專利名稱：用于治療膿毒癥的口服乳鐵蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過單獨或者與標準療法或金屬鰲合劑例如EDTA(乙二胺四乙酸)聯(lián)合口服施用乳鐵蛋白(LF)的組合物來預(yù)防或治療菌血癥、膿毒癥、膿毒性休克或相關(guān)病癥如急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的方法。更具體來說，本發(fā)明涉及通過單獨或者與金屬鰲合劑聯(lián)合或與標準療法聯(lián)合口服施用乳鐵蛋白組合物來預(yù)防性或治療性地治療內(nèi)毒素血癥、革蘭氏陰性或革蘭氏陽性菌血癥、膿毒癥、膿毒性休克或相關(guān)病癥如ARDS的方法。
背景技術(shù)：
膿毒癥被定義為對感染過程的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)。膿毒癥是可以發(fā)生在身體任何部位的細菌感染的結(jié)果。常見的部位是泌尿生殖道、肝臟或膽道、胃腸道及肺臟，罕見的部位是靜脈內(nèi)注射線、外科傷口、褥瘡性潰瘍及褥瘡。通過陽性血培養(yǎng)感染通常被確定，感染可引起休克，稱為膿毒性休克。膿毒性休克更多由醫(yī)院獲得的革蘭氏陰性桿菌引起，并且通常發(fā)生在無免疫應(yīng)答的或患有慢性疾病的患者。但是，大約三分之一的患者由革蘭氏陽性球菌和念珠菌引起。膿毒癥的診斷基于下面四個指標中至少存在兩個心動過速(心率＞90bpm)、換氣過度(呼吸頻率＞20/分鐘或pCO2exp＜35mm Hg)、發(fā)燒(＞38.3℃)或低體溫(＜36℃)，和白細胞增多(＞12,000/μL)或白細胞減少(＜4,000/μL)。
在美國，每年大約有750,000膿毒癥病例，其中至少有225,000病人致命。到目前為止，只有一種藥被批準用于膿毒癥，即重組人體激活蛋白C，其表現(xiàn)出抗血栓形成、抗感染、纖維蛋白溶酶原的特性。
由菌血癥和膿毒癥(SIRS)引起的膿毒性休克的病因?qū)W尚未完全明白。通過感染的有機物引發(fā)的細菌毒素激發(fā)復雜的免疫反應(yīng)。除了內(nèi)毒素以外(從革蘭氏陰性腸桿菌的細胞壁上被釋放的脂多糖類的脂質(zhì)分數(shù))，包含了大量介體包括腫瘤壞死因子、白細胞三烯、脂肪氧化酶、組胺、緩激肽、血清和白細胞介素-2。最初，出現(xiàn)動脈和小動脈血管舒張，降低外周血管對正?；蛟黾拥男呐懦隽康淖枇?，即使心率增加時射血分數(shù)可能降低。隨后，心輸出量可能降低，外周血管阻力可能增加。盡管增加了心輸出量，但是到毛細交換血管的血流被損害，最終引起一個或多個內(nèi)臟器官衰竭。
在實驗動物中，例如，在注射內(nèi)毒素的小鼠中，炎癥介體的氧化作用的突然增加和過度產(chǎn)生伴發(fā)內(nèi)毒素血癥及內(nèi)毒素引發(fā)的死亡。已經(jīng)描述了腹膜內(nèi)注射乳鐵蛋白主要通過與細菌內(nèi)毒素的結(jié)合影響內(nèi)毒素血癥的結(jié)果(Kruzel ML等人，2002)。也描述了非胃腸乳鐵蛋白的其它作用，例如脂多糖類(LPS)激發(fā)前1小時，腹膜內(nèi)注射乳鐵蛋白引起幾種介體的抑制，即在LPS注射后2小時，TNF-(α)相差82％，IL-6相差43％，IL-10相差47％；并且在休克后6小時氧化氮(NO)降低80％。LPS注射前18小時預(yù)防性腹膜內(nèi)注射乳鐵蛋白引起相似的降低，TNF-α降低95％，一氧化氮(NO)降低62％。與此相似，當腹膜內(nèi)注射乳鐵蛋白作為內(nèi)毒素性休克治療的后誘導時，血清中TNF-α和氧化氮顯著降低。
已有文獻報道口服乳鐵蛋白通過成熟腸道沒有任何重大程度的系統(tǒng)性吸收(Heyman M等人，1992；Fransson GB等人，1983；HollowayNM等人，2002)。文獻還認為乳鐵蛋白大部分作用與全身循環(huán)內(nèi)毒素的結(jié)合有關(guān)。例如在Rhesus猴中進行的GLP藥物代謝動力學研究以確定口服重組人乳鐵蛋白(以下簡寫為rhLF)的利用度。標準劑量為4mL/kg，通過口服管飼法給藥。與經(jīng)脈注射rhLF藥物代謝動力學比較。rhLF口服劑量為1000mg/kg?？诜搫┝恳院?，rhLF的血漿濃度較服藥前、內(nèi)源性的乳鐵蛋白值無顯著性提高。計算的重組乳鐵蛋白絕對生物利用度低于0.5％(Fransson GB等人，；Heyman M等人，1992)。
乳鐵蛋白是單鏈金屬結(jié)合糖蛋白，已知許多細胞類型如單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞及刷狀邊緣細胞都有乳鐵蛋白受體。乳鐵蛋白除了是B淋巴細胞和T淋巴細胞基本的生長因子之外，乳鐵蛋白還具有寬泛的與宿主主要的防御機制有關(guān)的功能。例如，有報道乳鐵蛋白激活自然殺傷細胞(NK)，誘導集落刺激活性，激活多形核中性白細胞(PWN)，調(diào)節(jié)粒細胞生成，提高抗體依賴細胞的細胞毒性，刺激使淋巴因子活化的殺傷(LAK)細胞活性，加強巨噬細胞毒性。
先前已經(jīng)將重組人體乳鐵蛋白描述為在各種原核和真核生物體包括曲霉菌(aspergillus)(US專利6,080,559)、牛(US專利5,919,913)、大米、谷物、酵母屬(Sacharomcyes)(US專利6,228,614)和赤壁酵母屬(Pichia pastoris)(US專利6,455,687、6,277,817、6,066,469)中表達之后被純化。還描述了為全長人體乳鐵蛋白的表達的表達系統(tǒng)(例如US專利6,100,054)。在所有的情況中，教導的部分是全長cDNA的表達和在前導肽處理后其N-末端是甘氨酸的完整蛋白的純化。Nuijens等人(US專利6,333,311)單獨描述了人體乳鐵蛋白的變體，但是他們的注意力被局限在乳鐵蛋白N-末端范圍發(fā)現(xiàn)的精氨酸殘基的缺失和替代上了。
本發(fā)明是第一次使用口服乳鐵蛋白組合物作為全身性菌血癥、膿毒癥、膿毒性休克或相關(guān)病癥的治療和預(yù)防。此外，本發(fā)明是第一次使用乳鐵蛋白與金屬鰲合劑聯(lián)合治療全身性菌血癥、膿毒癥、膿毒性休克或相關(guān)病癥。更進一步，本發(fā)明是第一次使用乳鐵蛋白與現(xiàn)有療法聯(lián)合治療全身性菌血癥、膿毒癥、膿毒性休克或相關(guān)病癥。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及預(yù)防性或治療性地治療菌血癥、膿毒癥、膿毒性休克或相關(guān)病癥例如多器官衰竭和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的方法。所述治療方法包括單獨或者與金屬鰲合劑聯(lián)合口服施用乳鐵蛋白組合物。
在可藥用的載體中分散的乳鐵蛋白組合物包括乳鐵蛋白或其中至少N-末端甘氨酸殘基被截短或替代的N-末端乳鐵蛋白變體。乳鐵蛋白是哺乳動物乳鐵蛋白，更特別地，乳鐵蛋白是人或牛的乳鐵蛋白。更進一步，該乳鐵蛋白是重組乳鐵蛋白。N-末端乳鐵蛋白變體包括至少缺乏N-末端甘氨酸殘基或在N-末端甘氨酸殘基發(fā)生替代的變體。該替代可以包括用天然的或人工合成的氨基酸殘基替代N-末端甘氨酸殘基。例如該替代可以包括用正氨基酸殘基或負氨基酸殘基替代N-末端甘氨酸殘基，或者用除了甘氨酸以外的中性氨基酸殘基替代N-末端甘氨酸殘基。其它的N-末端乳鐵蛋白變體包括缺乏一個或多個N-末端殘基的或者在N-末端發(fā)生一個或多個替代的乳鐵蛋白。在具體的實施方案中，N-末端乳鐵蛋白變體占乳鐵蛋白組合物的至少1％，占乳鐵蛋白組合物的至少5％，占乳鐵蛋白組合物的至少10％，占乳鐵蛋白組合物的至少25％，占乳鐵蛋白組合物的至少50％，或者之間的任何范圍。
口服乳鐵蛋白的給藥量為每天大約1mg-大約100g，更優(yōu)選的給藥量為每天大約10mg-大約10g。更具體來說，該組合物是含乳鐵蛋白濃度為大約0.1％-大約100％的溶液、膠囊或片劑。
在進一步的實施方案中，在可藥用的載體中分散的金屬鰲合劑可以與乳鐵蛋白組合物一起施用。優(yōu)選的金屬鰲合劑包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)或[亞乙基雙(氧亞乙基次氮基)]四乙酸(EGTA)。更優(yōu)選的金屬鰲合劑是EDTA。EDTA的給藥量為每天大約0.01μg到大約20g；EDTA與施用的組合物中的乳鐵蛋白的比例為1∶10000-大約2∶1。
本發(fā)明的實施方案是治療菌血癥的方法，所述方法包括給個體口服施用有效量的乳鐵蛋白組合物以提供改善個體菌血癥的步驟。這種改善是減輕膿毒癥、減輕膿毒性休克、減輕器官衰竭，降低發(fā)病率和/或降低死亡率。更具體來說，口服給藥是通過鼻飼管進行的。更進一步，乳鐵蛋白組合物可以與抗生素聯(lián)合給藥。
對于口服給藥來說，抗酸藥與乳鐵蛋白組合物可聯(lián)合給藥?？梢詫⑷殍F蛋白配制成延遲釋放的制劑。更進一步的，乳鐵蛋白組合物可以被配制成在小腸或大腸發(fā)生釋放的制劑。施用的組合物可以是液體制劑、有腸溶包衣的固體制劑或沒有腸溶包衣的固體制劑。
本發(fā)明的另一個實施方案是治療菌血癥的方法，所述方法包括給個體口服一定量的乳鐵蛋白組合物以增加胃腸道中乳鐵蛋白的量，補充個體粘膜免疫系統(tǒng)的步驟。更具體地說，口服是通過鼻飼管進行的。
更進一步，另一個實施方案是提高個體胃腸道粘膜免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給個體口服施用乳鐵蛋白組合物的步驟。乳鐵蛋白刺激胃腸道中的白細胞介素-18。白細胞介素-18刺激免疫細胞的產(chǎn)生或活性。乳鐵蛋白減少促炎細胞因子的產(chǎn)生和活性。
另一個實施方案是預(yù)防處于發(fā)展成菌血癥危險的個體的菌血癥的方法，所述方法包括給個體口服施用有效量的含有乳鐵蛋白的組合物和金屬鰲合劑以預(yù)防或減輕該個體的菌血癥的步驟。更具體地說，口服是通過鼻飼管進行的。處于發(fā)展成菌血癥危險的個體可能是無免疫應(yīng)答的個體。
一個特別的實施方案是降低有菌血癥的個體死亡率的方法，所述方法包括給個體口服施用有效量的乳鐵蛋白組合物以減輕菌血癥從而降低該個體死亡率的步驟。
另一個實施方案是治療個體膿毒病癥的方法，所述方法包括該個體口服施用有效量的乳鐵蛋白組合物以提供改善該個體膿毒病癥的步驟。這種改善是降低循環(huán)細菌的水平、減輕膿毒性休克、減輕器官衰竭、降低發(fā)病率或降低死亡率。
進一步的實施方案是降低患有膿毒癥的個體死亡率的方法，所述方法包括給個體口服施用有效量的乳鐵蛋白組合物以減輕膿毒癥從而降低個體死亡率的步驟。組合物降低了循環(huán)細胞因子的水平，例如，細胞因子選自IL-4、IL-6、TNF-α和IL-10。更進一步，該方法包括乳鐵蛋白組合物與已經(jīng)被批準的膿毒癥的療法如Drotrecogin-α(被激活的)Xigris聯(lián)合給藥。
另一個實施方案是降低患有急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的個體死亡率的方法，所述方法包括給個體口服施用有效量的乳鐵蛋白組合物以減輕ALI或ARDS從而降低個體死亡率的步驟。更進一步，該方法包括將乳鐵蛋白組合物與已經(jīng)被批準的ALI/ARDS的標準療法例如低潮氣容積換氣或表面活性劑聯(lián)合給藥。
前面已經(jīng)相當寬泛地概述了本發(fā)明的特征和技術(shù)優(yōu)勢，以便于可以更好地理解下面對本發(fā)明的詳盡描述。本發(fā)明的另外特征和優(yōu)勢將在下文中描述，形成本發(fā)明權(quán)力要求書的主題。應(yīng)該意識到被公開的概念及特別的實施方案可以被容易地利用作為基礎(chǔ)以改良或設(shè)計其它結(jié)構(gòu)從而執(zhí)行與本發(fā)明相同的目的。還應(yīng)該認識到等效的解釋不與在本發(fā)明附加的權(quán)力要求書中所闡述的內(nèi)容相背離。當考慮與附圖有關(guān)時，被認為是本發(fā)明特點的新特征關(guān)于它的組織和操作方法與進一步的目標和優(yōu)勢一起，將從下面的描述中更好的理解。但是，應(yīng)該清楚地理解，提供每個圖只為了圖解和描述的目的，并且不打算作為本發(fā)明限制的定義。
附圖簡述為了更完全地理解本發(fā)明，參照下面與附圖結(jié)合的描述。


圖1比較以不同劑量和給藥方案口服或靜脈內(nèi)施用rhLF對降低在脂多糖(LPS)引發(fā)的內(nèi)毒素血癥模型中的小鼠死亡率的作用。
圖2顯示膿毒癥中死亡率的降低和關(guān)鍵細胞因子的減少。
發(fā)明詳述對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，顯而易見的是，對本申請中被公開的發(fā)明實施各種方案并進行改良都沒有超出本發(fā)明的實質(zhì)和范圍。
正如在此使用的，當在權(quán)力要求書和/或說明書中與術(shù)語“包含”一起使用時，“一個”的使用意味著“一個”，但它也與“一個或多個”、“至少一個”、“一個或多于一個”意思一致。更進一步，術(shù)語“有”、“包括”和“包含”可以互換，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員認知這些術(shù)語是公開的最終術(shù)語。
本文所用術(shù)語“抗菌劑”被定義為抑制微生物生長、不對宿主造成損害的物質(zhì)。例如抗生素、抗真菌劑及消毒劑。
本文所用術(shù)語“抗生素”被定義為抑制微生物生長、不對宿主造成損害的物質(zhì)。例如抗生素可以抑制細胞壁合成、蛋白質(zhì)合成、核酸合成，或改變細胞膜功能?？赡鼙皇褂玫目股氐姆诸惏?但不限于此)大環(huán)內(nèi)酯類(如紅霉素)、青霉素類(如乙氧萘胺青霉素)、頭孢菌素類(如先鋒霉素)、carbepenems(如亞胺硫霉素，阿蘇胺)、其它的β-內(nèi)酰胺抗生素、β-內(nèi)酰胺抑制劑(如舒巴坦)、oxalines(如linezolid)、氨基糖苷類(如慶大霉素)、氯霉素、磺胺類藥物(如新諾明)、糖肽類(如萬古霉素)、喹啉類(如環(huán)丙沙星)、四環(huán)素類(如二甲胺四環(huán)素)、褐霉素、甲氧芐胺嘧啶(磺胺增效劑)、甲硝唑、氯林肯霉素、甲單孢酸、利福霉素(如利福平)、鏈陽性菌素類(如喹奴普汀和達福普汀)、脂蛋白(如達帕托霉素)、多烯類(如兩性霉素B)、唑類(如氟康唑)、和棘球白素類(如caspofungin acetate)。本文所用術(shù)語“發(fā)病率”是正在發(fā)病的狀態(tài)或情況。此外，“發(fā)病率”也指發(fā)病的比例，例如，與具體人群有關(guān)的病人數(shù)或病例數(shù)。
本文所用術(shù)語“菌血癥”被定義為個體血液中有細菌感染病灶或細菌。
本文所用術(shù)語“趨化因子”是指涉及細胞例如吞噬細胞和淋巴細胞的移動和活化的小細胞因子。本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到趨化因子在炎癥和免疫應(yīng)答過程中起著重要作用。
本文所用術(shù)語“細胞因子”是指影響其它細胞行為(例如刺激或抑制細胞的增殖)的細胞制造的蛋白質(zhì)。例如，由淋巴細胞制造的細胞因子常被稱為淋巴因子或白細胞介素。本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到術(shù)語細胞因子是文獻中所使用的涉及影響其它細胞行為的細胞制造的蛋白質(zhì)的普通術(shù)語。
本文所用術(shù)語“有效量”或“治療有效量”是涉及使疾病的癥狀或情況得到改善或糾正的量。
本文所用術(shù)語“內(nèi)毒素”涉及不被任意釋放到周圍介質(zhì)的細菌毒素。
文所用術(shù)語“內(nèi)毒素血癥”涉及血液中內(nèi)毒素的存在。
本文所用術(shù)語“革蘭氏陰性菌”被定義為用革蘭氏染色有紅著色的被分類的細菌。革蘭氏陰性菌有薄壁的細胞膜，細胞膜由單層肽聚糖和外層的脂多糖、脂蛋白及磷脂組成。典型的生物體包括但不限于由埃希氏桿菌屬(Escgerichia)、志賀氏桿菌屬(Shigella)、愛德華菌屬(Edwardsiella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、變形桿菌屬(Proteus)、摩根菌屬(Morganella)、普羅威斯登菌屬(Providencia)、耶森氏菌屬(Yersinia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、Buttlausella、西地西菌屬(Cedecea)、愛文氏菌屬(Ewingella)、克羅非菌屬(Kluyvera)、塔特姆菌屬(Tatumella)和拉恩氏菌屬(Rahnella)組成的腸桿菌科。其它示例性的不屬于腸桿菌科的革蘭氏陰性菌包括但不限于綠膿假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、Cepacia、加德納氏菌屬(Gardenerella)、Vaginalis和不動桿菌屬(Acinetobacter)。
本文所用術(shù)語“革蘭氏陽性菌”涉及用革蘭氏染色成有蘭著色的被分類的細菌。革蘭氏陽性菌有厚的細胞膜，細胞膜由多層肽聚糖和外層的胞壁酸組成。典型的生物體包括但不限于此金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、凝固酶陰性葡萄球菌、鏈球菌(streptococci)、糞鏈球菌(enterococci)、棒狀桿菌屬(corynebacteria)及桿菌屬(Bacillus)。
本文所用術(shù)語“無免疫應(yīng)答的”被定義為當暴露于病原體時，個體具有減少一個或多個對感染正常防御的生理機制的預(yù)先存在情況。無免疫應(yīng)答的情況可能是由于免疫系統(tǒng)缺陷或功能紊亂或者是由于提高對炎癥敏感性的其它因素，例如免疫抑制因子。即使這樣一種范疇考慮到了評價的概念性的基礎(chǔ)，但是有炎癥的無免疫應(yīng)答的個體常不完全適合一組或其它組。身體防御機制中的多個缺陷可能被影響。例如，無免疫應(yīng)答的可能起因于存在于中心線的或由于靜脈內(nèi)注射毒品而造成的其它型的損傷；或者由繼發(fā)的惡性腫瘤、營養(yǎng)不良、或已經(jīng)被其它感染因子如結(jié)核病、流感、金黃色葡萄球菌或性傳播疾病例如梅毒或肝炎所感染。
本文所用術(shù)語“乳鐵蛋白”或“LF”是指天然的或重組的乳鐵蛋白。天然的乳鐵蛋白可以通過哺乳動物奶或其它自然來源的初乳的純化獲得。重組乳鐵蛋白(rLF)可以通過重組表達或在有遺傳改變的動物體、植物、真菌、細菌或其它原核或真核生物屬直接產(chǎn)生，或通過化學合成的方式生產(chǎn)。
本文所用術(shù)語“乳鐵蛋白組合物”是指含有乳鐵蛋白、部分或局部乳鐵蛋白、N-末端乳鐵蛋白變體或其組合的組合物。
本文所用術(shù)語“死亡率”是正在臨終的或引起死亡的狀態(tài)。此外，死亡率也可以指給出的人群死亡比率或死亡人數(shù)的比例。
本文所用術(shù)語“發(fā)病率”是生病的狀態(tài)。此外，發(fā)病率也可以指給出的人群病人或疾病病例的生病率或比例。
本文所用術(shù)語“金屬鰲合劑”是指與金屬結(jié)合的化合物。可用于本發(fā)明的金屬鰲合劑包括二價金屬鰲合劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、[亞乙基雙(氧亞乙基次氮基)四乙酸](EGTA)、1，2-雙(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸(BAPTA)、羥基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)或其鹽。
本文所用術(shù)語“N-末端乳鐵蛋白變體”是指其中至少N-末端甘氨酸已被截短和/或替代的乳鐵蛋白。N-末端乳鐵蛋白變體也包括但不限于一個或多個N-末端氨基酸殘基的缺失和/或替代，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個N-末端氨基酸殘基的缺失和/或替代等。因此，N-末端乳鐵蛋白變體包括至少1～16個N-末端氨基酸殘基的缺失或截短和/或替代。至少乳鐵蛋白N-末端甘氨酸的缺失和/或替代調(diào)節(jié)與完全長度乳鐵蛋白相同的生物學作用和/或可以增強乳鐵蛋白生物學活性，例如，通過刺激各種細胞因子(如IL-18、MIP-3α、GM-CSF或IFN-γ)的產(chǎn)生、通過抑制各種細胞因子(如IL-2、IL-4、IL-5、Il-6、IL-10和TNF-α)、通過減輕膿毒癥、減輕膿毒性休克、減輕器官衰竭、降低發(fā)病率和/或降低死亡率。
本文所用術(shù)語“口服給藥”包括經(jīng)口、頰、腸、直腸或胃內(nèi)給藥。
本文所用術(shù)語“可藥用的載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌和抗真菌制劑、等張的和吸收延遲制劑等。在本領(lǐng)域用于藥物活性物質(zhì)的介質(zhì)和制劑的使用是眾所周知的。除了在任何傳統(tǒng)的介質(zhì)或制劑的范圍內(nèi)與本發(fā)明的帶菌者或細胞相矛盾外，期待在治療組合物中使用，也可以將補充的活性成分組合到該組和物中。
本文所用術(shù)語“預(yù)防”涉及減小、降低或抑制發(fā)展成疾病狀態(tài)或與疾病狀態(tài)或進展有關(guān)的參數(shù)，或其它不正常的或有害的情況的危險。
本文所用術(shù)語“膿毒癥”被定義為對感染過程的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，其宿主免疫系統(tǒng)嚴重混亂不能預(yù)防炎癥介質(zhì)從局部病灶到全身循環(huán)的廣泛“溢出”。
本文所用術(shù)語“膿毒性休克”是全身性炎癥反應(yīng)導致重要器官功能衰竭(如在ARDS中的肺衰竭)的膿毒癥的結(jié)果。
本文所用術(shù)語“個體”意味著根據(jù)此處描述的方法口服乳鐵蛋白組合物的任何哺乳類動物個體。專業(yè)技術(shù)人員認識到哺乳類動物個體包括但不限于此人類、猴子、馬、豬、牛、狗、貓、大鼠和小鼠。在具體的實施方案中，用本發(fā)明的方法治療人類個體。在進一步的實施方案中，該個體處在發(fā)展成菌血癥或膿毒癥的危險。因此，該個體可以或不可以認知他們的疾病狀態(tài)或潛在的疾病狀態(tài)，并且可以或不可以知道他們是治療的需要(治療性治療或預(yù)防性治療)。
本文所用術(shù)語“醫(yī)治”和“治療”涉及個體施用治療有效劑量的重組人體乳鐵蛋白組合物，以便于個體的疾病有所改善。改善是與菌血癥、膿毒癥、膿毒性休克或它們的后果有關(guān)的癥狀的改善或糾正。改善是可以觀察到的或可以衡量的改善，例如，降低循環(huán)細菌的水平、降低死亡率、降低發(fā)病率、減輕器官衰竭的發(fā)展、減少住院天數(shù)、減少或消減重癥監(jiān)護如重癥監(jiān)護病房的天數(shù)、或者減少或消減支持療法如機械呼吸器或PaO2/FiO2比例的使用。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到治療可以改善疾病的情況，但是不可以完全治愈該疾病。
A.乳鐵蛋白根據(jù)本發(fā)明所使用的乳鐵蛋白能夠從自然來源例如但不限于哺乳動物奶通過分離和純化獲得。乳鐵蛋白優(yōu)選為哺乳動物乳鐵蛋白，如?；蛉巳殍F蛋白。在被優(yōu)選的實施方案中，利用已熟知的、在本領(lǐng)域已被使用的基因工程技術(shù)重組產(chǎn)生乳鐵蛋白，如在基因改變的動物、植物或真核細胞重組表達或直接產(chǎn)生，或化學合成。見例U.S.專利5,571,896；5,571,697及5,571,691，在此引用作為參考。
在某些方面，本發(fā)明提供了具有超過天然LF和/或rLF的生物活性的乳鐵蛋白變體，例如刺激和/或抑制細胞因子或趨化因子的能力提高。特別是，本發(fā)明提供了其中至少一個N-末端甘氨酸殘基已經(jīng)被替代和/或截短的乳鐵蛋白變體。N-末端乳鐵蛋白變體可以自然存在或可通過一個或多個氨基酸的替代或缺失而被修改。
通過乳鐵蛋白水解和/或多聚核苷酸的表達能夠產(chǎn)生缺失的變體，編碼一個被截短的乳鐵蛋白，正如在U.S.專利6,333,311中所描述的，在此引用作為參考。
替代變體或取代變體通常包含在蛋白質(zhì)內(nèi)一個或多個位點上的一個氨基酸與另一個氨基酸的交換，替代可能是保守的，即一個氨基酸被另一個相似形狀和電荷的氨基酸所替代。保守的替代在本領(lǐng)域被熟知并且包括，例如，丙氨酸變成絲氨酸；精氨酸變成賴氨酸；天冬酰胺變成谷氨酰胺或組氨酸；天冬氨酸變成谷氨酸；半胱氨酸變成絲氨酸；谷氨酰胺變成天冬氨酸；谷氨酸變成天冬氨酸；甘氨酸變成脯氨酸；組氨酸變成天冬酰胺或谷氨酰胺；異亮氨酸變成亮氨酸或纈氨酸；亮氨酸變成纈氨酸或異亮氨酸；賴氨酸變成精氨酸；蛋氨酸變成亮氨酸或異亮氨酸；苯丙氨酸變成酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；絲氨酸變成蘇氨酸；蘇氨酸變成絲氨酸；色氨酸變成酪氨酸或苯丙氨酸；纈氨酸變成異亮氨酸或亮氨酸。
在進行這樣的改變中，可以考慮氨基酸的親水指數(shù)。使蛋白質(zhì)具有相互生物功能的氨基酸親水指數(shù)的重要性是本領(lǐng)域通常已知的(Kyte and Doolittle，1982)。氨基酸相關(guān)的親水特征有助于所得蛋白的二級結(jié)構(gòu)，該二級結(jié)構(gòu)又限定蛋白質(zhì)與其它分子例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等的相互作用。
基于親水性和電荷特征的，指定每個氨基酸的親水指數(shù)(Kyte和Doolittle，1982)。這些是異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯基丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、蛋氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
本領(lǐng)域公知某些氨基酸可以被其它具有相似親水指數(shù)或分數(shù)的氨基酸所替代，并且仍然產(chǎn)生具有相似的生物活性的蛋白質(zhì)，例如，仍然獲得生物功能相當?shù)牡鞍踪|(zhì)。在進行這樣的變化中，優(yōu)選親水指數(shù)在±2范圍內(nèi)的氨基酸替代物，特別優(yōu)選親水指數(shù)在±1范圍內(nèi)的氨基酸替代物，更特別優(yōu)選親水指數(shù)在±0.5范圍內(nèi)的氨基酸替代物。
本領(lǐng)域也理解像氨基酸的替代物在親水性的基礎(chǔ)上可以被有效地制得。U.S.專利4,554,101在此引用作為參考，聲明蛋白質(zhì)最大的局部平均親水性，正如由相鄰氨基酸的親水性所控制，與蛋白質(zhì)的生物性能有關(guān)。正如U.S.專利4,554,101所詳述的，下面的親水性值指定給氨基酸殘基精氨酸(+3.0)、賴氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、絲氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、蛋氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、異亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯基丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。
更進一步，一個氨基酸能夠被另一個具有相似親水性值的氨基酸所替代，并且仍獲得生物性和免疫性相當?shù)牡鞍踪|(zhì)，是被理解的。在這樣的變化中，優(yōu)選親水性值在±2的氨基酸替代物，特別優(yōu)選在±1范圍內(nèi)的氨基酸替代物，更特別優(yōu)選在±0.5范圍內(nèi)的氨基酸替代物。
因此，在本發(fā)明中，替代的變體或取代物可以用標準的突變技術(shù)產(chǎn)生，例如，象在U.S.專利5,220,007；5,284,760；5,354,670；5,366,878；5,389,514；5,635,377；5,789,166和6,333,311公開的定點誘變在此引用作為參考。設(shè)想至少N-末端甘氨酸殘基可以用20個天然存在的氨基酸中的任何一個替換或替代，例如，陽性電荷氨基酸(精氨酸、賴氨酸或組氨酸)、中性氨基酸(丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸)和/或陰性電荷氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)。更進一步，期望在N1～N16范圍內(nèi)的任何氨基酸殘基可以被替換或替代。設(shè)想只要蛋白質(zhì)保持刺激各種細胞因子(如IL-18，MIP-3α，GM-CSF或IFN-γ)產(chǎn)生的生物學的和/或功能的活性，至少到16個之多的N-末端氨基酸殘基可以被替換或替代，通過抑制各種細胞因子(如IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10或TNF-α)，通過減輕膿毒癥、減輕膿毒性休克、減輕器官衰竭、降低發(fā)病率、和/或降低死亡率。因此，本發(fā)明的N-末端乳鐵蛋白變體被認為是乳鐵蛋白功能相等物。
在功能相等物術(shù)語中，本領(lǐng)域技術(shù)人員很好地理解，“生物功能相等”的蛋白的固有定義是這樣的概念，當保持一個分子具有相等的生物活性的可接受水平和/或提高乳鐵蛋白分子的生物學活性時，對在分子被定義的部分的范圍內(nèi)所進行的變化數(shù)量有一個限制。因此，生物學功能相等物在此被定義為那些被選擇的氨基酸(或密碼子)可以被替代的蛋白質(zhì)。功能活性被定義為乳鐵蛋白刺激或抑制各種細胞因子或趨化因子和/或減輕膿毒癥、減輕膿毒性休克、減輕器官衰竭、降低發(fā)病率、和/或降低死亡率。
更進一步，N-末端氨基酸殘基可以用一個被修飾過的、和/或不常見的氨基酸所替代。一個示范表(但不限于此)，在下面提供了被修飾過的和/或不常見的氨基酸。


在乳鐵蛋白(乳鐵蛋白組合物)的制備中，N-末端乳鐵蛋白變體(缺失和/或替代)的存在和相關(guān)比例可以利用標準方法，通過Edman降解確定N-末端氨基酸序列來確定。N-末端乳鐵蛋白變體的相關(guān)比例包括乳鐵蛋白組合物的至少1％，乳鐵蛋白組合物的至少5％，乳鐵蛋白組合物的至少10％，乳鐵蛋白組合物的至少25％，乳鐵蛋白組合物的至少50％或之間的任何范圍。
在該方法中，蛋白質(zhì)與異硫氰酸苯酯(PITC)反應(yīng)，PITC在堿性條件下與氨基末端的氨基酸殘基反應(yīng)形成苯基硫代氨基甲?；苌?PTC-蛋白)。然后，三氟乙酸裂解掉第一個氨基酸作為anilinothialinone衍生物(ATZ-氨基酸)和為下一個降解循環(huán)留下新的氨基酸末端。
N-末端乳鐵蛋白變體的百分比通過利用丹磺?；磻?yīng)更精確地確定。簡言之，利用丹磺酰氯在堿性條件下(pH10)與蛋白質(zhì)反應(yīng)，蛋白質(zhì)被丹磺?；?。在丹磺?；螅瑢⒎磻?yīng)混合物被干燥成小球狀，然后，在6N鹽酸中完全水解。用在線熒光計與由已知的丹磺酰化氨基酸組成的標準物比較，通過RP HPLC確定N-末端氨基酸的比例。
B.藥物組合物本發(fā)明被描寫成包含乳鐵蛋白組合物的組合物，乳鐵蛋白組合物分散在藥物載體中。包含在本發(fā)明組合物中的乳鐵蛋白包括乳鐵蛋白或其中至少N-1端甘氨酸殘基被截短或替代N-末端乳鐵傳遞蛋變體。更具體而言，N-末端乳鐵蛋變體占組合物的至少1％，占組合物的至少5％，占組合物的至少10％，占組合物的至少25％，占組合物的至少50％或之間的任何范圍。
此外，該組合物包括與分散在藥物載體中的金屬鰲合劑聯(lián)合的乳鐵蛋白。因此，本發(fā)明被描寫成具有或不具有分散在藥物載體中的金屬鰲合劑的乳鐵蛋白組合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員明白兩個組合物(例如，單獨的乳鐵蛋白或與金屬鰲合劑組合的乳鐵蛋白)都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，并且能夠被交換使用，取決于所期望的反應(yīng)類型。設(shè)想金屬鰲合劑加到乳鐵蛋白組合物中提高了金屬離子的螯合，并且因此增強了免疫系統(tǒng)或提高了乳鐵蛋白的效果。
可以與乳鐵蛋白聯(lián)合使用的金屬鰲合劑包括二價金屬鰲合劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、[亞乙基雙(氧亞乙基次氮基)四乙酸](EGTA)、1，2-雙(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸(BAPTA)、羥基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)或其鹽。更優(yōu)選EDTA與乳鐵蛋白聯(lián)合使用。
進一步依照本發(fā)明，適合施用的本發(fā)明組合物在可接受的藥物載體中被提供，有或無惰性稀釋劑。該載體應(yīng)該是可吸收的，并且包括液體、半固體如糊劑、或固體載體。除了在任何傳統(tǒng)的介質(zhì)、劑型、稀釋劑或載體對接收者或?qū)ζ渲邪慕M合物的療效有損害的情況，為了用于實踐本發(fā)明的方法，在可施用的組合物中它的使用是合適的。載體或稀釋劑的例子包括脂肪、油類、水、鹽溶液、脂類、脂質(zhì)體類、樹脂類、粘合劑類、填充劑等，或其組合。
依照本發(fā)明，該組合物以任何方便和可應(yīng)用的方式與載體組合，例如，通過溶液、懸浮液、乳化作用、附加劑、膠囊、吸收劑等。這些方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是常規(guī)的。
在本發(fā)明的具體實施方案中，該組合物與半固態(tài)或固態(tài)載體完全結(jié)合或混合?；旌夏軌蛞匀魏畏绞竭M行，如研磨。為了使該組和物治療活性免受損失例如在胃中變性，在混合過程中可以加入穩(wěn)定劑。用于該組合物穩(wěn)定劑的例子包括緩沖劑，氨基酸如甘氨酸和賴氨酸，糖類如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇等，蛋白水解酶抑制劑等。此外，設(shè)想二價金屬鰲合劑，如EDTA也能夠被用來穩(wěn)定本發(fā)明組合物。更優(yōu)選地，對于口服組合物來說，穩(wěn)定劑也可以包括胃酸分泌的拮抗劑。
與半固態(tài)或固態(tài)載體組合的口服的組合物可以被進一步配制成硬或軟殼的明膠膠囊、片劑或丸劑。更優(yōu)選將明膠膠囊、片劑或丸劑進行腸包衣。腸溶包衣預(yù)防該組和物在胃或上部腸的變性，此處pH為酸性。見，如，U.S.專利5,62,9001。緊接著到達小腸，其pH堿性溶解包衣并允許乳鐵蛋白通過專門的細胞例如腸上皮細胞和Peyer’spatch M細胞釋放和吸收。
在另一個實施方案中，粉末組合物與有或無穩(wěn)定劑液體載體例如水或鹽溶液合并。
本發(fā)明中乳鐵蛋白的量可以為大約1g-大約100g，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物包括乳鐵蛋白的濃度為大約0.0001％-大約30％。更優(yōu)選地，乳鐵蛋白以10mg～10g的量口服。乳鐵蛋白可以包括乳鐵蛋白或其中至少N-1末端甘氨酸殘基被截短和/或被替代的N-末端乳鐵蛋白變體。
更優(yōu)選，本發(fā)明的組合物還包含金屬鰲合劑，例如但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、[亞乙基雙(氧亞乙基次氮基)四乙酸](EGTA)、1，2-雙(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸(BAPTA)、羥基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)或其鹽。組合物中金屬鰲合劑的量可以為大約1ng-大約20g。優(yōu)選的金屬鰲合劑是EDTA。
在配制時，溶液以與制劑相容的方式施用，量是治療的有效量以導致癥狀改善或糾正。制劑以各種劑型如可吞咽的溶液、藥物釋放膠囊等容易地施用。劑量的變化可以發(fā)生取決于被治療的個體的情況。在任何情況下，負責給藥的人可為個體決定合適的劑量。
C.治療和/或預(yù)防根據(jù)本發(fā)明，任何上述所描述的藥物載體提供的組合物對懷疑或患有菌血癥、膿毒癥、膿毒性休克或后遺癥的個體口服給藥。這些情況可能由革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌或其它感染因子如身體任何病灶內(nèi)的念珠菌所引起，并且處于發(fā)展成或已經(jīng)發(fā)展成全身炎癥反應(yīng)綜合征。在考慮幾個因素，如局部效果、藥效學、吸收、代謝、傳遞方式、年齡、體重、疾病嚴重程度和對治療的反應(yīng)的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠決定給予個體治療和/或預(yù)防有效劑量的組合物?？诜M合物包括經(jīng)口的、頰部的、腸的或胃內(nèi)的施用。
菌血癥可以由革蘭氏型陰性菌或革蘭氏陽性菌引起。革蘭氏型陰性菌具有薄壁細胞膜，細胞膜由單層肽聚糖和外層的脂多糖、脂蛋白及磷脂組成。典型的革蘭氏型陰性生物體包括但不限于由埃希氏桿菌屬、志賀氏桿菌屬、愛德華菌屬、沙門氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷白氏桿菌屬、腸桿菌屬、哈夫尼菌屬、沙雷氏菌屬、變形桿菌屬、摩根菌屬、普羅威斯登菌屬、耶森氏菌屬、歐文氏菌屬、Buttlausella、西地西菌屬、愛文氏菌屬、克羅非菌屬、塔特姆菌屬和拉恩氏菌屬組成的腸桿菌科。其它示例性的不屬于腸桿菌科的革蘭氏陰性菌包括但不限于綠膿假單孢菌、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌、伯克霍爾德氏菌屬、Cepacia、加德納氏菌屬、Vaginalis和不動桿菌屬。革蘭氏陽性菌細胞膜厚，細胞膜由多層肽聚糖和外層的胞壁酸組成。典型的革蘭氏陽性生物體包括金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、鏈球菌、糞鏈球菌、棒狀桿菌屬及桿菌屬。
例如，菌血癥可以通過感染的口腔組織的外科處理或常規(guī)的牙科處理、感染的下部尿道的導管插入術(shù)、膿腫的切開和引流、留置的器械的移殖，特別是IV和心臟內(nèi)導管、尿?qū)Ч芎驮殳浶g(shù)器械和導管引起。感染的原發(fā)位通常在肺、泌尿生殖道(GU)或胃腸道(GI)，或著軟組織包括褥瘡性潰瘍患者的皮膚。慢性病和無免疫應(yīng)答的個體較健康個體，更常見革蘭氏型陰性菌。另外，這些無免疫應(yīng)答的個體可以發(fā)展成由需氧桿菌、厭氧菌和真菌引起的血流感染。
對于膿毒性休克易感因素包括糖尿病；肝硬變；白細胞減少的狀態(tài)，特別是那些與下面的腫瘤或用細胞毒素因子治療有關(guān)的狀態(tài)；在尿道、膽道、或胃腸的先期感染；器械侵入包括導尿管、引流管、和其它外來的材料；和先前用抗生素、皮質(zhì)激素、呼吸機治療。膿毒性休克更常見于新生兒、大于35的個體、妊娠婦女、和那些由下面的疾病或醫(yī)生的治療引起的并發(fā)癥導致的嚴重的無免疫應(yīng)答的的人。
在進一步的實施方案中，該組合物與抗酸藥聯(lián)合施用。因此，在口服施用該組合物之前或同時或之后，施用抗酸藥。在施用該組合物之前或之后立即施用抗酸藥可以有助于降低乳鐵蛋白在消化道中的滅活的程度。合適的抗酸藥的例子包括但不限于碳酸鈉、氧化鎂、氫氧化鎂、碳酸鈣、三硅酸鎂、碳酸鎂和氫氧化鋁凝膠。
根據(jù)本發(fā)明，上面所描述的方法被用于菌血癥、膿毒癥、膿毒性休克、相關(guān)病癥或其后果的預(yù)防。在具體的實施方案中，紊亂以由于抗生素使用和相繼的內(nèi)毒素的釋放引起的內(nèi)毒素血癥的危險為特點，同明確鑒別菌血癥一樣。
此外，另一個實施方案是對處于發(fā)展成菌血癥危險的個體預(yù)防菌血癥的方法，包括給個體施用足夠劑量的乳鐵傳蛋白組合物以預(yù)防個體菌血癥的步驟。設(shè)想乳鐵蛋白組合物不僅對患有菌血癥的個體具有治療的益處，而且對那些處于發(fā)展成菌血癥、膿毒癥、膿毒性休克和相關(guān)情況危險的個體還具有預(yù)防特性。處于危險的個體可以或不可以認知他們的疾病狀態(tài)或潛在的疾病狀態(tài)，可以或不可以知道他們是治療的需要。
處于發(fā)展成菌血癥、膿毒癥、膿毒性休克和/或相關(guān)情況危險的人被考慮為無免疫應(yīng)答的的和/或慢性疾病。在細菌暴露時，無免疫應(yīng)答的個體，有一個先存在的條件，其降低了一個或多個對炎癥正常防御的機制。無免疫應(yīng)答的的情況可以是由于免疫系統(tǒng)缺陷或功能紊亂或增加對感染敏感性的其它因素，如免疫抑制劑。
預(yù)防性地，設(shè)想乳鐵蛋白組合物能夠降低下面的任何一個(指標)循環(huán)細菌水平；個體發(fā)展成膿毒癥、膿毒性休克、器官衰竭的危險、和減少與菌血癥有關(guān)的發(fā)病率和死亡率。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，施用有效量的該組合物，以減少、降低、抑制或排除發(fā)展成菌血癥的危險和減小已經(jīng)存在的菌血癥、膿毒癥、膿毒性休克或相關(guān)情況的影響。組合物中乳鐵蛋白的量可以為大約1mg-100g?？诜慕M合物含乳鐵蛋白的量每天在大約10mg～10g范圍內(nèi)為優(yōu)選。組合物含乳鐵蛋白的量每天在大約1mg～50g范圍內(nèi)更優(yōu)選。更優(yōu)選，本發(fā)明的組合物還包含金屬鰲合劑，例如但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、[亞乙基雙(氧亞乙基次氮基)四乙酸](EGTA)、1，2-雙(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸(BAPTA)、羥基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)或其鹽。組合物中金屬鰲合劑的量可以為大約0.01μg～20g。優(yōu)選的金屬鰲合劑為EDTA?？诜慕M合物中，EDTA和乳鐵蛋白的比例更優(yōu)選為大約1∶10,000-大約2∶1。
治療方案也可以變化，并且取決于細菌感染和其后果發(fā)展的進程。對正存在的細菌感染的陽性確定、抗生素的使用和治療配劑的已知效果和毒性(如果有)的基礎(chǔ)上，臨床醫(yī)生最適合決定最好的治療方案以使用。應(yīng)用rhLF的指導原則是在發(fā)展成菌血癥、膿毒癥、膿毒性休克的最早期體征時給予該治療以減輕菌血癥的進展并且降低由于膿毒癥和膿毒癥性休克造成的器官損傷的程度。
改善是任何能夠觀察到的或可衡量的改善。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員認識到治療可以改善病人或個體的情況，但不會是疾病的完全治愈。在某些方面，施用有效劑量的該組合物以減少、降低、抑制或廢除循環(huán)中的細菌水平。在進一步方面，改善可以包括下面任何一種情況，例如，降低循環(huán)細菌的水平、減輕膿毒癥的進展、減輕膿毒性休克的進展、減輕器官衰竭的進展、降低與菌血癥有關(guān)的發(fā)病率和降低與菌血癥有關(guān)的死亡率(死亡)。因此，施用乳鐵蛋白以后，如果上述任何情況改善，則乳鐵蛋白的量被認為是有效劑量。此外，施用乳鐵蛋白也將減輕膿毒癥、膿毒性休克和與其有關(guān)的其它情況的進展。
在某些方面，施用有效劑量的該組合物以減少、降低、抑制或廢除膿毒癥或膿毒性休克的嚴重性。在進一步方面，改善可以包括下面任何一種情況，例如，降低死亡率、降低發(fā)病率、減輕器官衰竭進展、減少住院天數(shù)、減少或排除重癥監(jiān)護如在重癥監(jiān)護病房的天數(shù)、減少或排除支持療法的使用如機械呼吸機或減少后遺癥如ARDS的發(fā)生。基線上的器官衰竭的患者的存活和預(yù)防及器官衰竭的逆轉(zhuǎn)也被評估。因此，施用乳鐵蛋白以后，如果上述任何情況改善，則乳鐵蛋白的量被認為是有效劑量。
在某些方面，施用有效劑量的該組合物以減少、降低、抑制或消除ALI或ARDS的嚴重性。在進一步方面，改善可以包括下面任何一種情況，例如，降低死亡率、減輕器官衰竭進展、減少住院天數(shù)、減少或排除減少或排除重癥監(jiān)護如在重癥監(jiān)護病房的天數(shù)、減少或排除支持療法的使用如機械呼吸機或PaO2/FiO2比例。因此，施用乳鐵蛋白以后，如果上述任何情況改善，則乳鐵蛋白的量被認為是有效劑量。
在具體實施方案中，該組合物可以單劑量或多劑量給藥。單劑量可以每天施用1次、或1天多次或1周多次。在進一步的實施方案中，乳鐵蛋白以系列劑量給藥。該系列劑量可以每天施用1次、或1天多次，1周1次或1周多次。在進一步的實施方案中，乳鐵蛋白通過鼻飼管連續(xù)注入給藥。
本發(fā)明的進一步實施方案是治療菌血癥、膿毒癥、膿毒性休克、相關(guān)病癥或其后果的方法，包括通過增加胃腸道中乳鐵蛋白的量補充粘膜免疫系統(tǒng)的步驟。優(yōu)選口服乳鐵蛋白。
此外，進一步的實施方案是提高個體胃腸道粘膜免疫應(yīng)答的方法，包括該個體口服本發(fā)明的組合物的步驟。該組合物包含單獨的乳鐵蛋白或與其它金屬鰲合劑如EDTA結(jié)合的乳鐵蛋白。設(shè)想通過乳鐵蛋白刺激細胞因子和/或趨化因子提高免疫應(yīng)答。細胞因子的例子包括白細胞介素-18和胃腸道中的GM-CSF，已知其可以增加免疫細胞或刺激免疫細胞的產(chǎn)生。例如，白細胞介素-18增加了自然殺傷細胞或T淋巴細胞。在具體的實施方案中，白細胞介素-18增加了(IL-18)CD4+、CD8+、CD3+細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知IL-18是一個Th1細胞因子，其與白細胞介素-12和白細胞介素-2協(xié)同作用于淋巴細胞IFN-γ產(chǎn)生的刺激。其它的細胞因子或趨化因子也可以被增加，例如但不限于IL-12、IL-1b、MIP-3α、MIP-1α或IFN-γ。其它的細胞因子或酶可以被抑制，例如但不限于IL-12、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、TNF-α或基質(zhì)金屬蛋白酶。進一步預(yù)期乳鐵蛋白抑制TNF-α的產(chǎn)生，其抑制炎癥中的細胞。還設(shè)想繼口服乳鐵蛋白后，乳鐵蛋白刺激白細胞介素-18和Th1反應(yīng)，其抑制原炎癥細胞因子，如IL-12、IL-4、IL-6、IL-8和TNF-α。
本發(fā)明中的乳鐵蛋白組合物還能導致細胞因子和趨化因子的抑制。細胞因子包括但不限于白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-5(IL-5)、白細胞介素-10(IL-10)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)。更進一步，乳鐵蛋白組合物還能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的產(chǎn)生。
在進一步的實施方案中，細胞因子，例如，白細胞介素-18或粒細胞/巨噬細胞菌落刺激因子能刺激免疫細胞的產(chǎn)生或活性。免疫細胞包括但不限于T-淋巴細胞、自然殺傷細胞、NK-T細胞、巨噬細胞、樹枝狀細胞、和多形核白細胞。更具體地，多形核白細胞是嗜中性粒細胞，T-淋巴細胞選自CD4+、CD8+和CD3+T細胞。
此外，設(shè)想口服與金屬鰲合劑如EDTA聯(lián)合口服給藥的乳鐵蛋白增加了被掩蔽的金屬離子的數(shù)量，并且因此增強了乳鐵蛋白在提高免疫系統(tǒng)方面的效果。
D.聯(lián)合治療為了提高本組合物的效果，期待將本發(fā)明的這些組合物和方法與在治療或預(yù)防菌血癥、膿毒癥、膿毒性休可和相關(guān)病癥的已知的藥劑效果結(jié)合，例如，治療細菌感染的已知藥劑如抗生素、治療膿毒癥的已知藥劑如α-Drotrecogin(被激活的)和治療炎癥的藥劑。在一些具體的實施方案中，預(yù)期傳統(tǒng)的療法或藥劑包括但不限于此，藥理學的治療藥劑與本發(fā)明的組合物組合。
本發(fā)明的組合物可以先于、同時和/或在其它藥劑間隔幾分鐘～幾周之后。在實施方案中，本發(fā)明的組合物和其它藥劑分別應(yīng)用在細胞、組織或生物體，通常保證重要的時間周期不超過每次給藥之間的時間，以便于該組合物和藥劑仍然能夠?qū)毎⒔M織或生物體發(fā)揮有利的聯(lián)合作用。
該組合物和一種或多種藥劑的各種聯(lián)合方案被應(yīng)用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道本發(fā)明的組合物和藥劑能夠以任何順序或聯(lián)合方式施用。在其它方面。一種或多種藥劑可以被基本上同時、或大約幾分鐘到幾小時、到幾天、到幾周之內(nèi)施用和任何其可推論的的范圍，施用該組合物之前和/或之后施用。
對于細胞、組織或生物體，該組合物的施用可以依照心血管療法服藥的總的治療方案，要考慮其毒性，如果有。期望治療周期被重復作為必要。在具體的實施方案中，設(shè)想各種附加的藥劑可以與本發(fā)明聯(lián)合應(yīng)用。
藥理學治療制劑和施用的方法、劑量等為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知(見例如“Physicians Desk Reference”、Goodman & Gilman’s“The Pharmacological Basis of Therapeutics”、“Remington’sPharmaceutical Sciences”、和“The Merck Index，EleventhEdition”在此引用作為相關(guān)部分的參考)，并且可以依照此處的公開內(nèi)容與本發(fā)明結(jié)合。劑量的變化必然要取決于被治療的個體的情況而發(fā)生。在任何情況下，負責給藥的人員將為每一個個體的個體決定合適的劑量，并且這種個體的確定是在本領(lǐng)普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍之內(nèi)。
可以被用于本發(fā)明的藥理學治療劑非限制性實例包括抗菌劑、抗膿毒癥劑、抗炎劑、抗生素/溶解纖維蛋白制劑、血凝素、抗心律不齊劑、抗高血壓劑、血管加壓藥，或治療代謝性酸中毒的藥物。本發(fā)明的某些方面，抗菌劑，例如，抗生素被用于與本發(fā)明的組合物結(jié)合，可以被使用的特異性抗生素的例子包括但不限于紅霉素、乙氧萘胺青霉素、頭孢唑啉、亞胺硫霉素、噻肟單酰胺霉素、慶大霉素、新諾明、萬古霉素、環(huán)丙沙星、二甲氧苯二氨嘧啶、利福平、甲硝唑、林肯梅素、替考拉寧、假單孢酸、阿奇梅素、甲基紅霉素、氧氟沙星、鹽酸洛氟沙星、諾氟沙星、萘啶酸、帕氟沙星、培氟沙星、氨氟沙星、加替沙星、莫西沙星、格米沙星、依諾沙星、氟羅沙星、二甲胺四環(huán)素、linezolid、替馬氟沙星、甲苯磺酸托氟沙星、克林沙星、舒巴坦、克拉維酸、兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、復方酮康唑和制霉菌素?？股氐钠渌樱缭赨.S.4,642,104所列出的在此處引用作參考的那些抗生素，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，將容易建議他們自身?？鼓摱景Y的藥物包括但不限于Drotrecogin-α(被激活的)。用于ALI和ARDS的藥物包括但不限于表面活性劑的肺內(nèi)滴注，和白細胞三烯改良劑?？寡装Y藥物包括但不限于非類固醇類抗炎癥藥物(例如，萘普生、布洛芬、施樂寶)和類固醇類抗炎癥藥物(例如，糖皮質(zhì)激素)。
可以被用于本發(fā)明的非藥理學干預(yù)的非限制性實例包括支持療法如膿毒癥和膿毒性休克中的器官支持，及ALI和ARDS中的低潮氣容積換氣方案。
E.實施例下面的實施例被包括以確定本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該意識到下面的實施例中所公開的技術(shù)代表了由本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的技術(shù)，以在本發(fā)明的實踐中行使良好功能并且因此能被認為制定了優(yōu)選的模式用于實踐中。然而，依照現(xiàn)在的內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該意識到在被公開的具體的實施方案中可以進行許多改變，并且仍然獲得同樣或相似的沒有背離本發(fā)明的實質(zhì)和范圍的結(jié)果。
實施例1脂多糖引發(fā)的小鼠膿毒性休克—模型描述在本實驗中，確定了脂多糖的劑量與實驗動物死亡率之間的關(guān)系。使用多組C57BL/6J、18±1g小鼠，每組10只。在用D(+)-半乳糖胺(20mg/小鼠)預(yù)治療后，動物立即接受不同劑量的大腸桿菌脂多糖(LPS，30、20、15和10ng/小鼠，靜脈內(nèi)注射)和載體(鹽水，0.2ml/小鼠，靜脈內(nèi)注射)。每12小時記錄死亡率，計3天。表2說明20～30ng/小鼠的LPS導致100％死亡率，15ng/小鼠的LPS導致50％死亡率。
表2脂多糖引發(fā)的膿毒癥的鼠科動物模型治療途徑 劑量N每12小時記錄的死亡數(shù) ％死亡率0-1212-2424-3636-4848-6060-72總計載體IV 0.2ml/小鼠 10 0 0 0 0 0 0 0 0(鹽水)LPS IV 30ng/小鼠 10 10 0 0 0 0 0 10 100LPS IV 20ng/小鼠 10 8 2 0 0 0 0 10 100LPS IV 15ng/小鼠 10 1 2 2 0 0 0 6 50LPS IV 10ng/小鼠 10 0 1 1 0 0 0 2 20實施例2靜脈內(nèi)注射rhLF在鼠科動物膿毒癥的LPS模型中的效果在用脂多糖(來自大腸桿菌的脂多糖，20ng/動物的LD100，靜脈內(nèi)注射)加半乳糖胺(20mg/動物，靜脈內(nèi)注射)攻擊前60分鐘和攻擊后10分鐘，靜脈內(nèi)注射載體和測試物質(zhì)(rhLF)，每組8只C57BL/6J雄性小鼠，體重18～20g，如表3所示，RhLF將脂多糖引發(fā)的死亡率降低了38％。
表3靜脈內(nèi)注射rhLF在脂多糖引發(fā)的膿毒癥中的效果治療途徑劑量N死亡數(shù)保護載體 IV 0.2ml/小鼠×28 8--RhLF IV 500μg/小鼠×2 8 538％實施例3口服rhLF在鼠科動物膿毒癥的脂多糖模型中的效果在用脂多糖加半乳糖胺攻擊后1、6和12小時，口服或靜脈內(nèi)注射重組人體乳鐵蛋白，劑量為5mg/小鼠和1.5mg/鼠(PO)，1.5mg/鼠和0.5mg/鼠(IV)。圖1說明了口服rhLF提供了與靜脈內(nèi)注射rhLF相似的保護。
實施例4口服rhLF對脂多糖引發(fā)的膿毒性休克的劑量依賴性保護在4組、每組10只實施例1中所描述的小鼠中，用脂多糖和半乳糖胺引發(fā)膿毒性休克。然后，這群鼠在施用脂多糖后1小時、6小時和12小時接受用管飼法施用安慰劑或施用3個劑量的rhLF(每劑量為1.5mg、5mg或10mg)中的1個劑量。如表4所示，口服rhLF對脂多糖引發(fā)的死亡率提供了劑量依賴性保護。
表4RhLF在脂多糖引發(fā)的膿毒癥中提供劑量依賴性保護治療劑量N死亡數(shù)保護載體 -- 10 10 --RhLF 1.5mg/劑10 6 40％RhLF 5mg/劑 10 5 50％RhLF 10mg/劑 10 4 60％實施例5通過不同方案口服rhLF對脂多糖引發(fā)的膿毒性休克的效力在5組、每組8-10只實施例1中所描述的小鼠中，用脂多糖和半乳糖胺引發(fā)膿毒性休克。這群小鼠在以4個不同方案中的一個接受管飼法施用安慰劑或5mg/劑rhLF。如表5所示，當預(yù)防性或治療性施用時和在所有被測試的方案中，口服rhLF對脂多糖引發(fā)的死亡率提供了保護。
表5以不同方案使用的RhLF對脂多糖引發(fā)的膿毒癥提供保護治療方案*N死亡數(shù)保護載體+1，+6，+12 10 10 --RhLF+1，+6，+12 10 5 50％RhLF-1，+1，+6，+12 -8 3 63％RhLF-+1，+12 8 6 25％RhLF-+1，+4，+8，+12 8 4 50％RhLF+6，+12 8 6 25％*注在與LPS劑量相對的小時施用安慰劑/RhLF。
實施例6RhLF在菌血癥鼠科動物模型中的保護效果使用得自雄性或雌性小鼠的ICR，每組10只，重22±2g。每只動物用在0.5ml、含5％粘蛋白的心-腦浸液培養(yǎng)基中被懸浮的大腸桿菌(ATCC 25922；1-3×105CFU/小鼠)進行腹膜內(nèi)接種。
在給予大腸桿菌后1、6、12和24小時，施用載體或rhLF(10mg/鼠)，在7天內(nèi)測量死亡率。如表6所示，相對于安慰劑治療的動物，rhLF治療的動物顯示死亡率下降10％。
表6rhLF的保護效果治療劑量N死亡數(shù)保護載體 5mL/kg×6 10 10 0％RhLF 10mg/小鼠 10 910％實施例7RhLF在菌血癥的亞致死鼠科動物模型中的保護效果使用得自雄性或雌性鼠的ICR，每組10只，重22±2g。每只動物用在0.5ml、含5％粘蛋白的心-腦浸液培養(yǎng)基中被懸浮的亞致死量的大腸桿菌(ATCC 25922)進行腹膜內(nèi)接種。
測試物質(zhì)，rhLF或載體，用下面的劑量和給藥時間表給藥1組細菌接種后@1、6、12和24小時，10mg/小鼠；2組細菌接種后@1、6、12、24、48和72小時，10mg/小鼠；3組載體對照，細菌接種后@1、6、12、24、48和72小時給藥。N＝10組；全部數(shù)量＝30只動物。在隨后的7天內(nèi)每天記錄死亡率。
實施例8與抗生素聯(lián)合的rhLF對菌血癥的亞致死鼠科動物模型的保護效果使用得自雄性或雌性鼠的ICR，每組10只，重22±2g。每只動物用在0.5ml、含5％粘蛋白的心-腦浸液培養(yǎng)基中被懸浮的亞致死量的大腸桿菌(ATCC 25922)進行腹膜內(nèi)接種。動物用卡那霉素抗生素治療，劑量100mg/kg/天。
測試物質(zhì)，rhLF或載體，用下面的劑量和給藥時間表給藥1組細菌接種后@1、6、12和24小時，10mg/小鼠；2組細菌接種后@1、6、12、24、48和72小時，10mg/小鼠；3組載體對照，細菌接種后@1、6、12、24、48和72小時給藥。N＝10組；全部數(shù)量＝30只動物。在接著的7天內(nèi)每天記錄死亡率。
實施例9口服rhLF對膿毒癥的狒狒模型的保護效果在預(yù)期的、隨機的、安慰劑對照的研試驗，在72小時的時間內(nèi)測定口服rhLF的功效，在處于抗生素治療下長期用設(shè)備監(jiān)視的輸注活的大腸桿菌的雄性狒狒中進行。
在施用抗生素時預(yù)防性地施用rhLF。狒狒隨機接受安慰劑或口服rhLF，劑量100、200或400mg/kg/天。
主要的結(jié)果測量是死亡率。較重要的發(fā)病率被考慮作為次要終點。施用rhLF的安全性也被監(jiān)視。
治療的藥理學效果通過測量重要的細胞因子濃度的變化，即在多個治療時間點收集的血清中的IL-18、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α的濃度變化來進行評價。
實施例10rhLF與EDTA聯(lián)合用藥時在菌血癥、膿毒癥和膿毒性休克中的保護效果重組人體乳鐵蛋白與EDTA聯(lián)合用藥，重量比為1∶1，口服或靜脈內(nèi)注射劑量為5和1.5mg rhLF/小鼠及5和1.5mg EDTA/小鼠(PO)，和1.5和0.5mg/小鼠以及1.5和0.5mg EDTA/小鼠(IV)，分別在用脂多糖加半乳糖胺攻擊后1、6和12小時給予。記錄3天內(nèi)的死亡率。相對于載體治療組死亡率大于或等于50％顯示重要意義的保護。
實施例11使用rhLF治療菌血癥和膿血癥安全性的臨床研究選擇患者用于該研究，基于菌血癥癥狀的存在—發(fā)燒＞101°F(38.3℃)、寒戰(zhàn)、身體不適、腹痛、惡心、嘔吐、腹瀉、焦慮、呼吸短促和精神錯亂。最可能的細菌感染是由于葡萄球菌、假單胞菌屬、嗜血桿菌屬和大腸桿菌。繼發(fā)的膿毒性休克通常出現(xiàn)在無免疫應(yīng)答的或慢性病患者。
下面指標至少出現(xiàn)2個癥狀時做膿毒癥的診斷心動過速(心率＞90bpm)、換氣過度(呼吸頻率＞20/分或pCO2ex＜35mmHg)、發(fā)燒(＞38℃)或低體溫(＜36℃)，以及白細胞增多(＞12,000/μL)或白細胞減少(＜4,000/μL)。
在使用抗生素治療潛在的感染時、或任何其它以后的、癥狀出現(xiàn)時最早的可能時間預(yù)防性地施用重組人體乳鐵蛋白?；颊唠S機地接受安慰劑或口服rhLF 3天，劑量為100、200或400mg/kg/天的逐漸增加的劑量，治療方案從最低劑量開始，在進展到下一個劑量前評價施用的安全性。對于不能口服攝取劑量的患者，使用鼻飼管以同樣的劑量水平輸注96小時。
本研究的主要結(jié)果是對菌血癥和膿毒癥的患者使用rhLF的安全性的評價。
實施例12臨床研究顯示rhLF對膿毒癥的保護作用—劑量范圍選擇患者用于該研究，基于菌血癥癥狀的存在—發(fā)燒＞101°F(38.3℃)、寒戰(zhàn)、身體不適、腹痛、惡心、嘔吐、腹瀉、焦慮、呼吸短促和精神錯亂。最可能的細菌感染是由于葡萄球菌、假單胞菌屬、嗜血桿菌屬和大腸桿菌。繼發(fā)的膿毒性休克通常出現(xiàn)在無免疫應(yīng)答的或慢性病患者。
下面指標至少出現(xiàn)2個癥狀時做膿毒癥的診斷心動過速(心率＞90bpm)、換氣過度(呼吸頻率＞20/分或pCO2exp＜35mmHg)、發(fā)燒(＞38℃)或低體溫(＜36℃)，以及白細胞增多(＞12,000/μL)或白細胞減少(＜4,000/μL)。
在使用抗生素治療下面的感染時、或任何其它以后的時間、癥狀出現(xiàn)時最早的可能時間預(yù)防性地使用重組人類乳鐵蛋白?；颊唠S機地接受安慰劑或口服rhLF 3天，劑量為100、200或400mg/kg/天。對于不能口服攝取劑量的患者，使用鼻飼管以同樣的劑量水平輸注96小時。
主要結(jié)果量度標準是死亡率。較重要的發(fā)病率作為次要點，rhLF使用的安全性也被監(jiān)視。病人至少被隨訪90天。
治療的藥理學效果通過測量重要的細胞因子濃度的變化，即在多種治療時間點收集的血清中的IL-18、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α。
實施例13臨床研究顯示rhLF對菌血癥和膿毒癥的保護作用-三期研究選擇患者用于該研究，基于菌血癥癥狀的存在—發(fā)燒＞101°F(38.3℃)、寒戰(zhàn)、身體不適、腹痛、惡心、嘔吐、腹瀉、焦慮、呼吸短促和精神錯亂。最可能的細菌感染是由于葡萄球菌、假單胞菌屬、嗜血桿菌屬和大腸桿菌。繼發(fā)的膿毒性休克通常出現(xiàn)在無免疫應(yīng)答的或慢性病患者。
下面指標至少出現(xiàn)2個癥狀時做膿毒癥的診斷心動過速(心率＞90bpm)、換氣過度(呼吸頻率＞20/分或pCO2exp＜35mmHg)、發(fā)燒(＞38℃)或低體溫(＜36℃)，以及白細胞增多(＞12,000/μL)或白細胞減少(＜4,000/μL)。
在隨機的、雙盲的、多劑量的、安慰劑對照的多中心研究中，重組人體乳鐵蛋白被用于患有菌血癥和/或膿毒癥的重癥監(jiān)護病房(ICU)患者。患者隨機接受安慰劑或使用rhLF以400mg/kg/天口服。對于不能口服攝取劑量的患者，使用鼻飼管以同樣的劑量水平輸注96小時。
主要結(jié)果量度標準是對于被治療的病人其所有原因的28天的死亡率。后期的效果變量包括在隨訪的28天時間內(nèi)時間對死亡，和患者在解除隨訪時的狀態(tài)(到90天)。較重要的發(fā)病率被作為次要點考慮。(多器官功能紊亂評分(MODS)和與膿毒癥有關(guān)的器官衰竭評價(SOFA))?；€上的器官衰竭的病人的存活及器官衰竭的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)也被評價?；颊弑浑S訪至少90天。
實施例14臨床研究顯示rhLF/Xigris組合對菌血癥和膿毒癥的保護作用-二期研究選擇患者用于該研究，基于菌血癥癥狀的存在現(xiàn)—發(fā)燒＞101°F(38.3℃)、寒戰(zhàn)、身體不適、腹痛、惡心、嘔吐、腹瀉、焦慮、呼吸短促和精神錯亂。最可能的細菌感染是由于葡萄球菌、假單胞菌屬、嗜血桿菌屬和大腸桿菌。繼發(fā)的膿毒性休克通常出現(xiàn)在無免疫應(yīng)答的或慢性病患者。
下面指標至少出現(xiàn)2個癥狀時做膿毒癥的診斷心動過速(心率＞90bpm)、換氣過度(呼吸頻率＞20/分或pCO2exp＜35mmHg)、發(fā)燒(＞38℃)或低體溫(＜36℃)，以及白細胞增多(＞12,000/μL)或白細胞減少(＜4,000/μL)。
在隨機的、雙盲的、多劑量的、安慰劑對照的多中心研究中，重組人體乳鐵蛋白被用于患有菌血癥和/或膿血癥的重癥監(jiān)護病房(ICU)患者?；颊唠S機接受Xigris(Drotrecogin-α，激活的)@24μg/kg/小時注入96小時，或施用rhLF以400mg/kg/天速率與XigrisR浸劑@24μg/kg/小時一起注入96小時。對于不能口服攝取rhLF劑量的患者，使用鼻飼管以同樣的劑量水平輸注96小時。
主要結(jié)果量度標準是對于被治療的病人其所有原因的28天的死亡率。后期的效果變量包括在隨訪的28天時間內(nèi)時間對死亡，和患者在解除隨訪時的狀態(tài)(到90天)。主要的發(fā)病率被作為次要點考慮。(多器官功能紊亂評分(MODS)和與膿血癥有關(guān)的器官衰竭評價(SOFA))?；€上的器官衰竭的病人的存活及器官衰竭的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)也被評價?；颊弑浑S訪至少90天。
實施例15臨床研究顯示rhLF在ARDS中的保護作用-二期研究在隨機的、對照的研究中，每個患者被隨機化到12mL/kg和6mL/kg換氣治療組以及rhLF或安慰劑之間。RhLF臂是安慰劑對照和雙盲的。
RhLF具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)性能，具有先前的研究提出的在ARDS預(yù)防中的效果。該研究被設(shè)計為了檢測在急性肺損傷或ARDS發(fā)作后早期口服rhLF是否將降低死亡率和發(fā)病率。
患者隨機接受安慰劑或以400mg/kg/天速率口服rhLF。
對于不能口服攝取劑量的患者，使用鼻飼管以同樣的劑量水平輸注96小時。
主要的結(jié)果測量是死亡率。較重要的發(fā)病率被考慮作為次要終點。患者被隨訪至少90天。
實施例16膿毒癥死亡率的降低與關(guān)鍵的細胞因子在脂多糖引發(fā)的膿毒癥中口服rhLF的保護作用與已知的細胞因子調(diào)節(jié)器有關(guān)。用脂多糖(20ng靜脈內(nèi)注射)+半乳糖胺治療小鼠。與脂多糖激發(fā)有關(guān)的，通過管飼法動物接受安慰劑(-1，+1，+6，+12小時)或rhLF(5mg/劑)。盡管在24小時內(nèi)全部死亡，但死亡率在72小時被測定。循環(huán)的細胞因子在脂多糖激發(fā)后45分鐘用ELISA方法測定。細胞因子群是每組4只動物?？傆?8只動物(12只安慰劑，16只rhLF)被生存隨訪。1-后部的(1-tailed)p-值比較安慰劑組和rhLF組動物。對于個體的細胞因子值以平均值顯示。與較早期的實驗一致，rhLF治療的動物顯示死亡率顯著降低59％。另外，觀察到IL-4，IL-6和IL-10的循環(huán)水平的降低(圖2)，先前報告所有的Th2細胞因子在膿毒癥的病理生理學中起作用。
實施例17與L006相對的L005抗膿毒癥的活性用脂多糖引發(fā)的膿毒癥的小鼠模型比較N-1截短百分比不同的三個批次的rhLF的生物學活性。對各組10只C57BL/6J、重18-20g雄性鼠用脂多糖(20ng/鼠靜脈內(nèi)注射)+半乳糖胺(20mg/鼠靜脈內(nèi)注射)激發(fā)后1，6和12小時口服次安慰劑或rhLF(5mg/劑)。在72小時內(nèi)每12小時記錄死亡率。如表7所示，不同批次的rhLF，隨著N-1截短的寬變化濃度，對脂多糖引發(fā)的死亡率都提供了相似的保護。
表7三種不同rhLF制劑的抗膿毒癥的效果

實施例18小鼠口服rhLF的生物利用度的缺乏定制合成的14C標記的rhLF(Perkin-Elmer生命科學)對CD-1小鼠口服給藥以確定蛋白吸收的程度。用14C-rhLF給小鼠接種，收集血和組織樣本如下表8所示。
表8給小鼠使用14C-rhLF的劑量

在所規(guī)定的時間，小鼠被施用無痛致死術(shù)，收集血和組織用于分析。在含有蛋白酶抑制劑的緩沖液中使組織勻化以防止蛋白降解。將血加工成血漿。血漿和組織勻漿的樣本在閃爍計數(shù)器上計數(shù)，在聚丙烯酰胺凝膠電泳法(PAGE)色譜上運轉(zhuǎn)以通過大小分離樣本成分。凝膠內(nèi)容物在被暴露在磷成像屏幕的膜上被吸收，以探測14C標記的帶。該屏幕能夠探測到500cpm大小。所記錄的計數(shù)值在下面的表9中顯示。
雖然計數(shù)被在血漿和組織中發(fā)現(xiàn)，這與已知的口服rhLF后其在胃和小腸中的降解是一致的。沒有探測到在聚丙烯酰胺凝膠電泳法(PAGE)凝膠上見到的完整的rhLF，確認在探測的范圍之內(nèi)，沒有rhLF蛋白在口服后被吸收。
表9口服后14C標記的rhLF的分布

實施例19人類口服rhLF生物利用度的缺乏5組獨立的健康人類個體口服重組人體乳鐵蛋白。這5組人群按6∶1的比例隨機分為rhLF和安慰劑組(總計使用了35名個體)。劑量在表10中顯示。
表10人類個體用藥劑量和劑量方案

收集1組從0到48小時血樣，或2組和5組1和7天的劑量間隔。使用被確認有效的ELISA法確定血漿乳鐵蛋白。乳鐵蛋白濃度值顯示對于rhLF和安慰劑治療的個體來說，個體之間高變異性。既然ELISA確定內(nèi)源性的和重組人體乳鐵蛋白，口服以后的rhLF的吸收程度只能夠?qū)φ諆?nèi)源性乳鐵蛋白的產(chǎn)生和逆轉(zhuǎn)的個體之間的差異估計。乳鐵蛋白的學業(yè)水平與施用給出的劑量的rhLF之間沒有關(guān)系是明顯的，重復每天用藥在第7天的乳鐵蛋白的水平?jīng)]有可測量到的增加。基于這些數(shù)據(jù)，估計rhLF口服生物利用度＜0.5％。(Mojaverian P，等人)引用的參考文獻在該說明書中提到的所有專利和出版物是本發(fā)明所屬的領(lǐng)域技術(shù)人員水平的象征。所有專利和出版物在此引用作為參考對于同樣的范圍似乎個體的出版物被特別地和個性地指明以被引用作為參考。
US 5,571,691US 5,571,697US 5,571,896US 5,629,001Kruzel ML，等人.Clin Exp Immunol 2002；13025-31Heyman M and Desjeux J-F，J Pediatr Gastroenterol Nutr1992；1548-57Frasson GB等人，Nutr Res 1983；3373-84Holloway NM，等人，Am J Vet Res 2002 Apr；63(4)476-8Mojaverian P.等人，Proceedings of the Annual Meeting ofthe American association of Pharmaceutical Scientists，2003。
盡管本發(fā)明和它的優(yōu)點已被詳細描述，但是應(yīng)該理解各種變化、替代物和改變能夠在此進行而沒有背離由權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明實質(zhì)和范圍。而且，本申請的范圍不限制于在說明書中描述的方法、機理、制備、物質(zhì)成分、手段、方法和步驟的具體的實施方案。作為本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員將容易意識到本發(fā)明的公開內(nèi)容、方法、機理、制備、物質(zhì)成分、手段、方法或步驟，目前存在或以后被發(fā)展的充分地執(zhí)行相同的功能或取得實質(zhì)性的相同的結(jié)果，因為在此描述的相關(guān)的實施方案可以根據(jù)本發(fā)明被利用。據(jù)此，權(quán)利要求書意欲包括它們的范圍如方法、機理、制備、物質(zhì)成分、手段、方法或步驟。
權(quán)利要求
1.治療菌血癥的方法，所述方法包括給個體口服施用有效劑量的乳鐵蛋白組合物的以提供該個體的菌血癥的改善的步驟。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述改善是減輕膿毒癥。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述改善是減輕膿毒性休克。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述改善是減輕器官衰竭。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述改善是降低個體發(fā)病率。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述改善是降低個體死亡率。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述乳鐵蛋白組合物分散在可藥用載體中。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述乳鐵蛋白是哺乳動物乳鐵蛋白。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述乳鐵蛋白是人或牛乳鐵蛋白。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述乳鐵蛋白是重組的乳鐵蛋白。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述乳鐵蛋白組合物包含N-末端乳鐵蛋白變體。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述N-末端乳鐵蛋白變體至少缺乏N-末端甘氨酸殘基。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述N-末端乳鐵蛋白占乳鐵蛋白組合物的至少1％-至少50％。
14.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括聯(lián)合施用抗酸劑與所述乳鐵蛋白組合物。
15.權(quán)利要求1的方法，其中乳鐵蛋白的給藥量為大約1mg/天-大約100g/天。
16.權(quán)利要求1的方法，其中乳鐵蛋白的給藥量為大約10mg/天-大約10g/天。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所施用的組合物是液體制劑。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所施用的組合物是固體制劑。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所施用的組合物是具有腸溶包衣的固體制劑。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述口服施用是通過鼻飼管進行的。
21.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括施用分散在可藥用載體中的金屬鰲合劑。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述金屬鰲合劑是乙二胺四乙酸(EDTA)或[亞乙基雙(氧亞乙基次氮基)]四乙酸(EGTA)。
23.權(quán)利要求22的方法，其中EDTA的給藥量為大約0.01μg/天-大約20g/天。
24.權(quán)利要求22的方法，其中組合物中EDTA與乳鐵蛋白的比例為1∶10,000-大約2∶1。
25.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括聯(lián)合施用乳鐵蛋白組合物與抗生素。
26.治療菌血癥或膿毒癥的方法，所述方法包括通過口服途徑施用有效量的乳鐵蛋白組合物來補充個體粘膜免疫系統(tǒng)的步驟。
27.提高個體胃腸道中粘膜免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給所述個體口服施用有效量的乳鐵蛋白組合物的步驟。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述乳鐵蛋白刺激胃腸道中的白細胞介素-18。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述白細胞介素-18刺激免疫細胞的產(chǎn)生或活性。
30.權(quán)利要求28的方法，其中所述乳鐵蛋白降低促炎細胞因子的產(chǎn)生或活性。
31.降低有菌血癥的個體死亡率的方法，所述方法包括給所述個體口服施用有效量的乳鐵蛋白組合物以減輕菌血癥從而降低該個體的死亡率的步驟。
32.治療個體膿毒癥的方法，所述方法包括給所述個體口服施用有效量的乳鐵蛋白組合物以提供所述個體膿毒癥的改善的步驟。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述改善是降低循環(huán)細菌的水平。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述改善是減輕膿毒性休克。
35.權(quán)利要求32的方法，其中所述改善是減輕器官衰竭。
36.權(quán)利要求32的方法，其中所述改善是降低個體的發(fā)病率。
37.權(quán)利要求32的方法，其中所述改善是降低個體的死亡率。
38.降低有膿毒癥的個體死亡率的方法，所述方法包括給所述個體口服施用有效量的乳鐵蛋白組合物以減輕膿毒癥從而降低個體死亡率的步驟。
39.權(quán)利要求38的方法，其中乳鐵蛋白組合物的量降低循環(huán)細胞因子的水平。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述細胞因子選自IL-4、IL-6和IL-10。
41.權(quán)利要求38的方法，所述方法還包括聯(lián)合施用乳鐵蛋白組合物與抗生素。
42.權(quán)利要求38的方法，所述方法還包括聯(lián)合施用乳鐵蛋白組合物與Drotrecogin-α(激活的)。
43.降低有急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的個體的死亡率的方法，所述方法包括給個體口服施用有效量的乳鐵蛋白組合物以減輕ALI或ARDS從而降低個體死亡率的步驟。
44.權(quán)利要求43的方法，所述方法還包括聯(lián)合施用乳鐵蛋白組合物與低潮氣容積換氣或表面活性劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過單獨或者與標準療法或金屬鰲合劑聯(lián)合口服施用乳鐵蛋白的組合物以預(yù)防或治療細菌引發(fā)的全身性炎癥反應(yīng)綜合征的后果來預(yù)防或治療菌血癥、膿毒癥、膿毒性休克或相關(guān)病癥如ARDS的方法。特別是，要求保護單獨或者與金屬鰲合劑或其它治療干預(yù)組合的重組人乳鐵蛋白在降低由菌血癥、膿毒癥、膿毒性休克或相關(guān)病癥如ARDS引起的死亡率中的治療應(yīng)用。
文檔編號C07K14/00GK1744907SQ200380109569
公開日2006年3月8日 申請日期2003年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月6日
發(fā)明者A·瓦拉哈查里, K·佩特拉克 申請人:阿根尼克斯有限公司