專(zhuān)利名稱(chēng)：從宿主細(xì)胞純化核酸的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及從細(xì)胞來(lái)源分離核酸的方法和組合物。更具體地，本發(fā)明涉及用有效的一步裂解組合物聯(lián)合核酸捕獲基質(zhì)從粗制細(xì)胞裂解物直接分離低分子量核酸，例如，染色體外DNA的方法和組合物。
背景技術(shù)：
分離低分子量核酸，尤其從宿主細(xì)胞分離染色體外核酸的能力通常是分子生物學(xué)中許多方案所必要的，以及生物技術(shù)和臨床研究中許多下游用途的基本要求。例如，通常的克隆方案預(yù)期從靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可得到質(zhì)粒載體DNA。染色體外核酸的質(zhì)量，例如，純度和完整性水平通常決定克隆方法的成功，并且通常是完整方法的關(guān)鍵參數(shù)。此外，DNA測(cè)序、限制性消化反應(yīng)，和隨后的連接反應(yīng)通常依賴(lài)于起始DNA材料的質(zhì)量。同樣，已經(jīng)需要并且持續(xù)需要從宿主細(xì)胞純化高質(zhì)量低分子量核酸的可靠方法。
常規(guī)低分子量核酸純化方案通常以或多或少兩個(gè)階段進(jìn)行在第一個(gè)階段，將含有靶核酸，即染色體外核酸的宿主細(xì)胞輕微裂解并將內(nèi)含物溶解化；在第二個(gè)階段，通過(guò)幾種常用的化學(xué)或酶學(xué)方法之一將靶核酸與污染性蛋白質(zhì)、RNA、高分子量核酸(即，染色體DNA)，和其他大分子分離。通常常規(guī)靶核酸純化方案已經(jīng)證明是費(fèi)力和耗時(shí)的，然而產(chǎn)生高質(zhì)量產(chǎn)物，或者相對(duì)快和省力的，但是產(chǎn)生相對(duì)低質(zhì)量產(chǎn)物。
更具體地，分離靶核酸更常用的省時(shí)方法之一包括堿性裂解技術(shù)。堿性裂解方法通常順序摻入NaOH/SDS裂解溶液與乙酸鉀溶液組合，和離心步驟以?xún)?yōu)先將靶核酸釋放和與其他污染性材料分離。用單獨(dú)的離心或過(guò)濾步驟產(chǎn)生澄清裂解物。需要乙醇沉淀澄清的裂解物以沉淀核酸。盡管堿性裂解方法相當(dāng)快，其耗費(fèi)約30到45分鐘，并且所得核酸的純度比較好，即可用于限制性消化和其他更基本的檢測(cè)型方法中，但是該方法不能提供高質(zhì)量染色體外核酸。
在另一方法中，通過(guò)堿性裂解方法制備的澄清裂解物可以與離液序列高的物質(zhì)，例如胍鹽、脲和碘化鈉組合，在DNA結(jié)合固相(例如，珠子或者其他結(jié)合基質(zhì))存在下純化靶核酸。核酸在一步反應(yīng)中結(jié)合固相，洗滌以除去殘留的污染物并用低鹽緩沖液洗脫核酸。盡管聯(lián)合堿性裂解與離液劑結(jié)合/洗滌/洗脫步驟的方法可以提供更高質(zhì)量核酸，但是它們?nèi)匀缓臅r(shí)，花費(fèi)約25分鐘，并且需要更多手工操作。
同樣，本領(lǐng)域中持續(xù)需要簡(jiǎn)單和時(shí)間有效的方法，和相應(yīng)的溶液，用以從宿主細(xì)胞純化低分子量靶核酸，如染色體外DNA，還需要從宿主細(xì)胞純化質(zhì)粒DNA的方法和溶液。在該背景下開(kāi)發(fā)了本發(fā)明。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了使用一種溶液和核酸捕獲基質(zhì)從宿主細(xì)胞裂解并分離低分子量核酸的一步方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將裂解溶液預(yù)冷以增強(qiáng)核酸純度。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸捕捉基質(zhì)含有具有至少1μm孔隙大小的捕獲基質(zhì)材料。與現(xiàn)有技術(shù)方案相比，按照本文中描述的方法可以快速(約8到10分鐘)和容易(需要很少試劑)地以高產(chǎn)率和純度分離低分子量核酸。
優(yōu)選地，按照本發(fā)明的方法和組合物分離的低分子量核酸具有約1.7到1.9的A260/280比率，和具有最小的蛋白質(zhì)污染，如通過(guò)視覺(jué)，即光度檢測(cè)方法，即，標(biāo)準(zhǔn)凝膠電泳和類(lèi)似方法所測(cè)量的。更優(yōu)選地，使用本發(fā)明的方法和組合物分離的低分子量核酸可以通常經(jīng)測(cè)序?yàn)橹辽?00個(gè)堿基，即每種樣品具有600質(zhì)量得分(q)≥20(CodonCode軟件，PHRED Interphace)(600 PHRED q＞20分)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了用于從宿主細(xì)胞純化低分子量核酸的裂解組合物。該裂解組合物優(yōu)選含有緩沖劑和去污劑。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，該去污劑含有非離子去污劑或者兩性離子去污劑，例如，正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基(ammonio)-1-丙烷磺酸鹽。在額外的實(shí)施方案中，裂解組合物還含有鹽、聚乙二醇、溶菌酶和/或RNA酶。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，裂解溶液在加入宿主細(xì)胞前預(yù)冷。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了用于從宿主細(xì)胞純化低分子量核酸的試劑盒。優(yōu)選地，該試劑盒包括核酸捕獲基質(zhì)和含有緩沖劑、非離子或者兩性離子去污劑，和任選地鹽、聚乙二醇、溶菌酶和/或RNA酶的裂解組合物。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸捕獲基質(zhì)含有摻入自旋柱的捕獲基質(zhì)材料，該自旋柱的平均孔隙大小為至少約1μm，更優(yōu)選地至少約3μm。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案為從宿主細(xì)胞純化低分子量核酸的方法。該方法包括向宿主細(xì)胞加入裂解組合物的步驟，其中裂解組合物含有0.2％到6％兩性離子或者非離子去污劑并且優(yōu)選在使用前預(yù)冷，將釋放的低分子量核酸與核酸捕捉基質(zhì)組合，并將捕獲的低分子量核酸洗脫到捕獲管中。在備選實(shí)施方案中，室溫下將裂解組合物與宿主細(xì)胞孵育至少2分鐘，更優(yōu)選地至少3分鐘，之后加入核酸捕獲基質(zhì)。
此外，本發(fā)明的方法和組合物可以經(jīng)修飾，如下文中更詳細(xì)描述，以?xún)?yōu)先分離溶解的蛋白質(zhì)、RNA、BACs，和高分子量核酸。在這些其他實(shí)施方案中，用含有緩沖劑和兩性離子去污劑的裂解溶液與用以高產(chǎn)率和高質(zhì)量地純化靶標(biāo)大分子的適宜的成分聯(lián)合，所述成分為例如，RNA酶、溶菌酶，或者DNA酶。
閱讀下面的詳細(xì)描述和參考所附權(quán)利要求書(shū)后，表征本發(fā)明的這些特征和多種其他特征以及優(yōu)點(diǎn)將顯而易見(jiàn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A和1B闡明在染色的0.5％瓊脂糖凝膠(1A)顯示和圖示(1B)分離的質(zhì)粒DNA，其中在室溫下將細(xì)胞與裂解溶液孵育不同的時(shí)間量。該圖闡明了來(lái)自每種條件的濃度和A212吸收讀數(shù)。
圖2闡明在染色的0.5％瓊脂糖凝膠上顯色的質(zhì)粒DNA，其中用于裂解緩沖液的去污劑類(lèi)型對(duì)所純化的質(zhì)粒DNA的產(chǎn)率和質(zhì)量具有顯著影響。在玻璃纖維(second1-12)板上分離DNA。
圖3闡明在染色的0.5％瓊脂糖凝膠上顯色的質(zhì)粒DNA，其中細(xì)胞與室溫裂解溶液、4℃裂解溶液，或者0℃裂解溶液孵育。
圖4闡明NA捕獲基質(zhì)材料的類(lèi)型和該基質(zhì)的孔隙大小對(duì)所純化的質(zhì)粒DNA的產(chǎn)率和質(zhì)量具有影響。分離的質(zhì)粒DNA在染色的0.5％瓊脂糖凝膠上顯現(xiàn)。
圖5闡明用于從不同類(lèi)型的宿主細(xì)胞分離不同質(zhì)粒載體的本發(fā)明的方法和Lysis裂解溶液。質(zhì)粒DNA在染色的0.5％瓊脂糖凝膠上顯現(xiàn)。
圖6闡明通過(guò)本發(fā)明的方法和Lysis裂解溶液分離的質(zhì)粒DNA為PCR提供了足夠模板DNA。PCR產(chǎn)物在染色的瓊脂糖凝膠上顯現(xiàn)。
圖7A和7B闡明通過(guò)分光光度分析，裂解方法提供了極好的濃度和產(chǎn)率，它們與QIAgen、Invitrogen、BioRad或者Promega試劑盒相當(dāng)或者更好。圖7A顯示了與QIAgen制備的DNA相當(dāng)?shù)牧呀夥椒―NA(在凝膠上標(biāo)記為FastPlasmid DNA)。圖7B圖示比較了從本發(fā)明的裂解方法制備的DNA的濃度與通過(guò)QIAgen、Invitrogen、BioRad和Promega制備的DNA的濃度。
圖8闡明使用本發(fā)明的方法和Lysis裂解溶液分離的DNA的測(cè)序質(zhì)量(通過(guò)測(cè)序追蹤)。
圖9闡明通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)，與其他常用的DNA分離試劑盒相比使用本發(fā)明的方法和Lysis裂解溶液分離的DNA的質(zhì)量。
圖10A和B闡明PEG、鹽和緩沖液的溶液可以驅(qū)使核酸結(jié)合二氧化硅顆粒。在A和B中，通過(guò)0.5％瓊脂糖凝膠顯現(xiàn)分離的質(zhì)粒DNA。
圖11闡明Lysis溶液可以直接加到液體細(xì)菌培養(yǎng)基和使用本發(fā)明的方法和材料分離的高質(zhì)量質(zhì)粒DNA。在染色的瓊脂糖凝膠上顯現(xiàn)分離的DNA樣品。
發(fā)明詳述定義提供下面的定義用以方便理解本文中所用的某些術(shù)語(yǔ)并且這些定義不限制本公開(kāi)的范圍。
“A260/280”指常用的核酸定量技術(shù)，其中測(cè)量受試樣品在約260nm和280nm處的吸收。260與280處吸收的比率用以指示核酸純度。蛋白質(zhì)污染物傾向?qū)⒃摫嚷式档偷郊s1.6，RNA污染物傾向?qū)⒃摫嚷噬叩?.9-2.0以上。
“A212”指用于幫助含有核酸的樣品中蛋白質(zhì)污染物的檢測(cè)的單一吸收讀數(shù)。例如，具有高A212讀數(shù)的樣品可能在該樣品中具有一定水平的蛋白質(zhì)污染，其當(dāng)與A260/280比率和凝膠瓊脂糖分析聯(lián)合時(shí)可以表明該樣品的質(zhì)量。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，認(rèn)為讀數(shù)為10是高的。
“宿主細(xì)胞”指含有靶核酸分子，例如，異源核酸分子，如質(zhì)?；蛘咂渌头肿恿亢怂岬募?xì)胞，在該情況中宿主細(xì)胞通常適于復(fù)制目標(biāo)核酸分子。用于本發(fā)明的適宜的宿主細(xì)胞的實(shí)例包括細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這些細(xì)胞的特定實(shí)例包括，SF9昆蟲(chóng)細(xì)胞(Summers和Smith，1987，Texas Agriculture Experiment StationBulletin，1555)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞(Puck等人，1958，ProcNatl Acad Sci USA 601275-1281)、大腸桿菌(E.Coli)DH5α細(xì)胞，以及多種其他細(xì)菌細(xì)胞來(lái)源，例如，大腸桿菌株系DH10b細(xì)胞、XL1Blue細(xì)胞、XL2Blue細(xì)胞、Top10細(xì)胞、HB101細(xì)胞，和DH12S細(xì)胞。
本文中所用“核酸”或者“NA”指脫氧核糖核酸和核糖核酸。本文中所用“核酸序列”指一條鏈上脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的順序或者序列。它們可以是天然的或人工序列，尤其基因組DNA(gDNA)、互補(bǔ)DNA(cDNA)、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA(t RNA)、核糖體RNA(rRNA)、雜種序列或者合成的或半合成序列，經(jīng)修飾的寡核苷酸，或其他。這些核酸可以來(lái)源于人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌或真菌等等。它們可以通過(guò)本領(lǐng)域中公知的任何技術(shù)得到，尤其通過(guò)文庫(kù)篩選，通過(guò)化學(xué)合成或者通過(guò)包括文庫(kù)篩選得到的序列的化學(xué)或酶促修飾的混合方法得到。它們可以經(jīng)化學(xué)修飾，例如，它們可以是假核酸(PNA)、通過(guò)多種化學(xué)鍵修飾的寡核苷酸(例如，硫代磷酸酯或者膦酸甲酯)，或者備選地，經(jīng)功能化，例如用具有不同特征性質(zhì)的一種或多種分子偶聯(lián)的寡核苷酸。
對(duì)于脫氧核糖核酸，它們可以是單鏈或雙鏈的，以及短寡核苷酸或者更長(zhǎng)序列。具體地，核酸有利地由質(zhì)粒、載體、附加體、表達(dá)盒等組成。這些脫氧核糖核酸可以攜帶目的治療基因、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的序列、經(jīng)修飾的反義序列，或者用于結(jié)合其他細(xì)胞組分的區(qū)域，等等。
本文中所用“低分子量核酸”指核酸的異源染色體外片段，例如，質(zhì)粒，所述片段的堿基長(zhǎng)度為約2kb到20kb，在某些方面為2kb到8kb。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的低分子量核酸含有質(zhì)粒，其中該質(zhì)粒具有復(fù)制原點(diǎn)或者復(fù)制子、選擇標(biāo)記和克隆位點(diǎn)。在某些情況中，低分子量核酸超螺旋化。用于本發(fā)明的實(shí)例質(zhì)粒包括pUC19、pUC18、pBS2、pEGFP、pBR322，等等。此外，考慮低分子量核酸包括核酸的其他形式，例如，RNA。
本文中所用“高質(zhì)量核酸”通常指與足夠低水平的污染物結(jié)合的核酸，從而其可以通過(guò)適宜的限制性?xún)?nèi)切核酸酶消化并可以直接用于常規(guī)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染方法，即，不需要該核酸的實(shí)質(zhì)性處理。優(yōu)選地，這種高質(zhì)量核酸的A260/280比為約1.6到2.0，更優(yōu)選地約1.7到1.9。備選地和/或額外地，使用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序方法，可以對(duì)這種高質(zhì)量核酸測(cè)序長(zhǎng)達(dá)至少400個(gè)堿基，更優(yōu)選地長(zhǎng)達(dá)600個(gè)堿基，通常具有PHRED得分q≥20。
對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，“分離的”和“純化的”可以互換，并且指與細(xì)胞碎片，例如，高分子量DNA、RNA和蛋白質(zhì)分離的多核苷酸，例如，低分子量核酸。這將包括與細(xì)胞碎片，包括DNA分離的分離的RNA樣品。
“核酸捕獲基質(zhì)”指用于捕獲本發(fā)明的低分子量核酸的介質(zhì)或者材料，包括通常由二氧化硅、尼龍、羧基等等以及基于二氧化硅的珠子，包括二氧化硅包被的磁珠組成的捕獲基質(zhì)材料。通常，本發(fā)明的捕獲基質(zhì)材料含有孔隙大小大于1μm，更通常大于或等于3μm的纖維濾器。本發(fā)明的核酸捕獲基質(zhì)或者“NA捕獲基質(zhì)”可以還含有用于捕獲低分子量核酸的一個(gè)或多個(gè)不同的捕獲基質(zhì)材料層。應(yīng)該注意當(dāng)使用多層基質(zhì)材料時(shí)，在材料的每層內(nèi)或者之間材料不必相同。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，NA捕獲基質(zhì)由玻璃料(frit)支持并且摻入常規(guī)自旋柱或者類(lèi)似裝置中。
“PHRED”或者“PHRED得分”指用于測(cè)量DNA序列質(zhì)量的軟件程序。該軟件從CodonCode Corporation公司購(gòu)買(mǎi)，版本0.020425.c。對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)，600的PHRED q20得分相當(dāng)于約730個(gè)堿基處于＞98.5％準(zhǔn)確度。
用于本發(fā)明的“聚乙二醇”或者“PEGs”為通過(guò)商業(yè)途徑可獲得的二元醇，其分子量為2,000到10,000道爾頓，更優(yōu)選地約8,000道爾頓。具有其他分子量約束，例如高于10,000道爾頓的PEG也預(yù)期用于本發(fā)明的組合物和方法中，盡管可能在提供高產(chǎn)率/質(zhì)量產(chǎn)物方面不那么有效。
本文中所用“去污劑”指具有插入生物膜和穩(wěn)定它們的性質(zhì)的任何兩親性分子。該性質(zhì)來(lái)自于去污劑分子能夠通過(guò)插入磷脂雙層和通過(guò)溶解脂質(zhì)和蛋白質(zhì)使膜破裂(La Cellule，Ed.Vigot和Dearie，1988，581-583頁(yè))。
“兩性離子”去污劑指顯示出兩性離子特征的去污劑，包括，例如以商標(biāo)名Zwittergen tTM和Anzergen tTM出售的磺基三甲銨乙內(nèi)酯。尤其適宜的去污劑如下N-十二基-N，N-二甲基銨基-3-丙烷磺酸鹽或者相應(yīng)的N-十四基或者N-十六基化合物(“Zwittergent”型Zwittergent 3-14，3-16)、N-十二基-N，N-二甲基-甘氨酸(Empigen BB.RTM.)、氨基氧化物、CHAPS、CHAPSO和α-卵磷脂(α-磷脂酰膽堿)或者α-溶血卵磷脂(α-溶血磷脂酰膽堿)。
本發(fā)明提供了用于裂解和溶解宿主細(xì)胞的方法和組合物。具體地，本發(fā)明提供了簡(jiǎn)單的3到5分鐘方法，其利用單一溶液裂解和釋放細(xì)胞的內(nèi)容物和同時(shí)溶解大部分該細(xì)胞的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)施方案包括用于從宿主細(xì)胞優(yōu)先分離低分子量核酸，例如，染色體外DNA、RNA或者其他區(qū)域DNA，以及優(yōu)先將蛋白質(zhì)與宿主細(xì)胞的核酸分離的方法和溶液。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了用于從靶標(biāo)宿主細(xì)胞純化低分子量核酸，例如，質(zhì)粒DNA的方法和組合物。具體地，從宿主細(xì)菌細(xì)胞以高產(chǎn)率和高質(zhì)量純化可用于克隆方法、限制性消化反應(yīng)，和測(cè)序反應(yīng)中的質(zhì)粒DNA。本發(fā)明的方法利用一種溶液裂解細(xì)菌細(xì)胞和結(jié)合核酸。低分子量核酸從宿主細(xì)胞釋放并直接從粗制裂解物被捕獲到核酸捕獲基質(zhì)上。將該基質(zhì)用適宜的洗滌緩沖液洗滌并在最終用途條件下洗脫。整個(gè)過(guò)程可以在10分鐘以?xún)?nèi)實(shí)施并且在優(yōu)選實(shí)施方案中可以在約8分鐘或更短時(shí)間內(nèi)實(shí)施。
裂解溶液本發(fā)明基于含有緩沖成分和去污劑的裂解溶液。在優(yōu)選實(shí)施方案中，去污劑為兩性離子去污劑，尤其選自包括但不限于，正-十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、等等的去污劑。注意兩性離子去污劑，特別與上面列舉的兩性離子去污劑具有類(lèi)似性質(zhì)的那些兩性離子去污劑在本發(fā)明的范圍內(nèi)。該溶液的實(shí)施方案能夠裂解靶標(biāo)宿主細(xì)胞并溶解大部分細(xì)胞蛋白。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的裂解溶液可與其他核酸分離方法，例如，高濃度離液劑鹽聯(lián)合以驅(qū)使核酸結(jié)合到固態(tài)支持體基質(zhì)。該溶液的優(yōu)選的緩沖劑/去污劑實(shí)施方案包括溶菌酶和DNA酶或RNA酶。
在另外的實(shí)施方案中，還預(yù)期上述裂解溶液可以還含有螯合劑、鹽、聚乙二醇、溶菌酶和RNA酶或DNA酶。如本領(lǐng)域中技術(shù)人員將理解的，用于除去DNA純化步驟中RNA的RNA酶，或者用于除去RNA純化步驟中DNA的DNA酶在使用本發(fā)明的方法純化靶核酸的技術(shù)上不需要，但是通過(guò)包括這些成分顯著提高了核酸產(chǎn)率和純度。此外，包括溶菌酶對(duì)所得產(chǎn)率具有顯著影響，并且尤其優(yōu)選作為本發(fā)明裂解溶液的額外的成分?？紤]包括這些組分用于根據(jù)本發(fā)明的核酸分離方法中。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，裂解溶液的緩沖組分為pH約8的Tris-Cl，盡管考慮其他緩沖化合物。通常，裂解溶液中Tris-Cl的終濃度為約0到約200mM，優(yōu)選約15到75mM。注意到可以調(diào)整本發(fā)明的緩沖組分從而很少需要或者不需要改變最終溶液的pH。例如，緩沖組分可以是Tris-氨基和Tris-氨基鹽酸鹽的組合以提供pH約7.9到8.4的最終裂解溶液。一種闡明性組合是最終裂解溶液中包括約17mM Tris氨基與28mM Tris-氨基鹽酸鹽?？梢杂闷渌彌_組合得到適宜的裂解溶液pH，其如上面提到的最適為7.9到8.4。
用于裂解溶液的優(yōu)選的鹽為用于核酸沉淀中的任何常用鹽，例如，NaCl、NH4Cl、NH4SO4、MgCl2、等等。在優(yōu)選實(shí)施方案中，鹽為NaCl，部分是由于其可利用性和相對(duì)低成本。裂解溶液中鹽的終濃度優(yōu)選為200到800mM，更優(yōu)選約400mM。
用于裂解溶液的優(yōu)選螯合劑為EDTA，但是預(yù)期也可以使用EGTA。本發(fā)明的實(shí)施方案中可以使用的EDTA的終濃度為0到20mM，優(yōu)選約9mM。
用于本發(fā)明的聚乙二醇(PEG)的優(yōu)選分子量為約2,000到10,000道爾頓，更優(yōu)選約8,000道爾頓。通常，裂解溶液中的最終PEG濃度為2到20％，優(yōu)選2到8％。注意到使用本領(lǐng)域中公知的技術(shù)，例如，通過(guò)將加熱到適宜的溫度并過(guò)濾以除去微粒制備PEG。令人驚奇地，具有較高分子量的PEG對(duì)本發(fā)明的純化的低分子量核酸的質(zhì)量具有有害影響。
通常，裂解溶液的實(shí)施方案包括溶菌酶，例如，蛋清溶菌酶或者重組溶菌酶，終濃度為約300到2,000μg/ml，優(yōu)選800到1,200μg/ml。此外，RNA酶(或者當(dāng)純化靶標(biāo)為RNA時(shí)，DNA酶)，例如，RNA酶A、RNA酶1、RNA酶T1優(yōu)選以約200到400μg/ml的濃度包括在裂解溶液中。在兩種情況中，溶菌酶或者RNA酶以?xún)龈煞勰┗蛘咭匀芤罕４?。例如，RNA酶通常保存在100mMNaCl、10mM Tris、和1mM EDTA溶液中。注意到溶菌酶和RNA酶分別是最優(yōu)化產(chǎn)率，即，完全釋放核酸和除去RNA污染物所需的，并且可以以高于上面所公開(kāi)的濃度包含，但是該更高濃度對(duì)于增強(qiáng)產(chǎn)率和質(zhì)量有限。溶菌酶、RNA酶和DNA酶可以通過(guò)商業(yè)途徑得到。
裂解溶液還包括終濃度為約0.2％到6％，優(yōu)選約2到4％的去污劑。注意到本發(fā)明的溶液中可以使用較低量的去污劑，尤其當(dāng)被裂解和溶解的細(xì)胞的濃度很低時(shí)。此外，盡管考慮本發(fā)明中使用較高水平的去污劑，但是它們可能不增加額外的功能價(jià)值從而不優(yōu)選。
通常，去污劑為離子去污劑、非離子去污劑，或者兩性離子去污劑。用于本發(fā)明的典型的離子去污劑包括，但不限于脫氧膽酸。用于本發(fā)明的典型的非離子去污劑包括，但不限于，Triton X-100、Apo10、Apo12和NP40。典型的兩性離子去污劑包括，但不限于，CHAPS和磺基三甲銨乙內(nèi)酯，磺基三甲銨乙內(nèi)酯去污劑分別以例如商標(biāo)名ZwittergentTM和AnzergentTM出售。還注意到在某些情況中，還可以使用，但不優(yōu)選非去污劑兩性離子材料。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，去污劑為兩性離子去污劑，例如，以商標(biāo)名ZwittergentTM和AnzergentTM出售的兩性離子去污劑，所述去污劑具有化學(xué)名正-十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽。用于本發(fā)明的一種優(yōu)選的去污劑為正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸。注意到本發(fā)明的去污劑可以以如下商標(biāo)名購(gòu)買(mǎi)，例如Anzergent 3-14，分析級(jí)；Anzergent3-8，分析級(jí)；Anzergent 3-10，分析級(jí)；Anzergent 3-12，分析級(jí)，或者zwittergent 3-8、zwittergent 3-10、zwittergent 3-12和zwittergent 3-14、CHAPS、CHAPSO、Apo10和Apo12。
注意到還考慮用于本發(fā)明的兼容去污劑可以混合在一起以提供用于裂解溶液中的必要的去污劑組合物(終濃度)。例如，在裂解溶液中終濃度為2％的去污劑可以由50∶50正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽∶正-十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽組成。
此外，預(yù)見(jiàn)裂解溶液的實(shí)施方案中可以包括其他成分，例如，濃度為50mM到6M，優(yōu)選200mM到400mM的離液劑鹽可以包括在溶液中以幫助蛋白質(zhì)變性。此外，該溶液中可以包括0.5％到25％的醇，像異丙醇，以幫助低分子量核酸的沉淀。
在裂解溶液的制備期間，應(yīng)該在溶液的其他組分已經(jīng)使pH為7.9到8.4，優(yōu)選約8.1的pH后加入溶菌酶、RNA酶(或者DNA酶)，和去污劑。當(dāng)需要調(diào)節(jié)pH時(shí)，可以使用本領(lǐng)域中任何種類(lèi)的熟知酸或者堿，例如，HCl或者NaOH。
還注意到如上討論的，通過(guò)用緩沖溶液的適宜量和組成制備溶液，裂解溶液的pH應(yīng)該相當(dāng)接近可接受的范圍。
裂解溶液優(yōu)選保存在4℃，盡管還預(yù)見(jiàn)可以在室溫保存。通常，溶液可以保存長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月。然而，還預(yù)見(jiàn)不存在RNA酶、DNA酶，和溶菌酶時(shí)該裂解溶液可以保存長(zhǎng)達(dá)1到2年。當(dāng)需要更長(zhǎng)保存時(shí)間時(shí)，可以在使用時(shí)有利地加入從濃縮液或者如上述從凍干粉末制備的溶菌酶、RNA酶和DNA酶。
在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，加入靶標(biāo)宿主細(xì)胞的裂解溶液的溫度為約0到10℃，更優(yōu)選1℃到8℃，最優(yōu)選0℃到4℃，通常約2℃到6℃。本文中所用術(shù)語(yǔ)“預(yù)冷的”指本發(fā)明的裂解組合物在前面的溫度范圍內(nèi)。同樣的，當(dāng)預(yù)計(jì)裂解步驟時(shí)，裂解溶液在用于宿主細(xì)胞前應(yīng)該置于冰上足夠的時(shí)間以實(shí)現(xiàn)必要的溫度。
表1提供了用于本發(fā)明方法的闡明性裂解溶液。
表1闡明性裂解溶液
裂解和溶解方法使用上述裂解溶液的方案，用本發(fā)明的方法裂解和溶解靶標(biāo)宿主細(xì)胞。為了裂解和溶解靶細(xì)胞，裂解溶液含有緩沖劑和去污劑，優(yōu)選兩性離子去污劑。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，裂解溶液還含有溶菌酶。根據(jù)所裂解和溶解的材料的預(yù)期用途，該裂解溶液可以還包括如上述的其他任選成分。例如，當(dāng)預(yù)期分離RNA時(shí)，包括DNA酶是有利的，或者當(dāng)預(yù)期分離DNA質(zhì)粒載體時(shí)，裂解溶液可以包括RNA酶。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法包括將細(xì)胞用預(yù)冷的裂解溶液渦旋或者混合10到30秒，然后是1到10分鐘，更優(yōu)選3到5分鐘室溫孵育。本發(fā)明的該優(yōu)選方法提供了堿性裂解方法的相容方法，花費(fèi)少一半的時(shí)間，并且通常提供更高質(zhì)量的產(chǎn)物，即，澄清的裂解物。
裂解方法和核酸純化本發(fā)明的方法還包括對(duì)含有靶標(biāo)低分子量核酸分子的宿主細(xì)胞實(shí)施一種溶液純化方法。該方法導(dǎo)致直接從裂解的細(xì)胞，即，直接從粗制細(xì)胞裂解物分離低分子量核酸，例如，質(zhì)粒DNA。通常，使用本發(fā)明的方法和組合物，從宿主細(xì)胞釋放低分子量核酸，并通過(guò)本發(fā)明的組合物實(shí)施方案溶解宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的相當(dāng)大部分。所釋放的低分子量核酸被核酸捕獲基質(zhì)從粗制細(xì)胞裂解物捕獲，并用基于醇的緩沖液洗滌該基質(zhì)。用適宜的緩沖液從捕獲基質(zhì)洗脫所得捕獲的低分子量核酸，其通常為高產(chǎn)率和極好的質(zhì)量。同樣的，按照本發(fā)明的方法，用單一緩沖液裂解宿主細(xì)胞和在固態(tài)支持體，即核酸捕獲基質(zhì)上結(jié)合/捕獲靶標(biāo)低分子量核酸。該完整過(guò)程(如下文更完整描述)可以在約8到10分鐘內(nèi)進(jìn)行，并且需要僅一種標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。
更詳細(xì)地，用靶標(biāo)低分子量核酸轉(zhuǎn)化細(xì)菌或者其他適宜的宿主細(xì)胞，如本領(lǐng)域中熟知的。宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到目標(biāo)濃度(通常5×108到20×108個(gè)細(xì)胞/ml或者A600為1到4OD單位)，收獲，旋轉(zhuǎn)沉淀。從細(xì)胞沉淀傾出任何LB生長(zhǎng)培養(yǎng)基或者細(xì)胞上的任何其他溶液)，將本發(fā)明的預(yù)冷裂解溶液(0℃到4℃)加入細(xì)胞沉淀中。通常，每1.5ml培養(yǎng)材料加入約400μl裂解溶液，盡管可以對(duì)其進(jìn)行調(diào)整以對(duì)細(xì)胞濃度和裂解溶液組合物進(jìn)行優(yōu)化，例如，當(dāng)處理更少數(shù)目的細(xì)胞時(shí)，裂解溶液中可以包括更低濃度的去污劑。注意在本發(fā)明的備選實(shí)施方案中，將裂解溶液直接加到細(xì)胞培養(yǎng)物中，即，在細(xì)胞被旋轉(zhuǎn)沉淀和生長(zhǎng)培養(yǎng)基從細(xì)胞沉淀倒出之前。通常，組合約2∶1到約1∶3比例的細(xì)胞裂解溶液，該比例取決于細(xì)胞濃度、裂解溶液的實(shí)施方案和其他類(lèi)似參數(shù)。盡管向細(xì)胞直接加入裂解溶液取消了除去生長(zhǎng)培養(yǎng)基所需的離心步驟，但是其可以稍微增加裂解純化方法期間所分離核酸的蛋白質(zhì)污染，這是由于起始材料中存在更高水平的潛在污染性材料。然而，當(dāng)這些污染物意義較小或者時(shí)間很重要時(shí)，本發(fā)明使得可以進(jìn)一步減少必要處理步驟。
裂解溶液的組成在下文中更詳細(xì)討論，該裂解溶液在宿主細(xì)胞上持續(xù)渦旋或者混合約10到30秒，更優(yōu)選約20秒。重懸浮的細(xì)胞混合物接著在室溫孵育1到10分鐘，更優(yōu)選地3到5分鐘，最優(yōu)選地約5分鐘。室溫孵育導(dǎo)致從宿主細(xì)胞大量釋放低分子量核酸和溶解大部分宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)。注意更短的裂解溶液室溫孵育可以與本發(fā)明一起使用，盡管低分子量核酸的產(chǎn)率相應(yīng)較低。此外，可以使用更長(zhǎng)的室溫裂解孵育，但是5到10分鐘的孵育后通常觀察到低分子量核酸產(chǎn)率或者質(zhì)量的很小提高。
宿主細(xì)胞上包括預(yù)冷的裂解緩沖液，和隨后室溫孵育提供了溫度梯度，在該溫度梯度期間宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)被裂解緩沖液溶解。不被理論所束縛，認(rèn)為本發(fā)明的該方面利用了一系列溫度(從0℃-4℃到室溫)和某種程度上pH改變(由于緩沖液的溫度改變)時(shí)不同的細(xì)胞蛋白質(zhì)溶解度。然而，預(yù)見(jiàn)可以關(guān)于本發(fā)明的方法調(diào)整裂解緩沖液溫度和宿主細(xì)胞孵育溫度，對(duì)低分子量核酸的總的產(chǎn)率和純度產(chǎn)生一定影響。
室溫孵育后，將所釋放的低分子量核酸和溶解的細(xì)胞碎片轉(zhuǎn)移到自旋柱，其具有至少一層核酸(NA)捕獲基質(zhì)(優(yōu)選的實(shí)施方案可以具有摻入到該自旋柱的第二和/或第三層NA捕獲基質(zhì))。上面的混合物通過(guò)該自旋裝置以約14,000RPM(20,000×G)旋轉(zhuǎn)約30秒，使用小型或微型離心機(jī)(本領(lǐng)域中技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到在本發(fā)明的背景中可以使用其他速度和時(shí)間，只要流體穿過(guò)自旋柱，如本領(lǐng)域中熟知的)。注意在該方面也可以使用其他方法，例如，真空過(guò)濾等等材料通過(guò)核酸捕獲基質(zhì)的方法。
在備選實(shí)施方案中，NA捕獲基質(zhì)材料直接包括在裂解緩沖液中并在室溫裂解緩沖液/宿主細(xì)胞孵育期間直接加到宿主細(xì)胞。在這些情況中，裂解緩沖液/核酸捕獲基質(zhì)在加到宿主細(xì)胞沉淀之前必須完全混合從而基質(zhì)完全重懸浮。
NA捕獲基質(zhì)結(jié)合到從細(xì)胞碎片，即粗制裂解物釋放的低分子量核酸的部分。令人驚奇地，孔隙大小大于1-2μm的核酸捕獲基質(zhì)優(yōu)選用于本發(fā)明，并且優(yōu)選地，在低分子量核酸的捕獲期間使用多層核酸捕獲基質(zhì)，每一層具有至少1-2μm的孔隙大小。注意還預(yù)期孔隙大小小于1-2μm的基質(zhì)材料也用于本發(fā)明，但是表現(xiàn)出傾向于阻塞并且需要較大孔隙材料不必要的額外的處理。此外，優(yōu)選用于此處的較大的孔隙材料傾向于提供更好的捕獲特征，而較小的孔隙材料不能提供所述捕獲特征。為了最大化捕獲的低分子量核酸的純度，對(duì)裝載的核酸捕獲基質(zhì)實(shí)施一次或多次洗滌步驟。洗滌緩沖液通常為20mMTris-Cl，pH7.2，0.2M NaCl，和2mM EDTA，pH 8.0)/異丙醇溶液。通常，Tris緩沖液異丙醇的比例為約30-35∶70-65，優(yōu)選約32.5∶67.5(注意可以用其他類(lèi)似醇，例如乙醇代替異丙醇)。注意到本發(fā)明可以使用其他洗滌緩沖液組合物，只要它們比低分子量核酸優(yōu)先從捕獲基質(zhì)解離污染物。該洗滌步驟除去來(lái)自裝載的核酸捕獲基質(zhì)的松散結(jié)合的蛋白質(zhì)和其他大分子。
最后，用10mM Tris，0.1mM EDTA溶液(pH約8.5)從NA捕獲基質(zhì)洗脫低分子量核酸。通常的洗脫參數(shù)包括使用更小的體積保持靶標(biāo)低分子量核酸的較高濃度，和最小化洗脫緩沖液中EDTA或者其他酶抑制性組分的量。
如關(guān)于上面的洗脫緩沖液闡明的，可以在與最終用途應(yīng)用相容的溶液中，例如，使用對(duì)聚合酶具有很小的抑制活性的洗脫緩沖液實(shí)施低分子量核酸的洗脫。同樣地，可以對(duì)洗脫的樣品直接實(shí)施最終用途應(yīng)用而不必沉淀和在適宜的緩沖液中重懸浮該核酸。用于本發(fā)明的其他洗脫緩沖液包括水、TE緩沖液、10-50mM Tris緩沖液，等等。
核酸捕獲基質(zhì)許多不同的核酸捕獲基質(zhì)組合物可以與本發(fā)明的方法和組合物聯(lián)用以捕獲低分子量核酸。用于本發(fā)明的捕獲基質(zhì)組合物包括基于二氧化硅、尼龍和丙烯酸的材料。濾器捕獲基質(zhì)材料的通常的孔隙大小為1到25μm，優(yōu)選1到5μm，最優(yōu)選3到5μm。注意具有更大孔隙的基質(zhì)材料可以與本發(fā)明連用，但是在捕獲低分子量核酸中較不有效。此外，更小孔隙捕獲基質(zhì)材料，例如，小于1μm，也可以與本發(fā)明連用，但是傾向于在捕獲過(guò)程期間堵塞(注意到具有1到2μm孔隙大小的基質(zhì)材料也可以表現(xiàn)出一定水平的堵塞，這取決于基質(zhì)層數(shù)和樣品大小)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，捕獲基質(zhì)材料的第一層摻入到如本領(lǐng)域中熟知的旋轉(zhuǎn)裝置中。捕獲基質(zhì)材料將在組成和孔隙大小上與前述參數(shù)相容，但是優(yōu)選為孔隙大小為3到5μm的玻璃纖維。在某些實(shí)施方案中，旋轉(zhuǎn)裝置包括兩層捕獲基質(zhì)材料，例如，第一(上)層材料的孔隙大小約5μm，第二層(下一層)捕獲基質(zhì)具有的孔隙大小約為3μm。額外的捕獲基質(zhì)材料為捕獲靶標(biāo)低分子量核酸提供了額外的表面區(qū)域/支持體。通常，這兩層是不同的材料，盡管考慮這兩層可以是相同材料。此外，層之間的孔隙大小通常是不同的，較大的孔隙大小材料在較小的孔隙大小材料之上。最后，可以加入額外的捕獲基質(zhì)材料，盡管濾器材料的堵塞可能變得更嚴(yán)重。
注意NA捕獲基質(zhì)中可以包括玻璃料，其在一層或多層捕獲基質(zhì)材料層之下用于支持。通常的玻璃料由惰性材料，例如聚乙烯組成，具有5到70μm的孔隙大小。
在備選實(shí)施方案中，一部分，例如350μl NA捕獲基質(zhì)漿液，例如，溶液中的二氧化硅顆粒直接沉積到裂解溶液/宿主細(xì)胞材料中并孵育短的時(shí)間段(通常使用渦旋或者其他混合技術(shù))。如上旋轉(zhuǎn)沉淀捕獲基質(zhì)漿液/裂解溶液混合物，并用適宜的洗滌緩沖液洗滌沉淀的基質(zhì)。
如上文，用適宜的洗脫緩沖液釋放捕獲的低分子量核酸。此外，二氧化硅包被的磁珠可以用作NA捕獲基質(zhì)。這些珠子的使用和制備在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,368,800中描述，將該專(zhuān)利并入作為參考。使用二氧化硅包被的磁珠避免了在靶標(biāo)核酸的純化期間需要離心步驟。
表2提供了代表性NA捕獲基質(zhì)材料與相應(yīng)孔隙大小以及幾種通過(guò)商業(yè)途徑可獲得的旋轉(zhuǎn)裝置。
表2NA捕獲基質(zhì)材料
裂解方法的自動(dòng)化本發(fā)明的方法和組合物可用于在高通量應(yīng)用中從靶標(biāo)宿主細(xì)胞分離高產(chǎn)率和高質(zhì)量的低分子量核酸。
使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和人員可以一次對(duì)一個(gè)樣品實(shí)施本發(fā)明的方法。然而，由于實(shí)施本發(fā)明的方法所需的有限數(shù)目的步驟和/組合物，和由于這些步驟復(fù)雜性的有限水平，預(yù)期這些方法可以用于高度自動(dòng)化步驟以從許多分散處理的樣品分離靶核酸樣品。
具體地，本發(fā)明的組合物和方法可用于多孔，例如，96或384孔方案中。細(xì)胞生長(zhǎng)于具體步驟所需的適宜數(shù)目的孔中。適宜的細(xì)胞生長(zhǎng)后，用多孔板離心沉淀細(xì)胞。將多孔板中的每個(gè)細(xì)胞樣品重懸浮在約400μl預(yù)冷的裂解溶液中。搖動(dòng)平板，或者用多通道移液管或者96針頭吹打每孔組分，以便完全重懸細(xì)胞。樣品在室溫下孵育約3到5分鐘。使用多通道移液管或者96孔針頭，將來(lái)自每管的裂解物轉(zhuǎn)移到相應(yīng)多孔濾器板中。濾液真空通過(guò)濾器基質(zhì)(如上討論的相同類(lèi)型的捕獲基質(zhì)形式)以在捕獲基質(zhì)上捕獲低分子量核酸。再次使用多通道移液管或者96孔針頭，向?yàn)V器板的每孔加入約400μl洗滌緩沖液。洗滌緩沖液穿過(guò)捕獲基質(zhì)以除去殘留的蛋白質(zhì)和核酸，并抽真空直到多數(shù)殘留的醇從捕獲的低分子量核酸除去。制備適宜的板以接收洗脫的低分子量核酸，并對(duì)每種樣品實(shí)施洗脫。也可以用離心實(shí)施該強(qiáng)行使液體穿過(guò)濾器板的方法。注意到在自動(dòng)化方法期間應(yīng)該避免離心，其中該方法在自動(dòng)化工作站上進(jìn)行。
最后，注意用二氧化硅包被的磁珠可以實(shí)施本發(fā)明的自動(dòng)化方法。純化步驟應(yīng)該基本上和上面的相同，只是應(yīng)該利用珠子的磁性性質(zhì)將NA捕獲基質(zhì)與裂解物分離并且應(yīng)該不需要離心步驟。
使用預(yù)先校準(zhǔn)的設(shè)備，可以將該方法自動(dòng)化成高通量方法。預(yù)見(jiàn)用于高通量操作的其他方法并且這些方法不限于96孔或者384孔板。同樣的，本發(fā)明的方法對(duì)于許多離散的高質(zhì)量低分子量核酸樣品的自動(dòng)化制備是理想的。
低分子量核酸純化試劑盒本發(fā)明的實(shí)施方案提供了用于實(shí)施上述核酸純化/分離方法的試劑盒。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒包括裂解溶液和NA捕獲基質(zhì)材料(作為旋轉(zhuǎn)柱或者基質(zhì)漿液)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該試劑盒還包括洗脫溶液和洗滌緩沖液。本發(fā)明的試劑盒還可以包括分子生物學(xué)級(jí)水、收集管、384孔板(任選裝入NA捕獲基質(zhì))、96孔板(任選裝入NA捕獲基質(zhì))、移液器頭、微型離心機(jī)、保護(hù)性手套，等等。
為了最大穩(wěn)定性，該試劑盒可以含有凍干的溶菌酶、RNA酶和/或DNA酶，它們可以在試劑盒第一次使用時(shí)加入裂解溶液中。在某些實(shí)施方案中，可以單獨(dú)提供去污劑以?xún)H在使用前加入到其他成分中。
最后，在某些試劑盒中，考慮還可以包括用于細(xì)胞培養(yǎng)的許多管，例如，Lid-Bac管(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,958,778和6,503,455，并入本文作為參考)。這些管應(yīng)該允許在單個(gè)管中培養(yǎng)靶細(xì)胞和處理、裂解和溶解那些相同的細(xì)胞(使用本發(fā)明的裂解溶液和方法)。然后通過(guò)加入核酸捕獲基質(zhì)漿液在該相同管或者在另一管，例如，其中直接裝入一層核酸捕獲基質(zhì)的旋轉(zhuǎn)裝置中分離靶核酸。
結(jié)合溶液在根據(jù)本發(fā)明的備選實(shí)施方案中，用包含緩沖劑、PEG和鹽的溶液優(yōu)先將來(lái)自澄清的裂解物的核酸結(jié)合到二氧化硅纖維。優(yōu)選的結(jié)合溶液包括分子量為2,000到10,000道爾頓的1到20％PEG；約100到2000mM鹽，例如，NaCl；約10到200mM緩沖液，例如，Tris。與該結(jié)合緩沖液使用的NA捕獲基質(zhì)包括二氧化硅珠和纖維。優(yōu)選的二氧化硅纖維具有1到20μm，更優(yōu)選約3到5μm的孔隙。
已經(jīng)一般性描述了本發(fā)明，通過(guò)參考下面的實(shí)施例將更容易理解本發(fā)明，這些實(shí)施例僅為了闡明而提供，并且不打算作為限制。
實(shí)施例實(shí)施例1制備裂解溶液表3提供了本發(fā)明的一種潛在的裂解溶液的組合物。每種組分的濃度是按照每升溶液組分的重量來(lái)計(jì)。
表3.裂解溶液
實(shí)施例2室溫孵育增加了高質(zhì)量質(zhì)粒DNA的回收下面的實(shí)施例闡明裂解緩沖液與含有質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞3到10分鐘室溫孵育，優(yōu)選5分鐘室溫孵育對(duì)于高質(zhì)量質(zhì)粒DNA的高產(chǎn)率回收是有益的。
如本領(lǐng)域中熟知的，將細(xì)菌宿主細(xì)胞用pUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)化在96孔板中過(guò)夜生長(zhǎng)。將平板在室溫解凍15分鐘，并向板的每孔加入前面描述的裂解緩沖液約400μl。注意裂解緩沖液在加到細(xì)菌培養(yǎng)物之前預(yù)冷到0℃。
培養(yǎng)物經(jīng)立即旋轉(zhuǎn)沉淀，或者在平板振蕩器上重懸浮，并在室溫孵育不同的時(shí)間量。除去具有0到10分鐘室溫孵育的每種裂解物并將其轉(zhuǎn)移到基于二氧化硅的NA捕獲基質(zhì)并以14000轉(zhuǎn)/分鐘旋轉(zhuǎn)沉淀1分鐘。從每孔除去所得濾液，并用洗滌緩沖液(20mM Tris-Cl pH 7.2，0.2M NaCl，2mM EDTA pH 8，75％異丙醇)洗滌NA捕獲基質(zhì)。以14000轉(zhuǎn)/分鐘旋轉(zhuǎn)洗滌緩沖液1分鐘。用50μl洗脫緩沖液(10mM Tris-Cl和0.1mM EDTA)從NA捕獲基質(zhì)洗脫捕獲的pUC19，并檢查每種洗脫樣品的pUC19產(chǎn)率和蛋白質(zhì)污染。
參考圖1A，在0.5％瓊脂糖凝膠上運(yùn)行來(lái)自每種孵育條件的分離的質(zhì)粒DNA。溴化乙錠染色的凝膠表明所有孵育條件提供了質(zhì)粒DNA的良好產(chǎn)率，包括立即旋轉(zhuǎn)條件。圖1B和表4提供了關(guān)于孵育時(shí)間的每種樣品濃度和A212值的圖示和列表闡明。注意隨著室溫孵育期的進(jìn)行，樣品中蛋白質(zhì)污染降低直到約3分鐘，此時(shí)樣品中蛋白質(zhì)和核酸濃度穩(wěn)定。一并考慮，圖1A和1B闡明裂解緩沖液對(duì)靶細(xì)胞的室溫孵育減少了分離的pUC19的蛋白質(zhì)污染而沒(méi)有不利地影響質(zhì)粒的產(chǎn)率。該實(shí)施例表明裂解溶液對(duì)宿主細(xì)胞的3到10分鐘，優(yōu)選5分鐘室溫孵育可用于最大化所得低分子量核酸的產(chǎn)率和純度。此外，使用本發(fā)明的溶液和方法，更短的孵育，0到2分鐘，似乎不能完全允許污染物與靶核酸分離。注意短孵育時(shí)間的DNA的高濃度(如通過(guò)吸收讀數(shù)確定)由于污染而增加并不代表實(shí)際濃度。對(duì)于大于或者等于3分鐘的孵育時(shí)間所示的濃度代表所分離DNA的真實(shí)濃度。
表4使用不同室溫孵育的質(zhì)粒產(chǎn)率和蛋白質(zhì)污類(lèi)
實(shí)施例3去污劑類(lèi)型和濃度對(duì)于裂解緩沖液有效性是關(guān)鍵的用于用核酸轉(zhuǎn)化細(xì)菌宿主細(xì)胞的方法和溶液與生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞用于分離所述核酸是本領(lǐng)域中熟知的。此外，用于從細(xì)菌宿主細(xì)胞純化質(zhì)粒DNA的發(fā)明性方法與上面實(shí)施例2中所示基本上相同，只是改變裂解緩沖液中去污劑類(lèi)型以確定哪種類(lèi)型的去污劑在該背景中最有用。
關(guān)于用于該實(shí)施例中的裂解緩沖液條件，所制備的標(biāo)準(zhǔn)裂解緩沖液具有50mM Tris-Cl(pH-8)；10mM EDTA(pH-8)；350μg/ml RNA酶；1200μg/ml溶菌酶；7.5％PEG-8000；1％去污劑(根據(jù)樣品改變類(lèi)型)；50μl/ml玻璃基質(zhì)珠；和0.75M NaCl。
使用上面的該基本組合物制備了一系列12種不同的裂解緩沖液，每一種具有加到1％的終濃度的不同類(lèi)型的去污劑。具體地，去污劑為(1)N，N′，N′-聚氧乙烯(10)-N-牛脂-1，3-二氨基丙烷(N，N，N-PTD)，(2)NDSB-195，(3)NDSB-201，(4)NDSB-256，(5)Apo-10，(6)Apo-12，(7)CHAPS，(8)正-辛基-B-D-吡喃葡萄糖苷，(9)De-Oxcholic Acid，(10)SDS，(11)Triton X-100與SDS混合(50∶50)，和(12)Triton X-100。注意在缺少RNA酶、溶菌酶和去污劑時(shí)可以使裂解緩沖液達(dá)到pH 8.5。如圖2中所示，用于裂解緩沖液中的去污劑類(lèi)型對(duì)純化的質(zhì)粒DNA的產(chǎn)率和質(zhì)量都具有顯著影響。例如，包括N，N，N-PTD去污劑導(dǎo)致高產(chǎn)率/高質(zhì)量一步質(zhì)粒制備，而在完全相同的條件下，包括De-oxcholic Acid提供了質(zhì)粒DNA的足夠產(chǎn)率，但是降低了所純化的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量。同樣的，去污劑類(lèi)型對(duì)所得產(chǎn)率和質(zhì)量具有深遠(yuǎn)影響。
用兩性離子去污劑實(shí)施一系列實(shí)驗(yàn)以確定它們用于裂解緩沖液中的有效性。通常，兩性離子(zw)去污劑以1到4％的濃度使用以確定所有或者特定類(lèi)型的兩性離子去污劑在本發(fā)明的方法中有效。有趣地，兩性離子去污劑正-辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽(zw-8)、正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽(zw-10)、正-十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽(zw-12)、正-十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽(zw-14)都顯示出足夠(zw-8)或者良好的結(jié)果(zw-10、zw-12和zw-14)(數(shù)據(jù)未顯示)。
為了進(jìn)一步限定兩性離子去污劑在裂解溶液中的有效性，將去污劑單獨(dú)或者混合以約1％到4％的終濃度摻入相同的裂解溶液(zw-10、zw-12和zw-14)中。表5闡明這些結(jié)果的概述，表明1到4％的兩性離子去污劑對(duì)于宿主細(xì)胞高產(chǎn)率和純度地分離低分子量核酸是極佳的。包括使用NP40或者Qiagen試劑盒純化的DNA的數(shù)據(jù)用于比較。
表5兩性離子去污劑濃度和類(lèi)型影響靶核酸的產(chǎn)率和純度
該數(shù)據(jù)闡明了在本發(fā)明的裂解溶液和方法的背景中使用兩性離子去污劑的有效性。
實(shí)施例4預(yù)冷的裂解溶液增強(qiáng)所純化核酸的質(zhì)量本發(fā)明的裂解方法和溶液用于評(píng)估向pUC19轉(zhuǎn)化的DH5α細(xì)胞加入不同溫度的裂解溶液的效果。如上確定分離的pUC19的質(zhì)量。
用于用pUC19轉(zhuǎn)化細(xì)胞，和生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞以分離pUC19的方法和溶液是本領(lǐng)域中熟知的。制備如上面實(shí)施例中描述的裂解溶液，其含有由3％zw 3-10、3％zw 3-12、或3％zw 3-14組成的去污劑。每種去污劑條件的裂解溶液在加入細(xì)胞前在室溫放置、冷卻到4℃或者冷卻到約0℃。表6和圖3中的結(jié)果表明用冷卻的裂解溶液(4℃和0℃)分離的DNA比用室溫裂解溶液分離的DNA具有更高質(zhì)量的分離DNA。圖3中的泳道3-18表明在每種溫度下來(lái)自每種去污劑類(lèi)型的產(chǎn)率大約相同(每泳道運(yùn)行2μl每種樣品)，相反地，來(lái)自相同樣品的吸收讀數(shù)表明不管去污劑類(lèi)型，使用室溫裂解溶液分離的pUC19具有更高水平的蛋白質(zhì)污染(見(jiàn)表6)。
表6裂解溶液的溫度影響NA質(zhì)量
該數(shù)據(jù)一般地闡明與在室溫加入細(xì)胞的裂解溶液相比，預(yù)冷的相同裂解溶液提供了更高質(zhì)量的分離的質(zhì)粒DNA。然而，注意在室溫加入的裂解溶液不提供分離的質(zhì)粒DNA，并且分離的質(zhì)粒DNA具有相當(dāng)好的質(zhì)量。
實(shí)施例5核酸捕獲基質(zhì)的基質(zhì)材料和孔隙大小對(duì)于高產(chǎn)率和質(zhì)量分離是關(guān)鍵的本發(fā)明的裂解方法用于評(píng)估具有不同組成和孔隙大小的許多濾膜物質(zhì)分離高質(zhì)量低分子量核酸的有效性。研究了濾器類(lèi)型和孔隙大小分離高產(chǎn)率和高質(zhì)量低分子量核酸的有效性。
從靶標(biāo)宿主細(xì)胞釋放低分子量核酸的方法如上文描述。簡(jiǎn)言之，在96孔培養(yǎng)板中靶標(biāo)宿主細(xì)胞中增殖靶標(biāo)低分子量核酸。宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到預(yù)定濃度，旋轉(zhuǎn)沉淀細(xì)胞并除去生長(zhǎng)培養(yǎng)基。向每孔加入約240μl預(yù)冷的裂解溶液并將細(xì)胞在調(diào)節(jié)到7的平板振蕩器上重懸浮2分鐘。
改變過(guò)濾板的孔中的過(guò)濾條件，其中每個(gè)板的孔具有6種過(guò)濾組合之一，如下制備這些過(guò)濾組合樣品1包括兩層NA捕獲基質(zhì)；層1(上層)為玻璃纖維層(1.2μm孔隙大小)，層2(中間)為玻璃纖維(0.8μm)，玻璃料為聚乙烯；樣品2包括與樣品1相同的組合，只是玻璃料為疏水的；樣品3包括兩層，第一層為23μm玻璃纖維濾器，其在孔隙大小為25μm的玻璃料上面；樣品4包括11μm玻璃纖維濾器/聚丙烯25-30μm組合；樣品5包括聚丙烯25-30μm上20μm/11μm玻璃纖維濾器組合；樣品6包括聚丙烯25-30μm上7μm玻璃纖維濾器組合。
表7中的結(jié)果表明，不像常規(guī)分離技術(shù)，本發(fā)明提供了用孔隙大小通常大于約1μm的捕獲基質(zhì)提供了最佳結(jié)果。用樣品3和5中基質(zhì)組合看到了本實(shí)施例的最好結(jié)果，表明11μm玻璃纖維濾器和23μm玻璃纖維濾器上的20μm玻璃纖維濾器提供了用于本發(fā)明的良好的低分子量核酸捕獲和釋放特征。
表7NA捕獲基質(zhì)結(jié)果
使用在1.5ml宿主細(xì)胞培養(yǎng)液和400μl裂解預(yù)冷的溶液實(shí)施第二系列實(shí)驗(yàn)。樣品與室溫下的裂解溶液孵育5分鐘。如下試驗(yàn)14種不同的捕獲基質(zhì)組合(1)Pallflex U100z Med.(粗糙的面向上)；(2)S&S GF#25；(3)Pallflex 2500-S 2608G(平滑的面向上)；(4)Pallflex 2500-S2608G(粗糙的面向上)；(5)Pallflex 2500 AE53009M(平滑的面向上)；(6)Pallflex 2500 AE 53009M(粗糙的面向上)；(7)Whatman GMF 934AH；(8)Whatman GMF 150 2μm(相同孔隙大小的兩層)；(9)Wha tman 150 2μm(僅頂層)；(10)20μm PE玻璃料與5μm GF層；(11)一層5μm GF；(12)S&S GF號(hào)24(平滑的面向上)；(13)23μm玻璃纖維濾器(Ciro)和(14)23μm玻璃纖維濾器(Ciro)與標(biāo)準(zhǔn)緩沖液。
試驗(yàn)所分離的質(zhì)粒DNA的濃度和質(zhì)量以及用于測(cè)序反應(yīng)中。(見(jiàn)表8和9)。結(jié)果表明玻璃纖維和較大孔隙大小樣品是核酸捕獲基質(zhì)的良好候選者。
表8NA捕獲基質(zhì)濃度、A260/280、和A212結(jié)果
表9分離的低分子量核酸的測(cè)序質(zhì)量
第三個(gè)系列實(shí)驗(yàn)在表10和圖4中顯示，其中試驗(yàn)了NA捕獲基質(zhì)材料和孔隙大小從細(xì)菌宿主細(xì)胞來(lái)源分離質(zhì)粒DNA的能力。收獲含有XL1Blue/pBS2的細(xì)菌宿主細(xì)胞并如上面實(shí)施例中在前描述的用裂解溶液處理。相似處理的樣品與尼龍、PVDF或者玻璃纖維濾器接觸，這些濾器具有如下描述的孔隙大小(1)0.45μm尼龍纖維，(2)1.2μm尼龍纖維，(3)5.0μm尼龍纖維，(4)PallflexEmfab纖維與70μm玻璃料，(5)0.45μm PVDF，(6)1.0μm玻璃纖維濾器，(7)兩層1.2μm玻璃纖維濾器，(8)23μm玻璃纖維濾器，(9)20μm玻璃料上為3μm玻璃纖維濾器，再上面為5μm玻璃纖維濾器。
圖4表明盡管用尼龍或者Pallflex分離質(zhì)粒DNA產(chǎn)生了合適的結(jié)果，玻璃纖維材料，尤其樣品9中兩層玻璃纖維材料在本發(fā)明背景中提供了極好的NA捕獲基質(zhì)。如表10中所示，所分離的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量顯示出良好的A260/A280比例和A212讀數(shù)，特別對(duì)于具有孔隙大小為4/μm的第一層和孔隙大小為3μm的第二層的兩層玻璃纖維捕獲基質(zhì)的樣品9。
表10質(zhì)粒DNA質(zhì)量
實(shí)施例6本發(fā)明的方法和組合物可用于許多不同的宿主細(xì)胞和靶標(biāo)低分子量核酸下面的實(shí)例中的數(shù)據(jù)闡明所述裂解溶液可用于從幾種不同的宿主細(xì)胞分離不同大小的質(zhì)粒DNA。宿主細(xì)胞/載體組合在LB/amp培養(yǎng)基中過(guò)夜生長(zhǎng)14到16小時(shí)。每種細(xì)胞條件由1.5ml沉淀的培養(yǎng)物組成，將該沉淀的培養(yǎng)物用400μl裂解溶液(見(jiàn)實(shí)施例1)處理。表11和圖5中數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的方法和組合物可用于許多不同的宿主細(xì)胞和不同的質(zhì)粒。
表11來(lái)自不同宿主細(xì)胞的質(zhì)粒DNA
實(shí)施例7所純化的低分子量核酸可以直接用于PCR反應(yīng)用本發(fā)明的方法和組合物從宿主細(xì)胞回收后，所純化的低分子量核酸可直接在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增。用本發(fā)明的方法和溶液處理含有來(lái)自小鼠cDNA文庫(kù)的pGEM克隆的細(xì)菌細(xì)胞，并將分離的pGEM直接用于PCR反應(yīng)中，即從本發(fā)明的NA捕獲基質(zhì)洗脫pGEM后，不對(duì)其實(shí)施額外的步驟。PCR反應(yīng)摻入T7和Sp6引物并且用本領(lǐng)域中熟知的PCR方法實(shí)施該P(yáng)CR反應(yīng)。
如圖6中所示，用本發(fā)明的方法和組合物分離的pGEM DNA是PCR的極好的模板。該數(shù)據(jù)表明本發(fā)明提供了可以直接用于PCR的質(zhì)量DNA，重要的是，該DNA在用于這些反應(yīng)中時(shí)不需要額外的操作。
實(shí)施例8用本發(fā)明的方法和組合物可以以96孔形式分離質(zhì)粒DNA在96孔板中生長(zhǎng)含有pUC19質(zhì)粒的細(xì)菌宿主細(xì)胞以確定本發(fā)明的方法和組合物是否可應(yīng)用于高通量應(yīng)用。
如上述生長(zhǎng)和旋轉(zhuǎn)沉淀細(xì)胞，只是細(xì)胞生長(zhǎng)在96孔板的孔中并且用平板離心機(jī)沉淀。向每孔加入約400μl預(yù)冷的裂解溶液。將板振蕩、渦旋或者每孔單獨(dú)上下吹打以完全混合裂解溶液中的細(xì)胞。然后室溫孵育5分鐘并洗脫和分析DNA。如表12中所示，從96孔板生長(zhǎng)的宿主細(xì)胞分離的質(zhì)粒DNA顯示出良好的質(zhì)量和產(chǎn)率。注意質(zhì)粒DNA在96孔濾器板中捕獲，該板中每孔具有一對(duì)玻璃纖維層，它們的孔隙大小為5μm和3μm，NA捕獲基質(zhì)在7μm玻璃料上。
該實(shí)施例中的數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的方法和組合物適用于高通量應(yīng)用，例如，96孔形式板。此外，所述數(shù)據(jù)還表明通過(guò)在平板振蕩器上振蕩平板，在平板渦旋器上渦旋該平板，或者用96孔針頭吹打每孔的內(nèi)含物可以完成細(xì)胞與裂解溶液的混合。
表12來(lái)自96孔板的48個(gè)孔的數(shù)據(jù)
實(shí)施例9使用本發(fā)明的方法和組合物純化的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量與其他常規(guī)質(zhì)粒DNA純化方法相當(dāng)來(lái)自劃線LB瓊脂板的2到5毫升培養(yǎng)物(Top10細(xì)胞/pSV-β-gal)過(guò)夜生長(zhǎng)達(dá)到所希望的細(xì)胞密度。在15ml錐形管中實(shí)施生長(zhǎng)。收獲約1.5ml細(xì)胞并沉淀和根據(jù)本發(fā)明中描述的方法和組合物或者根據(jù)生產(chǎn)商的建議(Qiagen、Invitrogen、Biorad或者Promega)處理(見(jiàn)實(shí)施例1-8)。具體地，使用裂解溶液分離的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量與用Qiagenprep Miniprep試劑盒、WizardPlus SV Minipreps DNA純化系統(tǒng)(Promega)、AurumPlasmid Mini試劑盒(BioRad)、S.N.A.PMiniPrep試劑盒(Invitrogen)分離的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量進(jìn)行比較。對(duì)每種方法使用相似數(shù)量的起始細(xì)胞和洗脫體積。
通過(guò)瓊脂糖凝膠分析、分光光度法分析、DNA測(cè)序和限制酶消化比較純化的質(zhì)粒DNA。
瓊脂糖凝膠電泳分析將用QIAgen方法和本文中描述的裂解方法分離的約4％質(zhì)粒DNA加到含有溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠中。注意在加入凝膠前向每個(gè)樣品加入1.5×Orange II染料。此外，加入100ng和200ng pUC19質(zhì)粒DNA作為對(duì)照。如圖7A中所示，根據(jù)本發(fā)明分離的質(zhì)粒DNA提供了與QIAgen分離的質(zhì)粒DNA相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)率。
分光光度分析用SPECTRAmax微板分光光度計(jì)(MolecularDevices Corp.)分析來(lái)自每種純化方法的樣品以確定DNA濃度和純度。將樣品在UV-Star 96孔板(Greiner bio-one Corp.)中稀釋20倍。在下面的波長(zhǎng)采集吸收讀數(shù)260、280和212nm。每種樣品一式兩份地進(jìn)行。將濃度和A260/280比率平均以確定圖7B中給出的值。圖7B中的數(shù)據(jù)闡明本裂解方法提供了極佳的濃度和產(chǎn)率，與QIAgen、Invitrogen、BioRad或者Promega試劑盒相當(dāng)或者更好。
DNA測(cè)序通過(guò)ABI BigDyeTM終止子化學(xué)在ABI 3700測(cè)序儀上測(cè)序進(jìn)一步分析每種方法的樣品。對(duì)質(zhì)粒DNA實(shí)施測(cè)序并且一式兩份地進(jìn)行。將模板DNA加入反應(yīng)物并且模板DNA根據(jù)載體和沉淀的起始材料而變。將200ng到300ng模板DNA等分到96孔板(Genemate-ISC Bioexpress)中，總體積為4μl。測(cè)序參數(shù)如下步驟1-94℃2分鐘；步驟2-94℃10秒；步驟3-50℃5秒；步驟4-70℃4分鐘；步驟5-返回步驟2并重復(fù)25次，步驟6-10℃保持。
在裝入ABI 3700 DNA測(cè)序儀前實(shí)施測(cè)序清除。向每孔加入約15微升99％異丙醇并使用Expender Heat Sealer熱封，然后快速渦旋。將樣品在室溫孵育15分鐘并以1900×g離心30分鐘。離心后，除去熱封并將板倒置在紙巾上然后倒轉(zhuǎn)返回到離心板載體。將該板以500×g旋轉(zhuǎn)1分鐘。將該板從離心機(jī)除去并將DNA重懸浮在10微升1/10×TE中并裝入測(cè)序儀。用基于PHRED的軟件版本0.020425.c(CodonCorporation)實(shí)施質(zhì)量得分。100質(zhì)量得分≥20的那些樣品為合格的結(jié)果。
如表13中所示，所有5種試劑盒都提供了合格的測(cè)序得分。此外，圖8提供了每種試劑盒的DNA的闡明性測(cè)序追蹤。該數(shù)據(jù)表明本裂解和純化方法和組合物提供了與使用其他試劑盒廠商的試劑盒分離的DNA相當(dāng)質(zhì)量的DNA。注意到本發(fā)明，包括洗脫步驟，在約14分鐘內(nèi)進(jìn)行，而QIAgen花費(fèi)約28分鐘，Invitrogen花費(fèi)約31分鐘，Promega花費(fèi)約36分鐘。BioRad Aurum試劑盒花費(fèi)約23分鐘。該數(shù)據(jù)闡明本文提供的裂解溶液和方法的改良的實(shí)用性。
表13合格測(cè)序得分
限制酶消化用EcoRI、HindIII和Ned I對(duì)pSV-β-gal載體實(shí)施限制性消化。對(duì)250ng質(zhì)粒DNA和1單位每種內(nèi)切酶實(shí)施限制性消化。緩沖液條件如酶生產(chǎn)商描述。如圖9中所示，本裂解分離的DNA為限制性?xún)?nèi)切酶提供了與其他常規(guī)分離方法相當(dāng)?shù)哪０錎NA。
實(shí)施例10PEG和鹽結(jié)合溶液驅(qū)使NA結(jié)合二氧化硅纖維下面的實(shí)施例中的數(shù)據(jù)闡明PEG和鹽的溶液可用于迫使低分子量核酸結(jié)合基于玻璃纖維的NA捕獲基質(zhì)。用如本領(lǐng)域中熟知的堿性裂解方法處理含有pUC19的宿主細(xì)胞。將澄清的裂解物置于本發(fā)明的基于二氧化硅的旋轉(zhuǎn)裝置上并確定所分離的pUC19的產(chǎn)率和A260/280讀數(shù)。備選地，將澄清的裂解物與8.5％PEG/850mM NaCl溶液組合并與上面的澄清裂解物基本上相同地處理。
如圖10B中所示，PEG和鹽驅(qū)使澄清裂解物中的pUC19結(jié)合基于二氧化硅的濾器(泳道1-4)。相比，不加入PEG和鹽的澄清裂解物不能提供任何可檢測(cè)的pUC19與目標(biāo)基于二氧化硅的捕獲基質(zhì)的結(jié)合(泳道5-8)。如圖10A中所示，當(dāng)本發(fā)明的裂解溶液與本發(fā)明的NA捕獲基質(zhì)連用時(shí)得到最佳結(jié)果-其中該裂解溶液包括先前描述的濃度的PEG和鹽(如泳道4-6和7-9中所示)。注意到當(dāng)本發(fā)明的裂解溶液不含有PEG或者鹽時(shí)，泳道1-3不顯示出質(zhì)粒DNA的純化。
實(shí)施例11在本發(fā)明的核酸純化方法期間可以向細(xì)胞培養(yǎng)物直接加入裂解溶液下面的實(shí)施例中的數(shù)據(jù)闡明本文中描述的裂解溶液甚至當(dāng)直接加入液體細(xì)菌培養(yǎng)物(細(xì)胞未沉淀)時(shí)也在本發(fā)明的方法中有效。如實(shí)施例1中描述的制備裂解溶液。將樣品加入多層玻璃纖維(5μm和3μm)濾器裝置或者單層Whatman 23μm玻璃濾器裝置。
將約1.5ml pUC19/XL1blue轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)物與2.25ml冷卻的裂解溶液混合并將細(xì)胞渦旋30秒。允許細(xì)胞在室溫孵育3分鐘并除去約930μl裂解物并將其加到多層或單層旋轉(zhuǎn)裝置以分離pUC19。注意到將每種培養(yǎng)物分成4份樣品，導(dǎo)致產(chǎn)率為從1.5ml培養(yǎng)物通常預(yù)期的產(chǎn)率的1/4。裂解物在旋轉(zhuǎn)裝置中旋轉(zhuǎn)沉淀并用約500μl洗滌緩沖液洗滌濾器。如前面描述的實(shí)施質(zhì)粒洗脫。如上述實(shí)施吸收讀數(shù)和凝膠電泳。
如表14和圖11中所示，從液體培養(yǎng)物提取質(zhì)粒DNA導(dǎo)致提取和純化高質(zhì)量DNA。結(jié)果顯示幾乎沒(méi)有蛋白質(zhì)或者RNA污染(見(jiàn)圖11中A260/280讀數(shù)和質(zhì)粒帶)。這些結(jié)果表明本發(fā)明的方法和溶液可以并入不需要在加入裂解溶液前沉淀細(xì)胞的方法中。這是有較大意義的結(jié)果-允許本發(fā)明的方法和溶液用于進(jìn)一步減小從目標(biāo)起始材料分離高質(zhì)量核酸的復(fù)雜性和所需時(shí)間。
表14來(lái)自液體培養(yǎng)物與裂解溶液直接混合的數(shù)據(jù)(所有讀數(shù)進(jìn)行兩次)
將清楚本發(fā)明適于實(shí)現(xiàn)本文中提到的目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)以及內(nèi)在的那些優(yōu)點(diǎn)。盡管為了公開(kāi)的目的描述了當(dāng)前優(yōu)選的實(shí)施方案，但是可以進(jìn)行多種改變和修飾，它們是本領(lǐng)域中技術(shù)人員容易聯(lián)想的并且包括在本文中公開(kāi)的本發(fā)明和如所述權(quán)利要求書(shū)定義的精神內(nèi)。
將本文中引用的所有出版物并入作為參考。
權(quán)利要求
1.用于裂解宿主細(xì)胞的裂解組合物，其含有緩沖劑；和兩性離子去污劑；其中宿主細(xì)胞中的至少一部分蛋白質(zhì)被該兩性離子去污劑溶解。
2.權(quán)利要求1的組合物，其還含有溶菌酶。
3.權(quán)利要求2的組合物，其還含有RNA酶。
4.權(quán)利要求2的組合物，其還含有DNA酶。
5.權(quán)利要求2的組合物，其還含有聚乙二醇。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述兩性離子去污劑選自正-辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十六基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽，和它們的混合物。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述兩性離子去污劑的終濃度為約1％到約5％。
8.權(quán)利要求1的組合物，其還含有離液序列高的鹽。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物的最終pH為約7.9到約8.4。
10.用于從宿主細(xì)胞純化低分子量核酸的試劑盒，該試劑盒含有用于從宿主細(xì)胞純化低分子量核酸的裂解溶液，該裂解溶液含有緩沖劑和兩性離子去污劑；和捕獲低分子量核酸的核酸捕獲基質(zhì)。
11.權(quán)利要求10的試劑盒，其中所述核酸捕獲基質(zhì)包含旋轉(zhuǎn)柱，所述旋轉(zhuǎn)柱含有捕獲基質(zhì)材料。
12.權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述捕獲基質(zhì)材料含有平均孔隙大小為至少1μm的玻璃纖維。
13.權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述捕獲基質(zhì)材料含有平均孔隙大小為至少3μm的玻璃纖維。
14.權(quán)利要求13的試劑盒，其還含有用于支持捕獲基質(zhì)材料的玻璃料。
15.權(quán)利要求10的試劑盒，其還含有用于從捕獲的低分子量核酸除去污染物的洗滌緩沖液；和用于從核酸捕獲基質(zhì)洗脫捕獲的低分子量核酸的洗脫緩沖液。
16.權(quán)利要求10的試劑盒，其中所述兩性離子去污劑選自正-辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十六基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽，和它們的混合物。
17.權(quán)利要求16的試劑盒，其中所述兩性離子去污劑的終濃度為約0.2％到約6％。
18.權(quán)利要求10的試劑盒，其還含有溶菌酶。
19.權(quán)利要求10的試劑盒，其還含有RNA酶。
20.權(quán)利要求10的試劑盒，其還含有DNA酶。
21.權(quán)利要求10的試劑盒，其還含有用于培養(yǎng)細(xì)胞的管。
22.權(quán)利要求21的試劑盒，其中所述用于培養(yǎng)細(xì)胞的管為lid-bac管。
23.權(quán)利要求10的試劑盒，其中所述核酸捕獲基質(zhì)整合到96孔板的至少一孔中，其中該96孔板包括在試劑盒中。
24.用于從宿主細(xì)胞純化低分子量核酸的方法，該方法包括向宿主細(xì)胞加入裂解量的裂解溶液以從宿主細(xì)胞釋放低分子量核酸，所述裂解溶液含有兩性離子去污劑；將用該裂解溶液處理的宿主細(xì)胞與核酸捕獲基質(zhì)組合，該核酸捕獲基質(zhì)具有平均孔隙大小為至少1μm的至少一層捕獲基質(zhì)材料用于捕獲低分子量核酸；和從該核酸捕獲基質(zhì)洗脫低分子量核酸。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述裂解溶液中所述兩性離子去污劑為約0.2％到約6％。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述裂解溶液中所述兩性離子去污劑為約1％到約5％。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述裂解溶液中所述兩性離子去污劑選自正-辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十六基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽，和它們的混合物。
28.權(quán)利要求24的方法，其中所述裂解溶液在加入宿主細(xì)胞前冷卻到低于室溫的溫度。
29.權(quán)利要求28的方法，其還包括將裂解溶液與宿主細(xì)胞在室溫孵育至少3分鐘后與所述核酸捕獲基質(zhì)組合。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述孵育為至少5分鐘。
31.權(quán)利要求24的方法，其還包括洗脫前將具有捕獲的低分子量核酸的核酸捕獲基質(zhì)用洗滌緩沖液洗滌。
32.權(quán)利要求24的方法，其中所述裂解溶液還含有聚乙二醇。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述聚乙二醇的終濃度為約2％到約20％。
34.權(quán)利要求24的方法，其中所述裂解溶液還含有溶菌酶。
35.權(quán)利要求24的方法，其中所述裂解溶液還含有RNA酶。
36.權(quán)利要求24的方法，其中所述裂解溶液還含有DNA酶。
37.權(quán)利要求24的方法，其中所述裂解溶液還含有離液序列高的鹽。
38.權(quán)利要求24的方法，其中所述低分子量核酸含有質(zhì)粒DNA。
39.用于從宿主細(xì)胞釋放染色體外DNA的組合物，其含有具有約0.2％到約6％兩性離子去污劑的溶液。
40.權(quán)利要求39的組合物，其中所述兩性離子去污劑選自正-辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十六基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽，和它們的混合物。
41.權(quán)利要求40的組合物，其還含有溶菌酶。
42.權(quán)利要求41的組合物，其還含有RNA酶。
43.權(quán)利要求41的組合物，其還含有聚乙二醇。
44.權(quán)利要求41的組合物，其還含有離液序列高的鹽。
45.用于在分離細(xì)胞蛋白質(zhì)與核酸期間溶解細(xì)胞蛋白質(zhì)的組合物，其含有選自正-辛基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-癸基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十二基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十四基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽、正-十六基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙烷磺酸鹽，和它們的混合物的去污劑。
46.權(quán)利要求45的組合物，其中所述去污劑的終濃度為約0.2％到約6％。
47.權(quán)利要求46的組合物，其中所述去污劑的終濃度為約1％到約5％。
48.用于從澄清的裂解物分離核酸的裂解組合物，其含有緩沖劑；聚乙二醇；和鹽；其中將裂解組合物加入澄清的裂解物，和將澄清的裂解物和裂解組合物的組合加入二氧化硅纖維以在該二氧化硅纖維上捕獲該核酸。
49.從細(xì)胞培養(yǎng)物中的宿主細(xì)胞純化低分子量核酸的方法，該方法包括向細(xì)胞培養(yǎng)物加入裂解量的裂解溶液以從宿主細(xì)胞釋放低分子量核酸；合并用裂解溶液處理的宿主細(xì)胞與核酸捕獲基質(zhì)，該核酸捕獲基質(zhì)具有平均孔隙大小至少1μm的至少一層捕獲基質(zhì)材料用于捕獲低分子量核酸；和從核酸捕獲基質(zhì)洗脫低分子量核酸。
50.權(quán)利要求49的方法，其中以裂解溶液與細(xì)胞培養(yǎng)物體積的比為約1∶2到約3∶1的比例將所述裂解溶液加入該細(xì)胞培養(yǎng)物。
全文摘要
提供了用于溫和裂解和溶解細(xì)胞的方法和組合物。還提供了用于從宿主細(xì)胞快速純化高質(zhì)量低分子量核酸的方法和組合物。將靶細(xì)胞用含有兩性離子去污劑，例如，正－十二基－N，N－二甲基－3－銨基－1－丙烷磺酸鹽的預(yù)冷的裂解溶液處理，并短暫室溫孵育。當(dāng)需要核酸純化時(shí)，將裂解溶液處理的細(xì)胞與平均孔隙大小至少1μm的核酸捕獲基質(zhì)接觸。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1768265SQ200380110142
公開(kāi)日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2003年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月12日
發(fā)明者M·J·多曼尼科, M·邁爾斯, K·基恩, L·R·布勞恩, T·科爾曹 申請(qǐng)人:伊彭多夫公司