專(zhuān)利名稱(chēng)：一種高效分離制備高純度紫杉醇半合成前體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紫杉醇半合成前體的分離方法。
背景技術(shù)：
紫杉醇(Taxol)是60年代美國(guó)化學(xué)家Wall和Wani首先從太平洋紫杉(短葉紅豆杉Taxus brevifolia)樹(shù)皮中分離出的一種天然二萜類(lèi)化合物。它由四個(gè)環(huán)組成，分子中具有11個(gè)手性中心和多個(gè)取代基團(tuán)，在13位羥基上還帶有一個(gè)氨基醇類(lèi)的側(cè)鏈，其化學(xué)式如式1所示。
式1由于紫杉醇是一種高效細(xì)胞毒素，具有抑制癌細(xì)胞的生物活性，且作用機(jī)理與一般抗癌藥物不同，近年來(lái)倍受藥物化學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注，并且作為一種療效顯著的抗癌藥物在臨床上的使用越來(lái)越廣泛。但是目前紫杉醇僅靠從紅豆杉樹(shù)皮中提取，不僅含量較低，僅約0.01％，每提取1kg紫杉醇就要砍伐1000～2000棵樹(shù)，且紅豆杉生長(zhǎng)較緩慢，資源有限，即便將全部天然資源采伐，也只能滿(mǎn)足短期需要。因此，人們長(zhǎng)期以來(lái)一直在研究獲取紫杉醇的其它途徑。概括起來(lái)，大致有以下四種途徑①全合成紫杉醇結(jié)構(gòu)復(fù)雜，母核中有9個(gè)手性中心，側(cè)鏈有2個(gè)手性中心，因此應(yīng)有2048個(gè)非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體，它的合成對(duì)有機(jī)化學(xué)家是一種挑戰(zhàn)。雖然經(jīng)過(guò)20多年的努力全合成最終獲得了成功，并具有很重要的學(xué)術(shù)價(jià)值，但是由于合成路線復(fù)雜，步驟煩瑣，大約有30多步，因此目前用全合成的方法提供藥源不太可能。②組織培養(yǎng)該方法是一個(gè)有前途的方法。但總的來(lái)說(shuō)，組織培養(yǎng)法還處于研究開(kāi)發(fā)階段，要實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)關(guān)鍵在于想辦法提高細(xì)胞產(chǎn)率。③真菌發(fā)酵在附生于紅豆杉樹(shù)皮的真菌中發(fā)現(xiàn)紫杉醇，是近年來(lái)紫杉醇研究的重要進(jìn)展。就目前的技術(shù)水平而言，從真菌培養(yǎng)液中僅能獲得納克級(jí)的紫杉醇，若要達(dá)到商業(yè)生產(chǎn)，必須達(dá)到毫克級(jí)水平。因此，若干技術(shù)問(wèn)題尚需解決。④半合成法紫杉醇的半合成主要是將紅豆杉植物中的紫杉烷成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，得到紫杉醇或具有生物活性的紫杉醇衍生物。較為成功的即是以如式2所示的10-deacetylbaccatinIII(又簡(jiǎn)稱(chēng)為“10-DAB”)為前體進(jìn)行的紫杉醇半合成首先將10-deacetylbaccatinIII的C7位羥基保護(hù)，C10位羥基乙酰化；再在C13位羥基上引入被保護(hù)的側(cè)鏈；最后水解去除側(cè)鏈上的保護(hù)基和C7位上的保護(hù)基而得到紫杉醇。
式2 10-deacetylbaccatinIII在多種紅豆杉植物的可再生枝葉中含量較高，具有紫杉烷的基本母核，作為半合成前體是非常適合的。普遍認(rèn)為半合成方法最有希望在不久的將來(lái)批量生產(chǎn)，從而緩解紫杉醇資源緊張，以至最終將替代現(xiàn)有植物提取方法。另外，利用半合成方法，還可以對(duì)紫杉醇及其衍生物進(jìn)行化學(xué)修飾，使其具有更好的制劑性和生物活性。
作為紫杉醇半合成前體，近年來(lái)有關(guān)10-deacetylbaccatinIII的分離方法的研究也倍受科學(xué)家的關(guān)注。如法國(guó)Rhone-Poulenc Rorer的Margraff R.等報(bào)導(dǎo)了用水處理紫杉的適用部位后，得到的水溶液再用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑萃取，然后選擇性結(jié)晶得到75％-90％HPLC純度的10-deacetylbaccatinIII，或用甲醇對(duì)該植物進(jìn)行提取，然后以一定比例的甲醇/水對(duì)萃取物處理，最后通過(guò)選擇性結(jié)晶得到75％-93％HPLC純度的10-deacetylbaccatinIII，該方法較為簡(jiǎn)單，但是得到的目標(biāo)產(chǎn)物純度有限。除此之外，其它報(bào)導(dǎo)大都采用柱色譜分離方法，如硅膠柱等，最后以制備HPLC為精制手段。且絕大部分都以紫杉醇為分離對(duì)象，10-deacetylbaccatinIII是在預(yù)先去除紫杉醇后經(jīng)進(jìn)一步分離得到的副產(chǎn)品，所用原料主要為紫杉樹(shù)皮，所以有些條件并不適合從紫杉枝葉中直接分離提取10-deacetylbaccatinIII。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效分離制備高純度紫杉醇半合成前體的方法，可以用于從紫杉枝葉的提取物中直接分離制備10-deacetylbaccatinIII。
請(qǐng)參考圖1，為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下方案A.拌樣將紫杉枝葉的提取物用甲醇溶解，與纖維素拌樣，拌樣均勻后揮干溶劑，碾磨均勻；B.用C8柱填料填充層析柱層析，用氮?dú)馄考訅?，體積百分比為30-50％的乙腈水溶液洗脫，用餾分收集器收集各餾分；C.將含有10-DAB的級(jí)分合并，濃縮后，用步驟A的方法再次拌樣；D.用C18柱填料填充層析柱層析，用氮?dú)馄考訅?，體積百分比為20-30％的乙腈水溶液洗脫，用餾分收集器收集各餾分；E.將含有10-DAB的級(jí)分合并、減壓濃縮、真空干燥后，用高速逆流色譜進(jìn)行進(jìn)一步地分離，根據(jù)紫外檢測(cè)器譜峰，收集目標(biāo)級(jí)分；在本步驟中，優(yōu)選鹵代烴-脂肪醇-水組成的溶劑體系進(jìn)行高速逆流色譜分離；其中，鹵代烴可以是氯仿、二氯甲烷或四氯化碳，最優(yōu)選為氯仿；脂肪醇可以是甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇，最優(yōu)選為甲醇。
必要時(shí)溶劑體系中還可以含有正己烷。
進(jìn)行高速逆流色譜分離時(shí)，洗脫方式是上相為固定相，下相為流動(dòng)相的正向洗脫方式。
F.目標(biāo)級(jí)分經(jīng)濃縮干燥后，用乙腈或甲醇重結(jié)晶即可得到高純度的10-DAB單體。
在步驟B和D中，優(yōu)選粒徑在30-80μm之間的C8柱和C18柱。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是該方法步驟簡(jiǎn)單，效率高，易于重復(fù)。高效液相色譜分析表明，采用該方法分離制備的10-deacetylbaccatinIII純度可達(dá)99％以上。


圖1為本發(fā)明的工藝流程2為實(shí)施例1中經(jīng)過(guò)C8柱后的1#樣的HPLC圖。
圖3為實(shí)施例1中經(jīng)過(guò)C18柱后的2#樣的HPLC圖。
圖4為10-DAB標(biāo)準(zhǔn)參考物的定量工作曲線。
圖5為實(shí)施例2中經(jīng)過(guò)二次柱分離后所得2#樣的HSCCC分離譜圖。
圖6為實(shí)施例2中經(jīng)HSCCC分離得到的含10-DAB部分(3#樣)的HPLC分析譜圖。
圖7為實(shí)施例3中3#樣一次重結(jié)晶得到的10-DAB結(jié)晶的HPLC分析圖。
圖8為實(shí)施例3中3#樣一次重結(jié)晶母液的HPLC分析圖。
圖9為實(shí)施例3中二次重結(jié)晶得到的10-DAB結(jié)晶的HPLC圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1紫杉枝葉醇提物的二次柱層析分離將紫杉枝葉的提取物用甲醇溶解，與纖維素拌樣，拌樣均勻后揮干溶劑，碾磨均勻；由于醇提物粗樣成分比較復(fù)雜，采用了兩步柱分離過(guò)程，用氮?dú)馄考訅?，第一步用C8柱和45％(v/v)乙腈水溶液洗脫，第二步采用C18柱和25％(v/v)乙腈水溶液洗脫，用HPLC對(duì)分離過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控，收集目標(biāo)級(jí)分，濃縮干燥，并用參考物對(duì)其中10-DAB含量進(jìn)行定量分析。
40g粗樣經(jīng)過(guò)第一個(gè)C8柱后，平均可得約10g含10-DAB樣；合并四次所得共得約40g樣(1#樣)。再經(jīng)過(guò)第二個(gè)C18柱分離后，平均可得約15g含10-DAB樣(2#樣)。圖2和圖3分別為1#樣和2#樣的HPLC分析譜圖，圖4為10-DAB標(biāo)準(zhǔn)參考物的定量工作曲線。經(jīng)定量分析，1號(hào)樣含10-DAB約0.57％，2#樣含10-DAB約1.5％。
實(shí)施例2柱層析分離后含10-DAB級(jí)分的高速逆流色譜純化如圖3所示，經(jīng)過(guò)兩次柱凈化過(guò)的樣品仍然相當(dāng)復(fù)雜，其中10-DAB含量也只有百分之一左右。此時(shí)，可以用柱子繼續(xù)純化下去，但是考慮到其純化效率較低，不過(guò)C18柱后樣品中10-DAB含量?jī)H比過(guò)柱前提高約2.5倍。因此，接下來(lái)采用高速逆流色譜純化。
此時(shí)，所用溶劑體系為正己烷-氯仿-甲醇-水(15∶35∶17∶8)。圖5為其中一個(gè)500mg樣品的分離譜圖。圖6給出了逆流色譜純化得到的含10-DAB部分(3#樣)的HPLC分析譜圖。經(jīng)定量分析，經(jīng)過(guò)HSCCC純化可平均得到含10-DAB約24％的純化樣?？梢钥闯?，其純化效率要比柱色譜高的多。
實(shí)施例3含10-DAB樣品的最終重結(jié)晶經(jīng)HSCCC純化后，10-DAB含量有了明顯提高。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙腈重結(jié)晶可以起到驚人的純化效果，經(jīng)HSCCC純化后的樣品經(jīng)一次或兩次重結(jié)晶即可得到高純度的10-DAB。圖7和圖8分別為3#樣經(jīng)重結(jié)晶得到的10-DAB結(jié)晶和母液的HPLC分析圖?？梢钥闯?，絕大部分干擾物都留在了母液里。圖9為經(jīng)二次結(jié)晶最終得到的高純度10-DAB的HPLC維分析圖。定量分析表明，其純度可達(dá)99％以上。
為了確認(rèn)所得產(chǎn)物為10-DAB，對(duì)上述結(jié)晶粉末進(jìn)行了快原子轟擊質(zhì)譜FAB-MS，氫譜1HNMR，碳譜13CNMR和KBr紅外IR譜鑒定。
質(zhì)譜鑒定說(shuō)明所得產(chǎn)物的分子量為544，與10-DAB分子量相同。
氫譜鑒定結(jié)果顯示，δ(CDCl3)8.09(2H，dd，J＝1.8，8，OBz)，7.61(1H，m，J＝1.2，7.3，OBz)，7.48(2H，t，J＝7.6，OBz)，5.64(1H，d，J＝6.7，2-H)，5.25(1H，s，10-H)，4.98(1H，dd，J＝1.8，9.8，5-H)，4.89(1H，t，J＝7.3，13-H)，4.32(1H，d，J＝8，20-H)，4.28(1H，m，7-H)，4.17(1H，d，J＝8，20-H)，4.01(1H，d，J＝6.7，3-H)，2.62(1H，m，6-αH)，2.29(3H，s，OAc)，2.27(2H，m，14-αH，14-βH)，2.07(3H，d，J＝1.2，18-CH3)，1.83(1H，m，6-βH)，1.74(3H，s，19-CH3)，1.09(6H，s，16-CH3，17-CH3)。這些數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的10-DAB數(shù)據(jù)基本一致。δ為2.0的最高峰為包夾在結(jié)晶中的乙腈CH3CN上質(zhì)子。
13CNMR分析結(jié)果表明，除了δ為77.0和39.5的峰分別為氘代試劑CDCl3和DMSO中C外，δ為211ppm的峰為分子中唯一的酮基，160～170ppm之間的兩峰為兩個(gè)酯基，150～130ppm之間的七個(gè)峰代表九個(gè)不飽和o，其中兩個(gè)雙鍵C，六個(gè)苯環(huán)C，還有一個(gè)CH3CN的叁鍵C。其它十八個(gè)為飽和C。共二十九個(gè)C與10-DAB相符。
紅外譜圖顯示，在3444cm-1和1706cm-1兩處有強(qiáng)吸收。
以上結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)均證實(shí)，所得到的產(chǎn)物確為10-deacetylbaccatinIII。
權(quán)利要求
1.一種紫杉醇半合成前體10-DAB的分離方法，其特征在于以乙腈和水的混合物為流動(dòng)相，先采用C8柱、然后采用C18柱，對(duì)紫杉枝葉的提取物進(jìn)行兩次粗分離；然后對(duì)粗分離后的目標(biāo)級(jí)分采用高速逆流色譜進(jìn)行進(jìn)一步分離和純化；最后采用重結(jié)晶的方法進(jìn)行精制，得到高純度的10-DAB。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紫杉醇半合成前體10-DAB的分離方法，其特征在于，由以下步驟組成A.拌樣將紫杉枝葉的提取物用甲醇溶解，與纖維素拌樣，拌樣均勻后揮干溶劑，碾磨均勻；B.用C8柱填料填充層析柱層析，用氮?dú)馄考訅?，體積百分比為30-50％的乙腈水溶液洗脫，用餾分收集器收集各餾分；C.將含有10-DAB的級(jí)分合并，濃縮后，用步驟A的方法再次拌樣；D.用C18柱填料填充層析柱層析，用氮?dú)馄考訅?，體積百分比為30-50％的乙腈水溶液洗脫，用餾分收集器收集各餾分；E.將含有10-DAB的級(jí)分合并、減壓濃縮、真空干燥后，用高速逆流色譜進(jìn)行進(jìn)一步地分離，根據(jù)紫外檢測(cè)器譜峰，收集目標(biāo)級(jí)分；F.目標(biāo)級(jí)分經(jīng)濃縮干燥后，用重結(jié)晶的方法進(jìn)行精制，即可得到高純度的10-DAB單體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紫杉醇半合成前體10-DAB的分離方法，其特征在于所述的C8柱和C18柱的粒徑在30-80μm之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紫杉醇半合成前體10-DAB的分離方法，其特征在于所述的步驟E中，優(yōu)選鹵代烴-脂肪醇-水組成的溶劑體系進(jìn)行高速逆流色譜分離；其中，鹵代烴可以是氯仿、二氯甲烷或四氯化碳；脂肪醇可以是甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的紫杉醇半合成前體10-DAB的分離方法，其特征在于所述的步驟E中，用氯仿-甲醇-水組成的溶劑體系進(jìn)行高速逆流色譜分離。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的紫杉醇半合成前體10-DAB的分離方法，其特征在于溶劑體系中還含有正己烷。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紫杉醇半合成前體10-DAB的分離方法，其特征在于所述的步驟E中，進(jìn)行高速逆流色譜分離時(shí)，其洗脫方式是上相為固定相，下相為流動(dòng)相的正向洗脫方式。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紫杉醇半合成前體10-DAB的分離方法，其特征在于所述的步驟F中，采用乙腈或甲醇進(jìn)行重結(jié)晶。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紫杉醇半合成前體10-DAB的分離方法，其特征在于所述的步驟F中，采用乙腈進(jìn)行重結(jié)晶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種高效分離制備高純度紫杉醇半合成前體的方法。以乙腈和水的混合物為流動(dòng)相，先采用C
文檔編號(hào)C07D305/00GK1560042SQ20041000697
公開(kāi)日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月3日
發(fā)明者曹學(xué)麗, 田宇, 董銀卯, 趙華, 陸辛玫 申請(qǐng)人:北京工商大學(xué)