰氯(180mg，0.95mmol)加至攪拌著的4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(500mg，0.9mmol)在二氯甲烷(10ml)和吡啶(0.9mmol)中的溶液中。繼續(xù)攪拌18小時，然后將該溶液在水(20ml)和乙酸乙酯(2×20ml)之間進行分配。將合并的有機相用硫酸鎂干燥并真空濃縮，得到黃色油狀物。在二氧化硅(20g)上純化，用己烷、然后用己烷∶乙醚1∶1、然后用乙醚進行洗脫，得到4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1-(甲苯-4-磺?；?-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(490mg，77％)。
LC保留時間為3.22分鐘[M]+729.6(運行時間為3.75分鐘)步驟24-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-5-甲基-1-(甲苯-4-磺酰基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在氮氣氛下，將正丁基鋰(1.6M，在己烷中；0.25ml，0.4mmol)滴加至攪拌著的4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-1-(甲苯-4-磺?；?-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(240mg，0.33mmol)在四氫呋喃(2ml)中的冷(-78℃)溶液中。將該混合物在-78℃下攪拌10分鐘，然后向其中加入碘甲烷(40μL；0.64mmol)。將反應混合物升溫至室溫，然后在水(20ml)和乙酸乙酯(2×20ml)之間進行分配。將合并的有機相用硫酸鎂干燥，然后真空濃縮，在二氧化硅柱(200mg)上純化，用己烷、然后用己烷∶乙醚1∶1、然后用乙醚洗脫，得到4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-5-甲基-1-(甲苯-4-磺酰基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(70mg；29％)。
LC保留時間為3.26分鐘[M]+743.6(運行時間為3.75分鐘)用實施例1的方法B得到終產物，其在Hsp90 FP試驗中具有活性‘A’。
實施例504-氯-6-(5-羥甲基-4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-苯-1，3-二酚 步驟14-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-5-羥甲基-1-(甲苯-4-磺酰基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在氮氣氛、室溫下，將氫化鋁鋰溶液(1M，在乙醚中，0.3ml，0.3mmol)滴加至攪拌著的4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-5-異丁氧基羰基-1-(甲苯-4-磺?；?-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(90mg，0.11mmol)[在前面的實施例中用鋰化化學制得]在無水乙醚(2ml)中的溶液中。將該混懸液攪拌2小時，然后向其中加入氫氧化鈉溶液(1M，3滴)，然后加入甲醇(0.5ml)。將該混合物在水(30ml)和乙酸乙酯(2×20ml)之間進行分配，將合并的有機相用硫酸鎂干燥，然后真空濃縮，得到4-[3-(2，4-二-芐氧基-5-氯-苯基)-5-羥甲基-1-(甲苯-4-磺酰基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(58mg，88％)。
LC保留時間為2.87分鐘[M]+605.6(運行時間為3.75分鐘)步驟2用實施例1的方法B獲得終產物。
該化合物在Hsp90 FP試驗中具有活性‘A’。
實施例515-(5-氯-2，4-二羥基-苯基)-4-哌嗪-1-基-2H-吡唑-3-甲酸乙基酰胺 根據實施例52和53中的鋰化化學制備該化合物，但是用異氰酸乙酯猝滅反應。該實施例54的化合物在Hsp90腺苷三磷酸酶試驗中具有活性‘A’。
實施例523-(4-氟-2-羥基苯基)-4-(哌嗪-1-基)-1H-吡唑 試劑和條件a.BnBr，K2CO3，DME，室溫，18小時，97％；b.PhNMe3Br3，THF，室溫，45分鐘；c.tBoc-哌嗪，K2CO3，DMF，80％(2步)；d.DMFDMA，μ-波200℃，15分鐘；e.NH2NH2·H2O，EtOH，μ-波，120℃，30分鐘，33％(2步)；f.BCl3，DCM，30％。
步驟12’-(芐氧基)-4’-氟苯乙酮將碳酸鉀(4.02g，29.10mmol)加至4’-氟-2’-羥基苯乙酮(2.0ml，2.56g，16.60mmol)在DMF(15mL)中的溶液中。在室溫下，于5分鐘期間，向其中滴加芐基溴(2.07ml，2.98g，17.50mmol)，并將該混合物攪拌18小時。將混合物傾入鹽酸(1.0M在H2O中；200ml)中并用乙酸乙酯(2×100ml)萃取。將合并的有機萃取物干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑。在用己烷研磨后，得到白色粉末形式的2’-(芐氧基)-4’-氟苯乙酮(3.94g，97％)。Rf0.44(9∶1己烷∶EtOAc)；δH(CDCl3)7.82(1H，dd，J＝8.6和7.0Hz)，7.43-7.38(5H，m)，6.75-6.69(2H，m)，5.13(2H，s)，2.56(3H，d，J＝3.2Hz)；LCMS保留時間2.68分鐘，M+H+245.1。
步驟22’-(芐氧基)-2-溴-4’-氟苯乙酮將苯基三甲基三溴化銨(1.55g，4.13mmol)加至2’-(芐氧基)-4’-氟苯乙酮(1.01g，4.13mmol)在THF(10ml)中的溶液中，將該混合物在室溫下攪拌45分鐘，在此期間，有機溶液褪色并形成白色沉淀。Tlc分析(9∶1己烷∶EtOAc)表明反應已經進行完全。將混合物傾入水(20ml)中并用乙醚(2×50mL)萃取。將合并的醚萃取物干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑，得到無色油狀物形式的2’-(芐氧基)-2-溴-4’-氟苯乙酮粗品，將其不經純化直接用于下一步。Rf0.47(9∶1己烷∶EtOAc)；δH(CDCl3)7.89(1H，dd，J＝9.4和6.9Hz)，7.45-7.40(5H，m)，6.77-6.74(2H，m)，5.15(2H，s)，4.47(2H，s)；LCMS保留時間2.75分鐘，M+H+323.3/325.3。
步驟32’-(芐氧基)-2-[4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基]-4’-氟苯乙酮將1-(叔丁氧羰基)哌嗪(808mg，4.34mmol)加至2’-(芐氧基)-2-溴-4’-氟苯乙酮(約4.13mmol)和碳酸鉀(856mg，6.20mmol)在DMF中的混合物中并將其在室溫下攪拌18小時。在真空下除去溶劑，將殘余物用乙酸乙酯(150ml)吸收并用水(100ml)和鹽水(100ml)洗滌。將有機層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑。將粗品用快速色譜法純化，用9∶1己烷∶EtOAc、然后用1∶1己烷∶EtOAc洗脫，得到黃色油狀物形式的2’-(芐氧基)-2-[4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基]-4’-氟苯乙酮純品(1.42g，2步的收率為80％)；Rf0.00(9∶1己烷∶EtOAc)，0.50(1∶1己烷∶EtOAc)；δH(CDCl3)7.89(1H，dd，J＝9.3和6.9Hz)，7.48-7.44(5H，m)，6.81-6.77(2H，m)，5.17(2H，s)，3.79(2H，s)，3.51-3.47(4H，m)，2.44-2.41(4H，m)，1.50(9H，s)；LCMS保留時間2.10分鐘，M+H+429.4。
步驟43-[4-氟-2-(芐氧基)苯基]-4-[4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基]-1H-吡唑將2’-(芐氧基)-2-[4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基]-4’-氟苯乙酮(270mg，0.63mmol)在二甲基甲酰胺二甲基縮醛(1.5ml)中的溶液在密封的微波管中于200℃下加熱15分鐘。形成白色沉淀。將該混合物在真空下蒸發(fā)至干，得到4-[1-(2-芐氧基-4-氟-苯甲?；?-2-二甲基氨基-乙烯基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯粗品。向其中加入乙醇(2mL)和水合肼(2.0ml)并將混合物在密封的微波管中于120℃下加熱30分鐘。將該粗品混合物裝載在干燥的預填充的二氧化硅柱上并將其干燥過夜。用2∶1己烷∶EtOAc洗脫產物，得到黃色膠狀物形式的4-[3-(2-芐氧基-4-氟-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(95mg，33％)；LCMS保留時間2.75分鐘，M+H+453.4。
步驟53-(4-氟-2-羥基苯基)-4-(哌嗪-1-基)-1H-吡唑將三氯化硼(1.0M在DCM中；0.829ml，0.829mmol)加至4-[3-(2-芐氧基-4-氟-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(75mg，0.166mmol)在DCM(7.5ml)中的溶液中。形成棕色沉淀。將該混合物在室溫下攪拌1小時，然后將其傾入碳酸氫鈉飽和水溶液(50ml)中并用DCM(3×50ml)萃取。將合并的有機層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑。將該產物用制備HPLC純化，得到灰白色固體形式的3-(4-氟-2-羥基苯基)-4-(哌嗪-1-基)-1H-吡唑(13mg，30％)；δH(MeOH-d4)7.96(1H，br s)，7.72(1H，s)，6.71-6.64(2H，m)，3.36-3.33(4H，m)，3.13-3.10(4H，m)，2.65(1H，s)；LCMS保留時間1.46分鐘，M+H+263.2。
該實施例52的化合物在Hsp90腺苷三磷酸酶試驗中具有活性‘B’。
實施例533-[4-乙酰氨基-2-羥基苯基]-4-(哌嗪-1-基)-1H-吡唑
試劑和條件a.AcCl，吡啶，DCM，96％；b.AlCl3，180℃，73％；c.BnBr，Cs2CO3，DMF，53％；d.PhNMe3Br3，THF，EE 95％或EE’100％；e.(EtO)2PH.Et3N，THF，＞100％(不純)；f.Cbz-哌嗪，DMF，K2CO3，50％；g.DMFDMA，THF；h.加入NH2NH2·xH2O，MeOH，98％；i.H2，Pd/C，MeOH，41％。
步驟1乙酸3-乙酰氨基苯酯將吡啶(46.32ml，45.30g，572mmol)加至攪拌著的3-氨基苯酚(25.0g，229mmol)在DCM(200ml)中的混懸液中并將該混合物冷卻至0℃。在2.5小時期間，由均壓滴液漏斗向該混合物中滴加乙酰氯(14.45ml，15.95g，203.21mmol)在DCM(100ml)中的溶液(警告放熱)并將該混合物在0℃下再攪拌1小時。將混合物傾入HCl(1.0M在H2O中；350ml)中并分離各層。將水層用另外的DCM(150ml)萃取，將合并的有機層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑。將粗產物在40℃、150mbar下再干燥18小時，得到白色固體形式的乙酸3-乙酰氨基苯酯(42.5g，96％)；δH(CDCl3)7.83(1H，br s)，7.45(1H，t，J＝2.0Hz)，7.23(1H，t，J＝8.1Hz)，7.14-7.11(1H，m)，6.78-6.76(1H，m)，2.28(3H，s)，2.06(3H，s)；LCMS保留時間1.76分鐘，M+H+194.2。
步驟24’-乙酰氨基-2’-羥基苯乙酮用研棒和研缽將乙酸3-乙酰氨基苯酯(10.47g，54.19mmol)研磨成細粉，然后將其在裝配有與供氮設備相連的起泡器的250ml圓底燒瓶中與AlCl3(14.45g，108.40mmol)混合。將該混合物小心加熱至熔化(75℃)，隨后發(fā)生劇烈反應(85℃)(警告反應劇烈放熱并產生氣體。注意這些過程出現的溫度表現出一些變化—所述的溫度是觀察到的最低溫度，對于各過程而言最高溫度是約較其高30℃)。將該混合物冷卻至室溫并用刮刀將棕色固體破碎成粉末。然后，將混合物在180℃下加熱4.25小時并冷卻至室溫。用刮刀將固體物質破碎，并向其中加入冰-水(100ml)。將混合物劇烈攪拌過夜并通過過濾取出純產物。將產物在減壓下干燥(45℃，100mbar)18小時，得到灰白色粉末形式的N-(4-乙?；?3-羥基-苯基)-乙酰胺(7.66g，73％)；δH(DMSO-d6)12.32(1H，s)，10.28(1H，s)，7.83(1H，d，J＝8.8Hz)，7.35(1H，d，J＝2.0Hz)，7.05(1H，dd，J＝8.8，2.0Hz)，2.56(3H，s)，2.07(3H，s)；LCMS保留時間1.87分鐘，M+H 194.2。
步驟3N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺在室溫下，于5分鐘期間，將芐基溴(4.84ml，6.97g，40.76mmol)滴加至N-(4-乙?；?3-羥基-苯基)-乙酰胺(7.50g，38.82mmol)和Cs2CO3(25.30g，77.64mmol)在DMF(175ml)中的混合物中。攪拌18小時后，在真空下除去溶劑，將殘余物與水(200ml)和DCM(200ml)一起劇烈攪拌至溶解完全。分離各層，再用DCM(2×200ml)萃取水層。將合并的有機層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑。將殘余物用PhMe(150ml)吸收并將其蒸發(fā)至干，于是開始形成結晶。將混合物重新混懸于PhMe(100ml)中并將其與活性炭(5g)一起回流1小時。將該熱溶液過濾并使之冷卻。通過過濾收集產物，得到無色晶體形式的N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺(5.79g，53％)；δH(CDCl3)7.83(1H，m)，7.76(1H，d，J＝8.5Hz)，7.58(1H，br s)，7.45-7.32(6H，m)，6.74(1H，dd，J＝8.5，1.9Hz)，5.15(2H，s)，2.56(3H，s)，2.19(3H，s)；LCMS保留時間2.33分鐘，M+H+284.3。
步驟4N-[3-芐氧基-4-(2，2-二溴-乙?；?-苯基]-乙酰胺將苯基三甲基三溴化銨(102mg，0.272mmol)加至N-(4-乙酰基-3-芐氧基-苯基)-乙酰胺(35mg，0.124mmol)在THF(3.5ml)中的溶液中并在室溫下攪拌2小時。將該混合物在水(25ml)和EtOAc(25ml)之間進行分配，分離各層并將有機層干燥(MgSO4)。在真空下除去溶劑，得到淡棕色固體形式的N-[3-芐氧基-4-(2，2-二溴-乙酰基)-苯基]-乙酰胺粗品(54mg，100％)；δH(CDCl3)7.92(1H，br s)，7.85(1H，d，J＝8.5Hz)，7.55(1H，br s)，7.50-7.35(5H，m)，7.09(1H，s)，6.78(1H，dd，J＝8.5，1.9Hz)，5.20(2H，s)，2.21(3H，s)；LCMS保留時間2.65分鐘，M+H+440.1/442.1/444.1。將該混合物以粗品形式用于下一步。
步驟5N-[3-芐氧基-4-(2-溴-乙?；?-苯基]-乙酰胺方法A將苯基三甲基三溴化銨(241mg，0.641mmol)加至攪拌著的N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺(165mg，0.582mmol)在THF(16ml)中的溶液中并在室溫下攪拌2小時。將該反應混合物傾入水(50ml)中并用乙醚(2×50ml)萃取。將合并的醚萃取物干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑，得到灰白色固體形式的N-[3-芐氧基-4-(2-溴-乙?；?-苯基]-乙酰胺(200mg，95％)粗品；δH(CDCl3)7.98(1H，br s)，7.92(1H，br s)，7.81(1H，d，J＝8.5Hz)，7.49-7.32(5H，m)，6.82(1H，dd，J＝8.5，1.9Hz)，5.16(2H，s)，4.50(2H，s)，2.20(3H，s)；LCMS保留時間2.52分鐘，M+H+362.2/364.2。雖然該粗品物質被少量其實原料和相應的二溴-化合物污染，但是其純度足以用于步驟6。
方法B在室溫下，將亞磷酸二乙酯(12.6μL，13.5mg，97.6μmol)和三乙胺(13.6μL，9.9mg，97.6μmol)在THF(0.1ml)中的溶液加至攪拌著的N-[3-芐氧基-4-(2，2-二溴-乙酰基)-苯基]-乙酰胺(41mg，92.9μmol)在THF(1.5ml)中的溶液中，將該反應攪拌2小時。將混合物傾入EtOAc(20ml)中并用水(20ml)和鹽水(20ml)洗滌。將有機層干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑，得到N-[3-芐氧基-4-(2-溴-乙?；?-苯基]-乙酰胺(40mg，＞100％)，通過NMR發(fā)現其被亞磷酸二乙酯衍生的污染物所污染。該物質可不經進一步純化成功地用于以下的步驟。所有分析數據如以上所報告。
步驟64’-乙酰氨基-2’-芐氧基-2-[4-(芐氧羰基)哌嗪-1-基]苯乙酮將1-(芐氧羰基)哌嗪(117μL，134mg，0.607mmol)加至N-[3-芐氧基-4-(2-溴-乙酰基)-苯基]-乙酰胺(200mg，0.552mmol)和碳酸鉀(115mg，0.828mmol)在DMF(5ml)中的混合物中并將其在室溫下攪拌18小時。在真空下除去溶劑，并用鹽水(25ml)吸收。用DCM(3×25ml)萃取水相并將合并的有機物干燥(MgSO4)。在真空下除去溶劑，將產物用制備HPLC純化，得到灰白色固體形式的4’-乙酰氨基-2’-芐氧基-2-[4-(芐氧羰基)哌嗪-1-基]苯乙酮純品(114mg，41％，50％rec.)；δH(CDCl3)8.23(1H，br s)，7.81(1H，d，J＝8.6Hz)，7.77-7.76(1H，m)，7.53-7.51(2H，m)，7.42-7.28(8H，m)，7.08(1H，dd，J＝8.6，1.8Hz)，5.20(2H，s)，5.12(2H，s)，4.00(2H，s)，3.59-3.48(4H，m)，2.65-2.60(4H，m)，2.14(3H，s)；LCMS保留時間2.07分鐘，M+H+502.5，以及回收的N-(4-乙酰基-3-芐氧基-苯基)-乙酰胺(35mg)。
步驟73-[4-乙酰氨基-2-芐氧基苯基]-4-[4-(芐氧羰基)-哌嗪-1-基]-1H-吡唑將4’-乙酰氨基-2’-芐氧基-2-[4-(芐氧羰基)哌嗪-1-基]苯乙酮(68mg，135.6μmol)和二甲基甲酰胺二甲基縮醛(90μL，81mg，677.9μmol)在干燥THF(0.5ml)中的溶液密封在微波管中并在120℃下加熱65分鐘。向其中加入另外的在THF(0.5ml)中的二甲基甲酰胺二甲基縮醛(90μL，81mg，677.9μmol)并將該管在120℃下再加熱40分鐘。
向所得的4-[1-(4-乙酰基氨基-2-芐氧基-苯甲?；?-2-二甲基氨基-乙烯基]-哌嗪-1-甲酸芐酯粗品溶液中加入水合肼(0.75ml)和MeOH(0.75ml)以便使混合物為單相，將該混合物在室溫下攪拌3天。在真空下除去揮發(fā)性物質，將殘余物傾入50％飽和鹽水(100ml)中。將產物用EtOAc(3×100ml)萃取，將合并的有機物干燥(MgSO4)并在真空下除去溶劑，得到黃色膠狀物形式的3-[4-乙酰氨基-2-芐氧基苯基]-4-[4-(芐氧羰基)哌嗪-1-基]-1H-吡唑粗品(70mg，98％)；LCMS保留時間2.48分鐘，M+H+526.5。
步驟83-[4-乙酰氨基-2-羥基苯基]-4-(哌嗪-1-基)-1H-吡唑將3-[4-乙酰氨基-2-芐氧基苯基]-4-[4-(芐氧羰基)哌嗪-1-基]-1H-吡唑(70mg，133.2μmol)在MeOH(7ml)中的溶液脫氣(3×真空/氮)并向其中加入鈀(10％在碳上；10mg，催化劑)。將反應混合物再次脫氣(3×真空/氮)并用一種氫氣(3×真空/氫)代替該氣氛。將混合物在室溫下振搖18小時。通過用硅藻土小墊過濾濾出催化劑并將其用另外的MeOH(15ml)洗滌。在真空下除去溶劑，得到粗品，將其用制備HPLC純化，得到白色固體形式的3-[4-乙酰氨基-2-羥基苯基]-4-(哌嗪-1-基)-1H-吡唑(16.3mg，41％)；δHMeOH-d4)8.47(1H，s)，7.80(1H，br s)，7.68(1H，s)，7.26(1H，s)，7.11(1H，dd，J＝8.5，2.1Hz)，3.34-3.29(4H，m)，3.11-3.07(4H，m)，2.12(3H，s)；LCMS保留時間1.26分鐘，M+H+302.3。
該實施例53的化合物在Hsp90 FP結合試驗中具有活性‘B’。
實施例543-甲基-5-(4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-6-酚
步驟1N-(4-乙?；?3-羥基-苯基)-乙酰胺將乙酸3-乙?；被?苯酯(5.0g，25.9mmol)研磨成細粉，然后將其在一個圓底燒瓶中與AlCl3(6.9g，52.3mmol)混合。用氮氣充溢后，將燒瓶加熱至95℃并將其保持在這一溫度下直至反應已經發(fā)煙完全。使該反應冷卻至室溫并將棕色固體破碎成粉末。然后，將反應重新加熱至180℃。4小時后，將反應冷卻至室溫并將其破碎成粉末。向其中加入冰水(100ml)并將反應攪拌過夜。將產物濾出，用水洗滌并干燥，得到棕色固體(2.57g，51.4％)。LC/MS保留時間＝1.864分鐘。194(MH+)。
步驟2N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺將N-(4-乙?；?3-羥基-苯基)-乙酰胺(2.57g，13.3mmol)混懸在DMF(60ml)中，然后依次加入Cs2CO3(8.70g，26.7mmol)和芐基溴(1.7ml，14mmol)。將該反應在室溫下攪拌過夜。在真空下除去溶劑并將油性殘余物在DCM/H2O(1∶1)中進行攪拌。將有機物用水洗滌、干燥(Na2SO4)并用柱色譜法純化，用己烷至1∶1己烷/EtOAc梯度洗脫，得到膏狀固體形式的芐酯(1.25g，33％)。LC/MS保留時間＝2.307分鐘。284(MH+)。
步驟3N-(4-乙酰基-5-芐氧基-2-溴-苯基)-乙酰胺將N-溴琥珀酰亞胺(0.756g，4.27mmol)逐份加至N-(4-乙?；?3-芐氧基-苯基)-乙酰胺(1.2g，4.24mmol)在DMF(24ml)中的溶液中并將該反應在室溫下攪拌過夜。將該反應混合物用DCM稀釋，用水洗滌并用MgSO4干燥，得到白色固體(1.03g，67％)。LC/MS保留時間＝2.609分鐘。362/364(MH+)。
步驟4N-(4-乙?；?5-芐氧基-2-溴-苯基)-N-烯丙基-乙酰胺向在氮氣下的N-(4-乙?；?5-芐氧基-2-溴-苯基)-乙酰胺(1.03g，2.85mmol)在無水THF(20ml)中的溶液冷卻至-78℃，然后向其中滴加LDA(2.1ml，2M溶液，4.3mmol)。將該反應在-78℃下繼續(xù)攪拌1小時，然后用烯丙基溴(0.44ml，2.85mmol)猝滅。使反應升溫至室溫并將其繼續(xù)攪拌過夜。將該溶液在EtOAc和水之間進行分配。收集將有機物并用水、鹽水洗滌，然后干燥(MgSO4)。用柱色譜法進行純化，用己烷/EtOAc(1∶1)洗脫，得到白色固體(0.662g，58％)。LC/MS保留時間＝2.703分鐘。402/404(MH+)。
步驟51-(1-乙?；?6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-乙酮將N-(4-乙?；?5-芐氧基-2-溴-苯基)-N-烯丙基-乙酰胺(0.662g，1.65mmol)、P(鄰-甲苯基)3(0.028g，0.092mmol)和三乙胺(0.34ml，2.24mmol)在MeCN(15ml)中的溶液用氮氣充溢，然后向其中加入Pd(OAc)2(0.005g)。將該反應在150℃下微波處理500秒。將該粗品混合物用EtOAc稀釋，用水洗滌并用MgSO4干燥。用柱色譜法進行純化，用己烷/EtOAc(1∶1)洗脫，得到(0.283g，54％)膏狀固體。LC/MS保留時間＝2.742分鐘。322(MH+)，344(MNa+)，280(MH+-Ac)。
步驟61-(1-乙酰基-6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-2，2-二溴-乙酮向1-(1-乙酰基-6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-乙酮(0.283g，0.88mmol)在無水THF(6ml)中的溶液中加入PhNMe3Br3(0.497g，2.3mmol)。將該反應在室溫下攪拌1小時。將該溶液用水稀釋，將有機物用Et2O萃取并用MgSO4干燥，得到粗產物(0.420g，＞90％)。LC/MS保留時間＝2.900分鐘。478/480(MH+)。
步驟71-(1-乙酰基-6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-2-溴-乙酮將粗產物1-(1-乙?；?6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-2，2二溴-乙酮(0.42g，0.88mmol)混懸在THF(4ml)中，然后向其中加入三乙胺(0.12ml，0.89mmol)和(EtO)2P(O)H(0.137ml，0.88mmol)。將其在室溫下攪拌過夜后，將該反應用EtOAc稀釋，用H2O、鹽水洗滌并用MgSO4干燥。在真空下除去溶劑并將粗產物用柱色譜法純化，用己烷/EtOAc(1∶1)洗脫，得到所述產物(0.039g，11％)。LC/MS保留時間＝2.830分鐘。400/402(MH+)。
步驟84-[2-(6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-2-氧代-乙基]-哌嗪-1-甲酸芐酯將化合物1-(1-乙酰基-6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-2-溴-乙酮(0.039g，0.1mmol)、K2CO3(0.019g，0.14mmol)和Cbz-哌啶(0.026ml，0.1mmol)在DMF(2ml)中于室溫下攪拌5小時。在真空下除去溶劑，將殘余物重新溶解在DCM中，用水、鹽水洗滌，用MgSO4干燥。用柱色譜法進行純化，用己烷/EtOAc(3∶2)洗脫，得到所述產物(0.008g，17％)。LC/MS保留時間＝2.236分鐘。498(MH+)。
步驟94-[1-(6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-羰基)-2-二甲基氨基-乙烯基]-哌嗪-1-甲酸芐酯將4-[2-(6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-2-氧代-乙基]-哌嗪-1-甲酸芐酯(0.661g，1.33mmol)在DMFDMA(5ml)中的溶液在100℃下加熱過夜。在真空下除去溶劑，將粗產物用柱色譜法純化，用己烷/EtOAc(1∶1)洗脫，得到所述產物(0.158g，22％)。LC/MS保留時間＝5.33分鐘。553(MH+)。
步驟104-[3-(6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸芐酯將4-[1-(6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-羰基)-2-二甲基氨基-乙烯基]-哌嗪-1-甲酸芐酯(0.158g，0.29mmol)和肼(0.75ml，15.5mmol)在EtOH中的溶液回流1小時，之后該反應已經進行完全。在真空下除去溶劑，將產物用柱色譜法純化，用己烷/EtOAc(1∶1)洗脫，得到灰白色固體(0.0445g，30％)。LC/MS保留時間＝2.713分鐘。522(MH+)。
步驟113-甲基-5-(4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-1H-吲哚-6-酚將4-[3-(6-芐氧基-3-甲基-1H-吲哚-5-基)-1H-吡唑-4-基]-哌嗪-1-甲酸芐酯(0.022g，0.042mmol)在MeOH(2ml)中的溶液除氣并用氮氣充溢。向該溶液中加入10％Pd/C(10mg)，將該混懸液除氣并用氫氣充溢。將反應在室溫、氫氣氛下振搖過夜。將反應用硅藻土過濾并在真空下除去溶劑。將終產物用HCI/Et2O鹽化并用乙醚研磨，得到淡棕色固體(0.0046g，33％)。LC/MS1.495分鐘。298(MH+)。
該實施例54的化合物在Hsp90 FP結合試驗中具有活性‘B’。
以下實施例55-64的含有被溴取代的間苯二酚環(huán)的化合物用類似于流程圖1的方法通過實施例1步驟3的中間體的溴代類似物制備。該溴代中間體根據以下的流程圖6制備流程圖6 步驟11-(2，4-二-芐氧基苯基)-乙酮 將芐基溴(35.6ml，0.3mol)加至2，4-二羥基苯乙酮(15g，0.1mol)和碳酸鉀(41.4g，0.3mol)在乙腈(150ml)中的混懸液中并將該混合物攪拌過夜。濃縮至干后，將殘余物重新混懸在二氯甲烷(100ml)中并用水(100ml)洗滌。將有機相用硫酸鎂干燥并濃縮。用己烷研磨，過濾并真空干燥，得到白色粉末形式的1-(2，4-二-芐氧基苯基)-乙酮(26g)。
LC保留時間為2.83分鐘，[M+H]+333.3(運行時間為3.75分鐘)
步驟21-(2，4-二-芐氧基苯基)-2-溴-乙酮 將苯基三甲基三溴化銨(5.6g，0.015mol)逐份加至攪拌著的1-(2，4-二-芐氧基苯基)-乙酮(5.0g，0.015mol)在四氫呋喃(50ml)中的溶液中并將該混合物攪拌2小時。將該混合物在水(50ml)和乙醚(2×50ml)之間進行分配。將合并的有機相用硫酸鎂干燥并濃縮，得到米黃色固體形式的1-(2，4-二-芐氧基苯基)-2-溴-乙酮，將其不經進一步純化直接使用。
LC保留時間為2.89分鐘，[M+H]+411.2和413.2(運行時間為3.75分鐘)步驟31-(2，4-二-芐氧基-5-溴-苯基)-2-溴-乙酮 將N-溴琥珀酰亞胺(2.67g，0.015mol)加至攪拌著的1-(2，4-二-芐氧基苯基)-2-溴-乙酮粗品(約6.16g，0.015mol)在二甲基甲酰胺(50ml)中的溶液中并將該混合物攪拌18小時。將該混合物濃縮至干，溶解在二氯甲烷(50ml)中并進行洗滌(2×50ml)。將合并的有機相用硫酸鎂干燥并濃縮，得到白色固體形式的1-(2，4-二-芐氧基-5-溴-苯基)-2-溴-乙酮，將其不經進一步純化直接使用。
LC保留時間為2.99分鐘，[M+Na]+511.2，513.2和515.2(運行時間為3.75分鐘)
在下表的實施例中，“Hsp90 IC50”欄中的輸入項是在以下所述的腺苷三磷酸酶試驗中所得的結果
用實施例55的化合物作為中間體制備了以下實施例65-76的化合物。例如，實施例70的化合物如下制備，并且類似地制備了另外的實施例65-69和71-76的化合物
步驟1將溴代中間體偶聯以形成苯乙烯基中間體將4-溴-6-(4-哌嗪-1-基-1H-吡唑-3-基)-苯-1，3-二酚(實施例58)(1當量)、4-氟苯乙烯(3當量)和N，N-二異丙基乙基胺(3當量)在正丁醇(每當量50ml)中的混合物脫氣(3×氮/真空)。向其中加入二氯二(三-鄰甲苯基膦基)鈀(II)(2mol％)并將該混合物在回流下加熱15小時。將混合物用小二氧化硅柱過濾并用二氯甲烷洗滌二氧化硅。
步驟2還原成苯乙基化合物在2小時期間，將乙酸鈉溶液(1.0M在H2O中，3當量)滴加至回流的烯(1當量)和對甲苯磺酰肼(3當量)在1，2-DME中的溶液中，并將其繼續(xù)回流20小時。將該混合物冷卻，傾入水中并用二氯甲烷萃取。將合并的有機萃取物干燥(MgSO4)并真空濃縮。將粗產物用快速色譜法純化。



實施例774-溴-6-{4-[4-(4-甲磺?；?芐基氨基)-哌啶-1-基]-1H-吡唑-3-基}-苯-1，3-二酚
步驟18-[3-(2，4-二-芐氧基-5-溴-苯基)-1H-吡唑-4-基]-1，4-二氧雜-8-氮雜-螺[4.5]癸烷 將1-(2，4-二-芐氧基-5-溴-苯基)-2-溴-乙酮(根據以上的流程圖6制得)(15.56g，31.74mmol)溶解在二甲基甲酰胺(20ml)中。向其中加入1，4-二氧雜-8-氮雜-螺[4.5]癸烷(4.55g，31.74mmol)和三乙胺(4.42ml，31.74mmol)并將該反應在室溫下攪拌1小時。在減壓下除去溶劑。將殘余物用二甲基甲酰胺二甲基縮醛(60ml，452mmol)吸收并在110℃下攪拌16小時。將該反應冷卻至室溫并真空濃縮，得到棕色油狀物。將其溶解在乙醇(100mol)和水合肼(23.8g，476mmol)中并回流16小時。將該反應冷卻至室溫，蒸發(fā)至干并將其用二氧化硅快速色譜法純化。用乙酸乙酯/己烷(1∶1)洗脫產物，將合并的級分蒸發(fā)并將殘余物用乙醚研磨，得到灰白色固體(6.31g)。
LC保留時間為2.79分鐘[M+H]+576.4和578.4(溴裂解模式)(運行時間為3.75分鐘)步驟21-[3-(5-溴-2，4-二羥基-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌啶-4-酮 將8-[3-(2，4-二-芐氧基-5-溴-苯基)-1H-吡唑-4-基]-1，4-二氧雜-8-氮雜-螺[4.5]癸烷(6.55g，11.4mmol)溶解在二氯甲烷(70ml)中并將其冷卻至0℃。向其中滴加三氯化硼(1M，在二氯甲烷中，57ml，57mmol)。將反應升溫至室溫并攪拌30分鐘。然后將其在0℃下用水(50ml)猝滅，升溫至室溫并攪拌3天。用飽和碳酸氫鈉水溶液將反應中和至pH＝7，將該淺棕色沉淀濾出，用水洗滌，然后在真空干燥箱中干燥(2.25g)。
LC保留時間為1.89分鐘[M+H]+352.4和354.2(溴裂解模式)(運行時間為3.75分鐘)步驟34-溴-6-{4-[4-(4-甲磺酰基-芐基氨基)-哌啶-1-基]-1H-吡唑-3-基}-苯-1，3-二酚 將1-[3-(5-溴-2，4-二羥基-苯基)-1H-吡唑-4-基]-哌啶-4-酮(0.1g，0.284mmol)溶解在甲醇(3ml)中。向其中加入三乙胺(0.044ml，0.312mmol)和4-甲磺酰基-芐胺鹽酸鹽(0.069g，0.312mmol)并將該反應在室溫下攪拌1小時。加入過量的硼氫化鈉并當嘶嘶聲停止時在真空下除去溶劑。將殘余物用二氧化硅快速色譜法純化。用甲醇/二氯甲烷(1∶9)對產物進行洗脫。必需用HPLC進行進一步純化。得到白色固體，收率為0.036g。
LC保留時間為1.68分鐘[M+H]+521.3和523.3(溴裂解模式)(運行時間為3.75分鐘)實施例78-88的化合物與實施例80的化合物類似通過步驟5中的適宜胺與步驟4中的中間體反應來制備?！癏sp90 IC50”欄中的輸入項也是在以下所述的腺苷三磷酸酶試驗中所得的結果



生物學結果可以用酵母HSP90作為模型系統來測量HSP90的固有腺苷三磷酸酶活性。該試驗以使用用于測量無機磷酸鹽的孔雀綠為基礎，用于對本文實施例的化合物的HSP90抑制活性進行試驗。
孔雀綠腺苷三磷酸酶試驗材料化學物質是市售可得的最高純度并且所有的水性溶液均用分析純的水制備。因為需要將無機磷酸鹽的污染最小化，所以對該試驗中所用的溶液和裝置應當采取預防措施。在使用前，用重蒸餾水或去離子水對玻璃器皿和pH計進行清洗，在可能的情況下，應當使用塑料器皿。所有的操作均應當戴手套。
(1)Greiner 384-孔(Greiner 781101)或Costar 384-孔平底聚苯乙烯多孔板(VWR)。
(2)(a)100mM Tris-HCl，pH7.4，(b)150mM KCl，(c)6mM MgCl2的試驗緩沖液。在室溫下貯存。
(3)0.0812％(w/v)孔雀綠(M 9636，Sigma Aldrich Ltd.，Poole，UK)。在室溫下貯存。
(4)2.32％(w/v)在沸水中的聚乙烯醇USP(P 1097，Sigma Aldrich Ltd，Poole，UK)(參見注釋1)，使之冷卻并在室溫下貯存。
(5)5.72％(w/v)在6M鹽酸中的鉬酸銨。在室溫下貯存。
(6)34％(w/v)檸檬酸鈉。在室溫下貯存。
(7)100mM ATP，二鈉鹽，特殊品質(47699，Sigma Aldrich)。在-20℃下貯存。
(8)表達酵母HSP90蛋白的大腸桿菌，純度＞95％(參見例如Panaretou等，1998)，在-80℃下以50μL等分試樣貯存。
方法1.用分析純的水將供試化合物稀釋至500μM(DMSO濃度將為2.5％)。將2.5μl這些化合物直接從子板中轉移到試驗板中，得到100μM的最終試驗濃度。為了獲得12個點的IC50值，進行1∶2連續(xù)稀釋以得到從100μM至97.6nM的一系列(2.5％DMSO)的試驗濃度，將2.5μl各濃度的物質轉移到試驗板中。試驗板中的第1行不包含化合物，用作陰性對照。還用不含化合物的另一列作為背景。
2.通過用試驗緩沖液將100mM貯備液稀釋至925μM來制備ATP，并且將5μl稀釋的ATP的等分試樣加至包括對照在內的各孔中(最終試驗濃度為370μM)。
3.向背景列中加入5μl緩沖液。
4.用試驗緩沖液將酶制品稀釋至1.05μM，并向各化合物孔中和向陰性對照行中加入5μl等分試樣。
5.將試劑聚集到孔的底部，用板封閉蓋(plate seal)覆蓋該板并將其在37℃下溫育過夜。
6.早上的第一件事是制備孔雀綠試劑。加入2份孔雀綠溶液、1份聚乙烯醇溶液、1份鉬酸銨溶液和2份分析純的水。
7.反轉以進行混合，然后將其放置約1小時直至顏色從棕色變成金黃色。
8.向每個孔中加入40μl孔雀綠試劑，將其放置5分鐘以使顏色變化。
9.向每個孔中加入5μl檸檬酸鈉試劑(參見注釋2)。
10.用板封閉蓋將其再次覆蓋，并在板振蕩器上振搖至少15分鐘。
11.用合適的讀板器(例如Victor，Perkin Elmer Life Sciences，MiltonKeynes，UK)在620nM下測量吸光度。在這些條件下，對照的吸光度為0.9至1.4，背景的吸光度為0.2-0.35，得到信噪比為～12。由用這些條件所獲得的數據算出的Z′因子為0.6至0.9。
注釋(1)將聚乙烯醇溶解在沸水中有一定的困難，需要攪拌2-3小時。
(2)加入孔雀綠試劑和檸檬酸鈉之間的時間間隔應盡可能短以降低ATP的非酶促水解。加入檸檬酸鈉后，顏色在室溫下穩(wěn)定長達4小時。
(3)可以用Biomek FX Robot(Beckman Coulter)將化合物加至試驗板中?？梢苑奖愕赜肕ultidrop 384分液器(Thermo Labsystems，Basingstoke，UK)將試劑加至板中。
(4)對于時間、蛋白和底物濃度將試驗條件最優(yōu)化以便在保留信噪比差別的同時獲得最小的蛋白濃度。
(5)用以下方程來計算信噪比(S/N)(S-B)/√(S的SD)2+(B的SD)2(6)為了測定HSP90的特定活性，制備一定濃度范圍的無機磷酸鹽(0-10μM)并如上所述在620nm下測量吸光度。由所得的校正曲線來計算特定活性。
將以上試驗中所試驗的化合物歸入兩種活性范圍中的一種，即A＝＜50μM；B＝＞50μM，這些歸類如以上所報告。
熒光偏振試驗熒光偏振{也稱為熒光各向異性}測量溶液中熒光旋轉種類，分子越大，熒光發(fā)射越偏振。當用偏振光對熒光團進行激發(fā)時，所發(fā)射的光也被偏振。分子大小與熒光發(fā)射的偏振成比例。
熒光素-標記的探針-RBT0045864-FAM- 與HSP90結合{全長人、全長酵母或N-末端結構域HSP90}，對各向異性{該探針蛋白復合物的旋轉}進行測量。
向試驗板中加入供試化合物，使其平衡并再次對各向異性進行測量。各向異性的任何變化是由于化合物競爭性結合HSP90從而釋放出探針釋而產生的。
材料化學物質是市售可得的最高純度，所有水性溶液均用分析純的水制備。
1)Costar 96-孔黑色試驗板#39152)(a)100mM Tris pH7.4；(b)20mM KCl；(c)6mM MgCl2的試驗緩沖液。在室溫下貯存。
3)BSA(牛血清白蛋白)10mg/ml(New England Biolabs #B9001S)。
4)20mM在100％DMSO中的探針貯備液濃度。在室溫下、黑暗中貯存。工作濃度為用分析純的水稀釋的200nM并在4℃下貯存。最終試驗濃度為80nM。
5)表達人全長HSP90蛋白的大腸桿菌，純度＞95％(參見例如Panaretou等，1998)并在-80℃下以50μL等分試樣貯存。
方案1)將100μl 1×緩沖液加至孔11A和12A中(＝FP BLNK)2)制備試驗混合物-將所有試劑均置于冰上，因為該探針是光敏性的，所以給盛冰的桶上加蓋。
i.終濃度n·1×Hsp90 FP緩沖液 10ml 1×·BSA 10mg/ml(NEB) 5.0μl5μg/ml·探針200μM 4.0μl80nM·人全長Hsp906.25μl200nM3)向所有其它孔中加入100μl試驗混合物等分試樣4)將板封閉并置于室溫、黑暗下20分鐘以使化合物稀釋板-1×3稀釋系列平衡1)在透明的96-孔v-底板-{#VWR 007/008/257}中，向孔B1至H11中加入10μl 100％DMSO2)向孔A1至A11中加入17.5μl 100％DMSO3)向A1中加入2.5μl化合物。由此得到2.5mM{50×}貯備化合物—約化合物20mM。
4)對孔A2至A10重復進行所述操作。在第11和12行中進行對照操作。
5)將5μl從列A轉移到列B中—不包括第12行。將孔進行混合。
6)將5μl從列B轉移到列C中。將孔進行混合。
7)對列G重復進行所述操作。
8)不向列H中加入任何化合物—這是第0列。
9)這產生了從50μM至0.07μM的1×3個稀釋系列。
10)在孔B12中制備20μl100μM的標準化合物。
11)在第一次溫育后，在FusionTMa-FP讀板器(Packard BioScience，Pangbourne，Berkshire，UK)上對試驗板進行讀數。
12)在第一次讀數后，向第1至10行的各孔中加入2μl稀釋的化合物。在第11行中{提供標準曲線}僅向B11-H11中加入化合物。向孔B12-H12{是陽性對照}中加入2μl 100mM的標準化合物。
13)由零對照和陽性孔計算Z’因子。通常得到0.7-0.9的值。
以上試驗中所試驗的化合物被歸入兩種活性范圍中的一種，即A＝＜10μM；B＝＞10μM，這些歸類如以上所報告。
還用生長抑制試驗對候選的HSP90抑制劑進行了評價用Sulforhodamine B (SRB)試驗評價細胞毒性計算50％抑制濃度(IC50)。
第1天1)用血細胞計數器測定細胞數。
2)用8道多頭移液器(multipipettor)向96-孔微量滴定板的各孔中加入160μl細胞混懸液(3600個細胞/孔或2×104個細胞/ml)。
3)將其于37℃下在CO2培養(yǎng)箱中溫育過夜。
第2天4)制備藥物貯備液，用介質將每種藥物進行連續(xù)稀釋，得到各孔中的終濃度。
5)用多頭移液器將40μl藥物(5×終濃度)一式四份地加至孔中。
6)對照孔位于96孔板的任何一側，向其中加入40μl介質。
7)將板在CO2培養(yǎng)箱中溫育4天(48小時)。
第6天8)將介質倒入洗滌池中并將板緩慢浸入10％冰冷的三氯乙酸(TCA)中。在冰上放置約30分鐘。
9)通過將板浸入自來水浴中并將其翻轉將板用自來水洗滌3次。
10)將其在培養(yǎng)箱中干燥。
11)向96孔板的各孔中加入100μl 0.4％在1％乙酸中的SRB，(除最后一列(右手)外，其是0％對照，即沒有藥物，沒有染料。第一列將是不含藥物但含染料的100％對照)。放置15分鐘。
12)用1％乙酸洗滌4次，洗掉沒有結合的SRB染料。
13)將板在培養(yǎng)箱中干燥。
14)用100μl 10mM Tris堿使SRB溶解并將板在板振蕩器上放置5分鐘。
15)用讀板器在540nm下測定吸光度。計算一式四份的孔的平均吸光度并將其表示為未進行處理的對照孔的值的百分比。
16)用％吸光度值對藥物濃度的對數作圖，確定IC50。
作為舉例說明，實施例2的化合物在SRB生長抑制試驗中產生位于‘A’范圍(＜50μM)內的IC50。
參考文獻為了對本發(fā)明和本發(fā)明所屬領域的現有技術狀態(tài)進行更充分地描述和公開，在以上引用了許多公開物。在以下給出了這些參考文獻的全部引證。在此將這些參考文獻各自全文引入本公開內容作為參考。
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權利要求
1.式(IA)或(IB)的化合物或其鹽、N-氧化物、水合物或溶劑合物 其中Ar是芳基、芳基(C1-C6烷基)、雜芳基或雜芳基(C1-C6烷基)，其中的任何一個均任選地在其芳基或雜芳基部分上被取代，R1是氫或任選取代的C1-C6烷基；R2是氫、任選取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、C1-C6烷基、C1-C6鏈烯基或C1-C6炔基；或者羧基、甲酰胺或羧酸酯基團；且環(huán)A是非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，其中(i)環(huán)碳任選地被取代，和/或(ii)環(huán)氮任選地被取代，取代基是式-(Alk1)p-(Cyc)n-(Alk3)m-(Z)r-(Alk2)s-Q的基團，其中Alk1、Alk2和Alk3是任選取代的C1-C3烷基，Cyc是任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基；m、n、p、r和s獨立地是0或1，Z是-O-、-S-、-(C＝O)-、-SO2-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-NRA-、-C(＝O)NRA-、-NRAC(＝O)-、-SO2NRA-或-NRASO2-，其中RA是氫或C1-C6烷基，且Q是氫或任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基。
2.權利要求1所述的化合物，其中Ar是任選取代的芳基或雜芳基；且環(huán)A是非芳族碳環(huán)或雜環(huán)，其中(i)環(huán)碳任選地被取代，和/或(ii)環(huán)氮任選地被取代，取代基是式-(Alk1)p-(Z)r-(Alk2)s-Q的基團，其中Alk1、Alk2是任選取代的C1-C3烷基，p、r和s獨立地是0或1，Z是-O-、-S-、-(C＝O)-、-SO2-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-NRA-、-C(＝O)NRA-、-NRAC(＝O)-、-SO2NRA-或-NRASO2-，其中RA是氫或C1-C6烷基，且Q是氫或任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基。
3.權利要求1或權利要求2所述的化合物，其中Ar是任選地被進一步取代的2-羥基苯基。
4.權利要求3所述的化合物，其中Ar是在5-位上任選地被進一步取代的2，4-二羥基苯基。
5.權利要求4所述的化合物，其中Ar是在5-位上被氯或溴進一步取代的2，4-二羥基苯基。
6.權利要求4所述的化合物，其中Ar是在5-位上被任選取代的苯基或C1-C6烷基進一步取代的2，4-二羥基苯基。
7.權利要求1所述的化合物，其中Ar是在5-位上被苯乙基進一步取代的2，4-二羥基苯基，所述的苯乙基任選地在其苯環(huán)上被取代。
8.以上權利要求中任一項所述的化合物，其中R1和R2獨立地是氫、甲基、乙基、正-或異-丙基、羥基乙基或芐基。
9.權利要求1至6中任一項所述的化合物，其中R1和R2各自是氫。
10.以上權利要求中任一項所述的化合物，其中環(huán)A是式(IIA)或(IIB)的環(huán) 其中X表示CH或N，且Y表示CH、O、S或NH，其中(i)環(huán)碳任選地被取代，和/或(ii)環(huán)氮任選地被取代，取代基是式-(Alk1)p-(Cyc)n-(Alk3)m-(Z)r-(Alk2)s-Q的基團，其中Alk1、Alk2和Alk3是任選取代的C1-C3烷基，Cyc是任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基；m、n、p、r和s獨立地是0或1，Z是-O-、-S-、-(C＝O)-、-SO2-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NRA-、-SO2NRA-、-NRAC(＝O)-、-NRASO2-或-NRA-，其中RA是氫或C1-C6烷基，且Q是氫或任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基。
11.以上權利要求中任一項所述的化合物，其中環(huán)A是式(IIA)或(IIB)的環(huán) 其中X表示CH或N，且Y表示CH、O、S或NH，其中(i)環(huán)碳任選地被取代，和/或(ii)環(huán)氮任選地被取代，取代基是式-(Alk1)p-(Z)r-(Alk2)s-Q的基團，其中Alk1、Alk2是任選取代的C1-C3烷基，p、r和s獨立地是0或1，Z是-O-、-S-、-(C＝O)-、-SO2-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NRA-、-SO2NRA-、-NRAC(＝O)-、-NRASO2-或-NRA-，其中RA是氫或C1-C6烷基，且Q是氫或任選取代的碳環(huán)或雜環(huán)基。
12.權利要求10或權利要求11所述的化合物，其中所述的任選取代的環(huán)A是式(IIA)的環(huán)，其中X是N且Y是NH或CH。
13.權利要求11所述的化合物，其中所述的任選取代的環(huán)A是式(IIA)的環(huán)，X是N，且Y是-NRA-，其中RA是式-(Alk1)-Q的基團，其中Alk1是C1-C3亞烷基且Q是任選取代的苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、咪唑基或嗎啉基。
14.權利要求13所述的化合物，其中RA是任選取代的芐基。
15.權利要求11所述的化合物，其中所述的任選取代的環(huán)A是式(IIA)的環(huán)，X是N且Y是-NRA-，其中RA是式-(Alk1)p-(Cyc)n-(Alk3)m-(Z)r-(Alk2)s-Q的基團。
16.權利要求15所述的化合物，其中p是1且m各自是1，Cyc是亞苯基。
17.式(IC)或(ID)的化合物或其鹽、N-氧化物、水合物或溶劑合物 其中R是氫、任選的取代基或任選地在苯環(huán)上被取代的苯乙基，且R2、m、r、s、Alk3、Z和Alk2的定義如權利要求1中所述。
18.權利要求17所述的化合物，其中R2是氫。
19.權利要求17或權利要求18所述的化合物，其中R是氯、溴或任選地在苯環(huán)上被取代的苯乙基。
20.權利要求17至19中任一項所述的化合物，其中是0，r是1，且Z是-C(＝O)NH-。
21.在本文中被具體地命名或公開的或者是本文實施例的主題的權利要求1或權利要求2所述的化合物。
22.治療哺乳動物、特別是人的對抑制HSP90活性有響應的疾病或病癥的方法，該方法包括對所述的哺乳動物施用有效量的以上權利要求中任一項所述的化合物。
23.用于人或獸醫(yī)學的權利要求1至21中任一項所述的化合物。
24.用于治療對抑制HSP90活性有響應的疾病或病癥的權利要求1至21中任一項所述的化合物。
25.權利要求1至21中任一項所述的化合物在制備藥物中的用途，所述的藥物用于控制對抑制HSP90活性有響應的疾病或病癥。
26.權利要求22所述的方法、用于權利要求23或權利要求24所述的用途的化合物或權利要求25所述的用途，其中所述的疾病或病癥是癌。
27.權利要求22所述的方法、用于權利要求23或權利要求24所述的用途的化合物或權利要求25所述的用途，其中所述的疾病或病癥是病毒性疾病、移植物排斥反應、炎性疾病、哮喘、多發(fā)性硬化、I型糖尿病、狼瘡、銀屑病、炎癥性腸病、囊性纖維化、與血管生成有關的疾病、糖尿病性視網膜病變、血管瘤或子宮內膜異位癥。
全文摘要
式(IA)或(IB)的化合物或其鹽、N－氧化物、水合物或溶劑合物是HSP90的抑制劑，在對HSP90抑制有響應的疾病如癌的治療中有價值。在各式中，Ar是芳基、芳基(C
文檔編號C07D409/12GK1738804SQ200380108919
公開日2006年2月22日 申請日期2003年12月18日 優(yōu)先權日2002年12月19日
發(fā)明者M·C·貝斯威克, M·J·德萊斯代爾, B·W·迪莫克, E·麥克唐納 申請人:劍橋弗納里斯有限公司, 癌癥研究技術有限公司, 癌癥研究所